CN106138098B - 自然杀伤细胞联合抗抑郁药在改善抑郁症状中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了自然杀伤(nature killer,NK)细胞免疫疗法的一种新用途。本发明采用动物模型，研究了NK细胞联合氟西汀治疗对慢性不可预见性抑郁症大鼠脑内单胺类递质浓度、外周血细胞因子水平及抑郁样行为的影响；临床研究，评价了照射后NK‑92细胞联合帕罗西汀对患者抑郁症状的改善及免疫指标的调节，证实了NK细胞免疫疗法对抑郁症状的显著改善作用。因此，NK细胞免疫治疗联合抗抑郁药物可显著改善抑郁症状。

Description

自然杀伤细胞联合抗抑郁药在改善抑郁症状中的应用
技术领域
本发明涉及细胞免疫学及神经内科学技术领域，具体涉及自然杀伤细胞联合抗抑郁药在改善抑郁症状中的应用。
背景技术
抑郁症是一种以持续心境低落为主要特征的情感性精神障碍综合征，该疾病具有发病率高、治愈难和复发率高等特点，直接影响到患者的工作状态和生活质量。单胺类神经递质假说是被广泛接受的抑郁症发病的生物学机制之一，以此研发的药物是目前抗抑郁症治疗的主要手段，包括三环类抗抑郁药物、单胺氧化酶抑制剂、5-HT及NA再摄取抑制药等。但临床数据显示，患者需要服药数周才能起效，部分患者易于复发，且仍有30％～50％的患者对该类药物无疗效反应。因此，现有的抗抑郁治疗手段尚不能满足临床需要。
随着神经-内分泌-免疫调节理论的发展，关于抑郁症的免疫学研究取得了较大的进展。研究显示抑郁症患者普遍存在外周血炎性细胞因子(IL-6、TNF-α、IFN-γ)水平升高，此外非特异性免疫细胞——NK细胞的数量减少及其活性下降与抑郁症状的严重程度和下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)活动增强的程度正相关，提示了抑郁症的免疫炎性机制以及NK免疫细胞数量及功能的改变可能参与抑郁症的病例机制，NK细胞可能成为改善抑郁症状的潜在治疗途径。
NK细胞是T细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞，它识别靶细胞无MHC限制性，可以在无预先致敏的情况下杀伤病变细胞，是机体天然免疫系统的核心细胞。NK细胞既是重要的外向性自然防御细胞，又是体内多种免疫细胞的调节细胞，不仅具有溶解靶细胞(某些肿瘤细胞和病毒感染细胞)的能力，而且还兼有重要的生理性免疫调节作用，在一定条件下可以通过血脑屏障，参与对神经系统的调节。但随着机体年龄的增加，NK的数量和功能也呈逐渐衰减的趋势。
目前NK细胞免疫治疗临床研究数据显示，自体或同种异体来源NK细胞可提高机体全身免疫能力，使免疫系统恢复监视功能，在抗肿瘤治疗和改善亚健康状态(如失眠、多梦、乏力和焦虑等)中发挥重要作用。相比较而言，自体或同种异体NK细胞在进行免疫治疗时存在一定的局限性，而永生化的NK细胞系因具有较强的细胞毒作用、体外易扩增培养、且不存在其他细胞污染等优点，可以克服自体或异体NK细胞的局限性，具有很好的临床应用前景。
随着细胞克隆化技术的不断成熟，相继报道的人NK细胞系有许多种，其中NK-92细胞是1992年建立的来自非霍奇金淋巴瘤患者的NK细胞系，由于其免疫表型为CD56highCD16-，无ADCC效应，类似于外周血CD56highNK细胞，并且它几乎缺失所有抑制性受体，高表达一系列的激活受体，且含有丰富的穿孔素和颗粒酶，因此它不但有很强的杀细胞效应，而且具有广泛免疫调节作用，使其成为临床细胞免疫治疗的有力候选者，它也是唯一经美国FDA批准进行临床I/II期研究的NK细胞系。
有报道指出在病理条件下，NK细胞可穿透血脑屏障，激活神经细胞的活性，参与对神经系统疾病的调节，但尚未见到NK细胞免疫疗法在改善抑郁症状中的应用的报道和专利。
发明内容
本发明的目的是提供一种从免疫调节的角度实现改善抑郁症状的新途径，即抗抑郁药物联合NK细胞免疫治疗在改善抑郁症状中的应用。
本发明将NK细胞免疫疗法联合抗抑郁药物对大鼠慢行轻度不可预见性抑郁症(chronic unpredictable mild stress,CUMS)模型进行干预，实施大鼠NK细胞联合氟西汀的抗抑郁治疗方案，证实了NK细胞联合抗抑郁药可进一步改善抑郁症模型大鼠的免疫功能，提高大鼠脑内单胺类递质的浓度，改善抑郁样症状。
本发明将NK细胞免疫疗法联合抗抑郁药物对抑郁症状患者进行干预，实施照射后NK-92细胞联合帕罗西汀的抗抑郁治疗方案，证实了该联合疗法可提高患者的免疫功能，显著改善患者抑郁症状。
本发明通过NK细胞联合抗抑郁药物治疗实现对抑郁症状患者脑内单胺类递质浓度和免疫功能的双重调节，具有治疗和防治的双重功效。
附图说明
图1、NK细胞联合氟西汀治疗大鼠慢行轻度不可预见性抑郁症模型技术路线。
图2、照射后NK-92细胞联合帕罗西汀治疗抑郁症状患者技术路线。
图3、大鼠外周血经NK细胞分离液收集获得的NK细胞的流式表型，图中Q1区域代表CD3-CD56+NK细胞。
图4、大鼠慢行轻度不可预见性抑郁症(CUMS)模型行为学评价，4A.糖水偏好，4B.旷场水平运动距离，4C.旷场垂直运动次数，图中，Control为正常对照组，CUMS为慢行轻度不可预见性抑郁症模型组，＊p<0.05，＊＊p<0.01。
图5、NK细胞联合氟西汀治疗对大鼠CUMS模型外周血炎性细胞因子水平的影响，5A.IL-6,5B.IL-1β,5C.IFN-γ,图中，Control为正常对照组,CUMS为慢行轻度不可预见性抑郁症模型组,Flu为氟西汀组(3.5mg/kg),NK+Flu为NK细胞联合氟西汀(3.5mg/kg)治疗组,与CUMS模型组相比＊p<0.05。
图6、照射后NK-92细胞生存情况，NK-92细胞经500cGy照射后48h细胞基本凋亡。
具体实施方式
实施例1
NK细胞联合氟西汀改善大鼠慢行轻度不可预见性抑郁症模型
(1)实验方法：
大鼠慢行轻度不可预见性抑郁症模型建立
SPF级SD大鼠24只，雄性，随机分为对照组6只，模型组18只，模型组大鼠以下应激因子按随机方法在3周内应用：①禁食不禁水24h②禁水不禁食24h③4℃游泳5min④夹尾1min(止血钳距尾根1cm)⑤束缚应激2h⑥40℃环境5min⑦潮湿垫料、鼠笼倾斜(45℃)24h⑧悬吊5min⑨明暗颠倒24h；每日采用1种刺激，每种刺激平均被采用2次，每种刺激不能连续出现，使动物不能预料刺激的发生。
大鼠慢行轻度不可预见性抑郁症模型的评价
旷场实验：将大鼠置于高40cm，边长80cm，四周及底部均为黑色的封闭方形旷场中心位置，适应5min后，用摄像系统观察并记录大鼠在旷场内5min的行为表现，包括水平活动距离，垂直运动次数，其中水平活动距离可以通过行为学分析系统获得数据。分别于造模前、造模3周、6周对大鼠进行水平运动和垂直运动的测定。
糖水消耗实验：糖水偏好测试均于大鼠禁水22h后进行，分别于造模前、造模3周、6周分别给予大鼠1瓶纯水和1瓶2％蔗糖水，均为50g，让大鼠自由饮用60分钟后移走两瓶水并分别称重，糖水偏爱＝糖水消耗/总液体消耗×100％。
脑组织单胺类递质的检测
各组大鼠末次给药30min后处死，冰上迅速剥离大脑皮层部位，称重后加入500μl0.1mol/L HClO4(含0.3mol/L Na2EDTA，0.5mmol无水亚硫酸钠，4℃预冷)，超声均浆，1000r/min高速离心10min，取上清200μl，1000r/min再次离心10min，取20μl进样检测单胺类神经递质及其主要代谢产物浓度，包括：5-HT，DA，NE，5-HIAA。待测样品于-80℃保存。
外周血细胞因子的检测
各组大鼠末次给药30min后处死，收集外周血清，按照ELISA试剂盒操作说民，检测外周血细胞因子水平，包括：IL-6、IL-1β、IFN-γ。待测样品于-80℃保存。
大鼠NK细胞的分离与培养
正常SD大鼠椎脱臼法处死，取出脾脏，剪碎脾组织，200目钢筛内轻轻研磨，以无血清RPMI-1640培养基冲洗洗筛网，4℃、1500r/min离心5min，收集脾细胞沉淀。加入2ml红细胞裂解液，充分混匀，室温反应5min，间歇轻轻振荡。加入PRMI-1640约10ml终止裂解，4℃1500r/min离心5min，弃上清，重悬细胞即为脾单个核细胞。使用大鼠脾脏NK细胞分离试剂盒，从新鲜制备的脾脏单个核细胞中分离NK细胞，收获大鼠NK细胞清洗后重悬进行流式表型测定以CD3-CD56+作为标记(见图3)。收集分离的大鼠NK细胞，用含10％小牛血清的RPMI-1640完全培养液重悬，调整细胞密度为1×107/ml，使用NK细胞扩增培养试剂盒，10～14天扩增培养后收获细胞，清洗细胞并调整细胞密度(1.5×106/ml)重悬于生理盐水中待用。
NK细胞联合氟西汀治疗大鼠抑郁症模型
将上述抑郁模型大鼠18只随机分为3组，每组6只，分别为：模型组、氟西汀组、氟西汀+NK细胞组。模型组给予生理盐水；氟西汀组大鼠灌胃给药剂量为3.5mg/kg(临用时以水配成所需浓度的混悬液)；氟西汀+NK细胞组大鼠除进行上述剂量氟西汀给药外进行两次NK细胞尾静脉输注(分离获得大鼠NK细胞，重悬于生理盐水中，进行两次细胞输注，每次1ml，前后间隔48h，细胞总数＝3×106)，氟西汀连续给药3周。
(2)统计学处理
采用GraphPad Prism5统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(x-±s)表示，采用t检验；技术资料以率(％)表示，采用X2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。
(3)实验结果
NK细胞联合氟西汀治疗改善大鼠CUMS抑郁样行为
随机给予模型组大鼠各种应激因子3周后，进行抑郁样行为学指标评价，成功建立大鼠CUMS模型(图4)，经NK细胞联合氟西汀治疗3周后，大鼠抑郁样行为显著改善(表1)。
表1NK细胞联合氟西汀治疗对大鼠CUMS模型抑郁样行为的影响(x-±s)
Figure GDA0001115355000000051
Control.正常对照组，CUMS.慢行轻度不可预见性抑郁症模型组，Flu.氟西汀组
(3.5mg/kg)NK+Flu.NK细胞联合氟西汀(3.5mg/kg)治疗组，与CUMS模型组相比＊p<0.05，＊＊p<0.01。
NK细胞联合氟西汀治疗可提高CUMS大鼠皮层单胺类递质的浓度
大鼠CUMS模型组皮层单胺类递质(5-HT，DA，NE)低于正常对照组，经NK细胞联合氟西汀治疗3周后，治疗组(氟西汀组或NK+氟西汀组)大鼠皮层单胺类递质(5-HT，DA，NE)浓度与CUMS模型组相比有显著提高；与单用氟西汀组相比，NK+氟西汀治疗组5-HT的浓度有进一步提高(表2)。
NK细胞联合氟西汀治疗可改善CUMS大鼠免疫状态
大鼠CUMS模型组外周血炎性细胞因子(IL-6、IL-1β、IFN-γ)水平明显高于正常对照组，经NK细胞联合氟西汀治疗3周后，CUMS大鼠外周血炎性细胞因子(IL-6、IL-1β、IFN-γ)水平显著降低(图5)。
表2NK细胞联合氟西汀治疗对大鼠CUMS模型皮层单胺类递质的影响(x-±s)
Figure GDA0001115355000000052
Control.正常对照组，CUMS.慢行轻度不可预见性抑郁症模型组，Flu.氟西汀组(3.5mg/kg)NK+Flu.NK细胞联合氟西汀(3.5mg/kg)治疗组，与CUMS模型组相比＊p<0.05，＊＊p<0.01,与Flu氟西汀组相比#p<0.05。
实施例2
照射后NK-92细胞联合帕罗西汀改善患者抑郁症状
NK-92细胞培养
人NK-92细胞系购置于中国科学院细胞库/干细胞库，细胞重悬于X-Vivo 10无血清培养液含有500U/ml人重组IL-2,0.6mm L-天冬氨酸，3mm L-谷酰氨酸，1.8mm L-丝氨酸和2.5％人AB血浆，调整细胞密度为2.5×105/ml，25ml培养在1L Vuelife培养袋内，每3d进行补液，维持细胞密度为2.5×105/ml，每天进行轻微振荡减少细胞聚集，15～17天后收集细胞，质量安全检测，NK-92细胞重悬于生理盐水，待回输(确保回输前48h进行含有IL-2的新鲜培养液补液)，回输前NK-92细胞进行500cGy照射，检测NK-92生存状况(照射后NK-92细胞杀伤活性见图6)，待细胞输注。
照射后NK-92细胞联合帕罗西汀治疗抑郁症患者
抑郁症患者，男，56岁，无其他严重疾病，汉密尔顿抑郁量表(HAMD)评分为22分，病程4年，接受NK细胞治疗前一直服用帕罗西汀、奥氮平、阿普唑仑和奋乃静等抗抑郁药物，但病情未得到控制。接受1个疗程的照射后NK-92细胞免疫治疗，共进行两次细胞输注，每次150ml含1.5×109NK细胞，前后间隔48h，细胞总数3×109，细胞输注前后2小时，各行200ml/h，2h生理盐水输注，同时服用帕罗西汀40mg/d，症状逐渐缓解，1个月后患者HAMD评分为5分，患者抑郁症状彻底改善；治疗前患者CD4+/CD8+比值为1.7，治疗后CD4+/CD8+比值为2.1，治疗前CD56+细胞百分比为2.6％，治疗后为9.5％，患者免疫状态提高，外周血自然杀伤细胞百分比提高(见表3)。目前患者已停服抗抑郁药物，精神状态及心理情绪维持正常。
表3抑郁症患者治疗前后HAMD评分及外周血淋巴细胞亚群的变化
Figure GDA0001115355000000061

Claims (2)

1.然杀伤细胞联合抗抑郁药物在制备改善抑郁症状的药物中的应用；所述自然杀伤细胞为无ADCC效应、免疫表型为CD56highCD16-的NK细胞；所述抗抑郁药物选自氟西汀和帕罗西汀；所述抑郁症状为心境低落、思维迟钝、意志活动减退、认知功能损伤以及睡眠障碍、乏力、食欲减退、体重下降、性欲减退、身体任何部位的疼痛。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述自然杀伤细胞为NK-92细胞系。
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