DE69922269T2

DE69922269T2 - IL-1 Rezeptor Fusionsproteine verwendet als Antagoniste und Verfahren zu deren Verwendung und Herstellung

Info

Publication number: DE69922269T2
Application number: DE69922269T
Authority: DE
Inventors: George D. Yorktown Heights Yancopoulos; Neil Carmel Stahl
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1998-09-25
Filing date: 1999-09-22
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2019-09-23
Also published as: ATE336583T1; NO20011513L; NZ510720A; HK1045847B; AU758970C; FR10C0025I1; US20020164690A1; ES2267300T3; CA2345109A1; DK1229047T3; IL142103A; JP2002525119A; WO2000018932A3; CA2345109C; DE122010000023I1; DE69932832T2; CN100345970C; US20020012962A1; NO2011003I1; EP1405915A1

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft IL-1-Rezeptor-Fusionsproteine, die als Antagonisten von IL-1 Verwendung finden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In WO93/19777 werden Fusionsproteine bereitgestellt, die ein Tumornekrosefaktor-Rezeptor-(TNF-R)-Polypeptid und zumindest ein weiteres Polypeptid umfassen, ausgewählt aus einem Interleukin-1 (IL-1R) und einem zweiten TNF-R-Polypeptid. In WO98/08969 wird ein lösliches Interleukin-1-Rezeptor-Hilfsmolekül-(IL-1R AcM)-Protein bereitgestellt, welches ein Mitglied der Ig-Superfamilie ist, zusammen mit isolierten Nukleinsäure-Molekülen, die für humanes IL-1R AcM codieren, als auch Vektoren, Wirtszellen und rekombinante Methoden zur Erzeugung des Proteins. In WO97/31010 wird ein Rezeptorprotein bereitgestellt, bezeichnet als 2F1, dessen Aminosäure sequenz besagtermaßen anzeigt, dass es ein Mitglied der IL-1-Rezeptorfamilie ist. In EP-A-0 460 846 werden Typ-II-Interleukin-1-Rezeptorproteine, DNAs und Expressionsvektoren bereitgestellt, die für Typ I-IL-R codieren, und Verfahren zur Erzeugung von Typ II-IL-1R als Produkte einer rekombinanten Zellkultur.
Außerdem wird in WO95/11303 ein Cytokin-antagonistisches Protein bereitgestellt, das zum Binden eines Cytokins zum Erhalt eines nicht-funktionellen Komplexes fähig ist, umfassend die lösliche Spezitäts-bestimmende α-Komponente des Cytokin-Rezeptors, und eine extrazelluläre Domäne einer β-Komponente de Cytokin-Rezeptors.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt ein isoliertes Nukleinsäure-Molekül bereit, das für ein Fusionspolypeptid codiert, welches Fusionspolypeptid die folgenden Fusionspolypeptid-Komponenten umfasst:

(a) einen Interleukin-1-(IL-1)-bindenden Abschnitt der extrazellulären Domäne der Spezifitäts-bestimmenden Komponente eines IL-1-Rezeptors;
(b) einen IL-1-bindenden Abschnitt einer extrazellulären Domäne der Signalübertragenden Komponente des IL-1-Rezeptors; und
(c) eine multimerisierende Komponente;

KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: Angeordnete Bindung von Rezeptorkomponenten in einem Modell eines generischen Cytokin-Rezeptors. Das Modell zeigt, dass die Cytokine bis zu drei Rezeptor-Bindungsstellen enthalten und mit ihren Rezeptor-Komponenten wechselwirken, indem zunächst die optionale α-Komponente gebunden wird, gefolgt von der Bindung an β1, und dann an β2. Die β-Komponenten für viele Cytokin-Rezeptoren wechselwirken durch Membran-proximale Regionen (schraffierte Boxen) mit der Jak/Tyk-Familie der Tyrosinkinasen von zytoplasmatischem Protein. Die Signaltransduktion wird lediglich auf die Dimerisation der β-Komponenten hin initiiert, wie durch die Tyrosinphosphorylierungen (P) der β-Komponenten und der Jak/Tyk-Kinasen schematisch dargestellt.
2A–2E: Nukleotidsequenz-Codierung und abgeleitete Aminosäuresequenz des Fusionspolypeptids, bezeichnet als 569, welches zum Binden des Cytokin IL-1 zur Bildung eines nicht-funktionellen Komplexes fähig ist.
3: Zeigt, dass die 1SC569-Trap (beschrieben in 2A–2E) zum Antagonisieren der Wirkungen von IL-1 und Blockieren der IL-6-Produktion von MRC5-Zellen auf die Behandlung mit IL-1 hin fähig ist.
4: Humane IL-1-Trap blockiert die in vivo-Wirkungen von exogen verabreichtem huIL-1. BALB/c-Mäuse erhielten eine subkutane Injektion von huIL-1 (0,3 μg/kg) zum Zeitpunkt 0. Vierundzwangzig Stunden vor der huIL-1-Injektion wurden die Tiere entweder mit Vehikel oder einem 150-fachen molaren Überschuss an huIL-1-Trap vorbehandelt. Zwei Stunden vor der Opferung (26 Stunden) wurden die Mäuse nochmals mit einer zweiten Injektion von huIL-1 (0,3 μg/kg, s.c.) provoziert. Die Blutproben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und die Seren auf die IL-1-Mengen untersucht (ausgedrückt als Mittelwert +/– SEM; n = 5 pro Gruppe).
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ein isoliertes Nukleinsäure-Molekül, das für ein Fusionspolypeptid codiert, welches Fusionspolypeptid die folgenden Fusionspolypeptid-Komponenten umfasst:

Mit " IL-1-bindendem Abschnitt" ist der minimale Abschnitt der extrazellulären Domäne gemeint, der zum Binden von IL-1 erforderlich ist. Unter den Fachleuten des Gebiets ist allgemein anerkannt, dass eine definierende Charakteristik eines Cytokin-Rezeptors das Vorhandensein der beiden Fibronektin-artigen Domänen, die kanonische Cysteine enthalten, und der WSXWS-Box ist (Bazan, J.F., 1990, PNAS 87: 6934–6938). Die Sequenzen, die für die extrazellulären Domänen der bindenden Komponente des IL-1-Rezeptors und der Signal-übertragenden Komponente des IL-1-Rezeptors codieren, können ebenfalls zur Schaffung des Fusionspolypeptids der Erfindung verwendet werden. In ähnlicher Weise können längere Sequenzen, die für größere Abschnitte der Komponenten des IL-1-Rezeptors codieren, verwendet werden. Allerdings wird überlegt, dass kleinere Fragmente als die extrazelluläre Domäne dahingehend wirken, IL-1 zu binden, weshalb die Erfindung Fusionspolypeptide betrifft, die den minimalen Abschnitt der extrazellulären Domäne umfassen, der zum Binden von IL-1 als dem IL-1-bindenden Abschnitt erforderlich ist.
Die Erfindung umfasst eine "Spezifitäts-bestimmende Komponente" eines IL-1-Rezeptors und eine "Signal-transduzierende Komponente" des IL-1-Rezeptors. Unabhängig von der verwendeten Nomenklatur zur Bezeichnung einer bestimmten Komponente oder Untereinheit eines IL-1-Rezeptors erkennt ein Fachmann des Gebiets, welche Komponente oder Untereinheit eines Rezeptors zur Bestimmung des zellulären Ziels des Cytokins verantwortlich ist, und weiß daher, welche Komponente die "Spezifitäts-bestimmende Komponente" darstellt.
In ähnlicher Weise weiß ein Fachmann des Gebiets, unabhängig von der verwendeten Nomenklatur, welche Komponente oder Untereinheit eines Rezeptors die "Signalübertragende Komponente" darstellt. Wie hierin verwendet, stellt die "Signalübertragende Komponente" eine Komponente des nativen Rezeptors dar, die nicht die Spezifitäts-bestimmende Komponente ist und die an das Cytokin in Abwesenheit der Spezifitäts-bestimmenden Komponente nicht bindet oder nur schwach bindet. Im nativen Rezeptor kann die "Signal-übertragende Komponente" an der Signalgebung teilnehmen.
Beispiele der Rezeptorkomponenten, die zur Herstellung der Cytokin-Antagonisten gemäß der Erfindung verwendet werden können, sind in Tabelle 1 angegeben.
TABELLE 1
IN TABELLE 1 ANGEGEBENE LITERATURREFERENZEN

1. Greenfeder, et al., Journal of Biological Chemistry 270: 13757–13765 (1995) – Siehe Seite 13757, Spalte 1, Zeile 6, bis Spalte 2, Zeile 3 und Spalte 2, Zeilen 10–12; Seite 13764, Spalte 2, letzte 3 Zeilen, und Seite 13765, Spalte 1, Zeilen 1–7;
2. Wesche et al., Journal of Biological Chemistry 272: 7727–7731 (1977) Siehe Seite 7731, Zeilen 20–26.

In der Herstellung der Nukleinsäuresequenz, die für das Fusionspolypeptid der Erfindung codiert, werden die ersten, zweiten und dritten Komponenten des Fusionspolypeptids in einem Einzelstrang der Nukleotide codiert, welcher bei Expression durch ein Wirts-Vektorsystem eine monomere Spezies des Fusionspolypeptids erzeugt. Die derart exprimierten Monomere werden dann durch die Wechselwirkungen zwischen den multimerisierenden Komponenten (den dritten Fusionspolypeptid-Komponenten) multimerisiert. Durch eine derartige Erzeugung der Fusionspolypeptide wird das Erfordernis einer Reinigung der heterodimeren Gemische umgangen, die entstehen würden, wenn die ersten und zweiten Komponenten als separate Moleküle erzeugt und dann multimerisiert werden würden. In US-Patent Nr. 5 470 952, ausgegeben am 28. November 1995, ist beispielsweise die Produktion heterodimerer Proteine beschrieben, die als CNTF oder IL-6-Antagonisten wirken. Die Heterodimeren werden aus Zelllinien ausgereinigt, die mit den entsprechenden Alpha-(α)- und Beta-(β)-Komponenten contransfiziert wurden. Die Heterodimeren werden dann von Homodimeren unter Anwendung von Methoden wie der passiven Elution aus präparativen, nicht-denaturierenden Polyacrylamidgelen oder unter Anwendung der Hochdruck-Kationenaustauschchromatographie abgetrennt. Das Erfordernis dieses Reinigungsschritts wird durch die Methoden der vorliegenden Erfindung umgangen.
Außerdem gibt PCT Internationale Anmeldung WO 96/11213, veröffentlicht am 18. April 1996, mit dem Titel "Dimere IL-3-Inhibitoren" an, dass der Anmelder Homodimere hergestellt hat, in denen zwei IL-4-Rezeptoren durch einen polymeren Spacer gebunden werden, und Heterodimere hergestellt hat, in denen ein IL-4-Rezeptor durch einen polymeren Spacer an eine Gamma-Kette des IL-2-Rezeptors geknüpft ist. Der beschriebene polymere Spacer ist Polyethylenglykol (PEG). Die beiden Rezeptorkomponenten, IL-4R und IL-2R-Gamma, werden separat exprimiert und gereinigt. Pegylierte Homodimere und Heterodimere werden dann durch miteinander Verbinden der Komponenten unter Verwendung bifunktionaler PEG-Reagenzien erzeugt. Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist der, dass das Erfordernis solch zeitaufwändiger und kostspieliger Reinigungs- und Pegylierungsschritte umgangen wird.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung befindet sich die Nukleotidsequenz, die für die erste Komponente codiert, stromaufwärts der Nukleotidsequenz, die für die zweite Komponente codiert. Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung befindet sich die Nukleotidsequenz, die für die erste Komponente codiert, stromabwärts der Nukleotidsequenz, die für die zweite Komponente codiert. Weitere Ausführungsformen der Erfindung können hergestellt werden, bei denen die Reihenfolge der ersten, zweiten und dritten Fusionspolypeptid-Komponenten umgestellt ist. Wird zum Beispiel die Nukleotidsequenz, die für die erste Komponente codiert, mit 1 bezeichnet, die Nukleotidsequenz, die für die zweite Komponente codiert, mit 2 bezeichnet, und die Nukleotidsequenz der dritten Komponente mit 3 bezeichnet, so kann die Reihenfolge der Komponenten in der isolierten Nukleinsäure der Erfindung, wie gelesen von 5' nach 3', eine beliebige der folgenden sechs Kombinationen sein; 1, 2, 3; 1, 3, 2; 2, 1, 3; 2, 3, 1; 3, 1, 2 oder 3, 2, 1.
Das an das Fusionspolypeptid gebundene Cytokin ist Interleukin-1.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst die multimerisierende Komponente eine von Immunglobulin abgeleitete Domäne. Spezifischer gesagt kann die von Immunglobulin abgeleitete Domäne ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus der Fc-Domäne von IgG, der Schwerkette von IgG und der Leichtkette von IgG. Bei einer anderen Ausführungsform kann die multimerisierende Komponente eine Fc-Domäne sein, von der die ersten fünf Aminosäuren (einschließlich eines Cysteins) entfernt wurden, um eine als Fc(ΔC1) bezeichnete multimerisierende Komponente zu erzeugen. Alternativ kann die multimerisierende Komponente eine Fc-Domäne sein, in der ein Cystein innerhalb der ersten fünf Aminosäuren durch eine andere Aminosäure substituiert wurde, wie zum Beispiel Serin oder Alanin.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Fusionspolypeptide bereit, die durch die isolierten Nukleinsäure-Moleküle der Erfindung codiert sind. Vorzugsweise liegen die Fusionspolypeptide aufgrund der Funktion der dritten multimerisierenden Komponente in multimerer Form vor. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Multimer ein Dimer. Geeignete multimerisierende Komponenten sind Sequenzen, die eine Hinge-Region einer Immunglobulin-Schwerkette codieren (Takahashi et al., 1982, Cell 29: 671–679); Immunglobulin-Gensequenzen und Teile davon. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Immunglobulin-Gensequenzen, insbesondere solche, die die Fc-Domäne codieren, zum Codieren der dritten multimerisierenden Komponente verwendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Vektor, welcher das Nukleinsäure-Molekül der Erfindung, wie hierin beschrieben, umfasst.
Ebenfalls bereitgestellt wird ein Expressionsvektor, der ein Nukleinsäure-Molekül der Erfindung, wie hierin beschrieben, umfasst, wobei das Nukleinsäure-Molekül funktionsfähig mit einer Expressions-Kontrollsequenz verknüpft ist. Ebenfalls bereitgestellt wird ein Wirts-Vektorsystem für die Herstellung eines Fusionspolypeptids, welches den Expressionsvektor der Erfindung umfasst, der in eine Wirtszelle eingeführt wurde, die zur Expression des Fusionspolypeptids geeignet ist. Die geeignete Wirtszelle kann eine Bakterienzelle wie E. coli, eine Hefezelle wie Pichia pastoris, eine Insektenzelle wie Spodoptera frugiperda, oder eine Säugerzelle, wie z.B. COS-, CHO-, 293-, BHK- oder NSO-Zellen sein.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Verfahren zur Herstellung der Fusionspolypeptide der Erfindung bereit, indem Zellen der hierin beschriebenen Wirts-Vektorsysteme unter Bedingungen gezüchtet werden, die die Produktion des Fusionspolypeptids und die Rückgewinnung des derart erzeugten Fusionspolypeptids erlauben.
Die hierin beschriebene Technologie kann auf die Entwicklung einer Cytokin-Trap für jegliches Cytokin angewendet werden, das eine α-Komponente, die Spezifität verleiht, als auch eine β-Komponente ausnützt, die in Bindung an die α-Spezifitätskomponente eine höhere Affinität für das Cytokin aufweist als irgendeine Komponente alleine. Demgemäß sind Antagonisten gemäß der Erfindung Antagonisten von Interleukin-1 [Greenfeder et al., J. Biol. Chem. 270: 13757–13765 (1995); Guo et al., J. Biol. Chem. 270: 27562–27568 (1995)].
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung gemäß der Erfindung beinhalten die oben beschriebenen Antagonisten in einem pharmakologisch geeigneten flüssigen, festen oder halbfesten Träger, geknüpft an einen Träger oder ein Zielmolekül (z.B. Antikörper, Hormon, Wachstumsfaktor, etc.) und/oder aufgenommen in Liposome, Mikrokapseln und ein kontrolliert freisetzendes Präparat (einschließlich Antagonistexprimierender Zellen) vor der in vivo-Verabreichung. Zum Beispiel kann die pharmazeutische Zusammensetzung einen oder mehrere der Antagonisten in einer wässrigen Lösung umfassen, wie etwa steriles Wasser, Salzlösung, Phosphatpuffer oder Dextroselösung. Alternativ können die Wirksubstanzen in einer festen (z.B. Wachs) oder halbfesten (z.B. gelatineartigen) Formulierung enthalten sein, die einem Patienten implantiert werden kann, der einer solchen Behandlung bedarf. Der Verabreichungsweg kann jegliche im Fachgebiet bekannte Verabreichungsform sein, einschließlich, doch nicht beschränkt auf intravenös, intrathekal, subkutan, durch Injektion in beteiligtes Gewebe, intraarteriell, intranasal, oral oder über ein implantiertes Element.
Die Verabreichung kann zur Verteilung der Wirksubstanz der Erfindung im ganzen Körper oder in einem lokalisierten Bereich führen. Zum Beispiel kann unter bestimmten Bedingungen, die entfernte Regionen des Nervensystems einbeziehen, eine intravenöse oder intrathekale Verabreichung des Agens erwünscht sein. In einigen Situationen kann ein die Wirksubstanz enthaltendes Implantat in oder nahe dem verletzten Bereich platziert werden. Zu geeigneten Implantaten zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Gelschaum, Wachs oder Implantate auf Mikropartikel-Basis.
BEISPIELE
KLONIEREN DER FUSIONSPOLYPEPTID-KOMPONENTEN
Die extrazellulären Domänen von humanen Cytokin-Rezeptoren wurden mittels standardmäßiger PCR-Techniken unter Verwendung von Gewebe-cDNAs (CLONTECH), kloniert in den Expressionsvektor pMT21 (Genetics Institute, Inc.), erhalten, und die Sequenzen wurden mittels standardmäßiger Techniken unter Verwendung eines ABI 373A DANN-Sequenzierers und des Taq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) sequenziert. Für das IL-1RAcP wurden Nukleotide 1 bis 1074 (entsprechend den Aminosäuren 1-358) von der Genbank-Sequenz AB006357 kloniert. Für das IL-1RI wurden Nukleotide 55 bis 999 (entsprechend den Aminosäuren 19-333) aus der Genbank-Sequenz X16896 kloniert.
PRODUKTION DER FUSIONSPOLYPEPTIDE (CYTOKIN-TRAP)
Die Cytokin-Traps codierenden Nukleotidsequenzen wurden aus den einzelnen klonierten DNAs (beschrieben supra) mittels standardmäßiger Klonier- und PCR-Techniken konstruiert. Die Sequenzen wurden in-frame konstruiert, so dass die Sequenz, die für die erste Fusionspolypeptid-Komponente codierte, an die Sequenz fusioniert wurde, die für die zweite Fusionspolypeptid-Komponente codierte, gefolgt von einer Fc-Domäne (Hinge, CH2- und CH3-Region des humanen IgG1) als der multimerisierenden Komponente. Extra-Nukleotide wurden in-frame zwischen die Sequenzen inseriert, die für die ersten und zweiten Fusionspolypeptid-Komponenten codierten, um eine Linkerregion zwischen die beiden Komponenten einzufügen (siehe 2A–2E – Trap 569).
Für die IL-1-Trap 569 (2A–2E) folgt der IL-1RAcP-Komponente 5' die IL-1RI-Komponente und dann die Fc-Domäne. Die endgültigen Konstrukte wurden in den Säuger-Expressionsvektor pCDNA3.1 (STRATAGENE) kloniert.
In der 569-Sequenz (2A–2E) codieren die Nukleotide 1-1074 für die IL-1RAcP-Komponente, codieren Nukleotide 1075-1098 für die Linkerregion, codieren Nukleotide 1099-2043 für die IL-1RI-Komponente und codieren Nukleotide 2044-2730 für die Fc-Domäne.
Die DNA-Konstrukte wurden entweder transient in COS-Zellen oder stabil in CHO-Zellen unter Anwendung von einem Fachmann des Gebiets bekannten standardmäßigen Techniken transfiziert. Die Überstände wurden abgesammelt und mittels Protein A-Affinitätschromatographie und Größenausschlusschromatographie anhand der standardmäßigen Techniken gereinigt. (Siehe zum Beispiel Harlow und Lane, Antibodies – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
MRC5-BIOASSAY FÜR IL1-TRAPS
Humane MRC5-Lungenfibroblastenzellen reagieren auf IL-1 durch Absondern von IL-6 und wurden daher zur Untersuchung der Fähigkeit von IL-1-Traps verwendet, die IL-1-abhängige Produktion von IL-6 zu blockieren. IL-1-Trap ISC569 (2A–2E) wurde gegen IL-1-RI.Fc getestet, welches die extrazelluläre Domäne des IL-1-Typ I-Rezeptors in Fusion an eine Fc-Domäne ist.
MRC5-Zellen wurden bei 1 × 10⁵ Zellen pro ml in Medium suspendiert, und 0,1 ml der Zellen wurden in die Vertiefungen einer 96-Well-Gewebekulturplatte ausplattiert (10.000 pro Vertiefung). Die Platten wurden für 24 Stunden bei 37°C in einem befeuchteten 5 % CO₂-Inkubator inkubiert.
Die IL-1-Trap und das rekombinante humane IL-1 wurden bei variierenden Dosen in einer 96-Well-Gewebekulturschale präinkubiert und für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. 0,1 ml dieses Gemischs wurden dann der 96-Well-Platte, enthaltend die MRC5-Zellen, hinzugegeben, so dass die Endkonzentration der IL-1-Trap 10 nM betrug und die End konzentrationen des IL-1 im Bereich von 2,4 pM bis 5 nM lagen. Die Kontrollvertiefungen enthielten entweder lediglich Trap oder gar nichts.
Die Platten wurden dann bei 37°C für 24 Stunden in einem befeuchteten 5 % CO₂-Inkubator inkubiert. Der Überstand wurde abgesammelt und auf die Mengen an IL-6 unter Verwendung eines R&D Systems Quantikine Immunoassay Kit gemäß den Anleitungen des Herstellers untersucht.
ERGEBNISSE
30 zeigt, dass Trap 569 (2A–2E) zum Antagonisieren der Wirkungen von IL-1 und Blockieren der IL-6-Produktion von MRC5-Zellen auf die Behandlung mit IL-1 hin in der Lage ist. Bei einer Konzentration von 10 nM ist Trap 569 zum Blockieren der Produktion von IL-6 bis zu einer IL-1-Konzentration von 3 nM fähig. Im Gegensatz dazu ist IL-1RI.Fc ein viel schlechterer Antagonist von IL-1. Es ist lediglich zum Blockieren der Wirkungen von IL-1 bei bis zu etwa 10–20 pM in der Lage. Daher blockiert Trap 569 das IL-1 etwa 100-mal besser als IL-1RI.Fc.
BLOCKIEREN VON INJIZIERTEM IL-1 DURCH IL-1-TRAP IN VIVO
IL-1 ist ein entzündungsförderndes Cytokin. Von der systemischen Verabreichung von IL-1 wurde gezeigt, dass sie akute Reaktionen in Tieren auslöst, einschließlich vorübergehender Hyperglykämie, Hyposinsulinämie, Fieber, Anorexie und erhöhten Serumspiegeln an Interleukin-6 (IL-6) (Reimers, 1998). Da Mäuse sowohl auf murines als auch humanes IL-1 reagieren, kann humanes IL-1 verwendet werden und können die in vivo-Bindungswirkungen von humanspezifischen IL-1-Antagonisten ausgewertet werden. Dieses akute Mausmodell wurde zur Bestimmung der Fähigkeit einer humanen IL-1-Trap verwendet, die in vivo-Wirkungen von exogen verabreichtem humanem IL-1 zu antagonisieren. Dies liefert eine schnelle Angabe der in vivo-Wirksamkeit der humanen IL-1-Trap und kann als ein Assay zur Unterstützung der Molekülauswahl verwendet werden.
Exgerimentelles Design:
Mäuse erhielten subkutane Injektionen von humanem IL-1 (0,3 μg/kg). Vierundzwanzig Stunden vor der Injektion mit humanem IL-1 wurden die Tiere entweder mit Vehikel oder einem 150-fachen molaren Überschuss an humaner IL-1-Trap (0,54 mg/kg) vorbehandelt. Zwei Stunden vor der Opferung (26 Stunden) erhielten die Mäuse eine zweite Injektion von humanem IL-1 (0,3 μg/kg). Blutproben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und die Seren auf die IL-6-Spiegel untersucht.
ERGEBNISSE
Die exogene Verabreichung von humanem IL-1 führte zu einer enormen Induktion der Serum-IL-6-Spiegel. Bei einem 150-fachen molaren Überschuss blockierte die humane IL-1-Trap den IL-6-Anstieg (4). Außerdem hielten die Wirkungen der humanen IL-1-Trap mindestens etwa weitere 24 Stunden lang an, was einen IL-6-Anstieg selbst dann verhinderte, wenn IL-1 nochmals verabreicht wurde (4). Eine derart langanhaltende Wirksamkeit legt nahe, dass eine tägliche Injektion einer IL-1-Trap für chronische Anwendungen nicht erforderlich sein muss.
Die vorliegende Erfindung ist durch die hierin beschriebenen spezifischen Ausführungsformen in ihrem Umfang nicht als beschränkt zu verstehen. Tatsächlich werden verschiedene Modifikationen der Erfindung über die hierin beschriebenen hinaus für Fachleute des Gebiets aus der vorangegangenen Beschreibung und den begleitenden Figuren erkennbar werden. Solche Modifikationen sind als im Rahmen der anhängenden Ansprüche befindlich zu betrachten.

Claims

Isoliertes Nukleinsäure-Molekül, das für ein Fusionspolypeptid codiert, welches Fusionspolypeptid die folgenden Fusionspolypeptid-Komponenten umfasst: (a) einen Interleukin-1-(IL-1)-bindenden Abschnitt der extrazellulären Domäne der Spezifitäts-bestimmenden Komponente eines IL-1-Rezeptors; (b) einen IL-1-bindenden Abschnitt einer extrazellulären Domäne der Signalübertragenden Komponente des IL-1-Rezeptors; und (c) eine multimerisierende Komponente; welche multimerisierende Komponente (c) mit einer multimerisierenden Komponente (c), die in einem anderen der Fusionspolypeptide enthalten ist, zur Bildung eines Multimers der Fusionspolypeptide multimerisiert; welches Multimer an IL-1 bindet und es einschließt und sich somit als ein Antagonist von IL-1 verhält.
Isoliertes Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 1, worin die Komponente (a) des Fusionspolypeptids einen IL-1-bindenden Abschnitt der extrazellulären Domäne des IL-1R vom Typ I umfasst und die Komponente (b) einen IL-1-bindenden Abschnitt einer extrazellulären Domäne von IL-1R-AcP umfasst.
Isoliertes Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 1, worin die Komponente (a) des Fusionspolypeptids einen IL-1-bindenden Abschnitt der extrazellulären Domäne des IL-1R vom Typ II umfasst und die Komponente (b) einen IL-1-bindenden Abschnitt einer extrazellulären Domäne von IL-1R-AcP umfasst.
Isoliertes Nukleinsäure-Molekül nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Multimer ein Dimer ist.
Isoliertes Nukleinsäure-Molekül nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die multimerisierende Komponente eine von Immunglobulin abgeleitete Domäne umfasst.
Isoliertes Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 5, worin die von Immunglobulin abgeleitete Domäne ausgewählt ist aus der Fc-Domäne von IgG, der Schwerkette von IgG und der Leichtkette von IgG.
Isoliertes Nukleinsäure-Molekül nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin sich die Nukleotidsequenz-codierende Komponente (a) stromaufwärts der Nukelotidsequenz-codierenden Komponente (b) befindet.
Nukleinsäure-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin sich die Nukleotidsequenz-codierende Komponente (a) stromabwärts der Nukleotidsequenz-codierenden Komponente (b) befindet.
Multimer, welches zwei oder mehr Fusionspolypeptide, codiert durch die Nukleinsäure-Moleküle nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfasst, welches Multimer an II-1 bindet und es einschließt und sich als ein Antagonist von II-1 verhält.
Multimer nach Anspruch 9, welches ein Dimer ist, umfassend zwei der Fusionspolypeptide.
Vektor, welcher das Nukleinsäure-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfasst.
Expressionsvektor, welcher ein Nukleinsäure-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfasst, worin das Nukleinsäure-Molekül funktionsfähig mit einer Expressions-Kontrollsequenz verknüpft ist.
Wirts-Vektorsystem für die Erzeugung eines Fusionspolypeptids, welches den Expressionsvektor nach Anspruch 12 in einer Wirtszelle umfasst.
Wirts-Vektorsystem nach Anspruch 13, wobei die Wirtszelle eine bakterielle Zelle, Hefezelle, Insektenzelle oder Säugetierzelle ist.
Wirts-Vektorsystem nach Anspruch 13, wobei die Wirtszelle E. coli, eine COS-Zelle, eine CHO-Zelle, eine 293-Zelle, eine BHK-Zelle oder eine NSO-Zelle ist.
Methode zur Erzeugung von Fusionspolypeptiden, welche das Züchten von Zellen des Wirts-Vektorsystems nach Anspruch 13, 14 oder 15 unter Bedingungen, die das Erzeugen von Fusionspolypeptiden zulassen, und das Gewinnen der derart erzeugten Fusionspolypeptide umfasst.
Methode nach Anspruch 16, welche außerdem das Möglichmachen umfasst, dass die Fusionspolypeptide Multimere der Fusionspolypeptide nach Anspruch 9 bilden.
Methode nach Anspruch 17, wobei die Multimere Dimere nach Anspruch 10 sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein Multimer nach Anspruch 9 oder ein Dimer nach Anspruch 10 in einem pharmakologisch geeigneten flüssigen, festen oder halbfesten Träger, geknüpft an einen Träger oder ein Zielmolekül und/oder aufgenommen in Liposome, Mikrokapseln oder ein kontrolliert freisetzendes Präparat, umfasst.