JP5401312B2 - 組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体 - Google Patents
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Description
本発明は、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）由来のＣ−末端α−アミド化酵素が有する５本のジスルフィド結合の内の少なくとも１本のジスルフィド結合が形成されない組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体、当該誘導体をコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含有する発現ベクター、当該発現ベクターにより形質転換された大腸菌、及び当該大腸菌を用いる当該誘導体の製造方法に関する。
特に、本発明は、Ｃ−末端α−アミド化酵素の遺伝子組換え技術を用いた製造時のリフォールディングにおいて形成されうる５本のジスルフィド結合の内の、少なくとも１つの特定のジスルフィド結合の形成を妨げることにより、その酵素活性が高められた組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体に関する。
特に、本発明は、Ｃ−末端α−アミド化酵素の遺伝子組換え技術を用いた製造時のリフォールディングにおいて形成されうる５本のジスルフィド結合の内の、少なくとも１つの特定のジスルフィド結合の形成を妨げることにより、その酵素活性が高められた組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体に関する。
Ｃ−末端α−アミド化酵素（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅＩ、ＥＣ １．１４．１７．３）は、真核生物に存在する一部の生理活性ペプチド（ペプチドホルモン、神経ペプチド、ペプチド毒素など）やタンパク質のＣ末端アミド構造を形成させる酵素である。このＣ末端アミド構造は、これらのペプチド又はタンパク質の生理活性作用の発現のために不可欠であることが知られている。例えば、ヒト・カルシトニンの場合、天然型のＣ−末端プロリンアミド残基をプロリン残基に変換すると、生理活性が１６００分の１にも低下することが知られている。
また、アフリカツメガエル由来のＣ−末端アミド化酵素自体は、日本国特許第２５９８０５０号（登録日平成９（１９９７）年１月９日）に、それをコードする遺伝子は、日本国特許第２５８１５２７号（登録日平成８（１９９６）年１１月２１日）に、それぞれ、開示されている。
Ｃ末端アミド構造を有するペプチドやタンパク質の前駆体構造の解析から、Ｃ末端α−アミド化酵素の基質では、アミド化（−ＣＯＯＨ基を−ＣＯＮＨ２基へ変換すること）される残基のＣ末端側には常にグリシン（Ｇｌｙ）が存在しており、一般式Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ（式中、ＸはＣ−末端α−アミド化される任意のアミノ酸残基を示し、Ｇｌｙはグリシン残基を示し、そしてＲは当該ペプチド又はタンパク質の残りの部分を示す）であることが知られている。このＧｌｙに対して、銅イオンを介した酸化（第１段階：Ｇｌｙのα炭素の水酸化）、及び脱アルキル化（第２段階：グリオキシル酸の遊離）の２段階で反応が行なわれ、基質のＣ末端がアミド化される。このアミド化酵素の最大酵素活性を得るためには、分子状酸素、銅イオン（Ｃｕ２＋）の他に、アスコルビン酸が必要であると報告されている（Ｂｅｔｔｙ Ａ．Ｅｉｐｐｅｒ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｅ．Ｍａｉｎｓ，ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｃ．Ｇｌｅｍｂｏｔｓｋｉ ″Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ Ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ−ａｍｉｄａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｔｈａｔ Ａｃｔｓ ｏｎ Ｇｌｙｃｉｎｅ−Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｘｙｇｅｎ，Ｃｏｐｐｅｒ，ａｎｄ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ″ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８０，５１４４−５１４８，１９８３を参照のこと）。
一般に、このようなアミド化を始めとするリン酸化、アシル化などの修飾は、ｍＲＮＡからの翻訳の後に行なわれるため、翻訳後修飾と呼ばれ真核細胞のみに見られる現象である。組換えタンパク質やペプチドの生産に広く用いられている大腸菌のような原核細胞は、かかるｍＲＮＡの翻訳後修飾を行なうことができない。現在までに解明されてきた真核細胞のアミド化ペプチドの生合成機構を考えれば、以下に示す方法により、大腸菌のような原核細胞を用いた遺伝子組換え法によりアミド化ペプチドを大量生産することができる。
一般式Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙで示されるアミド化ペプチド前駆体を組換え体として大腸菌などの原核細胞で大量発現させ、そして真核細胞由来のＣ−末端α−アミド化酵素を十分量確保し、さらにアミド化ペプチドが生産される最適反応条件下ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、当該アミド化ペプチド前駆体を当該Ｃ−末端α−アミド化酵素により処理することにより、アミド化ペプチドを大量かつ安価に製造することができる。事実、現在までに、このような方法により、以下に説明するように、アミド化ペプチドを製造しようとする試みがなされてきた。
Ｕｎｉｇｅｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＮＪ ０７００４． ″Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓａｌｍｏｎ ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ ｂｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｍｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ．″ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ Ｙ）．１９９３ Ｊａｎ；１１（１）：６４−７０は、大腸菌を用いた遺伝子操作によりサケ由来カルシトニン（ｓＣＴ）をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの一部と融合させて発現させた後、スルホン化、臭化シアンにより切断後、これとは別にＣＨＯ細胞により発現させたＣ−末端アミド化酵素を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＣ末端をアミド化する方法について報告している。
また、特開平７−１６３３４０号公報は、同様にＣＨＯ細胞により発現させたアミド化酵素を利用したヒト由来カルシトニン（ｈＣＴ）の製造方法について記載している。
これらの方法においては、着目のタンパク質のＣ−末端アミド化に使用されるＣ−末端α−アミド化酵素は、動物細胞であるＣＨＯ細胞により製造されたものである。
しかし、一般に、動物細胞を用いた組換えタンパク質の生産は、培養期間が長いため、単位時間あたりの生産性が低いこと等が課題として挙げられる。この課題を解決する方法として、例えば、特開平７−２５０６９１号公報に示すように、より短い培養期間で生産できる大腸菌を利用した方法が開発されてきた。
この方法は、アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ Ｉ、ＥＣ １．１４．１７．３）を遺伝子操作により、大腸菌内で大量に発現させる方法である。しかしながら、この方法で発現させたＣ−末端α−アミド化酵素及びその誘導体は、大腸菌内でそのほとんどが封入体（タンパク質のアミノ酸配列は同一であるが、高次構造を有していない、つまりは不溶性顆粒と呼ばれる不活性なタンパク質の塊）を形成しており、Ｃ−末端α−アミド化酵素活性を示さない。
したがって、この様な方法で製造した不活性な酵素は、何らかの方法を用いて活性型に変換する（例えば、リフォールディングする）ことが必要となる。このため、特開平７−２５０６９１号公報に記載の発明においては、大腸菌で発現させたＣ−末端α−アミド化酵素を尿素又はグアニジン塩酸塩などの変性剤で処理した後、変性剤濃度を低下させることによりリフォールディングさせた。しかしながら、この方法で得られる酵素の酵素活性量は、培養液１ｍＬ当り約１０〜１５ｍＵであり、特開平７−１６３３４０号公報に記載の発明におけるＣＨＯ細胞により発現させたアミド化酵素の酵素活性量２，８６０Ｕ（培養液１ｍＬ当り）に比べ低いものであった。
また、アフリカツメガエル由来のＣ−末端アミド化酵素自体は、日本国特許第２５９８０５０号（登録日平成９（１９９７）年１月９日）に、それをコードする遺伝子は、日本国特許第２５８１５２７号（登録日平成８（１９９６）年１１月２１日）に、それぞれ、開示されている。
Ｃ末端アミド構造を有するペプチドやタンパク質の前駆体構造の解析から、Ｃ末端α−アミド化酵素の基質では、アミド化（−ＣＯＯＨ基を−ＣＯＮＨ２基へ変換すること）される残基のＣ末端側には常にグリシン（Ｇｌｙ）が存在しており、一般式Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ（式中、ＸはＣ−末端α−アミド化される任意のアミノ酸残基を示し、Ｇｌｙはグリシン残基を示し、そしてＲは当該ペプチド又はタンパク質の残りの部分を示す）であることが知られている。このＧｌｙに対して、銅イオンを介した酸化（第１段階：Ｇｌｙのα炭素の水酸化）、及び脱アルキル化（第２段階：グリオキシル酸の遊離）の２段階で反応が行なわれ、基質のＣ末端がアミド化される。このアミド化酵素の最大酵素活性を得るためには、分子状酸素、銅イオン（Ｃｕ２＋）の他に、アスコルビン酸が必要であると報告されている（Ｂｅｔｔｙ Ａ．Ｅｉｐｐｅｒ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｅ．Ｍａｉｎｓ，ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｃ．Ｇｌｅｍｂｏｔｓｋｉ ″Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ Ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ−ａｍｉｄａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｔｈａｔ Ａｃｔｓ ｏｎ Ｇｌｙｃｉｎｅ−Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｘｙｇｅｎ，Ｃｏｐｐｅｒ，ａｎｄ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ″ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８０，５１４４−５１４８，１９８３を参照のこと）。
一般に、このようなアミド化を始めとするリン酸化、アシル化などの修飾は、ｍＲＮＡからの翻訳の後に行なわれるため、翻訳後修飾と呼ばれ真核細胞のみに見られる現象である。組換えタンパク質やペプチドの生産に広く用いられている大腸菌のような原核細胞は、かかるｍＲＮＡの翻訳後修飾を行なうことができない。現在までに解明されてきた真核細胞のアミド化ペプチドの生合成機構を考えれば、以下に示す方法により、大腸菌のような原核細胞を用いた遺伝子組換え法によりアミド化ペプチドを大量生産することができる。
一般式Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙで示されるアミド化ペプチド前駆体を組換え体として大腸菌などの原核細胞で大量発現させ、そして真核細胞由来のＣ−末端α−アミド化酵素を十分量確保し、さらにアミド化ペプチドが生産される最適反応条件下ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、当該アミド化ペプチド前駆体を当該Ｃ−末端α−アミド化酵素により処理することにより、アミド化ペプチドを大量かつ安価に製造することができる。事実、現在までに、このような方法により、以下に説明するように、アミド化ペプチドを製造しようとする試みがなされてきた。
Ｕｎｉｇｅｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＮＪ ０７００４． ″Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓａｌｍｏｎ ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ ｂｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｍｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ．″ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ Ｙ）．１９９３ Ｊａｎ；１１（１）：６４−７０は、大腸菌を用いた遺伝子操作によりサケ由来カルシトニン（ｓＣＴ）をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの一部と融合させて発現させた後、スルホン化、臭化シアンにより切断後、これとは別にＣＨＯ細胞により発現させたＣ−末端アミド化酵素を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＣ末端をアミド化する方法について報告している。
また、特開平７−１６３３４０号公報は、同様にＣＨＯ細胞により発現させたアミド化酵素を利用したヒト由来カルシトニン（ｈＣＴ）の製造方法について記載している。
これらの方法においては、着目のタンパク質のＣ−末端アミド化に使用されるＣ−末端α−アミド化酵素は、動物細胞であるＣＨＯ細胞により製造されたものである。
しかし、一般に、動物細胞を用いた組換えタンパク質の生産は、培養期間が長いため、単位時間あたりの生産性が低いこと等が課題として挙げられる。この課題を解決する方法として、例えば、特開平７−２５０６９１号公報に示すように、より短い培養期間で生産できる大腸菌を利用した方法が開発されてきた。
この方法は、アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ Ｉ、ＥＣ １．１４．１７．３）を遺伝子操作により、大腸菌内で大量に発現させる方法である。しかしながら、この方法で発現させたＣ−末端α−アミド化酵素及びその誘導体は、大腸菌内でそのほとんどが封入体（タンパク質のアミノ酸配列は同一であるが、高次構造を有していない、つまりは不溶性顆粒と呼ばれる不活性なタンパク質の塊）を形成しており、Ｃ−末端α−アミド化酵素活性を示さない。
したがって、この様な方法で製造した不活性な酵素は、何らかの方法を用いて活性型に変換する（例えば、リフォールディングする）ことが必要となる。このため、特開平７−２５０６９１号公報に記載の発明においては、大腸菌で発現させたＣ−末端α−アミド化酵素を尿素又はグアニジン塩酸塩などの変性剤で処理した後、変性剤濃度を低下させることによりリフォールディングさせた。しかしながら、この方法で得られる酵素の酵素活性量は、培養液１ｍＬ当り約１０〜１５ｍＵであり、特開平７−１６３３４０号公報に記載の発明におけるＣＨＯ細胞により発現させたアミド化酵素の酵素活性量２，８６０Ｕ（培養液１ｍＬ当り）に比べ低いものであった。
従って、本発明は、大腸菌を用いた遺伝子組換え法により製造される従来技術の酵素に比較して、より高い酵素活性量を有する組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体を提供しようとするものである。
本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するアフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素の遺伝子組換え技術を用いた製造時のリフォールディングにおいて形成されうる５本のジスルフィド結合の内の、少なくとも１つの特定のジスルフィド結合の形成を妨げられるようにそのアミノ酸配列が改変された組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体を大腸菌内で発現させ、得られる封入体を非還元状態で可溶化した後、リフォールディング操作を行うことで、大腸菌を用いた遺伝子組換え法により製造される従来技術の酵素に比較して、より高い酵素活性を有する組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体を提供する。
具体的には、上記課題は、以下の［１］〜［７］により解決される：
［１］以下の：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、６番目、１４５番目、４０番目、８５番目、２５２番目、及び２７４番目のシステイン残基から成る群から選ばれる少なくとも１つのシステイン残基が改変されているアミノ酸配列を有するポリペプチド；又は
（ｂ）上記（ａ）に記載の改変されたアミノ酸配列において、システイン残基以外のアミノ酸残基の内の１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、Ｃ−末端α−アミド化酵素活性を有するポリペプチド；
から成る組換えＣ−末端αアミド化酵素誘導体であって、６番目と１４５番目のシステイン残基の間、４０番目と８５番目のシステイン残基の間、及び２５２番目と２７４番目のシステイン残基の間の少なくとも１つの間ではジスルフィド結合が形成されていない前記組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体。
［２］配列番号２に示すアミノ酸配列において７３番目と９０番目のシステイン残基の間、及び１８６番目と２９３番目のシステイン残基の間ではジスルフィド結合が形成されている、前記［１］に記載のＣ−末端α−アミド化酵素誘導体。
［３］前記改変が他のアミノ酸による置換又は欠失である、前記［１］又は［２］に記載のＣ−末端α−アミド化酵素誘導体。
［４］ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）、ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、又はＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）である、前記［１］〜［３］に記載のＣ−末端α−アミド化酵素誘導体。
［５］前記［１］〜［４］のいずれかに記載の組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体をコードするＤＮＡ。
［６］前記［５］に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
［７］前記［６］に記載の発現ベクターにより形質転換された大腸菌。
［８］前記［７］に記載の大腸菌を培養して、組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体を発現させ、そして得られた誘導体を回収するステップを含む、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体の製造方法。
本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するアフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素の遺伝子組換え技術を用いた製造時のリフォールディングにおいて形成されうる５本のジスルフィド結合の内の、少なくとも１つの特定のジスルフィド結合の形成を妨げられるようにそのアミノ酸配列が改変された組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体を大腸菌内で発現させ、得られる封入体を非還元状態で可溶化した後、リフォールディング操作を行うことで、大腸菌を用いた遺伝子組換え法により製造される従来技術の酵素に比較して、より高い酵素活性を有する組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体を提供する。
具体的には、上記課題は、以下の［１］〜［７］により解決される：
［１］以下の：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、６番目、１４５番目、４０番目、８５番目、２５２番目、及び２７４番目のシステイン残基から成る群から選ばれる少なくとも１つのシステイン残基が改変されているアミノ酸配列を有するポリペプチド；又は
（ｂ）上記（ａ）に記載の改変されたアミノ酸配列において、システイン残基以外のアミノ酸残基の内の１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、Ｃ−末端α−アミド化酵素活性を有するポリペプチド；
から成る組換えＣ−末端αアミド化酵素誘導体であって、６番目と１４５番目のシステイン残基の間、４０番目と８５番目のシステイン残基の間、及び２５２番目と２７４番目のシステイン残基の間の少なくとも１つの間ではジスルフィド結合が形成されていない前記組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体。
［２］配列番号２に示すアミノ酸配列において７３番目と９０番目のシステイン残基の間、及び１８６番目と２９３番目のシステイン残基の間ではジスルフィド結合が形成されている、前記［１］に記載のＣ−末端α−アミド化酵素誘導体。
［３］前記改変が他のアミノ酸による置換又は欠失である、前記［１］又は［２］に記載のＣ−末端α−アミド化酵素誘導体。
［４］ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）、ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、又はＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）である、前記［１］〜［３］に記載のＣ−末端α−アミド化酵素誘導体。
［５］前記［１］〜［４］のいずれかに記載の組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体をコードするＤＮＡ。
［６］前記［５］に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
［７］前記［６］に記載の発現ベクターにより形質転換された大腸菌。
［８］前記［７］に記載の大腸菌を培養して、組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体を発現させ、そして得られた誘導体を回収するステップを含む、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体の製造方法。
図１は、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ由来のＣ−末端α−アミド化酵素とＲａｔ由来のＣ−末端α−アミド化酵素のアミノ酸配列の比較を示す。上段がアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）由来、下段がラット（Ｒａｔ）由来のアミノ酸配列である。ここでは、Ｃ−末端α−アミド化酵素の成熟タンパク質のＮ末端側にシグナル配列、Ｃ末端側に膜貫通ドメインを有する配列を示す。下線部分は、両種の間で保存されているアミノ酸残基を示し、約６５％の相同性を有している。囲み部は、両種のシステイン残基を示し、極めて高く保存されていることが分かる。
図２は、アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素におけるＳ−Ｓ結合の推定部位を示す図である。図２に示すとおり、ラット由来Ｃ−末端α−アミド化酵素の立体構造におけるＳ−Ｓ結合部位から、アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素は、６Ｃｙｓ−１４５Ｃｙｓ、４０Ｃｙｓ−８５Ｃｙｓ、７３Ｃｙｓ−９０Ｃｙｓ、１８６Ｃｙｓ−２９３Ｃｙｓ、及び２５２Ｃｙｓ−２７４Ｃｙｓの間で５対のＳ−Ｓ結合が形成されると、推定される。
図３は、ＰＣＲ法による変異導入の模式図である。
図４は、誘導体ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）、及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）遺伝子断片を得るためのＤＮＡプライマー塩基配列を示す。囲み部は、制限酵素ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）、及びＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）を示す。リーディング・フレームを合わせるためのグアニン（Ｇ）の１塩基挿入部分、及び終結コドンを、下線で示す。システインをアラニンで置換する変異部位を二重下線で示す。
図５は、誘導体ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）遺伝子断片を得るためのＤＮＡプライマー塩基配列を示す。囲み部は、制限酵素ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）、及びＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）を示す。リーディング・フレームを合わせるためのグアニン（Ｇ）の１塩基挿入部分、及び終結コドンを、下線で示す。システインをアラニンで置換する変異部位を二重下線で示す。
図６は、アミド化酵素及び誘導体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる発現確認の結果を示す。各レーンは以下の通りである：
レーン１及び１３：マーカー（分子量：１７５、８３、６２、４７．５、３２．５、２５、１６．５、６．５ｋＤａ）
レーン２：ＡＥ−Ｉ［１−３２１］
レーン３：ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）
レーン４：ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）
レーン５：ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）
レーン６：ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）
レーン７：ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）
レーン８：ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）
レーン１１：ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）
レーン９、１０、及び１２：−。
図７は、アミド化酵素及び誘導体の透析後タンパク質の濃度と酵素活性量の測定結果を示す表である。
図２は、アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素におけるＳ−Ｓ結合の推定部位を示す図である。図２に示すとおり、ラット由来Ｃ−末端α−アミド化酵素の立体構造におけるＳ−Ｓ結合部位から、アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素は、６Ｃｙｓ−１４５Ｃｙｓ、４０Ｃｙｓ−８５Ｃｙｓ、７３Ｃｙｓ−９０Ｃｙｓ、１８６Ｃｙｓ−２９３Ｃｙｓ、及び２５２Ｃｙｓ−２７４Ｃｙｓの間で５対のＳ−Ｓ結合が形成されると、推定される。
図３は、ＰＣＲ法による変異導入の模式図である。
図４は、誘導体ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）、及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）遺伝子断片を得るためのＤＮＡプライマー塩基配列を示す。囲み部は、制限酵素ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）、及びＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）を示す。リーディング・フレームを合わせるためのグアニン（Ｇ）の１塩基挿入部分、及び終結コドンを、下線で示す。システインをアラニンで置換する変異部位を二重下線で示す。
図５は、誘導体ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）遺伝子断片を得るためのＤＮＡプライマー塩基配列を示す。囲み部は、制限酵素ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）、及びＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）を示す。リーディング・フレームを合わせるためのグアニン（Ｇ）の１塩基挿入部分、及び終結コドンを、下線で示す。システインをアラニンで置換する変異部位を二重下線で示す。
図６は、アミド化酵素及び誘導体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる発現確認の結果を示す。各レーンは以下の通りである：
レーン１及び１３：マーカー（分子量：１７５、８３、６２、４７．５、３２．５、２５、１６．５、６．５ｋＤａ）
レーン２：ＡＥ−Ｉ［１−３２１］
レーン３：ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）
レーン４：ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）
レーン５：ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）
レーン６：ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）
レーン７：ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）
レーン８：ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）
レーン１１：ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）
レーン９、１０、及び１２：−。
図７は、アミド化酵素及び誘導体の透析後タンパク質の濃度と酵素活性量の測定結果を示す表である。
上述のように、大腸菌内で発現させたＣ−末端α−アミド化酵素が活性を示さない封入体として発現されるという問題に対し、特開平７−２５０６９１号公報に記載の発明においては、大腸菌内で発現させた封入体を尿素又はグアニジン塩酸塩などの変性剤で処理した後、リフォールディングさせることにより部分的にこの問題を解決した。しかしながら、この方法で得られる酵素の酵素活性量は培養液１ｍＬ当り約１０〜１５ｍＵと低いものであった。
本発明者らは、このような低い酵素活性量の原因は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するアフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素内に複数個存在しているシステイン残基当該酵素の一つは分子内に１０個のシステイン残基（すなわち、５対のＳ−Ｓ結合）を有している）が、天然型と同じジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）を形成することができないこと、つまりリフォールディング時にＳ−Ｓ結合の掛け違いが起きていることであると推定した。
アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素内のＳ−Ｓ結合位置は、これまでに明らかになっていない。そこで、本発明者らは、既に結晶構造が解析され、Ｓ−Ｓ結合の位置が同定されているラット由来のＣ−末端α−アミド化酵素のアミノ酸配列と、アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素のアミノ酸配列の相同性を検討し、両者が６５．２％と高い相同性を有しており、かつ、配列番号２に示すアミノ酸配列に相当する領域においてシステイン残基の位置が完全に保存されていることを明らかとした。そしてＳ−Ｓ結合の位置が両者で同様であると推定した。
そして、本発明者らは、リフォールディング時にＳ−Ｓ結合の掛け違いが起きているとのかかる推定を実証するために、アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素を用い、そのアミノ酸配列に含まれる特定のシステインをアラニンで置換し又は欠失させて、当該酵素誘導体が形成しうる５対のジスルフィド結合の内の少なくとも１対が形成されないように修飾した組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体を作製し、Ｓ−Ｓ結合の掛け違いが起こる確率を低く抑えることにより、より高い酵素活性量を有する組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体を高収率で取得することを計画した。
ところで、本分野においては、Ｓ−Ｓ結合を分子内に有するタンパク質に関しては、より高い酵素活性量を有する当該タンパク質を取得するために、Ｓ−Ｓ結合を新たに導入して、当該タンパク質の安定性を向上させる手法が一般的であり、Ｓｈｉｍｉｚｕ−Ｉｂｕｋａ Ａ，ｅｔ ａｌ．″Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｂｏｎｄ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｃｌａｓｓ Ａ ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ Ｔｏｈｏ−１．″ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００６ Ａｕｇ；１７６４（８）：１３４９−５５．Ｅｐｕｂ ２００６ Ｊｕｎ ２７、及びＳｉａｄａｔ ＯＲ ｅｔ ａｌ ″Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ．″ ＢＭＣ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００６ Ａｐｒ １６；７：１２に記載されるように様々な報告がなされている。Ｓｉａｄａｔ ＯＲ ｅｔ ａｌにおいては、アセチルコリンエステラーゼに、Ｓ−Ｓ結合を新たに導入することにより、野生型に比較して５０℃での安定性を約１７０倍にまで向上させたことや、変性剤、有機溶媒、さらにはプロテアーゼによる分解に対しても耐性を持たせることに成功している。
これに反し、これまでに本発明におけるような目的タンパク質からＳ−Ｓ結合を除去することにより酵素活性の向上や安定化を図る方法に関する報告はない。すなわち、Ｓ−Ｓ結合の除去は、目的タンパク質の構造的な安定性や活性の低下を引き起こす可能性があるので、Ｓ−Ｓ結合を除去することにより、所望の活性を有する目的タンパク質を所得することは困難であると当業者に予想されていた。
用語の定義
本願明細書における配列番号２に示すアミノ酸配列の番号は、Ｃ−末端α−アミド化酵素（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ Ｉ、ＥＣ １．１４．１７．３）の成熟タンパク質のＮ末端セリン残基を１番として付与している。ここで、システイン残基の位置は、それぞれ、配列番号２におけるアミノ酸番号６、４０、７３、８５、９０、１４５、１８６、２５２、２７４、及び２９３である。
本明細書中、システイン残基に関する用語「改変」とは、非制限的に、当該システイン残基の欠失、他のアミノ酸残基による置換、当該システイン残基を有するアミノ酸配列の除去又は当該システイン残基のチオール基に保護基を付加するなどの修飾であって、配列番号２で示されるアミノ酸配列の６番目と１４５番目のシステイン残基の間、４０番目と８５番目のシステイン残基の間、及び２５２番目と２７４番目のシステイン残基の間の少なくとも１つの間でジスルフィド結合が形成されないようにする修飾のいずれをも包含する。
本明細書中、用語「Ｃ−末端α−アミド化酵素」とは、Ｃ末端アミド構造を有するペプチドやタンパク質の前駆体のＣ末端側にあるグリシン残基のアミド化（−ＣＯＯＨ基を−ＣＯＮＨ２基へ変換すること）における銅イオンを介した酸化（第１段階：Ｇｌｙのα炭素の水酸化）を触媒する能力を有する酵素であり、特に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する酵素である。
本明細書中、用語「Ｃ−末端α−アミド化酵素誘導体」とは、上述のＣ−末端α−アミド化酵素のアミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する酵素である。
本明細書中、用語「Ｃ−末端α−アミド化酵素活性」とは、アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ Ｉ、ＥＣ １．１４．１７．３）の酵素活性と同様の酵素活性を意味する。
本明細書中、用語「ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）」は、アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素ＡＥ−Ｉ（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ Ｉ、ＥＣ １．１４．１７．３）の成熟タンパク質のうち、１番目のセリン残基から３２１番目のメチオニン残基に相当する領域のアミノ酸の一次配列（配列番号２）を有し、かつ、４０番目のシステイン残基がアラニン残基で、そして８５番目のシステイン残基がアラニン残基で置換されたアミノ酸配列（配列番号２７）を有するポリペプチドを意味する。用語「ＡＥ−Ｉ［１−３２１］」、用語「ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）」（配列番号３３）、用語「ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）」（配列番号３７）、用語「ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）」（配列番号２９）、及び用語「ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）」（配列番号３１）も同様の意味をもつ。尚、「ＡＥ−Ｉ［１−３２１］」を除き、これらは、単に、Ｃ−末端α−アミド化酵素の誘導体ともいう。
本明細書中、用語「ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）」は、アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｇｌｕｃｉｎｅ ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ Ｉ，ＥＣ１．１４．１７．３）のうち、Ｎ末端側に存在する３７個のアミノ酸からなるシグナル配列を除いた、セリン残基を１番目とし、３２１番目のメチオニン残基までのアミノ酸の一次配列において、１番目のセリン残基から７番目のロイシン残基までを欠失し、８番目のグリシン残基から３２１番目のメチオニン残基までを有し、かつ、１４５番目のシステイン残基がアラニン残基で置換されたアミノ酸配列（配列番号２５）を有するポリペプチドを意味する。ここで、１番目のセリン残基から７番目のロイシン残基までのフラグメントの欠失により、６番目のシステイン残基を欠失させている。用語「ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）」は、上述のように８番目のグリシン残基から３２１番目のメチオニン残基までを有し、かつ、１４５番目のシステイン残基がアラニン残基で、４０番目のシステイン残基がアラニン残基で、８５番目のシステイン残基がアラニン残基で置換されたアミノ酸配列（配列番号３５）を有するポリペプチドを意味する。これらは単に、Ｃ−末端α−アミド化酵素の誘導体ともいう。
酵素活性の測定方法及びＵｎｉｔ
酵素活性の測定には、特に大腸菌で発現させた場合、菌体粉砕後、大部分は沈殿画分に回収されるので、この沈殿画分を６Ｍ塩酸グアニジンで可溶化した後、塩酸グアニジン溶液で透析して調製した試料を用いる。一般に、Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙで表される基質又は発現したアミド化ペプチドを用い、これがＲ−Ｘ−ＣＯＮＨ２に変換される（例えば、合成基質〔１２５Ｉ〕−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙの〔１２５Ｉ〕−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ２への変換反応）により、酵素活性が測定できる。すなわち、まず、標識基質（標識Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ）をトリス塩酸バッファー中で被験酵素液と反応させる。これにトリス塩酸バッファーと酢酸エチルを加え、混合後、遠心分離して有機溶媒と水層を分離させる。ここで、未反応標識基質（標識Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ）の大部分が水層に、そしてアミド化された標識基質（標識Ｒ−Ｘ−ＣＯＮＨ２）が有機溶媒層に移行するために、両者を容易に分離することができる。Ｃ−末端アミド化生成物への変換率は、総放射能活性に対する有機溶媒層の放射能活性の比から求めることができる。当該測定法において、１時間当り、１ｐｍｏｌの標識Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ（基質）が標識Ｒ−Ｘ−ＣＯＮＨ２に５０％変換する酵素活性を１Ｕｎｉｔとして定義する。
なお、酸化反応後にアルカリ（水酸化ナトリウム）を添加することで、脱アルキル化させてアミド化酵素活性を評価した。
まず、測定するサンプルを２μＬ、１０μＬ及び１００μＬ取り、それぞれ蒸留水を加えて全量１００μＬとする。これに、１０ｍＭアスコルビン酸２５μｌ、２００μＭ硫酸銅２５μｌ、２０ｍｇ／ｍｌカタラーゼ１．２５μｌ、１％Ｌｕｂｒｏｌ ２０μｌ、〔１２５Ｉ〕−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ ２ｐｍｏｌ、１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．０）５０μｌ及び蒸留水２５μｌを加え、３７℃で１時間反応させた。反応後、反応液に２５０ｍＭ ＮａＯＨ ２５０μｌを加え、混合し、１５分間室温に置いた後（脱アルキル化）、１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．０）５００μｌと酢酸エチル２ｍｌを加え、混合し、遠心分離した。次に、酢酸エチル層１ｍｌを分取し、それと残りの溶液の放射能とを、ガンマ・カウンターを用いて測定することにより、酢酸エチル層へ移行した放射能の割合を求める。尚、この方法で、Ｃ−末端アミド化された〔１２５Ｉ〕−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＣＯＮＨ２は特異的に、酢酸エチル層へ移行することは液体クロマトグラフィー及びガンマ・カウンターによる測定により確認されている。酵素活性は、１時間当り、１ｐｍｏｌの標識Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ（基質）が標識Ｒ−Ｘ−ＣＯＮＨ２に５０％変換する酵素活性を１Ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義する。
図１に、本願発明に係るアフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ Ｉ、ＥＣ １．１４．１７．３）と、Ｐｒｉｇｇｅ ＳＴ，Ｋｏｌｈｅｋａｒ ＡＳ，Ｅｉｐｐｅｒ ＢＡ，Ｍａｉｎｓ ＲＥ，Ａｍｚｅｌ ＬＭ． ″Ａｍｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ： ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｙｌｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ．″Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９７ Ｎｏｖ １４；２７８（５３４１）：１３００−５で既に結晶構造が解析されているラット由来の当該酵素のアミノ酸配列のアラインメントを示す。図１から分かるように、両者は、６５．２％と高い相同性を有しており、かつ、配列番号２に記載のアミノ酸配列に相当する領域中に存在するシステイン残基の位置は完全に保存されている。
図２に、Ｐｒｉｇｇｅ ＳＴらにおいて、既に結晶構造が解析され、そのＳ−Ｓ結合の位置が同定されているラット由来のＣ−末端α−アミド化酵素の立体構造を示す。本発明者らは、当該立体構造におけるＳ−Ｓ結合の位置から、本発明に係るアフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素では、６Ｃｙｓ−１４５Ｃｙｓ、４０Ｃｙｓ−８５Ｃｙｓ、７３Ｃｙｓ−９０Ｃｙｓ、１８６Ｃｙｓ−２９３Ｃｙｓ、及び２５２Ｃｙｓ−２７４Ｃｙｓの間で５対のＳ−Ｓ結合が形成されることにより、立体構造が維持されると推定した。
かかるＳ−Ｓ結合の位置の推定に基づき、少なくとも１つのＳ−Ｓ結合が形成されない組換えポリペプチドを作製した。すなわち、アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素ＡＥ−Ｉのアミノ酸配列の１番目から３２１番目までのアミノ酸１次配列をコードする配列を含むプラスミド、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］を野生型とし、これを基に少なくとも１つのＳ−Ｓ結合が形成されないようなプラスミドを作製した。これらのプラスミドは、ｔｒｃ（ｌａｃとｔｒｐの融合型）プロモーター支配下、大腸菌内で発現されるようにデザインされたプラスミドであった。
ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］を鋳型に用い、Ｓ−Ｓ結合を形成することができる対のシステイン残基を、部位特異的突然変異により、アラニン残基で置換又は欠失することにより、上記５対のＳ−Ｓ結合の内の１対だけが形成されないように変異された配列を有するプラスミドｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）、及びｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）を作製した。さらにこれら誘導体のプラスミドを基に、上記５対のＳ−Ｓ結合の内の２対が形成されないように変異された配列を有するプラスミドｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、及びｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）を作製した。上述では、改変するシステイン残基の数を２個の倍数としているが、改変するシステイン残基の数はこれに限定されるものではなく、システイン残基１個を改変することにより１つのＳ−Ｓ結合を形成させないことでもよい。
これらのプラスミドを用い常法に従い大腸菌を形質転換し、上記部位特異的突然変異を有する目的遺伝子が導入された組換え大腸菌を得た。これらの組換え大腸菌を培養し、菌体内に目的物を封入体として発現させた。菌体を破砕し、遠心分離により封入体を沈殿画分として回収した。得られた封入体に対し変性剤を用いて変性した後、変性剤を含まないバッファーで希釈することによりリフォールディング操作を行った。リフォールディングにより得られたアミド化酵素及びその誘導体を、合成基質を用いたアミド化酵素活性測定により評価した。
最終的に、野生型ＡＥ−Ｉ［１−３２１］より高い酵素活性量を示す誘導体を５つ（すなわち、Ｓ−Ｓ結合を１対形成することができない誘導体ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）並びにＳ−Ｓ結合を２対形成することができない誘導体ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ））を得ることができた。
一般に、Ｓ−Ｓ結合を除くとタンパク質の安定性や活性が低下すると予想されるが、図７に示すように、本発明者らは、Ｃ−末端α−アミド化酵素について、そのＳ−Ｓ結合の内の少なくとも１対を除くことで、野生型より高い酵素活性量を示す誘導体を得ることができた。
野生型より高い酵素活性量を示す当該誘導体では、配列番号２に示すアミノ酸配列において７３番目と９０番目のシステイン残基の間、及び１８６番目と２９３番目のシステイン残基の間では、ジスルフィド結合が形成されていた。
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
本発明者らは、このような低い酵素活性量の原因は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するアフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素内に複数個存在しているシステイン残基当該酵素の一つは分子内に１０個のシステイン残基（すなわち、５対のＳ−Ｓ結合）を有している）が、天然型と同じジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）を形成することができないこと、つまりリフォールディング時にＳ−Ｓ結合の掛け違いが起きていることであると推定した。
アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素内のＳ−Ｓ結合位置は、これまでに明らかになっていない。そこで、本発明者らは、既に結晶構造が解析され、Ｓ−Ｓ結合の位置が同定されているラット由来のＣ−末端α−アミド化酵素のアミノ酸配列と、アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素のアミノ酸配列の相同性を検討し、両者が６５．２％と高い相同性を有しており、かつ、配列番号２に示すアミノ酸配列に相当する領域においてシステイン残基の位置が完全に保存されていることを明らかとした。そしてＳ−Ｓ結合の位置が両者で同様であると推定した。
そして、本発明者らは、リフォールディング時にＳ−Ｓ結合の掛け違いが起きているとのかかる推定を実証するために、アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素を用い、そのアミノ酸配列に含まれる特定のシステインをアラニンで置換し又は欠失させて、当該酵素誘導体が形成しうる５対のジスルフィド結合の内の少なくとも１対が形成されないように修飾した組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体を作製し、Ｓ−Ｓ結合の掛け違いが起こる確率を低く抑えることにより、より高い酵素活性量を有する組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体を高収率で取得することを計画した。
ところで、本分野においては、Ｓ−Ｓ結合を分子内に有するタンパク質に関しては、より高い酵素活性量を有する当該タンパク質を取得するために、Ｓ−Ｓ結合を新たに導入して、当該タンパク質の安定性を向上させる手法が一般的であり、Ｓｈｉｍｉｚｕ−Ｉｂｕｋａ Ａ，ｅｔ ａｌ．″Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｂｏｎｄ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｃｌａｓｓ Ａ ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ Ｔｏｈｏ−１．″ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００６ Ａｕｇ；１７６４（８）：１３４９−５５．Ｅｐｕｂ ２００６ Ｊｕｎ ２７、及びＳｉａｄａｔ ＯＲ ｅｔ ａｌ ″Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ．″ ＢＭＣ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００６ Ａｐｒ １６；７：１２に記載されるように様々な報告がなされている。Ｓｉａｄａｔ ＯＲ ｅｔ ａｌにおいては、アセチルコリンエステラーゼに、Ｓ−Ｓ結合を新たに導入することにより、野生型に比較して５０℃での安定性を約１７０倍にまで向上させたことや、変性剤、有機溶媒、さらにはプロテアーゼによる分解に対しても耐性を持たせることに成功している。
これに反し、これまでに本発明におけるような目的タンパク質からＳ−Ｓ結合を除去することにより酵素活性の向上や安定化を図る方法に関する報告はない。すなわち、Ｓ−Ｓ結合の除去は、目的タンパク質の構造的な安定性や活性の低下を引き起こす可能性があるので、Ｓ−Ｓ結合を除去することにより、所望の活性を有する目的タンパク質を所得することは困難であると当業者に予想されていた。
用語の定義
本願明細書における配列番号２に示すアミノ酸配列の番号は、Ｃ−末端α−アミド化酵素（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ Ｉ、ＥＣ １．１４．１７．３）の成熟タンパク質のＮ末端セリン残基を１番として付与している。ここで、システイン残基の位置は、それぞれ、配列番号２におけるアミノ酸番号６、４０、７３、８５、９０、１４５、１８６、２５２、２７４、及び２９３である。
本明細書中、システイン残基に関する用語「改変」とは、非制限的に、当該システイン残基の欠失、他のアミノ酸残基による置換、当該システイン残基を有するアミノ酸配列の除去又は当該システイン残基のチオール基に保護基を付加するなどの修飾であって、配列番号２で示されるアミノ酸配列の６番目と１４５番目のシステイン残基の間、４０番目と８５番目のシステイン残基の間、及び２５２番目と２７４番目のシステイン残基の間の少なくとも１つの間でジスルフィド結合が形成されないようにする修飾のいずれをも包含する。
本明細書中、用語「Ｃ−末端α−アミド化酵素」とは、Ｃ末端アミド構造を有するペプチドやタンパク質の前駆体のＣ末端側にあるグリシン残基のアミド化（−ＣＯＯＨ基を−ＣＯＮＨ２基へ変換すること）における銅イオンを介した酸化（第１段階：Ｇｌｙのα炭素の水酸化）を触媒する能力を有する酵素であり、特に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する酵素である。
本明細書中、用語「Ｃ−末端α−アミド化酵素誘導体」とは、上述のＣ−末端α−アミド化酵素のアミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する酵素である。
本明細書中、用語「Ｃ−末端α−アミド化酵素活性」とは、アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ Ｉ、ＥＣ １．１４．１７．３）の酵素活性と同様の酵素活性を意味する。
本明細書中、用語「ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）」は、アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素ＡＥ−Ｉ（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ Ｉ、ＥＣ １．１４．１７．３）の成熟タンパク質のうち、１番目のセリン残基から３２１番目のメチオニン残基に相当する領域のアミノ酸の一次配列（配列番号２）を有し、かつ、４０番目のシステイン残基がアラニン残基で、そして８５番目のシステイン残基がアラニン残基で置換されたアミノ酸配列（配列番号２７）を有するポリペプチドを意味する。用語「ＡＥ−Ｉ［１−３２１］」、用語「ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）」（配列番号３３）、用語「ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）」（配列番号３７）、用語「ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）」（配列番号２９）、及び用語「ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）」（配列番号３１）も同様の意味をもつ。尚、「ＡＥ−Ｉ［１−３２１］」を除き、これらは、単に、Ｃ−末端α−アミド化酵素の誘導体ともいう。
本明細書中、用語「ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）」は、アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｇｌｕｃｉｎｅ ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ Ｉ，ＥＣ１．１４．１７．３）のうち、Ｎ末端側に存在する３７個のアミノ酸からなるシグナル配列を除いた、セリン残基を１番目とし、３２１番目のメチオニン残基までのアミノ酸の一次配列において、１番目のセリン残基から７番目のロイシン残基までを欠失し、８番目のグリシン残基から３２１番目のメチオニン残基までを有し、かつ、１４５番目のシステイン残基がアラニン残基で置換されたアミノ酸配列（配列番号２５）を有するポリペプチドを意味する。ここで、１番目のセリン残基から７番目のロイシン残基までのフラグメントの欠失により、６番目のシステイン残基を欠失させている。用語「ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）」は、上述のように８番目のグリシン残基から３２１番目のメチオニン残基までを有し、かつ、１４５番目のシステイン残基がアラニン残基で、４０番目のシステイン残基がアラニン残基で、８５番目のシステイン残基がアラニン残基で置換されたアミノ酸配列（配列番号３５）を有するポリペプチドを意味する。これらは単に、Ｃ−末端α−アミド化酵素の誘導体ともいう。
酵素活性の測定方法及びＵｎｉｔ
酵素活性の測定には、特に大腸菌で発現させた場合、菌体粉砕後、大部分は沈殿画分に回収されるので、この沈殿画分を６Ｍ塩酸グアニジンで可溶化した後、塩酸グアニジン溶液で透析して調製した試料を用いる。一般に、Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙで表される基質又は発現したアミド化ペプチドを用い、これがＲ−Ｘ−ＣＯＮＨ２に変換される（例えば、合成基質〔１２５Ｉ〕−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙの〔１２５Ｉ〕−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ２への変換反応）により、酵素活性が測定できる。すなわち、まず、標識基質（標識Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ）をトリス塩酸バッファー中で被験酵素液と反応させる。これにトリス塩酸バッファーと酢酸エチルを加え、混合後、遠心分離して有機溶媒と水層を分離させる。ここで、未反応標識基質（標識Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ）の大部分が水層に、そしてアミド化された標識基質（標識Ｒ−Ｘ−ＣＯＮＨ２）が有機溶媒層に移行するために、両者を容易に分離することができる。Ｃ−末端アミド化生成物への変換率は、総放射能活性に対する有機溶媒層の放射能活性の比から求めることができる。当該測定法において、１時間当り、１ｐｍｏｌの標識Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ（基質）が標識Ｒ−Ｘ−ＣＯＮＨ２に５０％変換する酵素活性を１Ｕｎｉｔとして定義する。
なお、酸化反応後にアルカリ（水酸化ナトリウム）を添加することで、脱アルキル化させてアミド化酵素活性を評価した。
まず、測定するサンプルを２μＬ、１０μＬ及び１００μＬ取り、それぞれ蒸留水を加えて全量１００μＬとする。これに、１０ｍＭアスコルビン酸２５μｌ、２００μＭ硫酸銅２５μｌ、２０ｍｇ／ｍｌカタラーゼ１．２５μｌ、１％Ｌｕｂｒｏｌ ２０μｌ、〔１２５Ｉ〕−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ ２ｐｍｏｌ、１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．０）５０μｌ及び蒸留水２５μｌを加え、３７℃で１時間反応させた。反応後、反応液に２５０ｍＭ ＮａＯＨ ２５０μｌを加え、混合し、１５分間室温に置いた後（脱アルキル化）、１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．０）５００μｌと酢酸エチル２ｍｌを加え、混合し、遠心分離した。次に、酢酸エチル層１ｍｌを分取し、それと残りの溶液の放射能とを、ガンマ・カウンターを用いて測定することにより、酢酸エチル層へ移行した放射能の割合を求める。尚、この方法で、Ｃ−末端アミド化された〔１２５Ｉ〕−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＣＯＮＨ２は特異的に、酢酸エチル層へ移行することは液体クロマトグラフィー及びガンマ・カウンターによる測定により確認されている。酵素活性は、１時間当り、１ｐｍｏｌの標識Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ（基質）が標識Ｒ−Ｘ−ＣＯＮＨ２に５０％変換する酵素活性を１Ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義する。
図１に、本願発明に係るアフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ Ｉ、ＥＣ １．１４．１７．３）と、Ｐｒｉｇｇｅ ＳＴ，Ｋｏｌｈｅｋａｒ ＡＳ，Ｅｉｐｐｅｒ ＢＡ，Ｍａｉｎｓ ＲＥ，Ａｍｚｅｌ ＬＭ． ″Ａｍｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ： ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｙｌｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ．″Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９７ Ｎｏｖ １４；２７８（５３４１）：１３００−５で既に結晶構造が解析されているラット由来の当該酵素のアミノ酸配列のアラインメントを示す。図１から分かるように、両者は、６５．２％と高い相同性を有しており、かつ、配列番号２に記載のアミノ酸配列に相当する領域中に存在するシステイン残基の位置は完全に保存されている。
図２に、Ｐｒｉｇｇｅ ＳＴらにおいて、既に結晶構造が解析され、そのＳ−Ｓ結合の位置が同定されているラット由来のＣ−末端α−アミド化酵素の立体構造を示す。本発明者らは、当該立体構造におけるＳ−Ｓ結合の位置から、本発明に係るアフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素では、６Ｃｙｓ−１４５Ｃｙｓ、４０Ｃｙｓ−８５Ｃｙｓ、７３Ｃｙｓ−９０Ｃｙｓ、１８６Ｃｙｓ−２９３Ｃｙｓ、及び２５２Ｃｙｓ−２７４Ｃｙｓの間で５対のＳ−Ｓ結合が形成されることにより、立体構造が維持されると推定した。
かかるＳ−Ｓ結合の位置の推定に基づき、少なくとも１つのＳ−Ｓ結合が形成されない組換えポリペプチドを作製した。すなわち、アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素ＡＥ−Ｉのアミノ酸配列の１番目から３２１番目までのアミノ酸１次配列をコードする配列を含むプラスミド、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］を野生型とし、これを基に少なくとも１つのＳ−Ｓ結合が形成されないようなプラスミドを作製した。これらのプラスミドは、ｔｒｃ（ｌａｃとｔｒｐの融合型）プロモーター支配下、大腸菌内で発現されるようにデザインされたプラスミドであった。
ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］を鋳型に用い、Ｓ−Ｓ結合を形成することができる対のシステイン残基を、部位特異的突然変異により、アラニン残基で置換又は欠失することにより、上記５対のＳ−Ｓ結合の内の１対だけが形成されないように変異された配列を有するプラスミドｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）、及びｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）を作製した。さらにこれら誘導体のプラスミドを基に、上記５対のＳ−Ｓ結合の内の２対が形成されないように変異された配列を有するプラスミドｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、及びｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）を作製した。上述では、改変するシステイン残基の数を２個の倍数としているが、改変するシステイン残基の数はこれに限定されるものではなく、システイン残基１個を改変することにより１つのＳ−Ｓ結合を形成させないことでもよい。
これらのプラスミドを用い常法に従い大腸菌を形質転換し、上記部位特異的突然変異を有する目的遺伝子が導入された組換え大腸菌を得た。これらの組換え大腸菌を培養し、菌体内に目的物を封入体として発現させた。菌体を破砕し、遠心分離により封入体を沈殿画分として回収した。得られた封入体に対し変性剤を用いて変性した後、変性剤を含まないバッファーで希釈することによりリフォールディング操作を行った。リフォールディングにより得られたアミド化酵素及びその誘導体を、合成基質を用いたアミド化酵素活性測定により評価した。
最終的に、野生型ＡＥ−Ｉ［１−３２１］より高い酵素活性量を示す誘導体を５つ（すなわち、Ｓ−Ｓ結合を１対形成することができない誘導体ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）並びにＳ−Ｓ結合を２対形成することができない誘導体ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ））を得ることができた。
一般に、Ｓ−Ｓ結合を除くとタンパク質の安定性や活性が低下すると予想されるが、図７に示すように、本発明者らは、Ｃ−末端α−アミド化酵素について、そのＳ−Ｓ結合の内の少なくとも１対を除くことで、野生型より高い酵素活性量を示す誘導体を得ることができた。
野生型より高い酵素活性量を示す当該誘導体では、配列番号２に示すアミノ酸配列において７３番目と９０番目のシステイン残基の間、及び１８６番目と２９３番目のシステイン残基の間では、ジスルフィド結合が形成されていた。
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１：Ｃ−末端α−アミド化酵素及びその誘導体の調製（１）
誘導体の大腸菌発現プラスミドｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）、及びｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）の作製
アミド化酵素の誘導体は、アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素のアミノ酸配列１番目から３２１番目のアミノ酸配列をコードするプラスミド、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］を基に作製した。ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］は、ｔｒｃ（ｌａｃとｔｒｐの融合型）プロモーターの支配下、大腸菌内で発現させるようにデザインされたプラスミドである。このプラスミドｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］を鋳型に、１番目から３２１番目まで又は８番目から３２１番目までのアミノ酸配列をもつタンパク質に対し、Ｓ−Ｓ結合を形成しうる１対のシステイン残基２つをそれぞれアラニン残基で部位特異的変異導入により置換することにより、Ｓ−Ｓ結合が形成されることができない誘導体を作製した。ここで、誘導体ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）については、アミノ酸配列６番目と１４５番目のシステインが対となってＳ−Ｓ結合を形成するため、６番目のシステイン残基をアラニン残基で置換するのではなく、１番目から７番目までのアミノ酸残基を除去し、さらに１４５番目のシステイン残基をアラニン残基で置換することで、６Ｃｙｓ−１４５Ｃｙｓ間にＳ−Ｓ結合が形成されないようにした。
１対のＳ−Ｓ結合が形成されることができない誘導体を、ＰＣＲ法を用いた突然変異導入によりシステイン残基をアラニン残基で置換することにより作製した。図３に、当該誘導体の作製方法の概略を示す。
まず、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（構造遺伝子配列及びそれに対応するアミノ酸配列を配列番号１に示す）を鋳型に、誘導体それぞれのプライマーを作製した。図４に使用したプライマーの配列を示す。図４中、プライマーＰ１及びＰ１’は、５’末端に制限酵素ＢａｍＨＩ部位（囲み部）に加え、リーディングフレームを合わせる為にグアニン（下線部）が挿入されており、そしてプライマーＰ６は、５’末端に制限酵素ＸｈｏＩ部位（囲み部）に加え、終結コドンアンチセンス鎖ＴＴＡ（下線部）が付加されている。誘導体それぞれのプライマーＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４、及びＰ５とＰ６（又はＰ１’とＰ４、及びＰ５とＰ６）（Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、及びＰ５のみ変異を含む）を用いてＤＮＡフラグメントを増幅させて、アガロースゲル電気泳動及びＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）により３つ（又は２つ）の精製ＤＮＡフラグメントを得た。これらのＤＮＡフラグメントを全て混合したものを鋳型としてプライマーＰ１とＰ６（又はＰ１’とＰ６）（Ｐ１、Ｐ１’、及びＰ６は変異を含まない）を用いて再びＰＣＲで増幅して、変異を導入した約９６０ｂｐのＤＮＡフラグメントをそれぞれの誘導体について得た。
得られた各誘導体のＤＮＡフラグメントをＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）により精製した。この精製断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断し、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化ＤＮＡフラグメント、ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）、及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）を得た。同時に発現ベクターとなるｐＰＲＯＥＸＨＴａを制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断後、当該発現ベクター部分を含む約４．７ｋｂのＤＮＡフラグメントを分離・精製した。これと先に得た各誘導体のＤＮＡフラグメントとをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）によりＬｉｇａｔｉｏｎし、最終的に誘導体のプラスミドｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）、及びｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）を得た（それぞれの誘導体の構造遺伝子配列及びそれに対応するアミノ酸配列を配列番号２５、２７、２９、３１又は３３に示す）。プラスミドｐＰＲＯＥＸＨＴａ（ギブコ社）は、ｔｒｃ（ｌａｃとｔｒｐの融合型）プロモーター、その後にヒスタグ（Ｈｉｓ×６ｔａｇ）、マルチクローニング部位、及びβラクタマーゼが続く構成を有する発現ベクターである。
実施例２：Ｃ−末端α−アミド化酵素及びその誘導体の調製（２）
誘導体の大腸菌発現プラスミドｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、及びｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）の作製
ＡＥ−Ｉ［１−３２１］の有する５対のＳ−Ｓ結合の内２対のＳ−Ｓ結合が形成されることができない誘導体のプラスミドｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）及びｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）を、実施例１において得られたｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）及びｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）を鋳型にして作製した。変異導入及び発現ベクターの作製方法は実施例１と同様に行なった。
上記誘導体の遺伝子断片はＰＣＲ法を用いて作製した。実施例１と同様の方法を使用した。まず、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）及びｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）を鋳型にして、誘導体それぞれのプライマーＰ１（又はＰ１’）とＰ２、Ｐ３とＰ４、及びＰ５とＰ６（Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、及びＰ５のみ変異を含む）を用いてＤＮＡフラグメントを増幅させ、アガロースゲル電気泳動及び、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）により３つの精製ＤＮＡフラグメントを得る。これら３つのＤＮＡフラグメントを混合したものを鋳型としてプライマーＰ１（又はＰ１’）とＰ６（Ｐ１、Ｐ１’、及びＰ６は変異を含まない）にて再度ＰＣＲにて増幅することにより、変異を導入した約９６０ｂｐのＤＮＡフラグメントをそれぞれの誘導体について得た。プライマーの配列は図５に示した。図５中、プライマーＰ１及びＰ１’は、５’末端に制限酵素ＢａｍＨＩ部位（囲み部）に加えリーディング・フレームを合わせる為にグアニン（下線部）が挿入されており、そしてプライマーＰ６は、５’末端に制限酵素ＸｈｏＩ部位（囲み部）に加え、終結コドンアンチセンス鎖ＴＴＡ（下線部）が付加されている。
得られたそれぞれの誘導体ＤＮＡフラグメントをＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）により精製した。この精製断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断し、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化ＤＮＡフラグメント、ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）を得た。同時に発現ベクターとなるｐＰＲＯＥＸＨＴａを制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断後、発現ベクター部分を含む約４．７ｋｂのＤＮＡフラグメントを同様に分離・精製した。これと先に得た各誘導体のＤＮＡフラグメントをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）によりＬｉｇａｔｉｏｎして、最終的に誘導体のプラスミドｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）及びｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）を得た（それぞれの構造遺伝子配列及びそれに対応するアミノ酸配列を配列番号３５又は３７に示す）。
実施例３：ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、及びｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）の大腸菌内の導入及び発現
アミド化酵素及びその誘導体のプラスミドを用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換された大腸菌を約１ＬのＬＢ培地（０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）中、３７℃で振蘯培養し、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド）の添加により発現を誘導した。発現誘導後、約１２〜１６時間培養した。得られた菌体を破砕し、遠心分離後、封入体を含む沈殿画分を回収し、沈殿をＴｒｉｔｏｎＸ−１００（界面活性剤）を含むバッファーにて洗浄することにより、ＪＭ１０９由来のタンパク質及び膜成分を除去し、アミド化酵素及びその誘導体の封入体を回収した。アミド化酵素及びその誘導体の発現及び純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した（図６を参考のこと）。発現量は、封入体を変性剤にて可溶化した後、ＵＶ法で測定した。
コンピテント化した大腸菌ＪＭ１０９に、実施例１又は２において作製した発現プラスミド（ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、及びｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ））をそれぞれ添加し、氷中に１０分間インキュベーション後、１０μｇ／ｍｌアンピシリン（抗生物質）を含むＬＢ寒天培地（０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、１．５％（ｗ／ｖ）寒天）に接種し、３７℃で一晩培養することにより、各誘導体の形質転換体ＪＭ１０９［ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］］、ＪＭ１０９［ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）］、ＪＭ１０９［ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）］、ＪＭ１０９［ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）］、ＪＭ１０９［ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）］、ＪＭ１０９［ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）］、ＪＭ１０９［ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）］、及びＪＭ１０９［ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）］のコロニーを得た。
これら形質転換体のコロニーを、１０μｇ／ｍｌアンピシリン（抗生物質）を含む５ｍｌのＬＢ培地（０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）を含む試験管に接種し、３７℃で約１２〜１６時間振とう培養した。培養液全量を１０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１ＬのＬＢ培地に接種し、３７℃で振とう培養した。培養３〜６時間後（ＯＤ６６０ｎＭが０．５〜０．８になった時）に、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加することにより発現を誘導した。
Ｃ−末端α−アミド化酵素及びその誘導体は、菌体内に不溶性の封入体として発現されるため、以下のように封入体を回収した。培養液１Ｌを１０分間の遠心分離（６０００ｒｐｍ、４℃）により菌体を回収し、１００ｍＬの水で懸濁した後、フレンチプレスにて菌体を破砕した（１０，０００ｐｓｉ；２回）。菌体破砕液を１５分間遠心分離（６０００ｒｐｍ、４℃）して、沈殿画分に目的物である封入体を移行させた。この操作により、ほとんどの宿主大腸菌ＪＭ１０９由来のタンパク質が上清に移行するため、当該タンパク質は除去されうる。次に、沈殿画分を５０ｍｌの１％（ｗ／ｗ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（界面活性剤）を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）バッファーに懸濁し、１５分間遠心分離して（６０００ｒｐｍ、４℃）沈殿を回収した（これにより、ＪＭ１０９由来の膜成分等は界面活性剤に溶解して上清に移行するため、当該膜成分等は除去されうる）。この操作を２回繰り返してＣ−末端α−アミド化酵素の封入体を回収し、そして最終的に１ｍｌの１％（ｗ／ｗ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（界面活性剤）を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）バッファーに懸濁して、封入体懸濁液を得た。
得られた各誘導体の封入体懸濁液１０μＬをＳＤＡ−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファー（２Ｍ Ｕｒｅａ、３７５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、３０％（ｖ／ｖ）グリセロール、７％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１５％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、０．１％（ｗ／ｖ）ブロムフェノールブルー）１０μＬで２倍希釈し、０．１μＬ分（１−１０μｇ分に相当）を１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに供し、発現及び純度を確認した（図６を参照のこと）。Ｃ−末端α−アミド化酵素及び全ての誘導体において、分子量約４０ｋＤａ付近にバンドを検出し、その純度は約７０〜９０％であった。
アミド化酵素及び全ての誘導体の封入体懸濁液１０μＬを１０ｍＬの変性剤溶液（８Ｍ Ｕｒｅａ）にて可溶化し、分光光度計により、波長２８０ｎｍにおける吸光度Ａを測定し、Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｂｅｅｒの法則を元に、下記の式により濃度Ｃを算出した。
濃度Ｃ（ｍｇ／ｍｌ）＝Ａ・Ｍｗ／κｄ
｛式中、Ａは波長２８０ｎｍにおける吸光度であり、Ｍｗは、分子量（約４５，０００Ｄａ）であり、そしてκｄは、吸光係数（４１，７００（Ｍ−１・ｃｍ−１）（Ｃ−末端α−アミド化酵素及び誘導体はアミノ酸のトリプトファン（吸光係数５５００）、チロシン（吸光係数１２００）を、それぞれ、３個、２１個を含む）である。｝。
算出された濃度Ｃから、アミド化酵素及びその誘導体のタンパク質の発現量を算出したところ、１００〜１６０ｍｇ／培地１Ｌであった。
実施例４：アミド化酵素ＡＥ−Ｉ［１−３２１］、及びその誘導体ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）、ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）のリフォールディング及び酵素活性の評価
実施例３において得られたアミド化酵素及びその誘導体の封入体を用いて、変性作用のある８Ｍ尿素バッファー溶液により変性した後、変性剤を含まないバッファーで希釈することにより、リフォールディング操作を行なった。得られたリフォールディング溶液には変性剤が残っているため、透析により除去した。変性は、酵素活性測定を阻害することがわかっている。得られた透析サンプルについて、Ｃ−末端α−アミド化酵素活性を評価した。
実施例３において得られたＣ−末端α−アミド化酵素及びその誘導体の封入体を、８Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１０．０ ａｔ １５℃）、５０ｍＭ ＮａＣｌで濃度２．４ｇ／Ｌとなるように１ｍＬ可溶化した。溶液を１５℃で２〜４日間インキュベーションし、Ｓ−Ｓ結合を分解させた。
次に、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０ ａｔ ４℃）、５０ｍＭ ＮａＣｌで８倍希釈を行なうことで、変性剤濃度を下げ立体構造の再生を促した（リフォールディング操作）。さらに、尿素が活性測定を阻害することが分かっている為、５００ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０ ａｔ ４℃）、５０ｍＭ ＮａＣｌにて透析を４℃で一晩行なった。透析膜には、ＳＰＥＣＴＲＵＭ社のＳＰＥＣＴＲＡ／Ｐｏｒ ２ ＭＷＣＯ：１２−１４，０００ Ｄａを用いた。
リフォールディング後、透析後の溶液について、２８０ｎｍの吸光度により実施例３と同じ方法で、得られたタンパク質の濃度を測定した（図７を参照のこと）。Ｃ−末端α−アミド化酵素又は誘導体の酵素活性の測定は、合成基質〔１２５Ｉ〕−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙの〔１２５Ｉ〕−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ２への変換反応を利用して行った。Ｃ−末端α−アミド化酵素活性の測定方法、及びＵｎｉｔの定義は前述の通りである。
図７に、Ｃ−末端α−アミド化酵素及び誘導体の酵素活性の測定結果を示す。タンパク質１ｍｇ当たりの酵素活性量Ｕは以下の通りである：ＡＥ−Ｉ［１−３２１］：２０５Ｕ／ｍｇ、ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）：８４０Ｕ／ｍｇ、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）：１７９８Ｕ／ｍｇ、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）：５６Ｕ／ｍｇ、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）：ＮＤＵ／ｍｇ、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）：２７１Ｕ／ｍｇ、ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）：７７８Ｕ／ｍｇ、及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）：２２６０Ｕ／ｍｇ。この結果、Ｓ−Ｓ結合を除いていない野生型ＡＥ−Ｉ［１−３２１］に比較して、低い酵素活性量を示したものは、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）、及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）であり、中でもＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）は、酵素活性が全く検出されなかった。すなわち、１８６Ｃｙｓ−２９３Ｃｙｓ間で形成されるＳ−Ｓ結合は、アミド化酵素の活性発現において重要である可能性が示唆された。
一方、Ｓ−Ｓ結合を除いていない、野生型ＡＥ−Ｉ［１−３２１］に比較して、高い活性量を示したのは、１対のＳ−Ｓ結合を除いたＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）、並びに２対のＳ−Ｓ結合を除いたＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）であった。とりわけ、ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、及びＡＥ−Ｉ「１−３２１」（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）は、野生型に比較して、それぞれ、約４倍、及び約９倍、そしてＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）に至っては、約１１倍の酵素活性量を示した。
これら５つの誘導体の培養液１ｍＬ当たりの酵素活性量を算出すると（発現量は、平均値１３０ｍｇ／培地１Ｌとして計算した）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］：２７Ｕ／ｍＬ、ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）：１０９Ｕ／ｍＬ、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）：２３４Ｕ／ｍＬ、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）：３５Ｕ／ｍＬ、ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）：１０１Ｕ／ｍＬ、及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２９３Ａ）：２９４Ｕ／ｍＬとなった。
特開平７−２５０６９１号公報に記載の発明において、大腸菌を用いた遺伝子組換え法により製造されたアミド化酵素の活性量は、培養液１ｍＬ当り約１０〜１５ｍＵであった。これに対し、本発明において上記方法で得た誘導体の酵素活性量は、上述のように、約３５〜３００Ｕ／ｍＬであった。酵素の発現量やリフォールディング方法に違いがあるため、単純な比較はできないが、本願発明に係るＳ−Ｓ結合を除いた誘導体において、特開平７−２５０６９１号公報に記載の発明において得られたアミド化酵素の酵素活性に比較して、２，０００〜３０，０００倍の酵素活性量が向上されたことになる。
本願発明に係るＣ−末端α−アミド化酵素誘導体の培養に関して、高密度培養を行うことで当該誘導体の発現量は約５〜１０ｇ／Ｌとなることが確認されている。この場合、最終的に得られる酵素活性量は最大で培養液１ｍＬ当たり約２３，０００Ｕと算出され、これは特開平７−１６３３４０号公報に記載の発明においてＣＨＯ細胞を用いた遺伝子組換え法により製造された場合の酵素活性量（培養液１ｍＬ当りの酵素活性量の２，８６０Ｕ）を遥かに上回る。
本発明により、大腸菌を用いたアミド化酵素生産における従来技術（特開平７−２５０６９１号公報を参照のこと）において達成された培養液１ｍＬ当りの酵素活性量に比較して、極めて高い酵素活性量を有する組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体を得ることができた。また、本発明により、ＣＨＯ細胞を用いた遺伝子組換え法により製造された場合の酵素活性量（特開平７−１６３３４０号公報を参照のこと）に比較して高い酵素活性量を有する組換えＣ−末端α−アミド化酵素を得ることができた。本願発明に係る方法は、大腸菌を利用しているために、短期間で当該アミド化酵素を生産でき、上記ＣＨＯ細胞培養法に比較して、生産性が非常に高い。
また、本発明に係る組換えＣ−末端α−アミド化酵素は、ＧＬＰ−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−１）前駆体（Ｃ末端にＧｌｙが付加している）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、アミド化することが確認されており、これは、本発明に係る組換えＣ−末端α−アミド化酵素が、Ｃ末端アミド化ペプチドの生産におけるアミド化反応に十分に使用しうるものであることを示すものである。
誘導体の大腸菌発現プラスミドｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）、及びｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）の作製
アミド化酵素の誘導体は、アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素のアミノ酸配列１番目から３２１番目のアミノ酸配列をコードするプラスミド、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］を基に作製した。ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］は、ｔｒｃ（ｌａｃとｔｒｐの融合型）プロモーターの支配下、大腸菌内で発現させるようにデザインされたプラスミドである。このプラスミドｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］を鋳型に、１番目から３２１番目まで又は８番目から３２１番目までのアミノ酸配列をもつタンパク質に対し、Ｓ−Ｓ結合を形成しうる１対のシステイン残基２つをそれぞれアラニン残基で部位特異的変異導入により置換することにより、Ｓ−Ｓ結合が形成されることができない誘導体を作製した。ここで、誘導体ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）については、アミノ酸配列６番目と１４５番目のシステインが対となってＳ−Ｓ結合を形成するため、６番目のシステイン残基をアラニン残基で置換するのではなく、１番目から７番目までのアミノ酸残基を除去し、さらに１４５番目のシステイン残基をアラニン残基で置換することで、６Ｃｙｓ−１４５Ｃｙｓ間にＳ−Ｓ結合が形成されないようにした。
１対のＳ−Ｓ結合が形成されることができない誘導体を、ＰＣＲ法を用いた突然変異導入によりシステイン残基をアラニン残基で置換することにより作製した。図３に、当該誘導体の作製方法の概略を示す。
まず、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（構造遺伝子配列及びそれに対応するアミノ酸配列を配列番号１に示す）を鋳型に、誘導体それぞれのプライマーを作製した。図４に使用したプライマーの配列を示す。図４中、プライマーＰ１及びＰ１’は、５’末端に制限酵素ＢａｍＨＩ部位（囲み部）に加え、リーディングフレームを合わせる為にグアニン（下線部）が挿入されており、そしてプライマーＰ６は、５’末端に制限酵素ＸｈｏＩ部位（囲み部）に加え、終結コドンアンチセンス鎖ＴＴＡ（下線部）が付加されている。誘導体それぞれのプライマーＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４、及びＰ５とＰ６（又はＰ１’とＰ４、及びＰ５とＰ６）（Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、及びＰ５のみ変異を含む）を用いてＤＮＡフラグメントを増幅させて、アガロースゲル電気泳動及びＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）により３つ（又は２つ）の精製ＤＮＡフラグメントを得た。これらのＤＮＡフラグメントを全て混合したものを鋳型としてプライマーＰ１とＰ６（又はＰ１’とＰ６）（Ｐ１、Ｐ１’、及びＰ６は変異を含まない）を用いて再びＰＣＲで増幅して、変異を導入した約９６０ｂｐのＤＮＡフラグメントをそれぞれの誘導体について得た。
得られた各誘導体のＤＮＡフラグメントをＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）により精製した。この精製断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断し、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化ＤＮＡフラグメント、ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）、及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）を得た。同時に発現ベクターとなるｐＰＲＯＥＸＨＴａを制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断後、当該発現ベクター部分を含む約４．７ｋｂのＤＮＡフラグメントを分離・精製した。これと先に得た各誘導体のＤＮＡフラグメントとをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）によりＬｉｇａｔｉｏｎし、最終的に誘導体のプラスミドｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）、及びｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）を得た（それぞれの誘導体の構造遺伝子配列及びそれに対応するアミノ酸配列を配列番号２５、２７、２９、３１又は３３に示す）。プラスミドｐＰＲＯＥＸＨＴａ（ギブコ社）は、ｔｒｃ（ｌａｃとｔｒｐの融合型）プロモーター、その後にヒスタグ（Ｈｉｓ×６ｔａｇ）、マルチクローニング部位、及びβラクタマーゼが続く構成を有する発現ベクターである。
実施例２：Ｃ−末端α−アミド化酵素及びその誘導体の調製（２）
誘導体の大腸菌発現プラスミドｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、及びｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）の作製
ＡＥ−Ｉ［１−３２１］の有する５対のＳ−Ｓ結合の内２対のＳ−Ｓ結合が形成されることができない誘導体のプラスミドｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）及びｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）を、実施例１において得られたｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）及びｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）を鋳型にして作製した。変異導入及び発現ベクターの作製方法は実施例１と同様に行なった。
上記誘導体の遺伝子断片はＰＣＲ法を用いて作製した。実施例１と同様の方法を使用した。まず、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）及びｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）を鋳型にして、誘導体それぞれのプライマーＰ１（又はＰ１’）とＰ２、Ｐ３とＰ４、及びＰ５とＰ６（Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、及びＰ５のみ変異を含む）を用いてＤＮＡフラグメントを増幅させ、アガロースゲル電気泳動及び、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）により３つの精製ＤＮＡフラグメントを得る。これら３つのＤＮＡフラグメントを混合したものを鋳型としてプライマーＰ１（又はＰ１’）とＰ６（Ｐ１、Ｐ１’、及びＰ６は変異を含まない）にて再度ＰＣＲにて増幅することにより、変異を導入した約９６０ｂｐのＤＮＡフラグメントをそれぞれの誘導体について得た。プライマーの配列は図５に示した。図５中、プライマーＰ１及びＰ１’は、５’末端に制限酵素ＢａｍＨＩ部位（囲み部）に加えリーディング・フレームを合わせる為にグアニン（下線部）が挿入されており、そしてプライマーＰ６は、５’末端に制限酵素ＸｈｏＩ部位（囲み部）に加え、終結コドンアンチセンス鎖ＴＴＡ（下線部）が付加されている。
得られたそれぞれの誘導体ＤＮＡフラグメントをＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）により精製した。この精製断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断し、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化ＤＮＡフラグメント、ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）を得た。同時に発現ベクターとなるｐＰＲＯＥＸＨＴａを制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断後、発現ベクター部分を含む約４．７ｋｂのＤＮＡフラグメントを同様に分離・精製した。これと先に得た各誘導体のＤＮＡフラグメントをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）によりＬｉｇａｔｉｏｎして、最終的に誘導体のプラスミドｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）及びｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）を得た（それぞれの構造遺伝子配列及びそれに対応するアミノ酸配列を配列番号３５又は３７に示す）。
実施例３：ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、及びｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）の大腸菌内の導入及び発現
アミド化酵素及びその誘導体のプラスミドを用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換された大腸菌を約１ＬのＬＢ培地（０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）中、３７℃で振蘯培養し、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド）の添加により発現を誘導した。発現誘導後、約１２〜１６時間培養した。得られた菌体を破砕し、遠心分離後、封入体を含む沈殿画分を回収し、沈殿をＴｒｉｔｏｎＸ−１００（界面活性剤）を含むバッファーにて洗浄することにより、ＪＭ１０９由来のタンパク質及び膜成分を除去し、アミド化酵素及びその誘導体の封入体を回収した。アミド化酵素及びその誘導体の発現及び純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した（図６を参考のこと）。発現量は、封入体を変性剤にて可溶化した後、ＵＶ法で測定した。
コンピテント化した大腸菌ＪＭ１０９に、実施例１又は２において作製した発現プラスミド（ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、及びｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ））をそれぞれ添加し、氷中に１０分間インキュベーション後、１０μｇ／ｍｌアンピシリン（抗生物質）を含むＬＢ寒天培地（０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、１．５％（ｗ／ｖ）寒天）に接種し、３７℃で一晩培養することにより、各誘導体の形質転換体ＪＭ１０９［ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］］、ＪＭ１０９［ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）］、ＪＭ１０９［ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）］、ＪＭ１０９［ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）］、ＪＭ１０９［ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）］、ＪＭ１０９［ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）］、ＪＭ１０９［ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）］、及びＪＭ１０９［ｐＰＲＯＥＸＨＴａ ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）］のコロニーを得た。
これら形質転換体のコロニーを、１０μｇ／ｍｌアンピシリン（抗生物質）を含む５ｍｌのＬＢ培地（０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）を含む試験管に接種し、３７℃で約１２〜１６時間振とう培養した。培養液全量を１０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１ＬのＬＢ培地に接種し、３７℃で振とう培養した。培養３〜６時間後（ＯＤ６６０ｎＭが０．５〜０．８になった時）に、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加することにより発現を誘導した。
Ｃ−末端α−アミド化酵素及びその誘導体は、菌体内に不溶性の封入体として発現されるため、以下のように封入体を回収した。培養液１Ｌを１０分間の遠心分離（６０００ｒｐｍ、４℃）により菌体を回収し、１００ｍＬの水で懸濁した後、フレンチプレスにて菌体を破砕した（１０，０００ｐｓｉ；２回）。菌体破砕液を１５分間遠心分離（６０００ｒｐｍ、４℃）して、沈殿画分に目的物である封入体を移行させた。この操作により、ほとんどの宿主大腸菌ＪＭ１０９由来のタンパク質が上清に移行するため、当該タンパク質は除去されうる。次に、沈殿画分を５０ｍｌの１％（ｗ／ｗ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（界面活性剤）を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）バッファーに懸濁し、１５分間遠心分離して（６０００ｒｐｍ、４℃）沈殿を回収した（これにより、ＪＭ１０９由来の膜成分等は界面活性剤に溶解して上清に移行するため、当該膜成分等は除去されうる）。この操作を２回繰り返してＣ−末端α−アミド化酵素の封入体を回収し、そして最終的に１ｍｌの１％（ｗ／ｗ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（界面活性剤）を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）バッファーに懸濁して、封入体懸濁液を得た。
得られた各誘導体の封入体懸濁液１０μＬをＳＤＡ−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファー（２Ｍ Ｕｒｅａ、３７５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、３０％（ｖ／ｖ）グリセロール、７％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１５％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、０．１％（ｗ／ｖ）ブロムフェノールブルー）１０μＬで２倍希釈し、０．１μＬ分（１−１０μｇ分に相当）を１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに供し、発現及び純度を確認した（図６を参照のこと）。Ｃ−末端α−アミド化酵素及び全ての誘導体において、分子量約４０ｋＤａ付近にバンドを検出し、その純度は約７０〜９０％であった。
アミド化酵素及び全ての誘導体の封入体懸濁液１０μＬを１０ｍＬの変性剤溶液（８Ｍ Ｕｒｅａ）にて可溶化し、分光光度計により、波長２８０ｎｍにおける吸光度Ａを測定し、Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｂｅｅｒの法則を元に、下記の式により濃度Ｃを算出した。
濃度Ｃ（ｍｇ／ｍｌ）＝Ａ・Ｍｗ／κｄ
｛式中、Ａは波長２８０ｎｍにおける吸光度であり、Ｍｗは、分子量（約４５，０００Ｄａ）であり、そしてκｄは、吸光係数（４１，７００（Ｍ−１・ｃｍ−１）（Ｃ−末端α−アミド化酵素及び誘導体はアミノ酸のトリプトファン（吸光係数５５００）、チロシン（吸光係数１２００）を、それぞれ、３個、２１個を含む）である。｝。
算出された濃度Ｃから、アミド化酵素及びその誘導体のタンパク質の発現量を算出したところ、１００〜１６０ｍｇ／培地１Ｌであった。
実施例４：アミド化酵素ＡＥ−Ｉ［１−３２１］、及びその誘導体ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）、ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）のリフォールディング及び酵素活性の評価
実施例３において得られたアミド化酵素及びその誘導体の封入体を用いて、変性作用のある８Ｍ尿素バッファー溶液により変性した後、変性剤を含まないバッファーで希釈することにより、リフォールディング操作を行なった。得られたリフォールディング溶液には変性剤が残っているため、透析により除去した。変性は、酵素活性測定を阻害することがわかっている。得られた透析サンプルについて、Ｃ−末端α−アミド化酵素活性を評価した。
実施例３において得られたＣ−末端α−アミド化酵素及びその誘導体の封入体を、８Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１０．０ ａｔ １５℃）、５０ｍＭ ＮａＣｌで濃度２．４ｇ／Ｌとなるように１ｍＬ可溶化した。溶液を１５℃で２〜４日間インキュベーションし、Ｓ−Ｓ結合を分解させた。
次に、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０ ａｔ ４℃）、５０ｍＭ ＮａＣｌで８倍希釈を行なうことで、変性剤濃度を下げ立体構造の再生を促した（リフォールディング操作）。さらに、尿素が活性測定を阻害することが分かっている為、５００ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０ ａｔ ４℃）、５０ｍＭ ＮａＣｌにて透析を４℃で一晩行なった。透析膜には、ＳＰＥＣＴＲＵＭ社のＳＰＥＣＴＲＡ／Ｐｏｒ ２ ＭＷＣＯ：１２−１４，０００ Ｄａを用いた。
リフォールディング後、透析後の溶液について、２８０ｎｍの吸光度により実施例３と同じ方法で、得られたタンパク質の濃度を測定した（図７を参照のこと）。Ｃ−末端α−アミド化酵素又は誘導体の酵素活性の測定は、合成基質〔１２５Ｉ〕−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙの〔１２５Ｉ〕−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ２への変換反応を利用して行った。Ｃ−末端α−アミド化酵素活性の測定方法、及びＵｎｉｔの定義は前述の通りである。
図７に、Ｃ−末端α−アミド化酵素及び誘導体の酵素活性の測定結果を示す。タンパク質１ｍｇ当たりの酵素活性量Ｕは以下の通りである：ＡＥ−Ｉ［１−３２１］：２０５Ｕ／ｍｇ、ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）：８４０Ｕ／ｍｇ、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）：１７９８Ｕ／ｍｇ、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）：５６Ｕ／ｍｇ、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）：ＮＤＵ／ｍｇ、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）：２７１Ｕ／ｍｇ、ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）：７７８Ｕ／ｍｇ、及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）：２２６０Ｕ／ｍｇ。この結果、Ｓ−Ｓ結合を除いていない野生型ＡＥ−Ｉ［１−３２１］に比較して、低い酵素活性量を示したものは、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ７３Ａ／Ｃ９０Ａ）、及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）であり、中でもＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ１８６Ａ／Ｃ２９３Ａ）は、酵素活性が全く検出されなかった。すなわち、１８６Ｃｙｓ−２９３Ｃｙｓ間で形成されるＳ−Ｓ結合は、アミド化酵素の活性発現において重要である可能性が示唆された。
一方、Ｓ−Ｓ結合を除いていない、野生型ＡＥ−Ｉ［１−３２１］に比較して、高い活性量を示したのは、１対のＳ−Ｓ結合を除いたＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）、並びに２対のＳ−Ｓ結合を除いたＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）であった。とりわけ、ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、及びＡＥ−Ｉ「１−３２１」（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）は、野生型に比較して、それぞれ、約４倍、及び約９倍、そしてＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）に至っては、約１１倍の酵素活性量を示した。
これら５つの誘導体の培養液１ｍＬ当たりの酵素活性量を算出すると（発現量は、平均値１３０ｍｇ／培地１Ｌとして計算した）、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］：２７Ｕ／ｍＬ、ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）：１０９Ｕ／ｍＬ、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）：２３４Ｕ／ｍＬ、ＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）：３５Ｕ／ｍＬ、ＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）：１０１Ｕ／ｍＬ、及びＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２９３Ａ）：２９４Ｕ／ｍＬとなった。
特開平７−２５０６９１号公報に記載の発明において、大腸菌を用いた遺伝子組換え法により製造されたアミド化酵素の活性量は、培養液１ｍＬ当り約１０〜１５ｍＵであった。これに対し、本発明において上記方法で得た誘導体の酵素活性量は、上述のように、約３５〜３００Ｕ／ｍＬであった。酵素の発現量やリフォールディング方法に違いがあるため、単純な比較はできないが、本願発明に係るＳ−Ｓ結合を除いた誘導体において、特開平７−２５０６９１号公報に記載の発明において得られたアミド化酵素の酵素活性に比較して、２，０００〜３０，０００倍の酵素活性量が向上されたことになる。
本願発明に係るＣ−末端α−アミド化酵素誘導体の培養に関して、高密度培養を行うことで当該誘導体の発現量は約５〜１０ｇ／Ｌとなることが確認されている。この場合、最終的に得られる酵素活性量は最大で培養液１ｍＬ当たり約２３，０００Ｕと算出され、これは特開平７−１６３３４０号公報に記載の発明においてＣＨＯ細胞を用いた遺伝子組換え法により製造された場合の酵素活性量（培養液１ｍＬ当りの酵素活性量の２，８６０Ｕ）を遥かに上回る。
本発明により、大腸菌を用いたアミド化酵素生産における従来技術（特開平７−２５０６９１号公報を参照のこと）において達成された培養液１ｍＬ当りの酵素活性量に比較して、極めて高い酵素活性量を有する組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体を得ることができた。また、本発明により、ＣＨＯ細胞を用いた遺伝子組換え法により製造された場合の酵素活性量（特開平７−１６３３４０号公報を参照のこと）に比較して高い酵素活性量を有する組換えＣ−末端α−アミド化酵素を得ることができた。本願発明に係る方法は、大腸菌を利用しているために、短期間で当該アミド化酵素を生産でき、上記ＣＨＯ細胞培養法に比較して、生産性が非常に高い。
また、本発明に係る組換えＣ−末端α−アミド化酵素は、ＧＬＰ−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−１）前駆体（Ｃ末端にＧｌｙが付加している）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、アミド化することが確認されており、これは、本発明に係る組換えＣ−末端α−アミド化酵素が、Ｃ末端アミド化ペプチドの生産におけるアミド化反応に十分に使用しうるものであることを示すものである。
本発明により、大腸菌を用いた遺伝子組換え法により製造される従来技術の酵素に比較して、より高い酵素活性量を有する組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体を提供しうる。
［配列表］
［配列表］
Claims (6)
- 以下の：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、６番目、１４５番目、４０番目、８５番目、２５２番目、及び２７４番目のシステイン残基から成る群から選ばれる少なくとも１つのシステイン残基が他のアミノ酸により置換されているか又は欠失されているアミノ酸配列を有するポリペプチド；又は
（ｂ）上記（ａ）に記載の少なくとも１つのシステイン残基が他のアミノ酸により置換されているか又は欠失されているアミノ酸配列において、システイン残基以外のアミノ酸残基の内の１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、Ｃ−末端α−アミド化酵素活性を有するポリペプチド；
から成る組換えＣ−末端αアミド化酵素誘導体であって、６番目と１４５番目のシステイン残基の間、４０番目と８５番目のシステイン残基の間、及び２５２番目と２７４番目のシステイン残基の間の少なくとも１つの間ではジスルフィド結合が形成されておらず、酵素タンパク質１ｍｇ当たりの酵素活性量（Ｕ）が２７０Ｕ／ｍｇ以上である前記組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体。 - 配列番号２７に示すアミノ酸配列からなるＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）、配列番号３３に示すアミノ酸配列からなるＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）、配列番号３７に示すアミノ酸配列からなるＡＥ−Ｉ［１−３２１］（Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ，Ｃ２５２Ａ／Ｃ２７４Ａ）、配列番号２５に示すアミノ酸配列からなるＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ）、又は配列番号３５に示すアミノ酸配列からなるＡＥ−Ｉ［８−３２１］（Ｃ１４５Ａ，Ｃ４０Ａ／Ｃ８５Ａ）である、請求項１に記載のＣ−末端α−アミド化酵素誘導体。
- 請求項１又は２に記載の組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体をコードするＤＮＡ。
- 請求項３に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
- 請求項４に記載の発現ベクターにより形質転換された大腸菌。
- 請求項５に記載の大腸菌を培養して、組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体を発現させ、そして得られた誘導体を回収するステップを含む、請求項１又は２に記載の組換えＣ−末端α−アミド化酵素誘導体の製造方法。
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