JPH02484A - 突然変異体の酸性繊維芽細胞成長因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 動物細胞、特にヒト細胞の成長を制御する物質およびそ
れらが作用する機構の発見は、現在組織修復および創傷
治癒に関する生物医学的研究の主流の１つである。中胚
葉由来の多くの細胞を包含する様々な細胞に対して繊維
芽細胞成長因子（ＦＧＦ、　”）　、マイトジェンが確
認されており、それらは、組織修復を生じる有糸分裂を
誘発することができることが示唆されている。繊維芽細
胞マイトジェン活性は最初に中枢神経系からの組織抽出
液に見い出された。脳由来繊維芽細胞マイトジェンはト
ロウェル（Ｔｒｏｗｅｌｌ）等ジエー、エクスボ。

パイオル、　　（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｂｏｉｌ、）第１６巻、
６０〜７゜真（１９３９年）およびホフマン、グロース
（Ｇｒｏｗｔｈ）第４巻、３６１〜３７６頁（１９４０
年）によって最初に記載されている。その後下垂体抽出
液もまた繊維芽細胞に対して有効なマイトジェン活性を
有することが示された。アメリン、ブロク、ナトル、ア
カド、サイ、　　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ第７０巻、２７０２〜２７０６頁（
１９７３年）。脳および下垂体両繊維芽細胞成長因子の
部分精製は血管内皮細胞を包含する分化細胞の様々な細
胞型に対してマイトジェン活性を示した・ゴスボダロウ
イツ（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ）等、（ナトル、キ
ャンサーインストモノグル）　Ｎａｔｌ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、Ｍｏｎｏｇｒ、第４８巻、１
０９〜１３０頁（１９７８年）。繊維芽細胞成長因子は
元来、ミニリン塩基性タンパク質の限定加水分解から誘
導される１個のペプチドであると考えられていた。

最近では、ＦＧＦは２つの形態、酸性ＦＧＦ　（ａ　Ｆ
ＧＦ）および塩基性ＦＧＦ　（ｂ　ＰＧＦ）で存在し、
両形態は分離することができ、哺乳類の脳で精製するこ
とができることが示されている。トーツスおよびギメネ
ツーガレゴ（Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏ）、ティ
ーアイビーニス（ＴＩＢＳ）第１１巻、８１〜８４頁（
１９８６年）。

多くの細胞型は精製ａ　ＦＧＦあるいはｂＦＧＦのいず
れかでの刺激に応答してＤＮＡを合成し、−次繊維芽細
胞を包含する血管および角膜内皮細胞、軟骨細胞、骨芽
細胞、筋芽細胞、平滑筋、ダリア細胞および神経芽細胞
を分裂させる、エシュ（Ｅｓｃｈ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ第８２巻、６５
０７〜６５１１頁（１９８５年）、クオ（Ｋｕｏ）等、
フェト、ブロク、（Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、）第４４巻、６
９５頁（１９８５年）、ゲンスブルガー（Ｇｅｎｓｂｕ
ｒｇｅｒ）等、シー、アール、アカド、スク、（Ｃ，ｌ
？、八ｃａｄ。

Ｓｃ、）パリ第３０３巻、４６５〜４６８頁（１９８６
年）。

純粋なウシ脳由来のａ　ＦＧＦは培養の血管内皮細胞に
対して有効なマイトジェンとして作用するだけでなく生
体内で血管の成長を誘発する、トーツス等、Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ第８２巻
、６４０９〜６４１３頁（１９８５年）。また精製ａ　
ＦＧＦのマイトジェン活性は創傷治癒を促進するために
使用することができる。トーマス米国特許第４．４４４
，７６０号に記載。

酸性繊維芽細胞成長因子は元来、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３繊
維芽細胞に対するマイトジェン活性に基づくウシ脳から
均一性のために精製された、トーツス等、Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ第８１巻、
３５７〜３６１頁（１９８４年）。この脳由来成長因子
が再精製され、その血管内皮およびテストロダリア細胞
に対するマイトジェン活性（内皮細胞成長因子およびア
ストログリア成長因子ｌ）、場所（網膜由来成長因子、
眼由来成長因子■あるいは脳由来成長因子）およびヘパ
リン−セファロースへの結合（分ＩＩヘパリン結合成長
因子またはベパリン結合成長因子α）に基づいて多数の
実験室で新たに命名されている、トーツスおよびギメネ
ツーガレゴＴＴＢＳ第１１巻、８１〜８４頁（１９８６
年）。

ウシａ　ＦＧＦのアミノ酸配列は、決定されており塩基
性ＰＧＦに非常に対応していることが認識され、繊維芽
細胞マイトジェンインターロイキン１−アルファおよび
１−βに関係している。ギメネツーガレゴ等サイエンス
第２３０巻、１３８５〜１３８８頁（１９８５年）。ヒ
）ａＦＧＦの完全なアミノ酸配列は精製タンパク質から
、ギメネツーガレゴ等、バイオケム、バイオフィ、レス
、コム。

（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙ、　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ
、　）第１３８巻、６１１〜６１７頁（１９８６年）お
よび遺伝子からジェーエ等、サイエンス第２３３巻、５
４１〜５４５頁（１９８６年）決定されている。

脳から精製した天然のａ　ＦＧＦまたは組換え誘導ａＦ
ＧＰ　　（Ｔ−ａＦＧＦ）は培養のＢａ　１　ｂ／ｃ３
Ｔ３繊維芽細胞および血管内皮細胞委最適に刺激するた
めにヘパリンの併用投与を必要とする。ヒト脳由来およ
び組換えａ　ＦＧＦはヘパリンの存在下での最適活性に
比べてヘパリンネ在下で培養のこれらの細胞に有効なの
は約１〜５％にすぎない。ａ　ＦＧＦ最大活性に対して
必要とされる服用量が比較的低い一方、ヘパリンが恐ら
く有害な副作用を誘発するためヘパリンを用いずにａ　
ＦＧＦを投与することが望ましい。はとんどのタンパク
質の活性を破壊する標準条件、加熱極値ｐＨおよびプロ
テアーゼの存在のほかに純粋なヒトａ　ＦＧＰはまた凍
結乾燥および酸に不安定である。純粋なａ　ＦＧＦは酸
化によって連鎖内または連鎖間ジスルフィド結合により
架橋され２０１ジチオスレイトールを用いてジスルフィ
ド還元することによって活性形態で回収することができ
る。ヘパリンはａ　ＦＧＦの集合を仲介する分子間ジス
ルフィド結合を阻害することができる。

またこの不均一グリコサミノグリカンがトリプシンによ
って加熱変性およびタンパク質の加水分解からのａ　Ｆ
ＧＦを安定化することは注目されている。

その結果として外因性あるいは内因性ヘパリンのいずれ
も組織修復に関連する生体内活性に必要とされる。本発
明は天然ａ　ＦＧＦに比べてヘパリンの不在下で生物学
的活性が高められた組換え誘導ａ　ＦＧＦ固有の突然変
異形態を提供するものである。

従って本発明の目的は組換え体ウシおよびヒトａ　ＦＧ
Ｆ遺伝子を天然または組換え体タンパク質よりヘパリン
の不在下で活性なタンパク質をコードすることができる
遺伝子に突然変異によって変換することである。本発明
の他の目的は、特定の遺伝子を適当なりローニングベク
ターに組込むことである。さらに目的は適当な宿主を組
換え体ベクターの各々で形質転換することであり、特定
の突然変異ａ　ＦＧＦ遺伝子の発現を誘発することであ
る。

本発明のさらに他の目的は生物学的に活性なウシおよび
ヒト突然変異ａ　ＦＧＦを単離および精製することであ
る。本発明のこれらのそして他の目的は次の説明から明
らかとなる。

突然変異ウシおよびヒトａ　ＦＧＦに対してコードする
新規な遺伝子が構成される。固有の遺伝子は、特定の点
変異によって組換え体ウシおよびヒト天然ａ　ＦＧＦを
コードする遺伝子から誘導される。各遺伝子の構成物は
適当な宿主を形質転換するために使用される発現ベクタ
ーに挿入される。形質転換された宿主細胞は、ヒトまた
はウシの特有の突然変異組換え体ａ　ＦＧＦを産生じ、
精製され、突然変異されない形態に比べてヘパリンの不
在下で生物学的活性が増大または改良される。

酸性繊維芽細胞成長因子は種々のミクロ不均質形態で存
在し、ａ　ＦＧＦを含有することが知られている種々の
組織源および細胞型から分離される。

本明細書中で使用されるミクロ不均質形態は１個の遺伝
子生産物を意味し、ＤＮＡの１個の遺伝子単位から産生
されるタンパク質であり、構造上修飾された後翻訳され
る。しかしながらこれらの構造修飾はペプチドの生物学
的活性の著しいいかなる変化も生じない。“生物的活性
”および“生物学的に活性な”は交換して使用すること
ができ、本明細書中では天然、組換え体または突然変異
体組換えａ　ＦＧＦが実施例７に記載される休止Ｂａ　
ｌ　ｂ／ｃ３Ｔ３繊維芽細胞のＤＮＡ合成を刺激する能
力、上述の細胞型のいずれかを刺激する能力または当該
技術に記載される作用のいずれかを実施する能力として
定義される。修飾は、生体内あるいは分離および精製過
程中のいずれかで行なうことができる。

生体内修飾は、Ｎ末端でのアセチル化、タンパク質の加
水分解、グリコジル化またはリン酸化を生じるがこれら
に限定されない。タンパク質の加水分解は、タンパク質
のエキソ加水分解を包含することができ、１個以上の末
端アミノ酸を順次酵素的に切断して元の遺伝子生産物よ
り少ないアミノ酸を有するミクロ不均質形態を生成する
。またタンパク質の加水分解は、アミノ酸配列内の特定
の位置でペプチドを切断するエンドプロテアーゼの作用
から生じるタンパク質の内部加水分解の修飾を包含する
ことができる。類似の修飾は精製過程中に生起すること
ができ、ミクロ不均質形態の生成も生じる。精製中に生
じる最も普通の修飾は、タンパク質の加水分解であり、
一般にプロテアーゼ阻害剤の使用によって最少限に維持
される。はとんどの条件下でミクロ不均質形態の混合物
は、天然ａ　ＦＧＦの精製後に存在する。天然ａ　ＦＧ
Ｆはａ　ＦＧＦを包含する組織または細胞から分＾Ｗお
よび精製されたａ　ＦＧＦを意味する。

本発明は、すべての動物の酸性繊維芽成長因子のミクロ
不均質形態を包含することを企図している。好適な実施
態様はウシおよびヒトａ　ＦＧＦのミクロ不均質形態を
包含する。ウシａ　ＰＧＦの最も好適なミクロ不均質形
態は１５４個のアミノ酸形態、１４０個のアミノ酸形態
および１３４個のアミノ酸形態を包含する。１４０個の
アミノ酸形態は表■に示され、ギメネツーガレゴ等、サ
イエンス第２３０巻、１３８５〜１３８８頁（１９８５
年）、ウシ種の最も好適な形態である。

芽ニー」−一一表 ＴｙｒＣｙｓＳｅｒＡｓｎＧ］ｙＧｌｙＴｙｒＰｈｅＬ
ｅｕＡｒｇｌｌｅＬｅｕＰｒｏＡｓｐＧＩｎＬｅｕＧ］
ｎＬｅｕＣｙｓＡＩａＧｌｕＳｅｒｌｌｅＧＩｙＧＩｕ
ＶａｌＴｙｒｌｌｅＧ１ｙＬｅｕＬｅｕＴｙｒＧｌｙＳ
ｅｒＧ１ｎＴｈｒＰｒｏＡｓｎＧｌｕＧＩｕＣｙｓＬｅ
ｕＰｈｅＬｅｕＧ　ｌ　ｕＡｒｇＬｅｕＧ　ｌ　ｕＧ　
１ｕＡｓｎｌｌ　１ｓＴｙｒＡｓｎＴｈｒＴｙｒ　Ｉ　
ｌｅウシａ　ＦＧＦの１ ４０個のアミノ酸形態組換え体 のヌクレオチド配列を第２表に示す。

１５４個のアミノ酸形態は、さらに次のアミノ酸Ａ　ｌ
　ａ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｔｈｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−八１　ａ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｈｒ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｌｙｓを包含し、カルボキシル末端
Ｌｙｓが１４０個のアミノ酸形態の最初の位置のアミノ
末端Ｐｈｅに付加されている。ウシａ　ＦＧＦの１５４
個のアミノ酸形態のアミノ末端アラニン残基はアセチル
化することができる。１３４個のアミノ酸形態は、アミ
ノ末端の最初の６個のアミノ酸が除かれている以外は１
４０個のアミノ酸形態と一致する。天然ａ　ＦＧＦが分
離される場合、これらのミクロ不均質形態の相対量は使
用される過程に依存して異なるが一般にこれらの形態の
少なくとも２個を含有する。

ヒトａ　ＦＧＦは、ウシａ　ＦＧＦのそれと類似のミク
ロ不均質性を示す。ヒ）ａＦＧＦの最も好適なミクロ不
均質形態は１５４個のアミノ酸形態、１４０個のアミノ
酸形態および１３９個のアミノ酸形態を包含する。１４
０個のヒトアミノ酸形態は第８表に示されるように１１
個のアミノ酸によってウシ形態と異なる。１５４個のア
ミノ酸形態は、１４０個のアミノ酸形態とさらに１つの
例外である１５４個のウシアミノ酸形態に関連した１４
個のアミノ酸の正確な配列を含有する。ヒト形態の１４
０個のアミノ酸Ｐｈｅ　Ｎ−末端から決定される通りＮ
末端の１５番目の位置または一１０゛位のアミノ酸はイ
ソロイシンであり、ウシ形態ではスレオニン置き換えら
れる。さらに１４個のアミノ酸ヒトＮ末端配列はＡｌａ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−
Ｐｈｅ−丁ｈｒ−Ａ　ｌ　ａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇ　１
　ｕ−Ｌｙｓである。

さらに１５４個のアミノ酸形態のアミノ酸はＮ末端Ａｌ
ａ、−１４からカルボキシル末端Ｌｙｓ、１まで数えら
れる。−１４位のアミノ末端アラニン残基はアセチル化
することができる。ヒトａ　ＦＧＦの３番目の形態は１
３９個のアミノ酸を含有し、アミノ末端フェニルアラニ
ン残基が除かれた１４０個のヒトアミノ酸形態に相当す
る。アミノ末端アスパラギン残基はヒトａ　ＰＧＦの１
３９個のアミノ酸形態ではアスパラギン酸にアミド分解
することができる。１４０個および１３９個のアミノ酸
形態は、ヒトミクロ不均質形態の最も好適な形態である
。１４０個のアミノ酸形態は、第３表に示される。ギメ
ネツーガレゴ等バイオケム、パイオフィス、レス、コム
、　　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、）第１３８巻、６１１〜６１７頁（
１９８６年）。

ヒトａＦＧＦの１４０個のアミノ酸形態組換え体のヌク
レオチド配列は第４表に示される。

ＴｙｒＣｙｓＳｅｒＡｓｎＧＩｙＧＩｙＨｉｓＰｈｅＬ
ｅｕＡｒｇｌｌｅＬｅｕＰｒｏＡｓｐＧｌｎＬｅｕＧＩ
ｎＬｅｕＳｅｒＡｌａＧｌｕＳｅｒＶａｌＧＩｙＧｌｕ
ＶａｌＴｙｒｒｌｅＧｌｙＬｅｕＬｅｕＴｙｒＧＩｙＳ
ｅｒＧＩｎＴｈｒＰｒｏ八５ｎＧｌｕＧＩｕｃｙｓＬｅ
ｕＰｈｅＬｅｕＧｌｕへｒｇＬｅｕＧＩｕＧＩｕＡｓｎ
ＨｉｓＴｙｒＡｓｎＴｈｒＴｙｒｌｌｅ哺乳類ａ　ＦＧ
Ｆの遺伝子を得るための好適な操作は遺伝子を合成する
ことであり、これが翻訳タンパク質の最適な活用および
変異誘発の容易さを与えるからである。遺伝子は、ヒト
を含むいかなる動物からも得られるａ　ＦＧＦのミクロ
不均質形態のアミノ酸配列に基づいて合成することがで
きる。

好適な方法はウシアミノ酸配列をａ　ＦＧＦとして使用
し、他の種類の遺伝子を示すために塩基配列を化学的に
点変異するものである、リネメイヤー（Ｌｉｎｅｍｅｙ
ｅｒ）等、バイオチクノル、　（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
、）第５巻、９６０〜９６５頁（１９８７年）。

合成遺伝子はギメネツーガレゴ等、サイエンス第２３０
巻、１３８５〜１３８８頁（１９８５年）に記載される
決定ウシアミノ酸配列およびギメネッーガレゴ等、バイ
オケム、パイオフィス、レス。

コム、第１３８巻、６１１〜６１７頁（１９８６年）に
記載されるヒトアミノ酸配列に基づき、第１表および第
３表に示される。ウシａ　ＦＧＦの１４０個のアミノ酸
形態の固有のヌクレオチド配列は、イタクラ等サイエン
ス第　１９８巻、１０５６〜１０６３頁（１９７７年）
と類似の技術によってアミノ酸配列の逆翻訳から誘導さ
れる。ウシａ　ＦＧＦの天然アミノ酸配列に対応する種
々の新規なヌクレオチド配列は次の表に示される。

ウシ遺伝子は、１個の制限酵素切断部位を含む先導部お
よび翻訳開始部位でのＮ末端メチオニンコドンで構成さ
れる。また遺伝子はタンデム翻訳停止コドンを含む圧部
と２つの制限酵素切断部位を含有する。遺伝コードの余
分は、塩基配列を選択する余地があり、順次遺伝子中に
固有の制限酵素切断部位を組込むことができる。制限酵
素切断部位の位置を有する好適なウシ遺伝子塩基配列は
次の表に示される。

二重鎖分子の各々の連鎖に対する遺伝子配列は８個のヌ
クレオチド配列にランダムに分けられる。

オリゴヌクレオチドは二重鎖ＤＮＡを形成することがで
きる重複している末端で構成される。次の表は、ウシａ
　ＦＧＦ遺伝子を生成するために使用される多数のオリ
ゴヌクレオチド配置の１つを含む。

第−一二し一一表 ＡＣＡＴＧ　　３’ ＡＴＣＧＧＴ　　３ ＣＡ／ＴＴＧＧＴＴ ＧＴＡＧＧ７　３″ ３゛ ｂ’　　　ＴＣＧＡＣＧＡＴＡＴ　　ＣＴＡ’ｒＴＡら
ＴＬ；Ａ　　ｔＩＡＩＪｃｒ＋；ａしｌｂ　　ｂしｎｂ
ｕ＋ｃ；しａｔ；　　ＧＡＡＣＡＧＧＡＴＡ第７表に例
示されたオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドサブ
ユニットの具体例として存在するにすぎずそれらに限定
されるものとして解釈されるべきではない。オリゴヌク
レオチドの重複および配列を示す複合塩基配列は第２表
に例示される。

ウシ遺伝子は、まずタンパク質のＮ末端部分に対応する
半分と２番目のＣ末端の半分の２段階で組み立てられる
。一般にオリゴヌクレオチドはＡＴＰあるいは３２Ｐ−
標識ＡＴＰの存在下でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで
キナーゼ化される。各段階の１番目の反応では遺伝子の
１本の連鎖を作成するオリゴヌクレオチドは最も多い５
゛オリゴヌクレオチドを除いてキナーゼ化される。２番
目の反応では２木目の連鎖を作成するオリゴヌクレオチ
ドは最も多い５゛オリゴヌクレオチドを除いてキナーゼ
化される。キナーゼ化されたオリゴヌクレオチドを使用
する場合、添加されたオリゴヌクレオチドの約１％が後
者の生成物の同定に３２ｐ標識される。アニーリングは
約６０ｍＭ　ＴＲｒＳ　、ｐＨ約７．６、約５ｍＭジチ
オスレイトール（ＤＴＴ　）　、約１０ｍＭ　Ｍｇｃ、
，および約３０μＭ　ＡＴＰを含むようなものであるが
これに限定されない適当な緩衝液巾約９０℃で約４分間
なった後約６０℃に速かに移し、約３０℃に徐冷した。

連結反応は約６０ｍＭＴＲｌ５　、　ｐｌｆ約７．６、
約１０ｍＭ　ＤＴＴ、約１０ｍＭＭｇ（Ｊ、、約１ｍＭ
ＡＴＰおよび約０．０３ユニツトＴ４　ＤＮＡリガーゼ
のようなものであるがこれに限定されない適当な緩衝液
巾約２０℃で約１＋Ａ時間行なわれる。

連結されたオリゴヌクレオチドはポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動に続いてエタノール沈降によって精製される
。オリゴヌクレオチドは約８０％ホルムアミド約２０μ
ｐ、約５０＋ｎＭ　ＴＲｌ５−ホウ酸塩、約ｐｌ＋８．
３、約１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＨＤＴＡ）　、
約０．１％（Ｗ／Ｖ）キシレンシアツールおよび約０．
１％（Ｗ／Ｖ）ブロモフェノールブルーを含む緩衝液に
再び溶解する。各々の試料を約９０℃で約３分間加熱し
、約１０％尿禦−ポリアクリルアミドゲル中約７５ワッ
トで約５時間電気泳動にかけた。２３１塩基Ｎ末端バン
ドを取り除き、混合してｐｌ＋約８において約１　ｍＭ
　ＥＤＴＡを含む約０．５　Ｍ酢酸アンモニウム中約４
℃で溶離する２０９塩基Ｃ末端バンドを同様の方法で処
理する。

ａ　ＦＧＦのＮ末端あるいはＣ末端部分をコードしてい
る合成遺伝子配列はｐＢＲ３２２プラスミドに組込まれ
る。ａ　ＰＧＦ遺伝子が組込まれａ　ＦＧＰ遺伝子を発
現することができる他のプラスミドの使用が本発明の範
囲内に包含されることは特に望まれ企図される。再びア
ニーリングされたオリゴヌクレオチドの約３００ｆモル
を約１００ｆモルの回収２３１ベースペアＮ末端はＮ末
端に対して約１００ｆモルのアガロースゲル−精製約３
．９キロベース（ｋｂ）　ＥｃｏＲｌ−Ｂａｍｌｌｌ　
ｐ［ｌＲ３２２に各々連結される。２０９ｂｐＣ末端は
Ｂａｍｆｌｌ−５ａ　ｌ　Ｉ　ｐＢＲ３２２を使用して
同様の方法で組み立てられる。連結反応は、約２５ｍＭ
　ＴＲｌ５　、　ｐＨ約７．８、約１　ｍＭ　ＤＴＴ、
約１０ｓ＋Ｍ　Ｍｇｃ、ｚ　、約０．４　ｍＭ　ＡＴＰ
を含む緩衝液中で約１ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを
用いて約１時間約２０℃で行なわれる。各々の半遺伝子
連結ベクターは大腸菌ＲＰＩ　（ベテスダリサーチ　ラ
ボラトリーズ、ＩＩＲＬ）のような細菌のコンピテント
細胞を供給者操作により形質転換するために使用される
。形質転換された細胞はアンピシリンの増殖に選択され
、２３１ベースペア（ｂｐ）　ＥｃｏＲＩＢａｍｌｌｌ
インサートあるいは２０９　ｂｐ　Ｂａｍ１ｌＩ−５ａ
　ｊ！　１インサートの存在を微小溶解質プラスミド製
剤の制限解析によって選別される。

適当なサイズのインサートを含むクローンのＤＮＡ配列
は、マキサムおよびギルバート、ブロク。

ナトル、アカド、す仁ＵＳＡ第７４巻、５６０〜５６４
頁（１９７７年）化学的ＤＮＡ配列手法によって決定さ
れる。

最終の全長ａ　ＦＧＦ合成遺伝子は、Ｎ末端半クローン
を制限酵素Ｂａｍ１ｌｌおよびＳａ／ＩＴで切断し、ア
ルカリ性ホスファターゼで処理し、これをＣ末端半クロ
ーンのゲル精製２０９　ｂｐ　Ｂａｍ１ｌｌ−３ａ　ｌ
Ｉベインートに連結させることによってクローンされた
。

この連結物質は、前のようにｌ？！？Ｉコンピテント細
胞を形質転換するために使用された。

合成ａ　ＦＧＦ遺伝子の発現は、多数の異なったプロモ
ーター発現系によって達成される無傷のａＦＧＦ遺伝子
の発現に対する他のプロモーター発現系の使用が本発明
の範囲に包含されることが望まれ企図される。好適な構
成物はデボエル等、ブロク。

ナトル、アカド、サイ、ＵＳＡ第８０巻、２１〜２５頁
（１９８３年）によって記載される大腸菌ｔａｃプロモ
ーターであるｔｒｐプロモーターとｌａｃプロモーター
の領域間のハイブリッドを使用する。

ｔａｃプロモーターとｒｒｎＢ　ｒＲＮＡ転写ターミネ
ータ−を含むプラスミドｐＫＫ２２３−３（ファーマシ
ア）を修飾してｐＢＲ３２２−誘発Ｓａｎ［制限酵素部
位を除去した。ｒｒｎＢ　ｒＲＮＡターミネータ−は強
力なプロモーターによって発現させるために示されてい
る、ゲンツ等、ブロク、ナトル、アカド。

サイ、ＵＳＡ第７８巻、４９３６〜４９４０頁（１９８
１年）プロシラス遺伝子第２７巻、１６１〜１７２頁（
１９８４年）。

ｐＫに２２３−３プラスミドＤＮＡは２．７ｋｂＤＮ八
断片をへ成する制限酵素で切断されてクローンｐＫＫ２
．７を生ずる。合成ａ　ＦＧＦ遺伝子は、そのρＢｌ？
３２２ベクターから切断されｐＫＫ　　２．７をＥｃｏ
ＲＩおよびＳａ　ｌ　Ｉで制限された後ｐＫＫ２．７ブ
ラスミドに取込まれる。第１図に示される得られたＭｉ
ＩＡえ体は大腸菌ＪＭ１０５（ファーマシア）またはＤ
Ｈ５（８ＲＬ）に形質転換され発現される。

部位特異的変異誘発は、ａ　ＦＧＦのｌ補乳頬のアミノ
酸配列を別の種類のａ　ＦＧＦアミノ酸に転換するのに
有効な方法である。次の説明はウシａ　ＦＧＦの１４０
個のアミノ酸形Ｂ（天然形態に従って数えて）のヒ）　
ａ　ＦＧＦへの部位特異的突然変異転換に関するがこの
方法は、いかなる哺乳１ａＦＧＩ’も、他の種類のもの
に転換するために使用することができる。転換について
唯一の制限は両ａ　ＦＧＦのアミノ酸配列が既知でなけ
ればならないことである。

次の表は、置換されねばならないアミノ酸および置換基
が生成される第６表のウシａ　ＦＧＦアミノ酸地図の位
置を列挙する。

第−一」し−一表 配列の１つを含む。

第一一」Ｌ−一表 ５　　　　　　　　　Ｐｒｏ　　　　　　　　　Ｌｅｕ
２１　　　　　　　　　Ｈｉｓ　　　　　　　　Ｔｙｒ
３５　　　　　　　　Ａｒｇ　　　　　　　　Ｌｙｓ４
７　　　　　　　　　Ｓｅｒ　　　　　　　　　Ｃｙｓ
５１　　　　　　　　Ｖａｌ　　　　　　　　　ｌ１ｅ
６４　　　　　　　　Ｔｙｒ　　　　　　　　Ｐｈｅｌ
　０６　　　　　　　　Ａ　ｓ　ｎ　　　　　　　　Ｈ
ｉ　　５１１６　　　　　　　　　Ｓｅｒ　　　　　　
　　　Ａｒｇ１１７　　　　　　　　Ｃｙｓ　　　　　
　　　５ｅｒ１１９　　　　　　　　Ａｒｇ　　　　　
　　　Ｌｅｕ１２５　　　　　　　　Ｔｙｒ　　　　　
　　　Ｐｈｅウシ遺伝子配列でのようにヒト遺伝子配列
を表わす８個のオリゴヌクレオチドはウシオリゴヌクレ
オチドに対して使用したと同様の操作によって構成され
る。次の表は、ヒ）ａＦＧＦ遺伝子を生成するために使
用される多数のオリゴヌクレオチドａ　ＦＧＦに対する
クローン合成ウシ遺伝子は、−連の指向点突然変異によ
ってａ　ＦＧＦに対するヒト合成遺伝子に転換される。

クローン遺伝子のオリゴヌクレオチド指向変異誘発は、
ウシａ　ＦＧＦの塩基配列を変化させるので得られたア
ミノ酸配列は第８表に示される置換アミノ酸を含有し、
ヒトａＦＧＦである。欠失はウシ遺伝子中でなされてａ
　ＦＧＦの１３９個のヒトアミノ酸ミクロ不均質形態の
生成に対してアミノ末端フェニルアラニンが除去される
。点突然変異は２番目の位置のアスパラギンをアスパラ
ギン酸に置換するために行なわれる。

他方アスパラギンはアスパラギン酸にアミノ分解される
。これらの操作を実施する方法は以下に記載されあるい
は当業界で既知である。オリゴヌクレオチド指向変異誘
発は、当業界で既知の標準操作を使用して行なわれる。

シラーおよびスミス、メソソズインエンザイモロジー、
第１００巻、４６８〜５００真（１９８３年）、ノリス
等、ヌクレイツク　アシソズ　リサーチ第１１巻、５１
０３〜５１１２頁（１９８３年）およびシラーおよびス
ミス、ＤＮ八へ巻、４７９〜４８８頁（１９８４年）。

ウシのヒト転換への点突然変異は、標準化されたオリゴ
ヌクレオチド指向変異誘発によって行なわれ、次の表に
示される。塩基突然変異誘発の位置は第１０表に示され
ることができる。

第一　１０−一衷 Ｐｒ。

Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｙｒ ｓｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｔｙｒ ウシａ　ＦＧＦ遺伝子の突然変異を促進するために一木
調ＤＮＡバタテリオファージベクターを標準ベクター、
Ｍ１３ｍｐ１９に取込まれる。ウシｐＫＫ　−ａ　ＦＧ
ＰプラスミドをＥｃｏＲＩ　と５ａｊＮ　で切断し得ら
れた４４０ｂｐ断片はゲル精製される。ベクターＭ１３
ｍρ１９ＲＦ　［ｌＮＡを同じ２つのエンドヌクレアー
ゼで切断し、末端を順次細菌アルカリ性ホスファターゼ
で脱リン酸化する。ベクターＤＮ＾とａ　ＦＧＦ遺伝子
断片ＤＮＡを連結させ、混合物は大腸菌Ｄ　Ｈ５細胞を
形質転換するために使用する。ウシａＦＧＰ遺伝子を含
むファージクローンはＭ１３ｍρ１９−ｂａＦＧＦが選
択される。

第９表に示されるヒトオリゴマーはリン酸化され個々に
Ｍ　ｌ　３ｍｐｌ　９−　ｂ　ａＦＧＦ−重鎮ファージ
ＤＮＡにアニーリングされる。閉環二重鎖分子はＴ４　
ＤＮＡリガーゼとＤＮＡポリメラーゼエクレノウ断片で
製造される。標本は各々ＪＭ１０５コンピテント細胞を
形質転換するために使用され得られた形質転換細胞プラ
ークはポリヌクレオチドキナーゼを使用して標識された
適当なオリゴマーを用いるハイブリッド形成によって選
択される。−重鎮ＤＮＡは、ヒトオリゴマー４突然変異
を含むファージクローンから分離され上記の操作をヒト
オリゴマー５を使用して繰り返し、オリゴマー４と５突
然変異の両方を含むクローンを生成する。

次の操作では、これらのＭ１３ベースクローンにおける
ウシからヒトへの配列突然変異を１つのｐＢＲ３２２ベ
ースクローンに組み合わせた。ＲＦＤＮＡはヒトオリゴ
マー１．２．６および８によって列挙された塩基変化を
含むクローンから製造された。ヒト１突然変異体クロー
ンのＤＮＡはＥｃｏＲ１で切断され、末端は細菌アルカ
リ性ホスファターゼで脱リン酸化され、ＤＮＡはｌ１ｉ
ｎｄｒ［Ｉで切断された。

ヒト２突然変異体ＤＮＡは、旧ｎｄＩＩ［で切断され、
ホスファターゼで処理された後Ｂａｍ１ｌｌで切断され
た。

ヒドロ突然変異体ＤＮＡは、Ｂａｎ＋ＩＩＩで切断され
、ホスファターゼ処理された後Ａｐａｒで切断された。

同様にヒト８突然変異体ＤＮＡは、Ａｐａ（で切断され
、末端が脱リン酸化され、ＤＮＡはＳａｊ！Ｉで切断さ
れた。これらの４つのＤＮ＾標本は２％アガロースによ
り電気泳動にかけられ、各ヒＩ−１，２，６および８突
然変異を含む突然変異体ＤＮＡからの４５ｂｐ、１９０
ｂｐ、１３５ｂｐおよび７ｏｂｐの断片はゲルから溶難
された。各断片容量は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでｐＢＲ３
２２からのゲル精！！！！　３．７　ｋｂ　ＥｃｏＲ］
−３ａ　１　ｒ断片に集合的に連結され供給者によって
記載される通り大ＭＩＨ）Ｈｓコンピテント細胞（Ｂｌ
？Ｌ　）を形質転換するために使用される。全部で４つ
の突然変異体オリゴマーによって列挙された突然変異を
含むクローンは各々のオリゴマーから製造された放射性
標識プローブを用いるハイブリッド形成によって選択さ
れる。ヒト３突然変異体Ｍ１３クローンの切断１？Ｆ　
ＤＮＡから分ＷｌｌされたＩ　４０ｂｐ　Ｋｐｎｆ−Ｂ
ａｎ＋ＨＩ　　ＤＮＡ断片はこのヒト１−２−６−８突
然変異体ＤＮＡのエンドヌクレアーゼ切断生成物に連結
されＤ　Ｈ５コンピテント細胞に形質転換されてヒト１
−２−３−６−８突然変異を有するクローンを生成する
。この後者のクローンのＢａｍＨｒ−Ｐｓｔｌ消化断片
はヒト４−５Ｍ１３ベースクローンからのＲＦ　ＤＮＡ
のＢａｏ＋ＨＩ−ＰｓｔＩ消化断片に連結され、連結混
合物はＤＨ５コンピテント細胞を形質転換するために使
用される。ヒト１−２−３−４−５−６−８突然変異を
含むクローンはオリゴマーバイブリフト形成により選択
され、このＭｌ変えプラスミドのａ　ＦＧＦ遺伝子Ｅｃ
ｏＲｒ　−Ｓａ　ｌ　Ｉ　ＤＮＡ断片はＭｌ　３ｍｐｌ
　８　（ＢＲＬ　）のホスファターゼ処理ＥｃｏＲＩ−
５ａｌＴ−切断ＲＦ　ＤＮＡに連結される。コンピテン
トＤＨ５細胞はこの連結ＤＮＡで形質転換され、形質転
換された細胞はＪＭ１０５宿主細胞に平板にされる。こ
のクローンの一重鎖ファージＤＮＡはヒト７オリゴマー
とアニーリングされ、所望の突然変異全てを含むＭ１３
クローンは上述した操作により得られた。ヒトａ　ＦＧ
ＦはＭ　ｌ　３ｍｐｌ　８−　ｈ　ａＦＧＦに指定され
る。

ヘパリンネ在の純粋なａ　ＦＧＦは恐らく不正確に安定
化した分子内ジスルフィド結合の生成および分子間ジス
ルフィド結合によって生成される集塊のために活性が低
（なる。ジスルフィド共有結合は２つの分離したポリペ
プチド鎖の連鎖間ジスルフィド結合あるいは一重鎖分子
内連鎖ジスルフィド内の異なった位置のいずれかの２つ
のシスティン残基間で形成される。酵素酸化的アミノ化
の場合゛活性分子はｐＨ約９．１において３Ｍ塩化グア
ニジニウムの存在下２０ｍＭジチオトレイトールで還元
することによって回収することができる。本発明は、特
定の位置に対する位置指向変異誘発または異質の分子内
または分子間共有結合を形成することができるアミノ酸
および酸化を受けやすいアミノ酸の欠失を利用する。本
明細書中で使用される置換は、所望のアミノ酸が望まれ
ないアミノ酸に置換されるようにａ　ＦＧＰのＤＮＡ塩
基配列の慎重な変化を意味する。望まれないアミノ酸は
、望ましくない共存結合特にジスルフィド結合を形成し
ないものまたは分子の生物学的活性を低下させることが
できる空気酸化できるものであることができる。本明ｔ
ｌＩｒ書中で使用される欠失は、望ましくないアミノ酸
の脱離を生じるａ　ＦＧＦのＤＮＡ塩基配列の慎重な変
化を意味する。分子内および分子間共有結合生成に関連
する第一級アミノ酸はシスティンであり、一方酸化傾向
のあるアミノ酸はシスティン、メチオニンおよびトリプ
トファンを包含する。システィン残基は、ジスルフィド
結合を形成しないいかなるアミノ酸にも置き換えること
ができる。システィンの置換に好適なアミノ酸はセリン
である。酸化傾向のアミノ酸は酸化に抵抗するいかなる
アミノ酸にも置き換えることができ、アラニン、バリン
、ロイシンおよびイソロイシンを包含するがこれらに限
定されない。

本発明は不正確な分子内または分子間結合または酸化的
変化の生成のため天然または組換え体ａＦＧＦの活性を
低下させるかまたは不活性にすることができる１種以上
のシスティンおよびいくつかの非末端メチオニン残基の
位置特異的突然変異を包含することを企図している。ヒ
トおよびウシ組換え体および天然タンパク質は、ウシお
よびヒト両ａ　ＦＧＦの１４０個の天然アミノ酸形態に
よって定義される通り１６および８３位に共通に位置し
た２つのシスティン残基および６７位に共通に位置した
メチオニン残基を含有する。ウシおよびヒ）ａＦＧＰの
各々は各々４７および１１７位に３番目のシスティン残
基を含有する。共有のシスティン残基はジスルフィド結
合中のシスティン残基の位置が同族タンパク質中に極め
て維持されるためにジスルフィド結合を最も形成しやす
い。従ってウシおよびヒトａ　ＦＧＦの異なった位置に
ある３番目のシスティン残基は、十分活性なタンパク質
のジスルフィド結合には非常に見い出されにくい。

本発明の新規な突然変異体ａ　ＰＧＦは共通でないシス
ティン残基で置換された形態を包含するばかりでなく、
すべてのシスティンが置換されるか欠失されたもの、シ
スティンのいずれか１つまたは２つが置換または欠失さ
れたちのさらにメチオニンが置換または欠失されたもの
を包含する。位置指向変異誘発によるヒトまたはウシａ
　ＦＧＦ中のいずれか１つの特に特有のシスティン、す
べてのシスティン３個のシスティンまたはメチオニンの
２つは望ましくない分子内および分子間ジスルフィド結
合および酸化形態の生成１＃ｔｌ換または欠失すること
ができる。

位置特異的変異誘発はゲノムＤＮＡ　、　ｃＤＮＡから
生成された好ましくはウシまたはヒトｒ　−ａ　ＦＧＦ
でまたはヒトを含む哺乳類からのａ　ＦＧＦのミクロ不
均一形態に基づくタンパク質のミクロ不均質形態の１種
以上に対する遺伝子の組み立てによって行なわれる。ゲ
ノムＤＮＡは、哺乳類の脳または下垂体細胞から抽出さ
れ、マニアチス等、セル第１５巻、６８７〜７０１頁（
１９７８年）の手法により高分子量のランダム分裂ある
いはスミチェス等、サイエンス第２０２巻、１２８４〜
１２８９頁（１９７８年）の方法によって制限酵素での
切断によってクローンに調製される。次にゲノムＤＮＡ
は、適当なりローニングベクター　一般に大腸菌λファ
ージに組込まれる、マニアチス等、モレキュラークロー
ニング、ラボラトリ−マニュアル、コールドスプリング
ハーバ−ラボラトリ−コールドスプリングハーバ−、ニ
ューヨーク（１９８２年）参照。

ｃ　ＤＮＡをａ　ＦＧＦとして得るためにポリ　（Ａ）
含有ＲＮＡは、アビブおよびレダー、ブロク、ナトル。

アカド、サイ、第６９巻、１４０８〜１４１２頁（１９
７２年）の方法によってａ　ＦＧＦを発現する細胞から
抽出される。ｃ　ＤＮＡはマニアチス等、モレキュラー
クローニング、ラボラトリーマニュアル、コールドスプ
リングハーバ−ラボラトリ−コールドスプリングハーバ
−、ニューヨーク（１９８２年）に記載される標準手法
を使用して逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを使用
して調製される。ｃ　ＤＮＡはウェンシンク等、セル第
３巻、３１５〜３２５頁（１９７４年）と同様の手法に
よって結紮され適当なベクター通常ｐＢＲ３２２にクロ
ーンされる。

クローナルゲノムＤＮＡまたはｃ　ＤＮＡライブラリー
はオリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリッド形
成によりａ　ＦＧＦ配列を含有するクローンを確認する
ために選別される。オリゴヌクレオチドハイブリッド法
プローブの配列はａ　ＦＧＦの決定アミノ酸配列に基づ
いている。マニアチス等、上記、アンダーソンおよびキ
ングストン、ブロク。

ナトル、アカド、サイ、ＵＳＡ第８０巻、６８３８〜６
８４２頁（１９８３年）およびサッグス等ブロク、ナト
ル、アカド、サイ、ＵＳＡ第７８巻、６６１３〜６６１
７頁（１９８１年）はゲノムおよびｃ　ＤＮＡクローン
を選別する種々の操作を記載している。好適な操作は、
上述の通り合成されたウシおよびヒト遺伝子を特異的に
点突然変異するものである。

位置特異的変異誘発は、シラーおよびスミス、メソッズ
　イン　エンザイム、　　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ
ｎ−ｚｙｍ、）第１００＠、４６８〜５００頁（１９８
３年）フリユ等、ヌクレイツク　アシズ　レス。

（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）第１１巻、
５１０３〜５１１２頁（１９８３年）およびシラーおよ
びスミス、ＤＮＡ第３巻、４７９〜４８８頁（１９８４
年）の操作によりＭ　１３ｍｐｌ　８−　ｈ　ａＦＧＦ
またはＭ　１３ｍｐｌ　９−　ｂ　ａＦＧＦのようなヒ
トまたはウシａ　ＦＧＦ−重鎮バタテリオファージ組換
え体クローンで行なわれる。各々の種に対するオリゴヌ
クレオチドは１６．８３および１１７位のヒトａ　ＰＧ
Ｆ遺伝子そしてウシ遺伝子に対して１６．４７および８
３位のシスティンコドンの各々の代わりにセリンコドン
を列挙するために示される。オリゴヌクレオチドは６７
位のヒトまたはウシａ　ＦＧＦのメチオニンコドンの代
わりにロイシンコドンを列２４するために示される。合
成されたヒトオリゴマーは次の表に示され突然変異塩基
は下線が引かれている。

システィン システィン システィン メチオニン 第一一」二り一一表 １　　　（１６）　　５°ＣＣＧＴＴＡＧＡＧＧＡＧＴ
ＡＡＡＧＡＡＧＣ３゜２　　　（８３）　　　５’ＧＧ
ＡＡＡＡＧＧＧＡＣＴＣＣＴＣＧ　　　　３’３　　（
１１７）　　　５’ＣＣＧＣＧＴＴＴＡＧＡＧＣＴＧＣ
Ｃ３’（６７）　５’ＣＣＡＴＣＡＧＴＧＴＣＣＡＧＧ
ＧＣＡＡＧＧ　　３’類似のオリゴマーは、ウシａ　Ｆ
ＧＦ遺伝子の適当な領域に対して確認され特異的突然変
異は以下に記載される通り行なわれる。

ヒトオリゴマーはリン酸化されＭ１３ｍｐ１８ｈａＦＧ
ＦまたはＭ　１３ｍｐｌ　９−　ｂ　ａＦＧＦ−重鎮Ｄ
Ｎ八個々にアニーリングされる。ＤＮＡの２番目の連鎖
はブライマーとしてアニーリングされたオリゴマーを使
用して合成される。各々のシスティン突然変異遺伝子は
、大腸菌Ｄ　Ｈ５コンピテント細胞のような適当な宿主
を形質転換するために使用される。形質転換された細胞
は大腸菌ＪＭ１０５細胞のようなＭ１３ウィルスに対し
て使用し得る宿主のローンに平板にする。形質転換され
たプラークは適当に標識されたオリゴマーを用いるハイ
ブリッド形成によって選択される。ハイブリッド形成の
条件は各々のプローブに対して１個の塩基変化を含有す
るハイブリッドの保持を防止するように最適にされる。

−重鎮ＤＮＡはサンガー等、ブロク、ナトル、アカド、
サイ、ＵＳＡ第７４巻、５４６３〜５４６７頁（１９７
７年）の方法を使用するＤＮＡ配列解析に対してシステ
ィンからセリンへの突然変異の各々を含むファージクロ
ーンから分離される。ＲＦ　ＤＮＡは、ＥｃｏＲ［およ
び５ａｉｌで切断されアガロースゲル電気泳動によって
精製される各クローンに調製される。精製４４０ｂｐイ
ンサートはｐＫＫ　２．７　ｔａｃプロモーター発現ベ
クターの２．７　ｋｂＥｃｏＲｒ−Ｓａ　７！Ｉ　ＤＮ
Ａ断片に個々に連結される。連結ＤＮＡはコンビテン１
−ＤＨ５細胞を形質転換するために使用され、突然変異
システィンコドンを有するＤＮＡを含むクローンはハイ
ブリッド形成によって適当なオリゴマーに選択される。

各々０ａＦＧＦｉｆｆ伝子インサートはマキサムおよび
ギルバート、メサソド　イン　エンザイモロジー第６５
巻、４９９〜５６０頁（１９８０年）の方法によって配
列される。ヒ）ＤＮ八へ来の１個の塩基変化を含有する
クローンはタンパク質の置換位置に対してｐＫＫ　　−
ｈ　ａＦＧＦ　（Ｓｅｒｌ　６）　、ｐＫＫ　−ｈ　ａ
ＦＧＦ（Ｓｅｒ８３）およびｐＫＫ　−ｈ　ａＦＧＦ　
（Ｓｅｒｌ　１７）に指定され、ウシＤＮＡはｐＫＫ　
−ｂ　ａＦＧＦ　（Ｓｅｒｌ　６）、ｐＫＫ　−ｂ　ａ
ＦＧＦ　（Ｓｅｒ４７）およびｐＫＫ　−ｂ　ａ　ＦＧ
Ｆ（Ｓｅｒ８３）に指定される。

システィン残基のいずれか２つまたは全て３つの置換は
多数の点突然変異によってまたは上述の通りウシに対し
てＭ１３…ｐ１９およびヒトに対してＭ１３ｍｐ１８に
クローンされｐＫＫ２．１にサブクローンされたヒトあ
るいはウシ組換え体野生型および（Ｓｅｒｌ　６）　、
（Ｓｅｒ４７）　、（Ｓｅｒ８３）および（Ｓｅｒｆ　
１７）突然変異体合成遺伝子の制限断片を組み合わせる
ことによって達成される。多数の突然変異が上述の通り
ウシあるいはヒトの１個の突然変異ａ　ＦＧＰ構成物で
行なわれることができるが次の例示はヒｌ−ａ　ＦＧＰ
を包含することは理解されるべきである。　ｐＫＫ　−
ｈ　ａＦＧＦ　（Ｓｅｒｆ　６．３２）およびｐＫＫ　
−ｈ　ａ　ＦＧＦ　（Ｓｅｒ　１６．３２）組換え体は
Ｍ　１３ｍｐｌ　８　（Ｓｅｒｌ　６）の０．２３　ｋ
ｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｂａｍｌｌｌ断片をｐＫＫ２．７に導
入した後Ｍ１３ｍｐ１８（Ｓｅｒ８３）あるいはＭｌ　
３ｍｐｌ　８（Ｓｅｒｆ　１７）からの０．２　ｋｂ　
Ｂａｍ１ｌＩ−５ａ　ＩＩ！　ｌ断片を挿入するコトニ
よって組み立てられる。ｐＫＫ２．７ベクターは、多数
クローニング配列のＢａｍｌｌｆ部位を残しなからｔａ
ｃプロモーターの上流でＢａｍ１１１部位を除去するた
めに修飾される。対応する制限酵素で消化した後連結反
応および適当な宿主を形質転換してクローンを選択し、
組換え体約３．１　ｋｂに対して多量される分子量を有
するプラスミドを含有するものを選別する。適当な細菌
宿主は大腸菌Ｄ　Ｈ５、ＪＭ１０５またはＡ３１８９９
を包含することができるが、これらに限定されない。

突然変異体ｈ　ａ　ＦＧＦ　（Ｓｅｒ　１６．８３．１
１７）はｐＫＫ　−ｈ　ａ　ＦＧＰ　（Ｓｅｒ　１６．
８３）の０．１３ｋｂＳｐｈ　ｌ　−５ａ　１１断片を
１１７位のＣｙｓＯ代りにＳｅｔをコードしているｐＫ
Ｋ　−ｈ　ａＦＧＦ　（Ｓｅｔｌ　Ｌ　７）の対応する
断片に置き換えることによって組み立てられる。ｐＫＫ
　−ｈ　ａ　ＦＧＦ　（Ｓｅｒ　１６．８３）の３ｋｂ
　Ｓｐｈ　（１−５ａ　Ｉ！　ｌ断片は、分取用アガロ
ースゲル電気泳動、電気溶離によって精製され、同様の
方法で５％ポリアクリルアミドゲルから精製されるｐＫ
に−ｈ　ａＦＧＦ　（Ｓｅｒｌ　１　？）の０．１３ｋ
ｂ　５ｐｈｘ　−５ａｌｌ断片に連結される。精製フラ
グメントは連結され、組換え体は上述の通り選択される
。

ｐＫＫ　−ｈ　ａＦＧＦ　Ｃ３ｅｒ８３．１１７）突然
変異体は、ｐＫＫ　−ｈ　ａ　ＦＧＰの０．３　ｋｂ　
Ｐｓｔ　１断片非突然変異形態を８３および１１７位の
Ｃｙｓの代わりにＳｅｔのコドンを包含するｐＫＫ　−
ｈ　ａ　ＦＧＰ　（Ｓｅｒ　１６．８３．１１７）断片
に上記の技術を使用して置き換えることによって組み立
てられる。形質転換体はＰｓＬｊ！−５ａｌｌ消化によ
って解析されて連結断片の配向が決定される。全ての遺
伝子はサンガー等、ブロク、ナトル、アカド、サイ、Ｕ
ＳＡ第７４巻、５４６３〜５４６７真（１９７７年）の
ジデオキシ法によって配列される。

突然変異ａ　ＰＧＰ遺伝子の発現は、多数の異なった宿
主細胞の多数の異なったプロモーター−発現系によって
達成される。無傷突然変異ａ　ＦＧＦ遺伝子の発現に対
して他の宿主細胞およびブロモ−ター発現系の使用が本
発明の範囲内に包含されることは希望され企図される。

宿主細胞は細菌、酵母、昆虫および哺乳類細胞を包含す
る。また抗原はウィルスで発現されることができる。遺
伝子は多数の原核細胞および種々の氷核細胞で発現され
ることができるが、好適な宿主細胞は大腸菌である。

突然変異ａ　ＦＧＦの発現に使用することができる発現
ベクターは、ｐＢＲ３２２、ｐＰＬａ２３１１、ｐＫＣ
３０、ｐｔａｃｌ　２、λｇｔ　１１　、ＣｈｅＹ、　
ｐＡｓｌ、　ｐＬＣ２４、ｐＳＢ２２６、ＳＶ４０およ
びｐＫＫ２２３−３を包含し、ρＫＫ２２３−３が好適
であるがこれらに限定されない。大腸菌発現ベクターは
、一般に所望のタンパク質の最初のアミノ酸に付加され
たメチオニン残基を翻訳することができる。本発明は、
末端メチオニンを有する突然変異体ｒ　−ａ　ＦＧＦだ
けでなく酵母細胞、哺乳類細胞または細菌細胞のような
細胞型の翻訳により除去された末端メチオニンを有して
いる突然変異体ｒ　−ａ　ＦＧＦを包含することは理解
される。発現ベクターはＤＮＡ配列中ａ　ＦＧＦ遺伝子
の発現を高める１種以上のシストロンをさらに包含する
ことができる。スコナー等ブロク、ナトル、アカド、サ
イ、ＵＳＡ第８３巻、８５０６〜８５１０頁（１９８６
年）。好適な構成物は大腸菌ｔａｃプロモーター、デボ
エル等、ブロク、ナトル、アカド、サイ、ＵＳＡ第８０
巻、２１〜２５Ｑ（１９８３年）に記載されるＬｒｐプ
ロモーターとｌａｃプロモーターの領域間のハイブリッ
ドを使用する。ＬａｃプロモーターおよびｒｒｎＢｒＲ
Ｎ八転写ターミへターを含むプラスミド、ｐＫに２２３
−３　　（ファーマシア）はｐＨＲ３２２３Ｍ導５ａｌ
Ｉ制限酵素部位を除去するために修飾される。

ｒｒｎＢ　ｒＲＮＡターミネターは、強力プロモーター
によって発現させるために示されている。ゲンツ等、ブ
ロク９ナトル、アカド、サイ、ＵＳＡ第７８巻、４９３
６〜４９４０頁（１９８１年）ブロクウス、Ｇｅｎｅ第
２７巻、１６１〜１７２頁（１９８４年）。

ｐＫＫ２２３−３プラスミドＤＮＡは、制御酵素で切断
されてクローンＰＫＫ２．７を生じる２、　７　ｋｂＤ
Ｎ八断片へ生成する。合成ａ　ＦＧＦ遺伝子は、そのｐ
ＢＩ？３２２ベクターから切断されｐＫＫ２．７をＥｃ
ｏＲＩおよび５ａｌｌで限定した後ｐＫＫ２．７プラス
ミドに取込まれる。第１図に示される得られた組換え体
は、大腸菌ＪＭ１０５（ファーマシア）またはＤＩ［５
（ＢＲＬ　）に形質転換され発現される。

好適な発現を高めるベクターはヌクレオチド配列第１シ
ストロン、所望のタンパク質をコードしている遺伝子の
上流に第２シストロンを含有する。

突然変異ａ　ＦＧＦは第２シストロンである。第１シス
トロンは一般に停止コドンの上流にシャインーダルガル
ノの配列を含有する。発現を高めるベクターは野生型ま
たは突然変異体ａ　ＦＧＦの発現を高めるのに有効な第
１シストロンである次のヌクレオチド配列 へＡＴＴＡＴＧＴＡＴＣＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧＡＧ
ＧＡＡＴＴＡＣＡＴＡＧＣＴへへＴＴＴＡＴＴＣＣＴＣ
ＣＴＴＡＴＴへ＾（ｐＫＫ２．７）　（シストロン１，
２オリゴマー）　（ａＦＧＦ）を含有するが、これらに
限定されない。第１シストロンはＥｃｏＲＩ部位で適当
なｐＫＫ　−ｈ　ａ　ＦＧＦ構成物に挿入される。挿入
はＥｃｏＲＩ　クローニング部位の不全を生じる。組換
え体は上述したような適当な宿主細胞に形質転換され発
現される。この構成物は、野生型または突然変異体ａ　
ＦＧＦ発現の約１０倍の増加を生じる。発現が高められ
るベクターを含有するプラスミドはｐＫＫ　２　ｃ　−
ｈ　ａＦＧＰに指定される。本発明は、ｐＫＫ　２　ｃ
　−ｈ　ａ　ＦＧＦ　（Ｓｅｒｌ　６）　、ｐＫＫ　２
　ｃ−ｈａＦＧＦ　（Ｓｅｒ８３）　、ｐＫＫ　２ｃｍ
ｈａＦＧＦ　（Ｓｅｒｌ　１７）　、ｐＫＫ　２　ｃ−
ｈａＦＧＦ（Ｓｅｒ　１６．８３）％ｐＫに２ｃ　−ｈ
　ａＦＧＦ　（Ｓｅｒｆ　６．１１７）　、ｐＫＫ　２
ｃｍｈａＦＧＦ　（Ｓｅｒ８３．１１７）、ｐＫＫ　２
　ｃ　−ｈ　ａＦＧＦ　（Ｓｅｒｌ　６．８３．１１７
）のような発現を高めるベクターを含有するクローンを
包含することが企図される。

突然変異発現クローンは、約１％のトリプトン、約０．
５％の酵母エキス、約０．５％のＮａＣｌ、約０．４％
のグルコースおよび約５０μｇ／ｍｌのアンピシリンか
らなる適当な増殖培地中で約３７℃で増殖される。５５
０ｒ＋ｍにおける光学濃度が約０．５に達する場合、イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴ
Ｇ）を添加して最終濃度約１ｍＭを得ることができ、増
殖は約３７℃で約２４時間まで続けられる。培地１１か
らの細胞を遠心分離によって回収し、約１００ｍＭリン
酸塩および約５　＋＋ｖ／ｍ　ＩＩ　ＥＤＴＡを含む洗
浄緩衝液に再懸濁させる。

再懸濁の最後にリゾチーム約０．１　ｔｔｗ／ｍ　ｌを
添加し、懸濁液を緩かに振盪しながら約３０°Ｃで約１
５分間湯面する。細胞を遠心分離で集め、約１００ｍｔ
リン酸ナトリウムｐＨ約６．０、約３　ｍＭ　ＥＤＴＡ
　、約０．０３ｍＭＮ　−ｐ　−１−ルエンスルホニル
ーし一フェニルーアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣ
Ｋ）　、約０．０５ｍＭペプスタチンＡ、約０．０５ｍ
Ｍフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）　、約
０．０５ｍＭロイペプチンおよび約１５μｇ／ｍｅウシ
膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）を含有する破
壊緩衝液に再懸濁させる。細胞を直接破壊あるいは凍結
させ一７０℃で貯蔵し、２０，０００　ｐｓｉ、約４℃
でフレンチプレッシャーセル（Ｆｒｅｎｃｈ　ｐｒｅｓ
ｓｕｒｅ　ｃｅｌｌ）に約２回通過して解凍した直後に
破壊される。上澄み液を遠心分離により集め、凍結乾燥
する。

突然変異ａ　ＦＧＦをカチオン交換体マトリックス次に
ヘバリンーセファロースアフィニチイマトリックス次に
逆相高性能液体クロマトグラフィ　（１１ＰＬＣ）を使
用する３工程クロマトグラフイ処理によって均質に精製
する。凍結乾燥した上澄み液をリン酸緩析液約１００ｍ
Ｍ、ｐｌ＋約６．０に再懸濁し、同一緩衝液で平ｉ）ｉ
にしたカチオン交換体、好ましくはＣＭ−セファデック
スに添加する。ＣＭ−セファデックスをタンパク質１ｇ
当り沈降樹脂約６．５１１Ｉｌの割合で添加する。樹脂
を閃光ガラス漏斗に集め、リン酸塩緩衝食塩水約１００
ｍＭリン酸塩および約１５０ｍＭ　ＮａＣｌ５ｐＨ約６
で３回洗浄する。

樹脂を同一緩衝液に再懸濁し、カラムに充填し、約６０
０ｍＭ　Ｎａ（Ｊ緩衝液で洗浄溶離する。ヘパリン−セ
ファロースを約１０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐｌ＋約７．
２に平衡にし、タンパク質１ｇ当り沈降樹脂約ｌｌ１１
７！の割合で溶出液に添加し、約４℃で約１時間緩かに
振盪し、樹脂複合体を漏斗に集める。

樹脂を同一緩衝液に再懸濁させ、１時間につき１〜２カ
ラム容量でカラムに装填する。カラムを約１０ｍＭリン
酸塩、ｐＨ約７．２および約０．８ＭＮａＣ６を含有す
る緩衝液で洗浄し、同一緩衝液中１．５　ＭＮａＣｌで
溶離する。各々のタンパク質を集め、さらに逆相１１　
Ｐ　Ｌ　Ｃで精製する。画分をＦＩＰＬＣ逆相カラム約
０３に装填し、約１０ｍＭ）リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
で平衡にし、約Ｏ〜１００％の４ｍＭＴＦ＾、約θ〜６
７％のｃ、１，ＣＮの勾配で約３０分間溶離する。

精製突然変異組換え体ａ　ＰＧＦのマイトジェン活性は
”Ｈ−チミジンを細胞系繊維芽細胞によるＤＮＡ　、好
ましくは８ＡＬＢ／ｃ　３Ｔ３Ａ３１　　（アメカンタ
イプ力ルチュアコレクション）に組込むことによって定
量する。プラスミドｐＫＫ　−ｈ　ａ　ＦＧＦ（Ｓｅｒ
１６）からの突然変異体タンパク質は繊維芽細胞を非突
然変異ヒトａＦＧＦに等しいかまたは低いレベルで刺激
した。突然変異体タンパク質ｐＫＫ−ｈ　ａＦＧＦ　（
Ｓｅｒｆ　１　？）はヘパリンの不在下で非突然変異形
態より高い刺激活性を示した。

十分制御され非常に再現性のあるマイトジェンアッセイ
は野性型ｈａＦＧＦとＣｙｓの相対的マイトジェン比活
性をＳｅｔ突然変異体と比較するために必要である。血
清のない培養液中のＢａ１ｂ／Ｃ３Ｔ３細胞の集密的培
養は、バンクグラウンドからピークのＤＮＡ合成まで応
答の完全な上昇を進めるａＦＧＦ’／３度の少なくとも
ｌ　ｏｇ　３以上２倍の逐次希釈で刺激された。１刺激
単位は２最大応答を生じるｌ　　ｍｌ当りのａ　ＦＧＦ
の量として計算される。マイトジェン比活性は純粋ａＦ
ＧＦ１■当りの刺激単位数である。さらにアッセイは原
液をＴＦＡ／ＣＩｈＣＮの約５０μｇまたはこれ以下の
ａＦＧＦ／ｍｌに希釈することによって標定される。希
釈液は異なった試料を比較できるようにいかなる濃度作
用も排除する。

Ｃｙｓ　１１７いずれか２つのＣｙｓ残基または全て３
つのＣｙｓ残基のＳｅｒへの転換は、ヘパリンの不在下
でタンパク質の比活性が７〜２０倍増加する。

ヘパリンの存在下でさえ全部で４個の複数突然変異体は
、野生型ヒ）　７−　ａ　ＦＧＦより活性でありｈａＦ
ＧＰ　（Ｓｅｒ８３．１１７）は約２．７倍活性である
。

ヘパリンは野生型ａ　ＦＧＦの活性を２０倍刺激するが
、突然変異体の活性を約３〜５倍しか相乗しない。

ヒトａ　ＦＧＦの３個のＣｙｓ残基全部またはいずれか
２つのＳｅｔへの転換はヘパリンネ在下でタンパク質の
比活性が７〜２０倍増加する。ヘパリンの存在下でさえ
全部で４個の複数突然変異体は非突然変異ｈａＦＧＦよ
り活性であり、ｈ　ａ　ＦＧＦ　５ｅｒ（８３，１１７
）はかろうじて３倍活性である。

突然変異組換え体ａ　ＰＧＦは、これらに限定されない
が火傷、切傷または裂傷から生じる軟組１．ｔＭの創傷
および骨折、靭帯および股裂傷のような骨格筋創傷およ
び粘液嚢および胴の炎症の修復を促進または治癒するの
に宵月である。本明細書中で使用される組織修復はａ　
ＦＧＦのそばの中胚葉、外胚葉または神経外胚葉誘発細
胞による組織の再生として定義される。また突然変異ｒ
　−ａ　ＦＧＦは軟骨および軟骨質［１ｉの治癒および
再生を促進するのに有用である。角膜組織を包含する軟
ｆＪＩ織修復のための突然変異ａ　ＦＧＦの投与は一般
に局所、皮下、静脈または眼内による。軟組織は、上述
した骨格筋系に関連するものを除くすべての組織を包含
する。新規なペプチドはヘパリンを用いてまたは用いず
に好ましくはヘパリンを用いずに本発明のタンパク質量
０．１〜１００μｇ　／ｃａｌ１日を創傷面に、局所的
または皮下には約１−１００μｇ／ｃＩ１１／日投与す
ることができる。局所投与の最も好適な範囲は、約１−
１０μｇ／ｃｏｔ／日である。

ヘパリンはｉＪｔ　Ｄ−グルコサミンと異なった程度に
硫酸化されるＤ−グルクロン酸の等指部からなる硫酸化
グリコサミノグリカンである。直接治療に利用するため
には非変性形態並びに溶液形態で市販で入手することが
できる。ヘパリンがａ　ＦＧＦと局所または皮下で投与
される場合、好適な濃度は１日に投与されるａＦＧＦ　
５１　（質量）の約３〜３０倍である。

骨格筋および軟骨の修復または治癒に対して突然変異γ
−ａ　ＦＧＦは損傷部位に手術中にあるいは注射で投与
されるのが好ましい。突然変異ａ　ｐＧＦの緩慢な放出
形態の外科的注入は成長因子の放出が延長して持続され
ることが考慮される。緩慢な放出に対する突然変異ａ　
ＦＧＦの処方方法は当業界で既知である。骨格筋治癒に
対する用量レベルは約１０〜１００μｇ／ｃｔＡ／日で
ある。

さらにその上突然変異体γ−ａ　ＦＧＦは血管増殖（血
管形成）、血管修復（損傷した内皮細胞をもとへもどす
など）といった生体内血管組織修復の助長を促進し、注
入の血管生成に対して適当な基質上の内皮細胞の増殖を
刺激するのに有用である。

新規な突然変異体γ−ａ　ＦＧＦペプチドの生体内血管
形成作用は約１〜１０００μｇ／Ｃｒａ／口、好ましく
は約１０〜１００μｇ／ｃａｔ／日を皮下のような内部
投与によって達成される。表面修復の好適な適用範囲は
約１００ｎｇ〜１００１１　ｇ　／ｃｎｌ／日であり、
最適適用範囲は約１〜１０μｓ／ｃ＋＋Ｉ／日である。

広い血管修復は１回の服用器量０．１〜１１００ｎ／ａ
ｄまたは持続注入約１〜ｌ　０００μｇ／ｃＪ／日によ
って達成される。血管生成に対する適当な基質上の内皮
細胞の試験管内増殖は約１〜１０ｎｇ／−／日の投与に
よって達成される。

また突然変異体ｒ　−ａ　ＦＧＦは血栓作用の治療に血
管内皮細胞によるプラスミノーゲン活性化因子の生体内
誘発に有用である。血栓作用は、血管内の血栓の形成か
ら起こり、血栓症発作、深部静脈血栓症、心筋梗塞、お
よび他の内科症状を生じ組織の壊死を起こし、しばしば
患者の死に至らしめる。前に形成された血餅の消化およ
び血餅形成の予防は突然変異体ｒ　−ａ　ＦＧＦによっ
て仲介され血栓症の治療を高めることができる。また突
然変異体ｒ　−ａ　ＦＧＦでの前処理は血餅の形成が非
常に危険にある人を含む動物に血餅の形成を予防するた
めに使用することができる。血栓症の治療に望ましい突
然変異体γ−ａ　ＦＧＦの用量範囲は約１０μｇ〜ｌＯ
■／ｋｇ／口である。

また突然変異および野生型ｒ　−ａ　ＦＧＦは、アルツ
ハイマー病で損傷または破壊される海馬ニューロンおよ
び破壊が麻痺を引き起こす運動および知覚ニューロンを
維持刺激することを包含する中枢および末梢神経組織修
復を促進するのに有用である。損傷神経組織は突然変異
または野生型ａ　ＦＧＰによって刺激されてその領域の
損傷神経を再集団にし、ニューロンからの軸索の増殖を
促進する神経芽細胞の有余分裂によってさらに、ニュー
ロンを生成することができる。ペプチドは軟組織あるい
は骨格筋組織の創傷治癒に記載した通り投与することが
できる。

局所適用に対して種々の医薬処方が、本発明の有効化合
物の投与に有用である。かかる処方は親水性ワセリンま
たはポリエチレングリコール軟膏のような軟膏、キサン
タンゴムのようなゴムを含有するペースト、アルコール
または水溶液のような溶液、水酸化アルミニウムまたは
アルギン酸ナトリウムゲルのようなゲル、ヒトまたは動
物アルブミンのようなアルブミン、ヒトまたは動物コラ
ーゲンのようなコラーゲン、アルキルセルロース、ヒド
ロキシアルキルセルロースおよびアルキルヒドロキシア
ルキルセルロース例えばメチルセルロース、ヒドロキシ
プロルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒド
ロキシプロピルメチルセルロースおよびヒドロキシプロ
ピルセルロースのようなセルロース、プルロニックＦ−
１２７で例示されるプルロニック（商標名）ポリオール
のようなボロキサマー、テトロニック１５０８のような
テトロニックおよびアルギン酸ナトリウムのようなアル
ギン酸塩を包含するが、これに限定されない。医薬処方
は突然変異ａ　ＦＧＦ化合物の１種以上を約０．１〜１
００μｇ／ｍｌの量で包含する。

非局所適用に対して突然変異体は標串医薬的実施により
リン酸塩緩衝液食塩水、リン酸塩緩衝食塩水リンゲル液
などの医薬的に許容し得る担体または賦形剤と併用して
医薬組成物で投与される。

突然変異ａ　ＦＧＦが繊維芽細胞、血管および角膜内皮
細胞などを包含する種々の細胞型の分裂を刺激する能力
はこれらのペプチドを医薬剤として有用にする。これら
の化合物は新規な突然変異Ｔ−ＦＧＦを治療を必要とし
ている患者に投与することによってヒトを含む哺乳類の
傷を治療するために使用することができる。

次の実施例は本発明を具体的に説明するものであるが、
それらに限定されるものではない。

オリゴヌクレオチドはマツチウシおよびカルザース、ジ
ェー、アム、ケム、ツク、第１０３巻、３１８５〜３１
９１頁（１９８１年）、ビューケージおよびカルザース
、テ１−ラベドロンレターズ第２２巻、１８５９〜１８
６２頁（１９８１年）に記載される手法に従って合成さ
れた。合成オリゴヌクレオチドの塩基配列は第７．９お
よび１１表に示される。

実施例１で得たウシオリゴヌクレオチドを２つの別のユ
ニット、Ｎ末端ハーフ（２３１ｂｐ）およびＣ末端ハー
フ（２０９ｂｐ）として構成した。次に２つのハーフを
無傷合成遺伝子として組み合わせた、第６表参照。最初
にオリゴヌクレオチドを次の反応混合液中でキナーゼ化
した。７０１ｎＰＩトリスｐＨ７，６，５ｍＭ　ＤＴＴ
、　　１０ｍＭ　Ｍｇｃ、ｚ　、３３ｐＭＡＴＰ、１μ
ｌ当り０．３ユニツトＴ４ポリヌクレオチドキナーゼお
よび１μｒ当り２．５ｐモルオリゴヌクレオチド。混合
液を３７℃で１．５時間温置し次に０．２ユニツト／μ
ｌキナーゼおよびＡＴＰを混合液に追加した後さらに１
時間温置して濃度１００ｍＭを得た。放射性標識に対し
て開始混合液は［γ−”Ｐ］　−ＡＴＰ　３７　ｎＣｉ
／、ｃｒ　ｅを含有した。

アニーリングおよび連結反応は２つの別の反応で行なっ
た。各々の反応において８種のオリゴペプチドの各々を
添加した。１番目の反応ではＣ末端またはＮ末端ハーフ
遺伝子の１本鎖を作製するオリゴペプチドを最も多い５
°オリゴヌクレオチドを除いてキナーゼ化した。２番目
の反応では対立する連鎖を作製するオリゴヌクレオチド
を再び最も多い５°オリゴヌクレオチドを除いてキナー
ゼ化した。従って各反応では３種のオリゴヌクレオチド
をキナーゼ化し５種はしなかった。キナーゼ化オリゴヌ
クレオチドを使用する場合、３Ｚｐ標識オリゴヌクレオ
チドｔｐモルはまた後者の生成物の同定のために添加し
た。各反応は７０ｍＭトリスｐＨ７，６，５ｍＭ　ＤＴ
Ｔ、　　ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣｊ２　ｚおよび３０μＭＡ
ＴＰと共に２００μｌを含有した。オリゴヌクレオチド
を９０℃に４分間加熱した後直ちに反応物を６０℃に移
し、３０“Ｃに徐々に冷却させておくことによってアニ
ーリングした。連結反応は６０ｍＭトリスρ１１７．６
、ｌ　ＯｍＦＩ　ＤＴＴ、　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ！　ｚ
、１ｍＭ　　＾ＴＰおよびｌｐｅ当り　０，０３ユニツ
トＴ４ＯＮ八リガーゼを含む４００μβ中２０℃で１．
５時間温置することによって行なった。

連結オリゴヌクレオチドを精製するためにポリアクリル
アミドゲル電気泳動を使用した。連結オリゴヌクレオチ
ドをエタノールで沈降させ、８０％ホルムアミド、５０
ｍＭ　ＴＲＴＳ　−ホウ酸塩ｐｕａ、３．１　ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ　、０．１％（Ｗ／Ｖ）キシＬ／７：＞７／−ル
および０．１％（Ｗ／Ｖ）ブロモフェノールブルーの２
０μｌに再溶解した。各試料を９０℃で３分間加熱し１
０％尿素−ポリアクリル７ミドゲル中７５ワットで５時
間電気泳動にかけた。オリゴヌクレオチドハンドはゲル
をＸ線フィルムにさらすことによって可視された。

Ｎ末端に対する各反応の２３１ベースバンドをゲルから
削除し、混合し、０．５Ｍ酢酸アンモニウム、１１１１
Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐｔｌ　８の１　ｍ４７９４℃で溶離し
た。

溶＾１１シたＤＮＡをエタノールで沈降させ、７０ｍＭ
トリスｐＨ７，６，５ｍＭＤＴＴおよび１０ｍＭ　Ｍｇ
ｃ、ｚの３０μｌに再溶解した。Ｃ末端の２０９ベース
バンドを同様の方法で溶離した。

ゲル精製オリゴヌクレオチドを形質転換前に９０°Ｃに
４分間加熱し、２０℃に徐々に冷却することによってア
ニーリングした。最初の出発オリゴヌクレオチドから５
％回収されるとして回収アニーリング２３１ｂｐオリゴ
ヌクレオチド３００「モルおよび１００ｆモルを各々２
５ｍＭトリスｐｌ＋７．８．１ｍＭ　ＤＴＴ、　　ｌ　
ＯｍＭ　Ｍｇｃ、ｚ　、０．４ｍＭ　ＡＴＰの２０＋＋
１７！中で１ユニツトＴ４ＤＮＡ　リガーゼと共にアガ
ロースゲル精製３．９　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｂａｍｌｌ
Ｉ　ｐＢＲ３２２断片ＯＮＡ１００ｍＪに２０℃１時間
連結した。アニーリングした２０９ｂｐオリゴヌクレオ
チドをアガロース精製３．９　ｋｂ　Ｂａｎ＋１ＩＩ−
Ｓａ　ｌ　Ｉ　ｐＢＲ３２２断片ＤＮＡに２３１ベ一ス
ベア断片と同じ条件下で連結した。連結反応は１　：　
５　ＩＩ□０に希釈し、希釈液ｌμｌを供給者によって
記載される通り大腸菌ＲＲＩ　コンピテント細胞（ＢＲ
Ｌ　＞　　２０μ！を形質転換するために使用した。形
質転換体はアンピシリンの増殖に対して選択され、ミニ
溶解質プラスミド標本の限定解析によって２３１　ｂｐ
　ＥｃｏＲＩＢａｍｆ（Ｉまたは２０９　ｂｐ　Ｂａｌ
ｌ１ｌｌｌ　−５ａ　１　ｒインサートの存在を選別し
た。

適当なサイズのインサートを含むクローンのＤＮＡ配列
はマキサムおよびギルバート、ブロク。

ナトル、アカド、サイ、ＵＳＡ第７４巻、５６０〜５６
４頁（１９７７年）の化学ＤＮＡ配列を使用して決定し
た。２３１ｂｐクローンのいずれも正確な配列を有しな
いため、正確な配列を含むクローンを次の通り調製した
。Ｋｐｎ　ＩとＢａｍ）１１部位の間の正確な配列を有
する１個のクローンをＫｐｎｌでおよびｐＢＲ３２２ベ
クター中で切断する５ａ１１で切断した。４００ｂｐバ
ンドをゲル精製し、ａ　ＦＧＦ遺伝子インサートのＥｃ
ｏ９１部位からにｐｎＩ部位まで正確な配列を含む２番
目のクローンの３．８　ｋｂ　　Ｋｐｎｌ　−５ａｌｌ
バンドに連結した。形質転換後生成したクローンを得ら
れている所望の配列を確保するために配列した。

正確な２ｏ９ｂｐ配列を含むクローンが得られたため、
これらのクローンの操作はさらに必要としなかった。最
終全長ａ　ＦＧＦ合成遺伝子を８ａｍｌｌｌおよびＳａ
　ＲＩでＮ末端ハーフクローンを切断し、アルカリ性ホ
スファターゼで処理し、これをＣ末端ハーフクローンの
ゲル精製２０９　ｂｐ　ＢａｍＨＩ　−３ａ　１■イン
サートに連結した。この連結物質を前のようにＲＲＩコ
ンピテント細胞を形質転換するために使用した。

ウシａ　ＦＧＦ遺伝子の変異誘発を促進するために、実
施例２で得た合成遺伝子をＭ１３ｍｐ１９−重鎮ＤＮＡ
バクテリオファージベクターに導入した。シラーおよび
スミス、メソッズインエンザイモロジー第１００巻、４
６８〜５００頁（１９８３年）、ノリス等、ヌクレイッ
クアシフズリサーチ第１１巻、５１０３〜５１１２頁（
１９８３年）およびシラーおよびスミス、ＤＮＡ　、第
３巻、４７９〜４８８頁（１９μｌ４年）に報告される
通り変異誘発標準操作を使用した。ウシｐＫＫ　−ａ　
ＦＧＦプラスミドをＥｃｏＲＩ−Ｓａ　ｌ　Ｉで切断し
、得られた４４０　ｂｐ断片を実施例２のようにアガロ
ースゲル精製した。

ベクターＭ　１３ｍｐｌ　９ＲＦ　ＤＮＡ　（ＢＲＬ　
）を２つの同じエンドヌクレアーゼで切断し、末端を順
次細菌アルカリ性ホスファターゼ１００ユニツトを有す
る１０ｍＭ）リスｐＨ８，０１００ｐ　Ｒ中で脱リン酸
化した。連結反応を処理ベクターＤＮＡ５０ｎｇとａ　
ＦＧＦ遺伝子断片ＤＮＡ　　１２ｎｇを使用してＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ２ユニットを有する２５ｎ＋ＭトリスｐＨ
７，８，１０ｍＭ　　ＭｇＣｊ！ｚ　　、　　１１１１
Ｍ　　ＤＴＴ、　　０．４ｍＭ　　ＡＴＰの１０μ　２
９４℃で１６時間行なった。反応混合液を１：５Ｈ２０
に希釈し、希釈液１μβを供給者によって記載される通
り大腸菌Ｄ　Ｈ５コンピテント細胞（Ｂｌ？Ｌ）２０μ
ｌを形質転換するために使用した。細胞を０．０３％Ｘ
−ｇａ１および０．３　ｍＭ　ＩＰＴＧ中大腸菌ＪＭ１
０５（ファーマシア）宿主細胞を平板にし３７℃で部首
した後、無色のプラークを分離した。ウシａ　ＦＧＦ遺
伝子を含む１つのファージクローン、Ｍ　Ｉ　３ｍｐｌ
　９−　ｂ　ａＦＧＦを選択した。

ヒト配列を特定するために８種のオリゴヌクレオチドが
指定され合成した。第９表参照。オリゴマー８はさらに
突然変異を含みウシ遺伝子の３８６部位におけるチミン
はヒト遺伝子のシトシンに置き換えられる。この突然変
異は、ヒトａ　ＦＧＦアミノ酸配列配列化させずに限定
部位を組込ませることができる。

ヒトオリゴマー１．２．３．４．６および８をリン酸化
し、各々１５ｐモルを２０１１１ＭトリスｐＨ７，５，
１０ｍＭ　Ｍｇ（Ｊｚ　、５０ｍＭ　Ｎａｃ、，１１μ
ｌＭ　ＤＴＴの１０μｉ中で６５℃で１０分間、次に２
３°Ｃで１０分間Ｍ　１３ｍｐｌ　９−　ｂ　ａＦＧＰ
−重鎖ファージＤＮＡ０．５ｐモルに個々にアニーリン
グした。次に閉環二重鎖分子を２０１１ＩＭトリスｐＨ
７，５，１０ｍＭＭｇｃ、ｚ　　、２５ｍＭ　Ｍａｃｌ
、５．５　ｍＭ　ＯＴＴ、　　０．５　ｍＭ八へＰ　　
、　０．２　５ｍＭｄＡＴＰ　　、　　０．２　５ｍＭ
ｄＣＴＰ　　、、　０．２　５ｍＭｄＧＴＰ　、　０．
２５ｍＭｃｊＴＴＰの２０ｔｔｌ中でＴ　４　ＤＮＡリ
ガーゼ１ユニントおよびＤＮＡポリメラーゼエクレノウ
フラグメン１−２ユニツトを使用して１５℃で１７時間
温部首ることによって調製した。標本を各々ＪＭ１０５
コンピテント細胞を形質転換するために使用し、得られ
た形質転換体プラークを３２ｐ〜＾ＴＰおよびポリヌク
レオチドキナーゼを使用して放射性標識した適当なオリ
ゴマーを用いてハイブリッド形成によって選択した。ハ
イブリッド形成の条件は、１個の塩基変化を含むハイブ
リッド形成を防止するために各プローブに対して最適に
した。−重鎮ＤＮＡをヒトオリゴマー４突然変異を含む
ファージクローンから分離し、ヒトオリゴマー５を使用
して上記操作を操り返してオリゴマー４および５突然変
異を含むクローンを生成した。

次の操作ではこれらのＭ１３ベースクローン中のウシか
らヒトへの配列突然変異を１つのｐＨＲ３２２ベースク
ローンに組み合わせた。ＲＦ　ＤＮＡはヒトオリゴマー
および１２．６および８によって列挙される。塩基変化
を含むクローンから調製された。ヒト１突然変異体クロ
ーンのＤＮＡをＥｃ。

ＲＩで切断し、末端を細菌アルカリ性ホスファターゼで
脱リン酸化し、ＤＮＡを旧ｎｄＩＩＩで切断した。ヒト
２突然変異体ＤＮＡをｌｌ１ｎｄＩＩＩで切断し、ホス
ファターゼで処理した後、Ｂａｎ＋ｌｌＩで切断した。

ヒドロ突然変異体ＤＮＡをＢａｎ＋ＨＩで切断し、ホス
ファターゼ処理した後　Ａｐａｌで切断した。同様にヒ
ト８突然変異体をＡｐａ　　Ｉで切断し、末端を脱リン
酸化しＤＮＡをＳａｌ！Ｔで切断した。これらの４つの
ＤＮＡ標本を２％アガロースにより電気泳動にかけ各ヒ
ト１．２．６および８突然変異を含む突然変異体ＤＮ＾
からの４５ｂｐ、１９０ｂｐ、　１３５ｂｐ、および７
０ｂρの断片をゲルから溶離した。各断片約６０ｆモル
をＴ　４　ＤＮＡリガーゼ１．５ユニツトを有する２５
１トリスｐＨ７，８，１０ｍＭ　ＭｇＣＮｚ　、１ｍＭ
　ＤＴＴ。

０．４ｍＭ＾ＴＰの５μｌ中１２°Ｃで１６時間ｐｉｌ
ｌ　３２２からのゲル精製３．７　ｋｂＥｃｏＲＩ−５
ａ　ｌ　Ｉ断片約６０ｆモルに集合的に連結した。反応
混合液を１：５１１□０に希釈し、希釈液ｌμｌを供給
者によって記載される通り大腸菌ＤＨ５コンピテント細
胞（ＢＩｌＬ）２０ｐｌを形質転換するために使用した
。全部で４つの突然変異体オリゴマーによって列挙され
た突然変異を含むクローンを各々のオリゴマーがら製造
された放射線標識プローブを用いるハイブリッド形成に
よって選択した。ヒト３突然変異体Ｍ１３クローンの切
＠ＲＦ　ＤＮＡから分離された１４０ｂｐ　Ｋｐｎ　Ｉ
　−Ｂａｍ１ｌ　Ｉ　ＤＮＡ断片をこのヒト１−２−６
８突然変異体ＤＮＡのエンドヌクレアーゼ切断生成物に
連結してＤＨ５コンピテント細胞に形質転換してヒ）１
−２−３−６−８突然変異を有するクローンを生成した
。この後者のクローンのＢａ１ｌｌＩＩＩ−Ｐｃｔｌ消
化断片をヒト４−５Ｍ１３−ベースクローンからのＲＦ
　ＤＮＡのＢａｍｆｌｌ−Ｐｃｔｌ消化断片に連結し、
連結混合物はＤＨ５コンピテント細胞を形質転換するた
めに使用した。ヒ）１−２−３−４５−６−８突然変異
を含むクローンをオリゴマーハイブリッド形成により選
択し、このＩＩＩえブラスミドのａ　ＦＧＦ遺伝子Ｅｃ
ｏＲｒ−Ｓａ　／！　Ｅ　ＯＮＡ　Ｕｒ片をＭｌ　３ｍ
ｐｌ　８　（ＢＲＬ　）のホスファターゼ処理Ｅｃｏ　
ＲｒＳａｆｆｌ　−切断ＲＦ　ＤＮＡに連結した。コン
ピテントＤＨ５細胞をこの連結ＤＮＡで形質転換し、形
質転換した細胞をＪＭ１０５宿主細胞に平板にした。

このクローンの一重を貫ファージＤＮＡをヒト７オリゴ
マーとアニーリングし、所望の突然変異全てを含むＭ１
３クローンを上述した操作により得た。

Ｒ１’　ＤＮＡをこのクローンから調製し、ＥｃｏＲＩ
および５ａｌＩで切断した。得られた４４０ｂｐバンド
をゲル精製し、ｐＫＫ　２．７　ｔａｃプロモーター発
現ベクターの２．７　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｓａ　ｌ　Ｉ
　ＤＮＡ断片に連結した。

このＤＮＡをコンピテントＤＨ５！ｌｌ胞を形質転換す
るために使用してａ　ＦＧＦのヒト形態の生成ＣＪ使用
されるヒトｐＫＫ　−ａ　ＰＧＦ発現クローンを生成し
た。

実施例３で得たヒ）　ａ　ＦＧＦ−重鎮ハクテリオファ
ージ組換えクローン、Ｍ　１３ｍｐｌ　８−　ｈ　ａｐ
ＧＦをソ゛ラーおよびスミス、メソンズインエンザイモ
ａジー第１００巻、４６８〜５００頁（１９８３年）、
ノリス等、ヌクレイソファシソズリサーチ、第１１巻、
５１０３〜５１１２頁（１９８３年）およびシラーおよ
びスミス、ＤＮＡ、第３巻、４７９〜４８８頁（１９８
４年）に報告される操作を使用して突然変異を誘発させ
た。３種のオリゴヌクレオチドを１６．８３＃よび１１
７位のヒトａＦＧＦ遺伝子のシスティンコドンの各々の
代わりにセリンコドンを列挙するために示した。合成さ
れたオリゴマーは第１１表に示され突然変異塩基は下線
が引かれている。

オリゴマーをリン酸化し、各々の１５ｐモルを２０ｍＭ
）リスｐｌ＋７．５．１０ｍＭ　Ｍｇ０Ｌ２．　５０ｍ
ＭＮａＣＩ！および１　ｍＭ　ＤＴＴのＬｏｐ（！中６
５℃でｉ。

分間次に２３°Ｃで１０分間Ｍ　ｌ　３　ｍｐ　１　Ｂ
　−ｈａＦＧＦ−重鎮ＤＮＡ　３３０ｎｇに個々にアニ
ーリングした。

ＤＮＡの２番目の連鎖をＴ４ＯＮＡ　リガーゼ３屯位お
よびＤＮＡポリメラーゼエクレノウフラグメント０．４
単位を用いて２０ｍＭ）リスｐｌ＋７．５、ｌｏｍＭＭ
ｇＣＪｚ　、２５ｍＭ　ＮａＣ＃、５．５　ｍＭ　ＤＴ
Ｔ、　０．５　ｍＭＡＴＰ、　　０．２５ｍＭ　ｄ　Ａ
ＴＰ、　　０．２５　　ｄ　ＣＴＰ、　　０．２５ｍＭ
ｄ　ＧＴＩ’、０．２５ｍＭ　ｄ　ＴＴＰの２０ｔｔｌ
中でプライマーとしてアニーリングオリゴマーを使用し
て１２°Ｃで１７時間温４することによって合成した。

３種の標本を各々ｌ　：　５１ｈＯに希釈し、希釈液ｌ
μｌを供給者によって　記載される通り大腸菌ＤＨ５コ
ンピテント細胞（ヘテスダリサーチラボラトリー）２０
μ２アリコートを形質転換するために使用した。形質転
換された細胞をＭ１３ウィルスに対して宿主細胞として
作用する大ｒｉｒｉ１菌ＪＭＩ０５細胞のローンで平板
にした。得られた形質転換体プラークを”ｐＡＴＰおよ
びポリヌクレオチドキナーゼを使用して放射性標識した
適当なオリゴマーとハイブリッド形成して選択した。ハ
イブリッド形成の条件は各々のブコープに対して１個の
塩基変化を含有するハイブリッドの保持を防止するよう
に最適にした。

サンガー等、ブロク、ナトル、アヵド、サイ。

ＬＩＳＡ第７４巻、５４６３〜５４６７頁（１９７７年
）のジデオキシヌクレオチド鎮終結方法を使用するＤＮ
Ａ配列解析のためにシスティンからセリンまでの突然変
異の各々を含むファージクローンからニ重鎖ＤＮＡを分
離した。次にＲＦ　ＤＮＡを各々が列挙された突然変異
の１つを含む３個のクローンから調製し、ＥｃｏＲＩお
よびＳａβＩで切断した後、放出されたＦＧＦ遺伝子イ
ンサートをアガロースゲル電気泳動によって分離した。

精製４４０ｂｐインサートをＴ４ＤＮ八リガーゼ３単位
を有する２５ＩＩＩＭトリスｐｌ（？、８、ｔ　ＯｍＭ
　ＦｌｇＣｌ　ｔ　、１　ｍＭ　ＤＴＴｏ、　４ｍＭ　
ＡＴＰの１０ｐｌ中でｐＫＫ　２．７　ｔａｃプロモー
ター発現ベクターの２．７　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−Ｓａ
　１２１　ＤＮＡ１升片に１４℃で２時間各々連結した
。連結したＤＮＡをＤ　＋（５コンピテント細胞を形質
転換するために使用し、突然変異Ｃｙｓコドンを有する
ＤＮＡを含むクローンをハイブリッド形成によって適当
にオリゴマーに選択した。これらのクローンのプラスミ
ドＤＮＡ中のＦＧＦ遺伝子インサートをマキサムおよび
ギルバート、メソッズインエンザイモロジー第６５巻、
４９９〜５６０頁（１，９８０年）の化学的方法によっ
て完全に配列させた。１つのクローンは、８３位のシス
ティンコドンの代わりにセリンコドンを生じる元のヒト
ａ　ＦＧＦ発現クローンから１個の塩基変化だけを含有
し、ｐＫＫ　−ｈ　ａ　ＰＧＦ　（Ｓｅｒ８３）として
指定する。

また他の２つのシスティンからセリンへの突然変異の各
々を含むクローンはさらに列挙されない変化を含有した
。所望の１個の塩基突然変異体を生成するために次の連
結反応および形質転換を行なった。１６位にセリンコド
ンを有するクローンの４１０ｂｐＨｊｎｄＩＩＩ誘発Ｄ
ＮＡ断片を分離し、元のｐＫＫ　−ｈ　ａ　ＦＧＦ発現
クローンの２．７　ｋｂＨｉｎｄ　ＩＩＩ誘導断片に連
結した。１１７位にセリンコドンを含むクローンの２３
０ｂｐ　Ｎｃｏ　ｌ−５ａ１１誘１ＤＮＡを分離し、ｐ
Ｋに−ｈａＦＧＦの２．９ｋｂ　Ｎｃｏ　ｌ−５ａｌＩ
誘導断片に連結した。これらの連結試料の各々をＤＩＩ
　５コンピテント細胞を形質転換するために使用し、ハ
イブリッド形成および配列技術をｐＫに−ｈａ　ＦＧＦ
　（Ｓｅｒ　ｌ　６　）およびｐＫＫ　−ｈ　ａ　ＦＧ
Ｐ　（Ｓｅｒｆ１７）に指定される他の２つの所望の１
個の塩基突然変異体を％Ｉ　ＬＮするために使用した。

これらの３種のクローンをヒトａ　ＦＧＦのＳｅｒ　１
６．５ｅｒ８３および５ｅｒｌ１７形態の生成に使用し
た。

セリン（Ｓｅｒ）残基に転換される２または３個のシス
ティン（Ｃｙｓ　）を有するヒトａ　ＦＧＦの位置指向
突然変異体を非突然変異野性型の限定断片を組み合わせ
ることによって組み立て５ｅｒ（１６）、５ｅｒ（８３
）およびＳｅｔ　（１１７）突然変異体合成遺伝子は上
述した通りρＫＫ２．７にクローンされ、Ｍ１３ｍｐ１
８にサブクローンされている。ｐＫＫ　〜ｈ　ａ　ＦＧ
Ｆ　（Ｓｅｒ　ｌ　６．８３）およびｐＫＫ　−ｈ　ａ
　ＦＧＦ（Ｓｅｒｆ６．１１７）組換え体はまず５ｅｒ
ｌＧにコドンを包含するＭ　ｌ　３ｗｐ１　Ｂ（Ｓｅｒ
ｆ　６）の０６２３ｋｂ　ＵｃｏＲＩ−Ｂａｍｌｌｌ断
片をｐＫＫ　２゜７に導入し、次にＭｌ　３ｍｐ１　Ｂ
（Ｓｅｒ８３）あるいはＭ　１３ｍｐ　１　Ｂ　（Ｓｅ
ｒ１１７）からの０．２　ｋｂ　Ｉｌａｍｌｌｒ−Ｓａ
　Ｉ　Ｔ断片を挿入することによって組み立てた。ｐＫ
Ｋ２．７ベクターが２つのＢａｍ１ｌ　１部位、多数ク
ローニング配列のもの、およびＬａｃプロモーターの上
流で２番目のものを含有するため、Ｂａｍ１ｌ　１部位
の上流で２番目が除去された修飾ｐＫＫ２．１ベクター
をこれらの構成に使用した。対応する制限酵素で消化し
順次Ａ３１８９９コンピテント細胞（大腸菌ジェネテイ
ンクストックセンター）を連結反応および形質転換した
後アンピシリン耐性クローンを選択し、組換え体（３，
１ｋｂ）に予期された分子量を有するプラスミドを含む
ものを選別した。

突然変異体ｈ　ａ　ＦＧＰ　（Ｓｅｒ　１６．８３．１
１７）はｐＫＫ　−ｈ　ａ　ＦＧＦ　（Ｓｅｒ　１６．
８３）の０．１３ｋｂＳｐｈ　ｊ！　−Ｓａ　１１断片
を１１７位のＣｙｓの代わりにＳｅｔをコードしている
ｐＫＫ　（Ｓｅｒ　１１７　）の対応する断片に置き換
えることによって組み立てた。

ｐＫＫ　（Ｓｅｒ　１６．１８）の３ｋｂ　５ｐｈｌ−
５ａ７！ＩＵＴ片を分取用アガロースゲル電気泳動、電
気溶ｉ！ｉｌｆによって精製し、同様の方法で５％ポリ
アクリルアミドゲルから精製したｐＫＫ　（Ｓｅｒ　ｌ
　ｌ　？　）の０．１３ｋｂＳｐｈｌｌ　−３ａｌ　Ｉ
断片に連結した。精製した断片を連結し、Ａ３１８９９
細胞の形質転換後、アンピシリン耐性に対して組換え体
を選択した。

ｐＫＫ　−ｈ　ａＦＧＦ　（Ｓｅｒ８３．１１７）の組
み立てにはｐｌＫ　ｈ　ａＦＧＦの０．３　ｋｂ　Ｐｓ
ｔ　１断片を基本的に同様の方法を使用して８３および
１１７位の代わりにＳｅｒのコドンを包含するｐＫＫ　
−ｈ　ａ　ＦＧＰ　（Ｓｅｒｆ６．８３．１１７）の同
様の断片に置き換えた。

アンピシリン耐性に対して選択されたＡ　８１８９９を
ｒ’５ｔｌ−５ａｌ　ｌ消化により解析して連結断片の
配向を決定した。すべての突然変異体遺伝子をＵＳＢ社
の配列装置を使用するジデオキシによって配列した。

実施例４で得た無傷ａ　ＦＧＦ遺伝了・を修飾ｐＫＸ２
２３−３プラスミＦに組込んだ、ｐＫＫ２２３３プラス
ミド（ファーマシア）はＬｒｐプロモーターとｐ、ａｃ
プロモーターの領域間のハイブリッドであるｔａｃプロ
モーターを含有する、デボア等、ブロク、ナトル、アカ
ド、サイ、ＵＳＡｍ８（１゜２１〜２５頁（１９８３年
）。またこのプラスミドはｒｒｎＢ　ｒＲＮＡ転写終結
因子を含み、強力な終結因子配列は強力なプロモーター
から発現させることが見い出されている、ゲンツ等、ブ
ロク、ナトル、アカド、サイ、ＵＳＡ第７８巻、４９３
６〜４９４０頁（１９８１年）ブロシウス、ジエン第２
７巻、１６１〜１７２頁（１９８４年）。ρＫＫ２２３
−３プラスミドを修飾してｐＢＲ３２２誘導Ｓａｊ！ｒ
制限酵素部位を除去した。これは、ｐＫＫ２２３−３プ
ラスミドＤＮＡをＮｄｅ　ＩおよびＮａｖ　１で切断し
、ＤＮＡ断片をフレノウＤＮへポリメラーゼでプラント
末端とし、２．７　ｋｂＤＮＡ断片を再循環してクロー
ンｐＫＫ２．７を生成することによって達成した。次に
合成ａ　ＦＧＦ遺伝子をそのｐ［ｌＲ３２２ベクターか
ら切断し、この発現ベクターをＥｃｏＲ［およびＳａ７
！ｌで限定した後ｐＫＫ２．７に取込んだ。この構成物
は、シャインーダルガルノリポゾーム結合部位の下流に
合成遺伝子１１塩基の開始メチオニンが位置する。第１
図に例示される得られた組換えベクターを大腸菌ＪＭ１
０５綱胞にさらに大腸菌ＤＨ５細胞に形質転換した。

発現クローンを０．４％グルコースおよび５０μｇ／ｍ
／アンピシリンを含有するＬＢブイヨン（１％トリプト
ン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎａｃ、）中３７℃
で増殖させた。５５０ｎｍにおける光学密度が０．５に
達した時、ＩＰＴＧを添加して１ｍＭを得、３７℃で３
時間増殖を続けた。１０．０００　ｘｇで２０分間遠心
分離によって細胞を回収し、培養液ＩＡからの細胞を１
：１のグリセロール／リン酸塩緩衝食塩水に再懸濁させ
、ドライアイス／エタノール浴中で速かに凍結させ、−
７０℃で一晩貯蔵した。

実施例４のａ　ＰＧＦの突然変異形態に対して発現が高
められたレベルは配列をコードしているａ　ＦＧＰの上
流にシストロンをさらに導入するために実施例３の表現
ベクターを修飾することによって生じた。２種のオリゴ
ヌクレオチドを４９頁に示される通りの配列で合成した
。アニーリングの場合これらのオリゴマーは、ＥｃｏＲ
Ｉ切断で生じた延長部に補充する４塩基の５延長部を供
給し、７コドン読み取り枠はＡＴＧ翻訳開始コドンに続
き、ＴＡＡ終止コドンを先にし、さらにシャインーダル
ガルノリボゾーム結合部位は、終止コドンの上流で読み
取枠内に位置する。各オリゴマ−１ｐモルを使用して、
オリゴマーをＤＮＡ　リガーゼ緩衝液２０μρ中で７０
℃に１０分間加熱し、徐々に冷却することによって一諸
にアニーリングした。アニーリングした混合液０．３ｐ
モルをＴ　４　ＤＮＡ　リガーゼ３単位を含む最終審１
ｊ１２５ｕｌのＥｃｏＲＩ切断ｐＫＫ　−ｈａＦＧＦプ
ラスミドＤＮ八〇、１へモルに１４℃で２．５時間連結
した。連結したＤＮＡ　５ｐｇを使用してコンピテント
大腸菌ＪＭＩ　Ｏ５細胞を形質転換した。形質転換体は
ＥｃｏＲ１部位がこの挿入によって失われる場合、限定
解析によってさらにイムノプロット解析によって選別し
た。高レベルのＦＧＦ生成を示す１つのクローン発現ベ
クターは上記マキサムおよびギルバートの化学的手法に
よって配列されて新しいシストロン配列の正確な挿入を
６１！　認した。

次にこの高発現ｐＫＫ　２　ｃ　−ｈ　ａＦＧＦベクタ
ーを形質転換操作によって大腸菌Ｄ　Ｈ５に導入した。

ｈ　ａＦＧＦ　（Ｓｅｒｌ　１７）突然変異体を例えば
この高発現ベクターで発現させるためにｐＫＫ　−ｈ　
ａ　ＦＧＦ（Ｓｅｒｌ１７）の０．２３ｋｂ　Ｎｃｏｌ
−５ａｌｌ断片をｐＫに２Ｃ−ｈａＦＧＰの２．５ｋｂ
　Ｎｃｏｌ−５ａｌＴ断片に連結しコンピテント細胞に
形質転換した。他の突然変異ｈａＦＧＦをｐＫＫ　２　
ｃ　−ｈ　ａＦＧＦの野生型配列を含む適当な制限断片
を突然変異ｈａＦＧＦのすｎ似の制限断片に置き換える
同様の方法で２つのシトロン高発現ベクターに導入した
。

実施例５で得た凍結細胞を解凍し、１００ｍＭリン酸塩
緩衝液、ｐＨ７，２、ＥＤＴＡ　５ｐｇ／＠７で５０−
を生成する十分量に再懸濁し、細胞を２８．ＯＯＯｘｇ
で５分間遠心分離によって集めた。細胞を２回洗浄し、
遠心分離で集め、同一緩衝液５０ｍ／に再懸濁した。６
６０ｎｍにおける３種の突然変異体株懸濁液の消衰はｐ
ＫＫ　−ｈ　ａＦＧＦ　（Ｓｅｒｌ　ｌ　７）株、１０
３、ｐＫＫ　−ｈａＦＧＦ　（Ｓｅｒｌ　６）株、１０
８、ｐＫＫ　−ｈ　ａＦＧＦ　（Ｓｅｒ８３）株５９で
あった。各試料にリゾチーム０．１■／ｍｆを与え、３
０℃で緩かに振盪しながら１５分間温４した。細胞を遠
心分離で集め、２００ｍＭリン酸塩、ｐＨ６，０，３ｍ
ＭＥＤＴＡ、０．０５ｍＭ、ＴＰＣに、０．０５ｍＭペ
プスクチンＡ、　０．０５ｍＦロイペプチンおよび１５
μｇ７ｍｌＢＰＴｌからなる破壊緩衝液５０ｒｎｌに再
懸濁した。各細胞の懸濁液を４℃に維持し、予め冷却し
たフレンチフレラシャ−セルに２０，０００　ｐｓｉ、
４℃で２回通過させて破壊した。破壊した細胞懸濁液を
５Ｓ−３４ソーパルローターに１５，０００　ｒｐｍで
１５分間さらにベックマン超遠心分離機の７０Ｔｉロー
ターに４５，０００　ｒｐｌｌｌで６０分間４℃におい
て遠心分離した。上澄み液を集め、５５ｍ／容量に対す
る２８０ｒｍにおける消衰はｐＸＸ　−ｈ　ａＦＧＦ　
（Ｓｅｒｌ１７）、４−４、ｐＫＫ　−ｈ　ａＦＧＦ　
（Ｓｅｒｌ　６）　、４０およびｐＫＫ　−ｈ　ａ　Ｆ
ＧＦ　（Ｓｅｒ８３）、２３を決定し、その試料を一７
０℃で凍結した。

ＣＭ−セファデックスを含有する１００ｍＭリン酸塩緩
衝液ｐｌ＋６．０　２００ｍ７をタンパク質１ｇ当り沈
降樹脂６．５　ｍＺの比率で（タンパク質溶液ｌｏｗ／
ｒ０１の１ｃｍを通過させた吸光度が１．０と仮定して
）添加することによって溶解した。試料を閃光ガラス漏
斗に集め、１５０ｍＭ　Ｎａｃ、を含む１００ｍＭリン
酸塩緩衝液２００−でｐＨ６，０において３回洗浄した
。樹脂ケークを同一緩衝液２００ｍ７に再懸濁させ、断
面ＡｒＧΔｌｃｎ！当り、１２ｍｆＸｈｒ−’のカラム
に充填し、６００ｍＭ　　Ｎａｃ、を含む１５０ｍＭリ
ン酸塩緩衝液で同じ流速で洗浄した。６００ｍＭ　Ｎａ
ｃ、援衝液で溶離したタンパク質を含有する両分をプー
ルし、ｐＨ７，２に調節し、伝導率を脱イオン水で１０
μ５ｘＣｒＶ’に調節した。次に１０ｍＭリン酸塩ｐｌ
＋　７．２　テ平衡にしたヘパリン−セファロース（新
しく調製した）（伝導率１．３μ３Ｘｃｍ−’）をタン
パク質１■当り、沈降樹脂１ｒｎ１の比率で添加（上記
と同様に仮定した消衰係数を使用する）し、懸濁液を４
℃で１時間緩かに振盪し、樹脂を漏斗に集め、同一緩衝
液で再懸濁し、１時間当り１〜２カラム容量でカラムに
充填した。充填カラムを１１０１１Ｉリン酸塩、０．８
Ｍ　　Ｎａ（ＪｐＨ７，２で同じ流速において２８０ｎ
ｍにおける溶出液の消衰が溶離緩衝液以上の光学吸光度
単位０．０１以内の安定値に低下するまで洗浄し、次に
緩衝液を１０ｍＭリン酸塩、１．５Ｍ　　Ｎａ（ＪｐＨ
７，２に変えた。１．５　Ｍ緩衝液で溶離したタンノタ
ク質を含む両分（２８０ｎｍにおける消衰によって監視
した）を−緒にプールし、１０ｍＭ　ＴＦＡで平衡にし
たｃ、逆相ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃカラムに装填し、０〜６７
％ＣＩｈＣＮでの勾配で３０分間溶離した。

突然変異株の精製データを以下に示す。

ｐＫＫ　−ｈ　ａＦＧＦ　（Ｓｅｒｆ　６）０．６ＭＮ
ａｃ、Ｉ衝液を用いた全ｆｆ１２４ｍ１のＣＭ−セファ
デックスカラムから画分２５〜３１を溶離し、タンパク
質含有Ｉｉ３．５ｍｇを脱イオン水で１２５１１１１に
しく最終伝導率７１１１Ｓ／（Ｊ）、ヘパリン−セファ
ロース４　ｍｌを添加した。カラムを６ｍ　７！／　ｈ
で運転した。１．５Ｍ　　ＮａＣｊ２で溶離した画分５
５〜５７をＣ，カラムに注入した。このカラムから主要
ピークを集め、タンパク質含有量８０μｇを有した。

ｐＫＫ　−ｈ　ａＦＧＰ　（Ｓｅｒ８３）０．６Ｍ　　
Ｎａｃ、１ｍ街液を用いた全量４０ｍ１ｌのＣＭ−セフ
ァデックスカラムから画分１９〜３３を溶離し、タンパ
ク譬含有５１４．０　Ｑｒを脱イオン水で１５０ｍｊ！
にしく最終伝導率１０ｍＳ／ｃｍ）　、ヘパリン−セフ
１０−ス４　ｍｌを添加した。カラムを６ｍｌ／ｈで運
転した。１．５　Ｍ　　Ｎａｃ、で溶離した画分４０〜
４４をＣ，カラムに注入した。このカラムから主要ピー
クを集め、タンパク質含有量は８０μｇであった。

ｐＫＫ　−ｈ　ａＦＧＦ　（Ｓｅｒｌ　Ｉ　７）０．６
Ｍ　　ＮａＣ７！４７衝液を用いた全量５７ｍｘのＣＭ
−セファデックスカラムから画分工９〜３３を溶離し、
タンパク賞金をＬｔｌｌ、４■を脱イオン水で２５０ｍ
１にしく最終伝導率１２ｍＳ／ｃｍ）　、ヘパリン−セ
ファロース１０ｍ１を添加した。カラムを１１ｎ＋７！
／ｈで運転した。１．５Ｍ　　！４ａｃ、で溶離した両
分５９〜６２を０３カラムに注入した。

このカラムから主要ピークを集め、タンパク質含有量は
６１４μｇであった。

多数突然変異体のタンパク質生成物を同様の操作で精製
した。ａ　ＦＧＦのすべての形態、組換え野生型および
突然変異体は、１本の１５ｋＤａバンドだけが還元およ
び５ＯＳ１５％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動によ
り検出闇値の１００倍以上の荷重で見られるため高度に
精製された。

実施例７で得た精製ｒ　−ａ　ＦＧＦの生物学的活性を
トーマス等、ジュー。パイオル、ケム、第２２５巻、５
５１７〜５５２０頁（１９８０年）で修飾した繊維芽細
胞マイトジェンアッセイを使用して評価した。ＢＡＬＢ
／　ｃ３Ｔ３Ａ３１繊維芽細胞（アメリカンタイプ力ル
チュアコレクション）を１０％加熱不活化仔ウシ血清を
含む培地で９６ウエルの培養皿にｌウェル当り３Ｘ１０
’細胞で平板にし、７％ＣＯＸ　（ｐＨ７、３５±０．
０５）中に４置した。

細胞は、培地を１．０％加熱不活化仔ウシ血清６に置き
換えさらに２４時間後に完全に休止した。平板にしだ後
５５時間でヘパリンで５μｇの存在下または不在下で試
験試料ｌＯμｌおよびデキサメクゾン０．１１μｇを添
加し、７０時間で各ウェルに［メチル−３Ｈ］　−チミ
ジン（２０Ｃｉ／ミリモル、ニューイングランドヌクレ
ア）０．２μＣｉおよび無標識チミジン０．３μｇを補
足し、９５時間で細胞をＤＮＡに組込まれた放射性標識
の定量に対して処理した。各々の服用量一応答点は４回
の定量の平均とした。Ｓｅｔ　−１１７突然変異体の結
果は次の表に示され、突然変異形態だけが野性型に等し
いかまたは高い活性を示している。

第−土ｌ−表 第一１３−表 服用用 （用り士／−）　　−ヘパリン ３．１６ｐｇ　　　　　　１４４９ １０．０　　ｐｇ　　　　　　１９１７３１−６　　ｐ
ｇ　　　　　　１５４７１００　　　　ｐｇ　　　　　
　２２６３３１６　　　　ｐｇ　　　　　　２６４７１
．００ｎｇ　　　　　　３９７５ ３．１６ｎｇ　　　　　　６４００ １０、Ｏｎｇ　　　　　１２６６５ ３１．６０ｇ　　　　　２１８４３ １００　　　　ｎｇ　　　　　４４７４４野生型　　　
　５ｅｔ−１１７ ＋へバール　　　　−ヘパリン ５４５ｉ６　　　　　２２８６９ 突然変異体 ＋ヘパリン ４本の滴定曲線は最大上昇の２で比較する。

ヘパリンネ在下のＷＴは他の３本のピークに見られるの
と同じピークの大きさが仮定されるピークに達せず、ｚ
最大値は推定した。

ＷＴ　　　　　　　　　　　　　　　　６６ｎｇ／ｍＺ
＋　　　　　　　　０．５６ｎｇ／ｒｎＩＳｅｒ−１１
７２，３ｎ　ｇ／ｍ！ 突然変異体　　＋　　　　　〇、２０ｎｇ／ａ／精製反
応物１．５１ｎｗ／ｍ１を含有する原液からすべての希
釈液を調製した。５ｅｒ−１１７突然変異体はヘパリン
の存在下で野生型と少なくとも同じ活性である。野生型
の活性は、突然変異体より約１０倍以上ヘパリンに依存
しており、その結果ＷＴａ　ＦＧＦのヘパリン依存の９
０％が５ｅｔ−１１７突然変異体では排除される。

生物学的活性を評価するために使用されたマイトジェン
活性は突然変異および野生型ａ　ＦＧＦが比較できるよ
うに修飾された。加熱不活化仔ウシを１％インシュリン
−セレン−トランスフェリン（ＩＴＳ　）　、Ｌ−ヒス
チジン０．４ｇ、ＩＭエタノールーアミン５０μ！、７
５％ＤＭＥＤＩ／当りリノール酸５．３５ｍｇを有する
ウシ血清アルブミン１．２５　ｇ、ペニシリン−ストレ
プトマイシンの両方を含む２５％ＩＩａｍ’Ｓ　Ｆ　１
２および上述したし一グルタミンに置き換えた。完全な
服用量一応答アソセイは上述した通りバンクグラウンド
からピークのＤＮ八へ成レベルまでの完全な上昇を進め
るａＦＧＦ濃度の少なくともＩ！ｏｇ３以上２倍の逐次
希釈で行なわれた。すべての濃度点は９６ウ工ル皿中の
葉書的Ｂａ　ｌ　ｂ／ｃ３Ｔ３細胞の４倍で行なった。

■刺激単位単位は、２最大応答を生じるｌ−当りのａ　
ＦＧＦの世として計算した。マイトジェン比活性は純粋
なａＦＧＦ　　１■当りの刺激単位数である。ａ　ＦＧ
Ｆの全試料は同じＴＦＡ／ＣｌｌｆｆＣＮ溶媒で５０ｐ
ｇ／ｍｌに予め希釈した。野性型および突然変異ａ　Ｆ
ＧＦの活性は次の表で比較される。

第−上↓−表 ）Ｊｌ換え野生型ｈａＦＧＦ、１個のＳｅｔ突然変異体
および多数Ｓｅ突然変異体を定量した。マイトジェン活
性は、ヒト血清アルブミン１■／ｍｊ２を含有する３７
°Ｃにおいてｐｌ＋７．３にＣＯ２で緩衝した連続試料
希釈液として通常使用される血清のないＤ肝溶液で０．
１および８日温置することにより測定した。マイトジェ
ン試料をヘパリン５００ｐｇ／ｍｌの存在下または不在
下で検定では最大濃度が希釈される１０倍濃縮液に等価
な５１２ｎｇ／＠７で貯蔵した。各々の試料を貯蔵し、
ヘパリンの存在下あるいは不在下で検定した。各々０８
１００％活性をセットして比較することにより相対的安
定性を貯蔵時間の作用として第２図に示す。第２図にお
いてマは野生型に対応し、ムはｈ　ａＦＧＰ　（Ｓｅｒ
ｆ　６）に対応し、■はｈ　ａＦＧＦ　（Ｓｅｒ８３）
に対応し、・はｈ　ａＦＧＦ　（Ｓｅｒｌ　１７）に対
応し、はｈａＦＧＦ（Ｓｅｒｌ６．８３）に対応し、△
はｈ　ａ　ＦＧＦ　（Ｓｅｒｌ６．１１７）に対応し、
口はｈａＦＧＦに対応し、○はｈ　ａ　ＦＧＦ　（Ｓｅ
ｒ　１６．８３．１１７）に対応する。

ヘパリンの存在下野生型ｈａＦＧＦおよび突然変異体の
活性の喪失は、指数崩壊に密接に適合する、第４Ａ図参
照。５ｅｒ（１６）を除く突然変異すべての活性は野性
型マイトジェンより安定である。最も安定な突然変異は
安定性が減少する順に５ｅｒ（１６，８３，１１７）　
、５ｅｔ（１１７）　、５ｅｔ（１６，８３）　　、５
ｅｒ（８３、１１７）、５ｅｒ（１６，８３）および５
ｅｔ（８３）　、５ｅｒ（１６）である。５ｅｒ（８３
）の安定性は野生型よりわずかだけ高い。ａ　ＦＧＦの
種々の形態は、ヘパリンの不在下で安定でなく　、５ｅ
ｔ（１６，８３，１１７）は明らかに除いて崩壊は時間
の簡単な関数ではないように思われる。

大腸菌Ｄ　Ｈ５のセリン１１７突然変異を発現すること
ができる遺伝子を含むＡ４８−１ａｌに指定された発現
ベクターｐＫＫ　−ｈ　ａＦＧＦ　（Ｓｅｒｌ　Ｉ　７
）の試料はブダペスト条約に従って１９８７年９月３０
日にアメリカンタイブカルチュアコレクション、１２３
０１パークラウンドライフ、ロックビル、マリ−ラント
２０８５２ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ番号６７５２２
に指定されている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、突然変異体γ−ａ　ＦＧＦの遺伝子を含むｐ
ＫＫ２２３−３プラスミドを示す図である。 第２図は、ヘパリンの存在下（Ａ）とヘパリンネ在下（
Ｂ）での組換え野生型ｈａＦＧＦと踵々Ｃ・突然変異体
の相対的安定性を比較するものである。 出 願 人 メルク エンド カムパニ インコーポレーテＶド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、酸性繊維芽細胞成長因子の生物学的に有効な組換え
   ヒト突然変異体ミクロ不均質形態。 ２、１４０個のヒト天然アミノ酸ミクロ不均質形態に従
   って数えて１６、８３および１１７位のシステイン残基
   の１個以上が分子内または分子間ジスルフィド結合を形
   成することができないアミノ酸に置換され、任意により
   該ミクロ不均質形態のＮ末端で通常の１番目のアミノ酸
   にさらにメチオニンが付加されていることを特徴とする
   酸性繊維芽細胞成長因子の生物学的に有効な組換えヒト
   突然変異体ミクロ不均質形態。 ３、突然変異体酸性繊維芽細胞成長因子が １５４、１４０または１３９個のアミノ酸ミクロ不均質
   形態を有する請求項２記載の酸性繊維芽細胞成長因子の
   組換えヒト突然変異体ミクロ不均質形態。 ４、置換アミノ酸がセリンである請求項２記載の酸性繊
   維芽細胞成長因子の組換えヒト突然変異体ミクロ不均質
   形態。 ５、１４０個のヒト天然アミノ酸ミクロ不均質形態に従
   って数えて１６、８３および１１７位の３個全部のシス
   テインが分子内または分子間ジスルフィド結合を形成す
   ることができないアミノ酸に置換され、任意により該ミ
   クロ不均一形態のＮ末端で通常の１番目のアミノ酸にさ
   らにメチオンが付加されていることを特徴とする酸性繊
   維芽細胞成長因子の生物学的に有効な組換えヒト突然変
   異体ミクロ不均質形態。 ６、突然変異体酸性繊維芽細胞成長因子が １５４、１４０または１３９個のアミノ酸ミクロ不均質
   形態を有する請求項５記載の酸性繊維芽細胞成長因子の
   組換えヒト突然変異体ミクロ不均質形態。 ７、置換アミノ酸がセリンである請求項５記載の酸性繊
   維芽細胞成長因子の組換えヒト突然変異体ミクロ不均質
   形態。 ８、１４０個のヒト天然アミノ酸ミクロ不均質形態に従
   って数えて１６、８３または１１７位のいずれか２個の
   システインが分子内または分子間ジスルフィド結合を形
   成することができないアミノ酸に置換され、任意により
   該ミクロ不均質形態のＮ末端で通常の１番目のアミノ酸
   にさらにメチオニンが付加されていることを特徴とする
   酸性繊維芽細胞成長因子の生物学的に有効な組換えヒト
   突然変異体ミクロ不均質形態。 ９、突然変異体酸性繊維芽細胞成長因子が １５４、１４０または１３９個のアミノ酸ミクロ不均質
   形態を有する請求項８記載の酸性繊維芽細胞成長因子の
   組換えヒト突然変異体ミクロ不均質形態。 １０、置換アミノ酸がセリンである請求項８記載の酸性
   繊維芽細胞成長因子の組換えヒト突然変異体ミクロ不均
   質形態。 １１、１４０個のヒト天然アミノ酸ミクロ不均質形態に
   従って数えて１１７位のシステインが分子内または分子
   間ジスルフィド結合を形成することができないアミノ酸
   に置換され任意によりＮ末端で通常の１番目のアミノ酸
   にさらにメチオニンが付加されており、該突然変異体酸
   性繊維芽細胞成長因子がヒト天然酸性繊維芽細胞成長因
   子より生物学的活性が大きいことを特徴とする酸性繊維
   芽細胞成長因子の生物学的に有効な組換えヒト突然変異
   体ミクロ不均質形態。 １２、突然変異体酸性繊維芽細胞成長因子が１５４、１
   ４０または１３９個のアミノ酸ミクロ不均質形態を有す
   る酸性繊維芽細胞成長因子の組換えヒト突然変異体ミク
   ロ不均質形態。 １３、置換アミノ酸がセリンである請求項１１記載の酸
   性繊維芽細胞成長因子の組換えヒト突然変異体ミクロ不
   均質形態。 １４、１４０個のヒト天然アミノ酸ミクロ不均質形態が
   非酸化アミノ酸に置換され、任意により該ミクロ不均一
   形態のＮ末端で通常の１番目のアミノ酸にさらにメチオ
   ニンが付加されている請求項１、２、５、８または１１
   記載の酸性繊維芽細胞成長因子の生物学的に有効な組換
   えヒト突然変異体ミクロ不均質形態。 １５、非空気酸化アミノ酸がアラニン、バリン、ロイシ
   ンあるいはイソロイシンのいずれかである請求項１４記
   載の酸性繊維芽成長因子の組換えヒト突然変異体ミクロ
   不均質形態。 １６、アミノ酸がロイシンである請求項１４記載のアミ
   ノ酸。 １７、請求項２記載の酸性繊維芽細胞成長因子の組換え
   ヒト突然変異体ミクロ不均質形態をコードするヌクレオ
   チジ配列。 １８、酸性繊維芽細胞成長因子の発現を高めるシストロ
   ンが酸性繊維芽細胞成長因子の組換えヒト突然変異体ミ
   クロ不均質形態の該配列の上流に付いている請求項１７
   記載のヌクレオチド配列。 １９、請求項５記載の酸性繊維芽細胞成長因子の組換え
   ヒト変異体ミクロ不均質形態にをコードするヌクレオチ
   ド配列。 ２０、酸性繊維芽細胞成長因子の発現を高めるシストロ
   ンが酸性繊維芽細胞成長因子の組換えヒト突然変異体ミ
   クロ不均一形態の該配列の上流に付いている請求項１９
   記載のヌクレオチド配列。 ２１、請求項８記載の酸性繊維芽細胞成長因子の組換え
   ヒト変異体ミクロ不均質形態をコードするヌクレオチド
   配列。 ２２、酸性繊維芽細胞成長因子の発現を高めるシストロ
   ンが酸性繊維芽細胞成長因子の組換えヒト変異体ミクロ
   不均質形態の該配列の上流に付いている請求項２１記載
   のヌクレオチド配列。 ２３、請求項１１記載の酸性繊維芽細胞成長因子の組換
   えヒト変異体ミクロ不均質形態をコードするヌクレオチ
   ド配列。 ２４、酸性繊維芽細胞成長因子の発現を高めるシストロ
   ンが酸性繊維芽細胞成長因子の組換えヒト変異体ミクロ
   不均質形態の該配列の上流に付いている請求項２３記載
   のヌクレオチド配列。 ２５、請求項１４記載の酸性繊維芽細胞成長因子の組換
   えヒト変異体ミクロ不均質形態にをコードするヌクレオ
   チド配列。 ２６、酸性繊維芽細胞成長因子の発現を高めるシストロ
   ンが酸性繊維芽細胞成長因子の組換えヒト変異体ミクロ
   不均質形態の該配列の上流に付いている請求項２５記載
   のヌクレオチド配列。 ２７、医薬担体および請求項１記載の酸性繊維芽細胞成
   長因子の組換えヒト突然変異体ミクロ不均質形態の有効
   量を包含している軟組織、骨格筋組織、軟骨、血管組織
   、および神経組織の修復およびプラスミノーゲン活性化
   因子産生のための医薬組成物。 ２８、医薬担体および請求項２記載の酸性繊維芽細胞成
   長因子の組換えヒト突然変異体ミクロ不均質形態の有効
   量を包含している軟組織、骨格筋組織、軟骨、血管組織
   および神経組織修復およびプラスミノーゲン活性化因子
   産生のための医薬組成物。 ２９、医薬担体および請求項５記載の酸性繊維芽細胞成
   長因子の組換えヒト突然変異体ミクロ不均質形態の有効
   量を包含している軟組織、骨格筋組織、軟骨、血管組織
   および神経組織修復およびプラスミノーゲン活性化因子
   産生のための医薬組成物。 ３０、医薬担体および請求項８記載の酸性繊維芽細胞成
   長因子の組換えヒト突然変異体ミクロ不均質形態の有効
   量を包含している軟組織、骨格筋組織、軟骨血管組織お
   よび神経組織修復およびプラスミノーゲン活性化因子産
   生のための医薬組成物。 ３１、医薬担体および請求項１１記載の酸性繊維芽細胞
   成長因子の組換えヒト突然変異体ミクロ不均質形態の有
   効量を包含している軟組織、骨格筋組織、軟骨、血管組
   織および神経組織修復およびプラスミノーゲン活性化因
   子産生のための医薬組成物。 ３２、医薬担体および請求項１４記載の酸性繊維芽細胞
   成長因子の組換えヒト突然変異体ミクロ不均質形態の有
   効量を包含している軟組織、骨格筋組織、軟骨、血管組
   織および神経組織修復およびプラスミノーゲン活性化因
   子産生のための医薬組成物。 ３３、請求項１記載の酸性繊維芽細胞成長因子の組換え
   ヒト突然変異体ミクロ不均質形態の有効量を治療を必要
   としている患者に投与することを特徴とする軟組織、骨
   格筋組織、軟骨、血管組織および神経組織修復およびプ
   ラスミノーゲン活性化因子の産生を促進する方法。 ３４、請求項２記載の酸性繊維芽細胞成長因子の組換え
   ヒト突然変異体ミクロ不均質形態の有効量を治療を必要
   としている患者に投与することを特徴とする軟組織、骨
   格筋組織、軟骨、血管組織および神経組織修復およびプ
   ラスミノーゲン活性化因子の産生を促進する方法。 ３５、請求項５記載の酸性繊維芽細胞成長因子の組換え
   ヒト突然変異体ミクロ不均質形態の有効量を治療を必要
   としている患者に投与することを特徴とする軟組織、骨
   格筋組織、軟骨、血管組織および神経組織修復およびプ
   ラスミノーゲン活性化因子の産生を促進する方法。 ３６、請求項８記載の酸性繊維芽細胞成長因子の組換え
   ヒト突然変異体ミクロ不均質形態の有効量を治療を必要
   としている患者に投与することを特徴とする軟組織、骨
   格筋組織、軟骨、血管組織および神経組織修復およびプ
   ラスミノーゲン活性化因子の産生を促進する方法。 ３７、請求項１１記載の酸性繊維芽細胞成長因子の組換
   えヒト突然変異体ミクロ不均質形態の有効量を治療を必
   要としている患者に投与することを特徴とする軟組織、
   骨格筋組織、軟骨、血管組織および神経組織修復および
   プラスミノーゲン活性化因子の産生を促進する方法。 ３８、請求項１４記載の酸性繊維芽細胞成長因子の組換
   えヒト突然変異体ミクロ不均質形態の有効量を治療を必
   要としている患者に投与することを特徴とする軟組織、
   骨格筋組織、軟骨、血管組織および神経組織修復および
   プラスミノーゲン活性化因子の産生を促進する方法。 ３９、 ａ、ヒト突然変異体ミクロ不均一酸性繊維芽細胞成長因
   子をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドを供
   給し、そのヌクレオチド配列はプラスミドを含有する宿
   主によって発現され、 ｂ、プラスミドを宿主に組込み、 ｃ、組換えヒト突然変異ミクロ不均一酸性繊維芽細胞成
   長因子を生成するヌクレオチド配列の発現に適当な条件
   下でプラスミドを含有する宿主を維持する の段階よりなることを特徴とする酸性繊維芽細胞成長因
   子の生物学的に有効な組換えヒト突然変異体ミクロ不均
   質形態の製造方法。 ４０、１４０個のウシ天然アミノ酸ミクロ不均質形態に
   従って数えて１６、４７および８３位のシステイン残基
   の１個以上が分子内または分子間ジスルフィド結合を生
   成することができないアミノ酸に置換され、任意により
   該不均質ミクロ形態のＮ末端で通常の１番目のアミノ酸
   にさらにメチオニンが付加されていることを特徴とする
   生物学的に有効な組換えウシ突然変異体ミクロ不均質酸
   性繊維芽細胞成長因子。 ４１、１４０個のウシ天然アミノ酸ミクロ不均質形態に
   従って数えて６７位のメチオニン残基が非空気酸化アミ
   ノ酸に置換され任意により該ミクロ不均質形態のＮ末端
   で通常の１番目のアミノ酸にさらにメチオニンが付加さ
   れている請求項３５記載の組換えウシ突然変異体ミクロ
   不均質酸性繊維芽細胞成長因子。 ４２、次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 およびそのすべてのミクロ不均質形態を有し、任意によ
   り該ミクロ不均質形態のＮ末端で通常の１番目のアミノ
   酸にさらにメチオニンが付加されている生物学的に有効
   な組換えヒト突然変異体酸性繊維芽細胞成長因子。 ４３、６７位のメチオニン残基がロイシンに置換される
   請求項３７記載の組換えヒト突然変異体ミクロ不均質酸
   性繊維芽細胞成長因子。 ４４、次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 およびそのすべてのミクロ不均質形態を有し、任意によ
   り該ミクロ不均質形態のＮ末端で通常の１番目のアミノ
   酸にさらにメチオニンが付加されている生物学的に有効
   な組換えヒト突然変異体酸性繊維芽細胞成長因子。 ４５、６７位のメチオニン残基がロイシンに置換される
   請求項４３記載の組換えヒト突然変異体ミクロ不均質酸
   性繊維芽細胞成長因子。 ４６、次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 およびそのすべてのミクロ不均質形態を有し、任意によ
   り該ミクロ不均質形態のＮ末端で通常の１番目のアミノ
   酸にさらにメチオニンが付加されている生物学的に有効
   な組換えヒト突然変異体酸性繊維芽細胞成長因子。 ４７、６７位のメチオニン残基がロイシンに置換される
   請求項４６記載の組換えヒト突然変異体ミクロ不均質酸
   性繊維芽細胞成長因子。