DE69631331T2

DE69631331T2 - Cd40l mutein

Info

Publication number: DE69631331T2
Application number: DE1996631331
Authority: DE
Inventors: J. Richard ARMITAGE; C. William FANSLOW; K. Melanie SPRIGGS; Subhashini Srinivasan; G. Marylou GIBSON
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2004-11-18
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: ES2214541T3; PT832229E; AU6263896A; NZ311335A; NO317735B1; NO975437L; IL122174A0; CA2222914C; ATE257858T1; CA2222914A1; WO1996040918A2; KR100453314B1; JP3279573B2; EP0832229B1; DE69631331D1; WO1996040918A3; JPH11504819A; NO975437D0; EP0832229A2; AU693713B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Menschliches CD40-Protein (CD40) ist ein Peptid aus 227 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 30.600, und einem sekretorischen Signalpeptid mit 19 Aminosäuren, das hauptsächlich aus hydrophoben Aminosäuren besteht (Stamenkovic et al., EMBO J. 8: 1403, 1989). CD40 gehört zu einer Familie von Rezeptoren, deren Mitglieder zwei Formen von TNF-Rezeptoren (Smith et al., Science, 248: 1019, 1990; und Schall et al., Cell 61: 361, 1990), Nervenwachstumsfaktorrezeptoren (Johnson et al., Cell 47: 545, 1986), T-Zellen-Antigen-OX40 (Mallett et al., EMBO J. 9: 1063, 1990), menschliches Fas-Antigen (Itoh et al., Cell 66: 233, 1991) und Mäuse-4-1BB-Rezeptoren (Kwon et al., Cell. Immunol. 121: 414, 1989 [Kwon et al. I] und Kwon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1963, 1989 [Kwon et al., II]) enthalten. Das Molekulargewicht (ohne Glycosylierung) des reifen menschlichen CD40-Proteins beträgt 28.300.
Aktivierte CD4+ T Zellen exprimieren hohe Anteile eines Liganden für CD40 (CD40L). Menschliches CD40L, ein membranengebundenes Glycoprotein, wurde aus peripheren Blut-T-Zellen geklont, wie dies in Spriggs et al., J. Exp. Med. 176: 1543 (1992), und WO 93/08207, beschrieben ist. Das Klonen von Mäuse-CD40L wird in Armitage et al., Nature 357: 80, 1992, beschrieben. CD40L induziert die B-Zellen-Proliferation in Abwesenheit eines beliebigen Co-Stimulus und kann auch die Produktion von Immunglobulinen in Gegenwart von Cytokinen induzieren. CD40L ist ein Typ-II-Membranen-Polypeptid mit einer extrazellulären Region an seinem C-Terminus, einer Transmembranenregion, und einer intrazellulären Region an seinem N-Terminus. Zu den löslichen Formen von CD40L gehören die extrazelluläre Region von CD40L oder ein Fragment davon. Die biologische Aktivität von CD40L wird durch Anbindung der extrazellulären Region des CD40L an CD40 bewirkt und umfasst die B-Zellen-Proliferation und die Induktion von Antikörper-Sekretion (einschließlich IgE-Sekretion).
Vor der vorliegenden Erfindung war ein Ligand für CD40, der eine höhere Bindungsaffinität für menschliches CD40 aufwies als natives CD40L, noch unbekannt. Aus diesem Grund besteht innerhalb dieses Fachgebietes der Bedarf, ein solches CD40-Ligandenmutein zu identifizieren und zu charakterisieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein neuartiges Zytokin, welches im folgenden als "CD40L" bezeichnet wird, wurde, wie in WO 93/08207 beschrieben, isoliert und charakterisiert. Die vorliegende Erfindung umfasst isolierte DNA-Moleküle, welche neuartige menschliche CD40L-Muteine codieren, und deren Komplementäre. Die isolierten DNA-Moleküle werden aus der Gruppe bestehend aus einer DNA ausgewählt, welche ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz codiert, wie sie in der SEQ ID-Nr. 2 dargestellt ist, wobei das Cystein an der Aminosäure 194 durch Tryptophan ersetzt ist, und DNAs, welche ein Polypeptid codieren, bei dem es sich um ein Fragment des Muteins handelt, das Tryptophan an der Aminosäure 194 aufweist.
DNAs, welche Fragmente eines CD40L-Muteins codieren, werden aus einer Gruppe ausgewählt, die aus Peptiden besteht, welche die Aminosäuren 1 bis 261, 35 bis 261, 34 bis 225, 113 bis 261, 113 bis 225, 120 bis 261, oder 120 bis 225 der SEQ-ID Nr. 2 umfassen, wobei das Cystein an der Aminosäure entsprechend der Aminosäure 194 der SEQ-ID Nr. 2 durch Tryptophan ersetzt ist. DNAs, welche unter stringenten Bedingungen (Hybridisierung in 6 × SSC bei 63°C über Nacht; Waschen in 3 × SSC bei 55°C) zu einer der zuvor genannten DNAs hybridisieren und welche ein Peptid codieren, das an CD40 bindet und in welchem das Cystein an der Aminosäure, welche der Aminosäure 194 der SEQ-ID Nr. 2 entspricht, durch Tryptophan ersetzt ist, können ebenfalls hergestellt werden.
Die Erfindung stellt weiters neuartige CD40L-Muteine dar, die von den DNA-Molekülen der Erfindung codiert werden. Die neuartigen Muteine unterscheiden sich von menschlichem CD40L dadurch, dass sie eine Aminosäuresequenz wie in der SEQ ID-Nr. 2 beschrieben aufweisen, wobei das Cystein an der Aminosäure 194 durch Tryptophan ersetzt ist. Die neuartigen Muteine weisen Fragmente der extrazellulären Domäne von CD40L auf, welche CD40 binden und Trytophan an der Aminosäure 194 aufweisen. Vorzugsweise werden die Fragmente aus der Gruppe bestehend aus Peptiden ausgewählt, welche die Aminosäuren 1 bis 261, 35 bis 261, 34 bis 225, 113 bis 261, 113 bis 225, 120 bis 261, oder 120 bis 225 der SEQ ID-Nr. 2 aufweisen, wobei die Aminosäure 113 bis 261 am meisten bevorzugt wird, wobei das Cystein an der Aminosäure, welche der Aminosäure 194 der SEQ ID-Nr. 2 entspricht, durch Tryptophan ersetzt ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Bindung des trimeren menschlichen und Mäuse-CD40L und des dimeren menschlichen und Mäuse-CD40L an C40/Fc, welche durch eine Biosensor-Analyse bestimmt wird.
2 zeigt die Bindung des trimeren menschlichen CD40L (2A) und zweier Zubereitungen monomeren menschlichen CD40Ls (2B) an C40/Fc in einer Biosensor-Analyse.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Neuartige Polypeptide, die als Liganden für menschliches und Mäuse-CD40 dienen können, wurden wie in WO 93/08207 beschrieben isoliert und sequenziert. Die vorliegende Erfindung erzeugt DNA-Moleküle, welche neuartige menschliche CD40L-Muteine und deren Komplementäre codieren. Die isolierten DNA-Module werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus einer DNA besteht, welche ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 2 beschrieben besitzt, wobei das Cystein an der Aminosäure 194 der SEQ ID Nr: 2 durch Tryptophan ersetzt wird, und DNAs, welche Fragmente davon codieren und Tryptophan an der Position 194 in der SEQ ID Nr: 2 aufweisen.
CD40L ist ein Ligand für CD40, einen Rezeptor, der ein Mitglied der TNF-Rezeptor-Superfamilie ist. CD40L mit voller Länge ist ein membranengebundenes Polypeptid mit einer extrazellulären Region an seinem C-Terminus, einer Transmembranenregion, und einer intrazellulären Region an seinem N-Terminus. Eine lösliche Version des CD40L kann aus der extrazellulären Region oder einem Fragment davon hergestellt werden. Die extrazelluläre Region des menschlichen CD40L erstreckt sich von der Aminosäure 47 bis zur Aminosäure 261 der SEQ ID Nr. 1. Die biologische Aktivität von CD40L wird durch Anbindung an CD40 bewirkt und umfasst die Proliferation von B-Zellen und die Induktion einer Immunglobulin-Sekretion von aktivierten B-Zellen.
Das hierin beschriebene neuartige CD40L Mutein wurde durch Mutation von Nucleotidsequenzen erhalten, welche ein CD40L-Polypeptid codieren. Ein wie hier beschriebenes CD40L Mutein oder ein analoges Mutein ist ein Polypeptid, das im wesentlichen homolog zu einem nativen CD40L ist, welches aber eine Aminosäuresequenz besitzt, die sich von einem CD40L-Polypeptid mit nativer Sequenz durch ein oder mehrere Deletionen, Insertionen oder Substitutionen unterscheidet. Analoge von CD40L können aus DNA-Konstrukten synthetisch hergestellt werden, welche durch Oligonucleotidsynthese und Ligation oder durch Orts-spezifische Mutagenesetechniken hergestellt werden.
Fachleuchte dieses Bereiches werden anerkennen, dass zusätzliche Mutationen an einer DNA vorgenommen werden können, welche CD40L codiert, das ein Tryptophan an der Aminosäure 194 besitzt. Im allgemeinen sollten Substitutionen eher konservativ durchgeführt werden, das heißt, die bevorzugtesten Aminosäuresubstitute sind jene, welche die Fähigkeit der Proteine der Erfindung, ihre Rezeptoren auf eine Weise zu binden, die im wesentlichen gleich ist wie jene von nativem CD40L, nicht beeinflussen. Zu den Beispielen für konservative Substitutionen gehören unter anderem Aminosäuren außerhalb der Bindungsdomäne(n), und Substitutionen von Aminosäuren, welche die sekundäre und/oder tertiäre Struktur von CD40L nicht verändern. Zusätzliche Beispiele umfassen das Substituieren eines aliphatischen Restes durch andere, wie zum Beispiel Ile, Val, Leu, oder Ala, oder Substitutionen eines polaren Restes durch einen anderen, wie zum Beispiel zwischen Lys und Arg; Glu und Asp; oder Gln und Asn. Andere derartige konservative Substitutionen, wie zum Beispiel Substitutionen ganzer Regionen mit ähnlichen Hydrophobizitätseigenschaften, sind gut bekannt.
Auf ähnliche Weise sollten die möglichen Auswirkungen der Deletion oder Insertion auf die biologische Aktivität berücksichtigt werden, wenn eine Deletions- oder Insertionsstrategie verfolgt wird. Untereinheiten der Proteine der vorliegenden Erfindung können durch Weglassen von terminalen oder internen Resten oder Sequenzen konstruiert werden, um Fragmente zu bilden. Zusätzliche Informationen bezüglich der möglichen Mutationsarten können aus einem Vergleich der Sequenz von CD40L mit Sequenzen und Strukturen anderer Mitglieder der TNF-Familie abgeleitet werden.
Die primäre Aminosäurestruktur des CD40L-Muteins der vorliegenden Erfindung kann modifiziert werden, um CD40L-Derivate durch Bildung kovalenter oder aggregativer Konjugate mit anderen chemischen Komponenten, wie zum Beispiel Glycosylgruppen, Lipiden, Phosphaten, Acetylgruppen und ähnlichem, oder durch Erzeugung von Aminosäuresequenzmutanten zu erzeugen. Kovalente Derivate von CD40L werden durch Verlinkung bestimmter funktionaler Gruppen mit CD40L-Aminosäure-Seitenketten oder am N-Terminus oder C-Terminus eines CD40L-Muteins oder dessen extrazellulärer Domäne hergestellt.
Zu anderen Derivaten von CD40L, die im Umfang dieser Erfindung liegen, gehören kovalente oder aggregative Konjugate von CD40L oder dessen Fragmenten mit anderen Proteinen oder Polypeptiden, wie zum Beispiel durch Synthese in rekombinanter Kultur als N-terminale oder C-terminale Fusionen. So kann zum Beispiel das Konjugat eine Signal- oder Leitpolypeptidsequenz an der N-terminalen Region oder C-terminalen Region eines CD40L-Polypeptids aufweisen, welches auf co-translationale Weise oder post-translationale Weise die Übertragung des Konjugats von der Synthesestelle zu einer Stelle innerhalb oder außerhalb der Zellmembrane oder der Zellwand leitet (z. B. der α-Faktor-Leiter von Saccharomyces).
CD40L-Polypeptidfusionen können Polypeptide aufweisen, welche für die Erleichterung der Reinigung und Identifizierung von CD40L (z. B. poly-His) oder Fusionen mit anderen Cytokinen zugesetzt wurden, um neuartige polyfunktionale Einheiten zu schaffen. Andere Cytokine umfassen zum Beispiel beliebige Interleukine-1 bis 13, TNF (Tumornekrosefaktor), GM-CSF (Granulocytmakrophagenkolonie-stimulierender Faktor), G-CSF (Granulocytkolonie-stimulierender Faktor), MGF (Mastzellenwachstumsfaktor), EGF (Epidermiumwachstumsfaktor), PDGF (von Plättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor), NGF (Nervenwachstumsfaktor), EPO (Erythropoietin), γ-IFN (Gamma-Interferon), 4-1BB-L (4-1BB-Ligand), und andere Cytokine, welche das Wachstum, die Differenzierung oder Funktion von Immunzellen beeinflussen.
Die biologische Aktivität von CD40L kann zum Beispiel mittels Konkurrenz bei der Anbindung an die Ligandenbindungsdomäne von CD40 (d. h. durch konkurrenzierende Bindungstests) bestimmt werden. In diesem Dokument werden mehrere nützliche Bindungstests offenbart. Fachleute dieses Bereiches können leicht Routineexperimente anwenden, um Bindungstests zu entwickeln, indem sie entweder isoliertes CD40-Protein (d. h. CD40/Fc) oder Zellen verwenden, welche CD40 exprimieren.
CD40L kann auch durch Messung der biologischen Aktivität in einem B-Zellen-Proliferationstest getestet werden. Menschliche B-Zellen können durch Reinigung mittels negativer Selektion und Percoll-Dichtesedimentation aus menschlichen Tonsillen gewonnen werden, wie dies von Defiance et al., J. Immunol. 139: 1135, 1987, beschrieben wird. Burkitt-Lymphomzelllinien können verwendet werden, um die Zellproliferation als Reaktion auf CD40L zu messen. Beispiele für Burkitt-Lymphomzelllinien umfassen Raji (ATCC CCL 86), Daudi (ATCC CLL 213) und Namalwa (ATCC CRL 1432).
Ein weiterer Test zur Bestimmung der biologischen Aktivität von CD40L besteht darin, das Immunglobulin zu messen, welches von B-Zellen als Reaktion auf die Aktivierung durch CD40L oder ein Derivativ oder Analog davon produziert wird. Die polyclonale Immunglobulinsekretion kann zum Beispiel durch Inkubation mit 5 × 10⁵ B-Zellen/ml in einer Kultur für einen Zeitraum von mindestens sieben Tagen gemessen werden. Die Produktion von Immunglobulin (Ig) kann mittels eines ELISA-Tests gemessen werden, wie er zum Beispiel in Maliszewski et al., J. Immunol. 144: 3028, 1990 [Maliszewski et al. I] oder Maliszewski et al., Eur J. Immunol. 20: 1735, 1990 [Maliszewski et al. II]) beschrieben ist.
CD40L Polypeptide können als Oligomere, wie zum Beispiel Dimere oder Trimere, vorhanden sein. Oligomere sind durch Disulfidbindungen verlinkt, die zwischen Cysteinresten auf unterschiedlichen CD40L-Polypeptiden gebildet werden. Alternativ dazu können zwei lösliche CD40L-Domänen mit einer Linkersequenz verlinkt werden, wie zum Beispiel jener, die im US-Patent 5,073,627 beschrieben ist. CD40L-Polypeptide können auch durch Expression eines Fusionsproteins erzeugt werden, welches lösliches CD40L (extrazelluläre Domäne) und eine Fc-Region eines Immunglobulins (zum Beispiel SEQ ID-Nr. 4) enthält, um ein divalentes CD40L zu bilden. Fusionsproteine, die sowohl mit schweren als auch leichten Ketten eines Antikörpers hergestellt werden, bilden ein CD40L-Oligomer mit bis zu vier CD40L-Extrazellulärregionen. Trimeres CD40L wird durch Expression einer DNA hergestellt, welche ein Fusionsprotein codiert, das ein Peptid aufweist, welches ein Trimer in Lösung bildet (zum Beispiel ein Mutein eines Hefe-GCN4-"Leucinzipper" (Leucinreassoziation) (SEQ ID-Nr. 5), oder die Lungenoberflächenprotein-D (SPD) Trimerisationsdomäne (SEQ ID-Nr. 6; Hoppe et al., FEBS Letters 344: 191, 1994), gefolgt von der extrazellulären Region von CD40L.
Fusionsproteine können mittels herkömmlicher Techniken der Enzymzerschneidung und der Ligation von Fragmenten der gewünschten Sequenzen hergestellt werden. PCR-Techniken, bei denen synthetische Oligonucleotide verwendet werden, können zum Herstellen und/oder Erweitern der gewünschten Fragmente herangezogen werden. Überlappende synthetische Oligonucleotide, welche die gewünschten Sequenzen repräsentieren, können ebenfalls verwendet werden, um DNA-Konstrukte herzustellen, welche Fusionsproteine codieren. Fusionsproteine können auch CD40L und zwei oder mehrere zusätzliche Sequenzen umfassen, einschließlich einer Leader- (oder Signalpeptid-) sequenz, einer oligomerisierenden Region (d. h. Fc-Region, Leucinzipperkomponente oder geeignete Zipperkomponente), Linker-Sequenz, und Sequenzen, welche stark antigene Komponenten codieren, die ein Mittel zur einfachen Reinigung oder schnellen Erkennung eines Fusionsproteins darstellen.
Signalpeptide fördern die Proteinsekretion von Zellen. Ein beispielhaftes Signalpeptid sind die Aminosäuren –26 bis –1 der SEQ ID-Nr. B. Das Flag^®-Octapeptid (Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988) verändert die biologische Aktivität von Fusionsproteinen nicht, ist hoch antigen und stellt ein Epitop zur Verfügung, welches reversibel durch einen spezifischen monoclonalen Antikörper gebunden ist, wodurch eine rasche Erkennung und einfache Reinigung des exprimierten Fusionsproteins ermöglicht wird. Die Flag^®-Sequenz wird auch spezifisch durch Rinderschleimhaut-Enterokinase am Rückstand unmittelbar nach der Asp-Lys-Paarung gespalten, wobei Fusionsproteine, auf welche dieses Peptid aufgesetzt ist, auch resistent gegen intrazelluläre Degradation in E. coli sein können. Ein monoklonaler Mäuse-Antikörper, der die Flag^®-Sequenz bindet, wurde bei der ATCC unter der Zugangsnummer HB 9259 hinterlegt; Verfahren zur Verwendung des Antikörpers bei der Reinigung von Fusionsproteinen, welche die Flag^®-Sequenz enthalten, sind im US-Patent 5,011,912 beschrieben.
Geeignete Fc-Regionen sind als Fc-Regionen definiert, welche sich an Protein A oder Protein G anbinden können, oder alternativ dazu von einem Antikörper erkannt werden, der bei der Reinigung oder Erkennung eines Fusionsproteins verwendet werden kann, welches die Fc-Region enthält. Vorzugsweise enthalten Fc-Regionen die Fc-Region des menschlichen IgG₁ oder des Mäuse-IgG₁. Ein Beispiel dafür ist die menschliche IgG₁-Fc-Region, die in der SEQ ID-Nr. 4 dargestellt ist. Fragmente einer geeigneten Fc-Region können ebenfalls verwendet werden, wie zum Beispiel eine Fc-Region aus menschlichem IgG₁, aus dem eine Sequenz von Aminosäuren gelöscht wurde, die für die Anbindung von Protein A verantwortlich sind, so dass sich das Fragment an das Protein G bindet, nicht aber an das Protein A.
Eine Linker-Sequenz, welche die extrazelluläre Region des CD40L von der oligomerisierenden Komponente mit einem Abstand trennt, der ausreicht, um sicherzustellen, dass sich das CD40L korrekt in seine sekundäre und tertiäre Struktur faltet, kann ebenfalls verwendet werden. Geeignete Linker-Sequenzen (1) adoptieren eine flexible, erweiterte Konformation, (2) weisen keine Neigung zur Entwicklung einer geordneten Sekundärstruktur auf, welche mit den funktionalen Domänen der Fusionsproteine interagieren könnte, und (3) besitzen minimale hydrophobe oder geladene Eigenschaften, welche die Interaktion mit den funktionalen Proteindomänen fördern könnten. Typische Oberflächenaminosäuren in flexiblen Proteinregionen umfassen Gly, Asn und Ser. Von nahezu jeder Permutation von Aminosäuresequenzen, welche Gly, Asn und Ser enthalten, kann erwartet werden, dass sie die obigen Kriterien für eine Linker-Sequenz erfüllt. Andere nahezu neutrale Aminosäuren, wie zum Beispiel Thr und Ala, können ebenso in der Linker-Sequenz verwendet werden. Die Länge der Linker-Sequenz kann sich ändern, ohne dass dadurch die biologische Aktivität des Fusionsproteins wesentlich beeinträchtigt wird. Linker-Sequenzen sind nicht notwendig, wenn verschmolzene Proteine unwesentliche N- oder C-terminale Aminosäureregionen besitzen, die verwendet werden können, um die funktionalen Domänen zu trennen und sterische Störungen zu verhindern.
Es können DNA-Konstrukte hergestellt werden, welche verschiedene Additionen oder Substitutionen von Aminosäurerückständen oder -sequenzen codieren, oder Deletionen von terminalen oder internen Rückständen oder Sequenzen, die nicht für die biologische Aktivität oder Bindung benötigt werden. Zum Beispiel kann die extrazelluläre CD40L N- Glycolysierungsstelle so modifiziert werden, dass eine Glycosylierung ausgeschlossen wird, während die Expression eines homogenen, reduzierten Kohlehydratanalogs mit Hilfe von Hefeexpressionssystemen zugelassen wird. N-Glycosylierungsstellen in eukaryotischen Polypeptiden sind gekennzeichnet durch ein Aminosäuretriplet Asn-X-Y, wobei X eine beliebige Aminosäure außer Pro und Y Ser oder Thr ist. Entsprechende Modifizierungen an der Nucleotidsequenz, welche dieses Triplet codiert, führen zu Substitutionen, Additionen oder Deletionen, welche ein Anhaften von Kohlehydratrückständen an der Asn-Seitenkette verhindern.
Zu weiteren Ansätzen zur Mutagenese gehört die Modifikation von Sequenzen, welche dibasische Aminosäurerückstände codieren, um die Expression in Hefesystemen zu verstärken, in denen KEX2-Proteaseaktivitäten vorhanden sind. Untereinheiten eines CD40L-Polypeptids können durch Löschen von Sequenzen konstruiert werden, welche terminale oder interne Rückstände oder Sequenzen codieren. Darüber hinaus können andere Analysen durchgeführt werden, um den erfahrenen Fachmann bei der Auswahl von Stellen für die Mutagenese zu unterstützen. So diskutiert zum Beispiel WO 93/08207 Verfahren zur Auswahl von Ligandenagonisten und Antagonisten.
Die Sequenz von Mäuse-CD40L cDNA wurde durch Direktexpressionstechniken erhalten; die Sequenz des menschlichen CD40L wurde durch speziesübergreifende Hybridisierungstechniken erhalten, bei denen Mäuse-CD40L cDNA als Probe verwendet wurde. Beide sind in WO 93/08207 beschrieben. Kurz gesagt wurde die extrazelluläre Region des menschlichen CD40 (der Rezeptor; SEQ ID-Nr. 3) durch Techniken der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern auf der Basis einer in Stamenkovic et al. publizierten Sequenz geklont. Ein CD40/Fc-Fusionsprotein wurde mittels PCR-Techniken durch Verschmelzen einer DNA, welche die extrazelluläre Domäne von CD40 codiert, mit einer DNA erhalten, welche die Fc-Domäne des menschlichen IgG1 (SEQ ID-Nr. 4) codiert. Gereinigte lösliche CD40-Proteine waren in der Lage, biologischen Aktivitäten entgegenzuwirken, die von CD40L mittelbar bewirkt wurden.
Aus einer EL4-Zelllinie, welche mittels FACS (fluoreszenzaktivierte Zellsortierung) auf der Basis der Bindung eines biotinylierten CD40/Fc-Fusionsproteins sortiert wurde, ist eine cDNA-Bibliothek erstellt worden. Die Zellen wurden fünf Mal sortiert, bis eine signifikante Verschiebung der Fluoreszenzaktivität auf der Basis der Expression eines Liganden für CD40 durch die sortierten EL-4-Zellen eintrat. Kurz gesagt wurde cDNA synthetisiert, in einen leeren pDC406-Vektor eingefügt und in E. coli transformiert. Die Transformanten wurden gepoolt, und die DNA aus den Pools wurde isoliert und in CV1-EBNA-Zellen transfektiert, um eine Expressionsklonungsbibliothek zu erstellen. Transfektierte CV1-EBNA-Zellen wurden auf Objektträgern kultiviert, um eine vorübergehende Expression von CD40L zu ermöglichen. Die Objektträger wurden mit radiojodiertem CD40/Fc gescreent und überprüft, um Zellen zu identifizieren, welche CD40L exprimieren, indem auf das Vorhandensein von autoradiographischen Silberkörnchen gegen einen hellen Hintergrund geachtet wurde.
Ein einzelner Klon wurde isoliert und mittels Standardtechniken sequenziert, um die cDNA-Sequenz und eine deduzierte Aminosäuresequenz von Mäuse-CD40L zu erzeugen. Die menschliche homologe CD40L-cDNA wurde durch speziesübergreifende Hybridisierungstechniken gefunden. Kurz gesagt wurde eine cDNA-Bibliothek aus menschlichen Peripherblutlymphozyten (PBL) aus aktivierten Peripherblutlymphozyten hergestellt. Eine Mäuse-Probe wurde entsprechend der codierenden Region von Mäuse-CD40L aus Nucleotid 13 bis Nucleotid 793 von Mäuse-CD40L konstruiert. Mit Hilfe von Standardtechniken für die speziesübergreifende Hybridisierung wurde die Probe zur Identifizierung eines Klons verwendet, der menschliches CD40L exprimiert. Die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen von menschlichem CD40L sind in SEQ ID-Nr. 1 und 2 dargestellt.
Rekombinante Expressionsvektoren für die Expression von CD40L durch rekombinante DNA-Techniken umfassen eine CD40L DNA-Sequenz mit einem synthetischen oder von einer cDNA abgeleiteten DNA-Fragment, welches ein CD40L-Polypeptid codiert, und wirkend mit einer geeigneten transkriptionalen oder translationalen regulierenden Nucleotidsequenz verlinkt ist, wie zum Beispiel von einem Säugetiergen, einem mikrobiellen Gen, einem viralen oder einem Insektengen. Beispiele für regulierende Sequenzen umfassen Sequenzen mit einer regulierenden Rolle bei der Genexpression (z. B. ein transkriptionaler Promotor oder Verstärker), gegebenenfalls eine Operatorsequenz zur Steuerung der Transkription, eine Sequenz, welche eine ribosomale mRNA-Bindungsstelle codiert, und geeignete Sequenzen, welche den Beginn und das Ende einer Transkription und einer Translation steuern.
Nucleotidsequenzen sind wirkend verlinkt, wenn die regulierende Sequenz auf funktionale Weise mit der CD40L-DNA-Sequenz in Beziehung steht. Auf diese Weise ist eine Promotor-Nucleotidsequenz auf operable Weise mit einer CD40L-DNA-Sequenz verlinkt, wenn die Promotor-Nucleotidsequenz die Transkription der CD40L-DNA-Sequenz steuert. Weiters kann eine Ribosomen-Bindungsstelle auf operable Weise mit einer Sequenz für ein CD40L-Polypeptid verlinkt sein, wenn die Ribosomen-Bindungsstelle innerhalb des Vektors positioniert ist, um die Translation zu fördern. Darüber hinaus können Sequenzen, welche Signalpeptide codieren, in Expressionsvektoren enthalten sein. So kann zum Beispiele eine DNA-Sequenz für ein Signalpeptid (sekretorischer Leiter) wirkend mit einer CD40L-DNA-Sequenz verlinkt sein.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von CD40L-Polypeptiden umfassen prokaryotische, Hefe- oder höhere eukaryotische Zellen. Prokaryoten umfassen gramnegative oder grampositive Organismen, wie zum Beispiel E. coli oder Bacilli. Geeignete prokaryotische Wirtszellen für die Transformation umfassen zum Beispiel E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, und verschiedene andere Arten innerhalb der Arten Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus. Höhere eukaryotische Zellen enthalten bekannte Zelllinien mit Säugetierursprung. Zellfreie Translationssysteme könnten auch verwendet werden, um CD40L-Polypeptide mit Hilfe von RNAs zu produzieren, die von den hierin offenbarten DNA-Konstrukten abgeleitet sind. Geeignete Klonungs- und Expressionsvektoren für die Verwendung mit bakteriellen, pilzlichen, Hefe- und Säugetier-Zellwirten sind zum Beispiel in Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985) beschrieben.
Die Expressionsvektoren, welche die rekombinante CD40L-DNA-Sequenz tragen, werden in eine geeignete homogene Kultur eines geeigneten Wirtsmikroorganismus oder einer geeigneten Säugetier-Zelllinie transfektiert oder transformiert. Transformierte Wirtszellen sind Zellen, die mit Nucleotidsequenzen transformiert oder transfektiert wurden, welche CD40L-Polypeptide codieren und CD40L-Polypeptide exprimieren. Exprimierte CD40L-Polypeptide sind konzentriert in der Wirtszelle vorhanden und/oder in überstehender Kulturflüssigkeit sekretiert. Dies hängt von der Art der Wirtszelle und dem Genkonstrukt ab, das in die Wirtszelle eingefügt wird.
Expressionsvektoren, die in prokaryotische Wirtszellen transfektiert wurden, umfassen im allgemeinen einen oder mehrere phänotypisch selektierbare Marker. Ein phänotypisch selektierbarer Marker ist zum Beispiel ein Gen, welches ein Protein codiert, das antibiotischen Widerstand überträgt oder eine autotrophe Anforderung liefert, und einen Replikationsursprung, der vom Wirt erkannt wird, um die Verstärkung innerhalb des Wirts sicherzustellen. Andere nützliche Expressionsvektoren für prokaryotische Wirtszellen umfassen einen selektierbaren Marker bakteriellen Ursprungs, der von kommerziell verfügbaren Plasmiden abgeleitet ist. Dieser selektierbare Marker kann genetische Elemente des Klonungsvektors pBR322 (ATCC 3.7017) umfassen. pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt somit ein einfaches Mittel für die Identifizierung transformierter Zellen dar. Die "Hauptgerüst"-Abschnitte von pBR322 sind mit einem geeigneten Promoter und einer CD40L-DNA-Sequenz kombiniert. Andere kommerziell verfügbare Vektoren schließen zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) ein.
Promotorsequenzen werden allgemein für rekombinante prokaryotische Wirtszellenexpressionsvektoren verwendet. Allgemeine Promotorsequenzen umfassen β-Lactamase (Penicillinase), Lactose-Promotorsystem (Chang et al., Nature 275: 615, 1978; und Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979), Tryptophan- (trp) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980; und EP-A-36776) und tac-Promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982). Ein besonders nützliches prokaryotisches Wirtszellenexpressionssystem verwendet einen Lambda-Phagen-P_L-Promotor und eine thermolabile cI857ts-Repressorsequenz. Plasmidvektoren, die von der American Type Culture Collection erhältlich sind, welche Derivate des Lambda-P_L-Promotors aufweisen, umfassen Plasmid-pHUB2 (resident im E. coli-Stamm JMB9 (ATCC 37092)) und pLLc28 (resident in E. coli RR1 (ATCC 53082)).
CD40L kann in Hefewirtszellen exprimiert werden, die vorzugsweise von der Saccharomyces-Gattung stammen (z. B. S. cerevisiae). Andere Hefegattungen, wie zum Beispiel Pichia oder Kluyveromyces, können ebenfalls verwendet werden. Hefevektoren enthalten oft einen Ausgangspunkt einer Replikationssequenz von einem 2 μ-Hefeplasmid, einer autonom replizierenden Sequenz (ARS), einer Promotorregion, Sequenzen für Polyadenylation, und Sequenzen für die Transkriptionstermination. Vorzugsweise umfassen Hefevektoren einen Ausgangspunkt für die Replikationssequenz und einen selektierbaren Marker. Geeignete Promotorsequenzen für Hefevektoren umfassen Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; und Holland et al., Biochem. 17: 4900, 1978), wie zum Beispiel Enolase, Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-Phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase, und Glucokinase. Andere geeignete Vektoren und Promotoren für die Verwendung bei der Hefeexpression werden im Detail in Hitzeman, EPA-73,657 beschrieben.
Säugetier- oder Insektenwirtszellen-Kultursysteme könnten ebenfalls verwendet werden, um rekombinante CD40L-Polypeptide zu exprimieren. Beispiele für geeignete Säugetierwirtszelllinien umfassen die COS-7-Linie von Affennierenzellen (ATCC CRL 1651), Gluzman et al., Cell 23: 175, 1981), L-Zellen, C127-Zellen, 3T3-Zellen (ATCC CCL 163), Eierstockzellen vom chinesischen Hamster (CHO), HeLa-Zellen, und BHK (ATCC CRL 10) Zelllinien. Geeignete Säugetier-Expressionsvektoren umfassen nicht transkribierte Elemente, wie zum Beispiel einen Replikationsausgangspunkt, eine Promotorsequenz, einen Verstärker, der mit dem Strukturgen verlinkt ist, andere flankierende, nicht transkribierte 5'- oder 3'-Sequenzen, wie zum Beispiel Ribosomen-Bindungsstellen, eine Polyadenylationsstelle, Spender- und Empfänger-Spleißstellen, und transkriptionale Terminationssequenzen.
Transkriptionale und translationale Kontrollsequenzen für Säugetierwirtszellen-Expressionsvektoren können von viralen Genomen ausgeschnitten werden. So werden zum Beispiel häufig verwendete Säugetierzellpromotorsequenzen und Verstärkersequenzen vom Polyoma-Virus, Adenovirs 2, Simian-Virus 40 (SV40) und vom menschlichen Zytomegalovirus abgeleitet. DNA-Sequenzen, welche zum Beispiel vom viralen SV40-Genom abgeleitet sind, SV40-Ausgangspunkt, Früh- und Spät-Promotor, Verstärker, Spleiß- und Polyadenylationsstellen können verwendet werden, um die anderen genetischen Elemente zur Verfügung zu stellen, die für die Expression einer strukturellen Gensequenz in einer Säugetierwirtszelle benötigt werden. Virale Früh- und Spät-Promotoren sind besonders nützlich, da beide leicht von einem viralen Genom als Fragment erhalten werden können, welche auch einen viralen Replikationsursprung enthalten können (Fiers et al., Nature 273: 113, 1978). Kleinere oder größere SV40-Fragmente können ebenfalls verwendet werden, sofern die etwa 250 bp große Sequenz, die sich von der Hind-III-Stelle bis zur Bgl-I-Stelle im viralen SV40-Replikationsursprung erstreckt, enthalten ist.
Beispielhafte Säugetier-Expressionsvektoren können wie von Okayama und Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983) offenbart konstruiert werden. Ein nützlicher Vektor mit starker Expression, PMLSV N1/N4, der von Cosman et al., Nature 312: 768, 1984 beschrieben wird, wurde als ATCC 39890 hinterlegt. Zusätzliche nützliche Säugetier-Expressionsvektoren sind in EP-A-0367566 und in der US-Patentanmeldung Ser. Nr. 07/701,415, eingereicht am 16. Mai 1991, beschrieben. Für die Expression einer extrazellulären Region eines Typ-II-Proteins, wie zum Beispiel CD40L, sollte eine heterologe Signalsequenz hinzugefügt werden, wie zum Beispiel die Signalsequenz für Interleukin-7 (IL-7), die im US-Patent 4,965,195 beschrieben ist, oder die Signalsequenz für den Interleukin-2-Rezeptor, der in der US-Patentanmeldung 06/626,667, eingereicht am 2. Juli 1984, beschrieben ist.
Reinigung rekombinanter CD40L-Polypeptide
CD40L-Polypeptide können durch Kultivierung transformierter Wirtszellen unter Kulturbedingungen hergestellt werden, die zum Exprimieren von CD40L-Polypeptiden notwendig sind. Die sich daraus ergebenden exprimierten Polypeptide können anschließend vom Kulturmedium oder den Zellextrakten gereinigt werden. Falls dies gewünscht wird, kann ein CD40L-Polypeptid mit Hilfe eines kommerziell verfügbaren Proteinkonzentrationsfilters, wie zum Beispiel einer Ultrafiltrationseinheit von Amicon oder Millipore Pellicon, konzentriert werden. Nach dem Konzentrationsschritt kann das Konzentrat an einer Reinigungsmatrix angewendet werden, wie zum Beispiel einem Gelfiltrationsmedium. Alternativ dazu kann ein Anionenaustauschharz verwendet werden, wie zum Beispiel eine Matrix oder ein Substrat mit anhängenden Diethylaminethylgruppen (DEAE). Bei den Matrizen kann es sich um Acrylamid, Agarose, Dextran, Zellulose oder andere Arten handeln, die gemeinhin bei der Proteinreinigung verwendet werden. Alternativ dazu kann ein Kationenaustauschschritt eingesetzt werden. Geeignete Kationenaustauscher umfassen verschiedene unlösliche Matrizen, unter anderem zum Beispiel Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen. Sulfopropylgruppen werden bevorzugt.
Schließlich können ein oder mehrere Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographieschritte (RP-HPLC) unter Verwendung von hydrophoben RP-HPLC-Medien (z. B. Silicagel mit anhängenden Methyl- oder anderen aliphatischen Gruppen) ausgeführt werden, um das CD40L weiter zu reinigen. Einige oder alle der zuvor genannten Reinigungsschritte können in verschiedenen Kombinationen auch verwendet werden, um ein im wesentlichen homogenes rekombinantes Protein zu erzeugen.
Es ist auch möglich, eine Affinitätssäule zu verwenden, welche eine CD40-Ligandenbindungsdomäne aufweist, um exprimierte CD40L-Polypeptide durch Affinität zu reinigen. CD40L-Polypeptide können von einer Affinitätssäule in einer hochkonzentrierten Salzelutionspufferlösung entfernt und anschließend in einer geringer konzentrierten Salzpufferlösung für die Verwendung dialysiert werden.
Rekombinantes Protein, das in Bakterienkultur hergestellt wurde, wird für gewöhnlich durch anfängliches Zerreißen der Wirtszellen, Zentrifugieren, Extrahieren von Zellpellets im Falle eines unlöslichen Polypeptids, oder vom Überstand im Falle eines löslichen Polypeptids, gefolgt von einem oder mehreren Schritten des Konzentrierens, des Aussalzens, des Ionenaustauschens, der Affinitätsreinigung oder der Größenausschlußchromatographie isoliert.
Schließlich kann RP-HPLC für die Schritte der Endreinigung eingesetzt werden. Mikrobielle Zellen können durch beliebige geeignete Verfahren zerrissen werden. Dazu gehören auch Gefrier-Auftau-Zyklen, Beschallung, mechanisches Zerreißen, oder die Anwendung von Zellauflösungsmitteln.
Transformierte Hefewirtszellen werden vorzugsweise verwendet, um CD40L als sezerniertes Polypeptid zu exprimieren. Dies vereinfacht die Reinigung. Sezerniertes rekombinantes Polypeptid von einer Hefewirtszellenfermentation kann mittels Verfahren gereinigt werden, die analog zu jenen sind, welche von Urdal et al., (J. Chromatog. 296: 171, 1984) offenbart werden. Urdal et al. beschreibt zwei sequentielle Umkehrphasen-HPLC-Schritte für die Reinigung von rekombinantem menschlichem IL-2 auf einer präparativen HPLC-Säule.
Verabreichung von CD40L-Verbindungen
Die vorliegende Erfindung sieht therapeutische Verbindungen vor, welche eine effektive Menge an CD40L-Mutein in einem geeigneten Verdünnungsmittel oder auf einem Träger aufweisen, und Verfahren zur Behandlung von Säugetieren mit Hilfe dieser Verbindungen. Für Behandlungszwecke wird das gereinigte CD40L-Mutein einem Patienten, und zwar vorzugsweise einem menschlichen Patienten, für die Behandlung in einer der Indikation entsprechenden Art und Weise verabreicht. Somit können zum Beispiel pharmazeutische CD40L-Muteinverbindungen (zum Beispiel in Form eines löslichen CD40L-Muteins, welches Tryptophan an der Aminosäure 194 aufweist), die verabreicht werden, um einen gewünschten therapeutischen Effekt zu erzielen, durch Bolusinjektion, kontinuierliche Infusion, zeitlich gestaffelte Abgabe aus Implantaten oder durch andere geeignete Techniken verabreicht werden.
Typischerweise wird ein therapeutischer CD40L-Muteinwirkstoff in Form einer pharmazeutischen Verbindung verabreicht, welche gereinigtes CD40L-Mutein in Verbindung mit physiologisch akzeptablen Trägermitteln, Arzneimittelträgern oder Verdünnungsmitteln aufweist. Solche Trägerstoffe sind für Patienten in der angewendeten Dosis und Konzentration ungiftig. Normalerweise erfordert die Herstellung solcher Verbindungen das Kombinieren von CD40L-Mutein mit Pufferlösungen, Antioxidantien, wie zum Beispiel Ascorbinsäure, Polypeptiden mit geringem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste), Proteinen, Aminosäuren, Kohlenhydraten einschließlich Glucose, Sucrose oder Dextran, Chelatbildner, wie zum Beispiel EDTA, Glutathion und anderen Stabilisierungsmitteln und Arzneimittelträgern. Neutrale gepufferte Salzlösung oder mit konspezifischem Serumalbumin gemischte Salzlösung sind beispielhaft für geeignete Verdünnungsmittel.
Die folgenden Beispiele sind dazu gedacht, bestimmte Ausführungsformen zu veranschaulichen, und nicht den Umfang der Erfindung einzuschränken.
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel beschreibt zwei Festphasen-Bindungstests, wobei der erste (a) verwendet werden kann, um die Fähigkeit der Anbindung von trimerem CD40L an CD40 zu beurteilen, und der zweite (b) verwendet wird, um das Vorhandensein von CD40L zu erkennen.
(a) Quantitative CD40L-ELISA
CD40/Fc wird wie in WO 93/08207 beschrieben hergestellt und gereinigt und auf Platten mit 96 Vertiefungen aufgetragen (Corning EasyWash ELISA-Platten, Corning, NY, USA). Die Platten werden mit 2,5 μg CD40/Fc pro Vertiefung beschichtet und in PBS über Nacht bei 4°C stehengelassen und mit 1% fettarmer Milch in PBS eine Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert. Die zu testenden Proben werden mit 10% normalem Ziegenserum in PBS verdünnt, und 50 μl werden pro Vertiefung hinzugegeben. Eine Titrierung unbekannter Proben wird doppelt durchgeführt, und eine Titrierung eines Referenzstandards von CD40L wird durchgeführt, um eine Standardkurve zu erstellen. Die Platten werden mit den Proben und Kontrollen 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend vier Mal mit PBS gewaschen. Im zweiten Schritt wird ein Reagensmittel, ein anti-oligomerisierender Kaninchen-Zipper, hinzugefügt (50 μl/Vertiefung, Konzentration ungefähr 2,5 μg/ml), und die Platten werden 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten werden erneut wie zuvor beschrieben gewaschen, und es wird zu Meerrettich-Peroxidase (Tago, Burlingame, CA, USA) konjugiertes Ziegen-F(ab')2 Anti-Kaninchen-IgG zugegeben. Die Platten werden 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und wie beschrieben gewaschen, und das Vorhandensein von CD40L wird durch Zugabe von Chromogen, Tetramethylbenziden (TMB; 100 μl/Vertiefung) für 15 Minuten bei Raumtemperatur erkannt. Die chromogene Reaktion wird durch die Zugabe von 100 μl 2 N H₂SO₄ gestoppt, und das OD₄₅₀–OD₅₆₂ der Vertiefungen wird bestimmt. Die Menge an trimerem CD40L kann bestimmt werden, indem die mit den unbekannten Proben erhaltenen OD-Werte mit den für die Standardkurve erzeugten Werten verglichen werden. Die Werte werden ausgedrückt als Anzahl der Bindungseinheiten pro ml. Eine Bindungseinheit entspricht in etwa einem ng Protein gemäß der Schätzung unter Verwendung eines gereinigten Fc-Fusionsproteins des Liganden als Standard. Auf diese Weise wurden die Konzentration und die spezifische Aktivität mehrerer unterschiedlicher Chargen an trimerem CD40L bestimmt.
(b) Qualitativer Dot-Blot
CD40L-Trimerisat (1 μl des rohen Überstands oder von Säulenfraktionen) wird in trockene BA85/21 Nitrocellulosemembranen (Schleicher und Schuell, Keene, NH) adsorbiert und trocknen gelassen. Die Membranen werden eine Stunde lang in Gewebekulturschalen in mit Tris (0,05 M) gepufferter Salzlösung (0,15 M) mit einem pH-Wert von 7,5 inkubiert, welche 1% Gew/Vol BSA enthält, um nicht spezifische Bindungsstellen zu blockieren. Am Ende dieser Zeit werden die Membranen dreimal in PBS gewaschen, und anti-oligomerisierender Kaninchen-Zipper-Antikörper wird mit einer Konzentration von ungefähr 10 μg/ml in PBS mit 1% BSA gewaschen, wonach die Membranen eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert werden. Die Membranen werden erneut wie beschrieben gewaschen, und ein mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) markierter Antikörper (wie z. B. Ziegen-Anti-Kaninchen-Ig; Southern Biotech, Birmingham, AL) wird mit einer Verdünnung von ungefähr 1 : 1000 in 1% BSA enthaltender PBS zugefügt. Nachdem die Membranen eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert wurden, werden sie gewaschen, und es wird ein Chromogen (d. h. ein 4-Chlornaphtol-Reagensmittel, Kirkegaard und Perry, Gaithersburg, MD) zugefügt. Nun kann sich zehn Minuten lang bei Raumtemperatur Farbe entwickeln, und die Reaktion wird durch Abspülen der Membranen mit Wasser gestoppt. Die Membranen werden gewaschen, und das Vorhandensein von CD40L wird bestimmt, indem das Vorhandensein einer blauschwarzen Farbe durch Analyse überprüft wird. Dieser Test wurde verwendet, um das Vorhandensein oder Fehlen von trimerem CD40L in Zellkulturüberstand und Reinigungssäulenfraktionen zu bestimmen. Der Test ermöglicht weiters ein semi-quantitatives Verfahren zur Bestimmung relativer Mengen an trimerem CD40L durch Vergleich der Intensität der Farbe in unbekannten Proben mit der Intensität bekannter Kontrollmengen.
BEISPIEL 2
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines menschlichen CD40L-DNA-Konstrukts, um trimeres CD40L in Eierstockzellen vom chinesischen Hamster (CHO) zu exprimieren. Trimeres CD40L enthält eine Leader-Sequenz und eine 33 Aminosäurensequenz, die als oligomerisierender Zipper (SEQ ID-Nr. 5) bezeichnet wird, gefolgt von der extrazellulären Region menschlichen CD40Ls von der Aminosäure 51 bis zur Aminosäure 261 (SEQ ID-Nr. 1). Das Konstrukt wurde hergestellt, indem die entsprechende DNA von einem plasmidhältigen menschlichen CD40L geschnitten wurde, und die DNA in den Expressionsvektor pCAVDHFR ligiert wurde. Das sich daraus ergebende Konstrukt wurde als CAV/DHFR-CD40LT bezeichnet. pCAVDHFR enthält Regulationssequenzen, die vom Cytomegalovirus, SV40 und Adenovirus 2 abgeleitet sind, zusammen mit dem Gen für die Dihydrofolatreduktase (DHFR), und es ermöglicht die zufällige Integration eines gewünschten Gens in Wirtszellenchromosomen. Die Expression von DHFR ermöglicht es den DHFR-Wirtszellen, in Medien ohne Glycin, Hypoxanthin und Thymidin (GHT) zu wachsen. Ein ähnliches Konstrukt wurde ebenfalls für die Expression von Mäuse-CD40L-Trimer in CHO-Zellen hergestellt. Zusätzlich zur Leader-Sequenz und zur oligomerisierenden Zipper-Sequenz enthielt das Mauskonstrukt auch eine Sequenz, welche das als Flag^® (weiter oben beschrieben) bezeichnete Octapeptid zwischen der Trimerisationsdomäne ("Leucin-Zipper" oder oligomerisierender Zipper) und der extrazellulären Region des Mäuse-CD40L codiert. Die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz der DNAs, welche menschliches CD40L codieren, sind in der SEQ ID-Nr. 7 bzw. 8 dargestellt. Zusätzliche Konstrukte können mit Hilfe von Standardverfahren hergestellt werden. Zum Beispiel sind auch Vektoren, welche Doppel-Promotoren enthalten, wie sie zum Beispiel im US-Patent 4,656,134 beschrieben sind, oder Vektoren, welche Verstärkersequenzen verwenden, wie sie im US-Patent 4,937,190 oder in Kaufmann et al., Nucl. Acids Res. 19: 4485, 1991, beschrieben sind, bei der Herstellung von Konstrukten zum Exprimieren von CD40L in CHO-Zellen von Nutzen.
Das sich daraus ergebende Ligationsprodukt wurde mit Hilfe von Lipofectin^®-Reagensmittel oder Lipfectamin^TM-Reagensmittel (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) in CHO-Zellen transfektiert. Beide diese Reagensmittel sind kommerziell erhältliche Reagensmittel, die dazu verwendet werden, Lipid-Nukleinsäurekomplexe (oder Liposomen) zu bilden, die beim Anwenden an kultivierten Zellen das Aufnehmen der Nucleinsäure in die Zellen erleichtern. Zellen, die mit dem pCAVDHFR-CD40LT-Konstrukt transfektiert wurden, wurden im DMEM:F12-Medium bei nicht vorhandenem GHT ausgewählt. Zellen, welche bei Abwesenheit von GHT wachsen konnten, wurden mit einem Festphasenbindungstest, wie er im Beispiel 16 beschrieben ist, auf die Produktion von CD40L getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass das Lipofectamin^TM-Reagensmittel bei diesem Transfektionssystem zu einem größeren Anteil an erfolgreichen Transfektionen führt.
Ungefähr 160 Klone wurden gescreent, und zwei positive Klone wurden identifiziert und für weitere Untersuchungen erweitert. Zellen wurden durch GHT-freies DMEM:F12 Medium hindurchgeführt und durch Überprüfung der Produktion von trimerem CD40L im oben beschriebenen Festphasenbindungstest auf deren Stabilität hin überwacht. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde ein Klon ausgewählt, der auf stabile Weise mit der CD40L-DNA transfektiert zu sein schien, und der etwa 1 μg/10⁶ Zellen/Tag trimeres CD40L produzierte und sezernierte. Zusätzliche Konstrukte, welche andere Vektoren umfassten, und alle oder ein Teil der in diesem Beispiel beschriebenen DNA-Sequenzen können verwendet werden, um zusätzlich stabil transfektierte Zelllinien herzustellen, wie sie im wesentlichen in diesem Dokument beschrieben sind.
Nachdem derartige stabil transfektierte Zelllinien identifiziert wurden, wurden großangelegte Kulturen von transfektierten Zellen gezüchtet, um einen Überstand zu sammeln, der trimeres CD40L enthielt. Geeignete Bedingungen für großangelegte Kulturen umfassen die Verwendung von Bioreaktoren. Ähnliche Verfahren wurden angewendet, um CHO-Zelllinien herzustellen, welche ein trimeres Mäuse-CD40L mit einer Menge von ungefähr 0,05 μg/10⁶ Zellen/Tag sezernierten. CHO-Zellen, die auf stabile Weise mit menschlichem oder Mäuse-CD40L-Konstrukt transfektiert wurden, nachdem sie ein DHFR-Gen vom pCAVDHFR-Plasmid erhalten haben, sind gegen Methotrexat beständig. Methotrexat kann dem Kulturmedium beigegeben werden, um die Anzahl an Kopien der CD40L-Trimerisat-DNA zu erhöhen, um die Produktion von CD40L-Trimerisat zu erhöhen.
BEISPIEL 3
Dieses Beispiel veranschaulicht die Bindungsaffinitäten mehrerer unterschiedlicher CD40L-Konstrukte. Affinitätsexperimente wurden mittels biospezifischer Interaktionsanalyse (BIA) mit Hilfe eines Biosensors durchgeführt, einem Messinstrument, welches einen biologischen Erkennungsmechanismus mit einem Fühlerelement oder Übertrager kombiniert. Ein beispielhafter Biosensor ist BIAcore^TM von Pharmacia Biosensor AB (Uppsala, Schweden; siehe Fägerstam L. G., Techniques in Protein Chemistry II, ed. J. J. Villafranca, Acad. Press, NY, 1991). BIAcore^TM verwendet die optische Oberflächen-Plasmonresonanz (Kretschmann und Raether, Z. Naturforschung, Teil A 23: 2135, 1968), um die Interaktion zweier biologischer Moleküle zu überwachen. Molekülpaare, deren Affinitätskonstanten im Bereich von 10⁵ bis 10¹⁰ M^–1 liegt, und Assoziierungsratenkonstanten im Bereich von 10³ bis 10⁶ M^–1s^–1 aufweisen, sind für die Charakterisierung mit BIAcore^TM geeignet.
Auf die Biosensor-Chips wurde Ziegen-Antimensch-IgG₁ Fc aufgetragen, welches zur Anbindung des CD40/Fc an den Chip benutzt wurde. Die unterschiedlichen Konstrukte von CD40L wurden anschließend mit jeweils stärker werdenden Konzentrationen zugefügt; der Chip wurde durch Zugabe von Natriumhydroxid zwischen den unterschiedlichen Konstrukten regeneriert. Es wurden zwei separate Experimente durchgeführt. Im ersten Experiment wurde die Bindung eines dimeren menschlichen CD40L (CD40L/Fc), eines trimeren menschlichen CD40L (CD40L/"Leucin-Zipper") und eines dimeren und trimeren Mäuse-CD40L (hergestellt im wesentlichen wie für das menschliche CD40L beschrieben) verglichen. Im zweiten Experiment wurde die Bindung von trimerem menschlichem CD40L mit der Bindung zweier unterschiedlicher Präparate aus monomerem menschlichem CD40L (welches nur den Anteil jener extrazellulären Domäne aufwies, die am stärksten homolog zu TNF war) verglichen. Die sich daraus ergebenden Daten wurden analysiert, um die Affinitäts- und die Assoziationsratenkonstanten der unterschiedlichen CD40L-Konstrukte zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 unten sowie in den 1 und 2 dargestellt.
Tabelle 1: Bindung von CD40L mit CD40/Fc
Die Analyse der Daten ergab, dass ein CD40L-Monomer, welches nur jenen Abschnitt der extrazellulären Domäne enthält, der am meisten homolog zu TNF ist, in der Lage war, CD40 zu binden, wenngleich mit einer etwas geringeren Affinität als oligomeres CD40L. Eine Analyse des Bindungsverhältnisses im zweiten Experiment zeigte, dass zweimal so viele CD40L-Monomereinheiten pro CD40/Fc-Molekül gebunden sind als trimeres CD40L, was bestätigt, dass zwei Monomere des CD40L ein CD40/Fc-Dimer binden, und ein trimeres CD40L ein CD40/Fc-Dimer bindet.
BEISPIEL 4
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung einer Anzahl von Muteinen eines CD40 Liganden-/Zipper-Fusionsproteins. Mutationen für Konstrukte, die in Hefe exprimiert werden sollten (Mutanten 14, 18, 32, 41, 43, 10PP und 18PP), wurden durch PCR-Missinkorporation (Mulrad et al., Yeast 8: 79, 1992) erzeugt und auf der Basis einer offensichtlichen Zunahme der Sekretion als verbesserte Sekretionsmutanten ausgewählt. Die Mutanten 14, 18, 32, 41 und 43 wurden in S. cerevisiae isoliert. Die Mutanten 10PP und 18PP wurden in P. pastoris isoliert. Mutationen für Konstrukte, die in Säugetierzellen (FL194.W, 194W, LZ12V, 215.T, 255.F und 194.S) exprimiert werden sollten, wurden ebenfalls mit Hilfe von PCR hergestellt und waren entweder das Ergebnis stellenbezogener Mutagenese, oder das Zufallsprodukt von PCR. Die Arten der erhaltenen Mutationen und deren Wirkung auf Aktivität (Fähigkeit CD40 in einem Festphasenbindungsassay, wie er im wesentlichen in Beispiel 1 beschrieben ist, zu binden) sind in der nachfolgenden Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2: Mutationen, die im CD40 Liganden-/Reißverschlussdomänen-Fusionsprotein vorhanden sind
Der Mutant 18PP besaß nur eine einzige Mutation im Molekül, welche ausreichend war, um die Sekretion in Hefe zu beeinflussen. Der Mutant 41 besaß zwei Mutationen, von denen beide in Isoleucinresten der Zipperdomäne waren. Die Mutationen im Zipper verbessern die Sekretion von Hefe ohne offensichtliche Auswirkungen auf die Aktivität. Der Mutant 194.W wurde in Hefezellen exprimiert und entweder durch eine Kombination von Ionenaustauschchromatographieschritten (194.W (c)) oder durch Affinitätschromatographie (194.W (a)) mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers gereinigt, der die oligomerisierende Zipperkomponente bindet. Der in Hefe exprimierte Mutant (194.W) wies in einem Biosensor-Test, der im wesentlichen wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt wurde, eine größere Affinität für CD40 auf, und er wies eine größere biologische Aktivität auf als wildes, in Hefe exprimiertes CD40 Liganden-/Zipperdomänen-Fusionsprotein (WT) in einem B-Zellen-Proliferationstest. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3: Vergleich zwischen WT und 194.W hinsichtlich der Rezeptorbindung und der B-Zellen-Proliferation
Darüber hinaus wies FL194W, das in Säugetierzellen exprimiert wurde, auch eine höhere Bindung auf als WT CD40L in einer semi-quantitativen Western-Blot-Analyse.
Zusätzliche Konstrukte wurden durch Substitution der Trimerisationsdomäne (SEQ ID Nr. 6; Hoppe et al., FEBS Letters 344: 191, 1994) des Lungenoberflächenproteins D (SPD) anstelle des Trimer-bildenden Reißverschlusses der SEQ ID Nr. 5 hergestellt. Dieses Konstrukt wird in S. cerevisiae und in Säugetierzellen in geringem Grad exprimiert. Die Aktivität wird wie zuvor beschrieben bestimmt; verschiedene Mutanten, die auf solchen Konstrukten basieren, können ebenfalls hergestellt werden, um die Sekretion oder andere Produkteigenschaften zu optimieren, wie dies oben beschrieben ist.
BEISPIEL 5
Dieses Beispiel veranschaulicht die Bindungsaffinitäten mehrerer unterschiedlicher CD40L-Konstrukte. Affinitätsexperimente wurden durch biospezifische Interaktionsanalyse (BIA) durchgeführt, die im wesentlichen im Beispiel 3 beschrieben ist, wobei zwei der Konstrukte verwendet wurden, die im Beispiel 4 beschrieben sind.
Die in Tabelle 4 präsentierten Ergebnisse zeigen die Durchschnittswerte, die für zwei unterschiedliche Präparate von wildem (WT) CD40LT und drei unterschiedliche Präparate von Mutein (194.W) erhalten wurden. Die Ergebnisse sind unten dargestellt.
Tabelle 4: Bindung von CD40LT an CD40/Fc
Diese Ergebnisse bestätigen, dass das CD40LT 194.W eine höhere Affinität für CD40/Fc besitzt als wildes CD40LT.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte DNA, welche ein CD40L-Mutein codiert, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer DNA, welche ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID Nr. 2 besitzt, wobei ein Cystein an der Aminosäure 194 durch Tryptophan ersetzt ist, und (b) einer DNA, welche ein Polypeptid codiert, bei dem es sich um ein Fragment des Muteins (a) handelt, das Tryptophan an der Aminosäure 194 enthält, und welche das Polypeptid CD40 bindet.
Isolierte DNA nach Anspruch 1, welche ein Polypeptid codiert, das aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden ausgewählt wird, welche die Aminosäuren 1 bis 261, 35 bis 261, 34 bis 225, 113 bis 261, 113 bis 225, 120 bis 261, oder 120 bis 225 der SEQ-ID Nr. 2 enthält.
Isolierte DNA nach Anspruch 2, welche weiters eine DNA enthält, die einen oligomerisierenden Zipper codiert, der durch eine SEQ-ID Nr. 5 repräsentierte Aminosäuresequenz besitzt.
Isolierte DNA nach Anspruch 3, wobei die DNA ein Fusionsprotein codiert, umfassend den oligomerisierenden Reißverschluss, der mit dem amino-proximalen Ende eines Fragments der extrazellulären Domäne von CD40L, bestehend aus den Aminosäuren 113 bis 261 der SEQ-ID Nr. 2, verschmolzen ist.
Rekombinierter Expressionsvektor, der eine DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.
Wirtszelle, welche mit einem rekombinierten Expressionsvektor nach Anspruch 5 transformiert oder transfektiert ist.
Verfahren zur Herstellung eines CD40L-Polypeptids, welches die Züchtung einer Wirtszelle nach Anspruch 6 unter Bedingungen aufweist, welche die Expression und Wiedergewinnung des CD40L-Polypeptids aus der Kultur fördern.
CD40L-Polypeptid, das von einer DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wurde.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Polypeptid nach Anspruch 8, zusammen mit einer Trägersubstanz, einem Arzneimittelträger oder einem Verdünnungsmittel aufweist.
CD40L-Polypeptid nach Anspruch 8 oder eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9 für die Verwendung bei der Induktion einer Immunglobulinsekretion.
CD40L-Polypeptid nach Anspruch 8 oder eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9 für die Verwendung bei der Induktion einer B-Zellen-Proliferation.