FR2590591A1 - Adnc codant pour la manganese-superoxyde-dismutase humaine, son expression dans des bacteries et procede pour recueillir de la manganese-superoxyde-dismutase humaine douee d'activite enzymatique. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une molécule d'ADN double brin dont la séquence d'un brin code pour la manganèse-superoxyde-dismutase humaine, ou un de ses analogues ou mutants. Cette molécule d'ADN est introduite dans une cellule procaryote ou encaryote, les cellules étant alors cultivées afin d'exprimer ladite séquence d'ADN. Application : procédé de production et de séparation de manganèse-superoxyde-dismutase humaine, ou d'un de ses analogues ou mutants, douée d'activité enzymatique, catalysant la réduction des radicaux super-oxydes, destinée à diminuer les lésions de reperfusion, prolonger la survie des organes isolés et traiter les inflammations. (CF DESSIN DANS BOPI)

Description

Cette demande est une "continuation-in-

part" du document des Etats-Unis d'Amérique N 801 090, déposée le 22 novembre 1985, dont le contenu

est mentionné ici en référence dans la présente deman-

de.

Tout au long de cette demande, diver-

ses publications sont citées en référence par des chif-

fres arabes entre parenthèses. Les citations complètes concernant ces références sont énumérées à la fin du mémoire descriptif. Les descriptioms i oes publicatics

dans leur intégralité sont mentionnées ici en référen-

ce dans cette demande afin de décrire plus complètement l'état de la pratique tel qu'il est connu de l'homme de l'art à la date de la présente invention qui y est

décrite.

La superoxyde-dismutase (SOD) et le phéno-

mène des radicaux oxygène libre (O2) ont été découverts

en 1968 par McCord et Fridovich (1). Les radicaux super-

oxydes et d'autres formes hautement réactives de l'oxy-

gène sont produits dans toutes les cellules présentant

une respiration en tant que sous-produits de la dégrada-

tion oxydative de macromolécules et constituants cellu-

laires très divers (pour un passage en revue, voir 2, 3). Un groupe de métalloprotéines connues sous le nom

d(e superoxyde-dismutases catalyse la réaction d'oxydo-

réduction 2021 + H + H202 + 02 et offre ainsi

2 2 2 2 2

un mécanisme de défense contre la toxicité de l'oxygène.

Il existe plusieurs formes connues de

SOD contenant différents métaux et différentes protéi-

nes. Les métaux présents dans les SOD comprennent le fer, le manganèse, le cuivre et le zinc. Toutes les

formes connues de SOD catalysent la même réaction.

Ces enzymes sont présents dans plusieurs groupes de l'évolution. Des superoxydes-dismutases contenant du fer sont présentes essentiellement dans des cellules procaryotes. Des superoxydes-dismutases contenant du cuivre et du zinc ont été trouvées dans pratiquement

tous les organismes eucaryotes (4). Des superoxydes-

dismutases contenant du manganèse ont été trouvéesdans

des organismes allant des micro-organismes à l'homme.

Puisque toute macromolécule biologique peut servir de cible pour l'action de dégradation du radical superoxyde abondant, un intérêt a été porté au potentiel thérapeutique des SOD. La littérature scientifique suggère que les SOD peuvent être utiles

dans une large gamme d'applications médicales. Celles-

ci comprennent la prévention de l'oncogénèse et du développement des tumeurs, et la réduction des effets

cytotoxiques et cardiotoxiques des médicaments anti-

cancéreux (10), la protection des tissus ischémiques (12) et la protection des spermatozoïdes (13). De plus, un intérêt est porté à l'étude de l'effet des SOD sur

le mécanisme du vieillissement (14).

Les investigations concernant le potentiel

thérapeutique des SOD humaines ont été limitées princi-

palement à cause de leur disponibilité limitée.

La superoxyde-dismutase présente également

un intérêt en raison de ses propriétés anti-inflammatoi-

25. res (11). Il a été établi que la superoxyde-dismutase d'origine bovine (orgotéine) possède des propriétés

anti-inflammatoires et elle est couramment commerciali-

sée dans certaines -arties de l'Europe comme médicament

à usage humain. Elle est également vendue aux Etats-

Unis d'Amérique comme produit à usage vétérinaire, en particulier pour le traitement des tendons enflammés chez les chevaux. Cependant, les approvisionnements en orgotéine sont limités. Les techniques antérieures comprenant l'extraction de cellules de boeuf ou d'autres

animaux présentent de sérieuses limitations et l'orgo-

téine ainsi obtenue peut produire des réactions allergi-

ques chez l'homme en raison de son origine non humaine.

La cuivre-zinc-superoxyde-dismutase (CuZn_ SOD) est la plus étudiée et la mieux caractérisée parmi les diverses formes de superoxyde-dismutase.

La CuZn-SOD humaine est une métallo-protéi-

ne dimère composée de sous-unités identiques liées

de manière non covalente, chacune ayant un poids molécu-

laire de 16 000 daltons et contenant un atome de cuivre et un atome de zinc (5). Chaque sous-unité est composée de 153 acides aminés dont la séquence a été déterminée

(6, 7).

L'ADN complémentaire codant pour la CuZn-

superoxyde-dismutase humaine a été cloné (8). La sé-

quence totale de l'ADN cloné a été également déterminée (9). En outre, des vecteurs d'expression contenant de l'ADN codant pour la superoxydedismutase destines

à la production et à l'extraction de superoxyde-dismuta-

se de bactéries ont été décrits (24, 25). L'expression d'une ADN codant pour la superoxyde-dismutase et la production de SOD dans des levures ont été également

décrites (26).

Récemment, le locus du gène CuZnSOD sur le chromosome humain 21 a été mis en évidence (27)

et les progrès récents concernant la CuZn superoxyde-

dismutase ont été résumés (28).

On connaît beaucoup moins -de chose au

sujet de la manganèse-superoxyde-dismutase (MnSOD).

La MnSOD de E. coli K-12 a été récemment clonée et

cartographiée (22). Barra et collaborateurs font connaî-

tre une séquence de 196 acides aminés pour le polypeptide MnSOD isolé de cellules de foie humain (19). Cependant, les divulgations de l'art antérieur diffèrent en ce qui concerne la structure de la molécule de MnSOD,

en particulier sur le point de savoir si elle possèddee ou quatre sous-

unités polypeptidiques identiques (19, 23). Cependant, il est clair que le polypeptide MnSOD et le polypeptide CuZn-SOD ne sont pas homologues (19). Les homologies des séquences d'acides aminés des MnSOD et de FeSOD provenant de diverses sources ont été également compa-

rées (18).

Baret et collaborateurs révèlent que dans

un modèle établi chez le rat la demi-vie de la MnSOD humai-

ne est notablement supérieure à la demi-vie de la cuivre-

SOD humaine; ils révèlent également que dans le modèle

établi chez le rat, la MnSOD humaine et la cuivre-

SOD du rat ne sont pas efficaces comme agents anti-

inflammatoires tandis que la cuivre-SOD bovine et la

cuivre-SOD humaine sont totalement actives (20).

McCord et collaborateurs révèlent que la manganèse-superoxyde-dismutase humaine naturelle protège mieux les leucocytes polynucléaires phagocytants

(PMN) des radicaux superoxyde libres que la CuZn-

superoxyde-dismutase bovine ou porcine dans des essais

"in vitro" (21).

La présente invention concerne la prépara-

tion d'une molécule d'ADN complémentaire codant pour

le polypeptide humain appelé manganèse-superoxyde-

dismutase, ou un de ses analogues ou mutants. Elle concerne également l'insertion de cet ADN complémentaire dans des vecteurs d'expression bactérienne efficaces, la production du polypeptide MnSOD humain, d'un analogue,

d'un mutant et d'un enzyme dans des bactéries, la sépa-

ration du polypeptide MnSOD humain, de l'analogue,

du mutant ou de l'enzyme produit par voie bactérienne.

La présente invention concerne également les polypepti-

des MnSOD humains, leurs analogues ou mutants ainsi

recueillis et leurs utilisations.

La présente invention propose en outre

un procédé de production de MnSOD humaine douée d'acti-

vité enzymatique dans des bactéries, ainsi qu'un procédé pour recueillir et purifier cette MnSOD humaine douée

d'activité enzymatique.

La présente invention mentionne également l'utilisation de manganésesuperoxyde-dismutase humaine ou d'un de ses analogues ou mutants, pour catalyser

la réduction de radicaux superoxydes en peroxyde d'hy-

drogène et oxygène moléculaire. En particulier, la présente invention concerne l'utilisation de MnSOD produite par voie bactérienne, ou d'un de ses analogues ou mutants, pour diminuer les lésions de reperfusion suivant l'ischémie et prolonger la durée de survie des organes isolés excisés. Elle concerne également l'utilisation de MnSOD produite par voie bactérienne,

ou d'un de ses analogues, pour le traitement des inflam-

mations. Une molécule d'ADN qui comprend de l'ADN complémentaire codant pour le polypeptide humain appelé manganèse-superoxyde-dismutase, ou un de ses analogues ou mutants, a été isolée d'une banque de cellules T humaines. La séquence nucléotidique d'une molécule d'ADN double brin qui code pour le polypeptide humain appelé manganèse-superoxyde-dismutase, ou un de ses analogues ou mutants, a été découverte. La séquence d'un brin codant pour le polypeptide ou un de ses analogues est représentée sur la figure 1, depuis le nucléotide 115 jusqu'au nucléotide 708 inclus. D'autres séquences

codant pour l'analogue ou le mutant peuvent être prati-

quement similaires au brin codant pour le polypeptide.

La séquence nucléotidique d'un brin d'une molécule

d'ADN double brin qui code pour un prépeptide de vingt-

quatre (24) acides aminés est également représentée sur la figure 1, depuis le nucléotide N 43 jusqu'au

nucléotide N 114 inclus.

La molécule d'ADN complémentaire double brin ou toute autre molécule d'ADN double brin qui contient un brin nucléotidique ayant la séquence codant pour

le polypeptide d'origine humaine appelé manganèse-

superoxyde-dismutase, ou un de ses analogues ou mutants, peut être incorporée dans un vecteur de clonage tel qu'un plasmide ou un virus. Chaque molécule d'ADN peut

être introduite dans une cellule, procaryote, par exem-

ple bactérienne, ou bien eucaryote, par exemple une cellule de levure ou de mammifère, en utilisant des procédés connus comprenant, mais à titre non limitatif, des procédés mettant en jeu des vecteurs de clonage

contenant chaque molécule.

L'ADN complémentaire ou l'ADN codant pour

le polypeptide d'origine humaine appelé manganèse-

superoxyde-dismutase, ou un de ses analogues ou mutants, est incorporé de préférence à un plasmide, par exemple

pMSE-4 ou PMSARB4, puis est introduit dans une cellule-

hôte convenable dans laquelle l'expression de l'ADN peut être effectuée et le po]lypeptide d'origine humaine appelé manganèse-superoxyde- dismutase (hMnSOD), ou

un de ses analogues ou mutants, peut être produit.

Les cellules-hôtes préférés comprennent Escherichia

coli, en particulier E. coli A4255 et E. coli A1645.

Le plasmide pMSE-4 dans la souche de E. coli A4255 a été déposé à l'American Type Culture Collection sous le N de dépôt ATCC 53250. Le plasmide pMSARB4 peut être obtenu de la manière représentéesur la figure

4 et décrite dans la description des figures.

On peut cultiver u faire croître les ellules da lesquelles ces molécules d'ADN ont été introduites suivant des procédés connus de l'homme de l'art, dans des conditions

convenables permettant la transcription de 1'ADN en ARNm et l'ex-

pression de l'ARNm sous forme d'une protéine. La pro-

téine résultante du type manganèse-superoxyde-dismutase

peut alors être recueillie.

Des compositions vétérinaires et pharmaceu-

tiques contenant de la MnSOD humaine, ou un de ses

analogues ou mutants, et des supports convenables peu-

vent également être préparées. Cette manganèse-superoxyde- dismutase humaine, ou ses analogues ou mutants, peut être utilisée pour catalyser la réaction suivante:

202' + 2H+ - H2 2 + 02

2 2 2 2

et diminuer ainsi les lésions cellulaires provoquées

par des radicaux superoxydes.

Plus précisément, ces enzymes ou leurs analogues ou mutants peuvent être utilisés pour diminuer les lésions provoquées par une reperfusion suivant une ischémie, augmenter la durée de survie des organes

isolés excisés ou traiter des inflammations.

La présente invention a pour objet un procédé de production de manganèsesuperoxyde-dismutase

humaine douée d'activité enzymatique, ou un ses analo-

gues ou mutants, dans une cellule bactérienne. La cellu-

le bactérienne contient et est capable d'effectuer

l'expression d'une séquence d'ADN codant pour la manga-

nèse-superoxyde-dismutase ou un ses analogues ou mu-

tants. Le procédé consiste à maintenir la cellule bacté-

rienne dans des conditions convenables et dans un milieu de production convenable. Le milieu de production est

supplémenté avec une quantité de Mn++ telle que la con-

centration de Mn++ disponible pour la cellule dans

le milieu soit supérieure à environ 2 millionièmes.

Dans une forme de réalisation préférée de la présente invention, la cellule bactérienne est une cellule de Escherichia coli renfermant un plasmide

qui contient une séquence d'ADN codant pour le poly-

peptide d'origine humaine appelé manganèse-superoxyde-

dismutase, par exemple pMSE-4 ou pMS RB4,dans la souche de, E. coli A4255. La concentration de Mn++ dans le milieu de production est comprise entre environ 50 et environ 1500 millionièmes, des concentrations de 150 à 750

millionièmes étant préférées.

La présente invention concerne également

un procédé pour extraire de la manganèsesuperoxyde-

dismutase ou un de ses analogues de cellules bactérien-

nes en contenant. Les cellules sont tout d'abord trai-

tées pour séparer une fraction protéique contenant

des protéines cellulaires comprenant la manganèse-

superoxyde-dismutase humaine, ou un de ses analogues ou mutants, puis la fraction protéique est traitée pour recueillir la manganèsesuperoxydedismutase humaine, ou un de ses analogues ou mutants. Dans une forme de réalisation préférée de la présente invention, les cellules sont tout d'abord traitées pour séparer les protéines solubles des protéines insolubles et des débris des parois cellulaires, et les protéines solubles sont recueillies. Les protéines solubles sont alors traitées pour séparer, par exemple précipiter, une fraction des protéines solubles contenant la hMnSOD

ou un de ses analogues ou mutants, et la fraction conte-

nant la hMnSOD ou un de ses analogues ou mutants est

recueillie. La fraction de protéines solubles recueil-

lie est alors traitée pour séparer la manganèse-super-

oxyde-dismutase humaine ou un de ses analogues.

Une forme de réalisation préférée de la présente invention concerne un procédé pour extraire de la manganèsesuperoxyde-dismutase humaine, ou un de ses analogues ou mutants, de cellules bactériennes qui contiennent de la manganèse-superoxyde-dismutase humaine ou un de ses analogues ou mutants. Le procédé

comprend tout d'abord l'isolement des cellules bacté-

riennes du milieu de production et leur mise en suspen-

sion dans une solution convenable ayant un pH d'environ

7,0 à 8,0. Puis les cellules sont brisées et centrifu-

gées et le surnageant résultant est chauffé pendant environ 30 à 120 minutes à une température comprise

entre 55 et 65 C, avantageusement pendant 45 à 75 minu-

tes à une température comprise entre 58 et 62 C et

de préférence pendant une heure à 60 C, puis est refroi-

di à une temperature inférieure à 10 C, de préférence à 4 C. Tout précipité qui se forme doit être éliminé,

par exemple par centrifugation, et le surnageant refroi-

di est dialysé contre un tampon approprié, par exemple un tampon au phosphate de potassium 2 mM ayant un pH d'environ 7,8. La dialyse est de préférence effectuée par ultrafiltration en utilisant une membrane filtrante inférieure à 30K. Simultanément ou après la dialyse,

le surnageant refroidi peut éventuellement être concen-

tré à un volume convenable approprié, égal par exemple à 0,03 fois son volume initial. La fraction retenue est alors

élué sur une colonne chromatographique échangeuse d'a-

nions avec une solution tamponnée appropriée, par exem-

ple une solution de tampon au phosphate de potassium au moins 20 mM ayant un pH d'environ 7,8. Les fractions d'éluant contenant de la superoxydedismutase sont

recueillies, rassemblées et dialysées contre de l'acéta-

te de potassium à environ 40 mM, à pH 5,5. Les fractions rassemblées dialysées sont alors éluées sur une colonne

chromatographique échangeuse de cations ayant un gra-

dient linéaire d'acétate de potassium d'environ 40 à environ 200 mM et un pH de 5,5. Les fractions de crête contenant la superoxyde-dismutase sont recueillies et rassemblées. Eventuellement, les fractions de crête rassemblées peuvent alors être dialysées contre une

- solution appropriée, par exemple de l'eau ou une solu-

tion tampon de phosphate de potassium à environ

mM ayant un pH d'environ 7,8.

1o La présente invention concerne également de la manganèse-superoxydedismutase humaine purifiée douée d'activité enzymatique, ou un de ses analogues, par exemple met-hMnSOD, ou des mutants produits par les procédés de la présente invention. Figure 1. Séquence d'ADN complémentaire codant pour la MnSOD humaine

La figure 1 représente la séquence nucléo-

tidique d'un brin d'une molécule d'ADN double brin codant pour la manganèse-superoxyde-dismutase humaine ainsi que la séquence de 198 acides aminés de la MnSOD humaine correspondant à la séquence d'ADN. La figure 1 représente également la séquence nucléotidique d'un brin d'une molécule d'ADN double brin codant pour un

prépeptide de MnSOD humaine mature, comprenant vingt -

quatre acides aminés, et la séquence d'acides aminés correspondant à cette séquence d'ADN. Les séquences ' et 3' non transcrites sont également représentées.

Figure 2. Elaboration de pMSE-4: plasmide d'expres-

sion de MnSOD humaine Le plasmide pHS8-4, contenant MnSOD sur un site d'insertion EcoRI (R1), a été digéré totalement avec les enzymes de restriction NdeI et NarI. Le grand fragment a été isolé et une ligation a été effectuée

avec un oligomère synthétique, de la manière représen-

tée sur la figure 2. Le plasmide résultant, pMS8-NN, contient la région codant pour la MnSOD mature, précédée par un codon d'initiation ATG. Le plasmide ci-dessus a été digéré avec EcoRI, les extrémités ont été réunies avec un fragment de Klenow de Polymérase I et ont été clivées de nouveau avec NdeI. Le petit fragment recélant le gène HnSOD a été inséré dans pSODa13 qui a été traité

avec NdeI et StuI. pSODu13 peut être obtenu de la maniè-

re décrite dans la demande de brevet en cours et cédée

conjointement au cessionnaire. Numéro des Etats-

1 1 Unis d'Amérique 644 245, déposée le 27 août 1984, qui est citée en référence dans le présent mémoire. Cela' a produit le plasmide pMSE-4 contenant la région codant pour MnSOD précédée par le site de liaison ribosomal cII et sous le contrôle du promoteur A PL' Le plasmide

pMSE-4 a été déposé à l'American Type Culture Collec-

tin sous le numéro de dépôt ATCC 53 250.

Figure 3. Effet de la concentration de Mn+"' sur l'ac-

tivité de la SOD produite dans E. coli Le graphique sur la figure 3 représente la corrélation entre l'activité spécifique en unités/ mg de MnSOD soluble recombinante produite par la souche de E. coli A4255 contenant le plasmide pMSE-4 dans des conditions de non-induction (32 C) et d'induction (42 C), et la concentration de Mn++ (millionièmes) dans

le milieu de croissance.

Figure 4. Elaboration de pmSARB4: plasmide d'expres-

sion de MnSOD humaine R Le vecteur d'expression TetR, pARB, a été produit à partir de pSOD51T-11 par digestion totale avec EcoRI, suivie par un clivage partiel:avec des enzymes de restriction BamHI. pSOD51T-11 a été déposé à l'American Type Culture Collection (ATCC) sous le numéro de dépôt 53 468. Le plasmide digéré a subi une ligation avec l'oligomère synthétique

'- AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3'

3'- GGGCCCAGATCTAGACrAG - 5' donnant pARB contenant le promoteur A PL' Le fragment EcoRI du plasmide pMSE-4 d'expression de MnSOD, contenant le site de liaison ribosomal cII et la séquence totale codant pour l'enzyme mature, a été inséré dans le site particulier EcoRI de pARB. Le plasmide résultant, pMSARB4, contient le

gène MnSOD sous le contrôle de A PL et cII RBS et confè-

re- une résistance à la tétracycline.

Une molécule d'ADN double brin qui comprend de l'ADN complémentaire codant pour le polypeptide d'origine humaine appelé manganèse-superoxydedismutase, ou un de ses analogues ou mutants, a été isolée d'une

banque d'ADN de cellules T humaines. La séquence nucléo-

tidique d'une molécule d'ADN double brin qui code pour

le polypeptide d'origine humaine appelé manganèse-

superoxyde-dismutase, ou un de ses analogues ou mutants, a été découverte. La séquence d'un brin de la molécule d'ADN codant pour le polypeptide d'origine humaine appelé manganèse-superoxyde-dismutase ou un de ses analogues est représentée sur la figure 1 et comprend les nucléotides numéro 115 à numéro 708 inclus. La séquence d'un brin codant pour un analogue ou mutant de hMnSOD est pratiquement similaire à celle du brin

codant pour le polypeptide hMnSOD. La séquence nucléo-

tidique du prépeptide de la manganèse-superoxyde--dismu-

tase humaine est également représentée sur la figure 1. Les nucléotides numéro 43 à numéro 114 inclus codent

pour ce prépeptide.

Les procédés de préparation de l'ADN com-

plémentaire et de détermination de la séquence de l'ADN codant pour le polypeptide d'origine humaine appelé manganèse-superoxyde-dismutase, ou un de ses analogues ou mutants, sont connus de l'homme de l'art et sont décrits plus en détail ci-après. De plus, maintenant

que la séquence d'ADN qui code pour la manganèse-super-

oxyde-dismutase humaine a été découverte, des procédés de synthèse connue peuvent être utilisés pour préparer des molécules d'ADN contenant des portions de cette

séquence.

Des vecteurs de clonage classiques tels que des plasmides, par exemple pBR322, des virus ou des bactériophages, par exemple A, peuvent être modifiés ou manipulés en utilisant des procédés connus de manière à produire de nouveaux vecteurs de clonage qui contien- nent de l'ADN complémentaire codant pour le polypeptide d'origine humaine appelé manganèse-superoxyde-dismutase, ou un des analogues ou mutants. De manière similaire,

ces vecteurs de clonage peuvent être modifiés ou manipu-

lés afin qu'ils contiennent des molécules d'ADN, dont

un brin comprend un segment portant la séquence repré-

sentée sur la figure 1 pour le polypeptide d'origine humaine appelé manganèse-superoxyde-dismutase, ou des segments pratiquement identiques à celui-ci. La molécule d'ADN insérée peut être obtenue par divers procédés

comprenant la synthèse enzymatique ou chimique.

Les vecteurs de clonage résultants sont

des entités chimiques qui n'existent pas à l'état natu-

rel et peuvent seulement être crééespar la technologie moderne couramment décrite sous le nom de technologie de l'ADN recombinant. Le vecteur de clonage est de

préférence un plasmide, par exemple pMSE-4 ou PMS RB4.

Ces vecteurs de clonage peuvent être introduits dans des cellules, procaryotes, par exemple bactériennes (Escherichia coli, B. subtilis, etc. ) ou eucaryotes, par exemple des cellules de levures ou de mammifères, en utilisant des techniques connues de l'homme de l'art, telles que la transformation, la transfection, etc. Les cellules dans lesquelles les vecteurs de clonage sont introduits contiennent ainsi l'ADN complémentaire codant pour le polypeptide d'origine humaine appelé manganèse-superoxyde-dismutase, ou un de ses analogues ou mutants, si l'ADN complémentaire était présent dans le vecteur de clonage ou bien contiennent de l'ADN qui comprend un brin dont la totalité ou une portion

présente la séquence du polypeptide MnSOD humain repré-

sentée sur la figure 1 ou une séquence pratiquement identique à celle-ci si cet ADN était présent dans

le vecteur de clonage.

Les cellules-de Escherichia.coli sont les cellules-hôtes préférées pour les vecteurs de clonage de la présente invention. Une souche auxotrophe de E. coli préférée

pour l'invention est la souche A1645 contenant le plas-

* mide pApoE-Ex2, qui a été déposée à l'American Type Culture Collection à Rockville, Maryland, Etats-Unis d'Amérique, sous le numéro de dépôt ATCC 39-787. Tous les dépôts à l'American Type Culture Collection

mentionnés dans cette demande ont été effectués confor-

mément au Traité de Budapest sur l'International Reco-

1S gnition of the Deposit of Microorganisms.

La souche A1645 a été obtenue à partir de la souche A1637 par sélection pour Gal+ (aptitude à fermenter le galactose) ainsi que la perte de résistance à la tétracycline. Elle contient encore des éléments du phage A. Son phénotype est C600 r m gal+ thr leu

lacZ bl (ÀcI857&Hl&BamH1 N*).

La souche A1637 a été obtenue à partir

de la souche C600 par insertion d'un transposon conte-

nant le gène de résistance à la tétracycline dans l'opé-

ron galactose ainsi que des éléments du phage À compre-

nant les élémènts responsables de la synthèse du répres-

seur cI. La souche C600 est disponible auprès de l'Ame-

rican Type Culture Collection, sous le numéro de dépôt

ATCC 23 724.

Des souches prototrophes d'Escherichia

coli permettant l'expression de hautes teneurs en poly-

peptide, même lorsqu'elles croissent dans un milieu minimal, sont encore plus appréciées comme hôtes pour

l'expression de gènes codant pour la manganèse-superoxy-

de-dismutase. Une souche prototrophe préférée pour

2590591-

l'invention est la souche A4255. La souche A4255 conte-

nant le plasmide pMSE-4 a été déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro de dépôt ATCC

53 250.

On peut traiter, par exemple faire croitre ou cultiver de manière appropriée dans des conditions convenables connues de l'homme de l'art, les cellules

obtenues dans lesquelles de l'ADN codant pour le-poly-

peptide d'origine humaine appelé manganèse-superoxyde-

dismutase, ou un de ses analogues ou mutants, a été

introduit,afin que l'ADN dirige l'expression de l'infor-

mation génétique codée par l'ADN, par exemple dirige

l'expression du polypeptide hMnSOD ou un de ses analo-

gues ou mutants, et que la cellule effectue l'expression du polypeptide hMnSOD ou-d'un de ses analogues ou mutants,

qui peuvent alors être recueillis.

Telle qu'utilisée tout au long de ce mémoi-

re descriptif, l'expression "superoxyde-dismutase" (SOD) signifie un enzyme ou un polypeptide agissant sur des radicaux superoxydes ou des radicaux oxygènes libres servant de récepteurs, ou catalysant la réaction de dismutation suivante:

22+ 2H 02 + H202

L'expression "manganèse-superoxyde-dismuta-

se" (MnSOD), telle qu'utilisée dans le présent mémoire,

signifie n'importe quelle molécule de superoxyde-dismu-

tase contenant l'élément manganèse, sous n'importelaquelle de ses formes chimiques.

L'expression "polypeptide d'origine humaine

appelé manganèse-superoxyde-dismutase", telle qu'utili-

sée dans le présent mémoire, signifie un polypeptide de 198 acides aminés, dont une portion de la séquence

d'acides aminés est représentée sur la figure 1; l'ex-

trémité N-terminalede la séquence est la lysine codée

par les nucléotides 115 à 117 de la figure 1 et l'extré-

mité COOH-terminalede la séquence est la lysine codée par les nucléotides 706 à 708 de la figure 1. L'expression "complexe polypeptidique de manganèse", telle qu'utilisée dans le présent mémoire,

signifie une molécule qui comprend un polypeptide d'ori-

gine humaine du type manganèse- superoxyde-dismutase complexé avec du manganèse sous n'importe laquelle

de ses formes chimiques et qui possède l'activité enzy-

matique de la manganèse-superoxyde-dismutase humaine naturelle.

L'expression "manganèse-superoxyde-dismuta-

se humaine", telle qu'utilisée dans le présent mémoire,

signifie une molécule qu comprend au moins deux polypepti-

des d'origine humaine du type manganèse-superoxyde-

dismutase complexés avec du manganèse sous n'importe

laquelle de ses formes chimiques et qui possède l'acti-

vité enzymatique de la manganèse-superoxyde-dismutase

humaine naturelle.

L'expression "analogue polypeptidique

de manganèse-superoxyde-dismutase humaine", telle qu'uti-

lisée dans le présent mémoire, signifie un polypeptide

qui comprend un polypeptide du type manganèse-superoxyde-

dismutase humaine, à une ou aux deux extrémités duquel un ou plusieurs acides aminés supplémentaires sont fixés.

L'expression "analogue de complexe poly-

peptidique de manganèse", telle qu'utilisée dans le présent mémoire, signifie une molécule qui comprend un complexe polypeptidique de manganèse, dont la portion polypeptidique comprend un ou plusieurs acides aminés supplémentaires fixés à une ou aux deux extrémités

de cette portion.

L'expression "analogue de manganèse-super-

oxyde-dismutase humaine", telle qu'utilisée- dans le présent mémoire, signifie une molécule qui comprend au moins deux polypeptides, dont au moins l'un est un analogue polypeptidique de manganèse-superoxydedismutase humaine, complexé avec du manganèse sous n'importe laquelle de ses formes chimiques, et qui

possède l'activité enzymatique de la manganèse-superoxy-

de-dismutase humaine naturelle.

1O L'expression "mutant polypeptidique de

manganèse-superoxyde-dismutase humaine", telle qu'utili-

sée dans le présent mémoire, signifie un polypeptide

ayant une séquence d'acides aminés pratiquement identi-

que à celle du polypeptide d'origine humaine du type manganèse-superoxydedismutase, mais en différant par

un ou plusieurs acides aminés.

L'expression "mutant de complexe polypepti-

dique de manganèse" signifie une molécule qui comprend

un mutant polypeptidique de manganèse-superoxyde-dismu-

tase humaine complexé avec du manganèse sous n'importe laquelle de ses formes chimiques et qui possède l'activité

enzymatique de la manganèse-superoxyde-dismutase.

L'expression "mutant de manganèse-superoxy-

de-dismutase humaine", telle qu'utilisée dans le présent mémoire, signifie une molécule qui comprend au moins

deux polypeptides, dont au moins un est un mutant poly-

peptidique de manganèse-superoxyde-dismutase humaine complexé avec du manganèse sous n'importe laquelle

de ses formes chimiques et qui possède l'activité enzy-

matique de la manganèse-superoxyde-dismutase humaine naturelle. Les mutants du polypeptide de hMnSOD et de hMnSOD qui sont considérés comme faisant partie de la présente invention peuvent être préparés par mutation de la séquence d'ADN représentée sur la figure 1, l'extrémité N- terminale de ladite séquence étant

la lysine codée par les nucléotides 115 à 117 et l'ex-

trémité COOH-terminale de ladite séquence étant la lysine

codée par les nucléotides 706-708.

On peut faire muter l'ADN par des procédés bien connus de l'homme de l'art; voir par exemple Bauer et collaborateurs, Gene 37: 73-81 (1985). La séquence mutée peut être insérée dans des vecteurs d'expression convenable, de la manière décrite dans

le présent mémoire, qui sont introduits dans des cellu-

les qui sont alors traitées afin que l'ADN muté dirige l'expression des mutants polypeptidiques de hMnSOD

et des mutants de hMnSOD.

On considère que la forme douée d'activité

enzymatique de la manganèse-superoxyde-dismutase humai-

ne est une protéine ayant au moins deux, et peut-être

quatre, sous-unités identiques, chacune de ces sous-

unités ayant approximativement 198 acides aminés dans

la séquence représentée sur la figure 1 pour la manganèse-

superoxyde-dismutase humaine, l'extrémité N-terminale de la séquence étant la lysine codée par les nucléotides -117 de la figure 1 et l'extrémité COOH-terminale de la séquence étant la lysine codée par les nucléotides

706-708 de la figure 1.

La MnSOD humaine, ou un de ses analogues ou mutants, peut être préparée à partir de cellules dans lesquelles de l'ADN ou de l'ADN complémentaire codant pour la manganèse-superoxyde-dismutase humaine, ou ses analogues ou mutants, a été introduit. Cette MnSOD humaine, ou ses analogues ou mutants, peut être utilisée pour catalyser la dismutation ou la réduction univalente de l'anion superoxyde en présence de protons pour former du peroxyde d'hydrogène, de la manière représentée dans l'équation suivante: MnSOD humaine

202- + 2H+) H202 + 02

Des compositions vétérinaires et pharmaceu-

tiques peuvent également être préparées, compositions contenant des quantités efficaces de hMnSOD ou d'un ou plusieurs analogues ou mutants de hMnSOD et un sup-

port convenable. Ces supports sont bien connus de l'hom-

me de l'art. La hMnSOD, ou un de ses analogues ou mu-

tants, peut être administrée directement ou sous forme d'une composition à l'animal ou à l'homme, par exemple pour traiter un sujet atteint d'inflammations ou pour diminuer les lésions provoquées chez un sujet par les radicaux oxygène libres lors de reperfusion après ischémie ou transplantation d'organes. La hMnSOD ou son analogue ou mutant peut également être ajoutée directement ou sous forme d'une composition au milieu

de perfusion d'un organe isolé, pour diminuer les lé-

sions provoquées chez un organe isolé par les radicaux oxygène libres lors de la perfusion après excision, prolongeant ainsi la durée de survie de l'organe. En outre, la hMnSOD ou un de ses analogues ou mutantspeut être utilisée pour diminuer les lésions neurologiques lors de la reperfusion après ischémie et pour traiter

la dysplasie broncho-pulmonaire.

Un procédé de production de manganèse-

superoxyde-dismutase humaine, ou d'un de ses analogues ou mutants douéed'activité enzymatique dans une cellule

bactérienne a été également découvert. La cellule bacté-

rienne contient et est capable d'exprimer une séquence d'ADN codant pour la manganèse-superoxyde-dismutase C humaine, ou un de ses analogues ou mutants. Le procédé consiste à maintenir la cellule bactérienne dans des conditions convenables et dans un milieu de production convenable. Le milieu de production est supplémenté avec une quantité de Mn++ telle que la concentration deMn ++ dans le milieu soit supérieure à environ 2 millionièmes. La cellule bactérienne peut être n'importe quelle bactérie dans laquelle une séquence d'ADN codant pour la manganèse-superoxydedismutase humaine a été introduite par des techniques d'ADN recombinant. La bactérie doit être capable d'effectuer l'expression de la séquence d'ADN et de produire la protéine. Les

conditions convenables et le milieu de production va-

rient suivant l'espèce et la souche de bactérie.

La cellule bactérienne peut contenir la séquence d'ADN codant pour la superoxyde-dismutase ou un de ses analogues dans le corps d'une molécule

vectrice d'ADN tellequ'un plasmide. Le vecteur ou plasmi-

de est élaboré par des techniques d'ADN recombinant

afin qu'il possède la séquence codant pour la SOD incor-

porée en une position convenable dans la molécule.

Dans une forme de réalisation préférée de la présente invention, la cellule bactérienne est une cellule de Escherichia coli. Une souche auxotrophe de E. coli préférée est la souche A1645. Une souche prototrophe de E. coli préférée est la souche A4255. La cellule de E. coli de la présente invention contient

un plasmide qui code pour la manganèse- superoxyde-

dismutase humaine, ou un de ses analogues ou mutants.

Dans une forme de réalisation préférée

de la présente invention, la cellule bactérienne con-

tient le plasmide pMSE-4. Un procédé d'élaboration

de ce plasmide est décrit dans la description des figu-

res et le plasmide proprement dit est décrit dans l'exemple 2. Ce plasmide a été déposé à la ATCC

sous le numéro de dépôt 43 250.

Dans une autre forme de réalisation préfé-

rée de la présente invention, la cellule bactérienne contient le plasmide pMSARB4. Un procédé d'élaboration

de ce plasmide est décrit dans la description des figu-

res et le plasmide proprement dit est décrit dans l'exemple 5. Ce plasmide peut être élaboré à partir de pSOD51T-11 qui a été déposé à l'American Type

Culture Collection sous le numéro de dépôt 53 468.

Dans des formes de réalisation particuliè-

res de la présente invention, un analogue de manganèse-

superoxyde-dismutase humaine douée d'activité enzymati-

que est produit par des cellules de souche de-E. coli A4255 contenant le plasmide pMSE-4 et par des cellules de souche de E. coli A4255 contenant le plasmide pl'SLRB4. Le milieu de production convenable pour la cellule bactérienne peut être n'importe quel type de milieu de croissance acceptable tel qu'un hydrolysat de caséine ou du milieu BL (Bouillon de Luria), ce dernier étant préféré. Les conditions de croissance convenables varient suivant la souche de E. coli et le plasmide qu'elle contient, la souche de E. coli A4255 contenant le plasmide pMSE-4 étant par exemple induite à 42 C et maintenue à cette température pendant environ 1 à environ 5 heures. Les conditions convenables de température, durée, agitation et aération pour la croissance de l'inoculum et pour la croissance de la culture jusqu'à une densité désirée avant la phase

de production ainsi que pour la maintenance de la cultu-

re pendant la durée de production peuvent varier et

sont bien connues de l'homme de l'art.

La concentration d'ions Mn++ dans le milieu qui est nécessaire pour produire de la MnSOD douée d'activité enzymatique varie suivant le type de milieu utilisé. Dans des milieux de croissance du type BL, des concentrations de Mn++ de 150 millionièmes

2590591 -

a 750 millionièmes se sont révélées efficaces. Il est préféré que, dans tous les types complexes de milieux de croissance, la concentration de Mn+ + dans le milieu

soit comprise entre environ 50 et environ 1500 millio-

nièmes. Les ingrédients particuliers des milieux d'approvisionnement, de culture, d'inoculation et de production convenables peuvent varier et sont connus

de l'homme de l'art.

La présente invention concerne également

un procédé pour extraire de la manganèse-superoxyde-

dismutase humaine, ou un de ses analogues ou mutants, de cellules bactériennes en contenant. Les cellules sont tout d'abord traitées pour séparer une fraction

protéique renfermant des protéines cellulaires compre-

nant de la manganèse-superoxyde-dismutase humaine ou

un de ses analogues ou mutants, puis la fraction protéi-

que est traitée pour recueillir la manganèse-superoxyde-

dismutase humaine, ou un de ses analogues ou mutants.

Dans une forme de réalisation préférée de la présente invention, les cellules sont tout d'abord

traitées pour séparer les protéines solubles des protéi-

nes insolubles et des débris de parois cellulaires et les protéines solubles sont alors recueillies. Les protéines solubles ainsi recueillies sont alors traitées pour séparer, par exemple précipiter, une fraction

des protéines solubles contenant la manganèse-superoxyde-

dismutase humaine, ou un de ses analogues ou mutants,

et la fraction est séparée. La fraction est alors trai-

tée pour recueillir séparément la manganèse-superoxyde-

dismutase humaine, ou un de ses analogues ou mutants.

Ce qui suit est une description d'une

forme de réalisation préférée de la présente invention.

Tout d'abord, les cellules bactériennes sont isolées du milieu de production et mises en suspension dans une solution convenable ayant un pH d'environ 7,0 ou

8,0. Les cellules sont alors brisées et centrifugées.

Le surnageant obtenu est chauffé pendant une durée d'environ 30 à 120 minutes à une température comprise entre approximativement 55 et 65 C, avantageusement pendant 45 à 75 minutes à une température de 58 à 62 C et de' préférence pendant une heure à 60 C, puis est

refroidi à une température inférieure à 10 C, de préfé-

rence à environ 4 C. Tout précipité qui peut se former au cours du refroidissement est éliminé, par exemple par centrifugation, puis le surnageant refroidi est

dialysé contre un tampon approprié. Le surnageant re-

froidi est de préférence dialysé par ultrafiltration en utilisant une membrane filtrante inférieure à 30K, de préférence 10K. Des tampons appropriés comprennent du tampon au phosphate de potassium 2 mM ayant un pH d'environ 7,8. Simultanément ou après cette dialyse,

le surnageant refroidi peut éventuellement être concen-

tré à un volume approprié, un volume égal par exemple à 0,03 fois le volume initial du surnageant s'étant révélé convenable. La fraction retenue est alors éluée sur une colonne chromatographique échangeuse d'anions avec une solution tamponnée appropriée, par exemple une solution de tampon au phosphate de potassium au moins 20 mM ayant un pH d'environ 7,8. Les fractions d'éluant contenant la superoxyde-dismutase sont recueillies,

rassemblées et dialysées contre de l'acétate de potas-

sium environ 40 mM, à pH 5,5. Les fractions rassemblées

dialysées sont alors éluées à travers une colonne chro-

matographique échangeuse de cations ayant un gradient linéaire d'acétate de potassium (KOAC) d'environ 40 à environ 200 mM et un pH de 5,5. Les fractions de crête contenant la superoxyde-dismutase sont recueillies et rassemblées. Eventuellement, les fractions de crête rassemblées peuvent alors être dialysées contre une

solution appropriée, par exemple de l'eau ou une solu-

tion tampon au phosphate de potassium environ 10 mM

ayant un pH d'environ 7,8.

La présente invention concerne également de la manganèse-superoxydedismutase humaine, ou un de ses analogues ou mutants, purifiée, c'est-àdire pratiquement dépourvue d'autres substances d'origine humaine, produite par les procédés de la présente invention. En particulier, elle concerne un analogue de manganèse-superoxyde-dismutase humaine ayant au moins deux polypeptides, dont au moins l'un possède la séquence d'acides aminés représentée sur la figure 1, l'extrémité N-terminale de ladite séquence étant la lysine codée par les nucléotides 115-117 de la figure 1 et l'extrémité COOH-terminale de ladite séquence étant la lysine codée par les nucléotides 706-708 de la figure 1, plus un résidu méthionine supplémentaire à l'extrémité N-terminale (met-hMnSOD). Une forme de réalisation préférée de la présente invention concerne de la met-hMnSOD purifiée ayant une activité spécifique

de 3500 unités/mg.

EXEMPLES

Il va de soi que les exemples suivants ne sont décrits qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre de la présente

invention. Les exemples ne comprennent pas de descrip-

tions détaillées des procédés classiques utilisés dans l'élaboration des vecteurs, l'insertion des gènes codant

pour les polypeptides dans ces vecteurs ou l'introduc-

tion des plasmides résultants dans des hâtes. De même,

les exemples ne comprennent pas de description détaillée

des procédés classiques utilisés pour analyser les polypeptides produits par ces systèmes hôtes-vecteurs ou établir l'identité de ces polypeptides par coloration d'aPrès activitécd gls defocalisation au point isoélectrique (FIE). Ces procédés sont bien connus de l'homme de l'art et sont décrits dans de nombreuses publications comprenant, à titre d'exemple, les suivantes: T. Maniatis, E.F. Fritsch et J. Sombrook, Molecular

Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labo-

ratory, New York (1982).

J.M. McCord et I. Fridovich, J. Biol. Chem. 244:6049-

(1969).

C. Beauchamp et I. Fridovich, Anal. Biochem. 44:276-

87 (1971).

EXEMPLE 1

Afin d'identifier des clones d'ADN complé-

mentaire codant pour MnSOD, des sondes oligomères mixtes ont été synthétisées suivant la séquence d'acides

aminés-publiée (18,19).

Sonde-5' - séquence de 30 motifs de AA15 à AA24 (18,19)

' 3'

TTGCATAATTTGTGCCTTAATGTG TGGTTC

T G T G

G G

Sonde-3' - séquence de 32 motifs de AA179 à AA189 (18)

' 3'

TCTGTTACGTTTTCCCAGTTTATTACGTTCCA

G G G G

La sonde-5' comprenant 30 nucléotides

correspond aux acides aminés 15 à 24 de la MnSOD mature.

La sonde-3' comprenant 32 nucléotides correspond aux

acides aminés 179 à 189 de la MnSOD mature. La sonde-

' est une sonde mixte comprenant 36 séquences différen- tes, telle que représentée ci-dessus. La sonde-3' est une sonde mixte comprenant 16 séquences différentes,

telle que montrée ci-dessus. (Lorsque plus d'un nucléo-

tide est représenté à une position donnée, le brin d'ADN a été synthétisé avec des quantités équimolaires de chacun des nucléotides représentés, donnant ainsi

la sonde mixte).

La sonde-5' a été utilisée pour sélection- ner 300 000 plaques d'une banque d'ADN complémentaire

de cellules T cloné dans le vecteur À gt-10. L'hybri-

dation a des répliques de plaques de phage immobilisées

sur des filtres de nitrocellulose a été effectuée sui-

vant des procédés classiques (Maniatis et collabora-

teurs, ci-dessus), sauf que l'hybridation a été effec-

tuée à 50 C dans 8xSSC pendant 16 heures. Puis les filtres ont été lavés à 50 C avec 5xSSC et 0,1% de

DSS. Trois plaques positives ont été isolées et dénom-

mées Phi MS8, Phi MS1 et Phi MS1J.

Les produits de digestion par EcoRi de l'ADN provenant de Phi MS8 et Phi MS1 ont montré qu'ils

possédaient tous deux des insertions d'ADN complémentai-

re ayant approximativement une longueur de 800pb qui s'hybrident aux deux sondes oligonucléotidiques ' et 3'. Phi MS1J portait seulement une insertion d'ADN complémentaire de 450 pb s'hybridant seulement

à la sonde terminale 5'.

Les insertions obtenues avec EcoRI des trois clones phagiques ont été sous-clonées dans le site EcoRI de pBR322, donnant ainsi respectivement pMS8-4, pMS1-4 et pMS1J. L'analyse par restriction et l'hybridation aux sondes oligonucléotidiques 5' et 3' ont révélé des profils similaires pour pMS8-4 et pMS1-4. La carte de restriction suivante montrant l'orientation 5') 3' a été déduite pour les

deux plasmides.

' fl TfII TuII XyI D I t I Rl I I - I il I, I i., I

200 300 400 500 600 700 800

La séquence de l'insertion d'ADN complémen-

taire de pMS8-4 est représentée sur la figure 1. La séquence d'acides aminés prévue diffère de la séquence d'acides aminés publiée (19) en ce que Glu est présent au lieu de Gln en trois (3) endroits (AA 42, 88, 108) et que deux acides aminés supplémentaires, Gly et Trp,

sont présents entre AA123 et AA124. L'analyse des séquen-

ces de pMS1-4 et pMSlJ a révélé que les trois clones de MnSOD ont été obtenus indépendamment et a confirmé

ces différences avec la séquence d'acides aminés publiée.

La séquence en amont de la lysine N-termi-

nale de la MnSOD mature laisse prévoir une séquence

* prépeptidique de 24 acides aminés.

EXEMPLE 2

Elaboration de pMSE-4: plasmide d'expression de MnSOD humaine AmpR Le point de départ pour l'élaboration de pMSE-4 est le plasmide pMS8-4 qui a été obtenu de

la manière décrite dans l'exemple 1. Le plasmide pMS8-

4, contenant de l'ADN complémentaire codant pour la MnSOD humaine sur une insertion EcoRI, a été totalement

digéré avec les enzymes de restriction NdeI et NarI.

Le grand fragment a été isolé et une ligation a été effectuée avec l'oligomère synthétique de la manière représentée sur la figure 2. Le plasmide résultant, pMS8-NN, contient la région codant pour la MnSOD mature, précédée par un codon d'initiation ATG. Le plasmide ci-dessus a été digéré avec EcoRI, les extrémités ont été réunies avec un fragment de Klenow de Polymérase

I et ont été de plus clivées avec NdeI. Le petit frag-

ment contenant le gène MnSOD a été inséré dans pSOD 13 qui a été traité avec NdeI et StuI. pSOD 13 peut être obtenu de la manière décrite dans la demande de brevet en cours et cédée conjointement au cessionnaire, numéro des Etats-Unis d'Amérique 644 245, déposée le

27 août 1984, qui est mentionnée ici en référence.

Ce plasmide pMSE-4 produit contient la région codant pour MnSOD précédée par le site de liaison ribosomal cII, sous le contrôle du promoteur \ PL' Le plasmide

pMSE-4 a été déposé à l'American Type Culture Collec-

tion sous le numéro de dépôt 53 250. Toutes les méthodes utilisées dans les procédés ci-dessus sont pratiquement

identiques à celles décrites dans Maniatis, ci-dessus.

EXEMPLE 3

Expression de la MnSOD humaine recombinante Le plasmide pMSE-4 a été introduit dans la souche de Escherichia coli A4255 en utilisant des procédés connus. La souche de E. coli 4255, contenant pMSE-4, a été cultivée à 32 C dans un milieu du type bouillon de Luria (BL) contenant 100 pg/ml d'ampicilline jusqu'à atteindre une densité optique (DO) à 600 nm

de 0,7. L'induction a été effectuée à 42 C. Des échan-

tillons prélevés à divers intervalles de temps ont

été séparés par électrophorèse sur des gels au dodécyl-

sulfate de sodium - polyacrylamide (DSS-PAGE). Les gels ont montré des augmentations des teneurs en MnSOD humaine pendant une durée allant jusqu'à 120 minutes après l'induction, moment auquel la protéine MnSOD recombinante formait 27% des protéines cellulaires totales, telles que déterminées par exploration de

gel coloré au bleu de Coomassie. La sonication d'échan-

tillons pendant 90 secondes dans un appareil de sonica-

tion W-375 et le partage des protéines en fractions soluble (s) et non solubles (p) par centrifugation à 10 000 g pendant 5 minutes ont révélé que la majeure partie de la MnSOD recombinante produite était non

soluble. La fraction protéique soluble induite conte-

nait seulement une activité de SOD légèrement supérieure à la contrepartie non induite, telle que déterminée par analyse au moyen de procédés classiques. Voir McCord et collaborateurs, ci-dessus. Apparemment, une portion de

la MnSOD trouvée dans la fraction soluble est inactive.

Cela a suggéré que la majeure partie de la MnSOD humaine produite dans les conditions décrites dans cet exemple

est effectivement inactive.

EXEMPLE 4

Effet de Mn++dans des milieux de croissance sur la solubilité et l'activité de la MnSOD L'addition de Mn++, à des concentrations croissantes jusqu'à 450 millionièmes, au milieu de culture de E. coli A4255, contenant pMSE-4, avant une induction de 2 heures à 42 C, n'a entraîné aucun

effet néfaste sur le rendement global en MnSOD humaine.

L'analyse des fractions protéiques soluble (s) et non soluble (p) traitées par sonication, au moyen d'une électrophorèse sur gel au dodécylsulfate de sodium - polyacrylamide (DSS-PAGE), a montré une solubilisation

accrue de la protéine recombinante avec des concentra-

tions accrues de Mn++ (tableau I). Une analyse de l'ac-

tivité de SOD (voir McCord et collaborateurs, ci-dessus) suggère une corrélation entre les concentrations accrues de Mn++ dans les milieux de culture et la solubilité accrue de la MnSOD, avec un optimum apparent à une concentration de Mn++ dans les milieux égale à 150 millionièmes (figure 3). De plus, des concentrations

accrues de Mn++ ont activé un enzyme soluble précé-

2590591 -

demment inactif. Des fractions protéiques solubles de cultures induites cultivées à ces teneurs en Mn+ ont montré une augmentation d'activité de SOD atteignant un facteur 60 par rapport aux fractions protéiques solubles de cultures non induites développées à ces teneurs en Mn++. La coloration d'après activitéde gelsde focalisation isoélectrique (FIE) (voir Beauchamp et collaborateurs, ci-dessus), a révélé que les formes multiples de la MnSOD recombinante étaient identiques

à celles de la MnSOD de foie humain native.

Les résultats concernant la production

de MnSOD humaine par E. coli A1645 contenant pMSE-

4 ont été similaires à ceux décrits ci-dessus.

TABLEAU I

M' Pourcentage Pourcentage de Activité Mn++ de MnSOD hu- MnSOD humaine spécifique (mil- maine soluble soluble dans unités/mg lionié- dans la MnSOD les protéines de protéines mes) humaine totale bactériennes solubles induite solubles

0 30,6 7,2 30

72,7 15,4 241

78,0 16,9 356

82,9 18,8 606

200 82,0 20,8 338

250 79,2 20,4 380

300 80,8 20,3 381

450 89,2 22,4 323

EXEMPLE 5

Elaboration de pMSARB4: Plasmide d'expression de MnSOD R

humaine Tet -

Le vecteur d'expression de Tet, pARB, a été produit à partir de psOD51T11 par digestion totale avec EcoRI, suivie par clivage partiel avec les enzymes de restriction BamHI. pSOD51T-11 a été déposé à l'American Type Culture Collection sous le numéro de dépôt 53 468. La ligation du plasmide digéré a été effectuée avec le ligomère synthétique

'- AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3'

3'- GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5'

donnant pARB contenant le promoteur À PL'

Le fragment EcoRI du plasmide pMSE-4 d'ex-

pression de MnSOD, contenant le site de liaison riboso-

mal cII et la séquence totale codant pour l'enzyme mature, a été inséré dans le site EcoRI particulier de pARB. Le plasmide résultant, pMSARB4, contient le

gène MnSOD sous le contrôle de A PL et du site de liai-

son ribosomal cII et confère une résistance à la tétra-

cycline (figure 4).

EXEMPLE 6

Expression de MnSOD humaine à partir de pMSARB4 Le plasmide pMSARB4 a été introduit dans la souche de Escherichia coli A4255, en utilisant des procédés connus. Les cultures ont été effectuées à 32 C dans du bouillon de Luria (BL) contenant diverses concentrations de Mn++, jusqu'à atteindre la densité optique (DO) à 600 nm de 6,7. L'induction a été effec-

tuée à 42 C. Des échantillons prélevés à divers inter-

valles de temps ont été traités par électrophorèse sur du DSS-PAGE. La teneur en hMnSOD a augmenté avec Je temps d'induction jusqu'à 120 minutes, moment auquel elle formait environ 15% des protéines cellulaires totales, telles que déterminées par exploration de

gel coloré au bleu de Coomassie.

La MnSOD induite était soluble, quelle que soit la concentration de Mn++ dans les milieux de culture. Cela s'oppose aux observations concernant R35 le plasmide pMSE-4 ApR. (Voi exemple 4). Cependant, le plasmide pMSE- 4 Amp (Voir exemple 4). Cependant, l'activité de SOD maximale et le taux: d'expression

étaient dépendants de la supplémentation en Mn++ (ta-

bleauII).

TABLEAUII

Expression de MnSOD dans E.coli A4255 (pMSA'RB4)

Pourcentage de hMnSOD Activité spécifi-

Mn++ soluble dans les pro- que

(millioniè- téines bactériennes Unités/mg de pro-

mes) solubles téines solubles

42 32 C 42 C

0 10,9 8,0 23

19,8 8,0 227

16,0 8,0 241

17,0 10,0 278

300 16,0 9,3 238

EXEMPLE 7

Purification de MnSOD humaine recombinante douée d'acti-

vité enzymatique On a fait fermenter la souche de E. coli

A4255 portant le plasmide pMSARB4 dans du BL supplémen-

té avec 750 millionièmes de Mn+, à 32 C, jusqu'à A600 de 17,0. L'induction de l'expression de la MnSOD humaine a été effectuée par un changement de température à

42 C pendant 2 heures, moment auquel la culture a at-

teint une A600 de 43,0. Les cellules ont été recueillies par centrifugation et remises en suspension dans un volume égal à 0,2 fois le volume initial, dans du tampon au phosphate de potassium 50 mM, à pH 7,8, contenant 250 mM de NaCl. Les bactéries ont été brisées par un double passage dans un Dynomill, ont été centrifugées

et les débris cellulaires ont été rejetés. Le surna-

geant a été chauffé pendant une heure à 60 C, a été refroidi à 4 C et le surnageant clarifié a été concentré à 0,03 fois son volume initial et a été dialysé contre du tampon au phosphate de potassium 2 mM, à pi 7,8, dans une unité d'ultrafiltration Pelicon munie d'une

membrane 10K. La préparation d'enzyme brut a été intro-

duite dans une colonne de DE52, a été lavée soigneuse-

ment avec du tampon au phosphate de potassium 2 mM, à pH 7,8, et a été éluée avec du tampon au phosphate de potassium 2OmM, à pH 7,8. Les fractions rassemblées

contenant l'enzyme ont été dialysées contre de l'acé-

tate de potassium 40 mM, à pH 5,5, ont été introduites dans une colonne de CM52 et ont été éluées avec un gradient linéaire d'acétate de potassium 40 - 200 mM

à pH 5,5. Les fractions correspondant aux pics, conte-

nant la MnSOD humaine ont été rassemblées, dialysées contre H20, ont été ajustées à du tampon au phosphate de potassium 10 mM, à pH 7,8, et ont été congelées

à -20 C.

La MnSOD humaine recombinante obtenue était pure à plus de 99%, avec une activité spécifique d'environ 3500 unités/mg. Le rendement global du procédé

de purification était d'environ 30% (tableauIII).

Le séquençage de l'enzyme purifié révèle la présence d'une méthionine additionnelle au niveau de l'acide aminé N-terminal, comparativement à la

MnSOD humaine connue (19).

L'analyse de la teneur en métal par absorption atomique a révélé la présence d'environ 0,77 atome de Mn par sous-unité d'enzyme. Cela est

conforme aux résultats publiés (23).

0% C> LIn uo T -1 çL uoTiezuluize; ap gTg3and aulúzue,T inod sinoTsvA 009ú ú'5D z'à z'8 z5liD ap jenTZ ZELZ O'8t L'5 ',L zçZQ ap jenTS 0çú lO' ú9 'L O ' O ZuoTa ue -enuaqq L6Ll 6'89 9' O'Z D,09 V lueeoeuanS LL 00'00 6'Ll O'00 TTTMou&CI aT suep zuepaSuans sui/spTun % aos op S adev anbT;TDds 91T&ToV Iuamapuae saI0eo1 eauT91o0j *aeueuTqmoDaz auTemnq aOsux ap uo;eoTTzna ImI nVII igV:

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Italie, 1-6 septembre 1985.

Claims (26)

REVENDICATIONS

1. ADN purifié caractérisée en ce qu'elle code pour le polypeptide d'origine humaine appelé manganèse-superoxyde-dismutase, ou un de ses analogues ou mutants.

2. Molécule d'ADN, caractérisé en ce qu'elle consiste en ADN complémentaire codant pour

le polypeptide d'origine humaine appelé manganèse-

superoxyde-dismutase, ou un de ses analogues ou mutants.

3. Molécule d'ADN double brin, caractérisée

en ce qu'elle code pour un prépolypeptide de manganèse-

superoxyde-dismutase humaine, ou un de ses analogues ou mutants, dont un brin comprend essentiellement la séquence nucléotidique représentée sur la figure 1, depuis le nucléotide numéro 43 jusqu'au nucléotide

numéro 708.

4. Molécule d'ADN double brin, caractérisée en ce qu'elle code pour le polypeptide d'origine humaine appelé manganèse-superoxyde-dismutase, ou un de ses

analogues ou mutants, dont un brin comprend-essentielle-

ment la séquence nucléotidique représentée sur la figure 1, depuis le nucléotide numéro 115 jusqu'au nucléotide

numéro 708 inclus.

5. Cellule, caractérisée en ce que l'ADN suivant la revendication 1 y a été introduite, ladite cellule étant éventuellement une cellule procaryote ou une cellule bactérienne, et étant de préférence

une cellule bactérienne contenant le plasmide pMSE-

4, cellule déposée sous le numéro ATCC 52250, ou bien

contenant le plasmidepMSARB4.

6. Procédé de production d'un polypeptide du type manganèse-superoxydedismutase humaine, - ou un de ses analogues ou mutants, caractérisé en ce qu'il consiste à traiter une cellule suivant la revendication

5 de manière que l'ADN dirige l'expression du polypep.ti-

de du type manganèse-superoxyde-dismutase humaine, ou un de ses analogues ou mutants, et que la cellule

effectue l'expression du polypeptide du type manganèse-

superoxyde-dismutase humaine, ou un de ses analogues ou mutants, et à séparer de la cellule le polypeptide du type manganèse-superoxydedismutase humaine, ou

un de ses analogues ou mutants, ainsi exprimé.

7. Polypeptide purifié, caractérisé en ce qu'il consiste en, ou comprend essentiellement, 222 acides aminés répondant à la séquence représentée sur la figure 1, l'extrémité N-terminale de ladite séquence étant la méthionine codée par les nucléotides 43-45 de la figure 1, et l'extrémité COOH-terminale

de ladite séquence étant la lysine codée par les nucléo-

tides 706-708 de la figure 1.

8. Polypeptide produit par voie bactérienne, de préférence dépourvu de substances d'origine humaine,

caractérisé en ce qu'il consisteen, oucomprendessentiel-

lement, 198 acides aminés formant la portion de la séquence d'acides aminés représentée sur la figure 1, l'extrémité N-terminale de ladite séquence étant la lysine codée par les nucléotides 115-117 de la figure 1 et l'extrémité COOH-terminale de ladite séquence étant la lysine codée par les nucléotides 706-708 de

la figure 1.

9. Manganèse-superoxyde-dismutase humaine ou un de ses analogues, caractériséeen ce qu'elle résulte de l'expression dans des bactéries de la séquence d'ADN représentée sur la figure 1, depuis le nucléotide numéro

115 jusqu'au nucléotide numéro 708.

10. Polypeptide caractérisé, en ce que:

(a) il est codé par l'ADN pour la manganèse-

superoxyde-dismutase humaine; (b) il est capable d'être produit dans des bactéries; et (c) il est capable de catalyser la réaction suivante:

+ 2H+ - H 202 + 02

2 2 2 2

11. Procédé de production de manganèse-

superoxyde-dismutase humaine douée d'activité enzymati-

que, ou d'un de ses analogues, dans une cellule bacté-

rienne qui contient et est capable d'effectuer l'expres-

sion d'une séquence d'ADN codant pour la superoxyde-

dismutase ou un de ses analogues, caractérisé en ce o10 qu'il consiste à maintenir la cellule bactérienne dans

des conditions convenables et dans un milieu de produc-

tion convenable, le milieu de production étant supplé-

menté avec une quantité de Mn++ telle que la concentra-

tion de Mn++ dans le milieu soit supérieure à environ

2 millionièmes.

12. Manganèse-superoxyde-dismutase humaine ou un de ses analogues ou mutants, caractérisée en ce

qu'eieest produitepar voie bactérienne.

13. Polypeptide ayant pratiquement la

même séquence d'acides aminés que le polypeptide d'ori-

gine humaine appelé superoxyde-dismutase, caractérisé

en ce qu'il a été produit dans un micro-organisme uni-

cellulaire.

14. Procédé pour séparer la manganèse-

superoxyde-dismutase humaine, ou un de ses analogues,

de cellules bactériennes qui contiennent de la manganèse-

superoxyde-dismutase humaine, caractérisé en ce qu'il consiste: (a) à traiter les cellules bactériennes de manière à recueillir une fraction protéique

contenant les protéines cellulaires, com-

prenant la manganèse-superoxyde-dismutase humaine; et (b) à traiter la fraction protéique de manière

à recueillir la manganèse-superoxyde-

dismutase humaine.

15. Manganèse-superoxyde-dismutase humaine, caractérisée en ce qu'elle est pratiquement dépourvue

d'autres substances d'origine humaine.

16. Molécule non présente à l'état naturel, ayant l'activité de la manganèse-superoxyde-dismutase,

caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux poly-

peptides du type manganèse superoxyde-dismutase humaine.

17. Polypeptide du type manganèse-superoxy-

de-dismutase humaine, caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide de 198 acides aminés, dont une portion de la séquence d'acides aminés est représentée sur la figure 1, l'extrémité N-terminale de ladite séquence étant la lysine codée par les nucléotides 115-117 de la figure 1 et l'extrémité COOH-terminale de ladite séquence étant la lysine codée par les nucléotides

706-708 de la figure 1.

18. Complexe polypeptidique de manganèse, caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide du type manganése-superoxyde-dismutase humaine complexé avec du manganèse sous n'importe laquelle de ses formes chimiques, complexe qui possède l'activité enzymatique

de la manganèse-superoxyde-dismutase humaine naturelle.

19. Manganèse-superoxyde-dismutase humaine,

caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux poly-

peptides du type manganèse-superoxyde-dismutase humaine complexés avec du manganèse sous n'importe laquelle

de ses formes chimiques, et possédant l'activité enzyma-

tique de la manganèse-superoxyde-dismutase humaine naturelle.

20. Analogue polypeptidiquede la manganèse-

superoxyde-dismutase humaine, caractérisé en ce qu'il

comprend un polypeptide du type manganèse-superoxyde-

dismutase humaine à une ou aux deux extrémités duquel

sont fixés un ou plusieurs acides aminés supplémentai-

res.

21. Analogue de complexe polypeptidique de manganèse, caractérisé en ce qu'il comprend un complexe polypeptidique de manganèse, un ou plusieurs acides aminés supplémentaires étant fixés à une ou aux deux extrémités de la portion polypeptidique dudit complexe.

22. Analogue de manganèse-superoxyde-

dismutase humaine, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux polypeptides, dont au moins un est un

analogue polypeptidique de manganèse-superoxyde-dismuta-

se humaine, complexé avec du manganèse sous n'importe laquelle de ses formes chimiques, ledit analogue de

dismutase ayant l'activité enzymatique de la manganèse-

superoxyde-dismutase humaine naturelle.

23. Mutant polypeptidique de manganèse-

superoxyde-dismutase humaine, caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide ayant une séquence d'acides aminés pratiquement identique à celle du polypeptide d'origine humaine appelé manganèse-superoxydedismutase,

mais en différant par un ou plusieurs acides aminés.

24. Mutant de complexe polypeptidique de manganèse, caractérisé en ce qu'il comprend un mutant polypeptidique de manganèse-superoxyde-dismutase humaine complexé avec du manganèse sous n'importe laquelle de ses formes chimiques, ledit mutant ayant l'activité

enzymatique de la manganèse-superoxyde-dismutase.

25. Mutant de manganèse-superoxyde-dismuta-

se humaine, caractérisé en ce qu'il comprend au moins

deux polypeptides, dont au moins un est un mutant poly-

peptidique de manganèse-superoxyde-dismutase humaine complexé avec du manganèse sous n'importe laquelle

de ses formes chimiques, et possédant l'activité enzyma-

tique de la manganèse-superoxyde-dismutase humaine naturelle.

26. Analogue de manganèse-superoxyde-

dismutase humaine, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux polypeptides, dont au moins un possède la séquence d'acides aminés représentée sur la figure 1, l'extrémité N-terminale de ladite séquence étant la lysine codée par les nucléotides 115-117 de la figure 1, et l'extrémité COOH-terminale de ladite séquence étant la lysine codée par les nucléotides 706-708 de la figure 1, plus un résidu méthionine supplémentaire

à l'extrémité N-terminale.