CN108219001A

CN108219001A - 趋化因子-免疫球蛋白融合多肽、组合物及其制备和使用方法

Info

Publication number: CN108219001A
Application number: CN201810054247.XA
Authority: CN
Inventors: 詹姆斯·W·利拉德
Original assignee: Ji'ante Technology Co
Current assignee: Ji'ante Technology Co
Priority date: 2011-06-01
Filing date: 2012-05-25
Publication date: 2018-06-29
Also published as: WO2012166588A2; US8541564B2; CN103857406B; US20130315909A1; AU2012262491A1; US20120308565A1; US8987210B2; CN103857406A; HK1198126A1; EP2714065A2; JP2014518632A; EP2714065A4; WO2012166588A3

Abstract

本申请涉及趋化因子‑免疫球蛋白融合多肽和趋化因子‑聚合物偶联物。所述融合多肽和偶联物可以用于治疗趋化因子受体介导的病症和调节炎症、炎性细胞运动性、癌症细胞运动性或癌症细胞存活。

Description

趋化因子-免疫球蛋白融合多肽、组合物及其制备和使用方法

本发明是原申请号为201280032847.7，申请日为2012年05月25日，原发明名称为：趋化因子-免疫球蛋白融合多肽、组合物及其制备和使用方法的分案申请。

本申请要求于2011年6月1日提交的美国临时专利申请61/492,260 的优先权。在此通过参考方式引入前述申请的全部内容。

技术领域

本申请主要涉及能够用于治疗趋化因子受体介导的病症和调节炎症、炎性细胞运动性、癌症细胞运动症或癌症细胞存活的组合物。

背景技术

趋化因子是趋化性细胞因子，具有6kDa至15kDa的分子量，被许多各种细胞释放来吸引并激活巨噬细胞、T和B淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞以及其它细胞类型。存在4种类型的趋化因子，即CXC、CC、C和CX3C，这根据氨基酸序列中的前两个半胱氨酸是否被单个氨基酸分开(CXC)或者是相邻的(CC)。不像其它趋化因子，C趋化因子只有两个半胱氨酸；1个N-末端半胱氨酸和1个下游半胱氨酸。唯一CX3C趋化因子，即CX3CL1，具有位于两个N-末端半胱氨酸之间的三个氨基酸。CXC趋化因子，如白细胞介素-8(IL-8/CXCL8)，嗜中性粒细胞激活蛋白-2(NAP-2/CXCL7)及黑色素瘤生长刺激活性蛋白 (MGSA/CXCL1)主要对嗜中性粒细胞和T淋巴细胞具有趋化性，而CC 趋化因子，如RANTES/CCL5、MIP-1α/CCL3、MIP-1β/CCL4、单核细胞趋化蛋白(MCP-1/CCL2、MCP-2/CCL8、MCP-3/CCL7、MCP-4/CCL13和 MCP-5/CCL12)和嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)(-1/CCL11和-2/CCL24) 对巨噬细胞、T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞和嗜碱性粒细胞以及其它细胞类型具有趋化性。还存在趋化因子淋巴细胞趋化因子-1/XCL1、淋巴细胞趋化因子-2/XCL2(均为C趋化因子)和分形素 (fractalkine)/CX3CL1(CX3C趋化因子)，它们不属于任何主要的趋化因子亚家族CXC和CC。

趋化因子结合至属于G-蛋白偶联的七跨膜域蛋白家族的被称为“趋化因子受体”的特异性细胞表面受体。一旦结合至它们的同源配体，趋化因子受体即通过所关联的三聚体G蛋白转导胞内信号，导致细胞内钙浓度快速增加、细胞形状变化、细胞粘附分子表达增加、细胞脱颗粒并促进细胞迁移以及其它反应。

趋化因子受体一直被认为是炎性、感染性及免疫调节性病症与疾病，包括癌症、哮喘和变应性疾病以及自身免疫性病理如类风湿性关节炎和动脉粥样硬化等的重要介质。例如，趋化因子受体CCR3在吸引嗜酸性粒细胞至变应性炎症部位并随后激活这些细胞中起着关键的作用。CCR3 的趋化因子配体诱导细胞内钙离子浓度的迅速增加，细胞粘附分子表达的增加、细胞脱颗粒并促进嗜酸性粒细胞迁移。另一种趋化因子受体 CCR2有助于癌演进并能够诱导肿瘤细胞的增殖或趋化作用。因此，调节趋化因子受体的媒介将有助于这样的病症和疾病。

趋化因子还参与细胞增殖性病症的发病机制，包括例如肿瘤血管生成和生长的诱导。许多肿瘤细胞还显示出表达趋化因子受体，如CXCR1、 CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CX3CL1、CCR2、 CCR5和CCR9，因此肿瘤细胞还可以在响应分泌的趋化因子时入侵、刺激它们自身生长和/或迁移。

趋化因子对将白细胞募集到损伤组织是关键的，并在伤口愈合过程中起重要作用。糖尿病患者的受损伤口愈合伴随有早期炎性细胞浸润的降低，但嗜中性粒细胞和巨噬细胞的持久性会导致慢性未愈合伤口。趋化因子可能对糖尿病伤口愈合的许多不同方面，包括血管生成、细胞外基质形成、再上皮化和生长因子表达的受损具有直接和炎性介导性作用。伤口中的某些趋化因子受体表达可加速愈合，并在手术、慢性溃疡、以及其它病状的情况下是有利的。

因此，趋化因子受体是对新型抗炎和抗肿瘤以及血管生成抑制、血管生成和伤口愈合剂的开发具有前途的靶标。因此，仍需要能够调节趋化因子受体活性的组合物。

发明内容

本申请的一个方面涉及一种具有趋化因子部分和免疫球蛋白部分的分离的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽，其中所述趋化因子部分包含选自由如下趋化因子组成的组中的趋化因子：人类CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、 CCL4L1、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14-1、CCL14-2、 CCL15、CCL16、CCL17、CCL 18、CCL19、CCL20-1、CCL20-2、CCL21、 CCL22、CCL23-1、CCL23-1、CCL24、CCL25-1、CCL25-2、CCL25-3、 CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、 CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、 CXCL16、XCL1、XCL2、CX3CL1及其功能性变体，并且其中所述免疫球蛋白部分包含选自由以下部分组成的组的肽：人类IgG1的恒定区、人类IgG2的恒定区、人类IgG3的恒定区、人类IgG4的恒定区及其功能性变体。在一个实施方式中，所述分离的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽是聚乙二醇化趋化因子-免疫球蛋白融合多肽。

在一个具体实施方式中，所述趋化因子-免疫球蛋白融合多肽选自由如下融合多肽组成的组：CCL2-IgG1Fc、CCL2(5-76)-IgG1Fc、 CCL2(5-76K/H→A)-IgG1Fc、CCL2-IgG4Fc、CCL2(5-76)-IgG4Fc、 CCL2(5-76K/H→A)-IgG4Fc、CCL7-IgG1Fc、CCL7(5-76)-IgG1Fc、 CCL7(5-76K/H→A)-IgG1Fc、CCL7-IgG4Fc、CCL7(5-76)-IgG4Fc、 CCL7(5-76K/H→A)-IgG4Fc、CCL8-IgG1Fc、CCL8(5-76)-IgG1Fc、 CCL8(5-76K/H/R→A)-IgG1Fc、CCL8-IgG4Fc、CCL8(5-76)-IgG4Fc、 CCL8(5-76K/H/R→A)-IgG4Fc、CCL13-IgG1Fc、CCL13(5-75)-IgG1Fc、 CCL13(5-75K/H→A)-IgG1Fc、CCL13-IgG4Fc、CCL13(5-75)-IgG4Fc、 CCL13(5-75K/H→A)-IgG4Fc、CCL25-IgG1Fc、CCL25(4-127)-IgG1Fc、CCL25(4-127K/H/R→A)-IgG1Fc、CCL25-IgG4Fc、CCL25(4-127)-IgG4Fc、 CCL25(4-127K/H/R→A)-IgG4Fc、CXCL11-IgG1Fc、 CXCL11(4-73)-IgG1Fc、CXCL11(4-73K/R→A)-IgG1Fc、CXCL11-IgG4Fc、 CXCL11(4-73)-IgG4Fc、CXCL11(4-73K/R→A)-IgG4Fc、 CXCL12α-IgG1Fc、CXCL12α(3-67)-IgG1Fc、CXCL12α(3-67K/R→A)-IgG1Fc、CXCL12α-IgG4Fc、 CXCL12α(3-67)-IgG4Fc、CXCL12α(3-67K/R→A)-IgG4Fc、 CXCL13-IgG1Fc、CXCL13(3-87)-IgG1Fc、CXCL13(3-87K/R→A)-IgG1Fc、 CXCL13-IgG4Fc、CXCL13(3-87)-IgG4Fc和 CXCL13(3-87K/R→A)-IgG4Fc。

本申请的另一个方面涉及一种编码具有趋化因子部分和免疫球蛋白部分的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽的分离的多核苷酸，其中所述趋化因子部分包含选自由如下趋化因子组成的组的趋化因子：人类CCL1、 CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、 CCL15、CCL16、CCL17、CCL19、CCL21、CCL23、CCL24、CCL25、 CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、 CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、 XCL1、XCL2、CX3CL1及其功能性变体，并且其中所述免疫球蛋白部分包含选自由如下部分组成的组的肽：人类IgG1的恒定区(IgG1Fc)、人类IgG2的恒定区(IgG2Fc)、人类IgG3的恒定区(IgG3Fc)、人类IgG4的恒定区(IgG4Fc)及其功能性变体。

在一个具体的实施方式中，编码趋化因子-免疫球蛋白融合多肽的所述分离的多核苷酸选自由如下多核苷酸组成的组：CCL2-IgG1Fc、 CCL2(5-76)-IgG1Fc、CCL2(5-76K/H→A)-IgG1Fc、CCL2-IgG2Fc、 CCL2(5-76)-IgG2Fc、CCL2(5-76K/H→A)-IgG2Fc、CCL2-IgG3Fc、 CCL2(5-76)-IgG3Fc、CCL2(5-76K/H→A)-IgG3Fc、CCL2-IgG4Fc、 CCL2(5-76)-IgG4Fc、CCL2(5-76K/H→A)-IgG4Fc、CCL7-IgG1Fc、 CCL7(5-76)-IgG1Fc、CCL7(5-76K/H→A)-IgG1Fc、CCL7-IgG2Fc、 CCL7(5-76)-IgG2Fc、CCL7(5-76K/H→A)-IgG2Fc、CCL7-IgG3Fc、CCL7(5-76)-IgG3Fc、CCL7(5-76K/H→A)-IgG3Fc、CCL7-IgG4Fc、 CCL7(5-76)-IgG4Fc、CCL7(5-76K/H→A)-IgG4Fc、CCL8-IgG1Fc、 CCL8(5-76)-IgG1Fc、CCL8(5-76K/H/R→A)-IgG1Fc、CCL8-IgG1Fc、 CCL8(5-76)-IgG1Fc、CCL8(5-76K/H/R→A)-IgG1Fc、CCL8-IgG2Fc、 CCL8(5-76)-IgG2Fc、CCL8(5-76K/H/R→A)-IgG2Fc、CCL8-IgG3Fc、 CCL8(5-76)-IgG3Fc、CCL8(5-76K/H/R→A)-IgG3Fc、CCL8-IgG4Fc、 CCL8(5-76)-IgG4Fc、CCL8(5-76K/H/R→A)-IgG4Fc、CCL13-IgG1Fc、 CCL13(5-75)-IgG1Fc、CCL13(5-75K/H→A)-IgG1Fc、CCL13-IgG2Fc、 CCL13(5-75)-IgG2Fc、CCL13(5-75K/H→A)-IgG2Fc、CCL13-IgG3Fc、 CCL13(5-75)-IgG3Fc、CCL13(5-75K/H→A)-IgG3Fc、CCL13-IgG4Fc、 CCL13(5-75)-IgG4Fc、CCL13(5-75K/H→A)-IgG4Fc、CCL25-IgG1Fc、 CCL25(4-127)-IgG1Fc、CCL25(4-127K/H/R→A)-IgG1Fc、CCL25-IgG2Fc、 CCL25(4-127)-IgG2Fc、CCL25(4-127K/H/R→A)-IgG2Fc、CCL25-IgG3Fc、 CCL25(4-127)-IgG3Fc、CCL25(4-127K/H/R→A)-IgG3Fc、CCL25-IgG4Fc、 CCL25(4-127)-IgG4Fc、CCL25(4-127K/H/R→A)-IgG4Fc、 CXCL11-IgG1Fc、CXCL11(4-73)-IgG1Fc、CXCL11(4-73K/R→A)-IgG1Fc、 CXCL11-IgG2Fc、CXCL11(4-73)-IgG2Fc、CXCL11(4-73K/R→A)-IgG2Fc、CXCL11-IgG3Fc、CXCL11(4-73)-IgG3Fc、CXCL11(4-73K/R→A)-IgG3Fc、 CXCL11-IgG4Fc、CXCL11(4-73)-IgG4Fc、CXCL11(4-73K/R→A)-IgG4Fc、 CXCL12α-IgG1Fc、CXCL12α(3-67)-IgG1Fc、 CXCL12α(3-67K/R→A)-IgG1Fc、CXCL12α-IgG2Fc、 CXCL12α(3-67)-IgG2Fc、CXCL12α(3-67K/R→A)-IgG2Fc、 CXCL12α-IgG3Fc、CXCL12α(3-67)-IgG3Fc、 CXCL12α(3-67K/R→A)-IgG3Fc、CXCL12α-IgG4Fc、 CXCL12α(3-67)-IgG4Fc、CXCL12α(3-67K/R→A)-IgG4Fc、 CXCL13-IgG1Fc、CXCL13(3-87)-IgG1Fc、CXCL13(3-87K/R→A)-IgG1Fc、 CXCL13-IgG2Fc、CXCL13(3-87)-IgG2Fc、CXCL13(3-87K/R→A)-IgG2Fc、 CXCL13-IgG3Fc、CXCL13(3-87)-IgG3Fc、CXCL13(3-87K/R→A)-IgG3Fc、 CXCL13-IgG4Fc、CXCL13(3-87)-IgG4Fc和CXCL13(3-87K/R→A)-IgG4Fc。

本申请的另一个方面涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含： (1)本申请的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽或编码本申请的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽的表达载体，和(2)药学上可接受的载体。

本申请的又一个方面涉及一种用于治疗受试者中的趋化因子受体介导的病症的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的本申请的药物组合物。

本申请的另一个方面涉及一种用于调节受试者中的炎症的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的本申请的药物组合物。

本申请的另一个方面涉及一种用于治疗受试者中的趋化因子受体介导的病症的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的聚乙二醇化趋化因子，其中所述趋化因子选自由如下趋化因子组成的组：人类CCL1、 CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、 CCL15、CCL16、CCL17、CCL19、CCL21、CCL23、CCL24、CCL25、 CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、 CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、 XCL1、XCL2、CX3CL1及其功能性变体。

在另一个实施方式中，所述聚乙二醇化趋化因子选自由如下聚乙二醇化趋化因子组成的组：CCL2-PEG、var-CCL2-PEG、CCL7-PEG、 var-CCL7-PEG、CCL8-PEG、var-CCL8-PEG、CCL13-PEG、 var-CCL13-PEG、CCL25-PEG、var-CCL25-PEG、CXCL11-PEG、 var-CXCL11-PEG、CXCL13-PEG、var-CXCL13-PEG、CXCL16-PEG和 var-CXCL16-PEG。

附图说明

图1A描绘了表达载体pCCL2.hIgG1Fc。Fc区包含IgG重链的CH2 和CH3域和铰链区。铰链作为Fc融合蛋白的两个部分之间的柔性间隔子，使该分子的每个部分能够独立地发挥作用。hEF1-HTLV prom是复合启动子，包含延伸因子-1α(EF-1α)核心启动子1以及人类T细胞白血病病毒(HTLV)类型1长末端重复序列2(Long Terminal Repeat2)的R区段和U5序列(R-U5’)的一部分。EF-1α启动子表现出强的活性，并使体内转基因产生长久持续性表达。R-U5’已被偶联到所述EF-1α核心启动子，以提高 RNA的稳定性。MCS：多克隆位点。SV40pAn：猿猴(Simina)病毒40 晚期多聚腺苷酸化信号。ori：最小的大肠杆菌(E.coli)复制起始序列。CMV enh/hFerL prom：该复合启动子结合人类巨细胞病毒立即早期基因1增强子和人类铁蛋白轻链基因的核心启动子。这种普遍存在的启动子驱动 Zeocin^TM抗性基因在哺乳动物细胞中表达。EM2KC是细菌启动子，能够使抗生素抗性基因在大肠杆菌中进行组成型表达。EM2KC位于内含子中，并在哺乳动物细胞中拼接出。Zeo：Zeocin^TM的抗性由来自印度斯坦链异壁菌(Streptoalloteichus hindustanus)的Sh ble基因赋予。同一抗性基因赋予哺乳动物细胞和大肠杆菌中的选择。βGlo pAn：人类β-珠蛋白 3’UTR和多聚腺苷酸化序列可以使转基因转录4的有效捕获。

图1B描绘了表达载体pCCL2(5-76).hIgG1Fc。

图1C显示了表达载体pCCL2.hIgG1Fc的核苷酸序列。

图1D显示了表达载体pCCL2(5-76).hIgG1Fc的核苷酸序列。

图1E显示了带有丙氨酸取代以除去GAG结合位点-Lys和His的表达载体pCCL2(5-76).hIgG1Fc的核苷酸序列。

图2A描绘了表达载体pCCL7.hIgG1Fc。

图2B描绘了表达载体pCCL7(5-76).hIgG1Fc。

图2C显示了表达载体pCCL7.hIgG1Fc的核苷酸序列。

图2D显示了表达载体pCCL7(5-76).hIgG1Fc的核苷酸序列。

图2E显示了带有丙氨酸取代以除去GAG结合位点-Lys和His的表达载体pCCL7(5-76).hIgG1Fc的核苷酸序列。

图3A描绘了表达载体pCCL8.hIgG1Fc。

图3B描绘了表达载体pCCL8(5-76).hIgG1Fc。

图3C显示了表达载体pCCL8.hIgG1Fc的核苷酸序列。

图3D显示了表达载体pCCL8(5-76).hIgG1Fc的核苷酸序列。

图3E显示了带有丙氨酸取代的表达载体pCCL8(5-76).hIgG1Fc的核苷酸序列。

图4A描绘了表达载体pCCL13.hIgG1Fc。

图4B描绘了表达载体pCCL13(5-75).hIgG1Fc。

图4C显示了该表达载体pCCL13.hIgG1Fc的核苷酸序列。

图4D显示了表达载体pCCL13(5-75).hIgG1Fc的核苷酸序列。

图4E显示了带有丙氨酸取代以除去GAG结合位点-Lys和His的表达载体pCCL13(5-76).hIgG1Fc的核苷酸序列。

图5A描绘了表达载体pCCL25.hIgG1Fc。

图5B描绘了表达载体pCCL25(4-127).hIgG1Fc。

图5C显示了表达载体pCCL25.hIgG1Fc的核苷酸序列。

图5D显示了表达载体pCCL25(4-127).hIgG1Fc的核苷酸序列。

图5E显示了带有丙氨酸取代以除去GAG结合位点-Lys和His的表达载体pCCL25(4-127).hIgG1Fc的核苷酸序列。

图6A描绘了表达载体pCXCL11.hIgG1Fc。

图6B描绘了表达载体pCXCL11(4-73).hIgG1Fc。

图6C显示表达载体pCXCL11.hIgG1Fc的核苷酸序列。

图6D显示了表达载体pCXCL11(4-73).hIgG1Fc的核苷酸序列。

图6E显示了带有丙氨酸取代以除去GAG结合位点-Lys和His的表达载体pCXCL11(4-127).hIgG1Fc的核苷酸序列。

图7A描绘了表达载体pCXCL11.hIgG4Fc。

图7B描绘了表达载体pCXCL11(4-73).hIgG4Fc。

图7C显示了表达载体pCXCL11.hIgG4Fc的核苷酸序列。

图7D显示了表达载体pCXCL11(4-73).hIgG4Fc的核苷酸序列。

图7E显示了带有丙氨酸取代以除去GAG结合位点-Lys和His的表达载体pCXCL11(4-127).hIgG4Fc的核苷酸序列。

图8A描绘了表达载体pCXCL13.hIgG1Fc。

图8B描绘了表达载体pCXCL13(3-87).hIgG1Fc。

图8C显示了表达载体pCXCL13.hIgG1Fc的核苷酸序列。

图8D显示了该表达载体pCXCL13(4-73).hIgG1Fc的核苷酸序列。

图8E显示了带有丙氨酸取代以除去GAG结合位点-Lys和His的表达载体pCXCL13(4-127).hIgG1Fc的核苷酸序列。

图9A描绘了表达载体pCXCL13.hIgG4Fc。

图9B描绘了表达载体pCXCL13(3-87).hIgG4Fc。

图9C显示了表达载体pCXCL13.hIgG4Fc的核苷酸序列。

图9D显示了表达载体pCXCL13(3-87).hIgG4Fc的核苷酸序列。

图9E显示了带有丙氨酸取代以除去GAG结合位点-Lys和His的表达载体pCXCL11(4-127).hIgG4Fc的核苷酸序列。

图10描绘了表达载体pCXCL16(47-114).hIgG1Fc。

图11描绘了指示潜在的聚乙二醇化位点的CXCL11的结构的图。

图12显示了在表1中列出的趋化因子和人类IgG Fc片段的氨基酸序列。

具体实施方式

提供下面详细的说明以使任何所属技术领域的技术人员能够制造和使用本发明。用于解释的目的，阐述了特定的术语以提供对本发明的彻底理解。然而，对本领域技术人员而言应当明了的是，对实践本发明而言并不要求这些具体细节。具体应用的描述仅作为代表性的实施例提供。本发明并不意在限于所示实施例，而是应被赋予与本文所公开的原理和特征相吻合的最广泛的可能范围。

除非另有定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。虽然类似或者等同于在此描述的任何方法、装置和材料都可以用于实践或检测本文所公开的主题，但是现在仍对代表性方法、装置和材料进行描述。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。

除非另有指明，否则表示成分，反应条件等在本说明书和权利要求书中使用的量的所有数值在所有情况中都应被理解为被术语“约”所修饰。因此，除非有相反的指示，否则在本说明书和所附的权利要求书中给出的数值参数是近似值，其可根据寻求由目前所公开的主题来获得的所需性能变化。

本申请主要涉及用于治疗趋化因子受体介导的病症和调节炎症的组合物和方法。特别地，本申请涉及趋化因子-免疫球蛋白融合多肽、趋化因子-聚合物偶联物及其用来调节免疫性、癌演进和炎症以及治疗趋化因子受体介导的病症，包括组织再生、伤口修复、干细胞动态平衡、细胞增殖性病症和炎症的用途。

本文所使用的术语“约”在指质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的值或量的时候是指涵盖从所指定的量发生的偏差，一些实施方式 ±20％，在一些实施例±10％，在一些实施方式±5％，在一些实施方式±1％，在一些实施方式±0.5％，并且在一些实施方式±0.1％的偏差，因为这样的偏差对执行所公开的方法是适合的。

本文所使用的术语“处理”或“治疗”或“疗法”是指减轻或消除病症和/ 或其伴随症状的方法。本文所使用的术语“预防”、“防止”或“阻止”是指阻止受试者获得病症和/或其伴随症状的方法。在某些实施方式中，术语“预防”、“防止”或“阻止”是指降低获得病症和/或其伴随症状的风险的方法。

在药理学意义上，在本发明的情况中，组合物的“有效量”是指在预防或者治疗组合物治疗有效的病症中有效的量。“病症”指任何受益于该组合物治疗的病状。

用于治疗目的的“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人类、非人类的灵长类动物、家畜和牲畜以及动物园、运动或宠物动物，如狗、马、猫、牛等。优选的是，所述哺乳动物是人类。

术语“抑制”是一个相对的术语，如果反应或病状在施用一种试剂后在数量上减少，或者如果在施用该试剂后与参考试剂相比减少了，则该试剂抑制了反应或病状。类似地，术语“预防”并不一定意味着试剂完全消除反应或病状，而是只要该反应或病状中的至少一个特性被消除即可。因此，减少或防止感染或反应如病理学反应的组合物可以但不必完全消除这种感染或反应，而是只要所述感染或反应与没有该试剂或者与参考试剂相比可测量地减少，例如至少约50％，如至少约70％，或约80％，或甚至为约90％(即减少至10％或更小)的感染或反应即可。

趋化因子-免疫球蛋白融合多肽

趋化因子已被证明介导众多涉及运动、侵袭、粘附、增殖和存活的细胞功能。以适当的水平表达，这些趋化性细胞因子促进适当的伤口愈合，新血管生成或免疫力。如果表达不当，这些因子可以决定(dicate) 慢性疾病如瘢痕瘤形成、血管生成、癌细胞的转移/耐药性、自身免疫性疾病、移植排斥、炎症(如关节炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、多发性硬化、慢性阻塞性肺病(COPD)等)、糖尿病。有益和有害的功能可以通过结合和激活趋化因子受体进行介导，所述趋化因子分为类型A、G蛋白偶联受体。

很多小分子拮抗剂已构建成阻断这些受体的作用。值得注意的是，许多这些化合物对它们的标靶具有高亲合力(5-50nM)和特异性。然而，这些抑制剂具有两个主要局限：(i)疏水性和可能的肝保留/毒性；和(ii)相对于短的血清半衰期或生物利用度(<6小时)。

本申请提供了用于临床用途的分离的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽。所述融合多肽包含融合到人类免疫球蛋白(Ig)G的恒定区(即，CH2 和CH3)或其变体的野生型人类趋化因子或其变体。所述趋化因子-免疫球蛋白融合多肽可以特异性地结合到一种或多种特定的趋化因子受体，从而调节该受体的一种或多种生物活性(例如，受体激活)。

本发明一方面涉及具有趋化因子部分和免疫球蛋白部分的分离的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽，其中所述趋化因子部分包含选自由如下部分组成的组的趋化因子：人类CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL4L1、 CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14-1、CCL14-2、CCL15、 CCL16、CCL17、CCL 18、CCL19、CCL20-1、CCL20-2、CCL21、CCL22、 CCL23-1、CCL23-1、CCL24、CCL25-1、CCL25-2、CCL25-3、CCL26、 CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、 CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、 CXCL16、XCL1、XCL2、CX3CL1及其功能性变体，并且其中所述免疫球蛋白部分包含选自由如下部分组成的组的肽：人类IgG1的恒定区(Fc)、人类IgG2的恒定区、人类IgG3恒定区、人类IgG4的恒定区及其功能性变体。上述趋化因子和人类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc区的完整的氨基酸序列都列在下面的表1中并在图12显示。

表1

不希望受到任何具体操作理论的束缚，免疫球蛋白区域可以增加融合多肽的血清半衰期或生物利用度，并可以选择Fc部分的精确的多肽序列，以使血清半衰期和/或生物利用度最大化。此外，来自不同的IgG亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的Fc区表现出不同的免疫学活性，因此，IgG Fc区可根据所希望的免疫学活性进行选择。例如，IgG1的Fc区能激活补体，而IgG4的Fc区具有降低的补体活性。

因此，可以根据各区域表现出来的所需的免疫学活性为具体用途来选择具体的Fc区。在一些具体的实施方式中，Fc区可以是人类IgG1、 IgG2、IgG3或IgG4的Fc区。因此，趋化因子-免疫球蛋白融合多肽在增强免疫力、抑制自身免疫、抑制炎症和/或抑制增殖性病症细胞的生长/ 转移上具有效用。本申请还提供了分离的多核苷酸，其编码本文所公开的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽和能够体内表达所述趋化因子-免疫球蛋白融合多肽的表达载体。

术语“分离的”在用于蛋白质或核苷酸时是指该蛋白质或多核苷酸基本上不含有在天然状态下与它们关联的其它细胞组分。它可以处于均质状态，不过它可以处于干燥或在水溶液中。均质性和分子是否是分离的可以使用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法等分析化学技术来测定。作为存在于制剂中的主要物种的蛋白基本上分离的。术语“分离的” 指蛋白或多核苷酸在电泳凝胶中实质上形成一个条带。特别地，这意味着该蛋白质或多核苷酸在一些实施方式中为至少约50％纯度，在一些实施方式中为至少约85％纯度，并且在一些实施方式中为至少约99％纯度。

术语“多核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，不管是单链形式还是双链形式。除非特别限定，否则该术语涵盖包含具有与基准核酸类似的结合性能并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢的天然核苷酸的已知类似物的核酸。除非另有说明，否则一个具体的核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子取代可以通过生成一个或者多个选定的(或者所有的)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现。术语“多核苷酸”或“多核苷酸序列”也可以与基因、开放阅读框(ORF)、该基因编码的cDNA和mRNA互换使用。

术语“多肽”、“蛋白”和“肽”在本文中可互换使用，是指20蛋白氨基酸或氨基酸类似物的聚合物，而不管其大小或功能如何。虽然“蛋白”通常被用来指相对较大的多肽，而“肽”通常被用来指小的多肽，但是这些术语在本领域中的使用是重叠和变化的。本文所使用的术语“多肽”是指肽、多肽和蛋白，除非另有说明。术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在指基因产物时在本文中可互换使用。因此，示例性的多肽包括基因产物、天然存在的蛋白、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段以及其它等同物、变体及其类似物。

所述趋化因子-免疫球蛋白融合多肽的趋化因子部分可以基于趋化因子受体或对其显示出结合特异性的受体进行选择。这提供了趋化因子- 免疫球蛋白融合多肽对一个或多个特定的趋化因子受体的选择性靶向，从而由此调节受体的激活以及随后的生物活性。表1(改编自Allen等 (2007)Annu.Rev.Immunol.25:787-820)提供了示例性的受体列表，所述受体可以被一个或多个趋化因子靶向，所述趋化因子可以被引入到目前公开的主题的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽中。

如表2中所公开的，某些趋化因子可以特异性地结合一个以上的趋化因子受体。例如，CXCL11可以特异性地结合至趋化因子受体 CXCR3-A、CXCR3-B、CXCR7和DARC/Duffy。因此，如果期望靶向多于一个的趋化因子受体，特定的趋化因子如CXC11可以被选择来引入当前公开的主题的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽中。在目前公开的主题的一些实施方式中，趋化因子-免疫球蛋白融合多肽可以包含选自由如下趋化因子部分组成的组的趋化因子部分：CCL2、CCL7、CCL8、CCL13、 CCL25、CXCL11、CXCL13及其突变。多肽的“突变”包括基准多肽的变体和片段。

表2：趋化因子受体和它们的配体

术语“功能性变体”是指与基准蛋白或多肽存在一个或多个氨基酸的差异，例如一个或多个氨基酸取代，但基本保持了基准蛋白或多肽的生物学功能的蛋白质或多肽。如本文所用的，趋化因子的功能性变体是保持原始的趋化因子的受体结合功能的变体，并且IgG的Fc区的功能性变体是保持原始Fc区的免疫学活性的变体。

多肽的功能性变体可以是原始的多肽的片段。术语“片段”在参照基准多肽使用时，是指这样的多肽，其与基准多肽本身相比其中有氨基酸残基缺失，但剩余的氨基酸序列通常与在基准多肽中的对应位置相同。此类缺失可以发生在基准多肽的氨基末端或羧基末端，或者两者兼而有之。片段通常具有至少3个、5个、6个、8个或10个氨基酸长度，至少14个氨基酸长度，至少20、30、40或50个氨基酸长度，至少75个氨基酸长度，或至少100、150、200或更多个氨基酸长度。

术语“功能性变体”还包括保守取代变体。术语“保守取代变体”是指包含这样的氨基酸残基序列的多肽，所述氨基酸残基序列与基准肽具有一个或多个保守氨基酸取代的差异，并保持如本文中所描述的基准肽的一些或者全部活性。“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被功能类似的残基取代的取代。保守取代的例子包括一种非极性(疏水性)残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另外的氨基酸的取代；一个带电荷或极性(亲水性)残基对另外的氨基酸的取代，例如精氨酸和赖氨酸之间的取代、谷氨酰胺和天冬酰胺之间的取代、苏氨酸和丝氨酸之间的取代；一个碱性残基如赖氨酸或精氨酸对另外氨基酸的取代；或一种酸性残基如天冬氨酸或谷氨酸对另外氨基酸的取代，或一个芳族残基例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸对另外氨基酸的取代。短语“保守取代变体”还包括这样的肽，其中一个残基被替换为化学衍生残基，条件是所得到的肽保持如本文中所描述的基准肽的一些或者全部活性。

在一些具体的实施方式中，本文所公开的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽包括趋化因子部分的功能性变体，其引入氨基酸取代以消除糖胺聚糖(例如肝素、层粘附蛋白、GAG)-结合，其由此可增加多肽的血清半衰期。例如，在一些实施例中，一个或多个丙氨酸可取代趋化因子部分的 GAG结合位点内的赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸。

本文所公开的在趋化因子序列中包括具有一个或多个突变的趋化因子变体的具体的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽相应地命名以指示具体的突变。例如，在趋化因子的名称之前的“var”(例如，var-CCL2)表示趋化因子部分具有改造突变从而导致不同于基准趋化因子序列(例如，CCL2) 的多肽序列的变体。由截断造成的片段突变表示截断后留下的序列。例如，在76个氨基酸的CCL2趋化因子的N-末端4个氨基酸的截断将被标为“var-CCL2”或“CCL2(5-76)”。一个或多个氨基酸取代所得的变体突变将以“X#Y”或“X→Y”的形式将在趋化因子名称之后标成括号 (parenthetical)，其中在基准多肽中的氨基酸X(采用单字母氨基酸代码标准，如本领域中已知的)在特定的残基(#)位置或者整个多肽或者多肽的特定区域(X→Y)(例如，如趋化因子多肽的GAG-结合区)被氨基酸Y所取代。在一些实施方式中，突变可以同时包括基准趋化因子多肽的片段和变体。这些突变体中在所命名的多肽中于趋化因子名称之后的括号中以连续示出。例如，“CCL2(5-76K/H→A)”表示这样的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽，其在趋化因子部分中包括在N-末端已被截断以除去残基1-4 并且还发生丙氨酸(A)代替序列中的赖氨酸(K)和组氨酸(H)的突变的突变体CCL2多肽。最后，参考命名法则，本文所公开的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽根据趋化因子部分(A)和免疫球蛋白部分(B)融合在一起(即 AB)进行命名。因此，例如，CCL2-IgG1Fc是指这样的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽，其包含与IgG类型1免疫球蛋白的Fc恒定区融合的野生型趋化因子CCL2趋化因子部分。

在一些实施方式中，本申请提供了融合至人类免疫球蛋白多肽的人类趋化因子多肽。在一些实施方式中，本申请提供了以下分离的新型趋化因子-免疫球蛋白融合多肽：CCL2-IgG1Fc、var-CCL2-IgG1Fc、 CCL2-IgG2Fc、var-CCL2-IgG2Fc、CCL2-IgG3Fc、var-CCL2-IgG3Fc、 CCL2-IgG4Fc、var-CCL2-IgG4Fc、CCL7-IgG1Fc、var-CCL7-IgG1Fc、 CCL7-IgG2Fc、var-CCL7-IgG2Fc、CCL7-IgG3Fc、var-CCL7-IgG3Fc、 CCL7-IgG4Fc、var-CCL7-IgG4Fc、CCL8-IgG1Fc、var-CCL8-IgG1Fc、 CCL8-IgG2Fc、var-CCL8-IgG2Fc、CCL8-IgG3Fc、var-CCL8-IgG3Fc、 CCL8-IgG4Fc、var-CCL8-IgG4Fc、CCL13-IgG1Fc、var-CCL13-IgG1Fc、CCL13-IgG2Fc、var-CCL13-IgG2Fc、CCL13-IgG3Fc、var-CCL13-IgG3Fc、 CCL13-IgG4Fc、var-CCL13-IgG4Fc、CCL25-IgG1Fc、var-CCL25-IgG1Fc、 CCL25-IgG2Fc、var-CCL25-IgG2Fc、CCL25-IgG3Fc、var-CCL25-IgG3Fc、 CCL25-IgG4Fc、var-CCL25-IgG4Fc、CXCL11-IgG1Fc、 var-CXCL11-IgG1Fc、CXCL11-IgG2Fc、var-CXCL11-IgG2Fc、 CXCL11-IgG3Fc、var-CXCL11-IgG3Fc、CXCL11-IgG4Fc、 var-CXCL11-IgG4Fc、CXCL13-IgG1Fc、var-CXCL13-IgG1Fc、 CXCL13-IgG2Fc、var-CXCL13-IgG2Fc、CXCL13-IgG3Fc、 var-CXCL13-IgG3Fc、CXCL13-IgG4Fc和var-CXCL13-IgG4Fc。

在一些具体实施方式中，本申请提供了以下分离的新型趋化因子-免疫球蛋白融合多肽：CCL2-IgG1Fc(SEQ ID NO:52)、CCL2(5-76)-IgG1Fc (SEQ ID NO:53)、CCL2(5-76K/H→A)-IgG1Fc(SEQ ID NO:54)、 CCL7-IgG1Fc(SEQ ID NO:55)、CCL7(5-76)-IgG1Fc(SEQID NO:56)、 CCL7(5-76K/H→A)-IgG1Fc(SEQ ID NO:57)、CCL8-IgG1Fc(SEQ ID NO:58)、CCL8(5-76)-IgG1Fc(SEQ ID NO:59)、CCL8(5-76K/H→A)-IgG1Fc (SEQ ID NO:60)、CCL13-IgG1Fc(SEQ ID NO:61)、CCL13(5-75)-IgG1Fc (SEQ ID NO:62)、CCL13(5-75K/H→A)-IgG1Fc(SEQ ID NO:63)、 CCL25-IgG1Fc(SEQ ID NO:64)、CCL25(4-127)-IgG1Fc(SEQ IDNO:65)、 CCL25(4-127K/H→A)-IgG1Fc(SEQ ID NO:66)、CXCL11-IgG1Fc(SEQ ID NO:67)、CXCL11(4-73)-IgG1Fc(SEQ ID NO:68)、 CXCL11(4-73K/H→A)-IgG1Fc(SEQ ID NO:69)、CXCL11-IgG4Fc(SEQ ID NO:70)、CXCL11(4-73)-IgG4Fc(SEQ ID NO:71)、 CXCL11(4-73K/H→A)-IgG4Fc(SEQ ID NO:72)、CXCL13-IgG1Fc(SEQ ID NO:73)、CXCL13(3-87)-IgG1Fc(SEQID NO:74)、 CXCL13(3-87K/H→A)-IgG1Fc(SEQ ID NO:75)、CXCL13-IgG4Fc(SEQ ID NO:76)、CXCL13(3-87)-IgG4Fc(SEQ ID NO:77)和 CXCL13(3-87K/H→A)-IgG4Fc(SEQ ID NO:78)。

本文所公开的新型趋化因子-免疫球蛋白融合多肽可以使用本领域通常已知的任何的各种肽生成技术来制备。例如，基因重组技术可以用于生成本文所公开的融合多肽。因此，在一些实施方式中，提供了编码选自由如下融合多肽组成的组中的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽的分离的核酸分子：CCL2-IgG1Fc、var-CCL2-IgG1Fc、CCL2-IgG2Fc、var-CCL2-IgG2Fc、CCL2-IgG3Fc、var-CCL2-IgG3Fc、CCL2-IgG4Fc、 var-CCL2-IgG4Fc、CCL7-IgG1Fc、var-CCL7-IgG1Fc、CCL7-IgG2Fc、 var-CCL7-IgG2Fc、CCL7-IgG3Fc、var-CCL7-IgG3Fc、CCL7-IgG4Fc、 var-CCL7-IgG4Fc、CCL8-IgG1Fc、var-CCL8-IgG1Fc、CCL8-IgG2Fc、 var-CCL8-IgG2Fc、CCL8-IgG3Fc、var-CCL8-IgG3Fc、CCL8-IgG4Fc、 var-CCL8-IgG4Fc、CCL13-IgG1Fc、var-CCL13-IgG1Fc、CCL13-IgG2Fc、 var-CCL13-IgG2Fc、CCL13-IgG3Fc、var-CCL13-IgG3Fc、CCL13-IgG4Fc、 var-CCL13-IgG4Fc、CCL25-IgG1Fc、var-CCL25-IgG1Fc、CCL25-IgG2Fc、 var-CCL25-IgG2Fc、CCL25-IgG3Fc、var-CCL25-IgG3Fc、CCL25-IgG4Fc、 var-CCL25-IgG4Fc、CXCL11-IgG1Fc、var-CXCL11-IgG1Fc、 CXCL11-IgG2Fc、var-CXCL11-IgG2Fc、CXCL11-IgG3Fc、 var-CXCL11-IgG3Fc、CXCL11-IgG4Fc、var-CXCL11-IgG4Fc、CXCL13-IgG1Fc、var-CXCL13-IgG1Fc、CXCL13-IgG2Fc、 var-CXCL13-IgG2Fc、CXCL13-IgG3Fc、var-CXCL13-IgG3Fc、 CXCL13-IgG4Fc和var-CXCL13-IgG4Fc。

在一些具体实施方式中，所述分离的核酸分子编码选自由以下融合多肽组成的组的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽：CCL2-IgG1Fc、 CCL2(5-76)-IgG1Fc、CCL2(5-76K/H→A)-IgG1Fc、CCL2-IgG2Fc、 CCL2(5-76)-IgG2Fc、CCL2(5-76K/H→A)-IgG2Fc、CCL2-IgG3Fc、CCL2(5-76)-IgG3Fc、CCL2(5-76K/H→A)-IgG3Fc、CCL2-IgG4Fc、 CCL2(5-76)-IgG4Fc、CCL2(5-76K/H→A)-IgG4Fc、CCL7-IgG1Fc、 CCL7(5-76)-IgG1Fc、CCL7(5-76K/H→A)-IgG1Fc、CCL7-IgG2Fc、 CCL7(5-76)-IgG2Fc、CCL7(5-76K/H→A)-IgG2Fc、CCL7-IgG3Fc、 CCL7(5-76)-IgG3Fc、CCL7(5-76K/H→A)-IgG3Fc、CCL7-IgG4Fc、 CCL7(5-76)-IgG4Fc、CCL7(5-76K/H→A)-IgG4Fc、CCL8-IgG1Fc、 CCL8(5-76)-IgG1Fc、CCL8(5-76K/H→A)-IgG1Fc、CCL8-IgG2Fc、 CCL8(5-76)-IgG2Fc、CCL8(5-76K/H→A)-IgG2Fc、CCL8-IgG3Fc、 CCL8(5-76)-IgG3Fc、CCL8(5-76K/H→A)-IgG3Fc、CCL8-IgG4Fc、 CCL8(5-76)-IgG4Fc、CCL8(5-76K/H→A)-IgG4Fc、CCL13-IgG1Fc、 CCL13(5-75)-IgG1Fc、CCL13(5-75K/H→A)-IgG1Fc、CCL13-IgG2Fc、 CCL13(5-75)-IgG2Fc、CCL13(5-75K/H→A)-IgG2Fc、CCL13-IgG3Fc、 CCL13(5-75)-IgG3Fc、CCL13(5-75K/H→A)-IgG3Fc、CCL13-IgG4Fc、 CCL13(5-75)-IgG4Fc、CCL13(5-75K/H→A)-IgG4Fc、CCL25-IgG1Fc、 CCL25(4-127)-IgG1Fc、CCL25(4-127K/H→A)-IgG1Fc、CCL25-IgG2Fc、 CCL25(4-127)-IgG2Fc、CCL25(4-127K/H→A)-IgG2Fc、CCL25-IgG3Fc、CCL25(4-127)-IgG3Fc、CCL25(4-127K/H→A)-IgG3Fc、CCL25-IgG4Fc、 CCL25(4-127)-IgG4Fc、CCL25(4-127K/H→A)-IgG4Fc、CXCL11-IgG1Fc、 CXCL11(4-73)-IgG1Fc、CXCL11(4-73K/H→A)-IgG1Fc、CXCL11-IgG2Fc、 CXCL11(4-73)-IgG2Fc、CXCL11(4-73K/H→A)-IgG2Fc、CXCL11-IgG3Fc、 CXCL11(4-73)-IgG3Fc、CXCL11(4-73K/H→A)-IgG3Fc、CXCL11-IgG4Fc、 CXCL11(4-73)-IgG4Fc、CXCL11(4-73K/H→A)-IgG4Fc、CXCL13-IgG1Fc、CXCL13(3-87)-IgG1Fc、CXCL13(3-87K/H→A)-IgG1Fc、CXCL13-IgG2Fc、 CXCL13(3-87)-IgG2Fc、CXCL13(3-87K/H→A)-IgG2Fc、CXCL13-IgG3Fc、 CXCL13(3-87)-IgG3Fc、CXCL13(3-87K/H→A)-IgG3Fc、CXCL13-IgG4Fc、 CXCL13(3-87)-IgG4Fc和CXCL13(3-87K/H→A)-IgG4Fc。重组克隆技术也可以被用来构建编码融合多肽基因产物的异源基因序列，如本领域已知的。

表达载体

还提供了包含编码本文公开的多肽的核酸分子的重组表达载体。设想到特别有用的载体是DNA区段的编码部分被定位成受启动子的控制的那些载体。所述启动子可以是如下形式的启动子：其天然地与例如哺乳动物组织中的趋化因子或免疫球蛋白基因相关联，例如，可以使用重组体克隆和/或PCR技术，结合在此公开的组合物，通过分离位于外显子或克隆区段上游的5'非编码序列来获得。

在其它一些实施方式中，可以设想到的是，通过将编码DNA区段定位成受重组或者异源的启动子控制将获得某些优点。在此使用的重组或异源的启动子拟指在其自然环境中不是天然地与趋化因子或免疫球蛋白基因相关联的启动子。这样的启动子可以包括从植物、昆虫、细菌、病毒、真核生物、鱼、鸟或哺乳动物细胞中分离的启动子。当然，采用有效地指导DNA区段在选择用于表达的细胞类型中表达的启动子是重要的。用于蛋白表达的启动子和细胞类型的组合使用对于分子生物学领域的技术人员而言一般是已知的。所用的启动子可以是组成型或诱导型的，并能在适当的条件下用于指导所引入的DNA区段的高水平表达，例如在重组蛋白或肽的大规模生产中是有利的启动子。

表达载体通常含有用于转录终止的序列，并且可以另外含有对 mRNA稳定性具有积极影响的一个或多个元件。表达载体可以进一步包括在相邻的蛋白编码区之间的内部核糖体进入位点(IRES)，以便于在感染或转染细胞中由共同mRNA表达两种或更多种蛋白。此外，表达载体可进一步包括编码标记产物的核酸序列。这种标记物产物可以用于确定基因是否已被递送到细胞和正在被表达。优选的标记基因是大肠杆菌lacZ 基因，其编码β-半乳糖苷酶和绿色荧光蛋白(GFP)。

在一些实施方式中，本申请的表达载体是能够在体外环境中表达本申请的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽的质粒表达载体。所表达的融合多肽然后使用本领域技术人员已知的方法进行分离和纯化。

在其它一些实施方式中，本申请的表达载体是能够在体内环境中表达本申请的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽的质粒表达载体。这些表达载体可以使用递送系统例如脂质体(包括阳离子脂质体(例如DOTMA、 DOPE、DC-胆固醇)和阴离子脂质体)、微胶囊、纳米颗粒和电穿孔导入到受试者中。在一些实施方式中，表达载体可以经由抗体、受体或受体配体而被靶向特定的细胞类型。媒介物如“隐匿物(stealth)”以及其它抗体偶联脂质体(包括靶向到感兴趣的细胞的脂质介导药物)、通过细胞特异性配体进行的受体介导的DNA靶向、或病毒载体靶向，例如淋巴上皮或内皮细胞。在一般情况下，受体参与胞吞作用的途径，无论是组成型的还是配体诱导型的。这些受体在网格蛋白包被的凹坑(pit)中集簇，通过网格蛋白包被小泡进入细胞，穿过酸化的内体(其中受体被分选)，然后或者再循环到细胞表面而储存在细胞内，或在溶酶体中降解。内在化途径具有多种功能，如营养吸收、激活蛋白的去除、大分子的清除、病毒和毒素的伺机进入、配体的解离和降解以及受体水平调节。许多受体遵循一个以上的细胞内途径，这取决于细胞类型、受体浓度、配体类型、配体化合价以及配体浓度。

在其它另外一些实施方式中，本申请的表达载体是能够在体内环境中表达本申请的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽的基于病毒的表达载体。示例性的病毒载体可以包括或衍生自腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、HIV病毒、慢病毒、逆转录病毒、辛德毕斯(Sindbis)病毒和其它RNA病毒等。还优选的是共享这些病毒的性能使得它们适合用作载体的任何病毒家族。逆转录病毒包括莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)、HIV和其它慢病毒载体。腺病毒载体相对稳定和易于使用，具有高滴度，并可以以气溶胶制剂递送，并且能转染非分裂细胞。痘病毒载体大且具有用于插入基因的若干位点，它们具有热稳定性并且可以在室温下保存。病毒递送系统通常采用去除了一个或多个基因并在被去除的病毒DNA位置有外源基因和/或基因/启动子盒被插入到病毒基因组中的病毒载体。被去除的基因(或多个基因)的必要功能可以由已被改造成在转基因中(intrans)表达早期基因的基因产物的细胞系提供。

在其它一些实施方式中，表达载体是噬菌体DNA、酵母质粒或杆状病毒。

包含编码本文公开的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽的多核苷酸的示例性的表达载体构建体示于图1-10中。这些表达载体包括 pCCL2-IgG1Fc(SEQ ID NO:79)、pCCL2(5-76)-IgG1Fc(SEQ ID NO:80)、 pCCL2(5-76K/H→A)-IgG1Fc(SEQ ID NO:81)、pCCL7-IgG1Fc(SEQ ID NO:82)、pCCL7(5-76)-IgG1Fc(SEQ ID NO:83)、 pCCL7(5-76K/H→A)-IgG1Fc(SEQID NO:84)、pCCL8-IgG1Fc(SEQ ID NO:85)、pCCL8(5-76)-IgG1Fc(SEQ ID NO:86)、 pCCL8(5-76K/H→A)-IgG1Fc(SEQ ID NO:87)、pCCL13-IgG1Fc(SEQ ID NO:88)、pCCL13(5-75)-IgG1Fc(SEQ ID NO:89)、 pCCL13(5-75K/H→A)-IgG1Fc(SEQ ID NO:90)、pCCL25-IgG1Fc(SEQ ID NO:91)、pCCL25(4-127)-IgG1Fc(SEQ ID NO:92)、 pCCL25(4-127K/H→A)-IgG1Fc(SEQ ID NO:93)、pCXCL11-IgG1Fc(SEQ ID NO:94)、pCXCL11(4-73)-IgG1Fc(SEQ ID NO:95)、 pCXCL11(4-73K/H→A)-IgG1Fc(SEQ ID NO:96)、pCXCL11-IgG4Fc(SEQ ID NO:97)、pCXCL11(4-73)-IgG4Fc(SEQ ID NO:98)、 pCXCL11(4-73K/H→A)-IgG4Fc(SEQ ID NO:99)、pCXCL13-IgG1Fc(SEQ ID NO:100)、pCXCL13(3-87)-IgG1Fc(SEQ ID NO:101)、 pCXCL13(3-87K/H→A)-IgG1Fc(SEQ ID NO:102)、pCXCL13-IgG4Fc (SEQ ID NO:103)、pCXCL13(3-87)-IgG4Fc(SEQ ID NO:104)和 CXCL13(3-87K/H→A)-IgG4Fc(SEQ ID NO:105)。应当理解的是，除了上面具体公开的那些载体和基因之外的载体和基因的其它组合也都被目前公开的主题所设想到，如本领域的技术人员应当理解的那样。

蛋白偶联物

在一些实施方式中，本申请的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽及其某些趋化因子及其变体被偶联至非蛋白聚合物，以形成蛋白-聚合物偶联物。除非有相反的具体指明，否则术语“非蛋白质聚合物”被定义为由两个或两个以上的单体的共价键形成的分子，其中没有单体包含在选自由以下物质形成的组中：丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸 (Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(trp)和酪氨酸(Tyr)残基。血清可溶性非蛋白聚合物(如聚乙二醇)以及组织或脂溶性聚合物(如聚己内酯)可以用于多肽的递送、释放和/或滞留。在一些实施方式中，蛋白-聚合物偶联物是聚乙二醇化趋化因子-免疫球蛋白融合多肽、趋化因子或其变体。

在一个方面中，本申请涵盖具有任意摩尔比的聚合物与趋化因子或其片段的偶联物，其赋予偶联物如本文教导的所希望的范围的表观尺寸。该偶联物的表观尺寸将部分取决于所用的聚合物的尺寸和形状、所用的趋化因子或其片段的尺寸和形状、连接至趋化因子或其片段的聚合物分子的数量、以及趋化因子或其片段上的这些连接位点的位置。这些参数可以容易地加以确定和最大化，以获得具有任何类型的趋化因子或其片段、聚合物和连接系统所需的外观尺寸的偶联物。

在一些实施方式中，本申请的蛋白-聚合物偶联物具有至少约500,000 D、或至少约800,000D、或至少约900,000D、或至少约1,000,000D、或在至少约1,200,000D、或至少约1,400,000D、或至少约1,500,000D、或至少约1,800,000D、或至少约2,000,000D、或至少约2,500,000D的有效尺寸。在一个实施方式中，所述聚合物是PEG(聚乙二醇)。

在其它一些实施方式中，本申请的蛋白-聚合物偶联物具有等于或约 500,000D至等于或约10,000,000D的有效尺寸，或者等于或约500,000D 至等于或约8,000,000D的有效尺寸，或者等于或约500,000D至等于或约5,000,000D的有效尺寸，或者等于或约500,000D至等于或约 4,000,000D的有效尺寸，或者等于或约500,000D至等于或约3,000,000 D的的有效尺寸，或者等于或约500,000D至等于或约2,500,000D的有效尺寸，或者等于或约500,000D至等于或约2,000,000D的有效尺寸，或者等于或约500,000D至等于或约1,800,000D的有效尺寸，或者等于或约500,000D至等于或约1,600,000D的有效尺寸，或者等于或约500,000D至等于或约1,500,000D的有效尺寸，或者等于或约500,000D 至等于或约1,000,000D的有效尺寸。在一个实施方式中，所述聚合物是 PEG。

在另一个实施方式中，蛋白-聚合物偶联物具有比未偶联的趋化因子 -免疫球蛋白融合多肽、趋化因子或其变体的有效尺寸大至少约8倍、或大至少约10倍、或大至少约12倍、或大至少约15倍、或大至少约18 倍、或大至少约20倍、或大至少约25倍、或大至少约28倍、或大至少约30倍、或大至少约40倍的有效尺寸。在一个实施方式中，所述聚合物是PEG。

在另一个实施方式中，蛋白-聚合物偶联物具有比未偶联的趋化因子 -免疫球蛋白融合多肽、趋化因子或其变体的有效尺寸大大约8倍至约100 倍、或大约8倍至约80倍、或大约8倍至约50倍、或大约8倍至40倍、或大约8倍至约30倍、或大约8倍至约28倍、或大约8倍至约25倍、或大约8倍至约20倍、或大约8倍至约18倍、或大约8倍至约15倍的有效尺寸。在一个实施方式中，所述聚合物是PEG。

在另一个实施方式中，蛋白-聚合物偶联物具有比未偶联的趋化因子 -免疫球蛋白融合多肽、趋化因子或其变体的有效尺寸大大约25倍至约 100倍、或大约25倍至约80倍、或大约25倍至约50倍、或大约25倍至约40倍、或大约25倍至约30倍、或大约25倍至约28倍的有效尺寸。在一个实施方式中，所述聚合物是PEG。

在另一个实施方式中，蛋白-聚合物偶联物具有不大于约10:1、或不大于约5:1、或不大于约4:1、或不大于约3:1、或不大于约2:1、或不大于1:1的聚合物与蛋白质的摩尔比。在一个实施方式中，所述聚合物是 PEG。

在另一个实施方式中，蛋白-聚合物偶联物是共价连接至具有至少约20,000D的实际分子量的至少一种聚合物的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽、趋化因子或其变体。在一个实施方式中，所述聚合物是PEG。

在又一个实施方式中，所述偶联物是共价连接至具有至少约30,000 D的实际分子量的至少一种聚合物的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽、趋化因子或其变体。在一个实施方式中，所述聚合物是PEG。

在又一个实施方式中，所述偶联物是共价连接至具有至少约40,000 D的实际分子量的至少一种聚合物的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽、趋化因子或其变体。在一个实施方式中，所述聚合物是PEG。

在另一个实施方式中，所述偶联物是共价连接至具有等于或约 20,000D至等于或约300,000D、或者等于或约30,000D至等于或约 300,000D、或者等于或约40,000D至等于或约300,000D的实际分子量的至少一种聚合物的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽、趋化因子或其变体。在一个实施方式中，所述聚合物是PEG。

本申请的偶联物可以使用聚合物通过现在已知的或以后开发的用于衍生趋化因子或其片段的任何合适的技术制得。但应理解的是，本发明并不限于利用趋化因子或其片段和聚合物之间的任何特定类型的键的偶联物。

本申请的偶联物包括这样的物种，其中聚合物被共价连接到位于趋化因子-免疫球蛋白融合多肽、趋化因子或其变体上的一个非特异性位点或多个非特异性位点(即该聚合物连接不是靶向到未偶联趋化因子或其片段的特定区域或特定氨基酸残基)。在这些实施方式中，偶联化学能够例如利用未偶联抗体中的赖氨酸残基的游离的ε(epsilon)氨基作为聚合物的连接位点，其中，所述赖氨酸残基氨基使用聚合物随机衍生。

此外，本发明的偶联物包括这样的物种，其中聚合物被共价连接至未偶联的趋化因子或其片段的一个特异性位点或多个特异性位点(即，聚合物连接被靶向至未偶联的趋化因子或其片段的特定区域或一个或多个特定的氨基酸残基)。图11描绘了指示潜在的PEG化位点的CXCL11的结构的图。在这些实施方式中，偶联化学能够例如利用不在未偶联的趋化因子或其片段中的二硫桥键中的半胱氨酸的游离的巯基。在一个实施方式中，一个或多个半胱氨酸残基被改造进入到未偶联的趋化因子或其片段中的一个或多个选定的位点，目的是为聚合物提供一个或者多个特异性的连接位点。所述聚合物可以使用能够特异性地与未偶联抗体上的游离巯基或硫醇基团，如马来酰亚胺、巯基、硫醇基、三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯(tesylate)、氮丙啶、环氧乙烷(exirane)和5-吡啶基官能团反应的任意官能团所激活。该聚合物可以使用适合所选的偶联系统的化学性质的任何程序偶联到所述未偶联的趋化因子或其片段。

在另一个实施方式中，聚合物连接靶向未偶联的趋化因子或其片段的受体结合位点。在另一个实施方式中，聚合物连接靶向趋化因子或其片段上远离未偶联的趋化因子或其片段的受体结合位点的位点。

在某些实施方式中，蛋白-聚合物偶联物的蛋白质部分选自由如下部分组成的组：人类CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL4L1、CCL5、CCL7、 CCL8、CCL11、CCL13、CCL14-1、CCL14-2、CCL15、CCL16、CCL17、 CCL18、CCL19、CCL20-1、CCL20-2、CCL21、CCL22、CCL23-1、CCL23-1、CCL24、CCL25-1、CCL25-2、CCL25-3、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、 CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、 CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL16、XCL1、XCL2、CX3CL1 及其功能性变体，并且该蛋白-聚合物偶联物的聚合物部分是PEG。图11 描绘了指示潜在的PEG化位点的CXCL11的结构的图。

在其它一些实施方式中，蛋白-聚合物偶联物的蛋白部分是趋化因子 -免疫球蛋白融合多肽，其中，趋化因子部分选自由如下部分组成的组：人类CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL4L1、CCL5、CCL7、CCL8、 CCL11、CCL13、CCL14-1、CCL14-2、CCL15、CCL16、CCL17、CCL 18、CCL19、CCL20-1、CCL20-2、CCL21、CCL22、CCL23-1、CCL23-1、 CCL24、CCL25-1、CCL25-2、CCL25-3、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、 CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、 CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL16、XCL1、XCL2、CX3CL1 及其功能变体，并且免疫球蛋白部分选自由如下部分组成的组：人类IgG1 的Fc区、人类IgG2的Fc区、人类IgG3的Fc区、人类IgG4的Fc区及其变体。

在一些实施方式中，蛋白-聚合物偶联物是血清不稳定的多肽，该多肽选自由以下物质组成的组：CCL2-PEG、var-CCL2-PEG、CCL7-PEG、 var-CCL7-PEG、CCL8-PEG、var-CCL8-PEG、CCL13-PEG、 var-CCL13-PEG、CCL25-PEG、var-CCL25-PEG、CXCL11-PEG、 var-CXCL11-PEG、CXCL13-PEG、var-CXCL13-PEG、CXCL16-PEG和 var-CXCL16-PEG。

在一些具体实施方式中，蛋白-聚合物偶联物是血清不稳定的多肽，该多肽选自由如下物质组成的组：CCL2-PEG、CCL2(5-76)-PEG、 CCL2(5-76K/H→A)-PEG、CCL7-PEG、CCL7(5-76)-PEG、 CCL7(5-76K/H→A)-PEG、CCL8-PEG、CCL8(5-76)-PEG、 CCL8(5-76K/H→A)-PEG、CCL13-PEG、CCL13(5-75)-PEG、 CCL13(5-75K/H→A)-PEG、CCL25-PEG、CCL25(4-127)-PEG、 CCL25(4-127K/H→A)-PEG、CXCL11-PEG、CXCL11(4-73)-PEG、 CXCL11(4-73K/H→A)-PEG、CXCL11-IgG4Fc、CXCL11(4-73)-IgG4Fc、 CXCL11(4-73K/H→A)-IgG4Fc、CXCL13-PEG、CXCL13(3-87)-PEG、 CXCL13(3-87K/H→A)-PEG、CXCL16-PEG、CXCL16(3-87)-PEG和CXCL16(3-87K/H→A)-PEG。

据信，可以通过如本文教导的使用聚合物衍生趋化因子或其片段来显着改善任何趋化因子或其片段的血清半衰期、MRT和/或血清清除率。在一个优选的实施方式中，所述偶联物含有选自由如下物质组成的组的趋化因子或其片段：CCL2、CCL7、CCL8、CCL13、CCL25、CXCL11、 CXCL12α、CXCL13及其突变、变体及其片段。

制备趋化因子-免疫球蛋白融合多肽的方法

趋化因子-免疫球蛋白融合多肽或其变体可以使用本领域熟知的方法来制备。在某些实施方式中，所述趋化因子-免疫球蛋白融合多肽或其变体是通过化学合成制备。简言之，通过如下方法来合成趋化因子-免疫球蛋白融合多肽：使一个氨基酸的羧基或C-末端偶联至另一个氨基酸的氨基或N-末端。由于存在意外反应的可能，保护基团通常是必要的。化学肽合成开始于肽的C-末端并结束于N-末端。这与开始于N-末端的蛋白质生物合成相反。

在一些实施方式中，趋化因子-免疫球蛋白融合多肽可以使用传统的液相或固相合成来合成。可以使用9-芴甲氧羰基(Fmoc)和叔丁氧基羰基(t-Boc)固相肽合成(SPPS)来使肽从羧基末端向氨基末端生长。在某些实施方式中，使加入到反应中的最后一个“氨基酸”聚乙二醇化。这个最后的氨基酸通常被称为羧基-PEG-胺、羧基-PEO-胺或胺-PEG-酸，由此使胺被阻断而防止反应，并且酸自由地与反应中先前所添加的氨基酸的氨基反应。

在其它一些实施方式中，趋化因子-免疫球蛋白融合多肽或其变体是使用重组DNA技术来制备的。用于重组蛋白的表达和纯化的方法是非常成熟的。

在某些实施方式中，趋化因子-免疫球蛋白融合多肽使用如下物质来表达：表达载体如细菌质粒表达、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，以及病毒载体如牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和许多其它病毒。

携带趋化因子-免疫球蛋白融合多肽的表达载体可以通过任何各种公知的方法，如电穿孔、脂质体介导转染、磷酸钙沉淀、感染和转染等导入到宿主细胞中，这取决于载体和宿主细胞的选择。

因此，含有趋化因子-免疫球蛋白融合多肽的表达载体的宿主细胞也是本发明的特征。有利的宿主细胞包括原核(即细菌)宿主细胞，如大肠杆菌，以及许多真核宿主细胞，包括真菌(例如，酵母，如酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Picchiapastoris))细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞(如CHO细胞)。合适的表达宿主的例子包括：细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌，和鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酿酒酵母，毕赤酵母和粗糙脉孢菌；昆虫细胞，如果蝇(Drosophila)和草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)；哺乳动物细胞，如3T3、COS、CHO、BHK、 HEK 293或人黑色素瘤(Bowesmelanoma)；植物细胞，包括藻类细胞等。

宿主细胞可以培养在经改良而适于激活启动子、选择转化子或扩增插入的多核苷酸序列的常规营养培养基中。培养条件如温度、pH等通常是先前选择用于表达的宿主细胞使用的那些条件，并且本领域技术人员是清楚的并可以参考本文引用的参考文献。趋化因子-免疫球蛋白融合多肽也可以在非动物细胞如植物、酵母、真菌和细菌等中制备。在细菌系统中，许多表达载体可以根据目的用于表达产物的用途进行选择。例如，当需要大量多肽或其片段用于制备抗体时，指导容易纯化的融合多肽高水平表达的载体是优选采用的。这样的载体包括但不限于：多功能大肠杆菌克隆和表达载体，如BLUESCRIPT(Stratagene公司)，其中感兴趣的编码序列例如如上面所描述的本发明的多核苷酸可以框架内(in-frame)连接到载体，用于β-半乳糖苷酶的氨基末端翻译起始甲硫氨酸和后续7个残基的序列产生具有催化活性的β-半乳糖苷酶融合多肽；pIN载体(Van Heeke&Schuster(1989)J Biol Chem 264:5503-5509)；pET载体(Novagen、 Madison Wis.)，其中氨基末端甲硫氨酸与组氨酸标签框架内连接；等等。

类似地，在诸如酿酒酵母等酵母中，可以使用包含组成型或诱导型启动子如α因子、醇氧化酶和PGH的许多载体来制备所需的表达产物。在哺乳动物宿主细胞中，包括基于质粒和病毒的系统在内的许多的表达系统都可以使用。

对于趋化因子-免疫球蛋白融合多肽的长期、高产量制备，通常使用稳定表达系统。例如，编码趋化因子-免疫球蛋白融合多肽的多核苷酸使用含有病毒复制起始序列或内源表达元件和选择标记基因的表达载体导入宿主细胞中。在载体的导入之后，让细胞生长在富集培养基中1-2天，然后将它们换到选择培养基中。可选择标记的目的是赋予选择抗性，并且其存在允许细胞的生长和回收，由此成功地表达所导入的序列。例如，稳定转化的细胞的抗性组或菌落可以使用适合于该细胞类型的组织培养技术来增殖。使用编码ac趋化因子-免疫球蛋白融合多肽的核酸转化的宿主细胞可选地在适于从细胞培养物中表达和回收所编码的蛋白的条件下培养。

在转导合适的宿主细胞系并且让宿主细胞生长到合适的细胞密度之后，通过适当的方法(例如，温度变化或化学诱导)导入所选择的启动子并将细胞培养又一段时间。然后从培养基回收所分泌的多肽产物。或者，细胞可以通过离心收获，通过物理或化学方法破碎，并保留所得到的粗制提取物以用于进一步纯化。在表达蛋白中采用的真核生物或微生物细胞可通过任何常规的方法进行破碎，所述方法包括冷冻-解冻循环、超声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂，或者其它方法，这些方法对于本领域的技术人员是熟知的。

所表达的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽可以通过许多本领域熟知的许多方法中的任意方法从重组细胞培养物中回收和纯化，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析(例如，使用任何本文提到的标签系统)、羟磷灰石层析和凝集素层析。如需要的话，在完成成熟蛋白质的构型中可以使用蛋白重折叠步骤。最后，在最终的纯化步骤可以采用高效液相色谱(HPLC)。除了上面提到的参考文献之外，各种纯化方法是本领域熟知的。

在另一个实例中，使用杆状病毒表达载体系统(Baculovirus Expression VectorSystem，BEVS)将编码趋化因子-免疫球蛋白融合多肽的多核苷酸序列导入到昆虫细胞中。能够感染昆虫细胞的重组杆状病毒可以使用市售载体、试剂盒和/或系统，如来自BDBioscience的BD BaculoGold系统来生成。简而言之，编码趋化因子-免疫球蛋白融合多肽的多核苷酸序列被插入pAcSG2转移载体中。然后，宿主细胞SF9(草地贪夜蛾)通过含有杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的线性化基因组DNA的BD BaculoGold和pAcSG2-嵌合质粒共转染。转染后，在pACSG2质粒和杆状病毒基因组之间发生同源重组，从而生成重组病毒。在一个实例中，所述趋化因子-免疫球蛋白融合多肽在多角体蛋白启动子(pH)的调节控制下表达。类似的转移载体可以使用其它启动子如基本启动子(Ba)和P10启动子来制备。类似的，可以采用备选的昆虫细胞，例如与Sf9密切相关的SF21和衍生自粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的高五 (High Five，Hi5)细胞系。在表达的转染和导入(根据所选择的启动子和/ 或增强子或其它调控元件)后，回收(例如纯化或富集)所表达的趋化因子- 免疫球蛋白融合多肽，并复性以确保折叠成具有生物活性的构象。

在另一些实施方式中，趋化因子-免疫球蛋白融合多肽是通过质粒载体或病毒载体进行体内表达的。

治疗方法

本申请进一步提供了使用本文所公开的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽来调节炎症和/或治疗趋化因子受体介导的病症的方法。在一些实施例中，提供了一种用于治疗受试者中的趋化因子受体介导的病症的方法。在一些实施方式中，所述方法包括向需要的受试者施用有效量的本文所公开的受趋化因子-免疫球蛋白融合多肽。

本文所使用的术语“治疗”或“处理”涉及趋化因子受体介导的病症的任何治疗，包括但不限于预防性治疗和治疗性治疗。因此，术语“治疗” 或“处理”包括但不限于：预防趋化因子受体介导的病症或趋化因子受体介导的病症的发展；抑制趋化因子受体介导的病症的行进；阻止或预防趋化因子受体介导的病症的发展；降低趋化因子受体介导的病症的严重程度；缓解或减轻与趋化因子受体介导的病症相关的症状；以及使趋化因子受体介导的病症或一种或更多种与趋化因子受体介导的病症相关的症状消退。

在趋化因子受体介导的病症和炎症的治疗中，当以有效量施用时，治疗性化合物的实施方式显示出活性。本文所公开的组合物的有效量是所述组合物的无毒但足够的量，使得产生所期望的预防或治疗效果。所需要的组合物的确切的量将随受试者变化，这取决于物种、年龄、动物的状态、或动物中炎症或趋化因子受体介导的病症的严重程度、所用的具体的载体或佐剂及其施用方式等。因此，本文所公开的任何具体的治疗组合物的有效量将根据具体情况而变化，并且适当的有效量可以在每种应用情况中由本领域的技术人员仅使用常规试验即可确定。本文所公开的组合物可以以约0.1μg至约100mg/千克体重的量施用。例如，剂量方案可以为约1μg至约10mg/千克体重，并且这样的剂量单位也可以采用，使得总共有约7μg至约700mg的组合物被施用至约70公斤体重的受试者。

剂量方案可以进行调整以提供最佳的治疗反应，并且可以每天一次、每两周一次、每周一次、每两月一次、每月一次、或以其它适当的时间间隔进行施用。例如，本文所公开的组合物可以从每天一次至每星期一次，每次约5mg至250mg的剂量施用。另一个例子是，可以每天施用若干个分开的剂量，或该剂量可以如治疗情况的紧急程度所示按比例减少。一个实际的优点是，该化合物可以以方便的方式施用，如以静脉内、瘤内、皮下、透皮、腹膜内或口服施用。

在一些实施方式中，活性组合物采用胃肠外或腹膜内施用。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物以及在油中制备分散液。在储存和使用的通常条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。

适合于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液以及用于无菌可注射溶液或分散液的临时制备的无菌粉末。该形式应该是无菌的并且具有易注射性的流动程度。它在制造和贮存的条件下应该是稳定的，而且应当抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用而进行保存。所述药物载体可以是溶剂或含有例如如下物质的分散介质：水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物以及植物油。适当的流动性可以通过例如如下方式保持：通过使用包衣如卵磷脂、在分散液的情况下通过保持所要求的粒径和通过使用表面活性剂。

微生物作用的预防可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞等来实现。在许多情况下，可能希望包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延长吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现。

无菌可注射溶液可通过将所需量的所述组合物以各种上述列举的其它成分一起引入合适的溶剂中然后过滤灭菌来制备。一般地，分散液可以通过将各种灭菌的活性成分引入到含有基本分散介质和来自以上列举的所需其它成分的无菌媒介物(vehicle)中来制备。在用于无菌可注射溶液的制备的无菌粉末的情况中，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术由其先前无菌过滤的溶液获得活性成分加上任何其它所需成分的粉末。

如本文所用的，“药学上可接受的载体”和“药用载体”可互换使用，包括溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等诸如此类的物质。用于药物活性物质的此类介质和试剂的使用在本领域中是熟知的。除非有任何常规介质或试剂与所述活性成分不相容，否则设想了其在治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可以被引入到所述组合物中。

为便于剂量的均一和施用，肠胃外组合物可以配制成剂量-单位形式。如本文所使用的，剂量-单位形式是指适合作为单一剂量用于待治疗的受试者的物理上离散的单位，每个单位含有经计算与所需的药物载体联合产生所需的治疗效果的预定量的活性物质。本申请对剂量-单位形式的说明可以基于如下因素进行选择：(a)要实现的特定的治疗效果和活性物质的独特特征，和(b)本领域中复合用于治疗具有本文所述身体健康受损的病状的活的受试者中的病状的这种活性物质的固有局限性。

可将活性成分复合以方便而有效量地以有效量施用如本文所述的单位剂量形式的合适的药学上可接受的载体。单位剂量形式可以例如包含本质上具有活性的化合物，该化合物的量为例如约0.1至约1000mg，或者对于另一个实例，为约5至约500mg。按比例表示，该化合物通常以约1至约100mg/L载体存在。在含有补充活性成分的组合物的情况下，该剂量可以通过参考施用该成分的通常剂量和方式来确定。

此外，关于本发明公开的主题的治疗方法，优选的受试者是脊椎动物受试者。优选的脊椎动物是温血动物，优选的温血脊椎动物是哺乳动物。优选的哺乳动物最优选是人类。本文所使用的术语“对象”包括人类和动物受试者。因此，根据目前公开的主题，提供了兽医治疗用途。

因此，本发明提供用于哺乳动物(如人类)以及因频危而重要的那些哺乳动物(如西伯利亚虎)的治疗；具有经济重要性的动物，例如用于人类消费的在农场上养殖的动物；和/或对人类具有社会重要性的动物，如作为宠物饲养或在动物园中的动物。

这些动物的例子包括但不限于：食肉动物如猫和狗；猪，包括肉猪(pig)、肥猪(hog)和野猪；反刍动物和/或有蹄动物如牛(cattle)、公牛(oxen)、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼；以及马。还提供了鸟类的治疗，包括濒危和/或在动物园中饲养的那些鸟类，以及飞禽，更具体地说是家养飞禽，即家禽，如火鸡、鸡、鸭、鹅和珍珠鸡等的治疗，因为它们对人类也具有经济重要性。因此，还提供了牲畜的治疗，包括但不限于家养的猪、反刍动物、有蹄动物、马(包括赛马)和家禽等。

在目前公开的主题的一些实施方式中，受治疗的趋化因子受体介导的病症是细胞增殖性病症，如肿瘤或癌症。本申请提供了趋化因子-免疫球蛋白融合多肽，该融合多肽能够靶向在本文所公开的增殖性病症的细胞上表达的特异性趋化因子受体。肿瘤细胞表达可以支持粘附、侵袭和细胞存活的具有功能活性的趋化因子受体。趋化因子受体信号转导和趋化因子结合后的聚集被偶联至整合素聚集，这提高细胞存活并稳固细胞粘附。不希望受到理论的约束，本文所公开的新型趋化因子-免疫球蛋白融合多肽可以结合至在这些病变的细胞上的趋化因子受体并抑制细胞事件，包括细胞存活、迁移、侵入、粘附或它们的组合，并由此治疗所述细胞增殖性病症。表3列出了各种癌症和所列癌症与特定趋化因子和趋化因子受体的关联。

表3趋化因子、趋化因子受体与癌症关联(依赖于病期)

“细胞增殖性病症”是指特征为细胞的异常增殖的病症。增殖性病症并不意味着细胞生长速率方面的任何限制，而仅仅是表示失去影响生长和细胞分裂的正常控制。因此，在一些实施方式中，增殖性病症的细胞可以具有与正常细胞相同的细胞分裂速率，但是没有响应限制这种增长的信号。在“细胞增殖性病症”的范围内有赘生物(neoplasm)或肿瘤，这是组织的异常生长。“癌症”指以具有侵入周围组织和/或转移到新的定植部位的能力的细胞的增殖为特征的各种任意恶性赘生物，并包括白血病、癌、黑色素瘤和肉瘤。癌症的实例是脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和髓母细胞瘤。

“白血病”是指造血器官的广泛进行性恶性疾病，其主要特征在于血液和骨髓中的白细胞及其前体异常的增殖及发育。白血病包括，例如急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性前髓细胞性白血病、成人T细胞性白血病、非白血性白血病、白细胞不增多性白血病、嗜碱性白血病(basophylic leukemia)、母细胞性白血病、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚胎性白血病(embryonal leukemia)、嗜酸性白血病(eosinophilic leukemia)、格罗斯白血病(Gross'leukemia)、毛细胞性白血病、成血性白血病(hemoblastic leukemia)、成血细胞性白血病(hemocytoblastic leukemia)、组织细胞性白血病、干细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴细胞性白血病(lymphoblastic leukemia)、淋巴细胞性白血病、成淋巴性白血病 (lymphogenousleukemia)、淋巴样白血病(lymphoid leukemia)、淋巴肉瘤细胞性白血病、肥大细胞性白血病、巨核细胞性白血病、小成髄细胞性白血病、单核细胞性白血病、成髄性白血病(myeloblastic leukemia)、髓细胞性白血病、髓样粒细胞性白血病(myeloidgranulocytic leukemia)、髓单核细胞性白血病(myelomonocytic leukemia)、内格利型白血病(Naegeli leukemia)、浆细胞性白血病(plasma cell leukemia)、浆细胞性白血病(plasmacytic leukemia)、前髓细胞性白血病、李德尔细胞性白血病(Rieder cellleukemia)、希林氏白血病(Schilling's leukemia)、干细胞性白血病、亚白血性白血病和未分化细胞性白血病。

术语“癌”是指由倾向于浸润周围组织并发生转移的上皮细胞组成的恶性赘生物。示例性的癌包括例如腺泡癌(acinar carcinoma)、腺泡性癌 (acinous carcinoma)、腺嚢性癌(adenocystic carcinoma)、腺样嚢性癌 (adenoid cystic carcinoma)、腺癌(carcinoma adenomatosum)、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌(basalcell carcinoma)、基底细胞性癌(carcinoma basocellulare)、基底细胞样癌(basaloidcarcinoma)、基底鳞状细胞癌(basosquamous cell carcinoma)、细支气管肺泡癌(bronchioalveolar carcinoma)、支气管癌(bronchiolar carcinoma)、支气管源性癌(bronchogenic carcinoma)、脑样癌(cerebriform carcinoma)、胆管细胞癌(cholangiocellular carcinoma)、绒毛膜癌(chorionic carcinoma)、胶样癌 (colloidcarcinoma)、粉刺状癌(comedo carcinoma)、子宫体癌(corpus carcinoma)、筛状癌(cribriform carcinoma)、胸廓癌(carcinoma en cuirasse)、皮肤癌(carcinomacutaneum)、柱状细胞性癌(cylindrical carcinoma)、柱状细胞癌(cylindrical cellcarcinoma)、导管癌、硬癌(carcinoma durum)、胚胎性癌(embryonal carcinoma)、髓样癌(encephaloid carcinoma)、epiennoid 癌(epiennoid carcinoma)、腺样上皮癌(carcinoma epitheliale adenoides)、外生癌(exophytic carcinoma)、溃疡性癌(carcinoma ex ulcere)、硬癌 (carcinoma fibrosum)、胶体状癌(gelatiniformcarcinoma)、胶性癌 (gelatinous carcinoma)、巨大细胞癌(giant cell carcinoma)、巨细胞癌 (carcinoma gigantocellulare)、腺癌(glandular carcinoma)、颗粒细胞癌(granulosacell carcinama)、毛母质癌(hair-matrix carcinoma)、多血癌 (hematoidcarcinoma)、肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)、大嗜酸细胞癌(Hurthle cellcarcinoma)、透明质癌(hyaline carcinoma)、hypemephroid癌 (hypemephroidcarcinoma)、幼稚型胚胎性癌(infantileembryonal carcinoma)、原位癌、表皮内癌(intraepidermal carcinoma)、上皮内癌 (intraepithelial carcinoma)、克龙派切尔癌(Krompecher's carcinoma)、库尔奇茨基细胞(Kulchitzky-cell carcinoma)、大细胞癌(large-cell carcinoma)、豆状癌(lenticular carcinoma)、豆状癌(carcinomalenticulare)、脂瘤癌 (lipomatous carcinoma)、淋巴上皮癌(lymphoepithelialcarcinoma)、髓样癌 (carcinoma medullare)、髓样癌(medullary carcinoma)、黑色素癌(melanotic carcinoma)、软癌、黏液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinomamuciparum)、粘液细胞癌(carcinoma mucocellulare)、粘液表皮样癌 (mucoepidermoidcarcinoma)、粘膜癌(carcinoma mucosum)、粘液性癌 (mucous carcinoma)、粘液瘤样癌(carcinoma myxomatodes)、鼻咽癌 (naspharyngeal carcinoma)、燕麦细胞癌(oat cellcarcinoma)、骨化性癌 (carcinoma ossificans)、类骨质癌(osteoid carcinoma)、乳头状癌(papillary carcinoma)、门脉周癌(periportal carcinoma)、侵入前期癌(preinvasivecarcinoma)、棘细胞癌(prickle cell carcinoma)、软糊状癌(pultaceous carcinoma)、肾的肾细胞癌(renal cell carcinoma of kidney)、储备细胞癌 (reserve cellcarcinoma)、肉瘤样癌(carcinoma sarcomatodes)、施奈德癌 (schneideriancarcinoma)、硬癌(scirrhous carcinoma)、阴嚢癌(carcinoma scroti)、印戒细胞癌(signet-ring cellcarcinoma)、单纯癌(carcinoma simplex)、小细胞癌(small-cellcarcinoma)、马铃薯状癌(solanoid carcinoma)、球状细胞癌(spheroidalcellcarcinoma)、梭形细胞癌(spindle cell carcinoma)、髓样癌(carcinomaspongiosum)、鳞癌(squamous carcinoma)、鳞状细胞癌(squamous cellcarcinoma)、绳捆癌(string carcinoma)、血管扩张性癌(carcinoma telangieetatieum)、血管扩张癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌(transitional cell carcinoma)、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌(verrucouscarcinoma) 和绒毛状癌(carcinoma villosum)。

术语“肉瘤”通常是指这样的肿瘤，即这种肿瘤由像胚胎结缔组织之类的物质组成，并且通常由嵌于纤维物质或同质物质中紧密压实的细胞组成。肉瘤包括例如软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy肉瘤(Abemethy'ssarcoma)、脂肉瘤(adipose sarcoma)、脂肪肉瘤(liposarcoma)、腺泡状软组织肉瘤(alveolar soft part sarcoma)、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤(botryoid sarcoma)、绿色瘤肉瘤 (chloroma)、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤(embryonal sarconm)、Wilns肺瘤肉瘤 (Wilns'tumor sarcoma)、子宫内膜肉瘤(endometrial sarcoma)、间质肉瘤 (stromal sarcoma)、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、筋膜肉瘤(fascial sarcoma)、纤维母细胞肉瘤(fibroblastic sarcoma)、巨细胞肉瘤(giant cell sarcoma)、粒细胞肉瘤(granulocyticsarcoma)、霍奇金肉瘤(Hodgkin's sarcoma)、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤(idiopathic multiple pigmented hemorrhagic sarcoma)、B细胞免疫母细胞肉瘤(immunoblastic sarcoma of B cells)、淋巴瘤(例如非霍奇金淋巴瘤)、T细胞的免疫母细胞肉瘤(immunoblastic sarcoma of T-cells)、约翰逊肉瘤(Jensen's sarcoma)、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、肝巨噬细胞肉瘤(Kupffer cell sarcoma)、血管肉瘤(angiosarcoma)、白血病性肉瘤(leukosarcoma)、恶性间叶肉瘤 (malignant mesenchymomasarcoma)、骨膜外肉瘤(parosteal sarcoma)、网织红细胞肉瘤(reticulocyticsarcoma)、劳斯肉瘤(Rous sarcoma)、浆液嚢性肉瘤(serocystic sarcoma)、滑膜肉瘤和毛细血管扩张性肉瘤(telangiectatic sarcoma)。

术语“黑色素瘤”用以指一种源自于皮肤和其它器官的黑色素细胞系统的肿瘤。黑色素瘤包括例如肢端雀斑样痣黑色素瘤(acral-lentiginous melanoma)、无黑色素性黑色素瘤(amelanotic melanoma)、良性幼年黑色素瘤(benign juvenile melanoma)、克劳德曼黑色素瘤(Cloudman's melanoma)、S91黑色素瘤、哈-帕二氏黑色素瘤(Harding-Passey melanoma)、幼年黑色素瘤(juvenile melanoma)、恶性雀斑样痣黑色素瘤(lentigo maligna melanoma)、恶性黑色素瘤(malignant melanoma)、结节性黑色素瘤(nodular melanoma)、甲下黑色素瘤(subungal melanoma)和浅表扩散性黑色素瘤(superficial spreading melanoma)。

另外的癌症包括例如霍奇金病、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰腺癌 (malignant pancreatic insulanoma)、恶性类癌、恶性前皮肤损伤 (premalignant skin lesions)、睾丸癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高血钙症、宫颈癌、子宫内膜癌和肾上腺皮质癌。

在其它一些实施方式中，受治疗的趋化因子受体介导的病症是炎性疾病。不希望受到理论的约束，本文所公开的新型趋化因子-免疫球蛋白融合多肽可以结合这些细胞上的趋化因子受体和抑制能够导致炎症和炎性疾病的细胞事件。表4列出了各种例示性炎性疾病和所列疾病与具体趋化因子和趋化因子受体的关联。所列趋化因子受体与本文所公开的用作该受体的特异性配体的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽的靶向可以用来治疗所列的炎性疾病。

表4趋化因子、趋化因子受体和炎性疾病关联(依赖于病期)

本文所使用的术语“炎性疾病”包括由炎症至少部分地导致或者加重的疾病或病症，其特征主要在于受影响的组织或器官中的血流增加、水肿、免疫细胞的激活(如增殖、细胞因子生成或增强的吞噬作用)、发热、发红、肿胀、疼痛和/或功能丧失。炎症的原因可能是由于物理损伤、化学物质、微生物、组织坏死、细胞增殖性病症或其它媒介。

炎性疾病包括急性炎性疾病、慢性炎性疾病和复发性炎性疾病。急性炎性疾病一般持续时间相对较短，并且持续约几分钟至约1至2天，不过它们可能持续数周。急性炎性疾病的特征包括血量增加、流体和血浆蛋白的渗出(水肿)和白细胞(如嗜中性粒细胞)的迁移。慢性炎性疾病通常持续时间较长，例如数周至数月至数年或更长的时间，并且在组织学上与淋巴细胞和巨噬细胞的存在以及血管和结缔组织的增殖相关联。复发性炎性疾病包括一段时间后复发或具有周期性发作的病症。某些炎性疾病属于一个或多个类别。示例性炎性疾病包括但不限于：中枢或外周神经系统的炎性疾病(例如脓肿、艾滋病相关性感染、阿尔茨海默氏病、慢性疲劳综合症、先天性感染、脑炎、缺血、脑膜炎、多发性硬化、创伤性脑损伤等)；泌尿生殖系统的炎性疾病(例如子宫内膜异位症、肾小球硬化症、阴道和子宫颈感染、羊膜腔内感染、盆腔炎性疾病、肾脏炎/肾炎、性传播疾病、尿道炎、尿路感染、酵母感染等)；消化系统的炎性疾病(例如结肠癌、肝炎、炎性肠病、间质性膀胱炎、肠易激综合征、溃疡等)；呼吸系统的炎性疾病(例如慢性肺疾病、哮喘、结核病、肺炎等)；皮肤、体壁(integument)和骨骼肌肉系统的炎性病症(例如白塞氏病 ( disease)、克罗恩氏病、皮炎、齿龈炎、痛风、肌痛、骨关节炎、牙周炎、牛皮癣、类风湿性关节炎、脊柱关节病、皮肤晒伤等)；心血管系统的炎性疾病(例如动脉粥样硬化、心包炎、心内膜炎、川崎病、心肌炎、风湿热、血管炎)；自身免疫性疾病；猫抓病；眼部感染；莱姆病；淋巴结病；淋巴管炎；辐射诱发性炎症；结节病；斯耶格伦氏综合征；系统性红斑狼疮和相关病症；以及由微生物和炎症分子的感染引起的炎性病症。如本文所用的，术语“微生物”是指任何物种或类型的微生物，包括但不限于：细菌，病毒，古细菌，真菌，原生动物，支原体，朊病毒和寄生生物。术语微生物涵盖在另外的生物(例如动物(包括人类)和植物)中以及产生对该另外的生物具有致病性的媒介同时其本身对其他生物不具有直接的致病性或感染性的那些生物。如前所述，炎性疾病通常是至少部分地由于炎症引起或者因炎症而加重，这可以由炎性病症的症状和/或表现来表征，包括但不局限于受影响的组织和器官中的血量增加、水肿、免疫细胞的激活(如细胞增殖、细胞因子生成或者吞噬作用增强)、发热、发红、肿胀、疼痛和功能丧失。因此，本申请还提供了调节炎症的方法。术语“调节炎症”是指炎症的诱导或炎症的减轻，其中炎症是如在炎性疾病中出现的那样，是病理性的。本文使用的术语“减轻”是指预防炎症的症状和/或表现或者炎症的症状和/或表现的发展；抑制炎症的症状和/或表现的行进；阻止或预防炎症的症状和/或表现的发展；降低炎症的症状和/或表现的严重程度；改善或减轻与炎症相关的症状和/或表现，和/或引起炎症的症状和/或表现的消退。本发明通过如下实施例进行进一步的阐述，这些实施例不应该被解释为限制性的。下面的实施例可以包括与本主题相关的研究和实验过程中在不同时间收集的代表性数据的数据汇编。

下面所包括的实施例阐述了目前所公开的主题的模式。根据本公开内容和本领域技术人员的一般水平，本领域技术人员将会理解的是，以下实施例意在只是示例性的，并且可以采用许多变化、修改和变更而不脱离目前公开的主题的范围。

实施例1：质粒表达载体的生成

使用标准的分子生物学方法由来自InvivoGen(San Diego、CA)的 pFUSE-hIgG1-Fc1、pFUSE-hIgG2-Fc1、pFUSE-hIgG3-Fc1和 pFUSE-hIgG4-Fc1载体生成能够表达趋化因子-免疫球蛋白融合多肽的表达载体。该表达载体的实例示于图1-10中。

实施例2：趋化因子受体在乳腺癌细胞系中的表达

进行实验以比较CXCR7和CXCR3在不同阶段的乳腺癌组织、在非肿瘤性乳腺组织中的表达水平。非肿瘤性乳腺组织不表达可检测水平的 CXCR7。与非肿瘤性乳腺组织相比，CXCR7表达在晚期乳腺癌组织中显著较高。与正常乳腺细胞(MCF-10A)相比，CXCR7和CXCR3mRNA在乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)中均提高。

实施例3：var-CXCL11-IgG融合多肽抑制乳腺癌细胞中CXCR7和 CXCR3激活

使用Amnis ImageStream分析，本发明人发现，CXCL11刺激CXCR3 和CXCR7的聚集和快速脱敏，即CXCL12调节适度CXCR7集簇，并且肾上腺髓质素(adrenomedullin，AM)刺激CXCR3和CXCR7集簇。 CXCL11-IgG融合多肽废除CXCR3和CXCR7，但不废除CXCR4，由 CXCL11、CXCL12和AM引起的集簇和脱敏。

上述说明是处于教导本领域的技术人员如何实践本发明的的目的，而不是要详细描述本发明的在本领域的技术人员阅读本说明书之后会明了的所有那些显而易见的修改和变化。但是，其旨在将所有这些显而易见的改进和变化包括在由随后的实施方式限定的本发明的范围内。这些实施方式旨在覆盖有效满足预期目标的任何序列的成分和步骤，除非上下文有明确相反的指示。所有在本说明书中引用的参考文献在此通过引用的方式完全并入本文。

Claims

1.分离的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽，所述趋化因子-免疫球蛋白融合多肽包含：

选自由以下部分组成的组的趋化因子部分：人类CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL4L1、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14-1、CCL14-2、CCL15、CCL16、CCL17、CCL 18、CCL19、CCL20-1、CCL20-2、CCL21、CCL22、CCL23-1、CCL23-1、CCL24、CCL25-1、CCL25-2、CCL25-3、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL16、XCL1、XCL2、CX3CL1及其功能性变体；和

选自由以下部分组成的组的免疫球蛋白部分：人类IgG1的恒定区(IgG1Fc)、人类IgG2的恒定区(IgG1Fc)、人类IgG3的恒定区(IgG1Fc)、人类IgG4的恒定区(IgG1Fc)及其功能性变体。

2.如权利要求1所述的分离的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽，其中，所述融合多肽选自由以下融合多肽组成的组：CCL2-IgG1Fc、var-CCL2-IgG1Fc、CCL2-IgG2Fc、var-CCL2-IgG2Fc、CCL2-IgG3Fc、var-CCL2-IgG3Fc、CCL2-IgG4Fc、var-CCL2-IgG4Fc、CCL7-IgG1Fc、var-CCL7-IgG1Fc、CCL7-IgG2Fc、var-CCL7-IgG2Fc、CCL7-IgG3Fc、var-CCL7-IgG3Fc、CCL7-IgG4Fc、var-CCL7-IgG4Fc、CCL8-IgG1Fc、var-CCL8-IgG1Fc、CCL8-IgG2Fc、var-CCL8-IgG2Fc、CCL8-IgG3Fc、var-CCL8-IgG3Fc、CCL8-IgG4Fc、var-CCL8-IgG4Fc、CCL13-IgG1Fc、var-CCL13-IgG1Fc、CCL13-IgG2Fc、var-CCL13-IgG2Fc、CCL13-IgG3Fc、var-CCL13-IgG3Fc、CCL13-IgG4Fc、var-CCL13-IgG4Fc、CCL25-IgG1Fc、var-CCL25-IgG1Fc、CCL25-IgG2Fc、var-CCL25-IgG2Fc、CCL25-IgG3Fc、var-CCL25-IgG3Fc、CCL25-IgG4Fc、var-CCL25-IgG4Fc、CXCL11-IgG1Fc、var-CXCL11-IgG1Fc、CXCL11-IgG2Fc、var-CXCL11-IgG2Fc、CXCL11-IgG3Fc、var-CXCL11-IgG3Fc、CXCL11-IgG4Fc、var-CXCL11-IgG4Fc、CXCL13-IgG1Fc、var-CXCL13-IgG1Fc、CXCL13-IgG2Fc、var-CXCL13-IgG2Fc、CXCL13-IgG3Fc、var-CXCL13-IgG3Fc、CXCL13-IgG4Fc和var-CXCL13-IgG4Fc。

3.如权利要求1所述的分离的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽，其中，所述融合多肽选自由以下融合多肽组成的组：CCL2-IgG1Fc、CCL2(5-76)-IgG1Fc、CCL2(5-76K/H→A)-IgG1Fc、CCL2-IgG2Fc、CCL2(5-76)-IgG2Fc、CCL2(5-76K/H→A)-IgG2Fc、CCL2-IgG3Fc、CCL2(5-76)-IgG3Fc、CCL2(5-76K/H→A)-IgG3Fc、CCL2-IgG4Fc、CCL2(5-76)-IgG4Fc、CCL2(5-76K/H→A)-IgG4Fc、CCL7-IgG1Fc、CCL7(5-76)-IgG1Fc、CCL7(5-76K/H→A)-IgG1Fc、CCL7-IgG2Fc、CCL7(5-76)-IgG2Fc、CCL7(5-76K/H→A)-IgG2Fc、CCL7-IgG3Fc、CCL7(5-76)-IgG3Fc、CCL7(5-76K/H→A)-IgG3Fc、CCL7-IgG4Fc、CCL7(5-76)-IgG4Fc、CCL7(5-76K/H→A)-IgG4Fc、CCL8-IgG1Fc、CCL8(5-76)-IgG1Fc、CCL8(5-76K/H→A)-IgG1Fc、CCL8-IgG2Fc、CCL8(5-76)-IgG2Fc、CCL8(5-76K/H→A)-IgG2Fc、CCL8-IgG3Fc、CCL8(5-76)-IgG3Fc、CCL8(5-76K/H→A)-IgG3Fc、CCL8-IgG4Fc、CCL8(5-76)-IgG4Fc、CCL8(5-76K/H→A)-IgG4Fc、CCL13-IgG1Fc、CCL13(5-75)-IgG1Fc、CCL13(5-75K/H→A)-IgG1Fc、CCL13-IgG2Fc、CCL13(5-75)-IgG2Fc、CCL13(5-75K/H→A)-IgG2Fc、CCL13-IgG3Fc、CCL13(5-75)-IgG3Fc、CCL13(5-75K/H→A)-IgG3Fc、CCL13-IgG4Fc、CCL13(5-75)-IgG4Fc、CCL13(5-75K/H→A)-IgG4Fc、CCL25-IgG1Fc、CCL25(4-127)-IgG1Fc、CCL25(4-127K/H→A)-IgG1Fc、CCL25-IgG2Fc、CCL25(4-127)-IgG2Fc、CCL25(4-127K/H→A)-IgG2Fc、CCL25-IgG3Fc、CCL25(4-127)-IgG3Fc、CCL25(4-127K/H→A)-IgG3Fc、CCL25-IgG4Fc、CCL25(4-127)-IgG4Fc、CCL25(4-127K/H→A)-IgG4Fc、CXCL11-IgG1Fc、CXCL11(4-73)-IgG1Fc、CXCL11(4-73K/H→A)-IgG1Fc、CXCL11-IgG2Fc、CXCL11(4-73)-IgG2Fc、CXCL11(4-73K/H→A)-IgG2Fc、CXCL11-IgG3Fc、CXCL11(4-73)-IgG3Fc、CXCL11(4-73K/H→A)-IgG3Fc、CXCL11-IgG4Fc、CXCL11(4-73)-IgG4Fc、CXCL11(4-73K/H→A)-IgG4Fc、CXCL13-IgG1Fc、CXCL13(3-87)-IgG1Fc、CXCL13(3-87K/H→A)-IgG1Fc、CXCL13-IgG2Fc、CXCL13(3-87)-IgG2Fc、CXCL13(3-87K/H→A)-IgG2Fc、CXCL13-IgG3Fc、CXCL13(3-87)-IgG3Fc、CXCL13(3-87K/H→A)-IgG3Fc、CXCL13-IgG4Fc、CXCL13(3-87)-IgG4Fc和CXCL13(3-87K/H→A)-IgG4Fc。

4.如权利要求1所述的分离的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽，其中，所述融合多肽是聚乙二醇化融合多肽。

5.如权利要求4所述的分离的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽，其中，所述聚乙二醇化融合多肽具有至少约500,000道尔顿的分子量。

6.如权利要求4所述的分离的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽，其中，包含PEG分子的所述聚乙二醇化融合多肽具有至少约20,000道尔顿的分子量。

7.如权利要求4所述的分离的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽，其中，所述聚乙二醇化融合多肽具有不超过约10:1的PEG与融合多肽摩尔比。

8.如权利要求4所述的分离的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽，其中，所述聚乙二醇化融合多肽具有不超过约5:1的PEG与融合多肽摩尔比。

9.如权利要求4所述的分离的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽，其中，所述聚乙二醇化融合多肽具有不超过约2:1的PEG与融合多肽摩尔比。

10.如权利要求1所述的分离的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽，其中，趋化因子的所述功能性变体包含N-末端截断。

11.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1所述的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽。

12.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求3所述的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽。

13.一种表达载体，所述表达载体包含：

调控元件；和

多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至所述调控元件；

其中，所述多核苷酸编码权利要求1所述的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽。

14.如权利要求13所述的表达载体，其中，所述载体是基于质粒的表达载体。

15.如权利要求13所述的表达载体，其中，所述载体是基于病毒的表达载体。

16.一种药物组合物，所述药物组合物包含：

权利要求1所述的趋化因子-免疫球蛋白融合多肽；和

药学可接受的载体。

17.一种药物组合物，所述药物组合物包含：

权利要求13所述的表达载体，和

药学可接受的载体。

18.一种用于治疗受试者中的趋化因子受体介导的病症的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用有效量的权利要求16所述的药物组合物。

19.如权利要求18所述的方法，其中，所述趋化因子受体介导的病症选自由白血病、癌、黑色素瘤、肉瘤和淋巴瘤组成的组。

20.一种调节受试者中的炎症的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用有效量的权利要求1所述的药物组合物。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述炎症选自由如下炎症组成的组：中枢或外周神经系统的炎症；泌尿生殖系统的炎症；消化系统的炎症；呼吸系统炎症；皮肤、体壁和肌肉骨骼系统的炎症；心血管系统的炎症；自身免疫性疾病；猫抓病；眼部感染；莱姆病；淋巴结病；淋巴管炎症；辐射诱发性炎症；结节病；斯耶格伦氏综合征；系统性红斑狼疮；和由微生物感染和炎性分子导致的炎症。

22.一种治疗受试者中的趋化因子受体介导的病症的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用有效量的聚乙二醇化趋化因子或聚乙二醇化趋化因子-免疫球蛋白融合多肽，其中，所述趋化因子选自由以下因子组成的组：人类CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL19、CCL21、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、XCL1、XCL2、CX3CL1及其功能性变体。

23.如权利要求22所述的方法，其中，所述聚乙二醇化趋化因子选自由以下物质组成的组：CCL2-PEG、var-CCL2-PEG、CCL7-PEG、var-CCL7-PEG、CCL8-PEG、var-CCL8-PEG、CCL13-PEG、var-CCL13-PEG、CCL25-PEG、var-CCL25-PEG、CXCL11-PEG、var-CXCL11-PEG、CXCL13-PEG、var-CXCL13-PEG、CXCL16-PEG、和var-CXCL16-PEG。

24.如权利要求22所述的方法，其中，所述聚乙二醇化趋化因子-免疫球蛋白融合多肽选自由如下物质组成的组：CCL2-IgG1Fc、var-CCL2-IgG1Fc、CCL2-IgG2Fc、var-CCL2-IgG2Fc、CCL2-IgG3Fc、var-CCL2-IgG3Fc、CCL2-IgG4Fc、var-CCL2-IgG4Fc、CCL7-IgG1Fc、var-CCL7-IgG1Fc、CCL7-IgG2Fc、var-CCL7-IgG2Fc、CCL7-IgG3Fc、var-CCL7-IgG3Fc、CCL7-IgG4Fc、var-CCL7-IgG4Fc、CCL8-IgG1Fc、var-CCL8-IgG1Fc、CCL8-IgG2Fc、var-CCL8-IgG2Fc、CCL8-IgG3Fc、var-CCL8-IgG3Fc、CCL8-IgG4Fc、var-CCL8-IgG4Fc、CCL13-IgG1Fc、var-CCL13-IgG1Fc、CCL13-IgG2Fc、var-CCL13-IgG2Fc、CCL13-IgG3Fc、var-CCL13-IgG3Fc、CCL13-IgG4Fc、var-CCL13-IgG4Fc、CCL25-IgG1Fc、var-CCL25-IgG1Fc、CCL25-IgG2Fc、var-CCL25-IgG2Fc、CCL25-IgG3Fc、var-CCL25-IgG3Fc、CCL25-IgG4Fc、var-CCL25-IgG4Fc、CXCL11-IgG1Fc、var-CXCL11-IgG1Fc、CXCL11-IgG2Fc、var-CXCL11-IgG2Fc、CXCL11-IgG3Fc、var-CXCL11-IgG3Fc、CXCL11-IgG4Fc、var-CXCL11-IgG4Fc、CXCL13-IgG1Fc、var-CXCL13-IgG1Fc、CXCL13-IgG2Fc、var-CXCL13-IgG2Fc、CXCL13-IgG3Fc、var-CXCL13-IgG3Fc、CXCL13-IgG4Fc和var-CXCL13-IgG4Fc。