CN101443357A - Mcp1融合物 - Google Patents

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C·-C·仇
L·A·波伯
L·萨利文
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Abstract

本发明提供包含任选通过接头与免疫球蛋白融合的MCP1的多肽。还包括用所述多肽治疗疾病的方法。

Description

MCP1融合物
本申请要求2005年8月12日提交的美国临时专利申请号60/707,731的权益，其通过引用全部结合到本文中。
发明领域
本发明涉及特别有助于治疗或预防炎性疾病的融合蛋白；以及用所述融合蛋白治疗此类疾病的方法。
发明背景
单核细胞趋化蛋白-1(MCP1，也称为HCl1，MCAF，CCL2，SCYA2，GDCF-2，SMC-CF，HSMCR30，MGC9434，GDCF-2和HC11)是趋化因子受体CCR2的高选择性、高亲和力趋化因子配体。它由炎症组织局部分泌，吸引携带CCR2的细胞如单核细胞和记忆T细胞。与CCR2结合后，MCP1诱导钙流出，细胞沿MCP1的梯度迁移。
有确凿的生物学和遗传证据表明MCP1和CCR2在包括关节炎、动脉粥样硬化、多发性硬化和纤维化在内的炎性疾病中起关键作用。MCP1或CCR2缺陷的小鼠可免于出现实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)(Huang等，2001，J.Exp.Med.193：713；Izikson等，2000，J.Exp.Med.192：1075；Mahad和Ransohoff，2003，Semi.Immunol.15：23)。CCR2缺陷的小鼠还可免于出现胶原诱导性关节炎(Quinones等，2004，J.Clin.Invest.113：856)。而且，CCR2敲除的小鼠不出现动脉粥样硬化斑块(Charo和Taubman，2004，Circ.Res.95：858)。
本领域存在针对CCR2介导性炎症的抗炎剂的需要。
发明概述
本文公开的发明起源于一个惊人的发现：通过全身性给予趋化因子配体使受体脱敏来靶向作用于趋化因子受体，可防止携带受体的细胞运输至炎症部位，并防止暴露于活化信号如干扰素-γ。在本文讨论的例示性实施例中，将CCR2用作趋化因子受体，MCP1用作趋化因子配体。为了延长MCP1趋化因子的血清半衰期，通过用免疫球蛋白恒定区(从铰链至CH3区)标记MCP1设计免疫球蛋白-融合蛋白。
本发明可解决对抗炎疗法的需求及其它需求，在本发明的实施方案中，提供趋化因子配体如MCP1、SDF1或MIP1β或其片段(如其成熟多肽)，与延长蛋白体内半衰期的因子如免疫球蛋白或其片段或PEG融合。
本发明提供分离的多肽，包括(1)与一种或多种半衰期延长部分融合的一种或多种趋化因子多肽；或(2)两种或多种融合的趋化因子多肽。在本发明的实施方案中，MCP1选自人MCP1和小鼠MCP1。在本发明的实施方案中，所述部分是聚乙二醇(PEG)或免疫球蛋白。在本发明的实施方案中，所述多肽包括与一种或多种免疫球蛋白(如任何SEQ ID NO：8-12)融合的一种或多种成熟MCP1多肽(如人或小鼠)。在本发明的实施方案中，所述MCP1选自人MCP1和小鼠MCP1。在本发明的实施方案中，所述免疫球蛋白选自铰链区至CH3区的γ1和γ4。在本发明的实施方案中，所述多肽选自与小鼠IgG1融合的成熟人MCP1；与人IgG4融合的成熟人MCP1；与人IgG4单体变异体融合的成熟人MCP1；与人IgG1融合的成熟人MCP1；和与人IgG1单体变异体融合的成熟人MCP1。在本发明的实施方案中，所述MCP1包含选自SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在本发明的实施方案中，所述免疫球蛋白包含SEQ ID NO：3-7列出的氨基酸序列。在本发明的实施方案中，所述MCP1通过肽接头(如GS)与免疫球蛋白融合。本发明的范围包括包含任何多肽和药学上可接受的载体的药用组合物。本发明的范围还包括与一种或多种其它治疗剂缔合的任何多肽或其药用组合物；例如，其中所述其它治疗剂选自阿司匹林、双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、非诺洛芬、夫洛非宁、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、噁丙嗪、保泰松、吡罗昔康、双水杨酸酯、舒林酸、替诺昔康、噻洛芬酸、托美丁、苯甲酸倍他米松、戊酸倍他米松、丙酸氯倍他索、去羟米松、氟轻松、氟羟可舒松、表面类固醇、二丙酸阿氯米松、芦荟、安西奈德、安西奈德、蒽林、二丙酸倍他米松、戊酸倍他米松、卡泊三烯、丙酸氯倍他索、煤焦油、死海盐、地奈德、地奈德；戊酸倍他米松、去羟米松、二乙酸二氟拉松、泻盐、氟轻松、氟轻松、氟羟可舒松、丙酸氟替卡松、哈西奈德、丙酸卤贝他索、戊酸氢化可的松、氢化可的松、糠酸莫米松、油状麦片、凡士林、泼尼卡酯、水杨酸、他扎罗汀、曲安奈德、氢化可的松、地塞米松、甲基泼尼松龙和泼尼松龙的混合物、alefacept、依那西普、环孢菌素、甲氨蝶呤、阿曲汀、异维甲酸、羟基脲、霉酚酸酯、柳氮磺吡啶、6-硫鸟嘌呤、阿那白滞素、可注射金、青霉胺、硫唑嘌呤、氯喹、羟基氯喹、柳氮磺吡啶、口服金、金诺芬、硫代苹果酸金钠、金硫葡糖、美沙拉嗪、柳氮磺吡啶、布地奈德、甲硝唑、环丙沙星、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤或膳食补充剂钙、叶酸盐、维生素B12、塞来考昔、罗非考昔、伐地考昔、罗美昔布、艾托考昔、依法利珠单抗、阿达木单抗、英夫利昔单抗和ABX-IL8。
本发明提供编码本文任何一种多肽的分离的核苷酸，如编码选自下列的多肽：与小鼠IgG1融合的人未加工的MCP1；与人IgG4融合的人未加工的MCP1；与人IgG4单体变异体融合的人未加工的MCP1；与人IgG1融合的人未加工的MCP1；和与人IgG1单体变异体融合的人未加工的MCP1。在本发明的实施方案中，所述MCP1由SEQ IDNO：13列出的核苷酸序列编码。在本发明的实施方案中，所述免疫球蛋白由选自SEQ ID NO：14-18的核苷酸序列编码。在本发明的实施方案中，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO：19-23。本发明还包括含多核苷酸(如pcDNA3.1(+)hMCP1mIgG)的分离载体(如图1显示和/或包含SEQ ID NO：24的核苷酸序列)以及包含该载体的宿主细胞。
本发明还提供制备MCP1-Ig多肽的方法，包括在适合所述表达的条件下用含编码所述多肽的多核苷酸的表达载体转化宿主细胞(如pcDNA3.1(+)hMCP1 mIgG)，任选从宿主细胞分离多肽。在本发明的实施方案中，多核苷酸编码包含选自SEQ ID NO：8-12氨基酸序列的多肽。通过所述方法制备的任何多肽也在本发明范围之内。
本发明提供治疗受试者疾病的方法，通过降低趋化因子配体(如MCP1、SDF1或MIP1β)或趋化因子受体的表达或活性或者通过减少趋化因子受体携带细胞迁移入炎症组织内可治疗所述疾病，所述方法包括使受试者的趋化因子受体携带细胞对趋化因子配体脱敏。在本发明的实施方案中，所述疾病选自炎性疾病、寄生虫感染、细菌感染、病毒感染、癌症、心血管疾病和循环系统疾病。在本发明的实施方案中，通过全身性给予与半衰期延长部分(如免疫球蛋白或其片段)融合的趋化因子配体多肽或趋化因子配体多肽使趋化因子受体携带细胞对趋化因子配体脱敏。在本发明的实施方案中，所述MCP1包含SEQID NO：2列出的氨基酸序列。在本发明的实施方案中，Ig包含选自SEQ ID NO：3-7的氨基酸序列。在本发明的实施方案中，多肽是包含选自SEQ ID NO：8-12的氨基酸序列的MCP1-Ig。
本发明提供治疗或预防受试者炎性疾病的方法，包括给予受试者任选与又一种治疗剂或过程联合的MCP1-Ig或其药用组合物。在本发明的实施方案中，所述疾病选自阑尾炎、消化性溃疡、胃溃疡和十二指肠溃疡、腹膜炎、胰腺炎、炎性肠病、结肠炎、溃疡性结肠炎、伪膜性肠炎、急性结肠炎、缺血性结肠炎、憩室炎、会厌炎、失弛缓症、胆管炎、胆囊炎、腹部疾病、肝炎、克罗恩病、肠炎、惠普尔病、哮喘、过敏、过敏性休克、免疫复合物病、器官缺血、再灌注损伤、器官坏死、花粉热、脓毒症、败血症、内毒素性休克、恶病质、高热、嗜酸细胞性肉芽肿、肉芽肿病、肉状瘤病、脓毒性流产、附睾炎、阴道炎、前列腺炎和尿道炎、支气管炎、肺气肿、鼻炎、囊性纤维化、肺炎、成人呼吸窘迫综合征、黑肺病、肺泡炎、细支气管炎、咽炎、胸膜炎、鼻窦炎、皮炎、特应性皮炎、皮肌炎、晒伤、风疹疣、风疹块、狭窄、再狭窄、血管炎、脉管炎、心内膜炎、动脉炎、动脉粥样硬化、血栓性静脉炎、心包炎、心肌炎、心肌缺血、结节性多动脉炎、风湿热、脑膜炎、脑炎、多发性硬化、神经炎、神经痛、葡萄膜炎、关节炎和关节痛、骨髓炎、筋膜炎、佩吉特病、痛风、牙周病、类风湿性关节炎、滑膜炎、重症肌无力、甲状腺炎、系统性红斑狼疮、肺出血-肾炎综合征、白塞综合征、同种异体移植物排斥和移植物抗宿主病。在本发明的实施方案中，MCP1包含SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列。在本发明的实施方案中，Ig包含选自SEQ ID NO：3-7的氨基酸序列。在本发明的实施方案中，MCP1-Ig包含选自SEQ ID NO：8-12的氨基酸序列。在本发明的实施方案中，受试者是人。在本发明的实施方案中，又一种治疗剂或过程选自阿司匹林、双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、非诺洛芬、夫洛非宁、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、噁丙嗪、保泰松、吡罗昔康、双水杨酸酯、舒林酸、替诺昔康、噻洛芬酸、托美丁、苯甲酸倍他米松、戊酸倍他米松、丙酸氯倍他索、去羟米松、氟轻松、氟羟可舒松、表面类固醇二丙酸阿氯米松、芦荟、安西奈德、安西奈德、蒽林、二丙酸倍他米松、戊酸倍他米松、卡泊三烯、丙酸氯倍他索、煤焦油、死海盐、地奈德、地奈德、戊酸倍他米松、去羟米松、二乙酸二氟拉松、泻盐、氟轻松、氟轻松、氟羟可舒松、丙酸氟替卡松、哈西奈德、丙酸卤贝他索、戊酸氢化可的松、氢化可的松、糠酸莫米松、油状麦片、凡士林、泼尼卡酯、水杨酸、他扎罗汀、曲安奈德、氢化可的松、地塞米松、甲基泼尼松龙和泼尼松龙的混合物、alefacept、依那西普、环孢菌素、甲氨蝶呤、阿曲汀、异维甲酸、羟基脲、霉酚酸酯、柳氮磺吡啶、6-硫鸟嘌呤、阿那白滞素、可注射金、青霉胺、硫唑嘌呤、氯喹、羟基氯喹、柳氮磺吡啶、口服金、金诺芬、硫代苹果酸金钠、金硫葡糖、美沙拉嗪、柳氮磺吡啶、布地奈德、甲硝唑、环丙沙星、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤或膳食补充剂钙、叶酸盐、维生素B12、塞来考昔、罗非考昔、伐地考昔、罗美昔布、艾托考昔、依法利珠单抗、阿达木单抗、英夫利昔单抗、ABX-IL8和光疗。
本发明提供增加MCP1在受试者机体的体内半衰期的方法，包括使MCP1与免疫球蛋白或其片段融合。在本发明的实施方案中，MCP1包含SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列。在本发明的实施方案中，免疫球蛋白包含选自SEQ ID NO：3-7的氨基酸序列。
附图简述
图1.质粒pcDNA3.1(+)hMCP1 mIgG的图。
发明详述
本发明提供包含与任何半衰期延长部分融合的MCP1的多肽，所述部分延长或拖延MCP1在受试者机体中(如在血浆中)的体内半衰期。
分子生物学
根据本发明，可应用本领域技能范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。在文献中有关于此类技术的全面解释。参阅如Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验指南)，第2版(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(本文称为＂Sambrook，等，1989＂)；DNA Cloning：A Practical Approach(DNA克隆：实用方法)，I和II卷(D.N.Glover编辑，1985)；Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸 合成)(M.J.Gait编辑，1984)；Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)(B.D.Hames & S.J.Higgins编辑(1985))；Transcription And Translation (转录和翻译)(B.D.Hames & S.J.Higgins编辑(1984))；Animal Cell Culture(动物细胞培养)(R.I.Freshney编辑(1986))；Immobilized Cells And Enzymes(固定细胞和酶)(IRL Press，(1986))；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(分子克隆的实用指南)(1984)；F.M.Ausubel等(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学 的最新方案)，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。
“多核苷酸”、“核酸”或“核酸分子”包括核糖核苷(腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷；＂RNA分子＂)或脱氧核糖核苷(脱氧腺嘌呤核苷、脱氧鸟嘌呤核苷、脱氧胸腺嘧啶核苷或脱氧胞嘧啶核苷；＂DNA分子＂)的磷酸酯聚合物形式或其任何磷酸酯类似物，如硫代磷酸酯和硫酯，为单链形式、双链形式等。
“多核苷酸序列”、“核酸序列”或“核苷酸序列”是核酸如DNA或RNA中的一连串核苷酸碱基(也称为“核苷酸”)，指任何两个或多个核苷酸链。
“编码序列”或“编码”表达产物如RNA、多肽、蛋白质或酶的序列，是表达时可产生产物的核苷酸序列。
术语“基因”指编码或对应于核糖核苷酸或氨基酸(包括一种或多种RNA分子、蛋白质或酶的全部或部分)特殊序列的DNA序列，可包括或不包括调控DNA序列，例如启动子序列，该序列确定如基因表达的条件。可将基因从DNA转录为RNA，可将其翻译或不翻译为氨基酸序列。
“蛋白质序列”、“肽序列”或“多肽序列”或“氨基酸序列”包括蛋白质、肽或多肽中的连续两个或多个氨基酸。
“分离的多核苷酸”或“分离的多肽”分别包括多核苷酸(如RNA或DNA分子或混合聚合物)或多肽，部分或完全与正常出现在细胞或重组DNA表达系统的其它组分分离。这些组分包括但不限于细胞膜、细胞壁、核糖体、聚合酶、血清组分和外源性基因组序列。
虽然优选分离的多核苷酸或多肽是基本均匀的分子组合物，但可包含一些不均匀性。
DNA的“扩增”用于本文包括用聚合酶链式反应(PCR)增加DNA序列混合物中特殊DNA序列的浓度。关于PCR的描述，参阅Saiki等，Science(1988)239：487。
术语“宿主细胞”包括以任何方式选择、修饰、转染、转化、生长或使用或处理的任何生物体的任何细胞，通过细胞制备物质，例如通过细胞使基因、DNA或RNA序列或蛋白质表达或复制。宿主细胞包括细菌细胞(如大肠杆菌(E.coli))、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK293细胞、骨髓瘤细胞(包括但不限于SP2/0、NS1和NS0)、鼠类巨噬细胞J774细胞或任何其它巨噬细胞系和人肠上皮Caco2细胞。
多核苷酸的核苷酸序列可通过本领域已知的任何方法测定(如化学测序或酶测序)。DNA的“化学测序”包括如Maxam和Gilbert的方法(1977)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：560)，其中用个别碱基特异性反应使DNA随机断裂。DNA的“酶测序”包括如Sanger的方法(Sanger等，(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463)。
本文的多核苷酸可位于天然调控(表达控制)序列旁侧，或者可与异源性序列缔合，所述异源性序列包括启动子、内部核糖体进入位点(IRES)及其它核糖体结合位点序列、增强子、效应元件、抑制子、信号序列、多腺苷酸化序列、内含子、5′-和3′-非编码区等。
一般而言，“启动子”或“启动子序列”是能够与细胞内RNA聚合酶结合(如直接或通过其它启动子结合蛋白质或物质)并开始转录编码序列的DNA调控区。启动子序列通常在其3′末端被转录起始位点结合，向上游(5′方向)延伸，包括以任何水平开始转录所需要的最小量碱基或元件。在启动子序列内，可发现转录起始位点(例如通过用S1单链核酸酶作图方便地限定)以及负责与RNA聚合酶结合的蛋白质结合域(共有序列)。可使启动子与其它表达控制序列(包括增强子和阻遏子序列)或与本发明的多核苷酸可操作性缔合。可用于控制基因表达的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子(美国专利号5,385,839和5,168,062)、SV40早期启动子区(Benoist等，(1981)Nature290：304-310)、包含在Rous肉瘤病毒3′长末端重复中的启动子(Yamamoto等，(1980)Cell 22：787-797)、疱疹胸腺嘧啶核苷激酶启动子(Wagner等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1441-1445)、金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等，(1982)Nature 296：39-42)；原核表达载体如β-内酰胺酶启动子(Villa-Komaroff等，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：3727-3731)或者tac启动子(DeBoer等，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25)；还参阅“Useful proteins from recombinant bacteria(来自细菌重组体的有用的蛋白质)”Scientific American(1980)242：74-94；以及来自酵母或其它真菌的启动子元件如Gal 4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(甘油磷酸激酶)启动子或碱性磷酸酶启动子。
编码序列在细胞内转录和翻译控制序列“控制之下”、“与其功能性联合”或“与其可操作性联合”，当该序列指示RNA聚合酶介导编码序列转录入RNA、优选mRNA内时，可将其RNA剪接(如果它包含内含子)，任选翻译成由该编码序列编码的蛋白质。
术语“表达(express)”和“表达(expression)”指允许或引起基因、RNA或DNA序列的信息表现出来；例如，通过激活与相应基因转录和翻译有关的细胞功能产生蛋白质。DNA序列表达在细胞中或者由细胞形成“表达产物”如RNA(如mRNA)或蛋白质。表达产物本身也可称为被细胞“表达”。
术语“转化”指将多核苷酸引入细胞。引入的基因或序列可称为“克隆”。接受引入DNA或RNA的宿主细胞已经被“转化”，是“转化体”或“克隆”。引入宿主细胞的DNA或RNA可来自任何来源，包括与宿主细胞相同种类或物种的细胞，或者来自不同种类或物种的细胞。
术语“载体”包括媒介物(如质粒)，其中可将DNA或RNA序列引入宿主细胞内，以便转化宿主，任选启动所引入序列的表达和/或复制。
可用于本发明的载体包括质粒、病毒、噬菌体、可整合的DNA片段及可促进多核苷酸引入宿主内的其它媒介物。虽然质粒是最常用的载体形式，但本领域已知或者变成已知的发挥相似功能的所有其它载体形式都适用于本文。参阅如Pouwels等，Cloning Vectors：A Laboratory Manual(克隆载体：实验手册)，1985和Supplements，Elsevier，N.Y.，和Rodriguez等(编辑)，Vectors：A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses(载体：分子克隆载体及其用途的调查)，1988，Buttersworth，Boston，MA。
本发明包括制备MCP1(如成熟MCP1多肽)、MCP1多聚体或其融合物(如与体内半衰期延长部分(如Ig)融合)(如表达系统)的方法。在本发明的实施方案中，将MCP1或其多聚体或融合物插入引入合适的宿主细胞的表达载体内。然后让蛋白质在宿主细胞中表达。可将蛋白质从宿主细胞中分离和再纯化。通过此类方法制备的任何多肽也在本发明的范围之内。
术语“表达系统”指在合适条件下，可表达由载体携带和引入宿主细胞的蛋白质或核酸的宿主细胞和相容性载体。常用表达系统包括大肠杆菌(E.coli)宿主细胞或哺乳动物宿主细胞(如CHO细胞、HEK293细胞和骨髓瘤细胞)和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体，以及哺乳动物宿主细胞和载体。
编码本发明的MCP1或其多聚体或融合物的核酸的表达可在原核或真核细胞中用常规方法进行。虽然原核系统最常应用大肠杆菌(E.coli)宿主细胞，但也可使用本领域已知的许多其它细菌，如假单胞菌属和杆菌属的各种菌株。适合表达编码多肽的核酸的宿主细胞包括原核生物和高等真核生物。原核生物包括革兰氏阴性和革兰氏阳性生物，如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。高等真核生物包括来自动物细胞的已建立的组织培养细胞系(如CHO细胞)，所述动物细胞包括非哺乳动物来源(如昆虫细胞和鸟)和哺乳动物来源(如人、灵长类和啮齿类)。
原核宿主-载体系统包括用于许多不同物种的多种载体。扩增DNA的代表性载体是pBR322或其多种衍生物的任何一种(如pUC18或19)。可用于表达MCP1多肽的载体包括但不限于包含lac启动子(pUC-系列)、trp启动子(pBR322-trp)、Ipp启动子(pIN-系列)、lambda-pP或pR启动子(pOTS)或hybrid启动子如ptac(pDR540)的载体。参阅Brosius等，＂Expression Vectors Employing Lambda-，trp-，lac-，andIpp-derived Promoters(Lambda-、trp-、lac-和Ipp-衍生的启动子使用的表达载体)＂，Rodriguez和Denhardt(编辑)Vectors：A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses(载体：分子克隆载体及其用 途的调查)，1988，Buttersworth，Boston，205-236页。可将多种多肽高水平表达在E.coli/T7表达系统中，如公开于美国专利号4,952,496、5,693,489和5,869,320和Davanloo，P.等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：2035-2039；Studier，F.W.等，(1986)J.Mol.Biol.189：113-130；Rosenberg，A.H.等，(1987)Gene 56：125-135；和Dunn，J.J.等，(1988)Gene 68：259。
T7表达系统包括包含表达盒的pET质粒，其中将感兴趣的基因(如MCP1或其多聚体或融合物)插入来自大肠杆菌(E.coli)噬菌体T7的极强启动子之后(Studier等，J.Mol.Biol.189(1)：113-30(1986))。在T7聚合酶缺乏时，该启动子关闭。为了发生表达，将pET质粒转化入菌株内，该菌株通常包含λ溶源菌(最常用的溶源菌称为DE3)染色体上T7聚合酶的单拷贝。T7聚合酶在Lac-UV5 lac启动子的控制之下。当细胞在无乳糖的培养基中生长时，lac阻遏子(lacl)与lac操纵子结合，防碍lac启动子转录。当乳糖是唯一碳源，或者当乳糖类似物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)加入培养基时，乳糖(或IPTG)与阻遏子结合，诱导其与操纵子分离，允许启动子转录。将葡萄糖加入培养基内，通过分解物阻遏机制促成T7 RNA聚合酶的阻遏。
高等真核组织培养细胞也可用于本发明的MCP1或其多聚体或融合物的重组制备。可使用高等真核组织培养细胞系，包括昆虫杆状病毒表达系统和哺乳动物细胞。此类细胞的转化或转染和增殖可成为常规操作。有用的细胞系实例包括HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、HEK 293细胞、骨髓瘤细胞、J774细胞、Caco2细胞、幼大鼠肾(BRK)细胞系、昆虫细胞系、鸟细胞系和猴(COS)细胞系。通常，此类细胞系的表达载体包括复制起始点、启动子、翻译起始位点、RNA剪接位点(如果用基因组DNA)、多腺苷酸化位点和转录终止位点。这些载体通常也包含选择基因或扩增基因。合适的表达载体可以由质粒、病毒或逆转录病毒携带启动子衍生，如衍生自此类来源如腺病毒、SV40、细小病毒、痘苗病毒或巨细胞病毒。表达载体的实例包括
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pCDNA1、pCD(Okayama等，(1985)Mol.Cell Biol.5：1136)、pMClneo Poly-A(Thomas等，(1987)Cell 51：503)、pREP8、pSVSPORT及其衍生物，和杆状病毒载体如pAC373或pAC610。
在本发明的实施方案中，可将MCP1-Ig用蛋白质A或蛋白质G层析纯化。蛋白质A和蛋白质G优选与免疫球蛋白结合。而且，可将多肽用标准方法纯化，所述方法包括但不限于盐或醇沉淀、亲和层析、制备圆盘凝胶电泳、等电聚焦、高压液相层析(HPLC)、反相HPLC、凝胶过滤、阳离子和阴离子交换和分配层析以及逆流分配。此类纯化方法已为本领域熟知，公开于如“Guide to Protein Purification(蛋白质纯化指南)”，Methods in Enzymology，182卷，M.Deutscher编辑，1990，Academic Press，New York，NY。当从细胞或组织来源分离多肽时，在测定系统中优选包含一种或多种蛋白水解酶抑制剂，如苯甲磺酰氟(PMSF)、Pefabloc SC、抑肽素、亮肽素、糜蛋白酶抑素和EDTA。
发生在多肽内的修饰(如翻译后修饰)通常将是其如何产生的功能。对于宿主内克隆基因表达产生的多肽，例如修饰的性质和程度，大部分将取决于宿主细胞的翻译后修饰能力和多肽氨基酸序列中存在的修饰信号。例如，众所周知，糖基化通常不发生在细菌宿主如大肠杆菌(E.coli)中。因此，当需要MCP1或其多聚体或融合物糖基化时，可将多肽表达在糖基化宿主、通常是真核细胞中。昆虫细胞通常发生与哺乳动物细胞相似的翻译后糖基化。由于这种原因，已经开发有效地表达具有天然糖基化模式的哺乳动物蛋白质的昆虫细胞表达系统。可用于本发明的昆虫细胞是来自昆虫纲生物体的任何细胞；例如，所述昆虫是草地贪夜蛾(Spodoptera fruigiperda)(Sf9或Sf21)或者粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(High 5)。可用于本发明(例如制备MCP1或其多聚体或融合物)的昆虫表达系统实例包括Bac-To-Bac(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)或Gateway(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)。如果需要，可在制备真核表达系统时用去糖基化酶除去连接的碳水化合物。
可用常规和本领域熟知的方法使多肽如MCP1或其融合物或多聚体聚乙二醇化或加入聚乙二醇(PEG)(参阅如美国专利号5,691,154、美国专利号5,686,071、美国专利号5,639,633、美国专利号5,492,821、美国专利号5,447,722、美国专利号5,091,176)。
本发明涉及对本发明的MCP1或其多聚体或融合物相应的氨基酸或核苷酸序列的任何表面或轻度修饰。具体来讲，本发明涉及编码本发明多肽的多核苷酸的序列保守性变异。多核苷酸序列的“序列保守性变异”是指其中特定密码子内一个或多个核苷酸的改变不引起该位置编码的氨基酸改变。本发明还涉及本发明多肽的功能保守性变异。“功能保守性变异”是指其中蛋白质或酶的一个或多个氨基酸残基已经改变，多肽的总体构象和功能未改变，包括但决不限于一种氨基酸被具有相似特性的氨基酸置换。本领域熟知特性相似的氨基酸。例如，可互换的极性/亲水氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；可互换的非极性/疏水氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸；可互换的酸性氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸，可互换的碱性氨基酸包括组氨酸、赖氨酸和精氨酸。
本发明包括编码MCP1(如成熟MCP1多肽)、MCP1多聚体或其融合物(如与体内半衰期延长部分(如Ig)融合)(如任何SEQ ID NO：1、2、8-12)的多核苷酸以及杂交为多核苷酸的核酸。优选核酸在低严紧性条件、更优选在中严紧性条件且最优选在高严紧性条件下杂交。在适当的温度和溶液离子强度条件下，当核酸分子的单链形式退火为另一种核酸分子时，该核酸分子“可杂交为”另一种核酸分子，如cDNA、基因组DNA或RNA(参阅Sambrook等，同上)。温度和离子强度的条件决定杂交的“严紧性”。典型低严紧性杂交条件是55℃、5×SSC、0.1％SDS、0.25％牛奶和无42℃甲酰胺；或者30％甲酰胺、5×SSC、0.5％SDS和42℃。通常，中严紧性杂交条件类似于低严紧性条件，但杂交在40％甲酰胺中，用5×或6×SSC在42℃进行。高严紧性杂交条件与低严紧性条件相似，但杂交条件在50％甲酰胺、5×或6×SSC中，任选在更高温度(如高于42℃：57℃、59℃、60℃、62℃、63℃、65℃或68℃)下进行。一般而言，SSC是0.15M NaCl和0.015M枸橼酸钠。杂交要求两种核酸包含互补序列，但根据杂交的严紧性，碱基之间可能错配。核酸杂交的合适严紧性取决于核酸长度和互补度，为本领域熟知的变量。两种核苷酸序列之间相似性或同源性程度越大，核酸可杂交的严紧性越高。对于长度大于100个核苷酸的杂交，已经建立计算解链温度的公式(参阅Sambrook等，同上，9.50-9.51)。对于较短核酸即寡核苷酸的杂交，错配的位置变得更重要，寡核苷酸的长度决定其特异性(参阅Sambrook等，同上)。
本发明还包括含核苷酸序列的多核苷酸和含氨基酸序列的多肽，当用BLAST算法进行比较时，与参考MCP1(如成熟MCP1多肽)、MCP1多聚体或其融合物(如与体内半衰期延长部分(如Ig)融合)的任何SEQ ID NO：13和19-23的核苷酸序列和任何SEQ ID NO：1、2和8-12的氨基酸序列至少约70％相同、优选至少约80％相同、更优选至少约90％相同且最优选至少约95％相同(如95％、96％、97％、98％、99％、100％)，其中选择该算法的参数使各序列之间的最大配对超过各参考序列的全长。
本发明还包括含氨基酸序列的多肽，当用BLAST算法进行比较时，与参考MCP1(如成熟MCP1多肽)、MCP1多聚体或其融合物(如与体内半衰期延长部分(如Ig)融合)的任何SEQ ID NO：1、2和8-12至少约70％相似、优选至少约80％相似、更优选至少约90％相似且最优选至少约95％相似(如95％、96％、97％、98％、99％、100％)，其中选择该算法的参数使各序列之间的最大配对超过各参考序列的全长。
序列一致性指被比较的两种序列核苷酸或氨基酸之间的精确配对。序列相似性指除了不一致的生化相关性氨基酸之间匹配之外，被比较的两种多肽氨基酸之间的精确匹配。具有相似特性且可互换的生化相关性氨基酸在上文讨论。
下列关于BLAST算法的参考文献通过引用结合到本文中：BLAST算法：Altschul，S.F.等，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；Gish，W.等，(1993)Nature Genet.3：266-272；Madden，T.L.等，(1996)Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul，S.F.等，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang，J.等，(1997)Genome Res.7：649-656；Wootton，J.C.等，(1993)Comput.Chem.17：149-163；Hancock，J.M.等，(1994)Comput.Appl.Biosci.10：67-70；校准评分系统：Dayhoff，M.O.等，＂A model ofevolutionary change in proteins.＂在Atlas of Protein Sequence and Structure(蛋白质序列和结构图谱)，(1978)第5卷，增刊3.M.O.Dayhoff(编辑)，345-352页，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，DC；Schwartz，R.M.等，＂Matrices for detecting distant relationships.＂在Atlas of Protein Sequence and Structure(蛋白质序列和结构图谱)，(1978)第5卷，增刊3.M.O.Dayhoff(编辑)，353-358页，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，DC；Altschul，S.F.，(1991)J.Mol.Biol.219：555-565；States，D.J.等，(1991)Methods 3：66-70；Henikoff，S.等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919；Altschul，S.F.等，(1993)J.Mol.Evol.36：290-300；校准统计学：Karlin，S.等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268；Karlin，S.等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877；Dembo，A.等，(1994)Ann.Prob.22：2022-2039；和Altschul，S.F.＂Evaluating the statistical significance of multiple distinctlocal alignments(计算多种不同局部对比的统计学显著性).＂在Theoretical and Computational Methods in Genome Research(基因组研 究的理论和计算方法)(S.Suhai，编辑)，(1997)1-14页，Plenum，NewYork。
趋化因子配体及其融合物
本发明包括包含任选通过连接肽(如GS)与一种或多种“半衰期延长部分”融合的一种或多种任何趋化因子如MCP1多肽的任何融合多肽。本发明还包括包含融合入单纯连续多肽链的两种或多种趋化因子多肽或其片段的任何趋化因子配体多聚体。
在本发明的实施方案中，趋化因子多肽是MCP1、SDF1(包括SDF1α或SDF1β；参阅基因库检索号P48061)或MIP1β(参阅基因库检索号NP_002975.1、AAA36656.1、AAA36752.1、AAA51576.1、AAA57256.1、AAB00790.1、AAX07292.1、CAA34291.1、CAA37722.2、CAA37723.1或CAG46916.1)。在本发明的实施方案中，趋化因子多肽是CCL或CXCL类趋化因子的任何成员，如任何CCL1、2、3、4、5、6、7、8、9/10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28；或者任何CXCL1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。例如，在本发明的实施方案中，趋化因子选自I309、MIP1α、MIP1β、RANTES、C10、MCP2、MCP3、CCF18、嗜酸细胞活化趋化因子1、MCP4、MCP5、HCC1、HCC2、NCC4、TARC、PARK、ELC、LARC、SLC、MDC、MPIF1、嗜酸细胞活化趋化因子2、TECK、嗜酸细胞活化趋化因子3、ALP、CTACK的任何一种。例如，在本发明的实施方案中，趋化因子选自CCL23、CCL28、GROα、GROβ、GROγ、PF4、ENA78、GCP2、PBP、β-TG、CTAP-III、NAP-2、IL-8、MIG、IP10、I-TAC、SDF1、BLC、BRAK、lungine、淋巴细胞趋化因子或fractalkine的任何一种。本发明包括包含与半衰期延长部分(如MCP1-SDF1-Ig)融合的1种以上趋化因子的融合物。
“半衰期延长部分”是附加于多肽时，延长多肽在受试者机体(如在受试者血浆中)的体内半衰期的任何部分，如多肽、小分子或聚合物。例如，在本发明的实施方案中，半衰期延长部分是聚乙二醇(PEG)、单甲氧基PEG(mPEG)或免疫球蛋白(Ig)。在本发明的实施方案中，PEG是5、10、12、20、30、40或50kDa或更大的部分，或者包含约12000个乙二醇单元(PEG12000)。
术语“Ig”或“免疫球蛋白”包括来自任何物种如人或小鼠的任何免疫球蛋白及其任何片段或变异体或突变体。该术语包括任何重链IgG(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgA(如IgA1或IgA2)、IgM、IgD和IgE。在本发明的实施方案中，“Ig”或“免疫球蛋白”指来自从铰链区至重链CH3的任何上述多肽。在本发明的实施方案中，“Ig”是免疫球蛋白的“单体变异体”或“单体”。免疫球蛋白的单体变异体不与另一种免疫球蛋白(参阅如SEQ ID NO：5和7)二聚化。通过使涉及免疫球蛋白二聚化的一个或多个残基(如半胱氨酸残基)突变，可构建任何免疫球蛋白的单体变异体。例如，可使半胱氨酸残基突变为丝氨酸。
本发明还提供MCP1多聚体(如(成熟或未加工的MCP1)n其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9或10以上)。MCP1多聚体包含与一种或多种其它MCP1多肽或其成熟多肽融合的一种或多种MCP1多肽或其成熟多肽。
术语“MCP1”包括来自任何生物体(如来自任何哺乳动物如人、黑猩猩、犬类(参阅如检索号P52203)、红原鸡、印度野牛(参阅如检索号P28291)、褐家鼠(参阅如检索号XP_213425)或小家鼠)的任何MCP1基因或蛋白质或其任何同系物或片段(如成熟MCP1)。用几个同义词描述MCP1，包括CCL2、HC11、MCAF、MCP1、MCP1、SCYA2、GDCF-2、SMC-CF、HSMCR30、MGC9434、GDCF-2和HC11。成熟MCP1多肽缺乏位于未加工或不成熟MCP1多肽的前导序列。本领域普通技术人员很容易鉴定前导序列。在本发明的实施方案中，MCP1前导序列是SEQ ID NO：1的氨基酸1-23。
术语“MCP1-Ig”包括含有与一种或多种免疫球蛋白多肽或其片段(如人IgG4或IgG1或其片段，只包括铰链至CH3区)以任何方式和任何方向融合的一种或多种MCP1多肽(如人或小鼠)或其片段的多肽。
在本发明的实施方案中，未加工的人MCP1多肽序列包含下列氨基酸序列：
MKVSAALLCLLLIAATFIPQGLAQPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT(SEQ ID NO：1)。
在本发明的实施方案中，人MCP1的成熟多肽序列包含下列氨基酸序列：
QPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT(SEQ ID NO：2)。
在本发明的实施方案中，成熟MCP1是SEQ ID NO：1的氨基酸30-99。在本发明的实施方案中，成熟MCP1包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中将焦谷氨酸加入N-端，在本发明的另一个实施方案中，成熟MCP1包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中N-端谷氨酰胺(Q)被焦谷氨酸代替。
在本发明的实施方案中，小鼠MCP1包含UniProtKB/Swiss-Prot检索号P10148或者检索号NP_035463或IPI00108087.1的氨基酸序列。本发明实施方案还包括这些多肽的成熟、加工版本(如其中除去信号肽氨基酸1-23)。在本发明的实施方案中，小鼠MCP1包含氨基酸序列：
mqvpvmllgl lftvagwsih vlaqpdavna pltccysfts kmipmsrles ykritssrcpkeavvfvtkl krevcadpkk ewvqtyiknl drnqmrsept tlfktasalr ssaplnvkltrkseanastt fstttsstsv gvtsvtvn
(SEQ ID NO：30)
在本发明的实施方案中，小鼠免疫球蛋白重链恒定区(仅为铰链至CH3)的成熟多肽序列，同种型γ1包含氨基酸序列：
VPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO：3)
在本发明的实施方案中，人免疫球蛋白重链恒定区(仅为铰链至CH3)的成熟多肽序列，同种型γ4包含氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：4)
在本发明的实施方案中，人免疫球蛋白重链恒定区(仅为铰链至CH3)的成熟多肽序列，同种型γ4单体变异体(下划线为铰链区C突变为S)包含氨基酸序列：
ESKYGPPSPSSPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：5)
在本发明的实施方案中，人免疫球蛋白重链恒定区(仅为铰链至CH3)的成熟多肽序列，同种型γ1包含氨基酸序列：
VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：6)
在本发明的实施方案中，人免疫球蛋白重链恒定区(仅为铰链至CH3)的成熟多肽序列，同种型γ1单体变异体(下划线为铰链区C突变为S)包含氨基酸序列：
VEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：7)
在本发明的实施方案中，与小鼠IgG1(下划线为接头)融合的成熟人MCP1多肽序列包含氨基酸序列：
QPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKTGSVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO：8)
在本发明的实施方案中，与人IgG4(下划线为接头)融合的成熟人MCP1多肽序列包含氨基酸序列：
QPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKTGSESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：9)
在本发明的实施方案中，与人IgG4单体变异体(下划线为接头)融合的成熟人MCP1多肽序列包含氨基酸序列：
QPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKTGSESKYGPPSPSSPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：10)
在本发明的实施方案中，与人IgG1(下划线为接头)融合的成熟人MCP1多肽序列包含氨基酸序列：
QPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKTGSVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO：11)
在本发明的实施方案中，与人IgG1单体变异体(下划线为接头)融合的人MCP1多肽序列包含氨基酸序列：
QPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKTGSVEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：12)
在本发明的实施方案中，人MCP1编码区的DNA序列包含核苷酸序列(下划线为起始和终止密码子；粗体字为成熟多肽第一个氨基酸的密码子)：
atgaaagtctctgccgcccttctgtgcctgctgctcatagcagccaccttcattccccaagggctcgctcagccagatgcaatcaatgccccagtcacctgctgttataacttcaccaataggaagatctcagtgcagaggctcgcgagctatagaagaatcaccagcagcaagtgtcccaaagaagctgtgatcttcaagaccattgtggccaaggagatctgtgctgaccccaagcagaagtgggttcaggattccatggaccacctggacaagcaaacccaaactccgaagacttga(SEQ ID NO：13)
在本发明的实施方案中，小鼠重链免疫球蛋白恒定区γ1同种型，从铰链区氨基末端开始至CH3区羧基末端终止(下划线为终止密码子)的DNA序列包含核苷酸序列：
gtgcccagggattgtggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttccccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggaggtgcacacagctcagacaaaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgttcagtcagtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtcaacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccgaaggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtcagtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtggaatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggctcttacttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttcacctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggtaaatga(SEQ ID NO：14)
在本发明的实施方案中，人重链免疫球蛋白恒定区γ4同种型，从铰链区氨基末端开始至CH3区羧基末端终止(下划线为终止密码子)的DNA序列包含核苷酸序列：
gagtccaaatatggtcccccatgcccatcatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaat ga(SEQ ID NO：15)
在本发明的实施方案中，人重链免疫球蛋白恒定区γ4同种型单体变异体，从铰链区氨基末端开始至CH3区羧基末端终止(下划线是半胱氨酸变为丝氨酸；粗体为终止密码子)的DNA序列包含核苷酸序列：
gagtccaaatatggtcccccatctccatcatctccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaatga(SEQ ID NO：16)
在本文列出的任何免疫球蛋白单体变异体(其中一个或多个半胱氨酸已经突变)中，编码丝氨酸的密码子可以是编码丝氨酸的任何密码子；例如AGT、AGC、TCT、TCC、TCA或TCG。
在本发明的实施方案中，人重链免疫球蛋白恒定区γ1同种型，从铰链区氨基末端开始至CH3区羧基末端终止(下划线是终止密码子)的DNA序列包含核苷酸序列：
gttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga(SEQ ID NO：17)
在本发明的实施方案中，人重链免疫球蛋白恒定区γ1同种型单体变异体，从铰链区氨基末端开始至CH3区羧基末端终止(下划线是半胱氨酸变为丝氨酸；粗体为终止密码子)的DNA序列包含核苷酸序列：
gttgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatctccaccgtctccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga(SEQ ID NO：18)
在本发明的实施方案中，与小鼠IgG1融合的人MCP1(包括前导肽)的cDNA包含核苷酸序列：
atgaaagtctctgccgcccttctgtgcctgctgctcatagcagccaccttcattccccaagggctcgctcagccagatgcaatcaatgccccagtcacctgctgttataacttcaccaataggaagatctcagtgcagaggctcgcgagctatagaagaatcaccagcagcaagtgtcccaaagaagctgtgatcttcaagaccattgtggccaaggagatctgtgctgaccccaagcagaagtgggttcaggattccatggaccacctggacaagcaaacccaaactccgaagactggatccgtgcccagggattgtggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttccccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggaggtgcacacagctcagacaaaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgttcagtcagtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtcaacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccgaaggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtcagtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtggaatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggctcttacttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttcacctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggtaaatga(SEQ ID NO：19)
在本发明的实施方案中，与人IgG4融合的人MCP1(包括前导肽)的cDNA包含核苷酸序列：
atgaaagtctctgccgcccttctgtgcctgctgctcatagcagccaccttcattccccaagggctcgctcagccagatgcaatcaatgccccagtcacctgctgttataacttcaccaataggaagatctcagtgcagaggctcgcgagctatagaagaatcaccagcagcaagtgtcccaaagaagctgtgatcttcaagaccattgtggccaaggagatctgtgctgaccccaagcagaagtgggttcaggattccatggaccacctggacaagcaaacccaaactccgaagactggatccgagtccaaatatggtcccccatgcccatcatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaatga(SEQ ID NO：20)
在本发明的实施方案中，与人IgG4单体变异体融合的人MCP1(包括前导序列)的cDNA包含核苷酸序列：
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在本发明的实施方案中，与人IgG1融合的人MCP1(包括前导序列)的cDNA包含核苷酸序列：
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在本发明的实施方案中，与人IgG1单体变异体融合的人MCP1(包括前导序列)的cDNA包含核苷酸序列：
atgaaagtctctgccgcccttctgtgcctgctgctcatagcagccaccttcattccccaagggctcgctcagccagatgcaatcaatgccccagtcacctgctgttataacttcaccaataggaagatctcagtgcagaggctcgcgagctatagaagaatcaccagcagcaagtgtcccaaagaagctgtgatcttcaagaccattgtggccaaggagatctgtgctgaccccaagcagaagtgggttcaggattccatggaccacctggacaagcaaacccaaactccgaagactggatccgttgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatctccaccgtctccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga(SEQ ID NO：23)
在本发明的实施方案中，编码包含成熟人MCP1和小鼠IgG的融合蛋白的表达质粒即质粒pcDNA3.1(+)hMCP1mIgG的序列(下划线为起始和终止密码子，粗体为MCP1与mIg接头的密码子)包含核苷酸序列：
gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttacgatcagtcgaattcgccgccaccatgaaagtctctgccgcccttctgtgcctgctgctcatagcagccaccttcattccccaagggctcgctcagccagatgcaatcaatgccccagtcacctgctgttataacttcaccaataggaagatctcagtgcagaggctcgcgagctatagaagaatcaccagcagcaagtgtcccaaagaagctgtgatcttcaagaccattgtggccaaggagatctgtgctgaccccaagcagaagtgggttcaggattccatggaccacctggacaagcaaacccaaactccgaagactggatccgtgcccagggattgtggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttccccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggaggtgcacacagctcagacaaaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgttcagtcagtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtcaacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccgaaggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtcagtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtggaatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggctcttacttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttcacctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggtaaatgactagtcatagtttagcggccgctcgagtctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactgg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本发明的融合物包含以任何顺序重复任何次数的一种或多种MCP1和一种或多种半衰期延长部分(如免疫球蛋白)。如果融合物包含多种MCP1，则所述MCP1可以相同或不同。例如在实施方案中，本发明的融合物包含人MCP1-小鼠MCP1-Ig。本发明的融合物还包括多种免疫球蛋白多肽。例如在实施方案中，融合物包含人MCP1-人MCP1-IgG1-IgG1、人MCP1-人MCP1-IgG1-IgG4或人MCP1-Ig-小鼠MCP1-Ig-Ig-人MCP1。任何这些实施方案都包括在术语“MCP1-Ig”中。本发明还包括如(人MCP1)2-PEG或小鼠MCP1-人MCP1-PEG。
本发明羧基端MCP1融合物的范围包括氨基端含有MCP1的融合物；术语MCP1-Ig指这些类型融合物。例如，本发明包括任何下列MCP1-Ig融合物：人MCP1-Ig、Ig-人MCP1、小鼠MCP1-Ig、Ig-小鼠MCP1、PEG-人MCP1或人MCP1-PEG。
在本发明的实施方案中，本发明的MCP1-Ig融合物包含连接MCP1和Ig的接头(如肽接头)。在本发明的实施方案中，接头包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。
除了pcDNA3.1(+)hMCP1 mIgG之外，下列质粒形成本发明一部分。质粒pcDNA3.1(+)hMCP1 hIgG4(下划线为起始和终止密码子，粗体为MCP-1与mIg接头的密码子)：
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质粒pcDNA3.1(+)hMCP1 hIgG4单体变异体(下划线为起始和终止密码子，粗体为MCP-1与mIg接头密码子)：
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质粒pcDNA3.1(+)hMCP1 hIgG1单体变异体(下划线为起始和终止密码子，粗体为MCP-1与mIg接头密码子)：
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治疗组合物和方法
本发明包括治疗或预防任何病症、紊乱或疾病的方法，通过减少趋化因子受体携带细胞(如CCR2携带细胞；如单核细胞、巨噬细胞和记忆T淋巴细胞)迁移至炎症组织内、降低内源性趋化因子(如MCP1)表达或相关活性(如CCR2受体结合)或者通过降低趋化因子受体(如CCR2)的表达或活性可治疗所述病症、紊乱或疾病。在本发明的实施方案中，通过将配体全身性给予受试者，使受试者的趋化因子受体(如CCR2)携带细胞对同源趋化因子配体(如MCP1)的存在脱敏，治疗炎性疾病。在本发明的实施方案中，可延长给予趋化因子配体的时间，以便达到在细胞中完全脱敏的水平。例如，本发明包括治疗或预防受试者炎性疾病的方法，给予受试者治疗有效量的趋化因子或其多聚体或融合物，如MCP1、MCP1多聚体或其融合物(如与体内半衰期延长部分(如PEG或Ig)融合)或其药用组合物(如包含药学上可接受的载体)，任选与其联合的是治疗有效量的其它治疗剂。
本发明的药用组合物可用制药领域熟知的任何方法制备。参阅如Gilman等，(编辑)(1990)，The Pharmacological Bases of Therapeutics(治 疗药理学基础)，第8版，Pergamon Press；A.Gennaro(编辑)，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，(1990)，Mack PublishingCo.，Easton，Pennsylvania.；Avis等，(编辑)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications(药物剂型：胃肠外药物)Dekker，New York；Lieberman等，(编辑)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms： Tablets(药物剂型：片剂)Dekker，New York；和Lieberman等，(编辑)(1990)，Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems(药物剂型：分 散系统)Dekker，New York。
在本发明的实施方案中，术语“炎性疾病”或“医学炎性疾病”包括银屑病(如指甲银屑病、头皮银屑病、斑块型银屑病、脓疱型银屑病、点滴型银屑病、反相银屑病、红皮病型关节炎或银屑病性关节炎)、强直性脊柱炎、阑尾炎、消化性溃疡、胃溃疡和十二指肠溃疡、腹膜炎、胰腺炎、炎性肠病、结肠炎、溃疡性结肠炎、伪膜性肠炎、急性结肠炎、缺血性结肠炎、憩室炎、会厌炎、失弛缓症、胆管炎、胆囊炎、腹部疾病、肝炎、克罗恩病(如回结肠炎、回肠炎、胃十二指肠克罗恩病、空肠回肠炎或克罗恩(肉芽肿)结肠炎)、肠炎、惠普尔病、哮喘、过敏、过敏性休克、免疫复合物病、器官缺血、再灌注损伤、器官坏死、花粉热、脓毒症、败血症、内毒素性休克、恶病质、高热、嗜酸细胞性肉芽肿、肉芽肿病、肉状瘤病、脓毒性流产、附睾炎、阴道炎、前列腺炎和尿道炎、支气管炎、肺气肿、鼻炎、囊性纤维化、肺炎、成人呼吸窘迫综合征、黑肺病、肺泡炎、细支气管炎、咽炎、胸膜炎、鼻窦炎、皮炎、特应性皮炎、皮肌炎、晒伤、风疹疣、风疹块、狭窄、再狭窄、血管炎、脉管炎、心内膜炎、动脉炎、动脉粥样硬化、血栓性静脉炎、心包炎、心肌炎、心肌缺血、结节性多动脉炎、风湿热、脑膜炎、脑炎、多发性硬化、神经炎、神经痛、葡萄膜炎(如前型、后型、中间型或弥散型)、关节炎和关节痛、骨髓炎、筋膜炎、佩吉特病、痛风、牙周病、类风湿性关节炎(如多关节过程的青少年类风湿性关节炎或银屑病关节炎)、滑膜炎、重症肌无力、甲状腺炎、系统性红斑狼疮、肺出血-肾炎综合征、白塞综合征、同种异体移植物排斥或移植物抗宿主病。
本发明还包括治疗或预防受试者寄生虫、病毒或细菌感染的方法，给予受试者治疗有效量的趋化因子、多聚体或其融合物，如MCP1、MCP1多聚体或其融合物(如与体内半衰期延长部分(如PEG或Ig)融合)或其药用组合物(如包含药学上可接受的载体)，任选与其联合的是治疗有效量的其它治疗剂。在本发明的实施方案中，感染是单纯疱疹病毒感染(如HSV1或HSV2)、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV；如I型)感染、HIV感染、HIV神经病变、脑膜炎、肝炎(A、B或C等)、脓毒性关节炎、腹膜炎、肺炎、会厌炎、大肠杆菌(E.coli)0157：h7)、溶血性尿毒症综合征、血栓性血小板减少性紫癜、疟疾、登革出血热、利什曼病、麻风病、中毒性休克综合征、链球菌性肌炎、气性坏疽、结核分枝杆菌、鸟胞内分枝杆菌、卡氏肺囊虫肺炎、骨盆炎性疾病、睾丸炎、epidydimitis、军团菌病、莱姆病、A型流感、EB病毒、致命性嗜血细胞综合征、致命性脑炎或无菌性脑膜炎。
本发明还包括治疗或预防受试者癌症或恶性肿瘤(如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、胰腺癌、前列腺癌或膀胱癌)的方法，给予受试者治疗有效量的趋化因子、多聚体或其融合物，如MCP1、MCP1多聚体或其融合物(如与体内半衰期延长部分(如PEG或Ig)融合)或其药用组合物(如包含药学上可接受的载体)，任选与其联合的是治疗有效量的其它治疗剂。
本发明还包括治疗或预防受试者任何心血管或循环系统疾病的方法，给予受试者治疗有效量的趋化因子、多聚体或其融合物，如MCP1、MCP1多聚体或其融合物(如与体内半衰期延长部分(如PEG或Ig)融合)或其药用组合物(如包含药学上可接受的载体)，任选与其联合的是治疗有效量的其它治疗剂。在本发明的实施方案中，所述疾病或病症是心脏顿抑综合征、心肌梗死、充血性心力衰竭、中风、缺血性中风、出血、动脉硬化、动脉粥样硬化、再狭窄、糖尿病动脉硬化性疾病、高血压、动脉性高血压、肾血管性高血压、晕厥、休克、心血管系统梅毒、心力衰竭、肺心病、原发性肺动脉高压、心律失常、心房异位搏动、房扑、房颤(持续或阵发性)、灌注后综合征、心肺分流术炎症反应、紊乱性或多源性房性心动过速、规则的窄QRS心动过速、特殊心律失常、室颤、His束心律失常、房室传导阻滞、束支传导阻滞、心肌缺血性疾病、冠心病、心绞痛、心肌梗死、心肌病、扩张型充血性心肌病、限制性心肌病、心脏瓣膜病、心内膜炎、心包疾病、心脏肿瘤、主动脉和外周动脉瘤、主动脉夹层、大动脉炎症、腹主动脉及其分支闭塞、外周血管疾病、闭塞性动脉疾病、外周动脉硬化性疾病、闭塞性血栓性脉管炎、功能性外周动脉疾病、雷诺氏现象和疾病、手足发绀、红斑性肢痛病、静脉疾病、静脉血栓形成、静脉曲张、动静脉瘘、淋巴水肿、脂肪水肿、不稳定心绞痛、再灌注损伤、泵后综合征和缺血性再灌注损伤。
包含趋化因子、其多聚体或融合物如MCP1或其多聚体或融合物(如MCP1-Ig)的药用组合物可用常规药学上可接受的赋形剂和添加剂与常规方法制备。此类药学上可接受的赋形剂和添加剂包括非毒性可相容的填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂等。涉及所有给药途径，包括但不限于胃肠外(如皮下、静脉内、腹膜内、瘤内或肌内)和非胃肠外(如口服、经皮、鼻内、眼内、舌下、吸入、直肠和体表)。
可将注射剂制备成常规形式，如液体溶液或混悬液、适合在注射前成为液体溶液或混悬液的固体形式，或者作为乳液。注射液、溶液和乳液还可包含一种或多种赋形剂。合适的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。此外，如果需要，给予的药用组合物还可包含少量非毒性辅助物质如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、增溶剂及其它此类物质如乙酸钠、单月桂酸脱水山梨醇酯、油酸三乙醇胺酯和环糊精。
用于胃肠外制剂的药学上可接受的载体包括水性溶媒、非水性溶媒、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局麻药、悬浮剂和分散剂、乳化剂、掩蔽剂(sequestering)或螯合剂及其它药学上可接受的物质。
水性溶媒的实例包括氯化钠注射液、林格氏注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液、右旋糖和乳酸盐林格氏注射液。非水性胃肠外溶媒包括蔬菜来源的不挥发油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。通常将抑制细菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂加入包装在多剂量容器中的胃肠外制剂内，所述抗微生物剂包括苯酚或甲酚、汞制剂、苯甲醇、三氯叔丁醇、对羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯、柳硫汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲剂包括磷酸盐和枸橼酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局麻药包括盐酸普鲁卡因。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨醇酯80(TWEEN-80)。金属离子的隐蔽剂或螯合剂包括EDTA。药用载体还包括乙醇、聚乙二醇和丙二醇，用作水混溶性溶媒；和氢氧化钠、盐酸、枸橼酸或乳酸，用于调节pH。
胃肠外给药的制剂可包括准备注射的无菌溶液、准备在使用前与溶剂合并的无菌干燥可溶性制品如冻干粉剂(包括皮下注射用片)、准备注射的无菌混悬液、准备在使用前即时与溶媒合并的无菌干燥不溶性制品以及无菌乳液。溶液可以是水性或非水性。
本文还涉及植入延缓释放或持续释放系统，以便维持恒定的剂量水平。简言之，在该实施方案中，使趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体(如MCP1-Ig)分散在固体内部基质中，所述基质如聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、增塑或未增塑的聚氯乙烯、增塑尼龙、增塑聚对苯二甲酸乙酯、天然橡胶、聚异戊二烯、聚异丁烯、聚丁二烯、聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、硅酮橡胶、聚二甲基硅氧烷、碳酸硅酮共聚物、亲水聚合物如丙烯酸和甲基丙烯酸酯的水凝胶、胶原、交联聚乙烯醇和交联部分水解的聚乙酸乙烯酯，被包围在不溶于体液的外聚合物膜中，所述外聚合物膜为如聚乙烯、聚丙烯、乙烯/丙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、硅酮橡胶、聚二甲基硅氧烷、氯丁橡胶、氯化聚乙烯、聚氯乙烯、与乙酸乙烯酯的氯乙烯共聚物、偏二氯乙烯、乙烯和丙烯、离子聚合物聚对苯二酸乙烯酯、丁基橡胶、氯醇橡胶、乙烯/乙烯醇共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇三聚物和乙烯/乙烯氧基乙醇共聚物。在释放率控制步骤中，活性成分通过外聚合物膜弥散。此类胃肠外组合物包含的活性化合物的百分数高度取决于其具体特性，以及趋化因子或其多聚体或融合物如MCP1或其融合物或多聚体的活性以及受试者的需要。
可调节趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体的浓度以便注射的有效量可产生所需药理学作用。精确剂量特别取决于如本领域已知的患者或动物的年龄、体重和疾病。
将包含趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体的单位剂量胃肠外制剂包装在安瓿、小瓶或带针头的注射器内。如本领域已知和实施，所有胃肠外给药的制剂都必须无菌。此类制剂形成本发明的一部分。
可将趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体配制成可复原为溶液、乳液及其它混合物给药的冻干粉剂。还可将粉剂复原和配制为固体或凝胶。
通过使趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体或其药学上可接受的衍生物溶于合适溶剂中，制备无菌、冻干粉剂。所述溶剂可包括改善稳定性的赋形剂或者另一种粉剂或用粉剂制备的复原溶液的药学组分。可使用的赋形剂包括但不限于右旋糖、脱水山梨醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它合适赋形剂。所述溶剂还可包含缓冲剂如枸橼酸盐、磷酸钠或磷酸钾或本领域技术人员已知的其它此类缓冲剂，在一个实施方案中，约为中性pH。接着在本领域技术人员已知的标准条件下先后将溶液无菌过滤和冻干，得到所需制剂。在一个实施方案中，将所得溶液分配在小瓶内低压冻干。每个瓶可容纳单剂量或多剂量的趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体。可将冻干粉剂贮存在适当条件下，如约4℃至室温。
用注射用水将冻干粉剂重新配制，得到用于胃肠外给药的制剂。重新配制时，可将冻干粉剂加入无菌水或另一种合适载体中。精确的量取决于所选化合物。这样的量可按照经验确定。
通过用如与三氯氟甲烷、二氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或任何其它生物学相容性推进气体一起的如含三油酸脱水山梨醇酯或油酸的气雾剂，可吸入给药；还可以用包含趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体本身或与赋形剂联合的粉剂形式系统。
在实施方案中，将趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体配制为口服给药的固体剂型，在一个实施方案中，配制为胶囊剂或片剂。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可包含一种或多种下列成分或性质相似的化合物：粘合剂、润滑剂、稀释剂、助流剂、崩解剂、着色剂、甜味剂、调味剂、湿润剂、催吐包衣和薄膜包衣。粘合剂实例包括微晶纤维素、西黄蓍胶、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶溶液、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、交聚维酮、蔗糖和淀粉糊。润滑剂包括滑石、淀粉、硬脂酸镁或硬脂酸钙、石松和硬脂酸。稀释剂包括例如乳糖、蔗糖、淀粉、高岭土、盐、甘露醇和磷酸二钙。助流剂包括但不限于胶体二氧化硅。崩解剂包括交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、海藻酸、玉米淀粉、马铃薯淀粉、膨润土、甲基纤维素、琼脂和羧甲基纤维素。着色剂包括例如任何得到批准认证的水溶性FD和C染料、其混合物；和悬浮在氢氧化铝上的水不溶性FD和C染料。甜味剂包括蔗糖、乳糖、甘露醇和人造甜味剂如糖精和任何数量的喷雾干燥香料。调味剂包括提取自植物如水果的天然调味剂和产生令人愉快的感觉的合成化合物混合物(例如但不限于薄荷和水杨酸甲酯)。湿润剂包括单硬脂酸丙二醇酯、单油酸脱水山梨醇酯、单月桂酸二甘醇酯和聚氧乙烯月桂醚。催吐包衣包括脂肪酸、脂肪、蜡、虫胶、含铵虫胶和邻苯二甲酸乙酸纤维素。薄膜包衣包括羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇4000和邻苯二甲酸乙酸纤维素。
本发明范围包括给药方法，所述方法包括给予与例如一种或多种其它治疗剂联合的趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体或其药用组合物，以及包含与其它治疗剂联合的趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体的组合物。在实施方案中，其它治疗剂是给予受试者后治疗或预防受试者炎性疾病的药物。任何此类药物的给药和剂量通常根据核准药物的产品信息表列出的方案确定，参阅Physicians′Desk Reference 2003(Physicians′Desk Reference，第57版)；Medical Economics Company；ISBN：1563634457；第57版(2002年11月)以及本领域熟知的治疗方案。
术语“联合”表示可将趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体和其它治疗剂配制为单纯组合物同时递送或者单独配制为两种或多种组合物(如药剂盒)。而且，可在不同于其它组分的给药时间将各组分给予受试者；例如，可在给定时间段内以几种间隔非同时(如单独或按顺序)进行每次给药。而且，可以相同或不同途径(如口服、静脉内、皮下)将单独组分给予受试者。
“其它治疗剂”是给予受试者时，产生所需或有益的治疗作用，如预防、消除或减少与指定疾病(如炎性疾病)有关的症状进展或严重度的除了趋化因子、多聚体或其融合物之外的任何药物。其它治疗剂可以是例如抗炎剂或镇痛剂。
可与趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体联合给药或合并的其它治疗剂包括一种或多种非甾体抗炎药(NSAID)如阿司匹林、双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、非诺洛芬、夫洛非宁、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、噁丙嗪、保泰松、吡罗昔康、双水杨酸酯、舒林酸、替诺昔康、噻洛芬酸或托美丁。
可与趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体联合给药或合并的其它治疗剂包括一种或多种外用药，如蒽林、卡泊三烯、水杨酸、煤焦油、他扎罗汀、表面类固醇(如丙酸氯倍他索、丙酸氯倍他索、二丙酸倍他米松、丙酸氯倍他索、二乙酸二氟拉松、丙酸氯倍他索、丙酸卤贝他索、安西奈德、二丙酸倍他米松、二丙酸倍他米松、糠酸莫米松、二乙酸二氟拉松、哈西奈德、氟轻松、二乙酸二氟拉松、二丙酸倍他米松、二乙酸二氟拉松、去羟米松、去羟米松、曲安奈德、丙酸氟替卡松、安西奈德、二丙酸倍他米松、二乙酸二氟拉松、氟轻松、戊酸倍他米松、二乙酸二氟拉松、二丙酸倍他米松、去羟米松、戊酸倍他米松、曲安奈德、氟羟可舒松、氟轻松、糠酸莫米松、曲安奈德、氟轻松、苯甲酸倍他米松、戊酸氢化可的松、氟羟可舒松、丙酸氟替卡松、泼尼卡酯、地奈德、二丙酸倍他米松、曲安奈德、氢化可的松、氟轻松、苯甲酸倍他米松、戊酸倍他米松、戊酸氢化可的松、二丙酸阿氯米松、地奈德、氟轻松、地奈德、戊酸倍他米松、或者氢化可的松、地塞米松、甲基泼尼松龙和泼尼松龙的混合物)、凡士林、芦荟、油状麦片、泻盐或死海盐。
可与趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体联合给药或合并的其它治疗剂包括一种或多种alefacept、依那西普、环孢菌素、甲氨蝶呤、阿曲汀、异维甲酸、羟基脲、霉酚酸酯、柳氮磺吡啶或6-硫鸟嘌呤。
可与趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体联合给药或合并的其它治疗剂包括一种或多种阿那白滞素、注射金、青霉胺、硫唑嘌呤、氯喹、羟基氯喹、柳氮磺吡啶或口服金(如金诺芬、硫代苹果酸金钠或金硫葡糖)。
可与趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体联合给药或合并的其它治疗剂包括一种或多种美沙拉嗪、柳氮磺吡啶、布地奈德、甲硝唑、环丙沙星、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤或膳食补充剂钙、叶酸盐或维生素B12。
可与趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体联合给药或合并的其它治疗剂包括一种或多种COX2抑制剂如塞来考昔
Figure A200680037443D00571
罗非考昔伐地考昔
Figure A200680037443D00573
罗美昔布(PrexigeTM)或艾托考昔
Figure A200680037443D00574
可与趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体联合给药或合并的其它治疗剂包括一种或多种抗体如依法利珠单抗
Figure A200680037443D00581
阿达木单抗
Figure A200680037443D00582
英夫利昔单抗
Figure A200680037443D00583
或ABX-IL8。
在本发明的实施方案中，将趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体与光疗联合给予受试者特别是患银屑病的受试者。在此类实施方案中，使受试者暴露于日光、UVB光、PUVA(补骨脂素加紫外线A)、PUVA(补骨脂素-UVA)或激光。PUVA用紫外线A光联合补骨脂素治疗银屑病，补骨脂素是使皮肤对光线更敏感的口服或外用药物。激光发出高度聚焦的光束，主要影响银屑病皮肤，但不明显暴露健康皮肤。一种激光类型XTRAC准分子激光使用高度聚焦的紫外线B光。另一种用于银屑病的激光类型是脉冲染料激光，用黄光脉冲--与UVB或XTRAC使用的紫外线不同--破坏银屑病斑中生长的一些血液细胞。用脉冲染料激光治疗通常需要几个月，每三周安排一次。
剂量和给药
本发明组合物治疗性给药的经典方案在本领域众所周知。例如可以通过任何胃肠外(如皮下注射、肌内注射、静脉内注射)或非胃肠外途径(如口服、经鼻)给予本发明的药用组合物。
可口服给予本发明的丸剂和胶囊剂。可将注射组合物用本领域已知的医疗设备给药；例如用皮下注射针注射。
也可将本发明的注射药用组合物用无针头的皮下注射设备给药；如公开于美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556的设备。
在实施方案中，如果可能，根据Physicians′Desk Reference 2003(Physicians′Desk Reference，第57版)；Medical Economics Company；ISBN：1563634457；第57版(November 2002)给予与趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体联合给药的“其它治疗剂”(如抗炎剂)的日剂量。但是，临床医生可改变适当剂量以补偿接受治疗受试者的具体特征，例如根据所给予化合物或趋化因子、多聚体或其融合物(如MCP1-Ig)的功效、副作用、年龄、体重、疾病、一般健康状态和反应。
本发明提供治疗或预防受试者炎性疾病的方法，给予受试者治疗有效量的趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体，与其任选联合的是治疗有效量的其它治疗剂。术语“治疗有效量”指引起组织、系统、受试者或宿主的生物学或医学反应的治疗剂或物质(如MCP1-Ig)的量，所述反应为给药者(如研究者、医生或兽医)所寻求，包括例如目标疾病或其任何症状任何程度(包括在受试者中预防疾病)的缓解、逆转、消除或终止或减缓进展。在本发明的实施方案中，趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体(如MCP1-Ig；如包含SEQ ID NO：8、9、10、11或12列出的任何氨基酸序列的多肽)的治疗有效量或剂量为约0.1mpk(mg每公斤体重)-约10mpk(如0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mpk)，每天、每2天、每4天或每5天1次或每周1次。
例如，可以每天3次、每天2次、每天1次、每周3次、每周2次或每周1次、每2周或每3、4、5、6、7或8周1次给予本发明组合物。而且，可用更短或更长时间(如1周、1月、1年、5年)给予组合物。
可调节剂量方案以优化所需反应(如治疗反应)。例如，可根据治疗情况的紧迫性减少或增加剂量。例如，可根据药物功效、疾病进展或持续性或其任何症状或者患者年龄、体重、身高、既往病史、现用药物和交叉反应的可能性、过敏反应、敏感性和不良反应，由本领域技术人员(如医生或兽医)调节剂量。
具有本领域普通技能的医生或兽医很容易确定和给出有效量所需药用组合物的处方。例如，医生或兽医可将趋化因子、多聚体或其融合物如MCP1或其融合物或多聚体或其药用组合物的起始剂量定在低于获得所需治疗作用需要的水平，逐渐增加剂量直至获得所需作用。
例如，医生或兽医可通过多种方法监测银屑病进展，从而可改变给药方案。监测银屑病的方法包括例如皮肤活检或刮除和培养皮肤斑块，监测受试者皮肤上病变的扩散情况，或者用X-线检查银屑病关节炎(如果出现关节疼痛并持续存在)。
例如，医生或兽医可通过多种方法监测类风湿性关节炎进展，从而可改变给药方案。监测类风湿性关节炎的方法包括例如关节X-线、检测血液类风湿因子、检测提高的红细胞沉降率(ESR)、全血细胞计数以检测低红细胞压积(贫血)或异常血小板计数、验血以检测C-反应蛋白或滑膜液分析。
例如，医生或兽医可通过多种方法监测克罗恩病进展，从而可改变给药方案。监测克罗恩病的方法包括例如监测受试者或患者报道症状的严重度、乙状结肠镜检查、结肠镜检查、ERCP(内窥镜逆行胰胆管造影)、超声内镜、囊内窥镜、X-线平片、X-线造影片、CT扫描或白细胞扫描。
例如，医生或兽医可通过多种方法监测葡萄膜炎进展，从而可改变给药方案。监测葡萄膜炎的方法包括例如用裂隙灯显微镜和眼底镜检查眼部、检查视力和眼内压。
例如，医生或兽医可通过多种方法监测溃疡性结肠炎进展，从而可改变给药方案。监测溃疡性结肠炎的方法包括例如常规检查、结肠镜检查、直肠或结肠活检、粪便检测潜血或脓液、验血以检查白细胞水平或X-线检查。
实施例
提供下列实施例以更清楚地描述本发明，不应视为限制本发明的范围。在实施例部分公开的任何方法或组合物构成本发明的一部分。
实施例1：人MCP1-小鼠Ig重链γ1(铰链-CH2-CH3)融合物的设计、构建、表达和纯化
构建体的设计
hMCP1-mIg(NH2-人MCP1-小鼠Ig重链γ1(铰链-CH2-CH3)-COOH)：将BamH1位点作为接头引入cDNA，在MCP1与IgH链接合处插入二肽Gly-Ser。预期产物形成预测分子量为68,993的二聚体。
hMCP1-hIgG4(NH2-人MCP1-人IgH链γ4(铰链-CH2-CH3)-COOH)：将BamH1位点作为接头引入cDNA，在MCP1与IgH链接合处插入二肽Gly-Ser。预期产物形成预测分子量为69,146的二聚体。
hMCP1-hIgG4单体变异体(NH2-人MCP1-人Ig重链γ4(铰链-CH2-CH3)-COOH)：两个半胱氨酸残基被丝氨酸残基代替以消除分子内二硫键。将BamH1位点作为接头引入cDNA，在MCP1与IgH链接合处插入二肽Gly-Ser。预期产物形成预测分子量为34,543的二聚体。
hMCP1-hIgG1(NH2-人MCP1-人IgH链γ1(铰链-CH2-CH3)-COOH)：将BamH1位点作为接头引入cDNA，在MCP1与IgH链接合处插入二肽Gly-Ser。预期产物形成预测分子量为70,000的二聚体。
hMCP1-hIgG1单体变异体(NH2-人MCP1-人Ig重链γ1(铰链-CH2-CH3)-COOH)：三个半胱氨酸残基被丝氨酸残基代替以消除分子内二硫键。将BamH1位点作为接头引入cDNA，在MCP1与IgH链接合处插入二肽Gly-Ser。预期产物形成预测分子量为34,955的二聚体。
表达和纯化。在本实施例中，使MCP1-Ig在哺乳动物细胞中表达和分泌，然后从细胞生长培养基分离。用SDS-PAGE分析分析分离的蛋白质。
通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆人MCP1的cDNA(参阅基因库检索号NM_002982)和来自小鼠Ig恒定区的部分cDNA(参阅基因库检索号BC057688)(包括铰链、CH2和CH3区的编码序列)。通过标准分子生物学操作使MCP1-Ig cDNA作为Hind3-Not1片段克隆入哺乳动物表达载体pCDNA3.1(+)(Invitrogen，Carlsbad，CA)内，得到pcDNA3.1(+)hMCP1mIgG质粒。
使CHO-K1(ATCC CRL-9618)细胞保持在补充5％胎牛血清的D-MEM/F-12培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。按照制造商提出的方案用Lipofectamine 2000转染试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)将质粒DNA导入CHO-K1细胞内。在转染后48小时，将G418(Invitrogen)以1mg/ml加入培养基内，选择稳定转染的细胞。在转染后约10-14天，出现耐G418细胞的菌落。然后将细胞收集，以每孔3个细胞、每孔1个细胞和每孔0.3个细胞的频率通过有限稀释在96孔组织培养板内转染。在约7-10天出现单细胞衍生的克隆，用小鼠IgG1(Bethyl，Montgomery，TX)特异性酶联免疫吸附测定(ELISA)检测条件培养基。通过将产率标化为细胞数再次检测最高滴度克隆的表达水平。选择每升产生大于40mg的克隆制备(克隆52)。
在无血清条件下制备hMCP1-mIg蛋白质。使克隆52细胞逐渐戒除血清(weaned)适应由IS-CHO V基础培养基(Irvine Scientific，Irvine，CA)组成的无蛋白质培养基的混悬培养液。每升无蛋白质培养基包含8mM谷氨酰胺(Invitrogen，Gaithersburg，MD)、10ml 100×HT(Invitrogen)、1ml CD-脂质(Invitrogen)、8ml 45％葡萄糖(Sigma，St.Louis，MO)、20ml GSEM(Sigma)、各1ml痕量元素A(Trace ElementA)和痕量元素B(Trace Element B)(Cellgro，Herndon，VA)。制备时，将1升体积细胞以0.5×106/ml密度接种在3升振荡烧瓶内。在7.5％CO2存在下，使烧瓶在37℃恒温以75rpm速度振荡。使谷氨酰胺浓度保持在约300毫克/升，葡萄糖浓度保持在1-2克/升。大约第14天收集条件培养基，这时细胞活力为约20％。使条件培养基通过2-微米过滤单元过滤，然后根据制造商提出的方案用Affi-凝胶蛋白-A亲和柱(BioRad，Hercules，CA)处理。在还原条件下用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析纯化的蛋白质。用SimplyBlue SafeStain(Invitrogen)将凝胶染色后观察到单一条带，估计大小为约34千道尔顿。估计该产物的纯度大于99％。
实施例2：细胞迁移测定
在本实施例中，证明人MCP1-mIg的存在可阻碍THP-1人单核细胞沿重组人MCP1梯度迁移的能力。
使THP-1细胞(ATCC TIB202)保持在补充10％胎牛血清、1mM丙酮酸钠、4.5g/升葡萄糖、1.5g/l碳酸氢钠、10mM HEPES、0.05mMβ-巯基乙醇和青霉素/链霉素的RPMI1640中。按照制造商说明书用具有5μm滤器的96孔ChemoTx微量板(NeuroProbe，Gathersburg，MD)进行细胞迁移测定。将重组人MCP1(rhMCP1)(R & D Systems，Minneapolis，MN)置于底室。将hMCP1-mIg或同种型对照IgG置于顶室和底室。使细胞分配在顶孔中。将微量板置于37℃增湿CO2(5％)培养箱中2小时，让细胞向底室的人MCP1迁移。按照制造商方案通过CellTiter-Glo Luminiscent Cell Viability Assay Kit(Promega，Madison，WI)将细胞迁移定量为相对发光单位(RLU)。用趋化因子试剂存在下的迁移RLU减去自发迁移RLU计算细胞迁移。用最高细胞迁移数作为100％计算相对迁移％。
hMCP1-mIg和rhMCP1的近似EC50值分别为约0.5nM和0.05nM(表1，左和中列)。3nM的hMCP1-mIg明显降低THP-1细胞沿rhMCP1梯度迁移的能力(表1，右列)。
表1.hMCP1-mIg和重组人MCP1(rhMCP1)对THP-1人单核细胞迁移的作用。
细胞迁移相对％
浓度(nM)单独hMCP1-mIg单独rhMCP1 3nM rhMCP1+hMCP1-mIg
Figure A200680037443D00631
Figure A200680037443D00641
实施例3：胶原诱发的关节炎测定
用II型牛胶原(BCII)(Elastin Products，Owensville，MO)、Difco不完全弗氏佐剂和结核分支杆菌(MBT，H37RA株，Sigma，St.Louis，MO)使12-13周龄雄性B10.RIII小鼠免疫。在4℃使BCII溶于0.01M乙酸(60mg BCII在25ml 0.01M乙酸中)中过夜。使结核分枝杆菌与Difco不完全弗氏佐剂(1mg/ml)混合制备完全弗氏佐剂(CFA)。然后使1体积BCII和1体积CFA混合乳化。所述乳液包含1200μg/ml BCII和0.5mg/ml结核分支杆菌。
在小鼠背部5个位点(包括尾基部的1个位点)皮内注射使其免疫。每只小鼠接受总体积为0.25ml的乳液，相当于300μg BCII/只小鼠。
在免疫后16天对小鼠关节炎的症状和严重度进行评分，分成15组，以便每组具有相同数目的关节炎小鼠。按照以下0-4级进行评分：
0＝正常
1＝发红
2＝一个或多个足趾肿胀
3＝全爪肿胀
4＝关节强直
加强免疫前4天和第0、2、4、7和9天进行评分。在这几天还通过测径器测量评估肿胀程度。
还加强免疫接种：使BCII在0.01M乙酸(12.5mg BCII在25ml0.01M乙酸中)中溶解过夜。在免疫后20天(加强免疫接种第0天)用100μg BCII/0.2ml/只小鼠腹膜内注射对小鼠加强免疫。
在磷酸盐缓冲液中制备2mg/ml hMCP1-mIg(SEQ ID NO：8)和mIgG1(TC31-27F11，SP-BioPharma，Palo Alto，CA)，在指定时间点腹膜内给予小鼠。首次剂量为20毫克每公斤体重(mpk)。后续剂量为10mpk。
在结束时采集血清样品测定抗胶原抗体(IgG2a)。
表2的平均疾病评分和表3的足爪肿胀值表明在hMCP1-mIg处理组小鼠观察到的保护作用。
用ELISA测定抗胶原IgG2a的血浆水平。在4℃将测定板用ELISA级II型牛胶原(Chondrex，Redmond，WA)以50μl/ml包被过夜。将板用PBS洗涤，然后在4℃用1％ BSA封闭过夜。简单洗涤后，将样品以1:10,000稀释，与以40pg/ml开始2倍连续稀释的标准品(USBiologicals，Swampscott，MA)一起置于板上。将板在4℃培养过夜。洗涤后，将100μl过氧化物酶缀合的抗IgG(Abcam，Cambridge，MA)(1:500稀释)加入各孔内，在室温下培养2小时。将板洗涤，将100μlTMB(Sigma)加入各孔内。在490nM读板。
在hMCP1-mIg处理的动物中，与同种型对照(mIgG1)处理的动物相比，抗胶原IgG2a抗体的水平受到抑制(表4)。
表2.小鼠胶原关节炎的关节炎评分(均数±SEM)。
Figure A200680037443D00651
表3.小鼠胶原关节炎的足爪肿胀程度(均数±SEM)。
足爪肿胀程度(mm)
Figure A200680037443D0066161651QIETU
星号表示hMCP1-mIg处理组与同种型对照组的足爪大小相比p<0.05。
表4.在第9天抗胶原IgG2a的血浆水平。
Figure A200680037443D00662
数据用均数和标准误差表示。
实施例4：受体结合测定
在本实施例中，测定hMCP1(R & D Systems)和hMCP1-mIg(SEQID NO：8)与CCR2受体结合的能力。
用来自公开序列的寡核苷酸序列通过RT-PCR，用人外周血单核细胞产生全长人CCR2 cDNA(基因库检索号NM_000648)。还用来自公开序列的寡核苷酸序列通过RT-PCR，用小鼠脾细胞产生全长小鼠CCR2 cDNA(基因库检索号NM_009915)。
使鼠类IL-3依赖性前B细胞Ba/F3保持在补充10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100μg/ml链霉素和100ug/ml青霉素、50μM2-巯基乙醇和2μg/ml重组小鼠IL-3(Biosource International，Camarillo，CA)的RPMI 1640培养基(Invitrogen，Gaithersburg，MD)中。按照Chou等描述于British J.Pharmacology 137：663(2002)的电穿孔方案，通过用pME18Sneo-hCCR2或mCCR2质粒稳定地转染Ba/F3小鼠前B细胞，建立表达人CCR2和小鼠CCR2的重组Ba/F3细胞。在1mg/ml遗传霉素(Invitrogen)的存在下选择稳定的转染体。
按照先前Chou等，2002的描述制备细胞膜。简言之，使细胞沉淀，再悬浮于细胞溶解缓冲液(10mMHEPES，pH 7.5)和
Figure A200680037443D0067094544QIETU
蛋白酶抑制剂(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)中，在冰上孵育5分钟。将细胞转移至4639细胞破碎仪(Parr Instrument，Moline，IL)中，在冰上用1500psi氮破碎30分钟。以500g离心5分钟除去大分子碎片，然后以100,000g离心30分钟使上清液中的细胞膜沉积。使膜再悬浮于含10％蔗糖的细胞溶解缓冲液中，贮存在-80℃。放射性标记的人MCP1(比活性＝2200Ci/mmol)购自Perkin-Elmer(Boston，MA)。
在CCR2受体结合测定中，结合反应在下列条件下进行：50mMHEPES、10mM NaCl、1mM CaCl2、10mM MgCl2、0.1％牛血清白蛋白、2μg细胞膜和160μg麦胚凝集素SPA珠(Amersham，Piscataway，NJ)、30pM放射性碘化的人MCP1以及指定浓度的竞争剂。在室温下不断摇动培养反应混合物。用1450 Microbeta Trilux counter(Wallac，Gaithersburg，MD)测量膜结合的放射性标记的rhMCP1。用GraphPadPrism 4软件(San Diego，CA)计算EC50和Ki值。
与放射性标记的rhMCP1竞争性结合含CCR2细胞的膜的hMCP1-mIg的效能比未标记rhMCP1小5-12倍(表5)。
表5.放射性碘化rhMCP1对CCR2结合的抑制
Figure A200680037443D00671
实施例5：MCP1-Ig融合物的表达、纯化和鉴定
在本实施例中，将融合物表达和纯化并鉴定。
hMCP-1-hIg融合蛋白变异体。使人MCP1-hIg变异体蛋白在哺乳动物细胞中表达、分泌，然后从细胞生长培养基分离。用上文关于纯化hMCP-1-mIg的相同方案进行纯化。用SDS-PAGE分析分离的蛋白质。
用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆人MCP1的cDNA(参阅基因库检索号NM_002982)和人免疫球蛋白重链γ1同种型(参阅基因库检索号019046)或γ4同种型(参阅基因库检索号BC025985)恒定区的部分cDNA(两种情况下都包括铰链、CH2和CH3区的编码序列)。为了产生γ1和γ4变异体的单体形式，用丝氨酸残基代替铰链区的半胱氨酸残基。
将对应于hMCP1-hIg变异体的cDNA作为Hind3-Not1片段分别克隆入哺乳动物表达载体pCDNA3.1(+)(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，通过标准分子生物学操作产生pcDNA3.1(+)hMCP1-hIgG质粒。
将相应质粒稳定转染入CHO-K1细胞内表达hMCP-1-hIg变异体。转染、选择稳定克隆、组织培养和产物纯化的方案类似于hMCP-1-mIg实施例所述。
如hMCP-1-mIg实施例，用THP-1细胞膜测定hMCP-1-hIg变异体对CCR2受体的结合亲和力。估计二聚体形式hMCP-1-hIg(γ1)的变异体Ki值为16.8pM，单体形式hMCP-1-hIg(γ1)的变异体Ki值为28.8pM，二聚体形式hMCP-1-hIg(γ4)的变异体Ki值为51.9pM，单体形式hMCP-1-hIg(γ4)的变异体Ki值为90.1pM。相比之下，在相同实验测定hMCP-1的Ki值为65.7pM。
通过THP-1细胞趋化测定还确定变异体的相对功效。该方案类似于hMCP-1-mIg实施例所述。二聚体形式hMCP-1-hIg(γ1)的估计EC50值为50pM，单体形式hMCP-1-hIg(γ1)的估计EC50值为90pM，二聚体形式hMCP-1-hIg(γ4)的估计EC50值为500pM，单体形式hMCP-1-hIg(γ4)的估计EC50值为500pM。相比之下，在相同实验测定hMCP-1的EC50值为200-400pM。
通过趋化性测定用THP-1细胞确定hMCP-1-hIg变异体使CCR2脱敏的能力。该方案类似于hMCP-1-mIg实施例所述。在向hMCP-1迁移测试之前，使细胞与各种变异体hMCP-1-hIg培养30分钟。在低至1nM Ig-融合蛋白，用二聚体或单体形式hMCP-1-hIg(γ1)预处理之后，THP-1细胞的迁移完全停止。当细胞分别与1nM二聚体或单体形式hMCP-1-hIg(γ4)预孵育时，hMCP-1的EC50值增加2-4倍。当与10nM二聚体或单体形式hMCP-1-hIg(γ4)预孵育时，hMCP-1的EC50值增加30倍以上。
hMCP-1-mIg的纯化。为了大规模纯化(200mg以上)hMCP-1-mIg(用于下文提出的EAE和抗胶原抗体诱发的关节炎模型)，用来自GEHealthcare(Uppsala，Sweden)的rProA Sepharose FF或MabSelect树脂进行ProA亲和层析。用高盐缓冲液使亲和柱平衡，所述缓冲液由10mM pH 7.2磷酸钠和125mM NaCl的氯化钠组成。将条件培养基装入柱内，然后用上文提出的相同缓冲液洗涤10床体积。将装有样品的柱用5床体积含10mM，pH 7.2磷酸钠的磷酸盐缓冲液洗涤。用5床体积0.1M pH 2.9的乙酸进行产物洗脱。立即用1M Tris碱使pH达到7.2中和洗脱液。调节pH之后，用Stericup Express GP Plus 0.22μm(Millipore，Bedford MA)过滤汇集液。
根据需要用Q Sepharose HiTRAPFF(GE Healthcare)任选进行阴离子交换层析除去少量杂质。平衡和洗涤缓冲液由10mM pH 7.2磷酸钠和125mM NaCl氯化钠组成。产物处于流穿液(flow-through)中。
用含10K再生纤维素的Amicon Stir Cell，Model 8050(Millipore)浓缩产物。
hMCP-1-mIg的药代动力学。用C57B6小鼠进行hMCP-1-mIg的药代动力学研究。将单剂量hMCP-1-mIg以10毫克/公斤体重静脉内、腹膜内或皮下注射三组小鼠。在30分钟至7天的时间点收集血清样品。用抗hMCP-1抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)作为捕获抗体，用辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG1抗体(Bethyl，Montgomery，TX)作为检测抗体，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测hMCP-1-mIg的残留水平。结果显示血清半衰期为3-5天。在第7天hMCP-1-mIg的剩余水平为约10nM。
hMCP-1-mIg对急性和复发性EAE的作用。在SJL小鼠诱发实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。在第0天皮下注射2mg/mL完全弗氏佐剂(CFA)中的100μg/mL PLP139-151肽(HCLGKWLGHPDKF(SEQ ID NO：29)；Biosynthesis；Lewisville，TX)和静脉内注射100ng百日咳毒素，使小鼠免疫。在第3、5天或第3、5、7天用10毫克/公斤体重(mpk)小鼠IgG1同种型对照抗体(SP-Biopharma)或人MCP-1-小鼠Ig(hMCP-1-mIg)融合蛋白处理小鼠。然后监测小鼠的体重和临床病征。如下记录疾病评分：1＝尾部跛行，2＝后肢虚弱，3＝部分后肢麻痹，4＝全部后肢麻痹和5＝濒死。
通过对分离自脊髓的细胞进行流式细胞测定，监测细胞对中枢神经系统的侵入。每组用n＝3只小鼠。对小鼠灌注含肝素的等渗缓冲液以从CNS除去外周血。收集脑和脊髓以分离CNS单核细胞。挤压细胞使其通过金属丝筛网，与胶原酶和DNA酶孵育以释放单核细胞。然后使细胞混悬液通过percoll梯度离心。通过台盼蓝细胞计数测定细胞回收率，用FACS分析建立细胞分布曲线。分别用与抗CD45、CD11b(用于炎性巨噬细胞)和CD4(用于活化T细胞)缀合的BD染料使细胞染色。抗体购自BD Biosciences(San Jose，CA)。用cell quest软件(BDBiosciences，San Jose，CA)在Facscaliber上分析染色的细胞。
表6显示的结果表明hMCP-1-mIg在EAE模型中的保护作用。该保护作用显示与脊髓巨噬细胞数的减少有关。
表6.hMCP-1-mIg融合蛋白处理抑制EAE
Figure A200680037443D00701
*临床评分数据为这两项研究的合并数据。多数小鼠在临床前取得以进行早期机理研究，未包括在内。
表7.hMCP-1-mIg融合蛋白抑制巨噬细胞侵入CNS内
组别        给药方案      CNS分析      处理        炎性巨          噬活化T细
            10mpk                                  细胞*           胞**
A           d3，5         d5           hMCP1-mIgG1 1.87E+04        6.29E+04
                                       mIgG1       2.25E+04        3.76E+04
B           d3，5         d6           hMCP1-mIgG1 1.75E+04        7.26E+05
                                       mIgG1       4.73E+04        4.12E+05
C           d3，5         d6           hMCP1-mIgG1 1.62E+05        6.28E+04
                                       mIgG1       3.35E+05        9.20E+04
D           d3，5，7      d12          hMCP1-mIgG1 0.69E+05        1.29E+05
                                       mIgG1       2.36E+05        3.72E+05
*炎性巨噬细胞群定义为：CD45hi/CD11b+/CD4-
**活化T细胞定义为：CD45hi/CD11b-/CD4+
实施例6：hMCP-1-mIg对抗胶原抗体诱发的关节炎的作用
在本实施例中，测定hMCP-1-mIg减少抗胶原抗体诱发的关节炎的能力。
通过将800μg Chemicon’s arthrogen CIA抗体(Chemicon，Temecula，CA)合剂静脉内注入年龄匹配的雄性B10RIII小鼠诱发抗体诱发的关节炎。在该诱发之前，皮下注射40mpk同种型对照mIgG1或hMCP-1-mIg融合蛋白处理小鼠。在第2或3天开始发病。每天对动物评分。测量每只爪的评分系统如下：1＝一个关节肿胀，2＝两个或多个关节肿胀，3＝整个足部肿胀。每只小鼠可接受最大疾病评分为12。所得结果在下文表8列出。
表8.MCP-1 Ig融合蛋白抑制抗体诱发的关节炎
抗体诱发的关节炎中的huMCP-1Ig FP
平均疾病评分
Figure A200680037443D00721
本发明的范围不限于本文描述的具体实施方案。事实上，本领域技术人员从上述说明书中将清楚本文描述之外的本发明的各种修改。此类修改意味着落在附属权利要求的范围之内。
专利、专利申请、出版物、产品说明书和方案贯穿本申请书引用，出于各种目的其公开内容通过引用完全结合到本文中。
序列表
<110>Schering Corporation
<120>MCP1 Fusions
<130>JB06384
<140>
<141>2006-08-10
<150>60/707,731
<151>2005-08-12
<160>30
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>99
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
Figure A200680037443D00731
<210>2
<211>76
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
<210>3
<211>227
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>小鼠免疫球蛋白重链恒定区的成熟多肽序列(铰链至CH3，仅)，同种型γ1
<400>3
Figure A200680037443D00742
Figure A200680037443D00751
<210>4
<211>229
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人免疫球蛋白重链恒定区(铰链至CH3，仅)，同种型γ4
<400>4
Figure A200680037443D00752
<210>5
<211>229
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人免疫球蛋白重链恒定区(铰链至CH3，仅)，同种型γ4单体变异体
<400>5
Figure A200680037443D00762
<210>6
<211>233
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人免疫球蛋白重链恒定区(铰链至CH3，仅)，同种型γ1
<400>6
Figure A200680037443D00772
Figure A200680037443D00781
<210>7
<211>233
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人免疫球蛋白重链恒定区(铰链至CH3，仅)，同种型γ1单体变异体
<400>7
Figure A200680037443D00791
Figure A200680037443D00801
<210>8
<211>305
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人MCP-1，与小鼠IgG1融合
<400>8
Figure A200680037443D00802
Figure A200680037443D00811
<210>9
<211>307
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>成熟人MCP-1，与人IgG4融合
<400>9
Figure A200680037443D00812
Figure A200680037443D00821
Figure A200680037443D00831
<210>10
<211>307
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>成熟人MCP-1，与人IgG4单体变异体融合
<400>10
Figure A200680037443D00832
Figure A200680037443D00841
<210>11
<211>311
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>成熟人MCP-1，与人IgG1融合
<400>11
Figure A200680037443D00842
Figure A200680037443D00851
<210>12
<211>311
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人MCP-1，与人IgG1单体变异体融合
<400>12
Figure A200680037443D00861
<210>13
<211>300
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>13
Figure A200680037443D00872
<210>14
<211>684
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>小鼠重链免疫球蛋白恒定区，γ1同种型，始于铰链去的氨基端，终于CH3区的羧基端
<400>14
Figure A200680037443D00873
<210>15
<211>690
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人重链免疫球蛋白恒定区，γ4同种型，始于铰链去的氨基端，终于CH3区的羧基端
<400>15
Figure A200680037443D00882
<210>16
<211>690
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人重链免疫球蛋白恒定区，γ4同种型，单体变异体，始于铰链区的氨基端，终于CH3区的羧基端
<400>16
Figure A200680037443D00891
<210>17
<211>702
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人重链免疫球蛋白恒定区，γ1同种型，始于铰链去的氨基端，终于CH3区的羧基端
<400>17
Figure A200680037443D00892
<210>18
<211>702
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人重链免疫球蛋白恒定区，γ1同种型，单体变异体，始于铰链区的氨基端，终于CH3区的羧基端
<400>18
Figure A200680037443D00901
<210>19
<211>987
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人MCP-1(包括前导肽)，与小鼠IgG1融合
<400>19
Figure A200680037443D00902
<210>20
<211>993
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人MCP-1(包括前导肽)，与人IgG4融合
<400>20
<210>21
<211>993
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人MCP-1(包括前导序列)，与人IgG4单体变异体融合
<400>21
Figure A200680037443D00922
<210>22
<211>1005
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人MCP-1(包括前导序列)，与人IgG1融合
<400>22
Figure A200680037443D00923
Figure A200680037443D00931
<210>23
<211>1005
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人MCP-1(包括前导序列)，与人IgG1单体变异体融合
<400>23
Figure A200680037443D00932
Figure A200680037443D00941
<210>24
<211>6393
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pcDNA3.1(+)hMCP1 mIgG
<400>24
Figure A200680037443D00942
Figure A200680037443D00951
Figure A200680037443D00961
Figure A200680037443D00971
<210>25
<211>6399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pcDNA3.1(+)hMCP1 hIgG4
<400>25
Figure A200680037443D00981
Figure A200680037443D00991
Figure A200680037443D01001
Figure A200680037443D01011
<210>26
<211>6399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pcDNA3.1(+)hMCP1 hIgG4单体变异体
<400>26
Figure A200680037443D01012
Figure A200680037443D01021
Figure A200680037443D01031
Figure A200680037443D01051
<210>27
<211>6411
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pcDNA3.1(+)hMCP1 hIgG1
<400>27
Figure A200680037443D01071
<210>28
<211>6411
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pcDNA3.1(+)hMCP1 hIgG1单体变异体
<400>28
Figure A200680037443D01091
Figure A200680037443D01101
Figure A200680037443D01111
Figure A200680037443D01121
<210>29
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PLP139-151肽
<400>29
Figure A200680037443D01122
<210>30
<211>148
<212>PRT
<213>鼠(Mus sp.)
<400>30
Figure A200680037443D01123
Figure A200680037443D01131

Claims (48)

1.一种分离的多肽，所述多肽包括
(1)与一种或多种半衰期延长部分融合的一种或多种趋化因子多肽；或
(2)两种或多种融合的趋化因子多肽。
2.权利要求1的多肽，其中所述趋化因子选自人MCP1和小鼠MCP1。
3.权利要求1的多肽，其中所述半衰期延长部分是聚乙二醇或免疫球蛋白。
4.权利要求1的多肽，所述多肽包括与一种或多种免疫球蛋白融合的一种或多种成熟MCP1多肽。
5.权利要求4的多肽，其中所述MCP1选自人MCP1和小鼠MCP1。
6.权利要求3的多肽，其中所述免疫球蛋白选自铰链至CH3区的γ1和γ4。
7.权利要求4的多肽，其中所述多肽包括选自下列的多肽：
(a)与小鼠IgG1融合的成熟人MCP1；
(b)与人IgG4融合的成熟人MCP1；
(c)与人IgG4单体变异体融合的成熟人MCP1；
(d)与人IgG1融合的成熟人MCP1；和
(e)与人IgG1单体变异体融合的成熟人MCP1。
8.权利要求4的多肽，其中所述多肽包含选自SEQ ID NO：8-12列出的氨基酸序列。
9.权利要求4的多肽，其中所述MCP1包含SEQ ID NO：2列出的氨基酸。
10.权利要求4的多肽，其中所述免疫球蛋白包含选自SEQ IDNO：3-7列出的氨基酸序列。
11.权利要求4的多肽，其中所述MCP1通过肽接头与免疫球蛋白融合。
12.一种药用组合物，所述药用组合物包含权利要求1的多肽和药学上可接受的载体。
13.一种组合物，包含权利要求1的多肽以及一种或多种其它治疗剂或其药用组合物。
14.权利要求13的组合物，其中其它治疗剂选自阿司匹林、双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、非诺洛芬、夫洛非宁、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、噁丙嗪、保泰松、吡罗昔康、双水杨酸酯、舒林酸、替诺昔康、噻洛芬酸、托美丁、苯甲酸倍他米松、戊酸倍他米松、丙酸氯倍他索、去羟米松、氟轻松、氟羟可舒松、表面类固醇、二丙酸阿氯米松、芦荟、安西奈德、安西奈德、蒽林、二丙酸倍他米松、戊酸倍他米松、卡泊三烯、丙酸氯倍他索、煤焦油、死海盐、地奈德、地奈德、戊酸倍他米松、去羟米松、二乙酸二氟拉松、泻盐、氟轻松、氟轻松、氟羟可舒松、丙酸氟替卡松、哈西奈德、丙酸卤贝他索、戊酸氢化可的松、氢化可的松、糠酸莫米松、油状麦片、凡士林、泼尼卡酯、水杨酸、他扎罗汀、曲安奈德、氢化可的松、地塞米松、甲基泼尼松龙和泼尼松龙混合物、alefacept、依那西普、环孢菌素、甲氨蝶呤、阿曲汀、异维甲酸、羟基脲、霉酚酸酯、柳氮磺吡啶、6-硫鸟嘌呤、阿那白滞素、注射金、青霉胺、硫唑嘌呤、氯喹、羟基氯喹、柳氮磺吡啶、口服金、金诺芬、硫代苹果酸金钠、金硫葡糖、美沙拉嗪、柳氮磺吡啶、布地奈德、甲硝唑、环丙沙星、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤或膳食补充剂钙、叶酸盐、维生素B12、塞来考昔、罗非考昔、伐地考昔、罗美昔布、艾托考昔、依法利珠单抗、阿达木单抗、英夫利昔单抗和ABX-IL8。
15.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码权利要求1的多肽的核苷酸序列。
16.权利要求15的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码选自下列的成员：
(i)与小鼠IgG1融合的人未加工的MCP1；
(ii)与人IgG4融合的人未加工的MCP1；
(iii)与人IgG4单体变异体融合的人未加工的MCP1；
(iv)与人IgG1融合的人未加工的MCP1；和
(v)与人IgG1单体变异体融合的人未加工的MCP1。
17.权利要求15的多核苷酸，其中所述MCP1由SEQ ID NO：13列出的核苷酸序列编码。
18.权利要求15的多核苷酸，其中所述免疫球蛋白由选自SEQ IDNO：14-18的核苷酸序列编码。
19.权利要求15的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自SEQ IDNO：19-23的核苷酸序列。
20.一种包含权利要求15的多核苷酸的分离或重组载体。
21.一种包含权利要求20的载体的分离的宿主细胞。
22.一种分离的质粒，其特征在于基本如图1显示的质粒图。
23.权利要求22的质粒，所述质粒包含SEQ ID NO：24的核苷酸序列。
24.一种分离的质粒，所述质粒包含选自SEQ ID NO：24-28的核苷酸序列。
25.一种制备MCP1-Ig多肽的方法，所述方法包括在适合所述表达的条件下，用包含编码所述多肽的多核苷酸的表达载体转化宿主细胞，并任选从宿主细胞中分离多肽。
26.权利要求25的方法，其中所述多核苷酸编码包含选自SEQ IDNO：8-12的氨基酸序列的多肽。
27.权利要求25的方法，其中所述多核苷酸是质粒pcDNA3.1(+)hMCP1 mIgG。
28.一种通过权利要求25的方法制备的分离多肽。
29.一种治疗受试者疾病的方法，通过降低趋化因子或趋化因子受体的表达或活性或者通过减少趋化因子受体携带细胞向炎性组织的迁移可治疗所述疾病，所述方法包括使受试者的趋化因子受体携带细胞对趋化因子配体脱敏。
30.权利要求29的方法，其中所述疾病选自炎性疾病、寄生虫感染、细菌感染、病毒感染、癌症、心血管疾病、循环系统疾病和肥胖症相关性胰岛素抵抗。
31.权利要求29的方法，其中通过将趋化因子配体多肽或与半衰期延长部分融合的趋化因子配体多肽全身性给予受试者使所述趋化因子受体携带细胞对趋化因子配体脱敏。
32.权利要求29的方法，其中所述趋化因子是MCP1、SDF1、MIP1β或其成熟多肽。
33.权利要求31的方法，其中所述半衰期延长部分是免疫球蛋白或其片段。
34.权利要求32的方法，其中所述MCP1包含SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列。
35.权利要求33的方法，其中所述免疫球蛋白片段包含选自SEQID NO：3-7的氨基酸序列。
36.权利要求31的方法，其中所述多肽是包含选自SEQ ID NO：8-12的氨基酸序列的MCP1-Ig。
37.一种治疗或预防受试者炎性疾病、肥胖症相关性胰岛素抵抗、寄生虫感染、细菌感染、病毒感染、癌症或者心血管或循环系统疾病的方法，所述方法包括给予受试者多肽，所述多肽包括任选与一种或多种半衰期延长部分或其药用组合物融合的一种或多种MCP1多肽，还任选包括其它治疗剂或过程。
38.权利要求37的方法，其中所述炎性疾病选自阑尾炎、消化性溃疡、胃溃疡和十二指肠溃疡、腹膜炎、胰腺炎、炎性肠病、结肠炎、溃疡性结肠炎、伪膜性肠炎、急性结肠炎、缺血性结肠炎、憩室炎、会厌炎、失弛缓症、胆管炎、胆囊炎、腹部疾病、肝炎、克罗恩病、肠炎、惠普尔病、哮喘、过敏、过敏性休克、免疫复合物病、器官缺血、再灌注损伤、器官坏死、花粉热、脓毒症、败血症、内毒素性休克、恶病质、高热、嗜酸细胞性肉芽肿、肉芽肿病、肉状瘤病、脓毒性流产、附睾炎、阴道炎、前列腺炎和尿道炎、支气管炎、肺气肿、鼻炎、纤维化、囊性纤维化、肺炎、成人呼吸窘迫综合征、黑肺病、肺泡炎、细支气管炎、咽炎、胸膜炎、鼻窦炎、皮炎、特应性皮炎、皮肌炎、晒伤、风疹疣、风疹块、狭窄、再狭窄、血管炎、脉管炎、心内膜炎、动脉炎、动脉粥样硬化、血栓性静脉炎、心包炎、心肌炎、心肌缺血、结节性多动脉炎、风湿热、脑膜炎、脑炎、多发性硬化(MS)、神经炎、神经痛、葡萄膜炎、关节炎和关节痛、骨髓炎、筋膜炎、佩吉特病、痛风、牙周病、类风湿性关节炎、滑膜炎、重症肌无力、甲状腺炎、系统性红斑狼疮、肺出血-肾炎综合征、白塞综合征、同种异体移植物排斥和移植物抗宿主病。
39.权利要求37的方法，其中所述MCP1包含SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列。
40.权利要求37的方法，其中所述半衰期延长部分是聚乙二醇、免疫球蛋白或其片段。
41.权利要求40的方法，其中所述免疫球蛋白片段包含选自SEQID NO：3-7的氨基酸序列。
42.权利要求37的方法，其中所述多肽是包含选自SEQ ID NO：8-12的氨基酸序列的MCP1-Ig。
43.权利要求37的方法，其中所述受试者是人。
44.权利要求37的方法，其中其它治疗剂或过程选自阿司匹林、双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、非诺洛芬、夫洛非宁、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、噁丙嗪、保泰松、吡罗昔康、双水杨酸酯、舒林酸、替诺昔康、噻洛芬酸、托美丁、苯甲酸倍他米松、戊酸倍他米松、丙酸氯倍他索、去羟米松、氟轻松、氟羟可舒松、表面类固醇二丙酸阿氯米松、芦荟、安西奈德、安西奈德、蒽林、二丙酸倍他米松、戊酸倍他米松、卡泊三烯、丙酸氯倍他索、煤焦油、死海盐、地奈德、地奈德、戊酸倍他米松、去羟米松、二乙酸二氟拉松、泻盐、氟轻松、氟轻松、氟羟可舒松、丙酸氟替卡松、哈西奈德、丙酸卤贝他索、戊酸氢化可的松、氢化可的松、糠酸莫米松、油状麦片、凡士林、泼尼卡酯、水杨酸、他扎罗汀、曲安奈德、氢化可的松、地塞米松、甲基泼尼松龙和泼尼松龙混合物、alefacept、依那西普、环孢菌素、甲氨蝶呤、阿曲汀、异维甲酸、羟基脲、霉酚酸酯、柳氮磺吡啶、6-硫鸟嘌呤、阿那白滞素、可注射金、青霉胺、硫唑嘌呤、氯喹、羟基氯喹、柳氮磺吡啶、口服金、金诺芬、硫代苹果酸金钠、金硫葡糖、美沙拉嗪、柳氮磺吡啶、布地奈德、甲硝唑、环丙沙星、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤或膳食补充剂钙、叶酸盐、维生素B12、塞来考昔、罗非考昔、伐地考昔、罗美昔布、艾托考昔、依法利珠单抗、阿达木单抗、英夫利昔单抗、ABX-IL8和光疗。
45.一种增加趋化因子多肽在受试者机体的体内半衰期的方法，所述方法包括使多肽与免疫球蛋白或其片段或者与聚乙二醇(PEG)融合。
46.权利要求45的方法，其中所述趋化因子多肽是MCP1。
47.权利要求45的方法，其中所述MCP1包含SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列。
48.权利要求45的方法，其中所述免疫球蛋白包含选自SEQ IDNO：3-7的氨基酸序列。
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