JP3902728B2 - レセプターに基づくアンタゴニストならびに作製および使用の方法 - Google Patents

Description

【０００１】
本出願は、１９９８年９月２５日出願の米国仮出願番号第６０／１０１，８５８号の優先権を主張する、１９９９年５月１９日出願の米国出願番号０９／３１３，９４２号の優先権を主張する。本出願を通じて、種々の刊行物が引用される。これらの刊行物の開示は、本明細書においてその全体が本出願への参考として援用される。
【０００２】
（発明の背景）
生物学的活性が変化することを発見したが、毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）は、規定されたサイトカインのファミリー（本明細書においては、以降、サイトカインの「ＣＮＴＦファミリー」と呼ぶ）を含む。これらのサイトカインが一緒にグループ分けされるのは、その構造的類似性の距離によってであり［Ｂａｚａｎ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｎ ７：１９７〜２０８（１９９１）；ＲｏｓｅおよびＢｒｕｃｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８６４１〜８６４５（１９９１）］、そして、おそらく、より重要なことには、それらが「β」シグナル伝達レセプター成分を共有するからである［Ｂａｕｍａｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１９８５３〜１９８６２（１９９３）；Ｄａｖｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８０５〜１８０８（１９９３）；Ｇｅａｒｉｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１４３４〜１４３７（１９９２）；Ｉｐら、Ｃｅｌｌ ６９：１１２１〜１１３２（１９９２）；Ｓｔａｈｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：７６２８〜７６３１（１９９３）；ＳｔａｈｌおよびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ、Ｃｅｌｌ ７４：５８７〜５９０（１９９３）］。このファミリーのサイトカインによるレセプター活性化は、これらのβ成分のホモ二量体化、またはヘテロ二量体化のいずれかから生じる［Ｄａｖｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８０５〜１８０８（１９９３）、Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８０８〜１８１０（１９９３）；ＳｔａｈｌおよびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ、Ｃｅｌｌ ７４：５８７〜５９０（１９９３）］。ＩＬ−６レセプター活性化は、ＩＬ−６シグナルトランスデューサー［Ｈｉｂｉら、Ｃｅｌｌ ６３：１１４９〜１１５７（１９９０）］として最初に同定されたタンパク質である、ｇｐ１３０のホモ二量体化を必要とする［Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８０８〜１８１０（１９９３）、Ｈｉｂｉら、Ｃｅｌｌ ６３：１１４９〜１１５７（１９９０）］。ＣＮＴＦ，ＬＩＦおよびＯＳＭレセプター活性化は、ｇｐ１３０とＬＩＦＲβとして既知の第２のｇｐ１３０関連タンパク質（これは、ＬＩＦへの結合能力によって最初に同定された［Ｇｅａｒｉｎｇら、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８３９〜２８４８（１９９１）］）との間のヘテロ二量体化から生じる［Ｄａｖｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８０５〜１８０８（１９９３）］。
【０００３】
β成分に加えて、これらのサイトカインのいくつかはまた、特異性決定「α」成分を必要とする。この成分は、その組織分布がβ成分よりも限定されており、そのため特定のサイトカインの細胞標的を決定する［ＳｔａｈｌおよびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ、Ｃｅｌｌ ７４：５８７〜５９０（１９９３）］。従って、ＬＩＦおよびＯＳＭは、応答する細胞上のｇｐ１３０およびＬＩＦＲβの存在のみを必要とし得る、広範に活性な因子である。一方、ＣＮＴＦは、ＣＮＴＦαを必要とし［ＳｔａｈｌおよびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ、Ｃｅｌｌ ７４：５８７〜５９０（１９９３）］、そしてＩＬ−６は、ＩＬ−６Ｒαを必要とする［Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：５９３〜５９７（１９９２）］。ＣＮＴＦＲα（Ｄａｖｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７３６〜１７３９（１９９３）およびＩＬ−６Ｒα［Ｈｉｂｉら、Ｃｅｌｌ ６３：１１４９〜１１５７、Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８０８〜１８１０（１９９０）；Ｔａｇａら、Ｃｅｌｌ ５８：５７３〜５８１（１９８９）］の両方は、可溶性タンパク質として機能し得る。このことは、それらが細胞間シグナル伝達分子と相互作用しないが、そのリガンドは適切なシグナル伝達βサブユニットと相互作用することを補助するように働くという概念と一致する［ＳｔａｈｌおよびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ、Ｃｅｌｌ ７４：５８７〜５９０（１９９３）］。
【０００４】
他のサイトカイン系からのさらなる証拠もまた、二量体化が、全てのサイトカインレセプターがシグナル伝達を開始する共通の機構を提供するという概念を支持する。成長ホルモン（ＧＨ）は、この点に関して働くおそらく最良の例である。結晶学的研究は、それぞれのＧＨ分子が２つの異なるレセプター結合部位を含むことを示した。この両方の部位は、レセプター中の同じ結合ドメインにより認識され、ＧＨの単一分子が２つのレセプター分子に係わり合うことを可能にする［ｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６〜３１２（１９９２）］。二量体化は、引き続いて生じ、これはＧＨ上の部位１での１つのレセプター分子への最初の結合、続いて、第２のレセプター分子への部位２の結合を伴う［Ｆｕｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１６７７〜１６８０（１９９２）］。エリスロポエチン（ＥＰＯ）レセプターを用いる研究はまた、レセプター活性化における二量体化の重要性と一致する。なぜなら、ＥＰＯレセプターは、システイン残基を導入し、そしてジスルフィド結合二量体を生じる単一のアミノ酸変化により構成的に活性化され得るからである［Ｗａｔｏｗｉｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２１４０〜２１４４（１９９２）］。
【０００５】
レセプター活性化のための重要な工程であるβサブユニットのホモ二量体化またはヘテロ二量体化に加えて、第２の重要な特徴は、サイトカインのＣＮＴＦファミリーによる最終レセプター複合体の形成が、リガンドが順序立てられた様式でレセプター成分に首尾良く結合するような機構を通じて生じることである［Ｄａｖｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８０５〜１８１８（１９９３）；ＳｔａｈｌおよびＹａｎｃｏｐｏｌｕｓ、Ｃｅｌｌ ７４：５８７〜５９０（１９９３）］。従って、ＣＮＴＦは、最終的にＬＩＦＲβを補充してβ成分（これは、次いで、シグナル伝達を開始する）のヘテロ二量体を形成する前に、まずＣＮＴＦＲαに結合し、複合体を形成し、次いでこれはｇｐ１３０に結合して、単一のβ成分のみを有するためにシグナル伝達成分ではない中間体（本明細書ではαβ１中間体と呼ぶ）を形成する。ＩＬ−６Ｒαに結合したＩＬ−６およびｇｐ１３０の単一分子を含有する類似の中間体は、直接単離されていないが、本発明者らは、その遠い関連物であるＣＮＴＦに対する類似性によってそれが存在するということ、および最終活性化ＩＬ−６レセプター複合体が２つのｇｐ１３０モノマーを補充するという事実を推論した。要するに、これらの知見は、一般的サイトカインレセプター複合体の構造についての提案（図１）をもたらした。ここで、各サイトカインは、以下の３つまでのレセプター結合部位を有し得る：任意のα特異性決定成分に結合する部位（α部位）、第１のβシグナル伝達成分に結合する部位（β１部位）、および第２のβシグナル伝達成分に結合する部位（β２部位）［ＳｔａｈｌおよびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ、Ｃｅｌｌ ７４：５８７〜５９０（１９９３）］。これらの３つの部位は、シグナル伝達を開始するために重要な、複合体形成における最終工程（β成分二量体化を生じる）を伴う、連続的な様式で用いられる［Ｄａｖｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８０５〜１８１８（１９９３）］。レセプター活性化の詳細およびＣＮＴＦに関する非機能性β１中間体の存在という知識により、ＣＮＴＦは、特定の環境下でＩＬ−６に対する高親和性アンタゴニストであるという知見が導かれた。そして、これは、以下に詳細に記載するように、サイトカインのＣＮＴＦファミリーに対するリガンドまたはレセプターに基づくアンタゴニストを設計するための戦略的基礎を提供する。
【０００６】
一旦、サイトカイン結合がレセプター複合体形成を引き起こすと、β成分の二量体化が、広範な種々の基質のリン酸化を生じる細胞内チロシンキナーゼ活性を活性化する［Ｉｐら、Ｃｅｌｌ ６９：１２１−１１３２（１９９２）］。チロシンキナーゼ活性のこの活性化は、下流の現象に重要であると思われる。なぜならばチロシンのリン酸化をブロックするインヒビターは、遺伝子誘導のような後の現象をも妨げるからである［Ｉｐら、Ｃｅｌｌ ６９：１２１−１１３２（１９９２）；ＮａｋａｊｉｍａおよびＷａｌｌ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：１４０９−１４１８（１９９１）］。近年、本発明者らは、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、およびＴｙｋ２（Ｊａｋ／Ｔｙｋキナーゼといわれる）［Ｆｉｒｍｂａｃｈ−Ｋｒａｆｔら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５：１３２９−１３３６（１９９０）；Ｗｉｌｋｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２０５７−２０６５（１９９１］を含み、かつ他のサイトカインでのシグナル伝達［Ａｒｇｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｃｅｌｌ ７４：２３７−２４４（１９９３）；Ｓｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８４２９−８４３３（１９９３）；Ｖｅｌａｚｑｕｅｚら、Ｃｅｌｌ ７０：３１３−３２２（１９９２）；Ｗｉｔｔｈｕｈｎら、Ｃｅｌｌ ７４：２２７−２３６（１９９３）］に関与する、非レセプターチロシンキナーゼの新たに発見したファミリーは、リガンドの非存在化でβサブユニットのｇｐ１３０およびＬＩＦＲβの細胞質ドメインと予め会合（ｐｒｅａｓｓｏｃｉａｔｅ）し、そしてリガンドの付加の際にチロシンがリン酸化および活性化される［Ｓｔａｈｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：９２−９５（１９９４）］ことを実証した。従って、これらのキナーゼは、リガンドが細胞の外側に結合する結果として、細胞の内側で活性化される細胞内シグナル伝達の最も近い工程であると思われる。この系に基づく特異的アンタゴニストまたはアゴニスト活性に関して低分子の収集物をスクリーニングするためのアッセイ系は、以下に記載される。
【０００７】
サイトカインのＣＮＴＦファミリーは、潜在的なアンタゴニストおよびアゴニストの両方の治療的適用を提供する、広範な種々の生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明の１つの目的は、サイトカインに関連した疾患または障害の処置において有用であるサイトカインアゴニストの産生である。
【０００９】
本発明の別の目的は、サイトカインに関連した疾患または障害の処置のために開示されたサイトカインアンタゴニストの使用である。例えば、本明細書中に記載されるＩＬ−６アンタゴニストは、骨粗しょう症、癌の原発性および続発性の影響（多発性骨髄腫、または悪液質を含む）の処置に用いられ得る。
【００１０】
本発明の別の目的は、サイトカインレセプターの新規のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するために有用なスクリーニング系の開発である。
【００１１】
本発明の別の目的は、サイトカインのアゴニストおよびアンタゴニストとして作用する低分子を同定するために有用なスクリーニング系の開発である。
【００１２】
本発明の別の目的は、サイトカインのＣＮＴＦファミリーのメンバーの新規のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するために有用なスクリーニング系の開発である。
【００１３】
本発明の別の目的は、サイトカインのＣＮＴＦファミリーのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する低分子を同定するために有用なスクリーニング系の開発である。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、サイトカインを結合して非機能性複合体を形成し得る融合ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供し、これは以下を含む：
ａ）サイトカインのレセプターの特異性決定成分の細胞外ドメインのサイトカイン結合部分のアミノ酸配列を含む、第１の融合ポリペプチド成分をコードするヌクレオチド配列；
ｂ）サイトカインのレセプターのシグナル伝達成分の細胞外ドメインのサイトカイン結合部分のアミノ酸配列を含む、第２の融合ポリペプチド成分をコードするヌクレオチド配列；および
ｃ）多量体化成分のアミノ酸配列を含む、第３の融合ポリペプチド成分をコードするヌクレオチド配列。
【００１５】
「サイトカイン結合部分」により意味されるものは、サイトカインを結合するために必要な細胞外ドメインの最小部分である。サイトカインレセプターに特徴的な定義は、最も簡単に図式化した（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）システインを含む２つのフィブロネクチン様ドメインの存在およびＷＳＸＷＳボックスの存在であることが、当業者により容認される（Ｂａｚａｎ，Ｊ．Ｆ．、１９９０、ＰＮＡＳ ８７：６９３４−６９３８）。サイトカインのレセプターの結合成分およびサイトカインのレセプターのシグナル伝達成分の細胞外ドメインをコードする配列はまた、本発明の融合ポリペプチドを作製するために使用され得る。同様に、サイトカインのレセプターの成分のより大きい部分をコードするより長い配列が使用され得る。しかし、細胞外ドメインより小さいフラグメントがサイトカインを結合するように機能し、従って、本発明が、サイトカイン結合部分として、サイトカインを結合するために必要な細胞外ドメインの最小部分を含む融合ポリペプチドを意図することが意図される。
【００１６】
本発明は、サイトカインのレセプターの「特異性決定成分」およびサイトカインのレセプターの「シグナル伝達成分」を含む。サイトカインレセプターの特定の成分またはサブユニットを命名するために使用される命名法に関わらず、当業者は、レセプターのいずれの成分またはサブユニットが、そのサイトカインの細胞標的の決定を担うかを認識し、従って、いずれの成分が「特異性決定成分」を構成するかを知る。
【００１７】
同様に、使用される命名法に関わらず、当業者は、レセプターのいずれの成分またはサブユニットが「シグナル伝達成分」を構成するかを知る。本明細書中で使用される場合、「シグナル伝達成分」は、特異性決定成分ではなく、かつ特異性決定成分の非存在下ではサイトカインを結合しないかまたは弱く結合するネイティブのレセプターの成分である。ネイティブのレセプターにおいて、「シグナル伝達成分」は、シグナル伝達に関与し得る。
【００１８】
例えば、いくつかのサイトカインレセプターはαおよびβと命名される成分を有するが、ＩＬ−４レセプターは、ＩＬ−２Ｒγと呼ばれるシグナル伝達成分を有する。しかし、どんな名称が成分と関連するかに関わらず、当業者は、ＩＬ−４レセプターのいずれの成分がシグナル伝達成分であるかを知る。従って、本発明を実施するためおよびＩＬ−４に対する高親和性トラップを作製するために、当業者は、以下を含む単離された核酸を作製する：ＩＬ−４レセプターの特異性決定成分（ＩＬ−４Ｒα）の細胞外ドメインのサイトカイン結合部分のアミノ酸配列を含む、第１の融合ポリペプチド成分をコードするヌクレオチド配列；ＩＬ−４レセプターのシグナル伝達成分（ＩＬ−２Ｒγ）の細胞外ドメインのサイトカイン結合部分のアミノ酸配列を含む、第２の融合ポリペプチド成分をコードするヌクレオチド配列；および、ＩＬ−４に対する高親和性トラップを作製するための、多量体化成分（例えば、ＩｇＧのＦｃドメイン）のアミノ酸配列を含む、第３の融合ポリペプチド成分をコードするヌクレオチド配列。
【００１９】
本発明に従ってサイトカインアンタゴニスト調製するために使用され得るレセプター成分のいくつかのさらなる例を、表１に示す。表１は、制限するためではなく例示のために、特定のサイトカインレセプターの特異性決定成分として機能するそれらの成分およびシグナル伝達成分として機能するそれらの成分を記載するために科学文献で使用された、変動した命名法のいくつかを示す。
【００２０】
【表１】

多くの参考文献のうちのほんのわずかだけが表１に引用され、そしてそれらは以下のように示される：
１．ＳａｔｏおよびＭｉｙａｊｉｍａ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６：１７４−１７９（１９９４）−第１７６頁、第９行〜第１６行を参照のこと；
２．Ｍｉｙａｊｉｍａら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０：２９５−３３１（１９９２）−第２９５頁、第４行〜第２９６頁、第１行；第３０５頁、最終段落を参照のこと；
３．Ｋｏｎｄｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１８７４−１８７７（１９９３）−第１８７４頁、カラム１および２を参照のこと；
４．Ｈｉｌｔｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １３：４７６５−４７７５（１９９４）−第４７６６頁、カラム１、第２０行〜第２４行を参照のこと；
５．ＳｔａｈｌおよびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ、Ｃｅｌｌ ７４：５８７−５９０（１９９３）−第５８７頁、カラム２、第１５行〜第２２行を参照のこと；
６．Ｂａｓｓｉｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９：１４８６１−１４８６４（１９９４）−第１４８６１頁、カラム２、第１行〜第９行および第２１行〜第２８行を参照のこと；
７．Ｋｏｔｅｎｋｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：２０９１５−２０９２１（１９９５）−第２０９１５頁、要約の第１行〜第５行を参照のこと；
８．Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７０：１３７５７−１３７６５（１９９５）−第１３７５７頁、カラム１、第６行〜カラム２、第３行、およびカラム２、第１０行〜第１２行；第１３７６４頁、カラム２、最後の３行、および第１３７６５頁、カラム１、第１行〜第７行を参照のこと；
９．ＬｅｂｒｕｎおよびＶａｌｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７：１６８２−１６９１（１９９７）−第１６８２頁、要約、第２行〜第６行を参照のこと；
１０．ＫｅｎｎｅｄｙおよびＰａｒｋ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６：１３４−１４３（１９９６）−第１３４頁、要約の第１行〜第７行；第１３６頁、カラム２、第１行〜第５行を参照のこと；
１１．Ｗｅｓｃｈｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７２：７７２７−７７３１（１９９７）第７７３１頁、第２０行〜第２６行を参照のこと。
【００２１】
Ｋｏｔｅｎｋｏらは、活性ＩＬ−１０レセプター複合体のために、およびＩＬ−１０誘導性のシグナル伝達事象を開始するために必須な、アクセサリー鎖として機能することが報告されている、ＩＬ−１０Ｒ２（ＩＬ−１０Ｒβ）鎖を、最近同定した（Ｓ．Ｖ．Ｋｏｔｅｎｋｏら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９７，第１６巻：５８９４−５９０３）。さらなるサイトカインおよびそれらのレセプターは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．／Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（版権１９９６）によって出版された、Ｃｈａｒｌｅｓ Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ．およびＰａｕｌ Ｔｒａｖｅｒｓによる、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，第２版の付録ＩＩ、Ａ：９頁に記載される。
【００２２】
本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸配列を調製する際に、融合ポリペプチドの第１の成分、第２の成分、および第３の成分は、宿主ベクター系によって発現された場合に、融合ポリペプチドのモノマー種を生成する、ヌクレオチドの単一の鎖にコードされる。次いで、このようにして発現されたモノマーは、多量体となる成分（第３の融合ポリペプチド成分）間の相互作用によって、多量体となる。この様式で融合ポリペプチドを産生することは、第１および第２の成分が、別個の分子として産生され、次いで多量体となった場合に生じる、ヘテロ二量体混合物の精製のための必要性を回避する。例えば、１９９５年１１月２８日に発行された米国特許第５，４７０，９５２号は、ＣＮＴＦまたはＩＬ−６アンタゴニストとして機能するヘテロ二量体タンパク質の産生を記載する。このヘテロ二量体は、適切なアルファ（α）成分およびベータ（β）成分とともに同時トランスフェクトされた細胞株から精製される。次いで、ヘテロ二量体は、例えば、調製用の非変性ポリアクリルアミドゲルからの受動的溶出の方法を使用して、または、高圧陽イオン交換クロマトグラフィーを使用することによって、ホモ二量体から分離される。この精製工程の必要性は、本発明の方法によって回避される。
【００２３】
さらに、１９９６年４月１８日に公開された、Ｄｉｍｅｒｉｃ ＩＬ−４ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓという表題のＰＣＴ国際出願ＷＯ９６／１１２１３は、出願人が、２つのＩＬ−４レセプターがポリマー性スペーサーによって結合されるホモ二量体を調製し、そしてＩＬ−４レセプターが、ポリマー性スペーサーによってＩＬ−２レセプターγ鎖に連結されているヘテロ二量体を調製したことを言及する。記載されたポリマー性スペーサーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。２つのレセプター成分、ＩＬ−４ＲおよびＩＬ−２Ｒγは、別個に発現され、そして精製される。次いで、ＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）ホモ二量体およびヘテロ二量体は、二官能性ＰＥＧ試薬を使用して、成分を互いに結合させることによって産生される。このような時間を消費し、かつコストのかかる精製およびＰＥＧ化工程の必要性を回避することが、本発明の利点である。
【００２４】
本発明の１つの実施態様において、第１の成分をコードするヌクレオチド配列は、第２の成分をコードするヌクレオチド配列の上流にある。本発明の別の実施態様において、第１の成分をコードするヌクレオチド配列は、第２の成分をコードするヌクレオチド配列の下流にある。第１の融合ポリペプチド成分、第２の融合ポリペプチド成分、および第３の融合ポリペプチド成分の順番が再配列される、本発明のさらなる実施態様が準備され得る。例えば、第１の成分をコードするヌクレオチド配列が１と命名され、第２の成分をコードするヌクレオチド配列が２と命名され、そして第３の成分のヌクレオチド配列が３と命名される場合、５’から３’まで読まれるような本発明の単離された核酸における成分の順番は、以下の６つの組み合わせのいずれかであり得る：１、２、３；１、３、２；２、１、３；２、３、１；３、１、２；または３、２、１。
【００２５】
本発明のさらなる実施態様において、融合ポリペプチドによって結合されるサイトカインは、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−９、インターロイキン−１１、インターロイキン−１３、インターロイキン−１５、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、オンコスタチンＭ、白血病阻害因子、およびカルジオトロフィン（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）−１からなる群より選択されるサイトカインの造血素ファミリーのメンバーであり得る。
【００２６】
本発明のさらなる実施態様において、融合ポリペプチドによって結合されるサイトカインは、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、およびＩＦＮ−βからなる群より選択されるサイトカインのインターフェロンファミリーのメンバーであり得る。
【００２７】
本発明のさらなる実施態様において、融合ポリペプチドによって結合されるサイトカインは、Ｂ７．１（ＣＤ８０）およびＢ７．２（Ｂ７０）からなる群より選択されるサイトカインの免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり得る。
【００２８】
本発明のなおさらなる実施態様において、融合ポリペプチドによって結合されるサイトカインは、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＴ−β、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、および４−１ＢＢＬからなる群より選択されるサイトカインのＴＮＦファミリーのメンバーであり得る。
【００２９】
本発明のさらなる実施態様において、融合ポリペプチドによって結合されるサイトカインは、インターロイキン−１、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、インターロイキン−１４、インターロイキン−１８、およびＭＩＦからなる群より選択されるサイトカインであり得る。
【００３０】
特異性の決定およびシグナル伝達は、サイトカインのＴＧＦ−β／ＢＭＰファミリーにおけるのと類似の機構によって生じるので（Ｄ．Ｋｉｎｇｓｌｅｙ，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９４，８：１３３−１４６；Ｊ．Ｗｒａｎａ，Ｍｉｎｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ Ｍｅｔａｂ，２４：１２０−１３０（１９９８）；Ｒ．ＤｅｒｙｎｃｋおよびＸ．Ｆｅｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １３３３（１９９７）Ｆ１０５−Ｆ１５０；ならびにＪ．ＭａｓｓａｇｕｅおよびＦ．Ｗｅｉｓ−Ｇａｒｃｉａ，「Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｅｔａ Ｆａｍｉｌｙ Ｓｉｇｎａｌｓ」Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ、第２７巻：Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１９９６、Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄを参照のこと）、本発明は、ＴＧＦ−β／ＢＭＰファミリーのメンバーであるサイトカインについての高親和性のアンタゴニストを産生するために使用され得る。
【００３１】
従って、本発明のさらなる実施態様において、融合ポリペプチドによって結合されるサイトカインは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３ａ、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８ａ、ＢＭＰ−８ｂ、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、子宮内膜出血関連因子（ＥＢＡＦ）、増殖分化因子−１（ＧＤＦ−１）、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１２、ＧＤＦ−１４、ミューラー阻害物質（ＭＩＳ）、アクチビン−１、アクチビン−２、アクチビン−３、アクチビン−４、およびアクチビン−５からなる群より選択されるＴＧＦ−β／ＢＭＰファミリーのメンバーであり得る。
【００３２】
本発明の代替的な実施態様において、特異性決定成分、シグナル伝達成分、またはその両方は、単鎖Ｆｖによって置換され得る。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、合成ペプチドのストレッチによって、軽鎖のＶ領域に連結された重鎖のＶ領域のみを有する短縮型Ｆａｂである。例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄに与えられた、米国特許第５，５６５，３３２号；同第５，７３３，７４３号；同第５，８３７，２４２号；同第５，８５８，６５７号および同第５，８７１，９０７号を参照のこと。従って、本発明は、例えば、サイトカインを結合して、機能的でない複合体を形成し得る融合ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を意図し、この複合体は、サイトカインのレセプターの成分を決定する特異性の細胞外ドメインのサイトカイン結合部分のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド成分をコードするヌクレオチド配列；サイトカインのレセプターの成分を決定する特異性の細胞外ドメインのサイトカイン結合部分が結合する部位と異なる部位でサイトカインを結合し得るｓｃＦｖのアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド成分をコードするヌクレオチド配列；および、多量体となる成分のアミノ酸配列を含む第３の融合ポリペプチド成分をコードするヌクレオチド配列を含む。あるいは、特異性決定成分は、シグナル伝達成分が結合する部位とは異なるサイトカイン上の部位に結合するｓｃＦｖによって置換され得る。従って、本発明は、サイトカインを結合して、機能的でない複合体を形成し得る融合ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を意図し、この複合体は、サイトカインのレセプターのシグナル伝達成分の細胞外ドメインのサイトカイン結合部分が結合する部位とは異なるサイトカイン上の部位に結合するｓｃＦｖのアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド成分をコードするヌクレオチド配列；サイトカインのレセプターのシグナル伝達成分の細胞外ドメインのサイトカイン結合部分のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド成分をコードするヌクレオチド配列；および、多量体となる成分のアミノ酸配列を含む第３の融合ポリペプチド成分をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３３】
別の実施態様において、本発明は、サイトカインを結合して、機能的でない複合体を形成し得る融合ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を意図し、この複合体は、サイトカイン上の部位に結合する第１のｓｃＦｖのアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド成分をコードするヌクレオチド配列；第１のｓｃＦｖが結合する部位とは異なるサイトカイン上の部位に結合する第２のｓｃＦｖのアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド成分をコードするヌクレオチド配列；および、多量体となる成分のアミノ酸配列を含む第３の融合ポリペプチド成分をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
ｓｃＦｖを含む上記の実施態様のすべてにおいて、本発明はまた、第１の成分をコードするヌクレオチド配列が、第２の成分をコードするヌクレオチド配列の上流である実施態様；第１の成分をコードするヌクレオチド配列が、第２の成分をコードするヌクレオチド配列の下流である実施態様；ならびに、第１の融合ポリペプチド成分、第２の融合ポリペプチド成分、および第３の融合ポリペプチド成分の順番が再配列される、本発明のさらなる実施態様を意図する。例えば、第１の成分をコードするヌクレオチド配列が１と命名され、第２の成分をコードするヌクレオチド配列が２と命名され、そして第３の成分のヌクレオチド配列が３と命名される場合、５’から３’まで読まれるような本発明の単離された核酸における成分の順番は、以下の６つの組み合わせのいずれかであり得る：１、２、３；１、３、２；２、１、３；２、３、１；３、１、２；または３、２、１。
【００３５】
本発明の好ましい実施態様において、多量体となる成分は、免疫グロブリン由来のドメインを含む。より具体的には、免疫グロブリン由来ドメインは、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＩｇＧの重鎖、およびＩｇＧの軽鎖からなる群より選択され得る。別の実施態様において、多量体となる成分は、最初の５つのアミノ酸（システインを含む）が取り除かれて、Ｆｃ（ΔＣ１）と呼ばれる多量体となる成分を生成したＦｃドメインであり得る。あるいは、多量体となる成分は、最初の５つのアミノ酸中のシステインが別のアミノ酸（例えば、セリンまたはアラニン）によって置換されたＦｃドメインであり得る。
【００３６】
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子によってコードされる融合ポリペプチドを提供する。好ましくは、その融合ポリペプチドは、第３の多量体となる成分の機能によって、多量体形態である。好ましい実施態様において、その多量体は二量体である。適切な多量体となる成分は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域をコードする配列（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９８２，Ｃｅｌｌ ２９：６７１−６７９）；免疫グロブリン遺伝子配列、およびその部分である。本発明の好ましい実施態様において、免疫グロブリン遺伝子配列、とりわけ、Ｆｃドメインをコードするものは、第３の多量体となる成分をコードするように使用される。
【００３７】
本発明はまた、本明細書中に記載されるような本発明の核酸分子を含むベクターを意図する。
【００３８】
本明細書中に記載されるような本発明の核酸を含む発現ベクターもまた提供し、ここで、この核酸分子は、発現制御配列に作動可能に連結される。融合ポリペプチドの産生のための宿主ベクター系もまた提供し、これは、融合ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞内に導入された本発明の発現ベクターを含む。適切な宿主細胞は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、または哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、ＢＨＫ細胞またはＮＳ０細胞）であり得る。
【００３９】
本発明はまた、本発明の融合ポリペプチドを産生する方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載の宿主ベクター系の細胞を、融合ポリペプチドが産生可能な条件下で培養する工程、およびこのように産生された融合ポリペプチドを回収する工程による。
【００４０】
本発明は、サイトカイン（例えばＣＮＴＦファミリーのサイトカイン）によって共有されるレセプター成分に基づく新規アンタゴニストを提供する。
【００４１】
本明細書中に記載の発明は、α特異性決定成分を利用する、任意のサイトカインに対するアンタゴニストの産生を意図し、このα特異性決定成分は、サイトカインと結合した場合に、第１のβシグナル伝達成分に結合して非機能性中間体を形成し、次いで、この中間体は、第２のβシグナル伝達成分に結合して、βレセプター二量体化および引き続くシグナル伝達を生じる。本発明に従って、レセプターの可溶性α特異性決定成分（ｓＲα）およびサイトカインレセプターの第１のβシグナル伝達成分（β１）の細胞外ドメインが結合して、ヘテロ二量体（ｓＲα：β１）を形成し、このヘテロ二量体は、サイトカインと結合して、非機能性複合体を形成することによってサイトカインに対するアンタゴニストとして作用する。
【００４２】
実施例１に記載されるように、ＣＮＴＦおよびＩＬ−６は、β１レセプター成分ｇｐ１３０を共有する。ＣＮＴＦが、ＣＮＴＦＲαおよびｇｐ１３０と共に中間体を形成するという事実は、ＬＩＦＲβを欠失する細胞において実証され得（実施例１）、ここで、ＣＮＴＦとＣＮＴＦＲαとの複合体は、ｇｐ１３０と結合し、そしてＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒαによるｇｐ１３０のホモ二量体化を妨げ、これによって、シグナル伝達をブロックする。これらの研究は、リガンドの存在下で、非機能的中間体複合体（リガンド、そのαレセプター成分およびそのβ１レセプター成分からなる）が形成され得る場合に、この複合体が、リガンドの作用を効果的にブロックすることを示すので、これらの研究は、本明細書中に記載のＩＬ−６アンタゴニストの開発の基礎を提供する。他のサイトカインは、他のβ１レセプター成分（例えば、ＬＩＦＲβ）を使用し得、これらもまた、本発明に従ってアンタゴニストを産生するために使用され得る。
【００４３】
従って、例えば、本発明の１つの実施態様において、ＩＬ−６またはＣＮＴＦの効果的なアンタゴニストは、それらのレセプターのα特異性決定成分（それぞれ、ｓＩＬ−６ＲαおよびｓＣＮＴＦＲα）の細胞外ドメインとｇｐ１３０の細胞外ドメインとのヘテロ二量体からなる。この合成されたヘテロ二量体は、本明細書中以降、それぞれ、ｓＩＬ−６Ｒα：β１およびｓＣＮＴＦＲα：β１と称し、それぞれ、ＩＬ−６またはＣＮＴＦに対する高親和性トラップとして機能し、従って、サイトカインを、それらのレセプターのネイティブな膜結合形態とシグナル伝達複合体を形成させないようにさせる。
【００４４】
レセプターの細胞外部分由来のドメインと結合する可溶性リガンドは、これらのリガンドに対するトラップとして幾分効果的であり、そして従ってアンタゴニストとして作用することが示されたが［Ｂａｒｇｅｔｚｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：４０１０−４０１３（１９９３）；ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：８６１６−８６２０（１９９２）；Ｍｏｈｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：１５４８−１５６１（１９９３）；Ｎａｒａｚａｋｉら、Ｂｌｏｏｄ ８２：１１２０−１１２６（１９９３）］、ＩＬ−６レセプターおよびＣＮＴＦレセプターは、αレセプター成分がリガンド結合ドメインを構成し、これらのドメインが、これらのリガンドと共に、可溶性形態でレセプターアゴニストとして効果的に機能するという点で通常ではない［Ｄａｖｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７３６−１７３９（１９９３）；Ｔａｇａら、Ｃｅｌｌ ５８：５７３−５８１（１９８９）］。本発明に従って調製されたｓＲα：β１ヘテロ二量体は、機能的中間体を作製することなくピコモル濃度の範囲の親和性でこれらのリガンドと結合する（ＰＣ１２Ｄ細胞に対するＣＮＴＦについての結合研究に基づいて）、これらのリガンドに対する効果的なトラップを提供する。本明細書中に記載の技術を適用して、特異性を付与するα−成分、ならびにこのα−特異性成分に結合される場合に、いずれかの成分単独よりもサイトカインに対するより高い親和性を有するβ成分を利用して、任意のサイトカインに対するサイトカイントラップを開発し得る。従って、本発明に従うアンタゴニストは、以下のアンタゴニストを含む：インターロイキン１〜インターロイキン５［ＩＬ−１、Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３７５７−１３７６５（１９９５）；Ｇｕｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２７５６２−２７５６８（１９９５）］、ＩＬ−２；［Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、欧州特許第０３８６２８９−Ａ号および同第０３８６３０４−Ａ号（１９９０）；Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：３７９−３８２（１９９２）］；ＩＬ−３；［Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｃｅｌｌ ６６：１１６５−１１７４（１９９１）］、ＩＬ−４；［Ｉｄｚｅｒｄａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：８６１−８７３（１９９０）］、ＩＬ−５；［Ｔａｖｅｒｎｅｉｒら、Ｃｅｌｌ ６６：１１７５−１１８４（１９９１）］、ＩＬ−１１［（Ｃｈｅｒｅｌら、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪデータベースへのＤｉｒｅｃｔ Ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ；登録番号Ｚ３８１０２）］、インターロイキンン１５［ＩＬ−１５；Ｈｅｍａｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２９５：５５−６４（１９９５）；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、欧州特許第０３８６２８９−Ａ号および同第０３８６３０４−Ａ号（１９９０）；Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：３７９−３８２（１９９２）］、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子［ＧＭ−ＣＳＦ；Ｈａｙａｓｈｉｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：９６５５−９６５９（１９９０）］、ＬＩＦ、γインターフェロン［ＩＦＮγ；Ａｇｕｅｔら、Ｃｅｌｌ ５５：２７３−２８０（１９８８）；Ｓｏｈら、Ｃｅｌｌ ７６：７９３−８０２（１９９４）］、およびトランスフォーミング増殖因子β［ＴＧＦβ；Ｉｎａｇａｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５３５９−５３６３［１９９３）］。
【００４５】
αレセプター細胞外ドメインおよびβレセプター細胞外ドメインは、当業者に公知の方法を使用して調製され得る。ＣＮＴＦＲαレセプターは、クローン化され、配列決定され、そして発現されている［Ｄａｖｉｓら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：５９−６３（本明細書中にその全体が参考として援用される）］。ＬＩＦＲβおよびｇｐ１３０のクローニングは、Ｇｅｒｉｎｇら、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８３９−２８４８（１９９１），Ｈｉｂｉら、Ｃｅｌｌ ６３：１１４９−１１５７（１９９０）および公開ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１（１９９３年５月２７日公開）（これら全ては、本明細書中にそれら全体が参考として援用される）に記載される。
【００４６】
本発明の実施に有用なレセプター分子は、原核生物発現系または真核生物発現系における、クローニングおよび発現によって調製され得る。この組換えレセプター遺伝子は、かなり多数の方法を利用して発現および精製され得る。この因子をコードする遺伝子は、細菌発現ベクター（例えば、ｐＣＰ１１０のような（しかし、これに限定されない））内にサブクローニングされ得る。
【００４７】
組換え因子は、安定な生物学的に活性なタンパク質の引き続く形成を可能にする任意の技術によって精製され得る。例えば、これらに限定されないが、この因子は、可溶性タンパク質または封入体のいずれかとして細胞から回収され得、これらから、８Ｍ塩酸グアニジンおよび透析によって定量的に抽出され得る。因子のさらなる精製のために、従来のイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはゲル濾過が、使用され得る。
【００４８】
ｓＲα：βヘテロ二量体レセプターは、βレセプターヘテロ二量体の産生を記載する「Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ ａｎｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ」という表題の公開ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１（１９９３年５月２７日公開）に記載されるように、公知の融合領域を使用して操作され得るか、またはこれらは、化学的手段による細胞外ドメインの架橋によって調製され得る。利用されるドメインは、α成分およびβ成分の細胞外ドメイン全体からなり得るか、またはこれらは、ｓＲα：β１複合体においてそのリガンドおよび他の成分と複合体を形成する能力を維持する、それらの変異体またはフラグメントからなり得る。例えば、以下の実施例４に記載されるように、ＩＬ−６アンタゴニストは、その３つのフィブロネクチン様ドメインを欠失するｇｐ１３０を使用して調製される。
【００４９】
本発明の１つの実施態様において、細胞外ドメインは、ロイシンジッパーを使用して操作される。ヒト転写因子ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓのロイシンジッパードメインは、１：１の化学量論で安定なヘテロ二量体を形成することが示されている［ＢｕｓｃｈおよびＳａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：３６−４０（１９９０）；Ｇｅｎｔｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１６９５−１６９９（１９８９）］。ｊｕｎ−ｊｕｎホモ二量体もまた形成することが示されているが、これらは、ｊｕｎ−ｆｏｓヘテロ二量体より安定性が約１０００分の１未満である。ｆｏｓ−ｆｏｓホモ二量体は、検出されなかった。
【００５０】
ｃ−ｊｕｎまたはｃ−ｆｏｓのいずれかのロイシンジッパードメインは、キメラ遺伝子を遺伝的に操作することによって、上記のレセプター成分の可溶性ドメインまたは細胞外ドメインのＣ末端にインフレームで融合される。これらの融合は直接的であり得るか、またはこれらの融合は、可撓性リンカードメイン（例えば、ヒトＩｇＧのヒンジ領域）、または種々の長さおよび組み合わせで、低分子アミノ酸（例えば、グリシン、セリン、スレオニンまたはアラニン）からなるポリペプチドリンカーを使用し得る。さらに、キメラタンパク質は、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（Ｈｉｓ６）［配列番号１］によってタグ化されて、金属キレートクロマトグラフィーにより迅速な精製を可能にし得るか、そして／または抗体が利用可能なエピトープによってタグ化されて、ウェスタンブロット、免疫沈降、またはバイオアッセイにおける活性の欠損／ブロッキングでの検出を可能にし得る。
【００５１】
別の実施態様において、以下の実施例３に記載されるように、ｓＲα：β１ヘテロ二量体は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ−ドメインを使用することを除き、類似の方法を使用して調製される［Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ ６７：３５−４４（１９９１）］。後者とは反対に、ヘテロ二量体の形成は、Ｆｃ−ドメインを保持するキメラ分子がジスルフィド結合されたホモ二量体として発現されるので、生化学的に活性化されるはずである。従って、ホモ二量体は、鎖間ジスルフィドの破壊に有利であるが、鎖内ジスルフィドに影響を及ぼさない条件下で還元され得る。次いで、異なる細胞外部分を有するモノマーは、等モル量で混合され、そして酸化されてホモ二量体およびヘテロ二量体の混合物を形成する。この混合物の成分は、クロマトグラフィー技術によって分離される。あるいは、この型のヘテロ二量体の形成を、レセプター成分の可溶性部分または細胞外部分（これに、ｈＩｇＧのＦｃ−ドメインが続き、これに上記のｃ−ｊｕｎロイシンジッパーまたはｃ−ｆｏｓロイシンジッパーのいずれかが続く）からなる分子を遺伝的に操作および発現することによって偏向し得る［Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）］。これらのロイシンジッパーは、ヘテロ二量体を主に形成するので、これらは、所望の場合、ヘテロ二量体の形成を駆動するために使用され得る。ロイシンジッパーを使用する記載されたキメラタンパク質について、これらはまた、金属キレートまたはエピトープでタグ化され得る。このタグ化ドメインは、金属キレートクロマトグラフィーによって迅速な精製のために使用され得るか、そして／または抗体によってウェスタンブロット、免疫沈降、またはバイオアッセイにおける活性の減損／ブロッキングでの検出を可能にするために使用され得る。
【００５２】
さらなる実施態様において、ヘテロ二量体は、二量体の形成を駆動するドメイン由来の他の免疫グロブリンを使用して調製され得る。このようなドメインとしては、例えば、ＩｇＧの重鎖（Ｃγ１およびＣγ４）、ならびにヒト免疫グロブリンのカッパ（κ）軽鎖およびラムダ（λ）軽鎖の定常領域が挙げられる。Ｃγの軽鎖とのヘテロ二量体化は、ＣγのＣＨ１ドメインと軽鎖（ＣＬ）の定常領域との間で生じ、そして単一のジスルフィド架橋を介して２つのドメインの共有結合によって安定化される。従って、実施例４に記載されるように、構築物は、これらの免疫グロブリンドメインを使用して調製される。あるいは、免疫グロブリンドメインは、二量体化を駆動するＴ細胞レセプター成分から誘導され得るドメインを含む。本発明の別の実施態様において、ｓＲα：β１ヘテロ二量体は、可撓性リンカーループを利用してキメラ分子として発現することによって調製され得る。このキメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、それが、可撓性ループによって共に直列（「ヘッド−ヘッド」）に融合された２つの可溶性ドメインまたは細胞外ドメインを発現するように設計される。このループは、全体的に人工的（例えば、一定間隔でセリンまたはスレオニンによって干渉されるポリグリシン反復）であり得るか、天然に存在するタンパク質（例えば、ｈＩｇＧのヒンジ領域）から「拝借」され得る。分子は、融合される可溶性ドメインまたは細胞外ドメインの順序が、スイッチされる（例えば、ｓＩＬ６Ｒα／ループ／ｓｇｐ１３０またはｓｇｐ１３０／ループ／ｓＩＬ−６Ｒα）か、そして／またはループの長さおよび組成が変更されるように操作され、所望の特徴を有する分子の選択を可能にする。
【００５３】
あるいは、本発明に従って作製されたヘテロ二量体は、適切なα成分およびβ成分で同時トランスフェクトされた細胞株から精製され得る。ヘテロ二量体は、当業者に利用可能な方法を使用してホモ二量体から分離され得る。例えば、限定量のヘテロ二量体は、調製用の非変性ポリアクリルアミドゲルからの受動的溶出によって回収され得る。あるいは、ヘテロ二量体は、高圧カチオン交換クロマトグラフィーを使用して精製され得る。優れた精製は、Ｍｏｎｏ Ｓカチオン交換カラムを使用して得られている。
【００５４】
遊離ＣＮＴＦまたはＩＬ−６を結合することによってアンタゴニストとして作用するｓＲα：β１ヘテロ二量体に加えて、本発明はまた、新規な特性を有するＩＬ−６の操作された変異バージョンの使用を企図し、この新規な特性は、ＩＬ−６のバージョンを、ＩＬ−６Ｒαおよび１個のｇｐ１３０分子に結合させることを可能にするが、第２のｇｐ１３０に係合して、β成分ホモ二量体化を完了することができない。そのため、任意のＩＬ−６応答性細胞に対する有効なＩＬ−６アンタゴニストとして作用する。ＩＬ−６およびＣＮＴＦレセプター複合体の構造についての本発明者らのモデルは、これらのサイトカインがα、β１およびβ２レセプター成分を結合するための異なる部位を有することを示す［ＳｔａｈｌおよびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃｅｌｌ ７４：５８７−５９０（１９９３）］。これらの部位の各々を含む重要なアミノ酸残基の変異は、所望のアンタゴニスト特性を有する新規な分子を生じる。β１部位の除去は、αレセプター成分になお結合し得るが、β１成分には結合せず、これによって、ナノモル濃度の親和性を有するアンタゴニストを含む分子を与える。ＩＬ−６（ＩＬ−６β２−）のβ２部位を含む重要なアミノ酸残基の変異は、ＩＬ−６Ｒαおよび第１のｇｐ１３０単量体に結合するが、第２のｇｐ１３０に係合せず、従って、機能的に不活性であり得る分子を与える。同様に、ＣＮＴＦ β２部位の変異は、ＣＮＴＦＲαおよびｇｐ１３０を結合するが、ＬＩＦＲβを係合せず、これによって非機能的β１中間体を形成することによりＣＮＴＦ作用と拮抗する（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）分子（ＣＮＴＦβ２−）を与える。ＣＮＴＦが高親和性を有するβ１中間体を形成する、上記の結合結果に基づくと、ＣＮＴＦβ２−およびＩＬ−６β２−はともに、１０ｐＭの範囲の親和性を有するアンタゴニストを構成する。
【００５５】
種々の手段を用いて、所望の特性を有するＩＬ−６またはＣＮＴＦの変異を作製および同定する。ＩＬ−６またはＣＮＴＦをコードするＤＮＡの標準的方法によるランダム変異誘発を用い、次いで、産物の収集物を分析して、以下に概説されるように所望の新規な特性を有する変異したサイトカインを同定し得る。遺伝子操作による変異誘発を、組換えタンパク質の機能的ドメインの構造的組織化を評価するために、広範に用いてきた。いくつかの異なるアプローチは、欠失または置換の変異誘発を行うことに関して文献に記載された。最も成功したものは、アラニンスキャニング変異誘発［ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５］およびホモログスキャニング変異誘発［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１３３０−１３３６］であるようである
このような方法を用いたＩＬ−６またはＣＮＴＦ核酸配列の標的化された変異誘発を使用して、ＣＮＴＦβ２−、またはＩＬ−６β２−候補物を生成し得る。標的化された変異誘発に適切な領域の選択は、系統的に行われるか、または各因子に対するモノクローナル抗体のパネルを用いて、αレセプター成分単独に対するサイトカインの結合または上記のαβ１ヘテロ二量体可溶性レセプターに対するサイトカインの結合後に露出され得るサイトカインの領域をマッピングすることにより研究から決定され得る。同様に、サイトカイン単独でのもしくは上記のαレセプター成分もしくはαβ１ヘテロ二量体可溶性レセプターに結合した複合体における化学的修飾または限定されたタンパク質分解、次いで、保護領域もしくは露出領域の分析は、潜在的なβ２結合部位を明らかにし得る。
【００５６】
所望の特性を有するＣＮＴＦまたはＩＬ−６α変異体を同定するためのアッセイは、適切に応答性の細胞株に対するＩＬ−６またはＣＮＴＦの作用を高親和性でブロックする能力を包含する［Ｄａｖｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７３６−１７３９（１９９３）；Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１１３４９−１１３５３（１９９１）］。このようなアッセイとしては、ＣＮＴＦもしくはＩＬ−６によって駆動される細胞の増殖、生存性、またはＤＮＡ合成、あるいは因子の結合がＣＡＴまたはβ−ガラクトシダーゼのようなレポーターの生成を誘導する細胞株の構築が挙げられる［Ｓａｖｉｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：４０６７−４０７４（１９９３）］。
【００５７】
あるいは、種々の変異体の特性は、レセプターベースのアッセイを用いて評価され得る。１つのこのようなアッセイは、エピロープタグ化［Ｄａｖｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：５９−６３（１９９１）］ｓＲα：β１試薬を用いて上記のｓＲα：β１レセプターヘテロ二量体を結合する能力について変異体をスクリーニングすることからなる。さらに、エピトープタグ化可溶性β２試薬がβ１ヘテロ二量体の存在下でサイトカインに結合するか否かを評価することによってβ２部位の存在または非存在についてプローブし得る。例えば、ＣＮＴＦのみが、ＣＮＴＦＲαおよびｇｐ１３０両方の存在化でＬＩＦＲβ（β２成分）に結合する［Ｄａｖｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８０５−１８０８（１９９３）；Ｓｔａｈｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：７６２８−７６３１（１９９３）］。従って、可溶性ＬＩＦＲβ試薬は、可溶性ｓＲα：β１二量体ｓＣＮＴＦＲα：β１の存在下でＣＮＴＦに結合するのみである。ＩＬ−６については、ｓＲα：β１試薬がＩＬ−６Ｒα：β１であり、そしてβ２部位についてのプローブは、エピトープタグ化されたｓｇｐ１３０である。従ってＣＮＴＦのβ２−変異体は、ｓＲα：β１試薬を結合するものとして同定され、このことにより、サイトカインのαおよびβ１部位がインタクトであったが、β２試薬を結合しなかったことを示す。
【００５８】
さらに、本発明は、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２およびＴｙｋ２または任意の他のシグナル伝達成分（例えば、ＣＬＩＰ）からなる群より選択されるβ−レセプター成分またはシグナル伝達成分のリン酸化を測定することによって潜在的なβ２−変異体の活性を検出または測定する方法を提供する。これは、サイトカインのＣＮＴＦファミリーのメンバーに応答してリン酸化されることが決定される。
【００５９】
本明細書中に記載されるシグナル伝達成分を発現する細胞は、天然にそのようなことを行うか、またはそのようなことを行うために遺伝子操作されたかのいずれかであり得る。例えば、Ｖｅｌａｚｑｕｅｚら、Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．７０：３１３−３２２（１９９２）に記載されるように得られるＪａｋ１およびＴｙｋ２コード核酸配列は、当該分野で知られた任意の公知の方法を用いて、形質導入、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションによって、トランスジェニック動物などを通じて細胞に導入され得る。
【００６０】
本発明によれば、細胞を潜在的なアンタゴニストに曝露し、そしてβ成分またはシグナル伝達成分のいずれかのチロシンリン酸化が、潜在的なアンタゴニストの非存在下での同じ成分のチロシンリン酸化と比較される。本発明の別の実施態様において、上記の細胞と、潜在的なアンタゴニストを接触させることから得られたチロシンリン酸化は、親ＣＮＴＦファミリーメンバーに曝された同じ細胞のチロシンリン酸化と比較される。このようなアッセイにおいて、細胞は、細胞外レセプター（α成分）を発現しなければならないか、またはこの細胞は、可溶性レセプター成分の存在下で試験薬剤に曝され得るかのいずれかである。従って、例えば、ＣＮＴＦのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するために設計されたアッセイ系において、この細胞は、α成分ＣＮＴＦＲα、β成分ｇｐ１３０およびＬＴＦＲβならびにシグナル伝達成分（例えば、Ｊａｋ１）を発現し得る。細胞は、試験薬剤に曝され、そしてβ成分またはシグナル伝達成分のいずれかのチロシンリン酸化は、ＣＮＴＦの存在下で生じたリン酸化パターンと比較される。あるいは、試験薬剤への曝露から生じるチロシンリン酸化は、試験薬剤の非存在下で生じるリン酸化と比較される。あるいは、例えば、ＩＬ−６についてのアッセイ系は、β成分ｇｐ１３０およびシグナル伝達タンパク質（例えば、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２またはＴｙｋ２）を発現する細胞を、可溶性ＩＬ−６レセプターとともに試験薬剤に曝す工程を包含し得る。
【００６１】
本発明の別の実施態様において、上記のアプローチを用いて、リガンド結合、レセプター複合体形成、および引き続くシグナル伝達のプロセスにおける種々の工程において作用する低分子アンタゴニストをスクリーニングする方法を開発する。リガンド−レセプター相互作用を潜在的に妨げる分子は、可溶性レセプターと上記のリガンドとの間の複合体形成の干渉を評価することによりスクリーニングされる。あるいは、ＩＬ−６またはＣＮＴＦがレポーター遺伝子の応答を誘導する細胞ベースのアッセイは、低分子または天然産物のライブラリーに対してスクリーニングされて、潜在的なアンタゴニストを同定する。アンタゴニスト活性を示すこれらの分子は、他の因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはレセプターチロシンキナーゼを活性化するニューロトロフィン３のような因子）に応答する細胞ベースのアッセイに対して再スクリーニングされて、ＣＮＴＦ／ＩＬ−６／ＯＳＭ／ＬＩＦファミリーの因子に対するそれらの特異性を評価する。このような細胞ベースのスクリーニングを用いて、シグナル伝達プロセスにおける多くの標的のいずれかを阻害するアンタゴニストを同定する。
【００６２】
１つのこのようなアッセイ系において、アンタゴニストに対して特異的な標的は、Ｊａｋ／Ｔｙｋファミリーのキナーゼ［Ｆｉｒｍｂａｃｈ−Ｋｒａｆｔ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５：１３２９−１３３６（１９９０）；Ｗｉｌｋｓら、Ｍｏｌ．ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２０５７−２０６５（１９９１）］と、レセプターβサブユニットとの相互作用である。上記のように、ＬＩＦＲβおよびｇｐ１３０は、細胞質タンパク質チロシンキナーゼのＪａｋ／Ｔｙｋファミリーのメンバー（これは、リガンド誘導性β成分二量体化に応答して活性化される）と予め会合する（Ｓｔａｈｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：９２−９５（１９９３））。従って、細胞の細胞質に進入し得、そしてβ成分とＪａｋ／Ｔｙｋキナーゼとの間の相互作用を破壊し得る低分子は、潜在的に、全ての引き続く細胞内シグナル伝達をブロックし得る。このような活性は、低分子が、精製β成分とＪａｋ／Ｔｙｋキナーゼの関連する結合ドメインの間の相互作用をブロックする能力を評価したインビトロスキームでスクリーニングされ得る。あるいは、当業者は、ツーハイブリッド相互作用システムを用いてＪａｋ／Ｔｙｋキナーゼに結合するβ成分の酵母ベースのアッセイを阻害し得る分子について容易にスクリーニングし得る［Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：９５７８−９５８２（１９９１）］。このような系において、２つのタンパク質（β成分およびＪａｋ／Ｔｙｋキナーゼまたはこの例におけるその関連するドメイン）の間の相互作用は、便利なマーカー（例えば、β−ガラクトシダーゼ）の生成を誘導する。低分子の収集物を、２つのコントロールタンパク質間の相互作用を阻害することなく、所望の相互作用を破壊する能力について試験する。このスクリーニングの利点は、β成分とＪａｋ／Ｔｙｋキナーゼとの間の相互作用を阻害する前に、試験化合物が細胞に進入するという要件である。
【００６３】
本明細書中に記載のＣＮＴＦファミリーのアンタゴニストは、サイトカインであるＣＮＴＦおよびＩＬ−６に結合するか、またはこれと競合するかのいずれかである。従って、これらのサイトカインは、ＣＮＴＦまたはＩＬ−６により媒介される疾患または障害を処置するために有用である。例えば、ＩＬ−６アンタゴニストの治療的用途としては以下が挙げられる：
１）骨粗鬆症（閉経後の女性においてまたは卵巣摘出によりエストロゲンレベルが低下することにより悪化し得る）において、ＩＬ−６は、骨の吸収を導く破骨細胞生成（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）の重要なメディエーターであるようである［Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：６２６−６２７（１９９３）；Ｊｉｌｋａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：８８−９１（１９９２）］。重要なことには、ＩＬ−６は、エストロゲン枯渇状態において主要な役割を果たすにすぎないようであり、そして明らかに正常骨の維持に最小限に関与する。このことと一致して、ＩＬ−６に対する機能ブロック（ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）抗体は、破骨細胞の数を減少させ得るという実験的証拠を示す［Ｊｉｌｋａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：８８−９１（１９９２）］。エストロゲン置換治療もまた使用される一方で、子宮内膜癌および乳癌の危険性が増加することを含み得る副作用が存在するようである。従って、本明細書中に記載されるＩＬ−６アンタゴニストは、正常レベルまで破骨細胞生成を低減させるためにより特異的である
２）ＩＬ−６は、オートクラインまたはパラクリン様式のいずれかで作用して腫瘍形成を促進するすることにより、複数の骨髄腫に直接関与するようである［ｖａｎ Ｏｅｒｓら、Ａｎｎ Ｈｅｍａｔｏｌ．６６：２１９−２２３（１９９３）］。さらに、上昇したＩＬ−６レベルは、所望でない二次的作用（例えば、骨吸収、高カルシウム血症、および悪液質）を生じ；限られた研究では、ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒａに対する機能ブロック抗体は、いくらかの効力を有する［Ｋｌｅｉｎら、Ｂｌｏｏｄ ７８：１１９８〜１２０４（１９９１）；Ｓｕｚｕｋｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１９８９−１９９３（１９９２）］。従って、本明細書中で記載されるＩＬ−６アンタゴニストは、二次的作用および腫瘍増殖の阻害の両方に有益である
３）ＩＬ−６は、おそらく、脂肪組織におけるリポタンパク質リパーゼ活性を低減する［Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：４１１３〜４１１６（１９９２）］ことによりＡＩＤＳおよび癌に関連する悪液質を導く腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のメディエーターであり得る［Ｓｔｒａｓｓｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１６８１−１６８４（１９９２）］。従って、本明細書中に記載されるアンタゴニストは、このような患者において悪液質を緩和または軽減する際に有用である。
【００６４】
これらのまたは他のＣＮＴＦファミリーに関連する疾患または障害を処置するために有用な効果的用量は、当業者に公知の方法を用いて決定され得る［例えば、Ｆｉｎｇｌら、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ編、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１〜４６頁（１９７５）］。本発明に従う使用のための薬学的組成物は、インビボで投与する前に、薬理学的に受容可能な液体、固体、または半固体のキャリア中に、キャリアもしくは標的化分子（例えば、抗体、ホルモン、増殖因子など）に結合された、ならびに／またはリポソーム、マイクロカプセル、および徐放性調製物（アンタゴニスト発現細胞を含む）に組み込まれた上記のアンタゴニストを含む。例えば、この薬学的組成物は、水溶液中（例えば、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液またはデキストロース溶液）中に１つ以上のアンタゴニストを含み得る。あるいは、この活性薬剤は、固体（例えば、ろう）または半固体（例えば、ゼラチン様）処方物中に含まれ得、これらの処方物は、このような処置が必要な患者に移植され得る。投与経路は、当該分野で公知の任意の投与様式（静脈内、鞘内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌｌｙ）、皮下（関連する組織への注射によって）、動脈内、鼻腔内、経口、または移植デバイスを介してが挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。
【００６５】
投与は、身体全体にかまたは局所領域において、本発明の活性薬剤の分布を生じ得る。例えば、神経系の遠位領域を含むいくつかの条件において、薬剤の静脈内投与または鞘内投与が、所望され得る。いくつかの状況において、活性薬剤を含む移植片が、病変領域中にかまたはその近辺に配置され得る。適切な移植片には、ゲル泡状物（ｇｅｌｆｏａｍ）、ろう、または微粒子ベースの移植片が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６６】
（実施例）
（実施例１：ＣＮＴＦは、ＧＰ１３０に対する結合について、ＩＬ−６と競合する）
（材料および方法）
（材料）ＩＬ−６に応答するＰＣ１２細胞のクローン（ＰＣ１２Ｄ）を、ＤＮＡＸから得た。ラットＣＮＴＦを、記載される通りに調製した（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５７：１００３〜１００１２（１９９１））。ＩＬ−６およびｓＩＬ−６Ｒαを、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。抗血清を、ｇｐ１３０のＣ末端に近い領域に由来するペプチド（配列：ＣＧＴＥＧＱＶＥＲＦＥＴＶＧＭＥ）（配列番号２）に対して、記載される方法（Ｓｔａｈｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：７６２８〜７６３１（１９９３））によってウサギにおいて惹起した。抗ホスホチロシンモノクローナル４Ｇ１０を、ＵＢＩから購入し、そしてＥＣＬについての試薬を、Ａｍｅｒｓｈａｍから購入した。
【００６７】
（シグナル伝達アッセイ）ＰＣ１２Ｄのプレート（１０ｃｍ）を、無血清培地（ＲＰＭＩ１６４０＋グルタミン）中で１時間飢餓させ、次いで、示された濃度で添加されたラットＣＮＴＦの存在または非存在下で、ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍＬ）＋ｓＩＬ−６Ｒ（１ｍｇ／ｍＬ）と、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、サンプルを、抗ｇｐ１３０免疫沈降に供し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥし、そして記載されるように抗ホスホチロシンイムノブロッティングした（Ｓｔａｈｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：７６２８〜７６３１（１９９３））。
【００６８】
（結果）
ＣＮＴＦがＩＬ−６応答をブロックする能力を、ＩＬ−６Ｒα、ｇｐ１３０、およびＣＮＴＦＲαを発現するがＬＩＦＲβを発現しないＰＣ１２細胞株（ＰＣ１２Ｄと呼ばれる）を使用して測定した。推定されるように、これらの細胞は、ＩＬ−６に応答するが、ＣＮＴＦに応答しない（図２）。なぜなら、ＬＩＦＲβは、ＣＮＴＦシグナル伝達のために必要とされる成分であるからである（Ｄａｖｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：５９〜６３（１９９３））。他の細胞株での結果（Ｉｐら、Ｃｅｌｌ ６９：１１２１〜１１３２（１９９２））に従って、ＰＣ１２Ｄ細胞は、２ｎＭ ＩＬ−６に応答して、ｇｐ１３０（ならびにＣＬＩＰと呼ばれる種々の他のタンパク質）のチロシンリン酸化を生じる（図２）。組換え可溶性ＩＬ−６Ｒα（ｓＩＬ−６α）の添加は、他のいくつかの系で報告されているように、ｇｐ１３０チロシンリン酸化のレベルを増強させる（Ｔａｇａら、Ｃｅｌｌ ５８：５７３〜５８１（１９８９））。しかし、ＩＬ−６との２ｎＭ ＣＮＴＦの同時添加は、ｇｐ１３０のチロシンリン酸化を激しく減少させる。わずかなｇｐ１３０リン酸化応答は、ＣＮＴＦ、ＩＬ−６、およびｓＩＬ−６Ｒαの存在下で残存するが、ＣＮＴＦ濃度が８ｎＭへと四倍に増加する場合にこれは消去される。したがって、ＣＮＴＦＲαを含むがＬＩＦＲβを含まないＩＬ−６応答性細胞において、ＣＮＴＦは、ＩＬ−６作用のかなり強力なアンタゴニストである。
【００６９】
（実施例２．ＣＮＴＦＲα：βへのＣＮＴＦの結合）
（材料および方法）
（ＣＮＴＦ結合のスキャッチャード分析）¹²⁵Ｉ−ＣＮＴＦを記載される通りに調製し、そして精製した（Ｓｔａｈｌら、ＪＢＣ ２６８：７６２８〜７６３１（１９９３））。飽和結合研究を、２０ｐＭ〜１０ｎＭの範囲の¹²⁵Ｉ−ＣＮＴＦの濃度を使用して、ＰＣ１２細胞で行った。結合を単層の細胞上で直接的に行った。培地をウェルから取り除き、そして細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）、０．１ｍＭバシトラシン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍｇ／ｍｌロイペプチン、および１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡからなるアッセイ緩衝液で１回洗浄した。細胞を¹²⁵Ｉ−ＣＮＴＦ中で、室温で２時間インキュベートし、続いてアッセイ緩衝液で２回素早く洗浄した。細胞を１％ ＳＤＳを含むＰＢＳで溶解し、そしてＰａｃｋａｒｄ Ｇａｍｍａ Ｃｏｕｎｔｅｒで９０〜９５％の効率で計数した。非特異的結合を、１００倍過剰の未標識ＣＮＴＦの存在によって規定した。特異的な結合は、７０％〜９５％の範囲であった。
【００７０】
（結果）
ＣＮＴＦＲα：β１へのＣＮＴＦの結合についての平衡定数を、ＰＣ１２Ｄ細胞に対する、ヨード化したＣＮＴＦ結合のスキャッチャード分析から見積もった（図３）。このデータは、９ｐＭおよび３．４ｎＭの解離定数を有する２部位フィット（２ ｓｉｔｅ ｆｉｔ）と一致した。低親和性部位は、ＣＮＴＦＲαとのＣＮＴＦの相互作用に対応し、これは、およそ３ｎＭのＫｄを有する（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９０００〜１９００３（１９９３））。本発明者らは、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦＲα、およびｇｐ１３０を含む中間体として高親和性複合体を解釈する。Ｅｗｉｎｇ肉腫細胞株（ＥＷ−１）は、ＣＮＴＦＲα、ｇｐ１３０、およびＬＩＦＲβを含み、従って、ＣＮＴＦに応答して頑強なチロシンリン酸化を与え、１ｎＭおよび１０の解離定数を有する非常に類似の２部位フィットを示す。従って、ＣＮＴＦは、ＣＮＴＦＲαおよびｇｐ１３０のみを含む複合体に同程度の高親和性で結合することが明らかである。これは、ＬＩＦＲβをさらに含む複合体に結合するので、従って本明細書中に記載されるｓＲα：βアンタゴニストを作製する実現性を実証する。
【００７１】
（実施例３．サイトカインリガンドトラップを生成するための方法）
（ウイルスストックの生成）
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａから得られるＳＦ２１昆虫細胞を、Ｇｉｂｃｏ ＳＦ９００ＩＩ培地中で、１×１０⁶細胞／ｍＬの密度まで２７℃で増殖させた。ＧＰ１３０−Ｆｃ−Ｈｉｓ₆（図４）またはＩＬ６Ｒａ−Ｆｃ（図５）のいずれかについての個々のウイルスストックを、低い多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ）０．０１〜０．１ＰＦＵ／細胞でバイオリアクターに添加し、感染を開始した。この感染プロセスを、５〜７日間続けさせ、実質的な細胞溶解を損なうことなく最大のウイルス複製を可能にした。この細胞懸濁液を無菌的に滅菌遠心ビンにアリコートし、そして細胞を遠心分離により取り除いた。細胞を含まない上清を、無菌ビンに収集し、そしてさらなる使用まで４℃で貯蔵した。
【００７２】
ウイルス力価を、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ、ＭｉｌｌｅｒおよびＬｕｃｋｏｗにより記載されるようにプラークアッセイにより決定した。この方法を、２×１０⁶細胞で播種される、６０ｍｍ組織培養ディッシュ中で行う。ストックの連続希釈を、付着した細胞に加え、そしてこの混合物を、ウイルスが個々の細胞に吸着されることを可能にするように揺り動かしながらインキュベートした。アガーの重層を加え、そしてプレートを、２７℃で５〜７日間インキュベートする。ニュートラルレッドでの生存細胞の染色は、環状プラークの結果を示し、これは、ウイルス力価を与えるために計数された。
【００７３】
（タンパク質産生のための細胞の同時感染）
未感染ＳＦ２１細胞を、４０ＬのＳＦ９００ ＩＩ培地を含む６０ＬのＡＢＥＣバイオリアクター中で増殖させた。温度を、２７℃に制御し、そして溶存酸素レベルを、注入口での気体の流動における酸素の流速を制御することによって５０％の飽和度に維持した。２×１０⁶細胞／ｍＬの密度に達した場合に、これらの細胞を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｒｏｓｔａｋ ０．６５ミクロン膜を備える接線方向フロー濾過デバイスを備えた低剪断流動滅菌可能ポンプを使用して、２０Ｌの用量まで、バイオリアクター内で濃縮した。濃縮した新鮮な無菌増殖培地を、このバイオリアクターにゆっくりと添加し、一方、濾過システムは、ダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって使用済み増殖培地を取り除き続ける。２容量の交換（４０Ｌ）が行われた後に、さらなる２０Ｌの新鮮培地を、このバイオリアクターに加えて、４０Ｌの本来の容量にこれらの細胞を再懸濁させた。この細胞密度を、血球計を使用して生存細胞を計数することによってもう一度決定した。
【００７４】
各々のウイルスストックの必要とされる量を、細胞密度、ウイルス力価および感染の所望される多重度（ＭＯＩ）に基づいて算定した。５：１、５：２、１０：２、および１０：４のウイルスストック比（ＩＬ６Ｒα−Ｆｃ対ＧＰ１３０−Ｆｃ−Ｈｉｓ₆）は、全てが、有意な量のヘテロ二量体の産生を生じた。理想的なウイルスストック比は、各々の２つのホモ二量体からのヘテロ二量体の精製の容易さに非常に依存する。ＩＬ６Ｒα−Ｆｃホモ二量体は、固定化金属親和性クロマトグラフィーによって、下流を除去することが比較的に容易である。ウイルス感染比は、下流をクリアすることがより困難であるＧＰ１３０−Ｆｃ−Ｈｉｓ₆ホモ二量体の形成を最小化するように選択されている。感染のために選択されたＧＰ１３０−Ｆｃ−Ｈｉｓ₆ウイルスストックの相対量は、得られたホモ二量体をクリアするための精製方法が改善されたような、連続的なバッチで増大した。
【００７５】
ウイルスストックを、単一の容器中にて無菌的に混合し、次いで、バイオリアクターに移した。これは、ＳＦ２１細胞の同調化した感染を生じる。この感染を３〜４日間、進行させて、ヘテロ二量体タンパク質の最大の産生に十分な時間を可能にする。
【００７６】
（回収およびプロテインＡクロマトグラフィー精製）
バイオリアクタープロセスの感染期の終わりに、これらの細胞を、１０ｆｔ²Ｍｉｌｉｐｏｒｅ Ｐｒｏｓｔａｋフィルター（０．６５ミクロン）孔サイズを使用して、バイオリアクター中で濃縮した。このフィルターを通過する、細胞を含まない透過物を、清潔なプロセス容器中に収集した。濾過操作の終わりに、タンパク質産物を含む透過流動物のｐＨを、１０Ｎ ＮａＯＨで８．０に調製した。得られた沈澱を、０．８ミクロンデプスフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ）、続いて０．２ミクロンフィルターに抽出物を強制的に通すことによって除去した。十分な０．５Ｍ ＥＤＴＡストックを、５ｍＭの最終濃度を与えるように添加した。濾過したタンパク質溶液を、１００〜２００ｍＬのＰｈａｒｍａｃｉａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを備える１０ｃｍの直径のカラム（ＰＢＳで平衡化した）上に充填した。プロテインＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）は、３つの組換えタンパク質産物の各々のＦｃ−Ｆｃドメインに対して非常に高親和性を有する。このことは、細胞を含まない抽出物中の他のタンパク質がこのカラムを通じて流れる間にこれらの組換えタンパク質産物が結合することを可能にする。充填後に、このカラムを、さらなる３５０ｍＭ ＮａＣｌを含むＰＢＳでベースラインまで洗浄した。ＩｇＧ−Ｆｃタグ化タンパク質を、０．５Ｍ酢酸を用いてか、または０．１Ｍクエン酸および０．２Ｍリン酸二ナトリウム緩衝液の減少ｐＨ勾配を用いてかのいずれかで、低いｐＨで、溶出させた。Ｔｒｉｓ塩基またはリン酸二ナトリウムを、この溶出させたタンパク質に添加し、低ｐＨ条件への長期の曝露を回避した。
【００７７】
プールされたタンパク質を、ＰＢＳまたはＨＥＰＥＳ緩衝液中にダイアフィルトレーションし、そして１ｍＭヨードアセトアミドで誘導体化して、各Ｆｃドメインのヒンジ領域付近の遊離システイン上に露出したスルフヒドリル基を保護した。これは、タンパク質のジスルフィド媒介性凝集を防止する。名目上３０キロダルトンのカットオフを有する６ｆｔ²Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｓｐｉｒａｌ ｗｏｕｎｄ限外濾過膜を使用して、緩衝液の交換を行った。総タンパク質を、ダイアフィルトレーション緩衝液をブランクとして使用して、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって決定した。ヘテロ二量体タンパク質および２つのホモ二量体タンパク質の相対量を、６％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｓｉｎｅゲル（Ｎｏｖｅｘ）を使用して、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル電気泳動によって決定した。次いで、ゲルをクマシー染色し、脱染色溶液に一晩移した。Ｓｈｉｍａｄｚｕ走査デンシトメーターを使用して、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上の個々のタンパク質バンドの相対強度を決定した。ピーク領域比を使用して、カラムプール画分中でのヘテロ二量体およびホモ二量体の各々の画分を計算する。
【００７８】
（固定化した金属親和性クロマトフラフィー精製）
ＧＰ１３０−Ｆｃ−Ｈｉｓ₆融合タンパク質のＣ末端上の６つのヒスチジン残基は、２つのホモ二量体からのヘテロ二量体ＩＬ６アンタゴニストの分離の優れた分子の取扱いを提供する。ＧＰ１３０−Ｆｃ−Ｈｉｓ₆部分の各々のＣ末端ヒスチジン上のイミダゾール基は、いくつかの２価の金属（銅、ニッケル、亜鉛、コバルト、鉄およびカルシウムを含む）との強力な結合定数を有する。ＩＬ６Ｒα−Ｆｃホモ二量体は、Ｃ末端ヒスチジン残基を有さないので、これは、明らかに最も低親和性を有する。ＩＬ６Ｒα−Ｆｃ−ＧＰ１３０−Ｆｃ−Ｈｉｓ₆ヘテロ二量体は、一本鎖セットの６つのヒスチジンを有し、このことは、これが金属に対してより大きな親和性を有することを生じ、一方、Ｇｐ−１３０−Ｆｃ−Ｈｉｓ₆ホモ二量体が、２つのセットの６つのヒスチジンを有し、各々が、これが金属親和性カラムに対する３つのＩｇＧタグ化タンパク質の最高の親和性を生じる。従って、溶出緩衝液において漸増量のイミダゾールでの、３つのタンパク質の選択的溶出は、以下の順番でこれらのタンパク質を溶出させる。
１．ＩＬ６Ｒα−Ｆｃホモ二量体
２．ＩＬ６Ｒα−Ｆｃ−ＧＰ１３０−Ｆｃ−Ｈｉｓヘテロ二量体
３．ＧＰ１３０−Ｆｃ−Ｈｉｓホモ二量体
１００ｍＬのＰｈａｒｍａｃｉａ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを含む直径２６ｍｍのカラムを、カラムの溶出液中に顕著な緑色が観察されるまで、硫酸ニッケル溶液で飽和した。次いで、このカラムを数カラム容量の脱イオン水で洗浄し、次いで、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０で平衡化する。固定されたニッケルへのイミダゾールの結合は、緑色から青色への変化を生じる。イミダゾールを、４０ｍＭの最終濃度までタンパク質充填物に添加した。タンパク質充填物へのイミダゾールの添加は、ＩＬ６Ｒα−Ｆｃホモ二量体の結合を減少させ、残りの２種に対する利用可能な表面領域を増加させる。充填後、このカラムを、安定なベースラインが回復されるまで、数カラム容量の５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、８０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０で洗浄した。ヘテロ二量体が、選択的に、数カラム容量にわたる５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０とともに溶出された。上記の節に記載されるように、タンパク質画分をプールし、そしてＰＢＳにダイアフィルトレーションした。
【００７９】
（実施例４．リガンドトラップを構築する代替方法）
上記のように、ＣＮＦによるレセプター活性化、ならびにＩＬ−６およびＩＬ−１１による類似するレセプター活性化は、指示された配列の結合事象に続く（図６）。サイトカインは、初めに、その同族のＲαに低い親和性で結合する（Ｋｄ＝３〜１０ｎＭ）；これは必要な工程である−同族のＲαを発現しない細胞は同族のサイトカインに応答しない。サイトカイン・Ｒα複合体は、第１のシグナル伝達成分（ｇｐ１３０）に関連し、高い親和性複合体を形成する（ＣＮＴＦ・ＣＮＴＦＥＲα・ｇｐ１３０複合体については、１０ｐＭのオーダーのＫｄ）。この複合体は、それがシグナル伝達を引き起こすシグナル伝達成分の二量体化である場合に、シグナルを伝達しない（ＳｔａｈｌおよびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２５：１４５４〜１４６６（１９９４）；Ｓｔａｈｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１３４９〜１３５３（１９９５）；Ｄａｖｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８０５〜１８０８（１９９３）；Ｓｔａｈｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：９２〜９５（１９９４）；Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８０８〜１８１０（１９９３）。少なくとも、ＩＬ−６の場合には、サイトカイン・Ｒα・シグナルトランデューサーヘテロ三量体の複合体は、続いて、別の同様の複合体と会合し、六量体の複合体を形成する（図６）（Ｗａｒｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２３２８６〜２３２８９（１９９４））。生じたシグナルトランデューサーの二量体化（ＩＬ−６（Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：１８０８〜１８０１０（１９９３））およびＩＬ−６の場合におけるｇｐ１３０、ＣＮＴＦ（Ｄａｖｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８０５〜１８０８（１９９３））の場合におけるｇｐ１３０およびＬＩＦＲ）はシグナル伝達を引き起こす。
【００８０】
初めに生成されたヘテロ二量体分子は、ｇｐ１３０の細胞外ドメインと結合した可溶性Ｒα成分を含んだ。これらの分子は、高親和性サイトカイン・Ｒα・ｇｐ１３０複合体を模倣することが示され、そしてそれらの同族サイトカインの高親和性アンタゴニストととして振舞う（図７）。これらの分子を作製するために、ｇｐ１３０の細胞外ドメインが、それぞれ、ＩＬ−６およびＣＮＴＦ、ＩＬ−６αおよびＣＮＴＦＲαについてのαレセプター成分と組み合わせられた。ｇｐ１３０の細胞外ドメインとＲαを連結するために、可溶性Ｒα−成分およびｇｐ１３０がヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合され、それぞれＲα−Ｆｃおよびｇｐ１３０−Ｆｃを産生した。Ｆｃドメインが主に選択されたが、それは単に、自然にジスルフィド結合性二量体を形成するためだけではない。Ｒα−Ｆｃ・ｇｐ１３０−Ｆｃを含むヘテロ二量体分子が発現され、精製され、そしてその同族のリガンドの高度に強力なアンタゴニストとして振舞うことが示された。さらに、どのサイトカインが結合され、そして捕獲されるかを特定するαレセプター成分の選択であるため（適切なＲαの非存在下において、サイトカインとｇｐ１３０との測定可能な結合は存在しない）、これらの分子は、その同族のサイトカインに対して高度に特異的であることが見出された。
【００８１】
本発明者らは、その設定によって、さらなる有益な特徴（例えば、安定性、Ｆｃレセプター媒介性クリアランス、または減少したエフェクター機能（例えば、補体結合））を有し得る、異なるヘテロマーの可溶性レセプターリガンドトラップの操作を可能にするこの技術の伸展を本明細書中に記載する。さらに、記載される技術は、哺乳動物における任意のヘテロマータンパク質または他の適切なタンパク質発現系（レセプター、リガンドを使用するヘテロマー分子、および酵素または触媒抗体のような触媒成分が挙げられるが、これらに限定されない）の操作のための適合性を証明するはずである。
【００８２】
（材料および方法）
（ヘテロマーの免疫グロブリン重鎖／軽鎖の可溶性レセプターに基づく、ＩＬ−６に対するリガンドトラップ遺伝子工学）
本明細書中に記載されるＩＬ−６トラップが、ヒトｇｐ１３０、ヒトＩＬ−６αレセプター（ＩＬ−６Ｒα）、結合領域（Ｊ）を有するか、もしくは有しないヒトＩｇＧ１（Ｃγ１）（Ｌｅｗｉｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｎｏｌｏｇｙ １５１：２８２９〜２８３８（１９９３））またはＩｇＧ４（Ｃγ４）の重鎖（Ｃγ）の定常領域、ならびに異なるｊペプチド（ｊ）を有するか、もしくは有しないヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）のカッパ（κ）およびラムダ（λ）（Ｃｈｅｕｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６６：６７１４〜６７２０（１９９２））軽鎖の定常領域を使用して操作された。この設計は、Ｃγドメインがλまたはκ軽鎖とヘテロ二量体化する天然の能力を利用する。Ｃγと軽鎖とのヘテロ二量体化は、ＣγのＣＨ１ドメインと軽鎖（ＣＬ）の定常領域との間で生じ、１つのジスルフィド結合を介するその２つのドメインの共有結合により安定化される。発明者は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと同様に、ＣγとＣＬとの組み合わせを使用して、一方の鎖上のｇｐ１３０の細胞外ドメインおよびもう一方の鎖上のＩＬ−６Ｒαの細胞外ドメインから構成されるジスルフィド結合されたヘテロマーのタンパク質を産生し得ると判断した。Ｆｃに基づくそれらの対応物と同様に、このようなタンパク質が、ＩＬ−６に対する高親和性リガンドトラップであり、そしてＩＬ−６応答細胞上の天然レセプターとＩＬ−６の相互作用を阻害する結果として、従って、ＩＬ−６アンタゴニストとして機能することが想定された。さらに、全長Ｃγ領域を使用する構築物は、多くの抗体と同様に、Ｃγ鎖のホモダイマーを形成し、２つの「軽鎖」および２つの「重鎖」を含む抗体様分子を生じる（図８）。この設計の潜在的な利点は、それはより親密にＩＬ−６・ＩＬ−６Ｒα・ｇｐ１３０複合体を模倣し得、そして匹敵する単一ヘテロ二量体よりもリガンドに対するより高い親和性を示し得ることである。ＣＨ１ドメインのみから構成されるＣγの短縮バージョンを使用することにより、さらなる設計が組み込まれる。これらは、レセプターκ融合タンパク質とヘテロ二量体分子を形成し、従って、抗体のＦａｂフラグメントと類似する。すべての可溶性レセプターＩｇキメラ遺伝子は、プラスミドベクター（哺乳動物発現に適切なベクター（ＣＯＳモンキー腎臓細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞[ＣＨＯ]、およびｒａｓ形質転換線維芽細胞[ＭＧ−ｒａｓ]）が挙げられるが、限定されない）において操作され得、そして効率的な翻訳のために各キメラ遺伝子の初めにＫｏｚａｋ配列（ＣＧＣ ＣＧＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧＴ Ｇ）を含み得る。標準的な遺伝子工学方法論を使用して、操作が実行された。各構築物が、ＤＮＡ配列決定、哺乳動物発現、続いて、適切な抗体を用いるウエスタンブロット法によるリガンドの結合および解離を決定する生物物理学的アッセイ、および増殖阻害アッセイ（後述されるような、ＸＧ−１）により確認された。これらのキメラタンパク質を操作するために利用されるドメインが、適切な制限部位に隣接されるので、他のキメラタンパク質（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１５、ＩＮＦγ、ＴＧＦβなどのような因子に対するレセプターの細胞外ドメインを使用するキメラを含む）を操作するためにこれらのドメインを使用することが可能である。ＩＬ−６トラップを作製する際に利用される各成分についてにアミノ酸座標が、下記に列挙される（注記：番号付けは開始メチオニンを＃１として始まる；長い配列は、２０アミノ酸についての１文字コードを使用して列挙される）。
【００８３】
（ａ）ヒトｇｐ１３０を使用する構築物：
（ｉ）ｇｐ１３０−Ｃγ１を、インフレームでｇｐ１３０の細胞外ドメイン（アミノ酸１〜６１９）をＳｅｒ−Ｇｌｙ架橋に融合させること、次に、Ｃγ１および終止コドンを含む３３０アミノ酸を融合させることにより操作した（図９）
（ｉｉ）ｇｐ１３０−Ｊ−Ｃγ１を、Ｊペプチド（アミノ酸配列：ＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）をＳｅｒ−Ｇｌｙ架橋とＣγ１配列との間に挿入したことを除いて、ｇｐ１３０−Ｃγ１と同様の様式で操作した（図９参照のこと）
（ｉｉｉ）ｇｐ１３０Δ３ｆｉｂｒｏ−Ｃγ１を、インフレームで、その３つのフィブロネクチン様ドメインを有しないｇｐ１３０の細胞外ドメインを融合させることにより操作した（図１０）。このキメラタンパク質の残りの部分は、ｇｐ１３０−Ｃγ１と同一である
（ｉｖ）ｇｐ１３０−Ｊ−ＣＨ１を、Ｃγ１領域の代わりに、Ｃγ１のＣＨ１部分のみが使用されたことを除いて、ｇｐ１３０−Ｃγ１について記載されることと同一の様式において操作した（図１１）。この構築物のＣ末端ドメインは、ＩｇＧの重鎖と軽鎖とのヘテロ二量体化の原因であるシステイン残基を含むヒンジ部分を含む。Ｃγ１ホモ二量体化に関与する２つのシステイン残基を含むそのヒンジ部分を、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインと共に欠失させた
（ｖ）ｇｐ１３０−Ｃγ４を、Ｃγ１の代わりに、Ｃγ４が使用されたことを除いて、ｇｐ１３０−Ｃγ１について記載されることと同一の様式において操作した（図１２）。さらに、ＲｓｒＩＩ ＤＮＡ制限部位を、Ｃγ４ドメインのヒンジ領域において２つのサイレントな塩基変異を導入することにより、操作した。このＲｓｒｓＩＩ部位は、他の所望される遺伝子工学技術操作（例えば、ｇｐ１３０−Ｃγ４と同等のＣＨ１の構築）を可能にする
（ｖｉ）ｇｐ１３０−κを、Ｃγ１領域の代わりに、ヒトＩｇのκ軽鎖の定常領域を使用したことを除いて、ｇｐ１３０−Ｃγ１について記載されることと同一の様式において操作した（図１３）
（ｖｉｉ）ｇｐ１３０−Ｊ−κを、ｊペプチド（アミノ酸配列：ＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ）をＳｅｒ−Ｇｌｙ架橋とκ領域との間に挿入したことを除いて、ｇｐ１３０−Ｊ−κについて記載されることと同一の様式において操作した。
【００８４】
（ｖｉｉｉ）ｇｐ１３０−λを、Ｃγ１の代わりに、ヒトＩｇのλ軽鎖（Ｃｈｅｕｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６６：６７１４〜６７２０（１９９２））の定常領域を使用したことを除いて、ｇｐ１３０−Ｃγ１について記載されることと同一の様式において操作した（図１４）。
【００８５】
（ｂ）ヒトＩＬ−６Ｒαを使用する構築物：
（ｉ）ＩＬ６Ｒα−Ｃγ１を、インフレームで、ＩＬ−６Ｒα（Ｙａｍａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：８２５〜８２８（１９８８））のアミノ酸１〜３５８（これは、ＩＬ−６Ｒα（図１５）の細胞外ドメインを含む）をＡｌａ−Ｇｌｙ架橋に融合させ、続いて、Ｃγ１および終止コドンを含む３３０アミノ酸を融合させることにより操作した
（ｉｉ）ＩＬ６Ｒα−κを、Ｃγ１の代わりに、ｇｐ１３０−κのために利用するκドメイン（図１３）を使用したことを除いて、ＩＬ６Ｒα−Ｃγ１について記載されるように操作した
（ｉｉｉ）ＩＬ６Ｒα−ｊ−κを、ｇｐ１３０−ｊ−κについて記載されるｊペプチドをＡｌａ−Ｇｌｙ架橋とκドメインとの間に配置したことを除いて、ＩＬ６Ｒα−κについて記載されるように操作した
（ｉｖ）さらなる３つの構築物（ＩＬ６Ｒα３１３−Ｃγ１、ＩＬ６Ｒα３１３−κ、およびＩＬ６Ｒα３１３−ｊ−κ）を、アミノ酸１〜３１３（図１６）から構成されるＩＬ−６Ｒαの短縮形態を使用するように操作した。各これらの構築物を、インフレームで、上記のＣγ１、κ−ドメインおよびｊ−κ−ドメインが続く、Ｔｈｒ−Ｇｌｙ架橋を有するＩＬ６Ｒα３１３を融合することにより作製した。これらの構築物を、ｇｐ１３０Δ３ｆｉｂｒｏ由来の構築物を補完するために操作した。
【００８６】
（リガンドトラップの発現および精製）
可溶性ｇｐ１３０および可溶性ＩＬ−６Ｒαの共有結合性ヘテロ二量体を産生するために、ｇｐ１３０−Ｉｇキメラタンパク質を、対を補完する際に、適切なＩＬ−６Ｒα−Ｉｇキメラタンパク質とともに同時発現させた。対応する発現ベクターを、適切な哺乳動物細胞株に安定に、または一過性でのいずれかで同時トランスフェクトすることにより、同時発現を達成した。生じたジスルフィド結合性ヘテロ二量体を、いくつかの異なる方法（固定化プロテインＡまたはプロテインＧ上のアフィニティークロマトグラフィー、リガンドベースのアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換、およびゲルろ過が挙げられるが、限定されない）によって馴化培地から精製した。
【００８７】
重／軽レセプター融合タンパク質の精製のために使用される方法の型の例は以下の通りである：ｇｐ１３０−Ｃγ１・ＩＬ−６Ｒα−κを、２つの異なるベクター（ｇｐ１３０−Ｃγ１およびＩＬ−６Ｒα−κをそれぞれコードする）を同時トランスフェクトすることにより、ＣＯＳ細胞において発現させた。２日間のトランスフェクション後、血清なしの馴化培地（４００ｍｌ）を収集し、そしてＣγ１保有タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーにより、１ｍｌよりも多くのＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製した。この工程において産生された物質をさらに、第二のアフィニティークロマトグラフィー工程により、ｇｐ１３０−Ｃγ１・ＩＬ−６Ｒα−κ複合体からｇｐ１３０−Ｃγ１二量体を除去するために（ｇｐ１３０−Ｃγ１二量体はＩＬ−６に結合しない）、組換えヒトＩＬ−６を用いて誘導された１ｍｌよりも多くのヒトＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製した。この方法により産生されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後の銀染色により証明されるように（図１７）、９０％より高いの純度であった。類似のプロトコールが、他の重／軽レセプターヘテロ二量体の精製のために、首尾良く使用されてきた。
【００８８】
（結果）
（免疫グロブリン重鎖／軽鎖レセプター融合アンタゴニストの生物学的活性）
精製したリガンドトラップを、種々の異なるアッセイにおいて、それらがＩＬ−６を結合する能力について試験した。例えば、リガンドトラップに結合するＩＬ−６の解離速度を、抗ＩＬ−６モノクローナル中和抗体Ｂ−Ｅ８［Ｂｒｏｃｈｉｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １７：４１〜４８（１９９５）、およびその中の参考文献］からのＩＬ−６の解離速度と並行して測定した。この型の実験の例を、図１８に示す。この実験において、２０ｐＭ ¹²⁵Ｉ−ＩＬ−６（１０００μＣｉ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、５００ｐＭのｇｐ１３０−Ｃγ１・ＩＬ−６Ｒα−κまたは５００ｐＭのｍＡｂ Ｂ−Ｅ８のいずれかとともに、２０時間プレインキュベートした。この時点で、１０００倍過剰（２０ｎＭ）の「冷」ＩＬ−６を添加した。定期的に、この反応のアリコートを取り出し、このリガンドトラップまたはＢ−Ｅ８を、プロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈殿させ、そして結合したままである¹²⁵Ｉ−ＩＬ−６のｃｐｍの数を決定した。明確に、リガンドトラップからのヒト¹²⁵Ｉ−ＩＬ６の解離速度は、非常にゆっくりであった−３日後、最初の計数の約７５％が、なおこのリガンドトラップに結合されていた。対照的に、この計数の５％未満は、３日後にこの抗体に結合されたままであった。この結果は、これらのリガンドトラップからのこのリガンドの解離速度が非常にゆっくりであることを実証する。
【００８９】
異なるセットの実験において、リガンドトラップがリガンドの存在下で多量体化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚｅ）する能力を試験した。この例を、図１９に示す。ｇｐ１３０−Ｆｃ・ＩＬ−６Ｒα−Ｆｃとｇｐ１３０−Ｃ_H１・ＩＬ−６Ｒα−κとのＩＬ−６誘導化結合を、ｇｐ１３０−Ｃ_H１・ＩＬ−６Ｒα−κ（これは、それ自体プロテインＡを結合しない）がＩＬ−６依存性様式でｇｐ１３０−Ｆｃ・ＩＬ−６Ｒα−Ｆｃの存在下においてプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによって沈殿され得るか否かを試験することにより決定した（図９）。プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによるｇｐ１３０−Ｃ_H１・ＩＬ−６Ｒα−κの沈殿を、抗κ特異的ＨＲＰ結合体を用いるウエスタンブロッティングによって決定した。この抗κ特異的ＨＲＰ結合体は、ｇｐ１３０−Ｆｃ・ＩＬ−６Ｒα−Ｆｃを検出しない。ｇｐ１３０−Ｃ_H１・ＩＬ−６Ｒα−κは、ｇｐ１３０−Ｆｃ・ＩＬ−６Ｒα−ＦｃおよびＩＬ−６の両方が存在した場合にのみ、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによって沈殿され得る。この結果は、結論的に、ＩＬ−６がリガンドトラップ多量体化を誘導し得ることを示し、そして、このリガンドトラップが６量体サイトカイン・Ｒα・シグナルトランスデューサー複合体を模擬し得ることをさらに示す（図１）。リガンド誘導多量体化は、インビボにおけるサイトカイン・リガンドトラップ複合体の除去において重要な役割を果たし得る。
【００９０】
異なるリガンドトラップの生物学的活性を、リガンド依存性細胞増殖を測定するアッセイにおいてさらに試験し得る。いくつかの細胞増殖アッセイが、ＩＬ−６について存在し、そしてそれらは、細胞株（例えば、Ｂ９、ＣＥＳＳまたはＸＧ−１）を利用する。ＸＧ−１細胞株を使用するこの型のアッセイの例を、以下に示す：ＸＧ−１は、ヒト多発性骨髄腫に由来する細胞株である（Ｚｈａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ８３：３６５４〜３６６３（１９９４））。ＸＧ−１は、生存および増殖のために外因的に供給されたヒトＩＬ−６に依存する。ＸＧ−１株に対するＩＬ−６のＥＣ₅₀は、約５０ｐｍｏｌ／ｍｌである。いくつかの異なるＩＬ−６トラップがＸＧ−１細胞のＩＬ−６依存性増殖をブロックする能力を、ＸＧ−１培養物中で５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−６とともに、増加する量の精製したリガンドトラップをインキュベートすることによって試験した。試験したリガンドトラップを、上記の方法と類似の方法によって発現および精製させた。試験した全てのリガンドトラップは、用量依存性様式においてＸＧ−１のＩＬ−６依存性増殖を阻害することが見出された（図２０）。試験した５つの異なるトラップのうち、ｇｐ１３０−Ｃγ１・ＩＬ−６Ｒα−κは、最も活性であり、そして抗体Ｂ−Ｅ８と同じ、ＩＬ−６に対する中和活性を本質的に提示する。１０倍モル濃度過剰程に少ないｇｐ１３０−Ｃγ１・ＩＬ−６Ｒα−κまたはＢ−Ｅ８のいずれかは、ＩＬ−６の活性を完全にブロックした（Ａ５７０−６５０の読み＝０．３ＡＵは、ＸＧ−１細胞のいかなる増殖にも対応しない）。１００倍モル濃度過剰において、試験したリガンドトラップの全ては、ＩＬ−６の活性を完全にブロックした。この観察された阻害は、ＣＮＴＦ活性をブロックするｇｐ１３０−Ｆｃ・ＣＮＴＦＲα−Ｆｃリガンドトラップも、ｇｐ１３０−Ｆｃホモ二量体も、ＩＬ−６よりも１０００倍モル濃度過剰に使用される場合でさえＩＬ−６に対していかなるブロック活性をも示さない（データは示さず）ので、高度に選択性である。このデータは、ヘテロマーの免疫グロブリン重鎖／軽鎖レセプターに基づくリガンドトラップ機能が、これらの同族リガンドの選択的な高親和性アンタゴニストとして機能することを実証する。
【００９１】
（実施例５−融合ポリペプチド成分のクローニング）
ヒトサイトカインレセプターの細胞外ドメインを、組織ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を使用する標準的なＰＣＲ技術によって得、発現ベクターであるｐＭＴ２１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）にクローン化し、そしてその配列を、ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡシークエンサーおよびＴａｑ Ｄｉｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用する標準的な技術によって配列決定した。ＩＬ−４Ｒαについて、Ｇｅｎｂａｎｋ配列Ｘ５２４２５からのヌクレオチド２４１〜８６８（アミノ酸２４〜２３１に対応する）を、クローン化した。ＩＬ−２Ｒγについて、Ｇｅｎｂａｎｋ配列Ｄ１１０８６からのヌクレオチド１５〜７７６（アミノ酸１〜２３３に対応する）を、クローン化した。ＩＬ−６Ｒαについて、Ｇｅｎｂａｎｋ配列Ｘ５２４２５からのヌクレオチド５２〜１０４４（アミノ酸１〜３３１に対応する）を、クローン化した。ｇｐ１３０について、Ｇｅｎｂａｎｋ配列Ｍ５７２３０からのヌクレオチド３２２〜２１１２（アミノ酸３０〜６１９に対応する）を、クローン化した。ＩＬ−１ＲＡｃＰについて、Ｇｅｎｂａｎｋ配列ＡＢ００６３５７からのヌクレオチド１〜１０７４（アミノ酸１〜３５８に対応する）を、クローン化した。ＩＬ−１ＲＩについて、Ｇｅｎｂａｎｋ配列Ｘ１６８９６からのヌクレオチド５５〜９９９（アミノ酸１９〜３３３に対応する）を、クローン化した。
【００９２】
（実施例６−融合ポリペプチド（サイトカイントラップ）の生成）
サイトカイントラップをコードするヌクレオチド配列を、標準的なクローニング技術およびＰＣＲ技術によって、個々にクローン化したＤＮＡ（上記）から構築した。各々の場合において、第１の融合ポリペプチド成分をコードする配列を、多量体化成分として第２の融合ポリペプチド成分をコードする配列、続いてＦｃドメイン（ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域）に融合するように、配列をインフレームで構築した。いくつかの場合において，余分なヌクレオチドを、第１の融合ポリペプチド成分をコードする配列と第２の融合ポリペプチド成分をコードする配列との間にインフレームで挿入して、２つの成分間にリンカー領域を付加した（図２１Ａ〜図２１Ｄ−トラップ４２４；図２４Ａ〜図２４Ｆ−トラップ４１２；および図２６Ａ〜図２６Ｅ−トラップ５６９を参照のこと）。
【００９３】
ＩＬ−４トラップである４２４（図２１Ａ〜図２１Ｄ）、６０３（図２２Ａ〜図２２Ｄ）および６２２（図２３Ａ〜図２３Ｄ）について、ＩＬ−２Ｒγ成分は、ＩＬ４Ｒα成分次いでＦｃ成分の前の５’である。ＩＬ−６トラップである４１２（図２４Ａ〜図２４Ｆ）および６１６（図２５Ａ〜図２５Ｆ）について、ＩＬ−６Ｒα成分は、ｇｐ１３０成分次いでＦｃドメインの前の５’である。ＩＬ−１トラップである５６９（図２６Ａ〜図２６Ｅ）について、ＩＬ−１ＲＡｃＰ成分は、ＩＬ−１ＲＩ成分次いでＦｃドメインの前の５’である。最終的な構築物を、哺乳動物発現ベクターであるｐＣＤＮＡ３．１（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）へクローン化した。
【００９４】
５６９配列（図２６Ａ〜図２６Ｅ）において、ヌクレオチド１〜１０７４は、ＩＬ１ＲＡｃＰ成分をコードし、ヌクレオチド１０７５〜１０９８は、リンカー領域をコードし、ヌクレオチド１０９９〜２０４３は、ＩＬ１ＲＩ成分をコードし、そしてヌクレオチド２０４４〜２７３０は、Ｆｃドメインをコードする。
【００９５】
４１２配列（図２４Ａ〜図２４Ｆ）において、ヌクレオチド１〜９９３は、ＩＬ６Ｒα成分をコードし、ヌクレオチド９９４〜１０２３は、リンカー領域をコードし、ヌクレオチド１０２４〜２８１４は、ｇｐ１３０成分をコードし、そしてヌクレオチド２８１５〜３５０４は、Ｆｃドメインをコードする。
【００９６】
６１６配列（図２５Ａ〜図２５Ｆ）において、ヌクレオチド１〜９９３は、ＩＬ６Ｒα成分をコードし、ヌクレオチド９９４〜２７８４は、ｇｐ１３０成分をコードし、そしてヌクレオチド２７８５〜３４７４は、Ｆｃドメインをコードする。
【００９７】
４２４配列（図２１Ａ〜図２１Ｄ）および６２２配列（図２３Ａ〜２３Ｄ）において、ヌクレオチド１〜７６２は、ＩＬ２Ｒγ成分をコードし、ヌクレオチド７６３〜７７１は、リンカー領域をコードし、ヌクレオチド７７２〜１３９５は、ＩＬ４Ｒα成分をコードし、そしてヌクレオチド１３９６〜２０８２は、Ｆｃドメインをコードする。
【００９８】
最後に、６０３配列（図２２Ａ〜図２２Ｄ）において、ヌクレオチド１〜７６２は、ＩＬ２Ｒγ成分をコードし、ヌクレオチド７６３〜１３８６は、ＩＬ４Ｒα成分をコードし、そしてヌクレオチド１３８７〜２０７３は、Ｆｃドメインをコードする。
【００９９】
ＤＮＡ構築物を、当業者に周知の標準的な技術によって、ＣＯＳ細胞へ一過的にトランスフェクトするか、またはＣＨＯ細胞へ安定にトランスフェクトするかのいずれかを行った。上清を、標準的な技術によりプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって回収および精製した（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと）。
【０１００】
（実施例７：ＴＦ−１（ＡＴＣＣ）細胞を使用するＩＬ−４バイオアッセイプロトコル）
（必要な試薬および装置）
（ＭＴＴ色素溶液：）
ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］）（Ｓｉｇｍａカタログ＃ Ｍ２１２８）
作業濃度：Ｃａ⁺²、Ｍｇ⁺²を含まない２００ｍｌ ＰＢＳ中で５ｍｇの無水ＭＴＴを溶解する
濾過滅菌し、−２０℃でアリコートを保存する。
（安定化溶液：）
１０００ｍｌに対して、１００ｇ ＳＤＳ、９５０ｍｌ ｄＨ₂Ｏ、５０ｍｌ ジメチルホルムアミドおよび８５０μｌ 濃塩酸を合わせる
０．４５μｍフィルターユニットで濾過滅菌する
室温で保存する。
【０１０１】
（ＴＦ−１細胞増殖培地：）
ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン。
【０１０２】
（その他：）
０．４％ Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ、希釈のための滅菌チューブ、滅菌９６ウェル細胞培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ ＃３０７２）、血球計、遠心分離機、ＥＬＩＳＡプレートリーダー、１５μｌ、２５μｌ、５０μｌおよび１００μｌ容量のマルチチャネルピペット、滅菌試薬リザーバー、滅菌ピペットチップ、グローブ。
【０１０３】
（アッセイプロトコル）
（Ａ．アッセイプレートの調製）
１．滅菌９６ウェル組織培養プレートを、種々の濃度のＩＬ−４および１０ｎＭ ＩＬ−４アンタゴニストとともに、ウェルあたり５０μｌの増殖培地を含むように調製する。これは、ＩＬ−４の作業希釈物（アッセイされるべき最高濃度の４倍である）を調製することによってなされ得る。分離チューブにおいて、ＩＬ−４の２倍連続希釈を行う。各希釈物の２５μｌを、このプレートに渡って１つの行に添加する（すなわち、行Ａは最高濃度を得、行Ｇは最低濃度を得る）。ＩＬ−４を含まない２５μｌの増殖培地を行Ｈに添加する。試験されるべきアンタゴニストを、最終濃度の４倍であるストックを作製することによって調製する。２５μｌを三連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）セットのＩＬ−４含有ウェルに添加する（列１、２、３、Ａ〜Ｈ）。行Ｈにおいてアンタゴニストを含むことを確認する
２．ポジティブコントロールとして、アンタゴニストを有さない１つのセットを残す。これらのウェルは、ＩＬ−４および培地のみを含む
３．アッセイのために使用されるべき細胞を調製する前に、加湿した５％ ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃にて１〜２時間、このプレートをインキュベートする。
【０１０４】
（Ｂ．細胞の調製）
４．細胞を、増殖因子を含まないアッセイ培地中での遠心分離によって２回洗浄する
５．細胞数およびトリパンブルー生存度を決定し、そして細胞を、アッセイ培地中で８×１０⁵／ｍｌの最終濃度に懸濁する
６．５０μｌの細胞懸濁物（４０，０００細胞）を、このプレートの全てのウェルへ分配する。ここで、総容量は、１００μｌ／ウェルであるべきであ
７．加湿５％ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃にて６８時間プレートをインキュベートする。
【０１０５】
（Ｃ．発色）
８．６８時間のインキュベートの後、１５μｌのＭＴＴ色素溶液を各ウェルに添加する
９．加湿５％ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃にて４時間プレートをインキュベートする
１０．４時間後、１００μｌの可溶化溶液を各ウェルに添加する。プレートを密封した容器中で一晩静置して、ホルマザン結晶を完全に可溶化させる
１１．５７０／６５０ｎｍの吸光度を記録する。
【０１０６】
（結果）
図２７は、４ＳＣ３７５と命名したＩＬ−４トラップ（これは、ＩＬ−２Ｒγ−ｓｃｂ−ＩＬ４Ｒα−ＦｃΔＣ１の融合ポリペプチドである）は、ＴＦ１細胞バイオアッセイにおいて、ＩＬ４ＲαＦｃΔＣ１単独よりも、ＩＬ−４アンタゴニストとして数オーダーの程度良好であることを示す。
【０１０７】
図２８は、４ＳＣ３７５と命名したＩＬ−４トラップが、ＴＦ１細胞バイオアッセイにおいて、４ＳＣ４２４と命名したＩＬ−４トラップ（これは、ＩＬ−４Ｒα成分を豊富に有するＩＬ−２Ｒγ成分を有するＩＬ−２Ｒγ−ＩＬ４Ｒα−ＦｃΔＣ１の融合ポリペプチドである）と等しいアンタゴニスト活性を示すことを示す。
【０１０８】
（実施例８：ＸＧ−１細胞を使用するＩＬ−６バイオアッセイプロトコル）
（必要な試薬および機器）
（ＭＴＴ色素溶液：）
ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］）（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｍ２１２８）
作用濃度：Ｃａ⁺²、Ｍｇ⁺²なしで、２００ｍｌのＰＢＳ中に５ｍｇの無水ＭＴＴを溶解させる
滅菌濾過し、そしてアリコートを−２０℃にて貯蔵する。
【０１０９】
（可溶化溶液：）
１０００ｍｌについて、１００ｇのＳＤＳ、９５０ｍｌのｄＨ₂Ｏ、５０ｍｌのジメチルホルムアミド、および８５０μｌの濃塩酸を合わせる
０．４５μｍのフィルターユニットで濾過滅菌する
室温にて保存する。
【０１１０】
（アッセイ培地：）
ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０μＭ メルカプトエタノール。
【０１１１】
（他：）
０．４％ トリパンブルー染色液、希釈のための滅菌チューブ、滅菌９６ウェル細胞培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ＃３０７２）、血球計、遠心分離機、ＥＬＩＳＡプレートリーダー、１５、２５、５０および１００μｌ容量のマルチチャンネルピペット、滅菌試薬リザーバー、滅菌ピペットチップ、手袋。
【０１１２】
（アッセイプロトコル）
（Ａ．アッセイプレートの調製）
１．様々な濃度のＩＬ−６および１０ｎＭのＩＬ６アンタゴニストとともに、１ウェルあたり５０μｌの増殖培地を含むように、滅菌９６ウェル組織培養プレートを調製する。これを、アッセイされるべき最高濃度の４倍であるＩＬ−６の作業希釈物を調製することによって行い得る。別々のチューブにおいて、ＩＬ−６の２倍希釈系列を行う。２５μｌの各希釈物を、プレートを横切る１つの横列に添加する（すなわち、横列Ａは最高濃度を得、横列Ｇは最低濃度を得る）。ＩＬ−６を含まない２５μｌの増殖培地を横列Ｈに添加する。試験されるべきアンタゴニストを、最終濃度の４倍のストックを作製することによって調製する。ＩＬ−６含有ウェルの三連のセットに２５μｌを添加する（縦列１、２、３、ＡからＨ）。横列Ｈ中にアンタゴニストが含まれることを確認する。代表的なＩＬ−６滴定を、２００ｎｇ／ｍｌにて開始し、３．１ｎｇ／ｍｌに至るまでする
２．陽性コントロールとして、アンタゴニストなしの１つのセットを残す。これらのウェルは、アンタゴニストに代わって、ＩＬ−６および培地を含む
３．アッセイのために使用されるべき細胞を調製する前に、加湿５％ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃にて１〜２時間プレートをインキュベートする。
【０１１３】
（Ｂ．細胞の調製）
４．増殖因子を含まないアッセイ培地で、遠心分離（１０００ＲＰＭにて５分間）によって細胞を２回洗浄する
５．細胞数およびトリパンブルー生存度を決定し、そしてアッセイ培地中８×１０⁵／ｍｌの最終濃度まで細胞を懸濁する
６．５０μｌの細胞懸濁物（４００００細胞）を、プレートの全てのウェルに分配する。総容量は、ここで、１００μｌ／ウェルであるはずである
７．加湿５％ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃にて６８時間プレートをインキュベートする。
【０１１４】
（Ｃ．発色）
８．６８時間にて、１５μｌの色素溶液を各ウェルに添加する
９．加湿５％ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃にて４時間プレートをインキュベートする
１０．４時間後、１００μｌの可溶化溶液を各ウェルに添加する。プレートを密封した容器中で一晩静置して、ホルマザン結晶を完全に可溶化させる
１１．５７０／６５０ｎｍの吸光度を記録する。
【０１１５】
（結果）
図２９は、図２４Ａ〜図２４Ｆに記載したＩＬ−６トラップ（６ＳＣ４１２ＩＬ６Ｒ−ｓｃｂ−ｇｐｘ−ＦｃΔＣ１）が、ＸＧ１バイオアッセイにおいて、ヒトＩＬ−６−ＢＥ８に対する中和化モノクローナル抗体よりも、良好なＩＬ−６のアンタゴニストであることを示す。
【０１１６】
（実施例９：ＩＬ１トラップについてのＭＲＣ５バイオアッセイ）
ＭＲＣ５ヒト肺線維芽細胞は、ＩＬ−６を分泌することによりＩＬ−１に応答し、従って、ＩＬ−１トラップがＩＬ−６のＩＬ−１依存性産物をブロックする能力をアッセイするために利用された。ＩＬ−１トラップ１ＳＣ５６９（図２６Ａ〜図２６Ｅ）を、ＩＬ−１−ＲＩ．Ｆｃ（これは、Ｆｃドメインに融合したＩＬ−１ Ｉ型レセプターの細胞外ドメインである）に対して試験した。
【０１１７】
ＭＲＣ５細胞を、培地中１ｍｌあたり１×１０⁵細胞にて懸濁し、そして０．１ｍｌの細胞を、９６ウェル組織培養プレートのウェルにプレートする（１ウェルあたり１０，０００細胞）。プレートを、加湿５％ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃にて２４時間インキュベートする。
【０１１８】
可変用量のＩＬ−１トラップおよび組換えヒトＩＬ−１を、９６ウェル組織培養ディッシュ中でプレインキュベートし、そして３７℃にて２時間インキュベートする。次いで、０．１ｍｌのこの混合物を、ＩＬ−１トラップの最終濃度が１０ｎＭであり、かつＩＬ−１の最終濃度が２．４ｐＭ〜５ｎＭの範囲であるように、ＭＲＣ５細胞を含む９６ウェルプレートに添加する。コントロールウェルは、トラップ単独を含むか、または何も含まない。
【０１１９】
次いで、プレートを、加湿５％ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃にて２４時間インキュベートする。上清を収集し、そしてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔを製造業者の指示書に従って使用して、ＩＬ−６のレベルをアッセイする。
【０１２０】
（結果）
図３０は、トラップ５６９（図２６Ａ〜図２６Ｅ）がＩＬ−１の効果を拮抗し得、かつＩＬ−１での処理の際のＭＲＣ５細胞からのＩＬ−６産生をブロックし得ることを示す。１０ｎＭの濃度にて、トラップ５６９は、３ｎＭのＩＬ−１濃度まで。ＩＬ−６の産生をブロックし得る。対照的に、ＩＬ−１ＲＩ．Ｆｃは、ＩＬ−１のより弱いアンタゴニストである。それは、約１０〜２０ｐＭまでＩＬ−１の効果をブロックし得るのみである。従ってトラップ５６９は、ＩＬ−１のブロックにおいて、ＩＬ１ＲＩ．Ｆｃより約１００倍良好である。
【０１２１】
（実施例１０：ＩＬ１３／ＩＬ１４単一鎖トラップの構築）
１．ＩＬ−４α．ＩＬ−１３Ｒα１．Ｆｃと命名されたＩＬ−１３／ＩＬ−１４二重（ｄｕａｌ）トラップを作製するために、ヒトＩＬ−４Ｒα細胞外ドメイン（図３１Ａ〜図３１Ｇのヌクレオチド＃１〜６９３に対応する）およびヒトＩＬ−１３Ｒα１細胞外ドメイン（図３１Ａ〜図３１Ｇのヌクレオチド＃７００〜１６６５に対応する）を、標準的なＰＣＲ技術によって増幅し、そしてヒトＦｃ配列（図３１Ａ〜図３１Ｇのヌクレオチド＃１６７１から２３５５に対応する）を含む発現ベクターｐＭＴ２１に連結し、このように、Ｎ末端からＣ末端までのヒトＩｇＧ１の、ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα１、およびヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる融合タンパク質を作製した。さらに、アミノ酸配列ＳｅｒＧｌｙを有する２アミノ酸リンカー（図３１Ａ〜図３１Ｇのヌクレオチド＃６９４〜６９９に対応する）を、ＩＬ−４ＲαとＩＬ−１３Ｒα１との間にインフレームで構築し、そしてアミノ酸配列ＴｈｒＧｌｙを有する２アミノ酸リンカー（図３１Ａ〜図３１Ｇのヌクレオチド＃１６６６から１６７１に対応する）を、ＩＬ−１３Ｒα１とＦｃ部分との間にインフレームで構築した。全ての配列を、標準的な技術によって配列確認した。次いで、ＩＬ−４α．ＩＬ−１３Ｒα１．Ｆｃコード配列を、標準的な分子生物学技術を使用して、発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングした。
【０１２２】
２．ＩＬ−１３Ｒα１．ＩＬ−４α．Ｆｃと命名されたＩＬ−１３／ＩＬ−４二重トラップを作製するために、ＩＬ−１３Ｒα１細胞外ドメイン（図３２Ａ〜図３２Ｇのヌクレオチド＃１〜１０２９に対応する）およびヒトＩＬ−４Ｒα（図３２Ａ〜図３２Ｇのヌクレオチド＃１０６０〜１６９２に対応する）を、標準的なＰＣＲ技術によって増幅し、そしてヒトＦｃ配列（図３２Ａ〜図３２Ｇのヌクレオチド＃１６９９から２３８２に対応する）を含む発現ベクターｐＪＦＥ１４に連結して、Ｎ末端からＣ末端までのヒトＩｇＧ１の、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−４Ｒα、およびヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる融合タンパク質を作製した。さらに、アミノ酸配列ＧｌｙＡｌａＰｒｏＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＡｒｇＰｒｏを有する１０アミノ酸リンカー（図３２Ａ〜図３２Ｇのヌクレオチド＃１０３０から１０５９に対応する）を、ＩＬ−１３Ｒα１と１ＩＬ−４Ｒαとの間にインフレームで構築し、そしてアミノ酸配列ＳｅｒＧｌｙを有する２アミノ酸リンカー（図３２Ａ〜図３２Ｇのヌクレオチド＃１６９３から１６９８に対応する）を、ＩＬ−４ＲαとＦｃ部分との間にインフレームで構築した。全ての配列を、標準的な技術によって配列確認した。次いで、ＩＬ−１３Ｒα１．ＩＬ−４α．Ｆｃのコード配列を、標準的な分子生物学技術を使用して、発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングした。
【０１２３】
（実施例１１：ＩＬ−４α．ＩＬ−１３Ｒα１．ＦｃおよびＩＬ−１３Ｒα１．ＩＬ−４α．Ｆｃの発現）
ＤＨ１０Ｂ細胞におけるｐＣＡＥ８０１（ＩＬ−４α．ＩＬ−１３Ｒα１．ＦｃをコードするＤＮＡベクター構築物）およびｐＣＡＥ８０２（ＩＬ−１３Ｒα１．ＩＬ−４α．ＦｃをコードするＤＮＡプラスミド構築物）の大規模（１Ｌ）培養物を、ＬＢ＋アンピシリン中で一晩増殖させ、そしてプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｍｅｇａ Ｋｉｔを製造業者のプロトコルに従って用いて抽出した。精製したプラスミドＤＮＡの濃度を、ＵＶ分光計および蛍光測定機において決定した。このプラスミドＤＮＡをまた、ＢｂｓＩ、ＸｍｎＩおよびＮｃｏＩ制限酵素でのアリコートの消化によって確認した。全ての制限酵素消化フラグメントは、１％アガロースゲルにおいて、予測したサイズに対応した。
【０１２４】
４０の１５ｃｍペトリプレートに、４×１０⁶細胞／プレートの密度で、ＣＨＯ−Ｋ１／Ｅ１Ａ細胞を播種した。プレーティング培地は、Ｇｉｂｃｏ Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ｗ／１０％ Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）＋ペニシリン／ストレプトマイシンであり、グルタミンを補充した。次の日に、各プレートを、Ｇｉｂｃｏ ＯｐｔｉｍｅｍおよびＧｉｂｃｏ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを１２ｍｌの容量で製造業者のプロトコルに従って使用して、６μｇのｐＣＡＥ８０１、またはｐＣＡＥ８０２でトランスフェクトした。トランスフェクションミックスを細胞に添加した４時間後、１２ｍｌ／プレートのＯｐｔｉｍｅｍ ｗ／１０％ ＦＢＳを添加した。プレートを、５％ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃にて一晩インキュベートした。次の日に、培地を各プレートから除去し、そして２５ｍｌの発現培地（Ｇｉｂｃｏ ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ ｗ／グルタミン＋１ｍＭ 酪酸ナトリウム）を添加した。このプレートを３７℃にて３日間インキュベートした。
【０１２５】
インキュベーションの３日後、この培地を各プレートから取り出し、そしてスイングバケツローター中で４００ｒｐｍにて遠心分離して、細胞をペレットにした。その上清を滅菌１リットル瓶にデカントし、そして発現したタンパク質を以下に記載のように精製した。
【０１２６】
（実施例１２．培養培地からのＩＬ−４Ｒα．ＩＬ−１３Ｒα１．ＦｃおよびＩＬ−１３Ｒα１．ＩＬ−４Ｒα．Ｆｃタンパク質の精製）
（１．ＩＬ−４Ｒα．ＩＬ−１３Ｒα１．Ｆｃの精製）
ヒトＩＬ−４Ｒα．ＩＬ−１３Ｒα１．ＦｃをＣＨＯ細胞にて一過性発現させ、そして上清を上記のようにプレートトランスフェクションから収集した。分泌されたタンパク質の発現を、サンドイッチＥＬＩＳＡによって、それぞれヤギ抗ｈＩｇＧ（γ鎖特異的；Ｓｉｇｍａ １−３３８２）捕捉抗体およびレポート抗体、ならびにヤギ抗ｈＩｇＧ（Ｆｃ特異的）−ＦＩＴＣ結合体（Ｓｉｇｍａ Ｆ９５１２）捕捉抗体およびレポート抗体を使用して決定した。収量は、馴化培地１リットルあたり５．８〜９．２ｍｇ（平均７．５ｍｇ）の範囲であった。完全^TMプロテアーゼインヒビター錠剤（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．）をこの培地に溶解した（１錠剤／Ｌ）。この馴化培地を滅菌濾過（０．２２μｍ孔径）した後、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ｐＨ７．４）で事前に平衡化した５ｍＬ ＨｉＴｒａｐ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティーカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上に、４℃でローディングした。流速は約１〜２ｍＬ／分であった。このカラムをＰＢＳ緩衝液を用いて徹底的に洗浄し、このカラムから非特異的に結合したタンパク質を除去した。ＩＬ−４Ｒα．ＩＬ−１３Ｒα１．Ｆｃを、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ３．５）を使用して溶出した。この溶出物をすぐに、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＯＨを用いた滴定によって中和した。タンパク質を含有する画分をプールし、そしてすぐに４℃のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で透析した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ精製からの回収分は、６．８ｍｇ（７３％）であった。ＩＬ−４Ｒα．ＩＬ−１３Ｒα１．Ｆｃを、ＰＢＳ、５％（容量／容量）グリセロール（ｐＨ７．４）で事前に平衡化したｓｕｐｅｒｏｓｅ ６カラム（２５ｍＬベッド容量；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、周囲の温度でサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した。流速は、０．５ｍL／分であった。タンパク質画分を、クマシー染色した非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ ＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル）から評価した。画分を、保存的にプールし、凝集したタンパク質の量を減らした。全体の収量は５１％（４．４ｍｇ）であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判定した場合に９７％の純度であった。精製したＩＬ−４Ｒα．ＩＬ−１３Ｒα１．Ｆｃを、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、分析的サイズ排除クロマトグラフィー（Ｔｏｓｏｈａａｓ ＴＳＫＧ４０００ＳＷＸＬ）、Ｎ末端配列決定、およびヤギ抗ｈＩｇＧ−ＨＲＰ結合体（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｗ４０３Ｂ）を用いたイムノブロット、そしてまたマウスモノクローナル抗ｈＩＬ−４Ｒα（Ｒ＆Ｄ ＭＡＢ２３０）に続き、抗ｍＩｇＧ−ＨＲＰ結合体（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｗ４０２Ｂ）を２次抗体として用いたイムノブロットにより分析した。
【０１２７】
（２．ＩＬ−１３Ｒα１．ＩＬ−４Ｒα．Ｆｃの精製）
ヒトＩＬ−１３Ｒα１．ＩＬ−４Ｒα．ＦｃをＣＨＯ細胞にて一過性発現させ、そして上清を前記のようにプレートトランスフェクションから収集した。分泌したタンパク質の発現を、ヤギ抗ＩｇＧ（γ鎖特異的；Ｓｉｇｍａ １−３３８２）捕捉抗体およびレポート抗体、ならびにヤギ抗ｈＩｇＧ（Ｆｃ特異的）−ＦＩＴＣ結合体（Ｓｉｇｍａ Ｆ９５１２）捕捉抗体およびレポート抗体を使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡにより決定した。収量は、馴化培地１リットルあたり８．８ｍｇであった。完全^TMプロテアーゼインヒビター錠剤（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．）をこの培地に溶解した（１錠剤／Ｌ）。この馴化培地を滅菌濾過（０．２２μｍ孔径）した後、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ｐＨ７．４）で事前に平衡化した５ｍＬ ＨｉＴｒａｐ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティーカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上に、４℃でローディングした。流速は約１〜２ｍＬ／分であった。このカラムをＰＢＳ緩衝液を用いて徹底的に洗浄し、このカラムから非特異的に結合したタンパク質を除去した。ＩＬ−１３Ｒα１．ＩＬ−４Ｒα．Ｆｃを、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ３．５）を使用して溶出した。この溶出物をすぐに、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＯＨを用いた滴定によって中和した。タンパク質を含有する画分をプールし、そしてすぐに４℃のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で透析した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ精製からの回収分は、３．８ｍｇ（４３％）であった。ＩＬ−１３Ｒα１．ＩＬ−４Ｒα．Ｆｃを、ＰＢＳ、５％（容量／容量）グリセロール（ｐＨ７．４）で事前に平衡化したｓｕｐｅｒｏｓｅ ６カラム（２５ｍＬベッド容量；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、周囲の温度でのゲル濾過クロマトグラフィーによりさらに精製した。流速は、０．５ｍL／分であった。タンパク質画分を、クマシー染色した非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ ＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル）から評価した。画分を、保存的にプールし、凝集したタンパク質の量を減らした。全体の収量は１７％であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判定した場合に９５％の純度であった。精製したＩＬ−１３Ｒα１．ＩＬ−４Ｒα．Ｆｃを、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、分析的ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｔｏｓｏｈａａｓ ＴＳＫＧ４０００ＳＷＸＬ）、Ｎ末端配列決定、およびヤギ抗ｈＩｇＧ−ＨＲＰ結合体（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｗ４０３Ｂ）を用いたイムノブロット、そしてまたマウスモノクローナル抗ｈＩＬ−４Ｒα（Ｒ＆Ｄ ＭＡＢ２３０）に続き、抗ｍＩｇＧ−ＨＲＰ結合体（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｗ４０２Ｂ）を２次抗体として用いたイムノブロットにより分析した。
【０１２８】
（実施例１３．ＩＬ−４Ｒα．ＩＬ−１３Ｒα１．ＦｃおよびＩＬ−１３Ｒα１．ＩＬ−４Ｒα．Ｆｃによる、ＩＬ−４およびＩＬ−１３のブロック）
（材料および方法）
（ＴＦ１バイオアッセイ）ＴＦ１細胞を、増殖培地（１０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン）にて維持した。このバイオアッセイのために、細胞をアッセイ培地（上記と同様であるが、ＧＭ−ＣＳＦを除く）にて２回洗浄し、次いでアッセイ培地５０μｌにて２×１０⁵細胞でプレートした。この精製したＩＬ−４Ｒα．ＩＬ−１３Ｒα１．ＦｃおよびＩＬ−１３Ｒα．ＩＬ−４Ｒα．Ｆｃタンパク質をアッセイ培地に希釈して、濃度４０ｎＭにした。各トラップ２５μｌをこの細胞に添加した。ＩＬ−１３またはＩＬ−４のいずれかをアッセイ培地中で４０ｎＭまで希釈し、次いでアッセイ培地中での２倍希釈シリーズを作製した。次いで、ＩＬ−１３またはＩＬ−４のいずれか２５μｌを、この細胞およびトラップを含有するウェルに添加した。次いで、細胞を、３６℃にて５％ＣＯ₂に約７０時間インキュベートした。ＴＦ１細胞増殖の程度を、製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）に従って、ＭＴＳアッセイにより測定した。
【０１２９】
（結果）
ＩＬ−４Ｒα．ＩＬ−１３Ｒα１．ＦｃおよびＩＬ−１３Ｒα．ＩＬ−４Ｒα．ＦｃトラップがヒトＩＬ−１３およびヒトＩＬ−４活性の両方をブロックする能力を、前記のようなＴＦ１バイオアッセイにて測定した。ＩＬ−１３は、ＴＦ１細胞の増殖を刺激し、濃度０．２ｎＭで最大半分増殖（ｈａｒｆ−ｍａｘｉｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ）であった。濃度１０ｎＭのＩＬ−４Ｒα．ＩＬ−１３Ｒα１．ＦｃまたはＩＬ−１３Ｒα１．ＩＬ−４Ｒα．Ｆｃトラップいずれかの添加により、約２ｎＭまで、ＩＬ−１３誘導性増殖をブロックする（図３３）。約４〜５ｎＭのＩＬ−１３濃度で、ＴＦ１細胞の増殖が５０％阻害される。ＴＦ１細胞はＩＬ−４に対してより感受性であり、ＩＬ−４は、ＴＦ１細胞の増殖を刺激し、約０．０２ｎＭの濃度で最大半分増殖である。濃度１０ｎＭのＩＬ−４Ｒα．ＩＬ−１３Ｒα１．ＦｃまたはＩＬ−１３Ｒα１．ＩＬ−４Ｒα．Ｆｃいずれかの添加により、約１ｎＭまで、ＩＬ−４誘導性増殖がブロックされる（図３４）。約３〜４ｎＭのＩＬ−４濃度で、ＴＦ１細胞の増殖が５０％阻害される。これらの結果は、濃度１０ｎＭのＩＬ−４Ｒα．ＩＬ−１３Ｒα１．ＦｃおよびＩＬ−１３Ｒα１．ＩＬ−４Ｒα．Ｆｃは両方とも、ＩＬ−１３およびＩＬ−４の両方が細胞性応答を刺激する能力をブロックし得ることを示す。
【０１３０】
（実施例１４．ＩＬ−１トラップによる、注入されたＩＬ−１のインビボでのブロック）
ＩＬ−１は、プロ炎症性サイトカインである。ＩＬ−１の全身投与は、動物において急性応答（一過性高血糖症、低インスリン血症（ｈｙｐｏｉｎｓｕｌｉｎｅｍｉａ）、発熱、食欲不振、およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）の血清レベルの増加を含む）を惹起することが示されている（Ｒｅｉｍｅｒｓ、１９９８）。マウスはマウスＩＬ−１およびヒトＩＬ−１の両方に応答性であるので、ヒトＩＬ−１を使用し得、そしてヒト特異的ＩＬ−１アンタゴニストのインビボ結合効果を評価し得る。この急性マウスモデルを使用して、ヒトＩＬ−１トラップが、内因性投与されたヒトＩＬ−１のインビボ効果と拮抗する能力を決定した。これは、このヒトＩＬ−１トラップのインビボでの効力の迅速な指標を提供し、そしてこれを、分子選択を補助するためのアッセイとして使用し得る。
【０１３１】
（実験設計）
マウスに、ヒトＩＬ−１（０．３μｇ／ｋｇ）の皮下注射を行った。ヒトＩＬ−１注射の２４時間前に、この動物を、ビヒクルまたは１５０倍モル過剰のヒトＩＬ−１トラップ（０．５４ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで事前処理した。屠殺の２時間前（２６時間）に、このマウスに、ヒトＩＬ−１（０．３μｇ／ｋｇ）の２回目の注射を行った。血液サンプルを種々の時点で収集し、そして血清をＩＬ−６レベルについてアッセイした。
【０１３２】
（結果）
ヒトＩＬ−１の内因性投与は、血清ＩＬ−６レベルの劇的な誘導を生じた。１５０倍モル過剰で、ヒトＩＬ−１トラップは、ＩＬ−６の増加を完全にブロックした（図３５）。さらに、このヒトＩＬ−１トラップの効果は、少なくともさらに２４時間の間持続し、ＩＬ−１を再投与した場合でさえＩＬ−６の増加を妨げた（図３５）。このような長期間持続する効力は、ＩＬ−１トラップの毎日の注射が、長期の適用に必要でないかもしれないことを示唆する。
【０１３３】
（実施例１５：ＩＬ−４トラップがカニクイザルにおいてヒトＩＬ−４に対する生理学的応答をブロックする能力の評価）
ヒトＩＬ−４の全身投与が、カニクイザルにおいて全身応答を惹起した（Ｇｕｎｄｅｌら、１９９６）。従って、ヒトＩＬ−４をブロックする際のＩＬ−４トラップの有効性を、これらに応答を測定することによって示し得る。
【０１３４】
（実験設計）
この実験は、３つのパートからなる：ヒトＩＬ−４＋ビヒクル（パート１）、ヒトＩＬ−４＋ＩＬ−４トラップ（パート２）、およびヒトＩＬ−４＋ビヒクル（パート３）。ヒトＩＬ−４（２５μｇ／ｋｇ）を１日２回、４日間皮下注射し、そしてＩＬ−４トラップ（８ｍｇ／ｋｇ）およびビヒクルを５日間毎日静脈に与えた。このＩＬ−４トラップの注射は、ヒトＩＬ−４投与の１日前に始めた。全血を毎日、ＣＤ１６についてのフローサイトメトリー分析のために収集し、そして血漿を得て、サイトカイン単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）についてアッセイした。ＣＤ１６およびＭＣＰ−１は、ヒトおよびサルの両方におけるＩＬ−４媒介性炎症のマーカーである。
【０１３５】
（結果）
ヒトＩＬ−４の存在下で、ＭＣＰ−１は２．５倍増加し、そしてＩＬ−４トラップにより有意にブロックされた（図３６Ａ）。同様に、末梢血におけるＣＤ１６陽性リンパ球の存在の減少が、ＩＬ−４トラップにより減弱された（図３６Ｂ）。休息期間の後、このサルにヒトＩＬ−４を再び注射し、そしてヒトＩＬ−４に対するこの動物の応答性を再確認した（図３６Ａおよび３６Ｂ）。このことは、ＭＣＰ−１応答およびＣＤ１６応答の阻害がＩＬ−４トラップにより有意に媒介されることを示唆した。
【０１３６】
（実施例１６：ＩＬ−４誘導性ＩｇＥ分泌に対するＩＬ−４トラップの効果）
抗マウスＩｇＤ抗体の注射が、正常なマウスにおいてＩＬ−４媒介性のＩｇＥ増加を刺激することが示された。このモデルは、ＩＬ＝４アンタゴニスト（例えば、可溶性ＩＬ−４レセプターおよび抗ＩＬ−４モノクローナル抗体）を評価するために広範に使用されている（Ｓａｔｏら、１９９３）。本発明者らは、このモデルを使用して、このＩＬ−４トラップがＩｇＥのＩＬ−４媒介性増加をブロックするか否かの能力を評価することを決定した。
【０１３７】
（実験設計）
抗マウスＩｇＤ（１００μｌ／マウス、皮下）を注射したＢＡＬＢ／Ｃマウスを無作為に３群に分けた。各々に、ビヒクル、マウスＩＬ−４トラップ（１ｍｇ／ｇ、皮下）、またはマウスＩＬ−４に対するモノクローナル抗体（１ｍｇ／ｋｇ、皮下）のいずれかを与えた（３〜５日目）。血清を種々の時点で収集し、そしてＩｇＥレベルについてアッセイした。
【０１３８】
（結果）
マウスＩＬ−４トラップまたはマウスＩＬ−４抗体での処理は、両方とも、このマウスモデルにおいて、ＩＬ−４媒介性ＩｇＥ増加と有意に拮抗した（図３７）。これは、このマウスＩＬ−４トラップがマウスＩＬ−４に結合し、そして内因性ＩＬ−４によりインビボで惹起される生理学的応答と拮抗することを示唆する。
【０１３９】
本発明は、本明細書中に記載される特定の実施態様により範囲が制限されるべきではない。実際、本明細書中に記載されるものに加えての種々の改変が、上記の説明および添付の図面から、当業者に明らかになる。このような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、一般的なサイトカインレセプターのモデルにおけるレセプター成分の結合を順序付けて示す。このモデルは、サイトカインが、３つまでのレセプター結合部位を含み、かつ任意のα成分を最初に結合し、次いでβ１に結合し、次いでβ２に結合することにより、それらのレセプター成分と相互作用することを示す。多くのサイトカインレセプターについてのβ成分は、細胞質タンパク質チロシンキナーゼのＪａｋ／Ｔｙｋファミリーと、膜基部（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｒｅｇｉｏｎ）（斜線の四角）を通じて相互作用する。β成分およびＪａｋ／Ｔｙｋキナーゼのチロシンのリン酸化（Ｐ）により図式化されるように、β成分の二量体化の際にのみ、シグナル伝達が開始される。
【図２】 図２は、ＣＮＴＦが、ＩＬ６Ｒα、ｇｐ１３０、ＣＮＴＦＲαを発現するが、ＬＩＦＲβを発現しないＰＣ１２細胞株（ＰＣ１２Ｄと呼ぶ）におけるＩＬ−６応答を阻害することを示す。無血清の（ｓｅｒｕｍ−ｄｅｐｒｉｖｅｄ）ＰＣ１２Ｄ細胞を、示されるように、ＣＮＴＦの存在下または非存在下でＩＬ−６（５０ｍｇ／ｍｌ）を加えてインキュベートした。いくつかのプレートもまた、示されるように、可溶性ＩＬ６Ｒα（１ｍｇ／ｍＬ）または可溶性ＣＮＴＦＲα（１ｍｇ／ｍＬ）を与えた。細胞溶解物を、抗ｇｐ１３０による免疫沈降に供し、そして抗ホスホチロシンを用いてイムノブロットした。ｇｐ１３０のチロシンのリン酸化は、ＣＮＴＦの同時添加の際にブロックされる、ＩＬ−６レセプター系のＩＬ−６誘導活性化を示す。
【図３】 図３は、ＰＣ１２Ｄ細胞上のヨウ素化ＣＮＴＦ結合のスキャッチャード分析を示す。ＰＣ１２Ｄ細胞を、特異的な結合を決定するために、過剰の非放射性競合物の存在下または非存在下で、種々の濃度のヨウ素化ＣＮＴＦと共にインキュベートした。この図は、特異的に結合したヨウ素化ＣＮＴＦの量のスキャッチャードプロットを示し、そして９ｐＭおよび３．４ｎＭの解離定数を有する２つの結合部位と合致するデータを与える。
【図４】 図４は、ヒトｇｐ１３０−Ｆｃ−Ｈｉｓ₆のアミノ酸配列を示す。アミノ酸１〜６１９は、ヒトｇｐ１３０（Ｈｉｂｉら、Ｃｅｌｌ ６３：１１４９−１１５７（１９９０））に由来する。アミノ酸番号２が、コードＤＮＡ配列におけるコザック配列に適応するために、ＬｅｕからＶａｌに変化していることに注意のこと。ｇｐ１３０−Ｆｃ−Ｈｉｓ６のシグナルペプチドを斜体にしている（アミノ酸１〜２２）。Ｓｅｒ−Ｇｌｙ架橋を、太字で示す（アミノ酸６２０、６２１）。アミノ酸６６２〜８５３は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン（Ｌｅｗｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２８２９−２８３８（１９９３））に由来する。（＋）により、２つのＦｃドメインを連結する鎖間ジスルフィド架橋を形成するＦｃの前のＩｇＧヒンジの２つのシステイン（アミノ酸番号６３２および６３５）に印を付ける。ヘキサヒスチジン（ｈｉｓｔｉｎｅ）タグを、太字／斜体で示す（アミノ酸番号８５４〜８５９）。（・）は、停止コドンの位置を示す。
【図５】 図５は、ヒトＩＬ−６Ｒα−Ｆｃのアミノ酸配列を示す。鍵となる：アミノ酸１〜３５８は、ヒトＩＬ−６Ｒα（Ｙａｍａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：８２５−８２８（１９９８））に由来する。アミノ酸番号２が、コードＤＮＡ配列におけるコザック配列に適応するために、ＬｅｕからＶａｌに変化していることに注意のこと。ＩＬ−６Ｒα−Ｆｃのシグナルペプチド（アミノ酸１〜１９）は、斜体にしている。Ａｌａ−Ｇｌｙ架橋を、太字で示す（アミノ酸３５９、３６０）。アミノ酸３６１〜５９２は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン（Ｌｅｗｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２８２９−２８３８（１９９３））に由来する。（＋）により、２つのＦｃドメインを連結する鎖間ジスルフィド架橋を形成するＦｃの前のＩｇＧヒンジの２つのシステイン（アミノ酸番号３７１および３７４）に印を付ける。（・）は、停止コドンの位置を示す。
【図６】 図６は、ＣＮＴＦ／ＩＬ−６／ＩＬ−１１レセプター系を示す。６量体シグナル伝達レセプター複合体の順序付けられた形成を、概略的に示す。サイトカインは、Ｒαと会合して、不可欠なサイトカイン・Ｒα複合体（Ｋｄは約５ｎＭである）を形成する。次いで、この低親和性複合体は、最初のシグナル伝達成分（β１と印を付けた）と会合し、高親和性サイトカイン・Ｒα・β１複合体（Ｋｄは約１０ｐＭである）を形成する。ＩＬ−６Ｒαの場合では、この成分はｇｐ１３０である。この三量体高親和性複合体は、次いで、別のこのような複合体と会合する。この複合体の形成は、シグナル伝達を生じる。なぜならば、それは２つのシグナル伝達成分（それぞれ、β１およびβ２と印を付けた）の二量体化を伴うからである（（Ｗａｒｄら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６９：２３２８６−２３２８９（１９９４）；ＳｔａｈｌおよびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２５：１４５４−１４６６（１９９４）；ＳｔａｈｌおよびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃｅｌｌ ７４：５８７−５９０（１９９３））から適応される）。
【図７】 図７は、ＩＬ−６についてのヘテロ二量体レセプターに基づくリガンドトラップの設計を示す。このヘテロ二量体リガンドトラップは、２つのジスルフィド間連結したタンパク質（ｇｐ１３０−ＦｃおよびＩＬ−６Ｒα−Ｆｃ）から構成される。ｇｐ１３０−Ｆｃ・ＩＬ−６Ｒα−Ｆｃ複合体（上部パネル）は、高親和性サイトカイン・Ｒα・β１複合体（下部パネル）を模倣することが示される。このリガンドトラップは、ＩＬ−６を隔離することによりアンタゴニストとして機能し、従ってＩＬ−６−応答性細胞上でネイティブなレセプターと相互作用することに利用できないようにする。
【図８】 図８は、ヘテロマーイムノグロブリン重鎖／軽鎖レセプター融合体を示す。重鎖／軽鎖レセプター融合分子の例を、概略的に示す。ｇｐ１３０の細胞外ドメインは、Ｃγに融合するのに対して、ＩＬ−６Ｒαの細胞外ドメインは、κ鎖の定常領域（κ）に融合される。この鎖間ジスルフィド架橋（Ｓ−Ｓ）もまた示す。
【図９】 図９は、ｇｐ１３０−Ｃγ１のアミノ酸配列を示す。鍵となる：アミノ酸１〜６１９は、ヒトｇｐ１３０（Ｈｉｂｉら、Ｃｅｌｌ ６３：１１４９−１１５７（１９９０））に由来する。Ｓｅｒ−Ｇｌｙ架橋を、太字で示す。アミノ酸６６２〜６５１は、ヒトＩｇＧ１の定常領域（Ｌｅｗｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２８２９−２８３８（１９９３））に由来する。（＊）は、停止コドンの位置を示す。
【図１０】 図１０は、ｇｐ１３０Δ３ｆｉｂｒｏのアミノ酸配列を示す。鍵となる：アミノ酸１〜３３０は、ヒトｇｐ１３０（Ｈｉｂｉら、Ｃｅｌｌ ６３：１１４９−１１５７（１９９０））に由来する。他の記号は、図９に記載されるとおりである。
【図１１】 図１１は、Ｊ−ＣＨ１のアミノ酸配列を示す。鍵となる：Ｓｅｒ−Ｇｌｙ架橋を、太字で示す。Ｊ−ペプチドを斜体で示す。ＣＨ１ドメインに下線を付す。
【図１２】 図１２は、Ｃγ４のアミノ酸配列を示す。鍵となる：Ｓｅｒ−Ｇｌｙ架橋を、太字で示す。アミノ酸２〜２３９は、Ｃγ４配列を含む。
【図１３】 図１３は、κドメインのアミノ酸配列を示す。鍵となる：Ｓｅｒ−Ｇｌｙ架橋を、太字で示す。アミノ酸２〜１０８は、κドメインを含む。Ｃ末端システイン（アミノ酸１０８）は、κドメインとＣγのＣＨ１ドメインとのジスルフィド結合に関与するものである。
【図１４】 図１４は、λドメインのアミノ酸配列を示す。鍵となる：Ｓｅｒ−Ｇｌｙ架橋を、太字で示す。アミノ酸２〜１０６は、λドメインを含む（Ｃｈｅｕｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：６７１４−６７２０（１９９２））。Ｃ末端システイン（アミノ酸１０６）は、λドメインとＣγのＣＨ１ドメインとのジスルフィド結合に関与するものである。
【図１５】 図１５は、可溶性ＩＬ−６Ｒαドメインのアミノ酸配列を示す。鍵となる：アミノ酸１〜３５８は、可溶性ＩＬ−６Ｒαドメインを含む（Ｙａｍａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：８２５−８２８（１９８８））。Ａｌａ−Ｇｌｙ架橋を、太字で示す。
【図１６】 図１６は、可溶性ＩＬ−６Ｒα３１３ドメインのアミノ酸配列を示す。鍵となる：アミノ酸１〜３１３は、短縮したＩＬ−６Ｒαドメイン（ＩＬ−６Ｒα３１３）を含む。Ｔｈｒ−Ｇｌｙ架橋を、太字で示す。
【図１７】 図１７は、ｇｐ１３０−Ｃγ１・ＩＬ−６Ｒα−κの精製を示す。４％〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲルは、非還元条件下で泳動した。タンパク質を、銀による染色によって可視化した。レーン１：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により精製した約１００ｎｇの物質。レーン２分子サイズ標準（Ａｍｅｒｓｈａｍ）。レーン３：ＩＬ−６アフィニティークロマトグラフィー工程によるさらなる精製の後に本明細書で示される、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａで精製した物質。ｇｐ１３０−Ｃγ１二量体［（ｇｐ１３０−Ｃγ１）₂］、１つのＩＬ−６Ｒα−κと会合したｇｐ１３０−Ｃγ１二量体［（ｇｐ１３０−Ｃγ１）₂・（ＩＬ−６Ｒα−κ）₁］、および２つのＩＬ−６Ｒα−κと会合したｇｐ１３０−Ｃγ１二量体［（ｇｐ１３０−Ｃγ１）₂・（ｇｐ１３０−Ｃγ１）₂］の位置を、示し、ならびに分子サイズ標準についてのサイズを、キロダルトン（２００、１００、および４６）で示す。
【図１８】 図１８は、ＩＬ−６が、リガンドトラップからゆっくりと解離することを示す。重鎖／軽鎖レセプターに基づくリガンドトラップ（ｇｐ１３０−Ｃγ１・ＩＬ−６Ｒα−κ）からのＩＬ−６の解離速度を、中和モノクローナル抗体Ｂ−Ｅ８（ＢＥ８ ＭＡｂ）によって得た解離速度と比較した。
【図１９】 図１９は、ＩＬ−６が、リガンドトラップの多量体化を誘導し得ることを示す。（Ａ）２つの異なるリガンドトラップを概略的に示し、そしてプロテインＡに結合するそれらの能力に従って列挙する。ｇｐ１３０−Ｆｃ・ＩＬ-６Ｒα−Ｆｃ（ＧＦ６Ｆ）が、そのＦｃドメインを介してプロテインＡに結合するのに対して、ｇｐ１３０−ＣＨ１・ＩＬ−６Ｒα−κ（Ｇ１６Ｋ）は、プロテインＡに結合しない。（Ｂ）印を付けた、ＧＦ６Ｆ±ＩＬ−６、Ｇ１６Ｋ±ＩＬ−６、またはＧＦ６ＦおよびＧ１６Ｋ±ＩＬ−６の混合物からＰｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈殿させたタンパク質の抗κウエスタンブロット。
【図２０】 図２０は、ＩＬ−６依存性ＸＧ−１細胞増殖の阻害を示す。ＸＧ−１細胞［Ｚｈａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ８３：３６５４−３６６３（１９９４）］を、増殖アッセイのために、ＩＬ−６由来の細胞を５時間飢餓させることによって、調製した。アッセイを、ＲＰＭＩ＋１０％ウシ胎仔血清＋ペニシリン／ストレプトマイシン＋０．０５０ｎＭ ２−メルカプトエタノール＋グルタミン中、９６ウェル組織培養皿に配置した。１ウェルあたり０．１ｍｌのこの培地を使用した。細胞を、アッセイの開始に１ｍｌあたり２５０，０００の密度で懸濁した。ＩＬ−６±リガンドトラップまたは抗体の添加の７２時間後、ＭＴＴアッセイを、記載（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：５８１３−５８１８（１９９４））のように行った。利用された異なるリガンドトラップを列挙する。
【図２１】 図２１Ａ〜２１Ｄ：４２４と命名された、サイトカインＩＬ−４を結合して非機能性複合体を形成し得る融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列。
【図２２】 図２２Ａ〜２２Ｄ：６０３と命名された、サイトカインＩＬ−４を結合して非機能性複合体を形成し得る融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列。
【図２３】 図２３Ａ〜２３Ｄ：６２２と命名された、サイトカインＩＬ−４を結合して非機能性複合体を形成し得る融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列。
【図２４】 図２４Ａ〜２４Ｆ：４１２と命名された、サイトカインＩＬ−６を結合して非機能性複合体を形成し得る融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列。
【図２５】 図２５Ａ〜２５Ｆ：６１６と命名された、サイトカインＩＬ−６を結合して非機能性複合体を形成し得る融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列。
【図２６】 図２６Ａ〜２６Ｅ：５６９と命名された、サイトカインＩＬ−１を結合して非機能性複合体を形成し得る融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列。
【図２７】 図２７：４ＳＣ３７５と命名された、ＩＬ−２Ｒγ−ｓｃｂ−ＩＬ４Ｒα−ＦｃΔＣ１の融合ポリペプチドであるＩＬ−４トラップが、ＴＦ１細胞バイオアッセイにおいて、ＩＬ４ＲαＦｃΔＣ１単独よりもＩＬ−４アンタゴニストとして数倍の大きさでより良好であることを示す。
【図２８】 図２８：４ＳＣ３７５と命名されたＩＬ−４トラップが、ＩＬ−４Ｒα成分を豊富にもつＩＬ−２Ｒγ成分を有するＩＬ−２Ｒγ−ＩＬ４Ｒα−ＦｃΔＣ１の融合ポリペプチドである４ＳＣ４２４と命名されたＩＬ−４トラップ（図２１Ａ〜２１Ｄに記載）と等価に、ＴＦ１細胞バイオアッセイにおいてアンタゴニスト活性を表すことを示す。
【図２９】 図２９：図２４Ａ〜２４Ｆに記載されたＩＬ６トラップ（６ＳＣ４１２ ＩＬ６Ｒ−ｓｃｂ−ｇｐｘ−ＦｃΔＣ１）が、ヒトＩｌ−６−ＢＥ８に対するモノクローナル中和抗体よりも、ＸＧ１バイオアッセイにおいてＩＬ−６の良好なアンタゴニストであることを示す。
【図３０】 図３０：トラップ１ＳＣ５６９（図２６Ａ〜２６Ｅに記載）が、ＩＬ−１の効果と拮抗し得、そしてＩＬ−１での処置の際に、ＭＲＣ５細胞からのＩＬ−６産生をブロックし得ることを示す。
【図３１】 図３１Ａ〜３１Ｇ：ＩＬ−４Ｒα．ＩＬ−１３Ｒα１．Ｆｃ単鎖トラップ構築物のヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。
【図３２】 図３２Ａ〜３２Ｇ：ＩＬ−１３Ｒα１．ＩＬ−４Ｒα．Ｆｃ単鎖トラップ構築物のヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。
【図３３】 図３３：ＩＬ−４Ｒα．ＩＬ−１３Ｒα１．ＦｃおよびＩＬ−１３Ｒα１．ＩＬ−４Ｒα．ＦｃによるＩＬ−１３のブロッキング。１０ｎＭの濃度での、ＩＬ−４Ｒα．ＩＬ−１３Ｒα１．ＦｃトラップまたはＩＬ−１３Ｒα１．ＩＬ−４Ｒα．Ｆｃトラップのいずれかの添加は、約２ｎＭまでＩＬ−１３誘導増殖をブロックする。約４〜５ｎＭのＩＬ−１３濃度で、ＴＦ１細胞の増殖を５０％阻害する。
【図３４】 図３４：ＩＬ−４Ｒα．ＩＬ−１３Ｒα１．ＦｃおよびＩＬ−１３Ｒα１．ＩＬ−４Ｒα．ＦｃによるＩＬ−４のブロッキング。１０ｎＭの濃度での、ＩＬ−４Ｒα．ＩＬ−１３Ｒα１．ＦｃまたはＩＬ−１３Ｒα１．ＩＬ−４Ｒα．Ｆｃのいずれかの添加は、約１ｎＭまでＩＬ−４誘導増殖をブロックする。約３〜４ｎＭのＩＬ−４濃度で、ＴＦ１細胞の増殖を５０％阻害する。
【図３５】 図３５：ヒトＩＬ−１トラップは、外因的に投与されたｈｕＩＬ−１のインビボ効果をブロックする。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、時間０でｈｕＩＬ−１（０．３μｇ／ｋｇ）の皮下注射を与えた。ｈｕＩＬ−１注射の２４時間前に、ビヒクルまたは１５０倍モル濃度過剰ｈｕＩＬ−１トラップのいずれかで動物を前処置した。屠殺（２６時間）の２時間前に、このマウスを、ｈｕＩＬ−１の二次接種（０．３μｇ／ｋｇ、皮下）で再チャレンジした。血液サンプルを種々の時点で回収し、そして血清をＩＬ−１レベルについてアッセイした（平均±ＳＥＭ；１群あたりｎ＝５として表す）。
【図３６】 図３６Ａおよび図３６Ｂ：ヒトＩＬ−４トラップは、サルにおいてヒトＩＬ−４の効果と拮抗する。図３６Ａ：示されるように、カニクイザルを３つのパートで処置した。ヒトＩＬ−４（２５μｇ／ｋｇ）を４日間、毎日２回皮下注射し、そしてヒトＩＬ−４トラップ（８ｍｇ／ｍｌ）およびビヒクルを５日間（ヒトＩＬ−４投与の１日前に開始する）、毎日静脈内に与えた。血漿を毎日回収し、そしてＭＣＰ−１レベルをアッセイした。結果を、平均±ＳＥＭ；ｎ＝４として表した。（ＡＮＯＶＡ ｐ＜０．０００７；Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ：パート２対パート１、ｐ，０．０５；パート２対パート３、ｐ，０．０５；パート１対パート３、有意でない）。図３６Ｂ：示されるように、カニクイザルを３つのパートで処置した。ヒトＩＬ−４（２５μｇ／ｋｇ）を４日間、毎日２回皮下注射し、そしてヒトＩＬ−４トラップ（８ｍｇ／ｍｌ）およびビヒクルを５日間（ヒトＩＬ−４投与の１日前に開始する）、毎日静脈内に与えた。ＣＤ１６についてのフローサイトメトリー分析のために、全血を毎日回収した。結果を、平均±ＳＥＭ；ｎ＝４として表した。（ＡＮＯＶＡ ｐ＜０．０４２；Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ：パート２対パート１、ｐ＜０．０５；パート２対パート３およびパート１対パート３、有意でない）。
【図３７】 図３７：マウスＩＬ−４トラップは、マウスにおいてＩＬ−４媒介性ＩｇＥ増加を部分的に予防した。抗マウスＩｇＤ（１００μｌ／マウス、皮下）で注射されたＢＡＬＢ／Ｃマウスを無作為に３群に分け、各々（３〜５日目に）ビヒクル、マウスＩＬ−４トラップ（１ｍｇ／ｋｇ、皮下）、またはマウスＩＬ−４に対するモノクローナル抗体（１ｍｇ／ｋｇ、皮下）のいずれかを受けた。血清を種々の時点で回収し、そしてＩｇＥレベルについてアッセイした。結果を、平均±ＳＥＭ（１群あたりｎ＝５）として表した。（ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．０００２；Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ：ビヒクル対ＩＬ−４トラップ，ｐ＜０．０１；ビヒクル対ＩＬ−４抗体、ｐ＜０．００１；ＩＬ−４トラップ対ＩＬ−４抗体、有意でない）。

Claims (23)

1. 融合ポリペプチドをコードする単離された核酸分子であって、該融合ポリペプチド分子が、以下の融合ポリペプチド成分：
   ａ）サイトカインレセプターの特異性決定成分の細胞外ドメインのサイトカイン結合部分；
   ｂ）サイトカインレセプターのシグナル伝達成分の細胞外ドメインのサイトカイン結合部分；および
   ｃ）多量体化成分、
   を含み、
   該多量体化成分（ｃ）は、該融合ポリペプチドの多量体を形成するように該融合ポリペプチドの別のものに含まれる多量体化成分（ｃ）と多量体化し；
   該多量体は、サイトカインに結合して、非機能性サイトカイン／多量体複合体を形成し、ここで該サイトカインは、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）からなる群より選択される、
   単離された核酸分子。
2. 請求項１に記載の単離された核酸分子であって、前記サイトカインはＩＬ−４であり、前記融合ポリペプチドの成分（ａ）が、ＩＬ−４Ｒの細胞外ドメインのＩＬ−４結合部分を含み、そして成分（ｂ）が、ＩＬ−２Ｒγの細胞外ドメインのＩＬ−４結合部分を含む、単離された核酸分子。
3. 請求項１に記載の単離された核酸分子であって、前記サイトカインはＩＬ−４であり、前記融合ポリペプチドの成分（ａ）および（ｂ）が、ＩＬ−１３Ｒα１の細胞外ドメインのサイトカイン結合部分およびＩＬ−４Ｒαの細胞外ドメインのサイトカイン結合部分を含み、そして前記多量体が、ＩＬ−１３にも結合する、単離された核酸分子。
4. 請求項１に記載の単離された核酸分子であって、前記サイトカインはＩＬ−１であり、前記融合ポリペプチドの成分（ａ）がＩ型ＩＬ−１Ｒの細胞外ドメインのＩＬ−１結合部分を含み、そして成分（ｂ）がＩＬ−１Ｒ ＡｃＰの細胞外ドメインのＩＬ−１結合部分を含む、単離された核酸分子。
5. 請求項１に記載の単離された核酸分子であって、前記サイトカインはＩＬ−１であり、前記融合ポリペプチドの成分（ａ）がＩＩ型ＩＬ−１Ｒの細胞外ドメインのＩＬ−１結合部分を含み、そして成分（ｂ）がＩＬ−１Ｒ ＡｃＰの細胞外ドメインのＩＬ−１結合部分を含む、単離された核酸分子。
6. 請求項１に記載の単離された核酸分子であって、前記サイトカインはＩＬ−６であり、成分（ａ）がＩＬ６ＲａのＩＬ−６結合部分を含み、そして成分（ｂ）がｇｐ３０のＩＬ−６結合部分を含む、単離された核酸分子。
7. 前記多量体が二量体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
8. 前記多量体化成分が免疫グロブリン由来ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
9. 請求項８に記載の単離された核酸分子であって、前記免疫グロブリン由来ドメインが、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＩｇＧの重鎖、およびＩｇＧの軽鎖から選択される、単離された核酸分子。
10. 前記成分（ａ）をコードするヌクレオチド配列が、前記成分（ｂ）をコードするヌクレオチド配列の上流にある、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸分子。
11. 前記成分（ａ）をコードするヌクレオチド配列が、前記成分（ｂ）をコードするヌクレオチド配列の下流にある、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸分子。
12. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸分子によりコードされる２以上の融合ポリペプチドを含む多量体であって、該多量体は、サイトカインと結合して、非機能性サイトカイン／多量体複合体を形成する、多量体。
13. 前記多量体が二量体であり、前記融合ポリペプチドの２つを含む、請求項１２に記載の多量体。
14. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
15. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸分子を含む発現ベクターであって、該核酸分子が発現制御配列に作動可能に連結される、発現ベクター。
16. 融合ポリペプチドの生成のための宿主−ベクター系であって、宿主細胞中に請求項１５に記載の発現ベクターを含む、宿主−ベクター系。
17. 前記宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、請求項１６に記載の宿主−ベクター系。
18. 前記宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉ、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、ＢＨＫ細胞またはＮＳ０細胞である、請求項１６に記載の宿主−ベクター系。
19. 請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の宿主−ベクター系の細胞を、融合ポリペプチドの生成を可能にする条件下で増殖させる工程、およびそのように生成した融合ポリペプチドを回収する工程を包含する、融合ポリペプチドを生成するための方法。
20. 請求項１９に記載の方法であって、前記融合ポリペプチドが、請求項１２に記載されるように融合ポリペプチドの多量体を形成することを可能にする工程をさらに包含する、方法。
21. 請求項２５に記載の方法であって、前記多量体が請求項１８に規定される２量体である、方法。
22. ヒトまたは動物の身体の処置における使用のための、請求項１２または請求項１３に記載の多量体。
23. ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−６およびＩＬ−１３に関連する疾患または障害の処置のための医薬品の製造における、請求項１２または請求項１３に記載の多量体の使用。

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