JP2967557B2 - ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼｃＤＮＡ、その細菌中での発現及び酵素活性ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼの回収方法 - Google Patents
ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼｃＤＮＡ、その細菌中での発現及び酵素活性ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼの回収方法Info
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Description
【０００１】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】本明細
書では種々の刊行物を参考文献として括弧内の数字で紹
介し、これら参考文献の完全目録を明細書の発明の詳細
な説明の末尾に添付した。本発明の出願された時点で当
業者に公知の技術状態を完全に理解するために、これら
参考文献の開示内容全部が本明細書に含まれるものとす
る。
書では種々の刊行物を参考文献として括弧内の数字で紹
介し、これら参考文献の完全目録を明細書の発明の詳細
な説明の末尾に添付した。本発明の出願された時点で当
業者に公知の技術状態を完全に理解するために、これら
参考文献の開示内容全部が本明細書に含まれるものとす
る。
【０００２】スーパーオキシドジスムターゼ(SOD) と酸
素遊離ラジカル(O2 - ) の現象とは1968年にMcCord及び
Fridovich(1)によって発見された。スーパーオキシドラ
ジカル及びその他の高度に反応性の酸素種は全ての呼吸
細胞中で種々の高分子及び細胞成分に対する酸化性損傷
の副生物として産生される（参考文献2,3 ）。スーパー
オキシドジスムターゼとして公知の金属タンパク質のグ
ループは酸化還元反応２Ｏ2 - ＋２Ｈ+ →Ｈ2 Ｏ2 ＋Ｏ
2 を触媒し酸素毒性に対する防御メカニズムを与える。
素遊離ラジカル(O2 - ) の現象とは1968年にMcCord及び
Fridovich(1)によって発見された。スーパーオキシドラ
ジカル及びその他の高度に反応性の酸素種は全ての呼吸
細胞中で種々の高分子及び細胞成分に対する酸化性損傷
の副生物として産生される（参考文献2,3 ）。スーパー
オキシドジスムターゼとして公知の金属タンパク質のグ
ループは酸化還元反応２Ｏ2 - ＋２Ｈ+ →Ｈ2 Ｏ2 ＋Ｏ
2 を触媒し酸素毒性に対する防御メカニズムを与える。
【０００３】異なる金属及び異なるタンパク質を含む複
数の形態のSOD が公知である。SOD中に存在する金属と
しては鉄、マンガン、銅及び亜鉛がある。公知形態のSO
D は全て同じ反応を触媒する。これら酵素は幾つかの進
化的グループで検出される。鉄を含有するスーパーオキ
シドジスムターゼは主として原核細胞中で検出される。
銅及び亜鉛を含有するスーパーオキシドジスムターゼは
実質的に全ての真核生物中で検出される(4) 。マンガン
を含有するスーパーオキシドジスムターゼは微生物から
ヒトまでの生物中に検出された。
数の形態のSOD が公知である。SOD中に存在する金属と
しては鉄、マンガン、銅及び亜鉛がある。公知形態のSO
D は全て同じ反応を触媒する。これら酵素は幾つかの進
化的グループで検出される。鉄を含有するスーパーオキ
シドジスムターゼは主として原核細胞中で検出される。
銅及び亜鉛を含有するスーパーオキシドジスムターゼは
実質的に全ての真核生物中で検出される(4) 。マンガン
を含有するスーパーオキシドジスムターゼは微生物から
ヒトまでの生物中に検出された。
【０００４】全ての生体高分子は過剰のスーパーオキシ
ドラジカルの損傷作用の標的となり得るので、SOD の潜
在的治療能力の研究が盛んになって来ている。科学文献
はSOD の臨床用途が広いことを示唆している。これら
は、発癌及び腫瘍増殖の阻止、抗癌剤の細胞薬害及び心
臓薬害の低減(10)、虚血組織の保護(12)及び精子の保護
(13)を含む。更に、老化過程でのSOD の効果の研究も重
要である(14)。
ドラジカルの損傷作用の標的となり得るので、SOD の潜
在的治療能力の研究が盛んになって来ている。科学文献
はSOD の臨床用途が広いことを示唆している。これら
は、発癌及び腫瘍増殖の阻止、抗癌剤の細胞薬害及び心
臓薬害の低減(10)、虚血組織の保護(12)及び精子の保護
(13)を含む。更に、老化過程でのSOD の効果の研究も重
要である(14)。
【０００５】しかし乍らヒトSOD が少量しか入手できな
いことがヒトSOD の治療能力に関する研究の主な障害に
なっている。
いことがヒトSOD の治療能力に関する研究の主な障害に
なっている。
【０００６】スーパーオキシドジスムターゼはまたその
抗炎症特性のために重要である(11)。ウシ由来のスーパ
ーオキシドジスムターゼ（オルゴテイン）は抗炎症特性
をもつことが認められておりヨーロッパの一部でヒト用
の薬剤として市販されている。また、米国では、特に炎
症を起こしたウマの腱を治療する獣医薬として販売され
ている。しかし乍らオルゴテインの供給量も限られてい
る。ウシ又はその他の動物細胞からの回収を含めて従来
技術には重大な制約があり、このような細胞から得られ
たオルゴテインはヒト由来でないためヒトではアレルギ
ー反応を起こす可能性もある。
抗炎症特性のために重要である(11)。ウシ由来のスーパ
ーオキシドジスムターゼ（オルゴテイン）は抗炎症特性
をもつことが認められておりヨーロッパの一部でヒト用
の薬剤として市販されている。また、米国では、特に炎
症を起こしたウマの腱を治療する獣医薬として販売され
ている。しかし乍らオルゴテインの供給量も限られてい
る。ウシ又はその他の動物細胞からの回収を含めて従来
技術には重大な制約があり、このような細胞から得られ
たオルゴテインはヒト由来でないためヒトではアレルギ
ー反応を起こす可能性もある。
【０００７】銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ(CuZ
n SOD)は種々の形態のスーパーオキシドジスムターゼの
うちで最も研究が進み、その特性も最も解明されてい
る。
n SOD)は種々の形態のスーパーオキシドジスムターゼの
うちで最も研究が進み、その特性も最も解明されてい
る。
【０００８】ヒトCuZn SODは、非共有的に結合した同一
のサブユニットから成り、各サブユニットが分子量16,0
00ダルトンで銅１原子と亜鉛１原子とを含む二量体金属
タンパク質である(5) 。各サブユニットは153 個のアミ
ノ酸から成りその配列は解明されている(6,7) 。
のサブユニットから成り、各サブユニットが分子量16,0
00ダルトンで銅１原子と亜鉛１原子とを含む二量体金属
タンパク質である(5) 。各サブユニットは153 個のアミ
ノ酸から成りその配列は解明されている(6,7) 。
【０００９】ヒトCuZnスーパーオキシドジスムターゼを
コードするcDNAがクローニングされた(8) 。クローン化
DNA の全配列も決定された(9) 。更に、細菌中でスーパ
ーオキシドジスムターゼを産生及び回収するためのスー
パーオキシドジスムターゼをコードするDNA を含む発現
ベクターも記載されている(24,25) 。スーパーオキシド
ジスムターゼDNA の発現及びその酵母中でのSOD の産生
も開示された(26)。
コードするcDNAがクローニングされた(8) 。クローン化
DNA の全配列も決定された(9) 。更に、細菌中でスーパ
ーオキシドジスムターゼを産生及び回収するためのスー
パーオキシドジスムターゼをコードするDNA を含む発現
ベクターも記載されている(24,25) 。スーパーオキシド
ジスムターゼDNA の発現及びその酵母中でのSOD の産生
も開示された(26)。
【００１０】最近、ヒト染色体21上のCuZn SOD遺伝子座
が決定され(27)、CuZnスーパーオキシドジスムターゼに
関する最近の研究成果がまとめられた(28)。
が決定され(27)、CuZnスーパーオキシドジスムターゼに
関する最近の研究成果がまとめられた(28)。
【００１１】マンガンスーパージスムターゼ(MnSOD) に
ついてはまだ未知の部分が多い。大腸菌(E.coli )K-12
のMnSOD が最近クローニングされその地図が作成された
(22)。Barra 等はヒト肝臓細胞から単離されたMnSOD ポ
リペプチドの196 個のアミノ酸配列を開示している(1
9)。しかし乍ら従来技術の開示では、MnSOD 分子の構造
について、特に該構造の同一のポリペプチドサブユニッ
トが２つであるか４つであるかについて意見が分かれて
いる(19,23) 。しかし乍ら、MnSOD ポリペプチドとCuZn
SOD ポリペプチドとが相同でないことについては一致し
ている(19)。種々のソースからのMnSOD とFeSOD とのア
ミノ酸配列の相同性も比較されている(18)。
ついてはまだ未知の部分が多い。大腸菌(E.coli )K-12
のMnSOD が最近クローニングされその地図が作成された
(22)。Barra 等はヒト肝臓細胞から単離されたMnSOD ポ
リペプチドの196 個のアミノ酸配列を開示している(1
9)。しかし乍ら従来技術の開示では、MnSOD 分子の構造
について、特に該構造の同一のポリペプチドサブユニッ
トが２つであるか４つであるかについて意見が分かれて
いる(19,23) 。しかし乍ら、MnSOD ポリペプチドとCuZn
SOD ポリペプチドとが相同でないことについては一致し
ている(19)。種々のソースからのMnSOD とFeSOD とのア
ミノ酸配列の相同性も比較されている(18)。
【００１２】Baret 等はラットモデルに於いて、ヒトMn
SOD の半減期がヒトCuSOD の半減期より実質的に長いこ
とを開示している。彼等はまた、ラットモデルに於い
て、ヒトMnSOD とラット銅SOD とは抗炎症剤として有効
でないが、ウシCuSOD とヒトCuSOD とが完全に有効であ
ることを開示している(20)。
SOD の半減期がヒトCuSOD の半減期より実質的に長いこ
とを開示している。彼等はまた、ラットモデルに於い
て、ヒトMnSOD とラット銅SOD とは抗炎症剤として有効
でないが、ウシCuSOD とヒトCuSOD とが完全に有効であ
ることを開示している(20)。
【００１３】McCord等は、in vitro試験では天然産生ヒ
トマンガンスーパーオキシドジスムターゼが食作用を行
なうヒト多形核(PMN) 白血球をウシ又はブタのCuZnスー
パーオキシドジスムターゼよりも十分にスーパーオキシ
ド遊離ラジカルから保護することを開示している(21)。
トマンガンスーパーオキシドジスムターゼが食作用を行
なうヒト多形核(PMN) 白血球をウシ又はブタのCuZnスー
パーオキシドジスムターゼよりも十分にスーパーオキシ
ド遊離ラジカルから保護することを開示している(21)。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明はヒトマンガンス
ーパーオキシドジスムターゼポリペプチドもしくはその
類似体又はそれらの突然変異体をコードするcDNA分子の
調製に係る。本発明はまた、該cDNAを有効な細菌発現ベ
クターに挿入し、細菌中にヒトMnSOD ポリペプチド、そ
の類似体、その突然変異体及び酵素を産生し、細菌産生
ヒトMnSOD ポリペプチド、その類似体、その突然変異体
又は酵素を回収することを目的とする。本発明はまた、
このように回収されたヒトMnSOD ポリペプチド、その類
似体又はその突然変異体とそれらの使用とに係る。
ーパーオキシドジスムターゼポリペプチドもしくはその
類似体又はそれらの突然変異体をコードするcDNA分子の
調製に係る。本発明はまた、該cDNAを有効な細菌発現ベ
クターに挿入し、細菌中にヒトMnSOD ポリペプチド、そ
の類似体、その突然変異体及び酵素を産生し、細菌産生
ヒトMnSOD ポリペプチド、その類似体、その突然変異体
又は酵素を回収することを目的とする。本発明はまた、
このように回収されたヒトMnSOD ポリペプチド、その類
似体又はその突然変異体とそれらの使用とに係る。
【００１５】本発明は更に、細菌中での酵素活性ヒトMn
SOD の産生方法及びこのような酵素活性ヒトMnSOD の回
収及び精製方法に係る。
SOD の産生方法及びこのような酵素活性ヒトMnSOD の回
収及び精製方法に係る。
【００１６】本発明はまた、スーパーオキシドラジカル
が過酸化水素と分子酸素とに還元されるときの触媒の機
能を果たすヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ
もしくはその類似体又はそれらの突然変異体の使用に係
る。特に、本発明は虚血後の再潅流傷害を低減し、摘出
単離器官の生存期間を延長するための細菌産生MnSODも
しくはその類似体又はそれらの突然変異体の使用に係
る。本発明はまた、炎症治療のための細菌産生MnSOD も
しくはその類似体又はそれらの突然変異体の使用に係
る。
が過酸化水素と分子酸素とに還元されるときの触媒の機
能を果たすヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ
もしくはその類似体又はそれらの突然変異体の使用に係
る。特に、本発明は虚血後の再潅流傷害を低減し、摘出
単離器官の生存期間を延長するための細菌産生MnSODも
しくはその類似体又はそれらの突然変異体の使用に係
る。本発明はまた、炎症治療のための細菌産生MnSOD も
しくはその類似体又はそれらの突然変異体の使用に係
る。
【００１７】
【発明の実施の形態】ヒトマンガンスーパーオキシドジ
スムターゼポリペプチドもしくはその類似体又はそれら
の突然変異体をコードするcDNAを含むDNA 分子がヒトT-
細胞ライブラリーから単離された。ヒトマンガンスーパ
ーオキシドジスムターゼポリペプチドもしくはその類似
体又はそれらの突然変異体をコードする二重鎖のヌクレ
オチド配列が発見された。該ポリペプチドもしくはその
類似体をコードする１つの鎖の配列は第１図のヌクレオ
チド115 から下流にヌクレオチド708 までの配列であ
る。類似体又はそれらの突然変異体をコードする別の配
列は該ポリペプチドをコードする鎖と実質的に同様であ
ろう。24個のアミノ酸プレペプチドをコードする二重鎖
DNA 分子の１つの鎖のヌクレオチド配列は同じく第１図
にヌクレオチド43からヌクレオチド114 で示される。
スムターゼポリペプチドもしくはその類似体又はそれら
の突然変異体をコードするcDNAを含むDNA 分子がヒトT-
細胞ライブラリーから単離された。ヒトマンガンスーパ
ーオキシドジスムターゼポリペプチドもしくはその類似
体又はそれらの突然変異体をコードする二重鎖のヌクレ
オチド配列が発見された。該ポリペプチドもしくはその
類似体をコードする１つの鎖の配列は第１図のヌクレオ
チド115 から下流にヌクレオチド708 までの配列であ
る。類似体又はそれらの突然変異体をコードする別の配
列は該ポリペプチドをコードする鎖と実質的に同様であ
ろう。24個のアミノ酸プレペプチドをコードする二重鎖
DNA 分子の１つの鎖のヌクレオチド配列は同じく第１図
にヌクレオチド43からヌクレオチド114 で示される。
【００１８】ヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼポリペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然変
異体をコードする配列をもつヌクレオチド鎖を含む二重
鎖DNA 分子又はその他の任意の二重鎖DNA をプラスミド
又はウィルスの如きクローニングベヒクルに組み込んで
もよい。いずれのDNA 分子も、原核細胞例えば細菌又は
真核細胞例えば酵母もしくは哺乳動物に公知方法で導入
され得る。この公知方法はいずれかの分子を含むクロー
ニングベヒクルを使用する方法でもよいがこの方法に限
定はされない。
ゼポリペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然変
異体をコードする配列をもつヌクレオチド鎖を含む二重
鎖DNA 分子又はその他の任意の二重鎖DNA をプラスミド
又はウィルスの如きクローニングベヒクルに組み込んで
もよい。いずれのDNA 分子も、原核細胞例えば細菌又は
真核細胞例えば酵母もしくは哺乳動物に公知方法で導入
され得る。この公知方法はいずれかの分子を含むクロー
ニングベヒクルを使用する方法でもよいがこの方法に限
定はされない。
【００１９】好ましくはヒトマンガンスーパーオキシド
ジスムターゼポリペプチドもしくはその類似体又はそれ
らの突然変異体をコードするcDNA又はDNA をプラスミド
例えばpMSE-4又はpMS ΔRB4 に組み込んで、次にDNA が
発現できる適当な宿主細胞に導入し、ヒトマンガンスー
パーオキシドジスムターゼ(hMnSOD)ポリペプチドもしく
はその類似体又はそれらの突然変異体を産生する。好ま
しい宿主細胞は大腸菌(Escherichia coli ) 、特に大腸
菌A4255 株及び大腸菌A1645 株である。大腸菌A4255 株
中のプラスミドpMSE-4はAmerican Type Culture Collec
tionにATCC受託番号No.53250で寄託された。プラスミド
pMS ΔRB4 は第４図に示し図面に関する説明に記載のご
とく調製され得る。
ジスムターゼポリペプチドもしくはその類似体又はそれ
らの突然変異体をコードするcDNA又はDNA をプラスミド
例えばpMSE-4又はpMS ΔRB4 に組み込んで、次にDNA が
発現できる適当な宿主細胞に導入し、ヒトマンガンスー
パーオキシドジスムターゼ(hMnSOD)ポリペプチドもしく
はその類似体又はそれらの突然変異体を産生する。好ま
しい宿主細胞は大腸菌(Escherichia coli ) 、特に大腸
菌A4255 株及び大腸菌A1645 株である。大腸菌A4255 株
中のプラスミドpMSE-4はAmerican Type Culture Collec
tionにATCC受託番号No.53250で寄託された。プラスミド
pMS ΔRB4 は第４図に示し図面に関する説明に記載のご
とく調製され得る。
【００２０】かかるDNA 分子が導入された細胞を、DNA
をmRNAに転写しmRNAをタンパク質として発現させ得る適
当な条件下で当業者に公知の方法で培養又は増殖させ
る。得られたマンガンスーパーオキシドジスムターゼタ
ンパク質を回収する。
をmRNAに転写しmRNAをタンパク質として発現させ得る適
当な条件下で当業者に公知の方法で培養又は増殖させ
る。得られたマンガンスーパーオキシドジスムターゼタ
ンパク質を回収する。
【００２１】ヒトMnSOD もしくはその類似体又はそれら
の突然変異体と適当な担体とを含む獣医薬又は医薬組成
物を調製することも可能である。このヒトマンガンスー
パーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又はそれ
らの突然変異体は以下の反応を触媒するために使用され
得る。
の突然変異体と適当な担体とを含む獣医薬又は医薬組成
物を調製することも可能である。このヒトマンガンスー
パーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又はそれ
らの突然変異体は以下の反応を触媒するために使用され
得る。
【００２２】２Ｏ2 - ＋２Ｈ+ →Ｈ2 Ｏ2 ＋Ｏ2
これによりスーパーオキシドラジカルによって生じる細
胞傷害が低減する。
胞傷害が低減する。
【００２３】より特定的には、これら酵素もしくはその
類似体又はそれらの突然変異体は、虚血後の再潅流によ
って生じる傷害を低減するため、摘出単離器官の生存時
間を延長するため又は炎症治療に使用され得る。
類似体又はそれらの突然変異体は、虚血後の再潅流によ
って生じる傷害を低減するため、摘出単離器官の生存時
間を延長するため又は炎症治療に使用され得る。
【００２４】本発明の目的は、酵素活性ヒトマンガンス
ーパーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又はそ
れらの突然変異体を細菌細胞中で産生する方法を提供す
ることである。細菌細胞は、マンガンスーパーオキシド
ジスムターゼもしくはその類似体又はそれらの突然変異
体をコードするDNA 配列を含み該配列を発現し得る。本
発明方法では、細菌細胞を適当な産生培地中で適当な条
件下に維持する。培地中で細胞が利用できるMn2+の濃度
が約2ppmを上回るように産生培地にMn2+を補給する。
ーパーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又はそ
れらの突然変異体を細菌細胞中で産生する方法を提供す
ることである。細菌細胞は、マンガンスーパーオキシド
ジスムターゼもしくはその類似体又はそれらの突然変異
体をコードするDNA 配列を含み該配列を発現し得る。本
発明方法では、細菌細胞を適当な産生培地中で適当な条
件下に維持する。培地中で細胞が利用できるMn2+の濃度
が約2ppmを上回るように産生培地にMn2+を補給する。
【００２５】本発明の好適具体例に於いて、細菌細胞は
ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチ
ドをコードするDNA 配列を含むプラスミド、例えばpMSE
-4又はpMS RB4 を含む大腸菌細胞、例えば大腸菌A4255
株である。産生培地中のMn2+の濃度範囲は約50ppm 〜約
1500ppm であり、好ましくは150ppm及び750ppmである。
ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチ
ドをコードするDNA 配列を含むプラスミド、例えばpMSE
-4又はpMS RB4 を含む大腸菌細胞、例えば大腸菌A4255
株である。産生培地中のMn2+の濃度範囲は約50ppm 〜約
1500ppm であり、好ましくは150ppm及び750ppmである。
【００２６】本発明は更に、マンガンスーパーオキシド
ジスムターゼもしくはその類似体又はそれらの突然変異
体を含有細菌細胞から回収する方法に係る。ヒトマンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又
はそれらの突然変異体を含む細胞中に存在するタンパク
質を含むタンパク質画分を回収すべく細胞を先ず処理
し、次にタンパク質画分を処理してヒトマンガンスーパ
ーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又はそれら
の突然変異体を回収する。本発明の好適具体例に於いて
は、細胞を先ず処理して不溶タンパク質と細胞壁破片と
から可溶タンパク質を分離し、次に可溶タンパク質を回
収する。次に可溶タンパク質を処理して、hMnSODもしく
はその類似体又はそれらの突然変異体を含む可溶タンパ
ク質の画分を分離例えば沈澱させ、hMnSODもしくはその
類似体又はそれらの突然変異体を含む画分を回収する。
回収した可溶タンパク質画分を次に処理してヒトマンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼ又はその類似体を分離
回収する。
ジスムターゼもしくはその類似体又はそれらの突然変異
体を含有細菌細胞から回収する方法に係る。ヒトマンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又
はそれらの突然変異体を含む細胞中に存在するタンパク
質を含むタンパク質画分を回収すべく細胞を先ず処理
し、次にタンパク質画分を処理してヒトマンガンスーパ
ーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又はそれら
の突然変異体を回収する。本発明の好適具体例に於いて
は、細胞を先ず処理して不溶タンパク質と細胞壁破片と
から可溶タンパク質を分離し、次に可溶タンパク質を回
収する。次に可溶タンパク質を処理して、hMnSODもしく
はその類似体又はそれらの突然変異体を含む可溶タンパ
ク質の画分を分離例えば沈澱させ、hMnSODもしくはその
類似体又はそれらの突然変異体を含む画分を回収する。
回収した可溶タンパク質画分を次に処理してヒトマンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼ又はその類似体を分離
回収する。
【００２７】より好ましい方法によれば、ヒトマンガン
スーパーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又は
それらの突然変異体を含有する細菌細胞からヒトマンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又
はそれらの突然変異体を回収する。該方法では先ず産生
培地から細菌細胞を単離し、pH約 7.0〜8.0 の適当な溶
液に懸濁させる。次に細胞を破壊し遠心して得られた上
清を55〜65℃で約30〜120 分間、好ましくは58〜62℃で
45〜75分間、より好ましくは60℃で１時間加熱し、10℃
未満好ましくは約４℃まで冷却する。形成された沈澱物
を例えば遠心によって完全に除去し、冷却された上清を
適当なバッファ、例えばpH約7.8 の2mM燐酸カリウムバ
ッファに透析する。好ましくは30K より小さい濾過膜を
使用し限外濾過によって透析する。透析と同時又は透析
後に、冷却した上清を適当な容量、例えば初期容量の0.
03まで任意に濃縮してもよい。保持物(retentate) を適
当なバッファ溶液例えばpH約7.8 の20mM以上の燐酸カリ
ウムバッファ溶液でアニオン交換クロマトグラフィーカ
ラムから溶出する。スーパーオキシドジスムターゼを含
む溶出物の画分を収集し、プールし、pH5.5 の約40mMの
酢酸カリウムに透析する。透析したプール画分をpH5.5
の約40〜約200mM の酢酸カリウムの直線濃度勾配をもつ
カチオン交換クロマトグラフィーカラムで溶出する。ス
ーパーオキシドジスムターゼを含むピーク画分を収集
し、プールする。プールしたピーク画分を任意に適当な
溶液、例えば水又はpH約7.8 の約10mM燐酸カリウムバッ
ファのバッファ溶液に透析する。
スーパーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又は
それらの突然変異体を含有する細菌細胞からヒトマンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又
はそれらの突然変異体を回収する。該方法では先ず産生
培地から細菌細胞を単離し、pH約 7.0〜8.0 の適当な溶
液に懸濁させる。次に細胞を破壊し遠心して得られた上
清を55〜65℃で約30〜120 分間、好ましくは58〜62℃で
45〜75分間、より好ましくは60℃で１時間加熱し、10℃
未満好ましくは約４℃まで冷却する。形成された沈澱物
を例えば遠心によって完全に除去し、冷却された上清を
適当なバッファ、例えばpH約7.8 の2mM燐酸カリウムバ
ッファに透析する。好ましくは30K より小さい濾過膜を
使用し限外濾過によって透析する。透析と同時又は透析
後に、冷却した上清を適当な容量、例えば初期容量の0.
03まで任意に濃縮してもよい。保持物(retentate) を適
当なバッファ溶液例えばpH約7.8 の20mM以上の燐酸カリ
ウムバッファ溶液でアニオン交換クロマトグラフィーカ
ラムから溶出する。スーパーオキシドジスムターゼを含
む溶出物の画分を収集し、プールし、pH5.5 の約40mMの
酢酸カリウムに透析する。透析したプール画分をpH5.5
の約40〜約200mM の酢酸カリウムの直線濃度勾配をもつ
カチオン交換クロマトグラフィーカラムで溶出する。ス
ーパーオキシドジスムターゼを含むピーク画分を収集
し、プールする。プールしたピーク画分を任意に適当な
溶液、例えば水又はpH約7.8 の約10mM燐酸カリウムバッ
ファのバッファ溶液に透析する。
【００２８】本発明はまた、本発明の方法で産生され精
製された酵素活性ヒトマンガンスーパーオキシドジスム
ターゼもしくはその類似体例えばmet-hMnSOD又はそれら
の突然変異体に係る。
製された酵素活性ヒトマンガンスーパーオキシドジスム
ターゼもしくはその類似体例えばmet-hMnSOD又はそれら
の突然変異体に係る。
【００２９】図面の説明
第１図。ヒトMnSODcDNA の配列
第１図はヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼを
コードする二重鎖DNA分子の1 つの鎖のヌクレオチド配
列と該DNA 配列に対応するヒトMnSOD の198 個のアミノ
酸配列とを示す。第１図はまた、24個のアミノ酸から成
る、成熟ヒトMnSOD に対するプレペプチドをコードする
二重鎖DNA 分子の1 つの鎖のヌクレオチド配列と該DNA
配列に対応するアミノ酸配列とを示す。また5'及び3'の
未翻訳配列を示す。
コードする二重鎖DNA分子の1 つの鎖のヌクレオチド配
列と該DNA 配列に対応するヒトMnSOD の198 個のアミノ
酸配列とを示す。第１図はまた、24個のアミノ酸から成
る、成熟ヒトMnSOD に対するプレペプチドをコードする
二重鎖DNA 分子の1 つの鎖のヌクレオチド配列と該DNA
配列に対応するアミノ酸配列とを示す。また5'及び3'の
未翻訳配列を示す。
【００３０】第２図。pMSE-4: ヒトMnSOD 発現プラスミ
ドの構築 Eco R Ｉ(R1 ) インサートにMnSOD を含むプラスミドpM
S8-4をNde ＩとNar Ｉ制限酵素で完全消化した。大きい
断片を単離し第２図に示すように合成オリゴマーと結合
した。得られたプラスミドpMS8-NN はATG 開始コドンの
直後に成熟MnSOD のコード領域を含む。このプラスミド
をEco R Ｉで消化し、Polymerase ＩのKlenow断片で末端
を充填し、 更にNde Ｉで開裂した。MnSOD 遺伝子を担持
する小さい断片をNde ＩとStu Ｉとによって処理したpS
ODα13に挿入した。pSODα13は、1984年8 月27日出願の
米国特許出願第644245号に開示された方法で得られる。
該特許出願は本明細書に含まれるものとする。この結果
得られたプラスミドpMSE-4はλＰL プロモータのコント
ロール下でcII リボソーム結合部位の直後にMnSODコー
ド領域を含む。プラスミドpMSE-4はAmerican Type Cult
ure CollectionにATCC受託番号No.53250で寄託されてい
る。
ドの構築 Eco R Ｉ(R1 ) インサートにMnSOD を含むプラスミドpM
S8-4をNde ＩとNar Ｉ制限酵素で完全消化した。大きい
断片を単離し第２図に示すように合成オリゴマーと結合
した。得られたプラスミドpMS8-NN はATG 開始コドンの
直後に成熟MnSOD のコード領域を含む。このプラスミド
をEco R Ｉで消化し、Polymerase ＩのKlenow断片で末端
を充填し、 更にNde Ｉで開裂した。MnSOD 遺伝子を担持
する小さい断片をNde ＩとStu Ｉとによって処理したpS
ODα13に挿入した。pSODα13は、1984年8 月27日出願の
米国特許出願第644245号に開示された方法で得られる。
該特許出願は本明細書に含まれるものとする。この結果
得られたプラスミドpMSE-4はλＰL プロモータのコント
ロール下でcII リボソーム結合部位の直後にMnSODコー
ド領域を含む。プラスミドpMSE-4はAmerican Type Cult
ure CollectionにATCC受託番号No.53250で寄託されてい
る。
【００３１】第３図。大腸菌中で産生されたSOD の活性
に対するMn 2+の濃度の影響 第３図のチャート図は、非誘発条件（32℃）及び誘発条
件（42℃）下でプラスミドpMSE-4を含む大腸菌A4255 株
によって産生された組換体可溶性MnSOD の比活性（単位
／mg）と増殖培地中のMn2+濃度(ppm) との相関関係を示
す。
に対するMn 2+の濃度の影響 第３図のチャート図は、非誘発条件（32℃）及び誘発条
件（42℃）下でプラスミドpMSE-4を含む大腸菌A4255 株
によって産生された組換体可溶性MnSOD の比活性（単位
／mg）と増殖培地中のMn2+濃度(ppm) との相関関係を示
す。
【００３２】第４図。pMS RB4:ヒトMnSOD 発現プラスミ
ドの構築 pSODβ1 T-11 をEco R Ｉで完全消化しBam H Ｉ制限酵
素で部分開裂することによって TetR 発現ベクターp Δ
RBを調製した。pSODβ1 T-11はAmerican TypeCulture C
ollection(ATCC)に受託番号No.53468で寄託されてい
る。消化されたプラスミドを合成オリゴマー 5'-AATTCCCGGGTCTAGATCT-3' 3'- GGGCCCAGATCTAGACTAG-5' と結合しλＰL プロモータを含むp ΔRBを調製した。
ドの構築 pSODβ1 T-11 をEco R Ｉで完全消化しBam H Ｉ制限酵
素で部分開裂することによって TetR 発現ベクターp Δ
RBを調製した。pSODβ1 T-11はAmerican TypeCulture C
ollection(ATCC)に受託番号No.53468で寄託されてい
る。消化されたプラスミドを合成オリゴマー 5'-AATTCCCGGGTCTAGATCT-3' 3'- GGGCCCAGATCTAGACTAG-5' と結合しλＰL プロモータを含むp ΔRBを調製した。
【００３３】cII リボソーム結合部位と成熟酵素の完全
コード配列とを含むMnSOD 発現プラスミドpMSE-4のEco
R Ｉ断片をp ΔRBの単一Eco R Ｉ部位に挿入した。得ら
れたプラスミドpMS ΔRB4 はλＰL のコントロール下の
MnSOD 遺伝子とcII RBS を含みテトラサイクリン耐性で
あった。
コード配列とを含むMnSOD 発現プラスミドpMSE-4のEco
R Ｉ断片をp ΔRBの単一Eco R Ｉ部位に挿入した。得ら
れたプラスミドpMS ΔRB4 はλＰL のコントロール下の
MnSOD 遺伝子とcII RBS を含みテトラサイクリン耐性で
あった。
【００３４】詳細な説明
ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチ
ドもしくはその類似体又はそれらの突然変異体をコード
するcDNAを含む二重鎖DNA 分子がヒトT-細胞DNA ライブ
ラリーから単離された。ヒトマンガンスーパーオキシド
ジスムターゼポリペプチドもしくはその類似体又はそれ
らの突然変異体をコードする二重鎖DNA分子のヌクレオ
チド配列が発見された。ヒトマンガンスーパーオキシド
ジスムターゼポリペプチドもしくはその類似体をコード
するDNA 分子の１つの鎖の配列は第１図に示されており
ヌクレオチド115 から708 までを含む。hMnSOD類似体又
はそれらの突然変異体をコードする１つの鎖の配列はhM
nSODポリペプチドをコードする鎖に実質的に等しい。ヒ
トマンガンスーパーオキシドジスムターゼのプレペプチ
ドのヌクレオチド配列も第１図に示されている。ヌクレ
オチド43から114 までがこのプレペプチドをコードす
る。
ドもしくはその類似体又はそれらの突然変異体をコード
するcDNAを含む二重鎖DNA 分子がヒトT-細胞DNA ライブ
ラリーから単離された。ヒトマンガンスーパーオキシド
ジスムターゼポリペプチドもしくはその類似体又はそれ
らの突然変異体をコードする二重鎖DNA分子のヌクレオ
チド配列が発見された。ヒトマンガンスーパーオキシド
ジスムターゼポリペプチドもしくはその類似体をコード
するDNA 分子の１つの鎖の配列は第１図に示されており
ヌクレオチド115 から708 までを含む。hMnSOD類似体又
はそれらの突然変異体をコードする１つの鎖の配列はhM
nSODポリペプチドをコードする鎖に実質的に等しい。ヒ
トマンガンスーパーオキシドジスムターゼのプレペプチ
ドのヌクレオチド配列も第１図に示されている。ヌクレ
オチド43から114 までがこのプレペプチドをコードす
る。
【００３５】ヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼポリペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然変
異体をコードするcDNAを調製しDNA の配列を決定する方
法は当業者に公知であり詳細に後述する。更に、ヒトマ
ンガンスーパーオキシドジスムターゼをコードするDNA
配列が発見されたので、この配列部分を含むDNA 分子を
調製するために公知の合成方法を使用し得る。
ゼポリペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然変
異体をコードするcDNAを調製しDNA の配列を決定する方
法は当業者に公知であり詳細に後述する。更に、ヒトマ
ンガンスーパーオキシドジスムターゼをコードするDNA
配列が発見されたので、この配列部分を含むDNA 分子を
調製するために公知の合成方法を使用し得る。
【００３６】従来のクローニングベヒクル例えばpBR322
の如きプラスミド、ウィルス又は例えばλの如きバクテ
リオファージはヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼポリペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然
変異体をコードするcDNAを含む新規なクローニングベヒ
クルを産生するように公知方法によって修飾及び操作さ
れ得る。同様にかかるクローニングベヒクルは、１つの
鎖が第１図に示すヒトマンガンスーパーオキシドジスム
ターゼポリペプチドの配列をもつ断片又はこれと実質的
に等しい断片を含むDNA 分子を含むように修飾又は操作
され得る。挿入されるDNA 分子は酵素合成又は化学合成
の如き種々の方法によって調製され得る。
の如きプラスミド、ウィルス又は例えばλの如きバクテ
リオファージはヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼポリペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然
変異体をコードするcDNAを含む新規なクローニングベヒ
クルを産生するように公知方法によって修飾及び操作さ
れ得る。同様にかかるクローニングベヒクルは、１つの
鎖が第１図に示すヒトマンガンスーパーオキシドジスム
ターゼポリペプチドの配列をもつ断片又はこれと実質的
に等しい断片を含むDNA 分子を含むように修飾又は操作
され得る。挿入されるDNA 分子は酵素合成又は化学合成
の如き種々の方法によって調製され得る。
【００３７】得られたクローニングベヒクルは、天然に
は産生しない化学物質であり、一般にDNA 組換技術と指
称される最新の技術でしか調製できない。好ましくはク
ローニングベヒクルはプラスミド、例えばpMSE-4又はpM
S ΔRB4 である。これらクローニングベヒクルは形質転
換、トランスフェクション等の当業者に公知の技術を使
用し原核細胞例えば細菌（大腸菌、枯草菌）に導入され
てもよく、又は真核細胞例えば酵母もしくは哺乳動物に
導入されてもよい。従って、クローニングベヒクルが導
入される細胞はクローニングベヒクル中にcDNAが存在す
るときはヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポ
リペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然変異体
をコードするcDNAを含み、クローニングベヒクル中にDN
A が存在するときはそのDNA の１つの鎖の全部又は一部
が第１図のヒトMnSOD ポリペプチドの配列又はこれと実
質的に等しい配列を含む該DNA を含む。
は産生しない化学物質であり、一般にDNA 組換技術と指
称される最新の技術でしか調製できない。好ましくはク
ローニングベヒクルはプラスミド、例えばpMSE-4又はpM
S ΔRB4 である。これらクローニングベヒクルは形質転
換、トランスフェクション等の当業者に公知の技術を使
用し原核細胞例えば細菌（大腸菌、枯草菌）に導入され
てもよく、又は真核細胞例えば酵母もしくは哺乳動物に
導入されてもよい。従って、クローニングベヒクルが導
入される細胞はクローニングベヒクル中にcDNAが存在す
るときはヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポ
リペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然変異体
をコードするcDNAを含み、クローニングベヒクル中にDN
A が存在するときはそのDNA の１つの鎖の全部又は一部
が第１図のヒトMnSOD ポリペプチドの配列又はこれと実
質的に等しい配列を含む該DNA を含む。
【００３８】大腸菌は本発明のクローニングベヒクルの
好ましい宿主細胞である。現状で大腸菌の好ましい栄養
要求菌はプラスミドpApoE-Ex2 を含む大腸菌A1645 であ
る。該大腸菌はAmerican Type Culture Collection、Ro
ckville 、Maryland、USA にATCC受託番号No.39787で寄
託されている。本出願に記載のAmerican Type Culture
Collectionへの寄託はいずれも微生物の寄託の国際的承
認に関するブダペスト条約に従ってなされたものであ
る。
好ましい宿主細胞である。現状で大腸菌の好ましい栄養
要求菌はプラスミドpApoE-Ex2 を含む大腸菌A1645 であ
る。該大腸菌はAmerican Type Culture Collection、Ro
ckville 、Maryland、USA にATCC受託番号No.39787で寄
託されている。本出願に記載のAmerican Type Culture
Collectionへの寄託はいずれも微生物の寄託の国際的承
認に関するブダペスト条約に従ってなされたものであ
る。
【００３９】A1645 はGaｌ+ （ガラクトース発酵能）と
テトラサイクリン耐性の喪失とに基づく選択によってA1
637 から得られた。A1645 はλファージのエレメントを
維持している。その表現型は、C600ｒ- ｍ+ gal+ thr
- leu- lacZ- bｌ（λcI857 ΔH1 ΔBamH1N+ ）であ
る。
テトラサイクリン耐性の喪失とに基づく選択によってA1
637 から得られた。A1645 はλファージのエレメントを
維持している。その表現型は、C600ｒ- ｍ+ gal+ thr
- leu- lacZ- bｌ（λcI857 ΔH1 ΔBamH1N+ ）であ
る。
【００４０】A1637 はテトラサイクリン耐性遺伝子を含
むトランスポゾンをガラクトースオペロンとcIリプレッ
サー合成を生起させるエレメントを含むλファージのエ
レメントとに導入することによってc600から得られた。
C600はAmerican Type Culture CollectionからATCC受託
番号No.23724として得られる。
むトランスポゾンをガラクトースオペロンとcIリプレッ
サー合成を生起させるエレメントを含むλファージのエ
レメントとに導入することによってc600から得られた。
C600はAmerican Type Culture CollectionからATCC受託
番号No.23724として得られる。
【００４１】最小培地中で増殖するときでも高いレベル
のポリペプチドを発現し得る大腸菌の原栄養株はマンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子の
発現用宿主として更に好ましい。現在の好ましい原栄養
株はA4255 である。プラスミドpMSE-4を含むA4255 株は
American Type Culture CollectionにATCC受託番号No.5
3250で寄託されている。
のポリペプチドを発現し得る大腸菌の原栄養株はマンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子の
発現用宿主として更に好ましい。現在の好ましい原栄養
株はA4255 である。プラスミドpMSE-4を含むA4255 株は
American Type Culture CollectionにATCC受託番号No.5
3250で寄託されている。
【００４２】得られた細胞はヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼポリペプチドもしくはその類似体又は
それらの突然変異体をコードするDNA を取り込んでお
り、この細胞を当業者に公知の適当な条件下で増殖又は
培養によって適宜処理するとDNA は、そのDNA によって
コードされた遺伝情報の発現を指令する。例えばDNA が
hMnSODポリペプチドもしくはその類似体又はそれらの突
然変異体の発現を指令し、細胞はhMnSODポリペプチドも
しくはその類似体又はそれらの突然変異体を発現させ、
次にこれを回収する。
シドジスムターゼポリペプチドもしくはその類似体又は
それらの突然変異体をコードするDNA を取り込んでお
り、この細胞を当業者に公知の適当な条件下で増殖又は
培養によって適宜処理するとDNA は、そのDNA によって
コードされた遺伝情報の発現を指令する。例えばDNA が
hMnSODポリペプチドもしくはその類似体又はそれらの突
然変異体の発現を指令し、細胞はhMnSODポリペプチドも
しくはその類似体又はそれらの突然変異体を発現させ、
次にこれを回収する。
【００４３】本明細書中の「スーパーオキシドジスムタ
ーゼ(SOD) 」なる用語は、受容体としてスーパーオキシ
ド又は酸素遊離ラジカルに作用するか又は不均化反応 ２Ｏ2 - ＋２Ｈ+ →Ｏ2 ＋Ｈ2 Ｏ2 を触媒する酵素又はポリペプチドを意味する。
ーゼ(SOD) 」なる用語は、受容体としてスーパーオキシ
ド又は酸素遊離ラジカルに作用するか又は不均化反応 ２Ｏ2 - ＋２Ｈ+ →Ｏ2 ＋Ｈ2 Ｏ2 を触媒する酵素又はポリペプチドを意味する。
【００４４】本明細書中の「マンガンスーパーオキシド
ジスムターゼ(MnSOD) 」なる用語は、マンガン元素を任
意の化学的形態で含有するスーパーオキシドジスムター
ゼ分子を意味する。
ジスムターゼ(MnSOD) 」なる用語は、マンガン元素を任
意の化学的形態で含有するスーパーオキシドジスムター
ゼ分子を意味する。
【００４５】本明細書中の「ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼポリペプチド」なる用語は、198 個の
アミノ酸から成りその一部分が第１図のアミノ酸配列で
あるポリペプチドを意味する。配列のＮ末端は第１図の
ヌクレオチド 115〜117 によってコードされるリジンで
あり、配列のCOOH末端は第１図のヌクレオチド 706〜70
8 によってコードされるリジンである。
シドジスムターゼポリペプチド」なる用語は、198 個の
アミノ酸から成りその一部分が第１図のアミノ酸配列で
あるポリペプチドを意味する。配列のＮ末端は第１図の
ヌクレオチド 115〜117 によってコードされるリジンで
あり、配列のCOOH末端は第１図のヌクレオチド 706〜70
8 によってコードされるリジンである。
【００４６】本明細書中の「ポリペプチドマンガン複合
体」なる用語は、ヒトマンガンスーパーオキシドジスム
ターゼポリペプチドを任意の化学的形態のマンガンとの
複合体として含み、天然産生ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼの酵素活性をもつ分子を意味する。
体」なる用語は、ヒトマンガンスーパーオキシドジスム
ターゼポリペプチドを任意の化学的形態のマンガンとの
複合体として含み、天然産生ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼの酵素活性をもつ分子を意味する。
【００４７】本明細書中の「ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼ」なる用語は、少なくとも２つのヒト
マンガンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチドを
任意の化学的形態のマンガンとの複合体として含み、天
然産生ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼの酵
素活性をもつ分子を意味する。
シドジスムターゼ」なる用語は、少なくとも２つのヒト
マンガンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチドを
任意の化学的形態のマンガンとの複合体として含み、天
然産生ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼの酵
素活性をもつ分子を意味する。
【００４８】本明細書中の「ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼポリペプチド類似体」なる用語は、一
端又は両端に１つ以上の付加アミノ酸が結合したヒトマ
ンガンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチドを含
むポリペプチドを意味する。
シドジスムターゼポリペプチド類似体」なる用語は、一
端又は両端に１つ以上の付加アミノ酸が結合したヒトマ
ンガンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチドを含
むポリペプチドを意味する。
【００４９】本明細書中の「ポリペプチドマンガン複合
体類似体」なる用語は、一端又は両端に結合した１つ以
上の付加アミノ酸を含むポリペプチド部分をもつポリペ
プチドマンガン複合体を含む分子を意味する。
体類似体」なる用語は、一端又は両端に結合した１つ以
上の付加アミノ酸を含むポリペプチド部分をもつポリペ
プチドマンガン複合体を含む分子を意味する。
【００５０】本明細書中の「ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼ類似体」なる用語は、２つ以上のポリ
ペプチドを任意の化学的形態のマンガンとの複合体とし
て含み、ポリペプチドの少なくとも１つがヒトマンガン
スーパーオキシドジスムターゼポリペプチド類似体であ
り、天然産生ヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼの酵素活性をもつ分子を意味する。
シドジスムターゼ類似体」なる用語は、２つ以上のポリ
ペプチドを任意の化学的形態のマンガンとの複合体とし
て含み、ポリペプチドの少なくとも１つがヒトマンガン
スーパーオキシドジスムターゼポリペプチド類似体であ
り、天然産生ヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼの酵素活性をもつ分子を意味する。
【００５１】本明細書中の「ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼポリペプチド突然変異体」なる用語
は、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポリペ
プチドに実質的に等しいが１つ以上の異なるアミノ酸を
含むアミノ酸配列をもつポリペプチドを意味する。
シドジスムターゼポリペプチド突然変異体」なる用語
は、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポリペ
プチドに実質的に等しいが１つ以上の異なるアミノ酸を
含むアミノ酸配列をもつポリペプチドを意味する。
【００５２】本明細書中の「ポリペプチドマンガン複合
体突然変異体」なる用語は、ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼポリペプチド突然変異体を任意の化学
的形態のマンガンとの複合体として含みマンガンスーパ
ーオキシドジスムターゼの酵素活性をもつ分子を意味す
る。
体突然変異体」なる用語は、ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼポリペプチド突然変異体を任意の化学
的形態のマンガンとの複合体として含みマンガンスーパ
ーオキシドジスムターゼの酵素活性をもつ分子を意味す
る。
【００５３】本明細書中の「ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼ突然変異体」なる用語は、２つ以上の
ポリペプチドを任意の化学的形態のマンガンとの複合体
として含み、ポリペプチドの少なくとも１つがヒトマン
ガンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチド突然変
異体であり、天然産生ヒトマンガンスーパーオキシドジ
スムターゼの酵素活性をもつ分子を意味する。
シドジスムターゼ突然変異体」なる用語は、２つ以上の
ポリペプチドを任意の化学的形態のマンガンとの複合体
として含み、ポリペプチドの少なくとも１つがヒトマン
ガンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチド突然変
異体であり、天然産生ヒトマンガンスーパーオキシドジ
スムターゼの酵素活性をもつ分子を意味する。
【００５４】本発明の一部を構成するhMnSODポリペプチ
ド及びhMnSODの突然変異体は第１図のDNA 配列の突然変
異によって調製され得る。該配列のN 末端はヌクレオチ
ド115 〜117 によってコードされるリジンであり、該配
列のCOOH末端はヌクレオチド706 〜708 によってコード
される。
ド及びhMnSODの突然変異体は第１図のDNA 配列の突然変
異によって調製され得る。該配列のN 末端はヌクレオチ
ド115 〜117 によってコードされるリジンであり、該配
列のCOOH末端はヌクレオチド706 〜708 によってコード
される。
【００５５】DNA は当業者に公知の方法、例えばBauer
等、Gene、37:73-81(1985)の方法で突然変異させ得る。
突然変異した配列を本文に記載の適当な発現ベクターに
挿入し、これを細胞に導入し処理して突然変異DNA がhM
nSODポリペプチド突然変異体とhMnSOD突然変異体との発
現を指令する。
等、Gene、37:73-81(1985)の方法で突然変異させ得る。
突然変異した配列を本文に記載の適当な発現ベクターに
挿入し、これを細胞に導入し処理して突然変異DNA がhM
nSODポリペプチド突然変異体とhMnSOD突然変異体との発
現を指令する。
【００５６】ヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼの酵素活性形態は、少なくとも２つ、場合によっては
４つの等しいサブユニットをもつタンパク質であり、サ
ブユニットの各々が第１図のヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼの配列中のほぼ198 個のアミノ酸をも
ち、配列のＮ末端が第１図のヌクレオチド115 〜117で
コードされるリジンであり、配列のCOOH末端が第１図の
ヌクレオチド706 〜708 でコードされるリジンであると
推定される。
ゼの酵素活性形態は、少なくとも２つ、場合によっては
４つの等しいサブユニットをもつタンパク質であり、サ
ブユニットの各々が第１図のヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼの配列中のほぼ198 個のアミノ酸をも
ち、配列のＮ末端が第１図のヌクレオチド115 〜117で
コードされるリジンであり、配列のCOOH末端が第１図の
ヌクレオチド706 〜708 でコードされるリジンであると
推定される。
【００５７】ヒトMnSOD もしくはその類似体又はそれら
の突然変異体はヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼもしくはその類似体又はそれらの突然変異体をコー
ドするDNA 又はcDNAを導入した細胞から調製される。こ
のヒトMnSOD もしくはその類似体又はそれらの突然変異
体は陽子の存在下でスーパーオキシドアニオンの不均化
反応又は一価還元によって式
の突然変異体はヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼもしくはその類似体又はそれらの突然変異体をコー
ドするDNA 又はcDNAを導入した細胞から調製される。こ
のヒトMnSOD もしくはその類似体又はそれらの突然変異
体は陽子の存在下でスーパーオキシドアニオンの不均化
反応又は一価還元によって式
【００５８】
【化１】
【００５９】で示される過酸化水素を形成する反応を触
媒する。
媒する。
【００６０】有効量のhMnSOD又は１種類以上のhMnSOD類
似体又はそれらの突然変異体と適当な担体とを含有する
獣医薬及び医薬組成物の調製も可能である。かかる担体
は当業者に公知である。hMnSODもしくはその類似体又は
それらの突然変異体は、炎症にかかった患者を治療する
ため又は虚血もしくは臓器移植後の再潅流のときの酸素
遊離ラジカルによる患者に対する傷害を低減するために
動物又はヒト患者に直接に又は適した組成物の形態で投
与することができる。hMnSODもしくはその類似体又はそ
れらの突然変異体はまた、摘出後の潅流のときの酸素遊
離ラジカルによる単離器官の傷害を低減しこの器官の生
存期間を延長するために、単離器官の潅流媒体に直接添
加されてもよく又は組成物の形態で添加されてもよい。
更に、hMnSODもしくはその類似体又はそれらの突然変異
体は虚血後の再潅流のときの神経傷害を低減するために
使用されてもよく又は気管支肺形成異常の治療に使用さ
れてもよい。
似体又はそれらの突然変異体と適当な担体とを含有する
獣医薬及び医薬組成物の調製も可能である。かかる担体
は当業者に公知である。hMnSODもしくはその類似体又は
それらの突然変異体は、炎症にかかった患者を治療する
ため又は虚血もしくは臓器移植後の再潅流のときの酸素
遊離ラジカルによる患者に対する傷害を低減するために
動物又はヒト患者に直接に又は適した組成物の形態で投
与することができる。hMnSODもしくはその類似体又はそ
れらの突然変異体はまた、摘出後の潅流のときの酸素遊
離ラジカルによる単離器官の傷害を低減しこの器官の生
存期間を延長するために、単離器官の潅流媒体に直接添
加されてもよく又は組成物の形態で添加されてもよい。
更に、hMnSODもしくはその類似体又はそれらの突然変異
体は虚血後の再潅流のときの神経傷害を低減するために
使用されてもよく又は気管支肺形成異常の治療に使用さ
れてもよい。
【００６１】本発明はまた、細菌細胞中で酵素活性ヒト
マンガンスーパーオキシドジスムターゼもしくはその類
似体又はそれらの突然変異体を産生する方法を提供す
る。細菌細胞はヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼもしくはその類似体又はそれらの突然変異体をコー
ドするDNA 配列を含み該配列を発現し得る。本発明方法
では、細菌細胞を適当な条件下で適当な産生培地中に維
持する。培地中のMn2+濃度が約2ppmを上回るような量の
Mn2+を産生培地に補給する。
マンガンスーパーオキシドジスムターゼもしくはその類
似体又はそれらの突然変異体を産生する方法を提供す
る。細菌細胞はヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼもしくはその類似体又はそれらの突然変異体をコー
ドするDNA 配列を含み該配列を発現し得る。本発明方法
では、細菌細胞を適当な条件下で適当な産生培地中に維
持する。培地中のMn2+濃度が約2ppmを上回るような量の
Mn2+を産生培地に補給する。
【００６２】細菌細胞はDNA 組換技術によってヒトマン
ガンスーパーオキシドジスムターゼをコードするDNA 配
列が導入できるならいかなる細菌でもよい。細菌はDNA
配列を発現しタンパク物質を産生し得る必要がある。細
菌の種及び株に従って適正条件及び産生培地を任意に調
整し得る。
ガンスーパーオキシドジスムターゼをコードするDNA 配
列が導入できるならいかなる細菌でもよい。細菌はDNA
配列を発現しタンパク物質を産生し得る必要がある。細
菌の種及び株に従って適正条件及び産生培地を任意に調
整し得る。
【００６３】細菌細胞はプラスミドの如きベクターDNA
分子本体にスーパーオキシドジスムターゼ又は類似体を
コードするDNA 配列を含む必要がある。ベクター即ちプ
ラスミドは分子の適当な位置に取り込まれたSOD をコー
ドする配列をもつようにDNA組換技術によって構築され
得る。
分子本体にスーパーオキシドジスムターゼ又は類似体を
コードするDNA 配列を含む必要がある。ベクター即ちプ
ラスミドは分子の適当な位置に取り込まれたSOD をコー
ドする配列をもつようにDNA組換技術によって構築され
得る。
【００６４】本発明の好適具体例では細菌細胞が大腸菌
細胞である。大腸菌の好ましい栄養要求株はA1645 であ
る。大腸菌の好ましい原栄養株はA4255 である。本発明
の大腸菌細胞はヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼもしくはその類似体又はそれらの突然変異体をコー
ドするプラスミドを含む。
細胞である。大腸菌の好ましい栄養要求株はA1645 であ
る。大腸菌の好ましい原栄養株はA4255 である。本発明
の大腸菌細胞はヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼもしくはその類似体又はそれらの突然変異体をコー
ドするプラスミドを含む。
【００６５】本発明の好適具体例で細菌細胞はプラスミ
ドpMSE-4を含む。このプラスミドの構築方法は図面の説
明に記載されておりプラスミド自体は実施例２に記載さ
れている。このプラスミドはATCC受託番号NO.53250で寄
託されている。
ドpMSE-4を含む。このプラスミドの構築方法は図面の説
明に記載されておりプラスミド自体は実施例２に記載さ
れている。このプラスミドはATCC受託番号NO.53250で寄
託されている。
【００６６】本発明の別の好適具体例によれば、細菌細
胞がプラスミドpMS ΔRB4 を含む。このプラスミドの構
築方法は図面の説明に記載されておりプラスミド自体は
実施例５に記載されている。このプラスミドはATCC受託
番号No.53468で寄託されたプラスミドpSODβ1 T-11から
構築される。
胞がプラスミドpMS ΔRB4 を含む。このプラスミドの構
築方法は図面の説明に記載されておりプラスミド自体は
実施例５に記載されている。このプラスミドはATCC受託
番号No.53468で寄託されたプラスミドpSODβ1 T-11から
構築される。
【００６７】本発明の特定具体例に於いて、酵素活性ヒ
トマンガンスーパーオキシドジスムターゼ類似体は、プ
ラスミドpMSE-4を含む大腸菌A4255 株細胞及びプラスミ
ドpMS ΔRB4 を含む大腸菌A4255 株によって産生され
る。
トマンガンスーパーオキシドジスムターゼ類似体は、プ
ラスミドpMSE-4を含む大腸菌A4255 株細胞及びプラスミ
ドpMS ΔRB4 を含む大腸菌A4255 株によって産生され
る。
【００６８】細菌細胞の適当な産生培地はカゼイン水解
物又はLB(Luria Broth) 培地の如き許容されるいかなる
タイプの増殖培地でもよい。後者の方が好ましい。大腸
菌の株及び大腸菌が含むプラスミドに従って増殖条件を
適宜調整し得る。例えばプラスミドpMSE-4を含む大腸菌
A4255 は42℃で誘発され、この温度で約１〜５時間維持
される。産生段階以前に接種物を増殖させ培養物を所望
濃度まで増殖させ且つ産生期間中に培養物を維持するた
めの適当な温度、時間、撹拌及び通気条件は適宜変化し
得、当業者に公知である。
物又はLB(Luria Broth) 培地の如き許容されるいかなる
タイプの増殖培地でもよい。後者の方が好ましい。大腸
菌の株及び大腸菌が含むプラスミドに従って増殖条件を
適宜調整し得る。例えばプラスミドpMSE-4を含む大腸菌
A4255 は42℃で誘発され、この温度で約１〜５時間維持
される。産生段階以前に接種物を増殖させ培養物を所望
濃度まで増殖させ且つ産生期間中に培養物を維持するた
めの適当な温度、時間、撹拌及び通気条件は適宜変化し
得、当業者に公知である。
【００６９】酵素活性MnSOD を産生するのに必要な培地
中のMn2+濃度は使用培地の種類によって調整される。
中のMn2+濃度は使用培地の種類によって調整される。
【００７０】LB- タイプ増殖培地では150ppm〜750ppmの
Mn2+濃度が有効である。全ての複合タイプの増殖培地で
は、培地中のMn2+濃度は約50〜約1500ppm であるのが好
ましい。
Mn2+濃度が有効である。全ての複合タイプの増殖培地で
は、培地中のMn2+濃度は約50〜約1500ppm であるのが好
ましい。
【００７１】適当な保存、培養、接種及び産生用培地の
個々の成分を種々に調整し得ることも当業者に公知であ
る。
個々の成分を種々に調整し得ることも当業者に公知であ
る。
【００７２】本発明はまた、ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼもしくはその類似体又はそれらの突然
変異体を含有する細菌細胞からこれらを回収する方法を
提供する。細胞を先ず処理してヒトマンガンスーパーオ
キシドジスムターゼもしくはその類似体又はそれらの突
然変異体を含む細胞中に存在するタンパク質を含むタン
パク質画分を回収し、このタンパク質画分を処理してヒ
トマンガンスーパーオキシドジスムターゼもしくはその
類似体又はそれらの突然変異体を回収する。
シドジスムターゼもしくはその類似体又はそれらの突然
変異体を含有する細菌細胞からこれらを回収する方法を
提供する。細胞を先ず処理してヒトマンガンスーパーオ
キシドジスムターゼもしくはその類似体又はそれらの突
然変異体を含む細胞中に存在するタンパク質を含むタン
パク質画分を回収し、このタンパク質画分を処理してヒ
トマンガンスーパーオキシドジスムターゼもしくはその
類似体又はそれらの突然変異体を回収する。
【００７３】本発明の好適具体例によれば、細胞を先ず
処理して可溶タンパク質を不溶タンパク質及び細胞壁破
片から分離し次に可溶タンパク質を回収する。このよう
に回収された可溶タンパク質を処理しヒトマンガンスー
パーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又はそれ
らの突然変異体を含む可溶タンパク質の画分を分離例え
ば沈澱させ、この画分を回収する。次にこの画分を処理
してヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼもしく
はその類似体又はそれらの突然変異体を分離回収する。
処理して可溶タンパク質を不溶タンパク質及び細胞壁破
片から分離し次に可溶タンパク質を回収する。このよう
に回収された可溶タンパク質を処理しヒトマンガンスー
パーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又はそれ
らの突然変異体を含む可溶タンパク質の画分を分離例え
ば沈澱させ、この画分を回収する。次にこの画分を処理
してヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼもしく
はその類似体又はそれらの突然変異体を分離回収する。
【００７４】本発明の好適具体例を以下により詳細に説
明する。先ず、細菌細胞を産生培地から単離しpH約7.0
又は8.0 の適当な溶液に懸濁させる。次に細胞を破壊し
遠心する。得られた上清を約55〜65℃の範囲の温度で約
30〜120 分間、好ましくは58〜62℃で45〜75分間、より
好ましくは60℃で１時間加熱し、10℃未満好ましくは約
４℃に冷却する。冷却中に形成された沈澱物を例えば遠
心によって完全に除去し、次に冷却上清を適当なバッフ
ァに透析する。好ましくは30K 、より好ましくは10K よ
り小さい濾過膜を用いる限外濾過によって冷却上清を透
析する。適当なバッファとしてはpH約7.8 の2mM 燐酸カ
リウムバッファがある。この透析と同時又は透析後に、
冷却上清を適当な容量に任意に濃縮し得る。例えば上清
の初期容量の0.03容に濃縮するのが有利である。次に保
持物を適当なバッファ溶液例えばpH約7.8 の少なくとも
20mMの燐酸カリウムバッファ溶液を用い、アニオン交換
クロマトグラフィーカラムから溶出する。スーパーオキ
シドジスムターゼを含む溶出物の画分を収集しプール
し、pH5.5 の約40mM酢酸カリウムに透析する。透析した
プール画分をpH5.5 の約40〜約200mM 酢酸カリウム(KOA
C)直線勾配をもつカチオン交換クロマトグラフィーカラ
ムから溶出する。スーパーオキシドジスムターゼを含む
ピーク画分を収集しプールする。プールしたピーク画分
を適当な溶液例えば水又はpH約7.8 の約10mMの燐酸カリ
ウムのバッファ溶液で任意に透析してもよい。
明する。先ず、細菌細胞を産生培地から単離しpH約7.0
又は8.0 の適当な溶液に懸濁させる。次に細胞を破壊し
遠心する。得られた上清を約55〜65℃の範囲の温度で約
30〜120 分間、好ましくは58〜62℃で45〜75分間、より
好ましくは60℃で１時間加熱し、10℃未満好ましくは約
４℃に冷却する。冷却中に形成された沈澱物を例えば遠
心によって完全に除去し、次に冷却上清を適当なバッフ
ァに透析する。好ましくは30K 、より好ましくは10K よ
り小さい濾過膜を用いる限外濾過によって冷却上清を透
析する。適当なバッファとしてはpH約7.8 の2mM 燐酸カ
リウムバッファがある。この透析と同時又は透析後に、
冷却上清を適当な容量に任意に濃縮し得る。例えば上清
の初期容量の0.03容に濃縮するのが有利である。次に保
持物を適当なバッファ溶液例えばpH約7.8 の少なくとも
20mMの燐酸カリウムバッファ溶液を用い、アニオン交換
クロマトグラフィーカラムから溶出する。スーパーオキ
シドジスムターゼを含む溶出物の画分を収集しプール
し、pH5.5 の約40mM酢酸カリウムに透析する。透析した
プール画分をpH5.5 の約40〜約200mM 酢酸カリウム(KOA
C)直線勾配をもつカチオン交換クロマトグラフィーカラ
ムから溶出する。スーパーオキシドジスムターゼを含む
ピーク画分を収集しプールする。プールしたピーク画分
を適当な溶液例えば水又はpH約7.8 の約10mMの燐酸カリ
ウムのバッファ溶液で任意に透析してもよい。
【００７５】本発明はまた、本発明方法によって産生さ
れる精製された即ち実質的にヒト由来の別の物質を含ま
ないヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼもしく
はその類似体又はそれらの突然変異体に係る。特に本発
明は、２つ以上のポリペプチドを含み、このポリペプチ
ドの少なくとも１つが第１図のアミノ酸配列をもち、該
配列のＮ末端が第１図のヌクレオチド115 〜117 でコー
ドされるリジンであり、該配列のCOOH末端が第１図のヌ
クレオチド706 〜708 でコードされるリジンであり、該
配列のＮ末端に付加メチオニン残基が結合している(Met
-hMnSOD)ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ類
似体に係る。本発明の好適具体例は比活性3500単位／ｌ
をもつ精製Met-hMnSODである。
れる精製された即ち実質的にヒト由来の別の物質を含ま
ないヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼもしく
はその類似体又はそれらの突然変異体に係る。特に本発
明は、２つ以上のポリペプチドを含み、このポリペプチ
ドの少なくとも１つが第１図のアミノ酸配列をもち、該
配列のＮ末端が第１図のヌクレオチド115 〜117 でコー
ドされるリジンであり、該配列のCOOH末端が第１図のヌ
クレオチド706 〜708 でコードされるリジンであり、該
配列のＮ末端に付加メチオニン残基が結合している(Met
-hMnSOD)ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ類
似体に係る。本発明の好適具体例は比活性3500単位／ｌ
をもつ精製Met-hMnSODである。
【００７６】実施例
以下の実施例は本発明の理解を助けるための記載であ
り、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならな
い。実施例はベクター構築、ポリペプチドをコードする
遺伝子の該ベクター内挿入、又は、得られたプラスミド
の宿主内導入の従来方法に関する詳細な記載を含まな
い。実施例はまたかかる宿主ベクター系によって産生さ
れるポリペプチドの検定に使用される従来方法又は等電
点フォーカシング(IEF) ゲルの活性染色によるかかるポ
リペプチドの同定に使用される従来方法についても詳細
に説明しない。かかる方法は当業者に公知であり多くの
文献に記載されている。これら文献の例を以下に挙げ
る。
り、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならな
い。実施例はベクター構築、ポリペプチドをコードする
遺伝子の該ベクター内挿入、又は、得られたプラスミド
の宿主内導入の従来方法に関する詳細な記載を含まな
い。実施例はまたかかる宿主ベクター系によって産生さ
れるポリペプチドの検定に使用される従来方法又は等電
点フォーカシング(IEF) ゲルの活性染色によるかかるポ
リペプチドの同定に使用される従来方法についても詳細
に説明しない。かかる方法は当業者に公知であり多くの
文献に記載されている。これら文献の例を以下に挙げ
る。
【００７７】T.Maniatis、E.F.Fritsch 及びJ.Somobroo
k 、Molecular Cloning:A LaboratoryManual 、Cold Sp
ring Harbor Laboratory 、New York(1982):J.M.McCord
及びI.Fridovich 、J.Biol.Chem. 244:6049-55(1969):
C.Beauchamp 及びI.Fridovich 、Anal.Biochem.44:276-
87(1971)。
k 、Molecular Cloning:A LaboratoryManual 、Cold Sp
ring Harbor Laboratory 、New York(1982):J.M.McCord
及びI.Fridovich 、J.Biol.Chem. 244:6049-55(1969):
C.Beauchamp 及びI.Fridovich 、Anal.Biochem.44:276-
87(1971)。
【００７８】実施例1
MnSOD cDNAクローンを同定するために、公表されている
アミノ酸配列(18,19)に従って混合オリゴマープローブ
を合成した。
アミノ酸配列(18,19)に従って混合オリゴマープローブ
を合成した。
【００７９】
【化２】
【００８０】30個のヌクレオチドから成る5'- プローブ
は成熟MnSOD のアミノ酸15〜24に対応する。32個のヌク
レオチドから成る3'- プローブは成熟MnSOD のアミノ酸
179〜189 に対応する。5'- プローブは上記のごとく異
なる36個の配列から成る混合プローブである。3'- プロ
ーブは上記のごとく異なる16個の配列から成る混合プロ
ーブである。（所与の位置に1 つ以上のヌクレオチドが
図示されるとき、DNA鎖は図示のヌクレオチドの各々を
等モル量ずつ用いて合成される混合プローブである）。
は成熟MnSOD のアミノ酸15〜24に対応する。32個のヌク
レオチドから成る3'- プローブは成熟MnSOD のアミノ酸
179〜189 に対応する。5'- プローブは上記のごとく異
なる36個の配列から成る混合プローブである。3'- プロ
ーブは上記のごとく異なる16個の配列から成る混合プロ
ーブである。（所与の位置に1 つ以上のヌクレオチドが
図示されるとき、DNA鎖は図示のヌクレオチドの各々を
等モル量ずつ用いて合成される混合プローブである）。
【００８１】λgt-10 ベクターにクローニングされたT-
細胞cDNAライブラリーの300,000 のプラークを5'- プロ
ーブを使用してスクリーニングした。ニトロセルロース
フィルターに固定したファージプラークレプリカに対す
るハイブリダイゼーションを標準方法（上掲のManiatis
等）を準用し50℃の8 ×SSC 中で16時間行なった。次に
フィルターを50℃の5 ×SSC 及び0.1 ％SDS で洗浄し
た。３つの陽性プラークを単離しPhi MS8 、Phi MS1 及
びPhi MS1Jと命名した。
細胞cDNAライブラリーの300,000 のプラークを5'- プロ
ーブを使用してスクリーニングした。ニトロセルロース
フィルターに固定したファージプラークレプリカに対す
るハイブリダイゼーションを標準方法（上掲のManiatis
等）を準用し50℃の8 ×SSC 中で16時間行なった。次に
フィルターを50℃の5 ×SSC 及び0.1 ％SDS で洗浄し
た。３つの陽性プラークを単離しPhi MS8 、Phi MS1 及
びPhi MS1Jと命名した。
【００８２】Phi MS8 及びPhi MS1 から得たDNA のEcoR
Ｉ消化物は、双方ともが長さ約800bp のcDNAインサート
をもち5'- 及び3'- 末端のオリゴヌクレオチドプローブ
にハイブリダイズすることが判明した。Phi MS1Jは5'-
末端プローブのみにハイブリダイズする僅か450bp のcD
NAインサートを担持していた。
Ｉ消化物は、双方ともが長さ約800bp のcDNAインサート
をもち5'- 及び3'- 末端のオリゴヌクレオチドプローブ
にハイブリダイズすることが判明した。Phi MS1Jは5'-
末端プローブのみにハイブリダイズする僅か450bp のcD
NAインサートを担持していた。
【００８３】３つのファージクローンのEco R Ｉインサ
ートをpBR322のEco R Ｉ部位にサブクローニングすると
夫々pMS8-4、pMS1-4及びpMS1J が得られた。制限解析及
び5'- 及び3'- オリゴヌクレオチドプローブへのハイブ
リダイゼーションによって、pMS8-4及びpMS1-4の双方で
同様のパターンが判明した。双方のプラスミドについて
5'- →3'- 方向の以下の制限地図が推定された。
ートをpBR322のEco R Ｉ部位にサブクローニングすると
夫々pMS8-4、pMS1-4及びpMS1J が得られた。制限解析及
び5'- 及び3'- オリゴヌクレオチドプローブへのハイブ
リダイゼーションによって、pMS8-4及びpMS1-4の双方で
同様のパターンが判明した。双方のプラスミドについて
5'- →3'- 方向の以下の制限地図が推定された。
【００８４】
【化３】
【００８５】pMS8-4のcDNAインサートの配列を第１図に
示す。予想されるアミノ酸配列は公表されているアミノ
酸配列(19)に比較して３つの位置(AA42 、88、108)でGl
n がGlu で置換されAA123-124 間に２つの付加アミノ酸
Gly 及びTrp がある。pMS1-4及びpMS1J の配列解析よ
り、３つのMnSOD クローンが別々に誘導されることが判
明し、公表アミノ酸配列に比較して上記の違いをもつこ
とが確認された。
示す。予想されるアミノ酸配列は公表されているアミノ
酸配列(19)に比較して３つの位置(AA42 、88、108)でGl
n がGlu で置換されAA123-124 間に２つの付加アミノ酸
Gly 及びTrp がある。pMS1-4及びpMS1J の配列解析よ
り、３つのMnSOD クローンが別々に誘導されることが判
明し、公表アミノ酸配列に比較して上記の違いをもつこ
とが確認された。
【００８６】成熟MnSOD のN 末端リジンの上流の配列は
24個のアミノ酸のプレペプチド配列を予想させる。
24個のアミノ酸のプレペプチド配列を予想させる。
【００８７】実施例2 pMSE-4:Amp R ヒトMnSOD 発現プラスミドの構築
pMSE-4の構築の出発点は実施例1 に記載のごとく得られ
たプラスミドpMS8-4である。Eco R Ｉインサートにヒト
MnSOD cDNAを含むプラスミドpMS8-4をNde Ｉ及びNar Ｉ
制限酵素で完全消化した。大きい断片を単離し第２図に
示すごとく合成オリゴマーと結合した。得られたプラス
ミドpMS8-NN はATG 開始コドンの直後の成熟MnSOD のコ
ード領域を含んでいた。前記プラスミドをEco R Ｉで消
化し末端をPolymeraseＩのKlenow断片で充填し更にNde
Ｉで開裂した。MnSOD 遺伝子を含む小さい断片をNde Ｉ
及びStu Ｉで処理したpSOD13に挿入した。pSOD13は1984
年８月27日出願の米国特許出願第644245号に記載の方法
で得られる。該特許出願は本明細書に含まれるものとす
る。得られたプラスミドpMSE-4はcII リボソーム結合部
位の直後のMnSOD コード領域を含みλＰL プロモータの
コントロール下にある。プラスミドpMSE-4はATCC受託番
号No.53250で寄託されている。上記手順で使用される全
ての方法は上掲のManiatisの方法と実質的に同じであ
る。
たプラスミドpMS8-4である。Eco R Ｉインサートにヒト
MnSOD cDNAを含むプラスミドpMS8-4をNde Ｉ及びNar Ｉ
制限酵素で完全消化した。大きい断片を単離し第２図に
示すごとく合成オリゴマーと結合した。得られたプラス
ミドpMS8-NN はATG 開始コドンの直後の成熟MnSOD のコ
ード領域を含んでいた。前記プラスミドをEco R Ｉで消
化し末端をPolymeraseＩのKlenow断片で充填し更にNde
Ｉで開裂した。MnSOD 遺伝子を含む小さい断片をNde Ｉ
及びStu Ｉで処理したpSOD13に挿入した。pSOD13は1984
年８月27日出願の米国特許出願第644245号に記載の方法
で得られる。該特許出願は本明細書に含まれるものとす
る。得られたプラスミドpMSE-4はcII リボソーム結合部
位の直後のMnSOD コード領域を含みλＰL プロモータの
コントロール下にある。プラスミドpMSE-4はATCC受託番
号No.53250で寄託されている。上記手順で使用される全
ての方法は上掲のManiatisの方法と実質的に同じであ
る。
【００８８】実施例3 組換体ヒトMnSOD の発現
公知方法を用いプラスミドpMSE-4を大腸菌A4255 株に導
入した。pMSE-4を含む大腸菌A4255 株を100 ｇ／mlのア
ンピシリンを含むLuria Broth(LB) 培地で32℃で600nm
の光学密度(OD)が0.7 になるまで増殖させた。誘発は42
℃で行なった。種々の時点でサンプルを採取しドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS
−PAGE) で分離した。該ゲルによるとヒトMnSOD レベル
は誘発後の120 分間まで増加し、Coomasie-blue 染色ゲ
ルの走査によって定量するとこの時期に組換体MnSOD タ
ンパク質は全細胞タンパク質の27％を構成していた。W-
375 超音波処理装置でサンプルを90秒間超音波処理し1
0,000ｇで５分間遠心してタンパク質を可溶(s) 画分と
不溶(p) 画分とに分画すると、産生された殆んどの組換
体MnSOD が不溶であることが判明した。標準方法で検定
すると、誘発された可溶タンパク質画分は誘発されない
同様の画分よりもSOD 活性をすこしだけ多く含むことが
判明した。上掲のMcCord等参照。可溶画分中に検出され
るMnSOD の一部分は明らかに不活性である。これはこの
実施例に記載の条件下で産生されたヒトMnSOD の殆どが
事実上不活性であることを示唆する。
入した。pMSE-4を含む大腸菌A4255 株を100 ｇ／mlのア
ンピシリンを含むLuria Broth(LB) 培地で32℃で600nm
の光学密度(OD)が0.7 になるまで増殖させた。誘発は42
℃で行なった。種々の時点でサンプルを採取しドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS
−PAGE) で分離した。該ゲルによるとヒトMnSOD レベル
は誘発後の120 分間まで増加し、Coomasie-blue 染色ゲ
ルの走査によって定量するとこの時期に組換体MnSOD タ
ンパク質は全細胞タンパク質の27％を構成していた。W-
375 超音波処理装置でサンプルを90秒間超音波処理し1
0,000ｇで５分間遠心してタンパク質を可溶(s) 画分と
不溶(p) 画分とに分画すると、産生された殆んどの組換
体MnSOD が不溶であることが判明した。標準方法で検定
すると、誘発された可溶タンパク質画分は誘発されない
同様の画分よりもSOD 活性をすこしだけ多く含むことが
判明した。上掲のMcCord等参照。可溶画分中に検出され
るMnSOD の一部分は明らかに不活性である。これはこの
実施例に記載の条件下で産生されたヒトMnSOD の殆どが
事実上不活性であることを示唆する。
【００８９】実施例4 MnSOD の溶解度及び活性に対する増殖培地中のMn 2+濃度
の影響 42℃での誘発の２時間前にpMSE-4を含む大腸菌A4255 の
増殖培地に450ppmまで濃度を増加させ乍らMn2+を添加す
るとヒトMnSOD の総収率に不利な影響を与えないことが
判明した。超音波処理した可溶タンパク質(s) 画分と不
溶タンパク質(p) 画分とをドデシル硫酸ナトリウム−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE) で分析する
と、Mn2+の濃度増加に伴って組換体タンパク質の溶解度
が増加することが判明した（表１）。SOD 活性の定量ア
ッセイ（上掲のMcCord等参照）は、増殖培地中のMn2+濃
度の増加とMnSOD の溶解度の増加との相関関係があり培
地中のMn2+濃度150ppmで見掛け上最適の溶解度が得られ
ることを示唆する（第３図）。更にMn2+濃度を増加する
とそれまで不活性の可溶酵素が活性化された。これらの
Mn2+レベルで増殖させた誘発培養物の可溶タンパク質画
分は、これらのMn2+レベルで増殖させた非誘発培養物の
可溶タンパク質画分に比較して60倍までのSOD 活性を示
した。等電点フォーカシング(IEF) ゲル（上掲のBeau-c
hamp等参照）の活性染色では多数の形態の組換体MnSOD
が天然のヒト肝臓MnSOD の形態に等しいことが判明し
た。
の影響 42℃での誘発の２時間前にpMSE-4を含む大腸菌A4255 の
増殖培地に450ppmまで濃度を増加させ乍らMn2+を添加す
るとヒトMnSOD の総収率に不利な影響を与えないことが
判明した。超音波処理した可溶タンパク質(s) 画分と不
溶タンパク質(p) 画分とをドデシル硫酸ナトリウム−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE) で分析する
と、Mn2+の濃度増加に伴って組換体タンパク質の溶解度
が増加することが判明した（表１）。SOD 活性の定量ア
ッセイ（上掲のMcCord等参照）は、増殖培地中のMn2+濃
度の増加とMnSOD の溶解度の増加との相関関係があり培
地中のMn2+濃度150ppmで見掛け上最適の溶解度が得られ
ることを示唆する（第３図）。更にMn2+濃度を増加する
とそれまで不活性の可溶酵素が活性化された。これらの
Mn2+レベルで増殖させた誘発培養物の可溶タンパク質画
分は、これらのMn2+レベルで増殖させた非誘発培養物の
可溶タンパク質画分に比較して60倍までのSOD 活性を示
した。等電点フォーカシング(IEF) ゲル（上掲のBeau-c
hamp等参照）の活性染色では多数の形態の組換体MnSOD
が天然のヒト肝臓MnSOD の形態に等しいことが判明し
た。
【００９０】pMSE-4を含む大腸菌A1645 によるヒトMnSO
D 産生の結果は上記と同様であった。
D 産生の結果は上記と同様であった。
【００９１】
【表１】
【００９２】実施例５ｐＭＳ ΔＲＢ４：Ｔｅｔ Ｒ ヒトＭｎＳＯＤ発現プラス
ミドの構築 ＥｃｏＲＩで完全消化しＢａｍＨＩ制限酵素で部分開裂
してｐＳＯＤβ１ Ｔ−１１からＴｅｔＲ発現ベクター
ｐΔＲＢを生成した。ｐＳＯＤβ１ Ｔ−１１はＡＣＴ
Ｔ受託番号Ｎｏ．５３４６８で寄託されている。消化さ
れたプラスミドを合成オリゴマー ５’−ＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＣＴ−３’ ３’−ＧＧＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧ−５’ と結合しλＰＬプロモータを含むｐΔＲＢを調製した。
ミドの構築 ＥｃｏＲＩで完全消化しＢａｍＨＩ制限酵素で部分開裂
してｐＳＯＤβ１ Ｔ−１１からＴｅｔＲ発現ベクター
ｐΔＲＢを生成した。ｐＳＯＤβ１ Ｔ−１１はＡＣＴ
Ｔ受託番号Ｎｏ．５３４６８で寄託されている。消化さ
れたプラスミドを合成オリゴマー ５’−ＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＣＴ−３’ ３’−ＧＧＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧ−５’ と結合しλＰＬプロモータを含むｐΔＲＢを調製した。
【００９３】cII リボソーム結合部位と成熟酵素の完全
コード配列とを含むMnSOD 発現プラスミドpMSE-4のEco
R Ｉ断片をp ΔRBの唯1 つのEco R Ｉ部位に挿入した。
得られたプラスミドpMS ΔRB4 はλＰL のコントロール
下のMnSOD 遺伝子及びcII RBS を含みテトラサイクリン
耐性（第４図）である。
コード配列とを含むMnSOD 発現プラスミドpMSE-4のEco
R Ｉ断片をp ΔRBの唯1 つのEco R Ｉ部位に挿入した。
得られたプラスミドpMS ΔRB4 はλＰL のコントロール
下のMnSOD 遺伝子及びcII RBS を含みテトラサイクリン
耐性（第４図）である。
【００９４】実施例6 pMS RB4 からのヒトMnSOD の発現
公知方法を用い大腸菌A4255 株にプラスミドpMS ΔRB4
を導入した。種々の濃度のMn2+を含むLuria Broth(LB)
培地中で32℃で600nm の光学密度(OD)が6.7 になるまで
培養物を増殖させた。42℃で誘発した。種々の時点でサ
ンプルを採取しSDS −PAGEの電気泳動にかけた。hMnSOD
レベルは120 分間までは誘発時間に伴って増加し、この
時期にCoomasie Blue 染色ゲルの走査によって定量する
と総細胞タンパク質の約15％を含んでいた。
を導入した。種々の濃度のMn2+を含むLuria Broth(LB)
培地中で32℃で600nm の光学密度(OD)が6.7 になるまで
培養物を増殖させた。42℃で誘発した。種々の時点でサ
ンプルを採取しSDS −PAGEの電気泳動にかけた。hMnSOD
レベルは120 分間までは誘発時間に伴って増加し、この
時期にCoomasie Blue 染色ゲルの走査によって定量する
と総細胞タンパク質の約15％を含んでいた。
【００９５】増殖培地中のMn2+濃度にかかわりなく誘発
MnSOD は可溶であった。これは AmpR プラスミドpMSE-4
での観察と対照的である（実施例４参照）。しかし乍ら
最大SOD 活性及び発現レベルはMn2+の補給量に依存した
（表２）。
MnSOD は可溶であった。これは AmpR プラスミドpMSE-4
での観察と対照的である（実施例４参照）。しかし乍ら
最大SOD 活性及び発現レベルはMn2+の補給量に依存した
（表２）。
【００９６】
【表２】
【００９７】実施例7 酵素活性組換体ヒトMnSOD の精製
プラスミドpMS ΔRB4 を含む大腸菌A4255 株を750ppmの
Mn2+を補給したLB中で32℃でA600が17.0になるまで発酵
させた。温度を42℃にし２時間維持してヒトMnSOD の発
現を誘発した。この時期に培養物のA600は43.0に達して
いた。細胞を遠心によって回収し、250mM のNaClを含む
pH7.8 の50mMの燐酸カリウムバッファの出発容量の0.2
容で再懸濁させた。Dynomillに２回通して細菌を破壊
し、遠心し、細胞破片を廃棄した。上清を60℃で１時間
加熱し、４℃に冷却し、透明な上清を初期容量の0.03容
に濃縮し、10K 膜を備えたPelicon 限外濾過装置でpH7.
8 の2mM の燐酸バッファに透析した。粗酵素調製物をDE
52カラムに充填しpH7.8 の2mM 燐酸カリウムバッファで
完全に洗い、pH7.8 の20mMの燐酸カリウムバッファで溶
出した。酵素を含有するプール画分をpH5.5 の40mMの酢
酸カリウムに透析し、CM52カラムに充填しpH5.5 の40〜
200mM 酢酸カリウムの直線勾配で溶出した。ヒトMnSOD
を含むピーク画分をプールし、pH7.8 の10mM燐酸カリウ
ムバッファに調整したＨ2 Ｏに透析し−20℃で凍結し
た。
Mn2+を補給したLB中で32℃でA600が17.0になるまで発酵
させた。温度を42℃にし２時間維持してヒトMnSOD の発
現を誘発した。この時期に培養物のA600は43.0に達して
いた。細胞を遠心によって回収し、250mM のNaClを含む
pH7.8 の50mMの燐酸カリウムバッファの出発容量の0.2
容で再懸濁させた。Dynomillに２回通して細菌を破壊
し、遠心し、細胞破片を廃棄した。上清を60℃で１時間
加熱し、４℃に冷却し、透明な上清を初期容量の0.03容
に濃縮し、10K 膜を備えたPelicon 限外濾過装置でpH7.
8 の2mM の燐酸バッファに透析した。粗酵素調製物をDE
52カラムに充填しpH7.8 の2mM 燐酸カリウムバッファで
完全に洗い、pH7.8 の20mMの燐酸カリウムバッファで溶
出した。酵素を含有するプール画分をpH5.5 の40mMの酢
酸カリウムに透析し、CM52カラムに充填しpH5.5 の40〜
200mM 酢酸カリウムの直線勾配で溶出した。ヒトMnSOD
を含むピーク画分をプールし、pH7.8 の10mM燐酸カリウ
ムバッファに調整したＨ2 Ｏに透析し−20℃で凍結し
た。
【００９８】得られた組換え体ヒトＭｎＳＯＤは純度９
９％以上であり比活性約３５００単位／ｍｇであった。
精製手順の総収率は約３０％であった（表３）。
９％以上であり比活性約３５００単位／ｍｇであった。
精製手順の総収率は約３０％であった（表３）。
【００９９】精製酵素の配列決定によって公知のヒトMn
SOD (19)に比較してＮ末端アミノ酸に付加メチオニンが
存在することが判明した。
SOD (19)に比較してＮ末端アミノ酸に付加メチオニンが
存在することが判明した。
【０１００】原子吸収によって金属含量を分析すると、
酵素サブユニット当たり約0.77原子Mnが存在していた。
これは公表データと一致する(23)。
酵素サブユニット当たり約0.77原子Mnが存在していた。
これは公表データと一致する(23)。
【０１０１】
【表３】
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
【表５】
【０１０４】
【表６】
【０１０５】
【表７】
【図１Ａ】ヒトMnSOD cDNAの配列を示す。
【図１Ｂ】ヒトMnSOD cDNAの配列を示す。
【図２】ヒトMnSOD 発現プラスミドpMSE-4の構築を示
す。
す。
【図３】大腸菌中で産生されるSOD の活性に及ぼすMn2+
の濃度の影響を示す。
の濃度の影響を示す。
【図４】ヒトMnSOD 発現プラスミドpMS ΔRB4 の構築を
示す。
示す。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ａ６１Ｋ 38/44 ＡＤＵ
ＡＥＤ
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｎ 9/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 ヤツフア・ベツク
イスラエル国、ガデラ、パインズ・スト
リート（番地なし)
(56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，259（20)
（1984）ｐ．12595〜12601
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
C12N 15/09
C07K 14/47
C12N 1/21
C12N 9/02
A61K 38/44
ＤＩＡＬＯＧ ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ
ＳＥＲＶＩＣＥＳ
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．願書に添付の図１に示すＤＮＡ配列によりコードさ
れているアミノ酸配列において、上記ＤＮＡ配列中ヌク
レオチド１１５―１１７によりコードされているリジン
から上記ＤＮＡ配列中ヌクレオチド７０６―７０８によ
りコードされているリジンまでの連続したアミノ酸を含
んでいる、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ
ポリペプチド。 ２．願書に添付の図１に示すＤＮＡ配列によりコードさ
れているアミノ酸配列において上記ＤＮＡ配列中ヌクレ
オチド１１５―１１７によりコードされているリジンか
ら上記ＤＮＡ配列中ヌクレオチド７０６―７０８により
コードされているリジンまでの連続したアミノ酸を含ん
でいて、ヒト由来の他の物質を実質的に含んでいない、
形質転換されたヒト由来でない宿主中におけるポリペプ
チドをコードするＤＮＡの発現により生産される、請求
項１に記載のヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼポリペプチド。 ３．宿主が細菌である、請求項２に記載のヒトマンガン
スーパーオキシドジスムターゼポリペプチド。 ４．上記ＤＮＡが願書に添付の図１に示すＤＮＡ配列の
ヌクレオチド番号１１５からその下流同ＤＮＡ配列のヌ
クレオチド番号７０８までの塩基配列を有している、請
求項２または３に記載のヒトマンガンスーパーオキシド
ジスムターゼポリペプチド。 ５．願書に添付の図１に示すＤＮＡ配列のヌクレオチド
１１５―１１７によりコードされているリジンに付加さ
れたメチオニンをＮ−末端アミノ酸として有する、請求
項１ないし４のいずれかに記載のヒトマンガンスーパー
オキシドジスムターゼポリペプチド。 ６．願書に添付の図１に示すＤＮＡ配列によりコードさ
れているアミノ酸配列において上記ＤＮＡ配列中ヌクレ
オチド１１５―１１７によりコードされているリジンか
ら上記ＤＮＡ配列中ヌクレオチド７０６―７０８により
コードされているリジンまでの連続したアミノ酸を含ん
でいるヒトマンガンスパーオキシドジスムターゼポリペ
プチドを含有する、ヒトマンガンスーパーオキシドジス
ムターゼの活性を有する、複合体。 ７．上記ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポ
リペプチドが願書に添付の図１に示すＤＮＡ配列のヌク
レオチド１１５―１１７によりコードされているリジン
に付加されたメチオニンをＮ−末端アミノ酸として有し
ている、請求項６に記載の複合体。 ８．３５００単位／ｍｇより高いスーパーオキシドジス
ムターゼの比活性を有している請求項６または７に記載
の複合体。 ９．上記複合体中のマンガンの量が上記ポリペプチド当
たり０．７７原子である、請求項６ないし８のいずれか
に記載の複合体。 １０．ヒト由来の他の物質を実質的に含んでいない、請
求項６ないし９のいずれかに記載の複合体。 １１．生体内中、スーパーオキシドラジカルを、または
スーパーオキシドラジカルの損傷作用を、低減させるた
めに使用される、請求項６ないし１０のいずれかに記載
の複合体。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US80109085A | 1985-11-22 | 1985-11-22 | |
| US90705186A | 1986-09-12 | 1986-09-12 | |
| US907051 | 1986-09-12 | ||
| US801090 | 1986-09-12 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61278528A Division JP2609449B2 (ja) | 1985-11-22 | 1986-11-21 | ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ▲下ｃ▼ＤＮＡ、その細菌中での発現及び酵素活性ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼの回収方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08289792A JPH08289792A (ja) | 1996-11-05 |
| JP2967557B2 true JP2967557B2 (ja) | 1999-10-25 |
Family
ID=27122291
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61278528A Expired - Lifetime JP2609449B2 (ja) | 1985-11-22 | 1986-11-21 | ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ▲下ｃ▼ＤＮＡ、その細菌中での発現及び酵素活性ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼの回収方法 |
| JP8008627A Expired - Fee Related JP2967557B2 (ja) | 1985-11-22 | 1996-01-22 | ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼｃＤＮＡ、その細菌中での発現及び酵素活性ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼの回収方法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61278528A Expired - Lifetime JP2609449B2 (ja) | 1985-11-22 | 1986-11-21 | ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ▲下ｃ▼ＤＮＡ、その細菌中での発現及び酵素活性ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼの回収方法 |
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|---|---|
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| AU (1) | AU607897B2 (ja) |
| BE (1) | BE905796A (ja) |
| CA (1) | CA1341362C (ja) |
| CH (1) | CH676990A5 (ja) |
| DE (1) | DE3639725C2 (ja) |
| DK (1) | DK534686A (ja) |
| ES (1) | ES2003518A6 (ja) |
| FI (1) | FI90353C (ja) |
| FR (1) | FR2590591B1 (ja) |
| GB (1) | GB2183658B (ja) |
| GR (1) | GR862713B (ja) |
| HK (1) | HK75195A (ja) |
| IE (1) | IE59498B1 (ja) |
| IL (2) | IL106449A (ja) |
| IT (1) | IT1205418B (ja) |
| LU (1) | LU86676A1 (ja) |
| NL (1) | NL8602960A (ja) |
| PT (1) | PT83792B (ja) |
| SE (1) | SE8604884L (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| JPS62215532A (ja) * | 1986-03-18 | 1987-09-22 | Ube Ind Ltd | 抗炎症剤 |
| JPH0643341B2 (ja) * | 1986-03-27 | 1994-06-08 | 宇部興産株式会社 | 臓器機能改善剤 |
| JPH0643340B2 (ja) * | 1986-09-03 | 1994-06-08 | 宇部興産株式会社 | 虚血性心疾患治療薬 |
| JPS6377822A (ja) * | 1986-09-18 | 1988-04-08 | Ube Ind Ltd | 臓器機能改善剤 |
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| US5260204A (en) * | 1987-03-14 | 1993-11-09 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Human manganese superoxide dismutase (hMn-SOD) |
| EP0691401A1 (en) * | 1987-03-27 | 1996-01-10 | Bio-Technology General Corporation | Human manganese superoxide dismutase analogs, pharmaceutical compositions containing them, and use thereof |
| JPH01233228A (ja) * | 1988-03-11 | 1989-09-19 | Toyo Jozo Co Ltd | 悪性腫瘍細胞転移防止剤 |
| US5772996A (en) * | 1990-08-03 | 1998-06-30 | Public Health Laboratory Service Board | Pharmaceutical compositions containing superoxide dismutase from Bacillus Stearothermophilus and Bacillus Caldotenax |
| DE4038563A1 (de) * | 1990-12-04 | 1992-06-11 | Gruenenthal Gmbh | Verwendung von superoxiddismutasen zur prophylaxe und/oder behandlung von organversagen bei risikopatienten mit polytrauma |
| ATE209928T1 (de) * | 1992-09-09 | 2001-12-15 | Bio Technology General Corp | Verwendung von mangan-superoxiddismutase (mn-sod) zur herstellung von arzneimitteln zur behandlung von erkrankungen in niedriger dosierung |
| DE4239877C1 (de) * | 1992-11-27 | 1994-03-17 | Boehringer Ingelheim Int | Stabilisierte Superoxid-Dismutase (SOD)-Zusammensetzung |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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