JP7106187B2 - 分離マトリックスを保存する方法 - Google Patents
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Description
a)少なくとも50体積%のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む保存液を準備する工程;
b)分離マトリックスに保存液を浸透させる工程;および
c)保存液を浸透させた分離マトリックスを少なくとも5日の保存時間の間保存する工程を含む。
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では互換的に使用され、抗体の断片、抗体または抗体断片を含む融合タンパク質および抗体または抗体断片を含むコンジュゲートも含むと理解される。
QQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQ
配列番号52(末端切断型Cドメイン)
QQ NAFYEILHLP NLTEEQRNGF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQ
そのような免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインAドメインは、図1に図示される配列番号1(Eドメイン)、配列番号2(Dドメイン)、配列番号3(Aドメイン)、配列番号22(バリアントAドメイン)、配列番号4(Bドメイン)、配列番号5(Cドメイン)、配列番号6(プロテインZ)、配列番号7(Zvar)、配列番号51(リンカー領域アミノ酸1~8および56~58を含まないZvar)または配列番号52(リンカー領域アミノ酸1~8および56~58を含まないCドメイン)によって定義されるかあるいはそれと少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%の同一性を有する、ブドウ球菌プロテインA(SpA)の親Fc結合ドメインの変異体を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなってよく、この際、配列番号4~7の11位に対応する位置の少なくともアスパラギン(または配列番号2の例ではセリン)残基は、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異しており、配列番号4~7の21位および52位に対応するアスパラギン残基(配列番号51または52の13位および44位)は保存される。
X1Q X2AFYEILX3LP NLTEEQRX4X5F IX6X7LKDX8PSX9 SX10X11X12LAEAKX13 X14NX15AQ
ここで、互いに個別に:
X1=A、Qまたは欠失
X2=E、K、Y、T、F、L、W、I、M、V、A、HまたはR
X3=HまたはK
X4=AまたはN
X5=A、G、S、Y、Q、T、N、F、L、W、I、M、V、D、E、H、RまたはK、例えばS、Y、Q、T、N、F、L、W、I、M、V、D、E、H、RまたはKなど
X6=QまたはE
X7=SまたはK
X8=EまたはD
X9=Q、Vまたは欠失
X10=K、R、Aまたは欠失
X11=A、E、Nまたは欠失
X12=IまたはL
X13=KまたはR
X14=LまたはY
X15=D、F、Y、W、KまたはR
である。
X1=Aまたは欠失
X2=E
X3=H
X4=N
X6=Q
X7=S
X8=D
X9=Vまたは欠失
X10=Kまたは欠失
X11=Aまたは欠失
X12=I
X13=K
X14=L
である。
X1=A、X2=E、X3=H、X4=N、X6=Q、X7=S、X8=D、X9=V、X10=K、X11=A、X12=I、X13=K、X14=Lであってよい。いくつかの実施形態では、X2=E、X3=H、X4=N、X5=A、X6=Q、X7=S、X8=D、X12=I、X13=K、X14=LおよびX15=Dであり、X1、X9、X10およびX11の1以上は欠失している。さらなる実施形態では、X1=A、X2=E、X3=H、X4=N、X5=S、Y、Q、T、N、F、L、W、I、M、V、D、E、H、RまたはK、X6=Q、X7=S、X8=D、X9=V、X10=K、X11=A、X12=I、X13=K、X14=LおよびX15=D、あるいはX1=A、X2=E、X3=H、X4=N、X5=A、X6=Q、X7=S、X8=D、X9=V、X10=K、X11=A、X12=I、X13=K、X14=LおよびX15=F、Y、W、KまたはRである。
a)X1=Aまたは欠失、X2=E、X3=H、X4=N、X6=Q、X7=S、X8=D、X9=Vまたは欠失、X10=Kまたは欠失、X11=Aまたは欠失、X12=I、X13=K、X14=L;
b)X1=A、X2=E、X3=H、X4=N、X5=A、X6=Q、X7=S、X8=D、X9=V、X10=K、X11=A、X12=I、X13=K、X14=LおよびX15=D;
c)X1=A、X2=E、X3=H、X4=N、X6=Q、X7=S、X8=D、X9=V、X10=K、X11=A、X12=I、X13=K、X14=LおよびX15=D;または
d)X1=A、X3=H、X4=N、X5=A、X6=Q、X7=S、X8=D、X9=V、X10=K、X11=A、X12=I、X13=K、X14=LおよびX15=Dであってよい。
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK
配列番号9 Zvar(Q9A,N11E,N28A,N43A)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK
配列番号10 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43E,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK
配列番号11 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号12 Zvar(N11E,Q32A)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IASLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号13 Zvar(N11E)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号14 Zvar(N11E,Q32E,Q40E)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IESLKDDPSE SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号15 Zvar(N11E,Q32E,K50R)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IESLKDDPSQ SANLLAEAKR LNDAQAPK
配列番号16 Zvar(N11K)
VDAKFDKEQQ KAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号23 Zvar(N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)
VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK
配列番号24 Zvar(Q9A,N11E,N28A,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号25 Zvar(Q9A,N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRAAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK
配列番号26 Zvar(N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I)
VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号27 Zvar(Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号28 Zvar(Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRAILAEAKR LNDAQAPK
配列番号29 Zvar(Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号36 B(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
ADNKFNKEAQ EAFYEILHLP NLNEEQRNGF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号37 C(Q9A,N11E,E43A)
ADNKFNKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNGF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号38 Zvar(N11Y)
VDAKFDKEQQ YAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号39 Zvar(N11T)
VDAKFDKEQQ TAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号40 Zvar(N11F)
VDAKFDKEQQ FAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号41 Zvar(N11L)
VDAKFDKEQQ LAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号42 Zvar(N11W)
VDAKFDKEQQ WAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号43 Zvar(N11I)
VDAKFDKEQQ IAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号44 Zvar(N11M)
VDAKFDKEQQ MAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号45 Zvar(N11V)
VDAKFDKEQQ VAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号46 Zvar(N11A)
VDAKFDKEQQ AAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号47 Zvar(N11H)
VDAKFDKEQQ HAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号48 Zvar(N11R)
VDAKFDKEQQ RAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号49 Zvar(Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号50 Zvar(Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42R,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号54 Zvar(Q9A,N11E,A29G,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNGF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号55 Zvar(Q9A,N11E,A29S,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNSF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号56 Zvar(Q9A,N11E,A29Y,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNYF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号57 Zvar(Q9A,N11E,A29Q,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNQF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号58 Zvar(Q9A,N11E,A29T,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNTF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号59 Zvar(Q9A,N11E,A29N,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNNF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号60 Zvar(Q9A,N11E,A29F,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNFF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号61 Zvar(Q9A,N11E,A29L,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNLF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号62 Zvar(Q9A,N11E,A29W,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNWF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号63 Zvar(Q9A,N11E,A29I,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNIF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号64 Zvar(Q9A,N11E,A29M,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNMF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号65 Zvar(Q9A,N11E,A29V,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNVF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号66 Zvar(Q9A,N11E,A29D,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNDF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号67 Zvar(Q9A,N11E,A29E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNEF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号68 Zvar(Q9A,N11E,A29H,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNHF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号69 Zvar(Q9A,N11E,A29R,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNRF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号70 Zvar(Q9A,N11E,A29K,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNKF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号71 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,D53F)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNFAQAPK
配列番号72 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,D53Y)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNYAQAPK
配列番号73 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,D53W)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNWAQAPK
配列番号74 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,D53K)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNKAQAPK
配列番号75 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,D53R)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNRAQAPK
配列番号76 Zvar(Q9del,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKE_Q EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号77 Zvar(Q9A,N11E,Q40del,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPS_ SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号78 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42del,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV S_AILAEAKK LNDAQAPK
配列番号79 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43del,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SK_ILAEAKK LNDAQAPK
配列番号89 Zvar(D2del,A3del,K4del,Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
V___FDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号90 Zvar(V1del,D2del,Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,K58del)
__AKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAP_
配列番号91 Zvar(K4del,F5del,D6del,K7del,E8del,Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDA_____AQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号92 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,A56del,P57del,K58del)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQ___
配列番号93 Zvar(V1del,D2del,A3del,Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
___KFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号94 Zvar(V1del,D2del,A3del,K4del,F5del,D6del,K7del,E8del,Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
________AQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号95 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,K58_insYEDG)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKYE DG
分離マトリックスは、免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインAドメインの多量体を含む。そのような多量体は、上記のいずれかの実施形態によって定義される複数の免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインAドメイン(ポリペプチド単位)を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。多量体を使用することにより、免疫グロブリン結合容量を増加させることができ、多量体はモノマーよりも高いアルカリ安定性を有することもができる。多量体は、例えば二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体または九量体であり得る。多量体は、多量体の全ての単位が同一であるホモ多量体であってもよいし、少なくとも1つの単位が他の単位と異なるヘテロ多量体であってもよい。有利には、多量体中の全ての単位は、例えば、上記で開示された変異/保存を含むことによってアルカリ安定性である。ポリペプチドは、ポリペプチドのC末端とN末端との間のペプチド結合によって直接に互いと結合することができる。あるいは、多量体中の2以上の単位は、オリゴマー種またはポリマー種、例えば最大25または30アミノ酸、例えば3~25または3~20アミノ酸などを有するペプチドを含むリンカーによって結合することができる。リンカーは、例えば、APKVDAKFDKE、APKVDNKFNKE、APKADNKFNKE、APKVFDKE、APAKFDKE、AKFDKE、APKVDA、VDAKFDKE、APKKFDKE、APK、APKYEDGVDAKFDKEおよびYEDGからなる群から選択されるか、あるいは、APKADNKFNKE、APKVFDKE、APAKFDKE、AKFDKE、APKVDA、VDAKFDKE、APKKFDKE、APKYEDGVDAKFDKEおよびYEDGからなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるか、あるいはそれとの少なくとも90%の同一性または少なくとも95%の同一性を有するペプチド配列を含むかまたはそれから本質的になる。それらはまた、APKADNKFNKE、APKVFDKE、APAKFDKE、AKFDKE、APKVDA、VDAKFDKE、APKKFDKE、APKおよびAPKYEDGVDAKFDKEからなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるか、あるいはそれとの少なくとも90%の同一性または少なくとも95%の同一性を有するペプチド配列から本質的になる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドAPKVDAKFDKEまたはAPKVDNKFNKEからならない、あるいは、ペプチドAPKVDAKFDKE、APKVDNKFNKE、APKFNKE、APKFDKE、APKVDKEまたはAPKADKEからならない。
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPKC
配列番号18 Zvar(Q9A,N11E,N28A,N43A)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPKC
配列番号19 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43E,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号20 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号30 Zvar(N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)4
AQGT VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPKC
配列番号31 Zvar(Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R)4
AQGT VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPKC
配列番号32 Zvar(Q9A,N11E,N28A,Q40V,A42K,N43A,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号33 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)6
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号34 Zvar(Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42K,N43A,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号35 Zvar(Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42R,N43A,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号80 リンカーのD2、A3およびK4が欠失したZvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)2
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号81 リンカーのK58、V1およびD2が欠失したZvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)2
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAP AKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号82 リンカーのP57、K58、V1、D2およびA3が欠失したZvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)2
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAP AKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号83 リンカーのK4、F5、D6、K7およびE8が欠失したZvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)2
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号84 リンカーのA56、P57およびK58が欠失したZvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)2
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQ VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号85 リンカーのV1、D2およびA3が欠失したZvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)2
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK KFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号86 リンカーのV1、D2、A3、K4、F5、D6、K7およびE8が欠失したZvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)2
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK AQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号87 YEDGがリンカーのK58とV1の間に挿入されたZvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)2
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK YEDG VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号88 Zvar2
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
いくつかの実施形態では、上に開示されるポリペプチドおよび/または多量体は、C末端またはN末端に、1または複数のシステイン残基、複数のリジン残基および複数のヒスチジン残基からなる群から選択される、1または複数の連結要素をさらに含む。1または複数の連結要素はまた、C末端またはN末端から1~5アミノ酸残基の範囲内、例えば1~3または1~2アミノ酸残基の範囲内に位置してもよい。連結要素は、例えばC末端の単一のシステインであることがある。1または複数の連結要素は、CまたはN末端に直接に結合してもよいし、あるいは連結要素は、最大15アミノ酸、例えば1~5、1~10または5~10アミノ酸を含むストレッチを介して結合してもよい。このストレッチもまた、好ましくは変異したタンパク質の性質を損なわないようにアルカリ環境で十分に安定しているべきである。この目的のために、ストレッチがアスパラギンを含まない場合に有利である。ストレッチがグルタミンを含まない場合はさらに有利であり得る。C末端システインを有する利点は、タンパク質のエンドポイントカップリングがシステインチオールと支持体上の求電子基との反応を通じて達成され得ることである。これは、結合容量にとって重要な、カップリングタンパク質の優れた可動性を提供する。
a)リガンドはアルカリ安定化プロテインAドメインの多量体を含み、
b)多孔質支持体は56~70、例えば56~66マイクロメートルの体積加重メジアン径(d50,v)および55~80、例えば60~78または65~78mg/mlの乾燥固体重量を有する架橋ポリマー粒子を含む。架橋ポリマー粒子はさらに、分子量110kDaのデキストランの逆ゲル濾過クロマトグラフィーのKd値0.69~0.85、例えば0.70~0.85または0.69~0.80に相当する孔径を有してよい。多量体は、例えばアルカリ安定化プロテインAドメインの四量体、五量体、六量体または七量体、例えばアルカリ安定化プロテインAドメインの六量体などを含んでよい。高いリガンド含有量と粒度範囲、乾燥固体重量範囲および随意のKd範囲を組み合わせることにより、例えば、IgGに対する10%貫流の動的結合容量が2.4分の滞留時間で少なくとも45mg/ml、例えば少なくとも50または少なくとも55mg/mlであるような、高い結合容量が得られる。あるいは、またはさらに、IgGに対する10%貫流の動的結合容量は、6分の滞留時間で少なくとも60mg/ml、例えば少なくとも65、少なくとも70または少なくとも75mg/mlなどであることがある。
a)少なくとも50体積%のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む保存液を準備する工程;
b)分離マトリックスに保存液を浸透させる工程;および
c)保存液を浸透させた分離マトリックスを少なくとも5日の保存時間の間保存する工程。
水酸化ナトリウム溶液(0.01M、0.03M、0.05M、0.1M);
水酸化カリウム溶液(0.01M、0.03M、0.05M、0.1M);
10~20体積%のエタノールを含む水酸化ナトリウム溶液(0.01M、0.03M、0.05M、0.1M);
10~50体積%のイソプロパノールを含む水酸化ナトリウム溶液(0.01M、0.03M、0.05M、0.1M);
1~5体積%のベンジルアルコールを含む水酸化ナトリウム溶液(0.01M、0.03M、0.05M、0.1M);
10~20体積%のエタノールを含む水酸化カリウム溶液(0.01M、0.03M、0.05M、0.1M);
10~50体積%のイソプロパノールを含む水酸化カリウム溶液(0.01M、0.03M、0.05M、0.1M);または
1~5体積%のベンジルアルコールを含む水酸化カリウム溶液(0.01M、0.03M、0.05M、0.1M)。
タンパク質の変異誘発
部位特異的変異誘発を、変異をコードするオリゴヌクレオチドを用いて2工程のPCRによって実施した。鋳型として、Z、BまたはCのいずれかの単一のドメインを含有するプラスミドを使用した。PCR断片を大腸菌発現ベクターに連結した。DNA塩基配列決定法を使用して、挿入した断片の正しい配列を検証した。
構築物を、標準培地中の大腸菌K12の発酵によって細菌ペリプラズム内に発現させた。発酵後、細胞を熱処理してペリプラズムの内容物を培地に放出させた。培地に放出された構築物を、孔径0.2μmの膜を用いる精密濾過法によって回収した。
使用したベースマトリックスは、参照によりその全文がここに援用される米国特許第6602990号に記載の方法に従って調製し、Gel Filtration Principles and Methods,Pharmacia LKB Biotechnology 1991,pp 6-13に記載の方法に従う、Mw110kDaのデキストランの逆ゲル濾過クロマトグラフィーのKav値0.70に相当する孔径をもつ、85マイクロメートル(容積重量、d50V)の中位径の硬質架橋アガロースビーズであった。
50ml Falconチューブ中20mLのリガンド溶液(50mg/mL)に、169mgのNaHCO3、21mgのNa2CO3、175mgのNaClおよび7mgのEDTAを添加した。Falconチューブをローラーテーブルの上に5~10分間載せた後、77mgのDTEを添加した。還元は45分超進行した。次に、Sephadex G-25を充填したPD10カラムでリガンド溶液を脱塩した。脱塩した溶液中のリガンド含有量を、276nmのUV吸収を測定することによって求めた。
Gammanorm165mg/ml(Octapharma)、平衡化緩衝液中2mg/mlに希釈。
PBSリン酸緩衝液10mM+0.14M NaCl+0.0027M KCl、pH7.4(Medicago)
吸着緩衝液
PBSリン酸緩衝液10mM+0.14M NaCl+0.0027M KCl、pH7.4(Medicago)
溶出緩衝液
100mM酢酸塩pH2.9
動的結合容量
2mlの樹脂を、TRICORN(商標)5 100カラムに充填した。貫流容量を、AKTAExplorer10システムで滞留時間6分(流量0.33ml/分)で求めた。安定したベースラインが得られるまで平衡化緩衝液をバイパスカラムに流した。これは自動ゼロ化の前に行なった。100%UVシグナルが得られるまで試料をカラムに適用した。その後、安定したベースラインが得られるまで、平衡バッファーを再度適用した。
Asub=非結合IgGサブクラスによる吸光度への寄与;
A(V)=所与添加容量での吸光度;
Vc=カラム容量;
Vapp=10%貫流までの添加量;
Vsys=システムのデッドボリューム;
C0=フィード濃度。
10%貫流のDBC(Qb10)は、アルカリ洗浄溶液に繰り返し曝露する前と後に求めた。各々のサイクルには、0.5M NaOHを0.5/分の速度で20分間カラムに通してポンプ送達し、その後カラムを4時間静置するCIP工程が含まれた。曝露は室温(22+/-2℃)で行った。このインキュベーションの後、カラムを平衡緩衝液で流量0.5ml/分で20分間洗浄した。表4は、6回の4時間サイクル後の残存容量(すなわち、0.5M NaOHへの累積曝露時間は24時間)を、絶対数で、そして初期容量と比較して表す。
使用したベースマトリックスは、米国特許第6602990号の方法に従って調製され、上記の方法に従って、0.2M NaCl中のプロトタイプとプローブ分子として一連のデキストラン画分を充填したHR10/30カラム(GE Healthcare)を用いる(流量0.2ml/分)分子量110kDaのデキストランの逆ゲル濾過クロマトグラフィーのKd値0.62~0.82に相当する孔径をもつ、59~93マイクロメートル(体積加重、d50V)の中位径(Malvern Mastersizer2000レーザー回折装置で測定)の、一組の剛性架橋アガロースビーズ試料であった。1.0mlの排水した濾過ケーキ試料を105℃で一晩乾燥させ、秤量することによって求めたビーズ試料の乾燥重量は、53から86mg/mlに及んだ。
100mlのベースマトリックスをガラスフィルタ上で10ゲル体積の蒸留水で洗った。ゲルを秤量し(1g=1ml)、撹拌器を備えた250mlフラスコ中で30mlの蒸留水および8.08gのNaOH(0.202mol)と混合した。温度は水浴中27+/-2℃に調節した。16mlのエピクロロヒドリン(0.202mol)を、90+/-10分の間に激しい撹拌下で(約250rpm)添加した。反応をさらに80+/-10分間継続させ、その後、ゲルをガラスフィルタ上で10ゲル体積を上回る蒸留水で中性のpHに達するまで洗った。この活性化したゲルを下のようなカップリングに直接使用した。
2.4分および6分の滞留時間でのポリクローナルヒトIgGに対するQb10%動的容量を、実施例4に概説されるように決定した。
[実施態様1]
多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインAドメインの多量体を含む分離マトリックスを保存する方法であって、前記アルカリ安定化プロテインAドメインは、配列番号51または配列番号52によって定義されるブドウ球菌プロテインA(SpA)の親Fc結合ドメインの変異体を含み、配列番号51または配列番号52の13位および44位の位置の前記アミノ酸残基はアスパラギンであり、配列番号51または52の3位の少なくとも前記アスパラギン残基が、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に、例えばグルタミン酸に変異しており;かつ、前記方法が:
a)少なくとも50体積%のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む保存液を準備する工程と;
b)前記保存液を前記分離マトリックスに浸透させる工程と;
c)前記保存液を浸透させた分離マトリックスを少なくとも5日の保存時間の間保存する工程と
を含む、方法。
[実施態様2]
前記変異体が、配列番号51または52の1、2、7、10、15、20、21、24、25、28、29、32、34、35、36、39、42および43位の1以上においてさらなる変異を含む、実施態様1に記載の方法。
[実施態様3]
配列番号51または52の1位の前記グルタミン残基がアラニンに変異している、実施態様1または2に記載の方法。
[実施態様4]
配列番号51または52の35位の前記アスパラギンまたはグルタミン酸残基がアラニンに変異している、実施態様1乃至3のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様5]
前記免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインAドメインの多量体が、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体または九量体からなる群から選択されるホモ多量体である、実施態様1乃至4のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様6]
前記免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインAドメインの多量体が、各々、前記多孔質支持体と共有結合するためのC末端システイン残基を含む、実施態様1乃至5のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様7]
前記免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインAドメインの多量体が、チオエーテル結合によって前記多孔質支持体に結合されている、実施態様1乃至6のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様8]
前記分離マトリックスが、少なくとも11mg/ml、例えば少なくとも15mg/mlなどの、前記多孔質支持体と共有結合した前記免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインAドメインの多量体を含む、実施態様1乃至7のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様9]
前記多孔質支持体が高度に架橋されたアガロースビーズである、実施態様1乃至8のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様10]
前記アルカリ金属水酸化物水溶液が、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液またはその混合物、好ましくは水酸化ナトリウム溶液である、実施態様1乃至9のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様11]
前記アルカリ金属水酸化物水溶液が、10mM~100mM、例えば30mM~50mMなどのモル濃度を有する、実施態様1乃至10のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様12]
前記保存液が、C2-C7アルコール、例えばエタノール、イソプロパノールまたはベンジルアルコールなどをさらに含む、実施態様1乃至11のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様13]
前記保存液が、少なくとも70体積%のアルカリ金属水酸化物水溶液、例えば少なくとも90体積%のアルカリ金属水酸化物水溶液、好ましくは少なくとも99体積%のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む、実施態様1乃至12のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様14]
前記保存時間が、少なくとも10日、例えば少なくとも25日など、または例えば少なくとも50日など、または例えば少なくとも100日など、または例えば少なくとも200など、例えば最大400日、または例えば最大700日である、実施態様1乃至13のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様15]
前記分離マトリックスが、保存の前に洗浄流体で洗浄および/または消毒され、前記洗浄流体が少なくとも50体積%のアルカリ金属水酸化物水溶液を含み、前記アルカリ金属水酸化物水溶液のモル濃度が500mM~5M、例えば1M~2Mである、実施態様1乃至14のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様16]
前記分離マトリックスが、工程b)の後に、その最初の動的結合容量の少なくとも80%、例えばその最初の動的結合容量の少なくとも90%などを保持する、実施態様1乃至15のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様17]
前記多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインAドメインの多量体を含む分離マトリックスの保存のための、少なくとも50体積%のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む保存液の使用。
[実施態様18]
保存容器、分離マトリックスおよび保存液を含む分離マトリックス製品であって;前記保存容器は、前記保存液を浸透させた前記分離マトリックスを含有し;前記分離マトリックスは多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインAドメインの多量体を含み、前記アルカリ安定化プロテインAドメインは配列番号51または配列番号52によって定義されるブドウ球菌プロテインA(SpA)の親Fc結合ドメインの変異体を含み、前記配列番号51または配列番号52の13位および44位の位置のアミノ酸残基はアスパラギンであり、前記配列番号51または52の3位の少なくともアスパラギン残基はグルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異し;前記保存液は少なくとも50体積%のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む、分離マトリックス製品。
Claims (10)
- 多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインAドメインの多量体を含む分離マトリックスを保存する方法であって、前記アルカリ安定化プロテインAドメインは、配列番号51または配列番号52に少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、ブドウ球菌プロテインA(SpA)の親Fc結合ドメインの変異体を含み、配列番号51または配列番号52の13位および44位の位置のアミノ酸残基はアスパラギンであり、少なくとも配列番号51または52の3位のアスパラギン残基が、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異しており;かつ、前記方法が:
a)10mM~50mMのモル濃度を有するアルカリ金属水酸化物水溶液を含む保存液を準備する工程と;
b)前記保存液を前記分離マトリックスに浸透させる工程と;
c)前記保存液を浸透させた分離マトリックスを少なくとも5日の保存時間の間保存する工程と
を含み、
前記保存液が少なくとも50体積%のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む、方法。 - 前記変異体が、配列番号51または52の1、2、7、10、15、20、21、24、25、28、29、32、34、35、36、39、42および43位の1以上においてさらなる変異を含む、請求項1に記載の方法。
- 配列番号51または52の1位のグルタミン残基がアラニンに変異しており、および/または、配列番号51または52の35位のアスパラギンまたはグルタミン酸残基がアラニンに変異している、請求項1または2に記載の方法。
- 前記免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインAドメインの多量体が、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体または九量体からなる群から選択されるホモ多量体であり、および/または、前記免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインAドメインの多量体が、各々、前記多孔質支持体と共有結合するためのC末端システイン残基を含む、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記分離マトリックスが、少なくとも11mg/mlの、前記多孔質支持体と共有結合した前記免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインAドメインの多量体を含む、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多孔質支持体が高度に架橋されたアガロースビーズである、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アルカリ金属水酸化物水溶液が、30mM~50mMのモル濃度を有する、請求項1乃至6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記保存液が、少なくとも70体積%のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記保存時間が、少なくとも10日である、請求項1乃至8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記分離マトリックスが、工程b)の後に、その最初の動的結合容量の少なくとも80%を保持する、請求項1乃至9のいずれか1項に記載の方法。
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