PL221356B1 - Zmodyfikowany genetycznie, rekombinowany czynnik wzrostu fibroblastów (FGF1) skoniugowany z nanocząsteczkami metalu lub tlenku metalu, jego sekwencja DNA i aminokwasowa oraz zastosowanie - Google Patents

Zmodyfikowany genetycznie, rekombinowany czynnik wzrostu fibroblastów (FGF1) skoniugowany z nanocząsteczkami metalu lub tlenku metalu, jego sekwencja DNA i aminokwasowa oraz zastosowanie

Info

Publication number
PL221356B1
PL221356B1 PL398908A PL39890812A PL221356B1 PL 221356 B1 PL221356 B1 PL 221356B1 PL 398908 A PL398908 A PL 398908A PL 39890812 A PL39890812 A PL 39890812A PL 221356 B1 PL221356 B1 PL 221356B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
fgf1
nanoparticles
metal
gly
leu
Prior art date
Application number
PL398908A
Other languages
English (en)
Other versions
PL398908A1 (pl
Inventor
Anna Szlachcic
Katarzyna Pala
Piotr Jakimowicz
Małgorzata Zakrzewska
Jacek Otlewski
Original Assignee
Wrocławskie Ct Badań Eit & Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialności
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wrocławskie Ct Badań Eit & Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialności filed Critical Wrocławskie Ct Badań Eit & Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialności
Priority to PL398908A priority Critical patent/PL221356B1/pl
Priority to PCT/PL2013/050010 priority patent/WO2013157973A1/en
Publication of PL398908A1 publication Critical patent/PL398908A1/pl
Publication of PL221356B1 publication Critical patent/PL221356B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0052—Thermotherapy; Hyperthermia; Magnetic induction; Induction heating therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem zgłoszenia jest zmodyfikowany genetycznie, rekombinowany czynnik wzrostu fibroblastów (FGF1) skoniugowany z nanocząstkami metalu lub tlenku metalu, preferencyjnie z nanocząstkami złota. Wynalazek ma potencjalne zastosowanie w medycynie do celów diagnostycznych i leczniczych w zakresie terapii nowotworów.
Receptory fibroblastycznych czynników wzrostu są nadeksprymowane w wielu typach nowotworów, np. w nowotworach piersi, prostaty i pęcherza moczowego. Specyficzność oddziaływania FGF1 z receptorami czyni go potencjalnym białkiem celującym w komórki nowotworowe. Jednakże wadą tego czynnika wzrostowego (w porównaniu np. do powszechnie stosowanych przeciwciał) jest jego niska stabilność termodynamiczna i podatność na proteolizę, co sprawia, iż okres jego półtrwania w organizmie jest bardzo krótki. Wprowadzenie wybranych mutacji punktowych znacząco poprawia powyższe parametry. Stabilny mutant FGF1 został uzyskany przez wprowadzenie mutacji punktowych: Q40P, S47I oraz H93G [Zakrzewska i wsp., 2005]. Dzięki temu białko nie jest podatne na degradację proteolityczną i dezaktywację termiczną. Dodatkowo reszta cysteiny w pozycji 117 eksponowana na powierzchni białka została zmutowana do seryny (C117S), aby uniemożliwić przyłączanie się białka do powierzchni nanocząstek przez grupę tiolową cysteiny obecną w tej pozycji. W literaturze opisany jest efekt tej mutacji, która wydłuża znacząco okres półtrwania białka [Ortega i wsp. 1991, Culajay i wsp., 2000].
Nanocząstki posiadają unikalne właściwości fizyko-chemiczne, dzięki którym są coraz częściej wykorzystywane w medycynie, a szczególnie w leczeniu nowotworów. Nanocząstki złota posiadają zdolność absorpcji światła podczerwonego, w wyniku której emitują ciepło. Dzięki temu są wykorzystywane w terapii zwanej terapią fototermalną (ang. photo thermal therapy). Polega ona na wprowadzaniu nanocząstek do komórek nowotworowych i naświetlaniu ich światłem w zakresie bliskiej podczerwieni. Wywołuje to lokalny wzrost temperatury, a tym samym osłabienie lub śmierć komórek. Istotne jest, aby nanocząstki trafiały selektywnie do komórek nowotworowych, nie naruszając komórek zdrowych. W tym celu koniuguje się je z cząsteczkami celującymi, takimi jak przeciwciała, aptamery i inne. Przy koniugacji bardzo często mamy do czynienia z agregacją nanocząstek, co jest wynikiem wrażliwości koloidów złota na siłę jonową roztworu i obecność innych substancji. Stanowi to poważny problem w przypadku precyzyjnej aplikacji do tkanek. Zgłoszenie WO2010114632 opisuje sposób na odwracalną agregację i deagregację nanocząstek metali dzięki zastosowaniu polimerów (np. PEG) oraz cząsteczek chemicznych posiadających różne grupy funkcyjne. Związki te stanowią przeszkodę steryczną, umożliwiającą utrzymanie odpowiedniej odległości pomiędzy nanocząstkami, a tym samym zapobiegają ich agregacji. Podobne rozwiązanie proponują autorzy zgłoszenia WO2008119181, gdzie nanocząstki złota zostały opłaszczone nukleotydami, które dzięki negatywnemu ładunkowi pozwalają na odpychanie się wzajemne nanocząstek. W literaturze patentowej jest wiele dokumentów opisujących zastosowanie nanocząstek w terapii. Dokument WO2006122222 opisuje zastosowanie nanocząstek złota i srebra do obrazowania a także termoterapii. W tym przypadku nanocząstki są opłaszczone różnymi cząsteczkami celującymi, umożliwiającymi dostarczanie ich do wybranych tkanek. Aby zapobiec agregacji zastosowano związki organiczne i polimery, takie jak CTAB lub glikol polietylenowy.
Stosowanie polimerów i związków organicznych jako czynników zapobiegających agregacji ma jednak swoje ograniczenia. W przypadku przyłączania do nanocząstki białka lub innej cząsteczki biologicznej dochodzi do zaburzenia oddziaływania pomiędzy pojedynczymi cząstkami, co prowadzi do wytrącania się nanocząstek w postaci osadu. W związku z tym poszukiwane są metody przyłączania białek do nanocząstek złota, które zapewnią obniżenie agregacji nanocząstek w porównaniu do dotychczas stosowanych podejść. Nieoczekiwanie wspomniany problem został rozwiązany w prezentowanym wynalazku.
Pierwszym przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowany genetycznie, rekombinowany czynnik wzrostu fibroblastów FGF1 charakteryzujący się tym, że zawiera mutację Cys do Ser w pozycji nr 117 w sekwencji aminokwasowej ukazanej jako SEQ ID nr 1, i który ma zwiększoną stabilność i mniejsze właściwości agregujące w koniugacie z nanocząstką metalu lub tlenku metalu, korzystnie z nanocząstką złota, w porównaniu do dzikiego typu białka.
Drugim przedmiotem wynalazku jest sekwencja nukleotydowa zmodyfikowanego genetycznie, rekombinowanego czynnika wzrostu fibroblastów FGF1 zdefiniowana w pierwszym przedmiocie wynalazku, ukazana jako SEQ ID nr 2.
PL 221 356 B1
Trzecim przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowany rekombinowany czynnik wzrostu fibroblastów charakteryzujący się tym, że zawiera mutację Cys do Ser w pozycji 117 w sekwencji aminokwasowej ukazanej jako SEQ ID nr 3, który ma mniejsze właściwości agregujące w koniugacie z nanocząstką metalu lub tlenku metalu, korzystnie z nanocząstką złota.
Czwartym przedmiotem wynalazku jest sekwencja nukleotydowa zmodyfikowanego genetycznie, rekombinowanego czynnika wzrostu fibroblastów FGF1 zdefiniowana w przedmiocie trzecim wynalazku, ukazana jako SEQ ID nr 4.
Piątym przedmiotem wynalazku jest koniugat polipeptydu z nanocząstkami metalu lub tlenku metalu, preferencyjnie z nanocząstkami złota (FGF1-Au) charakteryzujący się tym, że zawiera polipeptyd zdefiniowany w zastrz. 1 albo 3.
Szóstym przedmiotem wynalazku jest koniugat jak zdefiniowano w piątym przedmiocie wynalazku do zastosowania w wywoływaniu hipertermii spowodowanej ekspozycją koniugatu na światło z zakresu bliskiej podczerwieni (NIR).
Niniejszy patent przedstawia koniugaty FGF1 z nanocząstkami złota, zaprojektowane tak, aby białko na powierzchni nanocząstki było specyficznie zorientowane i zapobiegało agregacji koloidu.
Specyficzna koniugacja do nanocząstek za pomocą grupy tiolowej cysteiny została osiągnięta przez usunięcie występującej naturalnie w białku i eksponowanej na powierzchni cysteiny 117 - została ona zastąpiona resztą seryny (mutacja C117S). Dodatkowo na N-końcu białka wprowadzono fleksybilny łącznik zakończony cysteiną. W opisanym mutancie występuje tylko jedna eksponowana cysteina - na końcu N białka, która umożliwia bezpośrednie przyłączenie czynnika wzrostu do złota i nie zaburza struktury białka. W przypadku, gdy reszta cysteiny 117 nie jest zmutowana do seryny, nanocząstki złota mogą przyłączyć się zarówno do grupy tiolowej na końcu fleksybilnego łącznika, jak i do cysteiny 117 na powierzchni białka, co skutkuje niehomogennym produktem mającym tendencję do większej agregacji. Ponadto dzięki wprowadzeniu mutacji C117S białko na powierzchni złota jest zorientowane tak, że region oddziaływania z receptorem FGF nie jest zasłonięty przez nanocząstkę. FGF1 może więc prawidłowo oddziaływać z receptorem i kierować nanocząstki specyficznie do komórek nadprodukujących receptor FGF.
Przykładowe realizacje wynalazku przedstawiono poniżej na rysunku, na którym fig. 1 ilustruje pomiar DLS koloidów złota (1a) oraz koniugatów FGF1-Au (1b), fig. 2 prezentuje schemat struktury białka FGF1 z wprowadzonymi mutacjami, pozwalającymi na specyficzną koniugację z nanocząstkami złota, fig. 3 przedstawia żel SDS-PAGE, na który naniesiono kolejne frakcje eluatu z kolumny Superdex75 mutanta FGF1, fig. 4 przedstawia krzywą denaturacji dla dzikiego typu i mutanta FGF1, fig. 5 przedstawia widma UV-Vis nanocząstek złota; widmo 1 - koniugaty mutanta FGF1, 2 - koniugaty nanocząstek ze stabilnym mutantem FGF1 niezawierającym podstawienia C117S, fig. 6 pokazuje schemat koniugatu złotej nanocząstki z mutantem FGF1, fig. 7 przedstawia wyniki testu proliferacyjnego komórek NIH/3T3 traktowanych mutantem FGF1, koniugatami FGF1-Au oraz koloidem złota, fig. 8 przedstawia analizę Western Blot szlaków sygnalizacyjnych w komórkach NIH/3T3 aktywowanych w wyniku inkubacji z wolnym mutantem FGF1, FGF1-Au oraz koloidami złota, fig. 9 przedstawia zdjęcia z mikroskopu konfokalnego ilustrujące specyficzną internalizację znakowanego mutanta FGF1 oraz koniugatów FGF1-Au w komórkach posiadających receptor FGFR1; 1 - Alexa488-FGF1, 2 - jądra wybarwione barwnikiem DAPI, 3 - nałożenie zdjęć 1 i 2; a - komórki U2OSR1, b - komórki U2OS, a fig. 10 ilustruje żywotność komórek U2OSR1 (a) oraz U2OS (b) traktowanych koniugatami FGF1-Au, nanocząstkami AuNP oraz buforem PBS, naświetlanych światłem z zakresu bliskiej podczerwieni.
P r z y k ł a d 1
Synteza nanocząstek złota
Koloidy złota przygotowano wg standardowej procedury [Turkevich i wsp., 1951]. 20 ml roztworu zawierającego 4 ml 1% (w/v) cytrynianu sodu (Sigma-Aldrich) i 0,08 ml 1% (w/v) kwasu taninowego (Sigma-Aldrich) dodano do 80 ml roztworu zawierającego 1 ml 1% (w/v) kwasu złotawego (Sigma-Aldrich). Następnie mieszaninę ogrzewano w 60°C przez 20 min na mieszadle magnetycznym, po czym schłodzono do temperatury pokojowej. Rozmiar nanocząstek mierzono metodą DLS (ang. Dynamie Light Scattering) z użyciem Zetasizer Ver. 6.00 beta 2 (Malvern Instruments). Widma UV-Vis mierzono na spektrofotometrze Cary 300 (Varian). Pomiary DLS wykazały, że rozmiar nanocząstek wynosi 10 nm (fig. 1a)
P r z y k ł a d 2
Nadprodukcja, oczyszczanie i charakterystyka biofizyczna mutanta FGF1
PL 221 356 B1
W sekwencji kodującej ludzki FGF1 wklonowanej do wektora pET-3c wprowadzono substytucję eksponowanej cysteiny seryną (C117S) oraz czteroaminokwasową insercję (Cys-Gly-Gly-Gly) na N-końcu białka za pomocą ukierunkowanej mutagenezy QuikChange (Stratagene). Otrzymane konstrukty zostały zsekwencjonowane w celu potwierdzenia obecności wprowadzonych mutacji. Konstrukty o właściwej sekwencji zostały namnożone w szczepie E. coli DH10 i oczyszczone. Czystość preparatów DNA została potwierdzona za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
Konstruktami zmodyfikowanego FGF1 stransformowano szczep bakterii E. coli BL21(DE3)pLysS przeznaczonych do nadprodukcji białek rekombinowanych. Hodowla prowadzona była w pożywce pełnej LB w 37°C, ekspresję białka indukowano izopropylotiogalaktozydem (IPTG) o stężeniu końcowym 0,5 mM przy gęstości optycznej (OD600) między 0,6 a 0,8. Następnie hodowla prowadzona była przez 4 godziny w 37°C, żwirowana, a osad bakteryjny zawieszono w buforze o składzie 20 mM TrisHCl, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF i zamrażano w -20°C.
Osady bakteryjne po rozmrożeniu były sonikowane w temperaturze 4°C i wirowane (14 000 g, 4°C, 1 godz.).Supernatant po wirowaniu, stanowiący frakcję białek rozpuszczalnych, był wiązany do złoża Heparin-Sepharose zrównoważonego uprzednio 20 mM TrisHCl, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT. Następnie złoże było przemywane schłodzonym buforem o powyższym składzie, i kolejno buforem zawierającym 20 mM TrisHCl, 0,7 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT. Elucję białka przeprowadzono buforem 20 mM TrisHCl, 2 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT - białko zwalniane było ze złoża pod wpływem wysokiej siły jonowej. Obecność białka w poszczególnych frakcjach eluatu (1 ml) była oznaczana spektrofotometrycznie przez absorbancję przy 280 nm. Czystość otrzymanego preparatu była sprawdzana za pomocą SDS-PAGE (fig. 3) oraz spektrometrii mas.
Natywność białka została potwierdzona za pomocą analizy widm fluorescencji. Wykorzystano fakt, iż w natywnie zwiniętej cząsteczce FGF1 fluorescencja reszty tryptofanu (Trp107) jest całkowicie wygaszona przy wzbudzeniu falą 280 nm). W stanie zdenaturowanym widmo emisji charakteryzuje się typowym dla tryptofanu maksimum przy 353 nm. Pomiary fluorymetryczne zostały przeprowadzone przy użyciu spektrofluorymetru Jasco FP-750, w buforze fosforanowym (25 mM H3PO4, pH 7,3), w temperaturze 21°C. Odczytywano wartości emisji w przedziale 300-400 nm, przy wzbudzeniu falami o długości 280 nm. Użyto kuwety o drodze optycznej 1 cm, a stężenie białka wynosiło 4 μM.
Pomiary denaturacji termicznej FGF1 prowadzone były w buforze fosforanowym z dodatkiem 0,7 M chlorowodorku guanidyny (GdmCl) aby zapobiec agregacji cząsteczek FGF1 w podwyższonej temperaturze oraz dwustanowość przejścia denaturacyjnego. Mierzono wzrost emisji fluorescencji przy długości fali 353 nm (wzbudzenie falą o długości 280 nm). Temperaturę zmieniano z szybkością 0,25°C/min. Droga optyczna wynosiła 1 cm, a stężenie białka 4 μM.
Otrzymane krzywe denaturacyjne były analizowane zgodnie z modelem dwóch stanów (brak intermediatów w procesie denaturacji białka). Ze zmian emisji fluorescencji wyliczano frakcję formy zdenaturowej oraz natywnej, a otrzymane znormalizowane krzywe denaturacji analizowano za pomocą programu GraFit (Jandel Scientific Software) (fig. 4).
Pomiary denaturacyjne prowadzone były równolegle dla mutanta FGF1 oraz dla dzikiego typu FGF1 (WT).
P r z y k ł a d 3
Koniugacja mutanta FGF1 z nanocząstkami złota
Koniugacja mutanta FGF1 z nanocząstkami polegała na wymianie ligandów na powierzchni złota w obecności niejonowego surfaktanta. Koloid po syntezie był stabilizowany cząsteczkami cytrynianu. Po dodaniu niejonowego surfaktanta cytrynian był wypierany i zastępowany cząsteczkami surfaktanta. Podczas koniugacji zastosowano n-decylo-3-D-maltozyd (DDM) w stężeniu 10 nM, co stanowiło 2-krotny nadmiar w odniesieniu do stężenia CMC (ang. critical micelle concentration) tego związku. Mieszaninę inkubowano z nanocząstkami 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
Przed reakcją mutant FGF1 został zredukowany za pomocą 0,5 mM TCEP po czym odsolony na kolumnie PD10. Białko dodawano kroplami do roztworu nanocząstek do końcowego stężenia 150 μM i inkubowano przez noc w temperaturze 4°C. Nadmiar reagentów odpłukano wirując 4-krotnie i przemywając osad buforem PBS.
Homogenność koloidów badano za pomocą spektrofotometrii w zakresie UV-Vis. Fig. 5 pokazuje, że nanocząstki opłaszczone mutantem FGF1 zachowują monodyspersyjność (1), podczas gdy w przypadku koniugatów białka nie zawierającego mutacji cysteiny 117 nanocząstki zaczynają agregować, co objawia się przesunięciem maksimum absorpcji i szerszym pikiem na widmie UV-Vis (2).
PL 221 356 B1
P r z y k ł a d 4
Testy proliferacyjne
Komórki NIH/3T3 hodowano w medium Quantum 333 zawierającym 2% surowicę wołową. Linia U2OS hodowana była w medium DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) zawierającym 10% cielęcą surowicę płodową. Stabilne transfektanty nadprodukujące receptor FGFR1 (U2OSR1) otrzymano dzięki uprzejmości dr Ellen M. Haugsten z The Norwegian Radium Hospital.
Komórki wysiewano na płytki 96-dołkową (104 komórek/dołek), następnie wymieniano medium na niezawierające surowicy. Po dobie dodawano do nich odpowiednio mutanta FGF1, koniugaty nanocząstek z mutantem FGF1 i same nanocząstki. Inkubowano 48 godzin w temperaturze 37°C a następnie przeprowadzano testy MTT (Sigma-Aldrich) lub Alamar Blue (Invitrogen) wg protokołu producenta.
Testy przekazywania sygnału w komórce
Komórki NIH/3T3 hodowane przez 24 godziny w medium bez surowicy stymulowano przez 15 min wolnym mutantem FGF1 lub koniugatem nanocząstek z FGF1 (FGF1-Au) w stężeniu 1, 10 i 100 ng/ml (białka) w obecności heparyny (10 U/ml). Następnie komórki następnie poddano lizie, sonikowano, a uzyskany materiał rozdzielony na żelu SDS-PAGE analizowano techniką Western-Blot z użyciem przeciwciał anty-fosfo-Erkl/2, anty-fosfo-FGFR, anty-fosfo-PLCy, anty-fosfo-Akt oraz anty-γ-tubuliny jako kontroli.
Z przeprowadzonych testów proliferacyjnych (MTT i Alamar Blue) wynika, że mutant FGF1 immobilizowany na nanocząstkach wykazuje taką samą aktywność proliferacyjną co wolne białko (fig. 7). Koniugat wiąże się prawidłowo do receptora i stymuluje ścieżki sygnalne aktywowane przez FGF1 na tym samym poziomie co wolny FGF1 (fig. 8).
P r z y k ł a d 5
Specyficzna internalizacja koniugatów FGF1-Au
Eksperyment potwierdzający specyficzną internalizację koniugatów FGF1-Au do komórek nadekspersjonujących receptor FGFR1 przeprowadzono na liniach U2OSR1, stabilnie stransfekowanych genem receptora FGFR1. Jako kontrolę użyto linii U2OS, która nie wykazuje ekspresji żadnej izoformy receptora.
Mutant FGF1 wyznakowany fluorescencyjnie za pomocą barwnika Alexa 488 został skoniugowany z nanocząstkami wg protokołu opisanego powyżej.
Linie komórkowe U2OS i U2OSR1 hodowano na szkiełkach mikroskopowych w medium bez surowicy przez 24 godziny w 37°C po czym inkubowano ze znakowanym wolnym mutantem FGF1 oraz znakowanym koniugatem FGF1-Au w stężeniu 100 ng/ml (w odniesieniu do białka) 30 min w 37°C. Po tym czasie preparaty utrwalono w roztworze formaliny i analizowano na mikroskopie konfokalnym Zeiss LSM Duo.
Zdjęcia z mikroskopu konfokalnego pokazują, że jedynie w przypadku komórek U2OSR1 mutant FGF1 oraz koniugat FGF1-Au znakowane barwnikiem Alexa 488 są internalizowane (fig. 9). W przypadku komórek kontrolnych U2OS zarówno sam FGF1 jak i koniugaty białka z nanocząstkami nie ulegały internalizacji. Ponieważ jedyna różnica pomiędzy wybranymi liniami polegała na obecności lub braku receptora FGFR1 uzyskany wynik świadczy o specyficznej internalizacji zależnej od receptora. Oznacza to również, że białko obecne na powierzchni nanocząstki jest poprawnie zwinięte i w pełni aktywne.
P r z y k ł a d 6
Hipertermia indukowana światłem z zakresu bliskiej podczerwieni
Eksperyment przeprowadzono na liniach U2OSR1 (stransfekowanych stabilnie receptorem FGF1) oraz U2OS jako kontroli. Komórki wysiano na płytkę 96 dołkową w medium DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą. Do odpowiednich dołków dodano koniugaty FGF1-Au oraz koloidy nieopłaszczone białkiem i bufor PBS jako kontrole. Następnie inkubowano 1 godzinę w temperaturze 37°C, po czym odpłukano niezwiązane nanocząstki. Odpowiednie dołki naświetlano laserem o długości fali 808 nm (1.2A, Optel Instruments) przez 10 i 20 min. Po hipertermii komórki inkubowano w 37°C przez 12 godzin. Żywotność sprawdzano za pomocą testu MTT (Sigma-Aldrich) wg protokołu producenta. Eksperyment powtórzono 4-krotnie.
Obniżoną żywotność komórek obserwowano jedynie w przypadku komórek U2OSR1 traktowanych koniugatami FGF1-Au (fig. 10a). Sugeruje to, że nanocząstki zostały specyficznie internalizowane do komórek zawierających receptor FGFR1.
W przypadku prób kontrolnych, do których dodano nanocząstki nieopłaszczone białkiem oraz bufor PBS nie zaobserwowano zmian żywotności w wyniku naświetlania światłem NIR (fig. 10b).
PL 221 356 B1
Wykaz sekwencji <110> Wrocławskie Centrum Badań EIT+ Sp z o.o <130> PK/1532/AW <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <212> PRT <213> artificial sequen.ce <400> 1
Met Cys Gly Gly Gly Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr
1 5 10 15
Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr
20 25 30
Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Pro His Ile Gin Leu Gin
35 40 45
Leu Ile Ala Glu Ser val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu
50 55 60
Thr Gly Gin Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly
65 70 75
Ser Gin Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu
80 85 90
Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys
95 100 105
Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Ser Lys Arg Gly
110 115 120
Pro Arg Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu
125 130 135
Pro Val Ser Ser Asp
140
<110> Wrocławskie Centrum Badań EIT+ Sp z o.o <130> PK/1532/AW <170> Patentln version 3.3
PL 221 356 B1 <210> 2 <211>
<212> DNA <213> artificial seguence <220>
<223> seąuence encoding stable mutant of fibroblast growth factor FGFl <400> 2 ggagatatac at atg tgc ggt ggt ggt gct aat tac aag aag ccc aaa ctc 51
Met Cys Gly Gly Gly Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu
10
ctc tac Leu Tyr tgt Cys agc Ser aac Asn ggg Gly ggc cac Gly His 20 ttc Phe ctg agg atc ctt ccg gat ggc Gly 99
Leu Arg Ile 25 Leu Pro Asp
15
aca gtg gat ggg aca agg gac agg agc gac ccg cac att cag ctg cag 147
Thr val Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Pro His Ile Gin Leu Gin
30 35 40 45
ctc att gcg gaa agc gtg ggg gag gtg tat ata aag agt acc gag act 195
Leu Ile Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr
50 55 60
ggc cag tac ttg gcc atg gac acc gac ggg ctt tta tac ggc tca cag 243
Gly Gin Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gin
65 70 75
aca cca aat gag gaa tgt ttg ttc ctg gaa agg ctg gag gag aac ggt 291
Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn Gly
80 85 90
tac aac acc tat ata tcc aag aag cat gca gag aag aat tgg ttt gtt 339
Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val
95 100 105
ggc ctc aag aag aat ggg agc agc aaa cgc ggt cct cgg act cac tat 387
Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Ser Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr
110 115 120 125
ggc cag aaa gca atc ttg ttt ctc ccc ctg cca gtc tct tct gat taa 435
Gly Gin Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp
130 135 140
agagatcc 443 <110> Wrocławskie Centrum Badań EIT+ Sp z o.o <130> PK/01532/AW <170> Patentln version 3.3 <210> 3
PL 221 356 B1
<212> PRT
<213> , artificial seąuence
<400> 3
Met Cys Gly Gly Gly Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr
1 5 10 15
Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr
20 25 30
Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gin His Ile Gin Leu Gin
35 40 45
Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu
50 55 60
Thr Gly Gin Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly
65 70 75
Ser Gin Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu
80 85 90
Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys
95 100 105
Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Ser Lys Arg Gly
110 115 120
Pro Arg Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu
125 130 135
Pro Val Ser Ser Asp
140 <110> Wrocławskie Centrum Badań EIT+ Sp z o.o.
<130> PK/01532/AW <170> Patentln version 3.3 <210> 4 <211>
<212> DNA <213> artificial seąuence <220>
<223> seąuence encoding mutant of fibroblast growth factor FGF1 <400> 4 ggagatatac at atg tgc ggt ggt ggt gct aat tac aag aag ccc aaa ctc 51
Met Cys Gly Gly Gly Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu
10
PL 221 356 B1
ctc Leu tac Tyr 15 tgt Cys agc Ser aac Asn ggg Gly ggc Gly 20 cac His ttc Phe ctg Leu agg Arg atc Ile 25 ctt Leu ccg Pro gat Asp ggc Gly 99
aca gtg gat ggg aca agg gac agg agc gac cag cac att cag ctg cag 147
Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gin His Ile Gin Leu Gin
30 35 40 45
ctc agt gcg gaa agc gtg ggg gag gtg tat ata aag agt acc gag act 195
Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr
50 55 60
ggc cag tac ttg gcc atg gac acc gac ggg ctt tta tac ggc tca cag 243
Gly Gin Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gin
65 70 75
aca cca aat gag gaa tgt ttg ttc ctg gaa agg ctg gag gag aac cat 291
Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His
80 85 90
tac aac acc tat ata tcc aag aag cat gca gag aag aat tgg ttt gtt 339
Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val
95 100 105
ggc ctc aag aag aat ggg agc agc aaa cgc ggt cct cgg act cac tat 337
Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Ser Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr
110 115 120 125
ggc cag a aa gca atc ttg ttt ctc ccc ctg cca gtc tct tct gat taa 435
Gly Gin Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp
130 135 140
agagatcc 443

Claims (6)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Zmodyfikowany genetycznie, rekombinowany czynnik wzrostu fibroblastów FGF1, znamienny tym, że zawiera mutację Cys do Ser w pozycji nr 117 w sekwencji aminokwasowej ukazanej jako SEQ ID nr 1, i który ma zwiększoną stabilność i mniejsze właściwości agregujące w koniugacie z nanocząstką metalu lub tlenku metalu, korzystnie z nanocząstką złota, w porównaniu do dzikiego typu białka.
  2. 2. Sekwencja nukleotydowa zmodyfikowanego genetycznie, rekombinowanego czynnika wzrostu fibroblastów FGF1 zdefiniowanego zastrz. 1, ukazana jako SEQ ID nr 2.
  3. 3. Zmodyfikowany rekombinowany czynnik wzrostu fibroblastów, znamienny tym, że zawiera mutację Cys do Ser w pozycji 117 w sekwencji aminokwasowej ukazanej jako SEQ ID nr 3, który ma mniejsze właściwości agregujące w koniugacie z nanocząstką metalu lub tlenku metalu, korzystnie z nanocząstką złota.
  4. 4. Sekwencja nukleotydowa zmodyfikowanego genetycznie, rekombinowanego czynnika wzrostu fibroblastów FGF1 zdefiniowanego zastrz. 3, ukazana jako SEQ ID nr 4.
  5. 5. Koniugat polipeptydu z nanocząstkami metalu lub tlenku metalu, preferencyjnie z nanocząstkami złota (FGF1-Au), znamienny tym, że zawiera polipeptyd zdefiniowany w zastrz. 1 albo 3.
  6. 6. Koniugat jak zdefiniowano zastrz. 5 do zastosowania w wywoływaniu hipertermii spowodowanej ekspozycją koniugatu na światło z zakresu bliskiej podczerwieni (NIR).
PL398908A 2012-04-21 2012-04-21 Zmodyfikowany genetycznie, rekombinowany czynnik wzrostu fibroblastów (FGF1) skoniugowany z nanocząsteczkami metalu lub tlenku metalu, jego sekwencja DNA i aminokwasowa oraz zastosowanie PL221356B1 (pl)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL398908A PL221356B1 (pl) 2012-04-21 2012-04-21 Zmodyfikowany genetycznie, rekombinowany czynnik wzrostu fibroblastów (FGF1) skoniugowany z nanocząsteczkami metalu lub tlenku metalu, jego sekwencja DNA i aminokwasowa oraz zastosowanie
PCT/PL2013/050010 WO2013157973A1 (en) 2012-04-21 2013-04-19 Genetically modified recombinant fibroblast growth factor (fgf1) conjugated with metal or metal oxide nanoparticles, its dna and amino acid sequences and use

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL398908A PL221356B1 (pl) 2012-04-21 2012-04-21 Zmodyfikowany genetycznie, rekombinowany czynnik wzrostu fibroblastów (FGF1) skoniugowany z nanocząsteczkami metalu lub tlenku metalu, jego sekwencja DNA i aminokwasowa oraz zastosowanie

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL398908A1 PL398908A1 (pl) 2013-10-28
PL221356B1 true PL221356B1 (pl) 2016-03-31

Family

ID=49383795

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL398908A PL221356B1 (pl) 2012-04-21 2012-04-21 Zmodyfikowany genetycznie, rekombinowany czynnik wzrostu fibroblastów (FGF1) skoniugowany z nanocząsteczkami metalu lub tlenku metalu, jego sekwencja DNA i aminokwasowa oraz zastosowanie

Country Status (2)

Country Link
PL (1) PL221356B1 (pl)
WO (1) WO2013157973A1 (pl)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220249611A1 (en) * 2018-10-09 2022-08-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Engineered fibroblast growth factor variants as receptor antagonists

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ226543A (en) * 1987-10-22 1992-02-25 Merck & Co Inc Recombinant mutant acidic fibroblast growth factor

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013157973A1 (en) 2013-10-24
PL398908A1 (pl) 2013-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Szlachcic et al. FGF1-gold nanoparticle conjugates targeting FGFR efficiently decrease cell viability upon NIR irradiation
Yu et al. Neurotoxin-conjugated upconversion nanoprobes for direct visualization of tumors under near-infrared irradiation
JP2015530358A (ja) 細胞透過性ペプチド、それを含んだコンジュゲート、及びそれを含んだ組成物
Yang et al. Magainin II modified polydiacetylene micelles for cancer therapy
KR20140036143A (ko) 항암 융합 단백질
Shao et al. Real-time visualizing and tracing of HSV-TK/GCV suicide gene therapy by near-infrared fluorescent quantum dots
KR101836921B1 (ko) 표적 지향성 펩타이드를 포함하는 재조합 자기조립성 단백질 및 그의 용도
JP2022031824A (ja) 遺伝子操作した成長因子変異体
Pourshohod et al. Enhancement of X-ray radiotherapy by specific delivery of ZHER2 affibody-conjugated gold nanoparticles to HER2-positive malignant cells
PL221356B1 (pl) Zmodyfikowany genetycznie, rekombinowany czynnik wzrostu fibroblastów (FGF1) skoniugowany z nanocząsteczkami metalu lub tlenku metalu, jego sekwencja DNA i aminokwasowa oraz zastosowanie
Chan et al. Exploiting protein corona around gold nanoparticles conjugated to p53 activating peptides to increase the level of stable p53 proteins in cells
PL238516B1 (pl) Sposób otrzymywania modyfikowanego polipeptydu
JP5403681B2 (ja) 新規核内移行ペプチド
CN101987873A (zh) P53融合蛋白及应用
KR102395704B1 (ko) 암세포 사멸 조성물 및 이의 용도
WO2021045210A1 (ja) ペプチド内包フェリチン
WO2020234832A1 (en) Light triggerable gene editing formulation, in vivo editing method, and uses thereof
Chouman et al. Fine tuning antibody conjugation methods using SNAP-tag technology
KR20230155484A (ko) 융합 단백질의 제조 방법
Harrison Jr et al. Compositions and methods for cancer treatment using targeted carbon nanotubes
US20240294590A1 (en) Nucleic acid encoding genetically engineered growth factor variants
Yang et al. Fabrication of genetically engineered polypeptide@ quantum dots hybrid nanogels for targeted imaging
CN112375135B (zh) 一种人工表皮生长因子与设计多肽及其应用
US20090022785A1 (en) Permeable Capsules
CN117603343A (zh) 阻断bFGF的新型胶原来源天然短肽及应用