FI90353C - Plasmidi humaani mangaanisuperoksididismutaasin ilmentämiseksi bakteereissa sekä menetelmä entsymaattisesti aktiivisen humaani mangaanisuperoksididismutaasin tuottamiseksi ja talteenottamiseksi - Google Patents

Description

1 90353

Plasmidi humaani mangaanisuperoksididismutaasin ilmentåmisek-si bakteereissa sekå menetelmå entsymaattisesti aktiivisen humaani mangaanisuperoksididismutaasin tuottamiseksi ja tal-teenottamiseksi

Esillå olevassa hakemuksessa viitataan erilaisiin julkaisui-hin arabialaisin numeroin, jotka ovat suluissa. Tåydellisiå lainauksia nåistå viitteistå voidaan loytåå patenttihakemuk-sen lopusta vålittomåsti ennen patenttivaatimuksia. Nåmå jul-kaisut kokonaisuudessaan on tåsså yhteydesså sisållytetty viitteinå esillå olevaan hakemukseen kyseisen tutkimusalan tunnetun alueen kuvaamiseksi tåydellisemmin henkildille, jotka ovat aiheeseen perehtyneet, sellaisena kuin kyseinen tut-kimusalue tunnetaan esillå olevan keksinnon ja patenttivaati-musten esitysajankohtana.

McCord ja Fridovich (1) loysivåt vuonna 1968 superoksididis-mutaasin (SOD) sekå vapaiden happiradikaalien (02—) ilmene-misen. Superoksidiradikaaleja sekå muita erittåin reaktiivi-sia happilajeja valmistuu jokaisessa hengittåvåsså solussa sivutuotteina oksidatiivisessa hajoamisessa moniksi erilai-siksi makromolekyyleiksi ja solunkomponenteiksi (selonteon suhteen katso 2, 3). Metalloproteiinien ryhmå, joka tunnetaan superoksididismutaaseina, katalysoi hapetus-pelkistysreak-tiota 202~ + 2H+ -* H202 + 02 ja antaa tåten kåyttddn torjun-tamekanismin hapen myrkyllisyyttå vastaan.

On olemassa useita tunnettuja SOD:n muotoja, jotka sisåltåvåt erilaisia metalleja ja erilaisia proteiineja. SOD:sså låsnå oleviin metalleihin kuuluvat rauta, mangaani, kupari sekå sinkki. SOD:n tunnetuista muodoista kaikki katalysoivat samaa reaktiota. Nåmå entsyymit esiintyvåt monissa kehitysryhmisså. Superoksididismutaaseja, jotka sisåltåvåt rautaa, on ensisi-jaisesti prokaryoottisissa soluissa. Superoksididismutaaseja, joissa on kuparia ja sinkkiå, on loydetty oleellisesti kaikista eukaryoottisista organismeista (4). Superoksidi- dismutaaseja, jotka sisaltavat mangaania, on loydetty organis- meista, jotka ulottuvat mikro-organismeista ihmiseen saakka.

90353

Koska jokainen biologinen makromolekyyli voi toimia voimakkaan superoksidiradikaalin tuhoavan toiminnan kohteena, on kehittynyt mielenkiintoa SOD:n terapeuttisia mahdollisuuksia kohtaan. Tie-teellinen kirjallisuus esittaa, etta SOD saattaa olla kaytto-kelpoinen kliinisten sovellutusten laajalla alueella. Nåihin kuuluvat kasvaimen synnyn ja kasvun estaminen seka syovanvastais-ten laakkeiden (10) sytotoksisten ja sydantoksisten vaikutusten våhentaminen, verettomien kudosten suojaus (12) seka siittioiden suojaus (13). Lisaksi esiintyy mielenkiintoa tutkia SOD vaikutuk-sia vanhenemistapahtumaan (14).

Humaani SOD:n terapeuttisten mahdollisuuksien tutkimus on ollut rajoitettua, mika johtuu sen rajoitetusta saannista.

Superoksididismutaasilla on myos mielenkiintoa sen tulehduksen-vastaisten ominaisuuksien vuoksi (11). Harastå saadulla superoksididismutaasilla (orgoteiinilla) on havaittu tulehduksenvastai-sia ominaisuuksia, ja sita myydaan talla hetkella Euroopan osissa ihmislaakkeena. Sita myydaan myos Yhdysvalloissa elainlaakinta-valmisteena, erityisesti hevosten tulehtuneiden janteiden hoitoa vårten. Kuitenkin orgoteiinin saanti on rajoitettua. Aiemmilla tekniikoilla, joihin kuuluu orgoteiinin saanti haran- tai muista elainsoluista, on vakavia rajoituksia, ja nain saatu orgoteiini saattaa saada aikaan ihmisessa allergisia reaktioita, koska se ei ole peraisin ihmisesta.

Kuparisinkkisuperoksididismutaasi (CuZn SOD) on superoksidi-dismutaasin erilaisista muodoista eniten tutkittu ja parhaiten karakterisoitu.

Humaani CuZn SOD on dimeerinen metalliproteiini, joka koostuu identtisista, ei kovalenttisesti kytketyista alayksikoista, jois-ta kullakin molekyylipaino on 16 OOO daltonia ja jotka sisaltavat yhden atomin kuparia ja yhden sinkkia (5). Kukin alayksikko koostuu 153 aminohaposta, joiden sekvenssi on maaritetty (6, 7).

3 90353

Humaani CuZn-superoksididismutaasia koodittava cDNA on kloonat-tu (8). Kloonatun DNA : n taydellinen sekvenssi on myos rnaari-tetty (9). Ennen kaikkea on kuvattu (24, 25) ilmentymisvekto-reita, jotka sisaltavat DNA:a koodittavaa superoksididismutaasia superoksididismutaasin valmistamiseksi bakteereissa seka erista-miseksi niista. Superoksididismutaasi-DNA:n ilmentyminen seka SOD:n valmistus hiivassa on myos julkaistu (26).

Askettain on karakterisoitu CuZn SOD-geenilokus humaani kromo-somilla 21 (27), ja viimeaikaiset kehitystulokset, jotka koske-vat CuZn superoksididismutaasia , on esitetty yhteenvetona (28).

Huomattavasti vahemman tiedetaan mangaanisuperoksididismutaasista (MnSOD).E. coli K-12:n MnSOD on askettain kloonattu ja kartoi-tettu (22). Barra et al. julkaisevat 196 aminohapon mittaisen aminohapposekvenssin MnSOD-polypeptidille, joka on eristetty humaani maksasoluista (19). Aiemmat julkaisut eroavat kuitenkin sen seikan suhteen, mita tulee MnSOD-molekyylin rakenteeseen, onko siina kaksi tax nelja identtista polypeptidialayksikkoa (19, 23). On kuitenkin selvaa, etta MnSOD-polypeptidi ja CuZn SOD-polypeptidi eivat ole homologisia (19). Eri lahteista saatujen MnSOD:den ja FeSOD:den aminohapposekvenssien homologioi-ta on myos verrattu (18).

Baret et al. julkaisevat, etta rotalla humaani MnSOD:n puoliin-tumisaika on oleellisesti pitempi kuin humaani Cu SOD:n puoliin-tumisaika; he julkaisevat myos, etta rotalla humaani MnSOD ja rotan Cu SOD eivat ole tehokkaita tulehduksenvastaisina aineina, kun taas haran Cu SOD ja humaani Cu SOD ovat taysin aktiivisia (20).

McCord et al. julkaisevat tiedon, jonka mukaan luonnossa esiin-tyva humaani mangaanisuperoksididismutaasi suojaa ihmisen fagosy-. . toivia liuskatumaisia ( PMN) leukosyytte ja superoksidin vapailta radikaaleilta paremmin kuin haran tai sian CuZn superoksidi-dismutaasi "in vitro"-kokeissa (21).

4 SO 353

Keksinnosså on kyse humaani mangaanisuperoksididismutaasin polypeptidianalogista, joka kåsittåå 199 aminohappoa, jonka sekvenssisså on metioniini N-pååsså ja jolla on kuviossa 1 annettu mååråtty sekvenssi. Barra et al., J. Biol. Chem., 259: 12595-12601, (1984) toisaalta esittåå sivun 12596 ku viossa 1 196 aminohappoa kåsittåvån mangaanisuperoksididismutaasin, jonka N-påå on lysiini. Edelleen Barra et al. ei esi-tå tai edes ehdota, ettå mangaanisuperoksididismutaasi, jolla on kolme lisåaminohappoa, voisi olla aktiivinen entsyymi. On huomattava, ettå lukuunottamatta esillå olevan polypeptidin N-påån lisåmetioniinia, kaksi muuta lisåaminohappoa, Gly-Trp, sijaitsevat molekyylin keskellå.

Esillå olevan polypeptidin ja viitteen Barra et al. mukaisen polypeptidin vålillå on kolme eroavuutta siinå, ettå esillå olevassa polypeptidisså kolmessa paikassa on glutaamihappo-tåhde (Glu), joissa kohdissa Barra et al. esittåå glutamiini-tåhteen (Gin). Siten on kuusi pååeroa esillå olevan polypeptidin ja viitteen Barra et al. mukaisen polypeptidin vålillå (nimittåin kolme lisåaminohappoa ja kolme erilaista aminohappoa) .

Viite Barra et al. ei esitå nyt esitettyå erityistå aminohap-posekvenssiå eikå se myoskåån ehdota, ettå se voitaisiin il-mentåå bakteereissa, eikå varmasti ollut ilmeistå, ettå siten ilmennettynå se olisi ollut entsymaattisesti aktiivinen. To-siasiassa Barra et al. ei edes keskustele 196 aminohappoa kåsittåvån mangaanisuperoksididismutaasin entsymaattisesta aktiivisuudesta. Siten alan ammattimiehelle ei olisi ollut ilmeistå, ettå esillå oleva keksint6, erityisesti superoksi-didismutaasin erityinen polypeptidianalogi, joka kåsittåå 199 aminohappoa, olisi entsymaattisesti aktiivinen.

Viitteen Barra et al. sivulla 12598 våitetåån, ettå "kaikissa mangaanisuperoksididismutaaseissa on 7 glysiinitåhdettå ase-missa 76, 77, 94, 101, 112, 130 ja 132 ja 3 proliinitåhdettå asemissa 5, 165 ja 170. Kaikkien tåhteiden pitåisi olla oleellisia sekundåårisen rakenteen yllåpitåmiseksi." Haluamme 5 90353 painottaa, ettå esillå olevassa polypeptidisså låsnå olevat kaksi lisåaminohappoa sijaitsevat kohdissa 122 ja 123, jotka sijaitsevat viitteesså Barra et al. viitatun kriittisen alu-een keskellå. Toinen nåistå kahdesta lisåaminohaposta on gly-siinitåhde ja Barra et al. tunnustaa, ettå glysiinitåhteet ovat tårkeitå sekundåårisen rakenteen yllåpitåmiseksi. Viit-teen Barra et al. mukaisessa sekvenssisså ei ole nåitå lisåglys iinitåhtei tå.

Lisåksi haluaitime painottaa, ettå kaksi glutamiinihapon muu-tosta glutamiiniksi ovat myos molekyylin keskellå (tåhteet 88 ja 109) ja nåmå muutokset aminohapposekvenssisså vaikuttavat molekyylivaraukseen, mikå vaikuttaisi myos polypeptidin las-kostumiseen ja siten polypeptidin aktiivisuuteen.

On hyvin tunnettua tekniikan tasossa, ettå entsymaattisesti aktiivinen polypeptidi on oikean primåårisen, sekundåårisen tai tertiåårisen rakenteen tulos. Jos joko primåårinen, se-kundåårinen tai tertiåårinen rakenne muuttuu, entsymaattinen aktiivisuus voi muuttua.

Siten kuusi muutosta esillå olevan polypeptidin aminohappo-jårjestyksesså tai "primåårisesså" rakenteessa (joista neljå ovat molekyylin keskellå) voisi vaikuttaa sekundååriseen ja tertiååriseen (konformationaaliseen) polypeptidin rakentee-seen. Siten polypeptidin entsymaattinen aktiivisuus voisi muuttua. Kuten edellå on esitetty, jopa viite Barra et al. ehdottaa, ettå aminohappotåhteiden, jotka muodostavat luon-nollisesti esiintyvån hMbnSOD:n primåårisen rakenteen, pitåi-si olla relevantteja sekundåårisen rakenteen yllåpitåmiseksi.

EP-hakemusjulkaisussa 138 111 esitetåån humaani Cu-Zn-supe-. . roksididismutaasin kloonaus ja ilmentåminen E. colissa ja hiivassa. Kuitenkin Cu-Zn-superoksididismutaasi ei ole sukua MnSOD:lle eikå nåiden kahden entsyymin vålillå ole sekvens-sihomologiaa (katso Barra et al., sivu 12597). Siten Cu-Zn- 90 353 entsyymin kloonaus ja ilmentåminen ei millåån tavoin opeta tai ehdota miten kloonataan tai ilmennetåån entsymaattisesti aktiivista MnSOD:tå.

Esillå oleva keksinto koskee plasmidia humaani mangaanisuper-oksididismutaasin analogin ilmentåmiseksi prokaryoottisessa isåntåsolussa.

Esillå oleva keksinto antaa edelleen kåyttoon menetelmån entsymaattisesti aktiivisen humaani MnSOD:n valmistusmenetelmån bakteereissa sekå menetelmån tållaisen entsymaattisesti aktiivisen humaani MnSOD:n talteenottamiseksi sekå puhdistami- seksi.

Esillå oleva menetelmå koskee myds humaani mangaanisuperoksi-didismutaasin tai sen analogien tai mutanttien kåyttoå kata-lysoimaan superoksidiradikaaleja vetyperoksidiksi ja molekyy-limuodossa esiintyvåksi hapeksi. Erityisesti esillå oleva keksinto koskee bakteereiden avulla valmistetun MnSOD:n tai sen analogien tai mutanttien kåyttoå våhentåmåån paikallista verettomyyttå seuraavan uudelleenperfuusion aiheuttamaa vau-riota sekå pidentåmåån leikattujen, eristettyjen elinten elinaikaa.

DNA-molekyyli, joka sisåltåå cDNA:n, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaaspolypeptidiå tai sen analogia tai mutanttia, on eristetty humaani T-solukirjastosta. On saatu selville kaksisåikeisen DNA-molekyylin nukleotidisekvenssi, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidiå tai sen analogia tai mutanttia. Yhden såikeen sekvenssi, joka koodittaa polypeptidiå tai sen analogia, esitetåån kuvassa 1, nukleotidista 115 geenin alapuolelle nukleotidiin 708 saakka, viimeksi mainittu mukaan lukien. Muut sekvenssit, jotka koodit-tavat analogia tai mutanttia, saattavat olla suurin piirtein samanlaisia kuin såie, joka koodittaa polypeptidiå. Kaksisåikeisen DNA-molekyylin yhden såikeen nukleotidisekvenssi, joka 7 90353 koodittaa 24 aminohapon mittaista esipeptidia nukleotideista numero 43-114, mainitut nukleotidit mukaanlukien, esitetaån myos kuvassa 1.

Kaksisaikeinen cDNA tai jokin muu kaksisaikeinen DNA-molekyyli, joka sisåltaa nukleotidisåikeen, jossa on sekvenssi, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidia tai sen analogia tai mutanttia, saatetaan sisallyttaa kloonausvehikkeliin, kuten esimerkiksi plasmidiin tai virukseen. Kumpikin DNA-molekyyli saatetaan vieda sisaan soluun, joko prokaryoottiseen, esimerkiksi bakteerisoluun, tai eukaryoottiseen soluun, esimerkiksi hiiva- tai nisåkåssoluun, tunnettuja menetelmia kåyttåmållå, mukaanluettuina menetelmat, mutta ei niihin rajoittuen, joihin sisaltyvat kloonausvehikkelit, jotka sisaltavat jomman kumman molekyylin.

Mieluummin cDNA tai DNA, joka koodittaa humaani mangaanisuper-oksididismutaasipolypeptidia tai sen analogia tai mutanttia, liitetåan plasmidiin, esim. pMSE-4:aan tai pMSARB4:aan, ja sitten se viedaan sopivaan isantåsoluun, jossa DNA voi ilmentya ja humaani mangaanisuperoksididismutaasi-, (hMnSOD)-polypeptidi : : : tai sen analogi tai mutantti voidaan valmistaa. Edullisiin isantasoluihin kuuluvat Escherichia coli, erityisesti E. coli A4255 seka E. coli A1645. Plasmidi pMSE-4, E. colin kannassa .: A4255, on tallennettu the American Type Culture Collectioniin ATCC-tulonumerolla 53250. Plasmidi pMSARB4 voidaan saada kuvassa 4 esitetylla tavalla ja kuten kuvataan kuvia koskevassa ku-vauksessa.

Soluja, joihin sellaisia DNA-molekyyleja on viety sisaan, voidaan viljella tai kasvattaa aiheeseen perehtyneelle tutuin menetelmin, sopivissa olosuhteissa, jotka sallivat DNA:n trans-kription mRNA:aan seka mRNA:n ilmentymisen proteiinina. Synty-va mangaanisuperoksididismutaasiproteiini voidaan sitten ottaa talteen.

8 90353

Voidaan rayos valmistaa elåinlååketieteellisiå ja farmaseutti-sia koostumuksia, jotka sisåltåvåt humaani MnSOD:a tai sen ana-logeja tai mutantteja seka sopivia kantaja-aineita. Tata humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogeja tai mutantteja voidaan kayttaa katalysoimaan seuraavaa reaktiota: 20 *· + 2H+ -> H202 -i- 02 ja tåten voidaan vahentaa solun tulehdusta, jonka superoksidira-dikaalit ovat aiheuttaneet.

Tarkemmin sanottuna, naitå entsyymeja tai niiden analogeja tai mutantteja saatetaan kayttaa våhentåmåån tulehdusta, jonka aiheuttaa paikallista verettomyytta seuraava uudelleenperfuusio, leikattujen, eristettyjen elinten elinajan lisaamiseen tai tuleh-dusten hoitoon.

Kyseessa oleva keksinto koskee menetelmaa entsymaattisesti aktii-visen humaani mangaanisuperoksididismutaasin tai sen analogin tai mutantin valmistamiseksi bakteerisolussa. Bakteerisolu si-saltaa DNA-sekvenssin ja pystyy ilmentamaan DNA-sekvenssia, joka koodittaa mangaanisuperokskdidismutaasia tai sen analogia tai mutanttia. Menetelmaan sisaltyy bakteerisolun yllapitaminen sopivissa olosuhteissa seka sopivassa valmistuselatusaineessa. Valmistukseen kaytettavaa elatusainetta taydennetaan Mn++:n sellaisella maaralla, etta Mn++:n konsentraatio, joka on solun saatavilla elatusaineessa, on suurempi kuin 2 miljoonasosaa.

Kyseessa olevan keksinnon edullisessa patenti.nsuoritusmuodossa bakteerisolu on Eschericia coli, joka sisaltaa plasmidin, joka sisaltaa DNA-sekvenssin, joka koodittaa humaani mangaanisuper-oksididismutaasipolypeptidia, esimerkiksi pMSE-4 tai pMS RB4 E. colin kannassa A4255. Mn++:n konsentraatio valmistukseen kaytettavassa elatusaineessa on noin 50-1500 mi 1joonasosaa, siten etta konsentraatiot 150-750 miljoonasosaa ovat edulliset.

9 90353

Kyseessa oleva keksinto koskee menetelmaa mangaanisuperoksidi-dismutaasin tai sen analogin takaisin saamiseksi bakteerisoluis-ta, jotka sisaltåvåt mainitun entsyymin. Soluja kasitellaan ensin, jotta saadaan takaisin proteiinijae, joka sisaltaa proteii-neja, joita solxaissa on lasna, humaani mangaanisuperoksidi-dismutaasi tai sen analogi tai mutantti mukaan luettuna, ja sitten proteiinijaetta kasitellaan humaani mangaanisuperoksidi-dismutaasin tai sen analogin tai mutantin takaisin saamiseksi. Kyseessa olevan patentin edullisessa suoritusmuodossa soluja kasitellaan ensin liukoisten proteiinien erottamiseksi liukene-mattomista proteiineista seka solunseinåman pirstaleista, ja liukoiset proteiinit otetaan talteen. Sitten liukoisia proteii-neja kasitellaan liukoisten proteiinien erottamiseksi, esim. saostamalla liukoisten proteiinien jae, joka sisaltaa hMnSODrn tai sen analogin tai mutantin, seka jae, joka sisaltaa hMnSOD:n tai sen analogin tai mutantin,saadaan takaisin. Liukoisten proteiinien takaisin saatua jaetta kasitellaan sitten, siten etta humaani mangaanisuperoksididismutaasi tai sen analogi saadaan talteen.

Kyseessa olevan keksinnon edullisempi patentinsuoritusmuoto koskee menetelmaa humaani mangaanisuperoksididismutaasin tai sen analogin tai mutantin saamiseksi bakteerisoluista, jotka sisaltavat humaani mangaanisuperoksididismutaasin tai sen analogin tai mutantin. Menetelmaan sisåltyy ensin bakteerisolujen eris-taminen valmistukseen kåytetystå elatusaineesta seka niiden sus-pensointi sopivaan liuokseen, jonka pH on noin 7,0-8,0. Sitten solut pirstotaan ja sentrifugoidaan ja syntyvåå supernatanttia kuumennetaan noin 30-120 minuutin ajan 55-65°C:n låmpotilassa, mieluummin 45-75 minuuttia 58-62°C:ssa ja viela mieluummin noin yhden tunnin ajan 60°C:ssa, ja sitten se jaahdytetaan alle 10°C:een, mieluummin 4°C:een. Jokainen muodostuva saostuma on poistettava sentrifugoiden, ja jaahdytetty supernatantti dialysoidaan sopivaa puskuria vastaan, esimerkiksi 2 mM kalium-fosfaattipuskuria vastaan, jonka pH on noin 7,8. Dialyysi suoritetaan mieluummin ultrafi 1traat ion avulla kayttamalla suodatinmembraania, joka on pienempi kuin 30K. Samanaikaisesti 10 90353 dialyysin kanssa tai sen jålkeen jååhdytetty supernatantti saatetaan valinnaisesti konsentroida sopivaan tilavuuteen, esimerkiksi 0,03:een sen alkuperåisestå tilavuudesta. Pidåt-tynyt aines eluoidaan sitten anionikromatografiapylvååsså sopivasti puskuroidun liuoksen avulla, esimerkiksi liuoksel-la, joka on ainakin 20-millimolaarinen kaliumfosfaatin suh-teen ja jonka pH on noin 7,8. Kootaan eluentin jakeet, jotka sisåltåvåt superoksididismutaasin, ne yhdistetåån ja dialy-soidaan noin 40-millimolaarista kaliumasetaattia, jonka pH on 5,5, vastaan. Dialysoidut, yhdistetyt jakeet eluoidaan sitten kationinvaihtokromatografiapylvåån kautta kåyttåen lineaaris-ta gradienttia, joka on noin 40-200-millimolaarinen kalium-asetaatin suhteen ja jonka pH on noin 5,5. Kootaan huippuja-keet, jotka sisåltåvåt superoksididismutaasin, ja ne yhdistetåån. Yhdistetyt huippujakeet saatetaan sitten valinnaisesti dialysoida sopivaa liuosta, esim. vettå tai puskuriliuosta vastaan, joka on noin 10-millimolaarinen kaliumfosfaatin suhteen ja jonka pH on noin 7,8.

Esillå oleva keksintå koskee my6s puhdistettua, entsymaatti-sesti aktiivista humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogeja, esim. met-hMnSOD:a, tai sen mutantteja, jotka on valmistettu esillå olevan keksinnon mukaisin menetelmin.

Keksinndn oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa pa-tenttivaatimuksissa.

Kuva 1. Humaani MnSQD-CDNA:n sekvenssi

Kuva 1 esittåå kaksisåikeisen DNA-molekyylin yhden såikeen nukleotidisekvenssiå, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasia sekå humaani MnSOD:n 198 aminohapon mittaista sekvenssiå, joka vastaa mainittua DNA-sekvenssiå. Kuva 1 esittåå myds kaksisåikeisen DNA-molekyylin yhtå såiettå, joka koodittaa kypsåå humaani MnSOD:a edeltåvåå peptidiå, joka koostuu 24 aminohaposta, sekå aminohapposekvenssiå, joka vastaa tåtå DNA-sekvenssiå. Kuvassa esitetåån myås 5'- ja 3'-sekvenssit, joille ei translaatiota suoriteta.

11 90353

Kuva 2. pMSE-4:n rakenne: humaani MnSOD:n ekspressioplasmidi Plasmidi pMS8-4, joka sisalsi MnSODrn EcoRI (R-^)-insertilla, pilkottiin tåydellisesti Ndel- ja Narl-restriktioentsyymien avul-la. Suuri fragmentti eristettiin ja sidottiin synteettisen oli-gomeerin kanssa, kuten kuvataan kuvassa 2. Syntyva plasmidi, pMS8-NN sisaltaa koodittavan alueen kypsalle MnSODrlle, jota koodittavaa aluetta edeltaa ATG-aloituskodoni. Ylla esitetty plasmidi pilkottiin EcoRI:lla, paatteet tåydennettiin polyme-raasi I:n Klenow-fragmentilla ja pilkottiin edelleen Ndelrlla. Pieni fragmentti, joka sisalsi MnSOD-geenin, liitettiin pSODit,13 : een , jota kasiteltiin Ndelrlla ja Stulrllå. pSODet-13 saatetaan saada, kuten on kuvattu kasittelyn alaisena olevas-sa US-patenttihakemuksessa 644 245 ja joka tahan yhteyteen liitetaan viitteena. Tama tuotti plasmidin pMSE-4:n, joka sisalsi MnSODra koodittavan alueen, jota edelsi ribosomien sitou-tumiskohta cll ja joka oli promoottorin kPL saatelyn alainen. Plasmidi pMSE-4 on tallennettu the American Type Culture Collectioniin ATCC-tulonumerolla 53250.

Kuva 3. Mn++:n konsentraation vaikutus E. colissa valmistetun S0D:n aktiivisuuteen_

Kuvassa 3 esitetty kartta ilmaisee korrelaation, joka vallitsee E. colin kannan A 4255, joka sisaltaa plasmidin pMSE-4, valmista- man liukoisen rekombinantti-MnSOD:n spesifisen aktiivisuuden, ilmaistuna yksikoina/mg seka ei-induktio- (32°C) etta induktio-(42°C) olosuhteissa, ja elatusaineen Mn++:n konsentraation valilla.

‘ ‘ Kuva 4. pMSARB4:n rakenne: humaani MnS0D:n ilmentymisplasmidi

Tet ekspressiovektori , pARB, valmistettiin pSODd-^T-ll:sta taydellisen EcoRI-kasittelyn avulla, jonka jalkeen sita pilkottiin osittain BamHI-restriktioentsyymien avulla. pSOD/i^T-ll on tallennettu the American Type Culture Collectioniin (ATCC) tulonumerolla 53468. Uutettu plasmidi kytkettiin seuraavan synteettisen oligomeerin kanssa -·- 5 1 - AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3' V 3'- GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5' 12 90 353 jolloin tuloksena oli pARB, joka sisaltaa ΐ1 P^-promoot tor in .

MnSODrn ekspressioplasmidin pMSE-4:n EcoRI-fragmentti, joka sisaltaa ribosomin sitoutumispaikan cll seka kypsaa entsyymia koodittavan taydellisen sekvenssin, vietiin pARB:n ainoaan EcoRI-kohtaan. Syntyva plasmidi. pMSARB4 sisaltaa MnSOD-geenin, joka on ^P :n sååtelyn alainen, seka cll RBS: n ja antaa resis-tenssin tetrasykliinille.

Kaksisaikeinen DNA-molekyyli, joka sisaltaa cDNA:n, joka koodit-taa humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidiå tai sen analogia tai mutanttia, on eristetty humaani T-solu DNA-kirjas-tosta. Kaksisaikeisen DNA-molekyylin nukleotidisekvenssi, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidia tai sen analogia tai mutanttia, on keksitty. DNA-molekyylin yhden saikeen sekvenssi, joka koodittaa humaani mangaanisuper-oksididismutaasipolypeptidia tai sen analogia, esitetaan kuvas-sa 1, ja se sisaltaa nukleotidinumerot 115-708, mainitut nukleo-tidit mukaanluettuina. Yhden saikeen sekvenssi, joka koodittaa hMnSOD-analogia tai mutanttia, on suurin piirtein samankaltainen kuin saie, joka koodittaa hMnSOD-polypeptidia. Kuvassa 1 esitetaan myos humaani mangaanisuperoksididismutaasia edeltava pepti-di. Nukleotidit numerot 43-114, mainitut nukleotidit mukaan luettuina, koodittavat tata peptidia.

Menetelmat cDNArn valmistamiseksi seka DNA:n sekvenssin maaritta-miseksi, joka sekvenssi koodittaa humaani mangaanisuperoksidi-dismutaasipolypeptidia, sen analogia tai mutanttia, ovat tutki-mustyohon perehtyneiden tuntemia, ja niita kuvataan yksityis-kohtaisemmin tassa yhteydessa myohemmin. Ennen kaikkea, nyt on loydetty DNA-sekvenssi, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasia, ja tunnettuja synteesimenetelmia voidaan kayttaa taman sekvenssin osia sisaltavien DNA-molekyylien valmistamiseksi .

Tavanomaiset kloonausvehikkelit, kuten esimerkiksi plasmidit, esimerkiksi pBR322, virukset tai bakteriofaagit, esim. , voidaan 13 90353 muuntaa tai rakentaa tunnettuja menetelmiå kåyttåmålla uusien kloonausvehikkeleiden valmistamiseksi, jotka vehikkelit sisaltavat cDNA:n, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaa-sipolypeptidiå tai sen analogeja tai mutantteja. Samalla tavalla voidaan sellaisia kloonausvehikkeleita muuntaa tai rakentaa, siten etta ne sisaltavat DNA-molekyyleja, joiden yhteen saikee-seen sisåltyy segmentti, jolla on kuvassa 1 esitetty sekvenssi humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidiå vårten tai segmentteja, jotka ovat oleellisesti sen kaltaisia. DNA-molekyyli, joka on sijoitettu valiin, voidaan valmistaa erilaisin menetel-min, joihin kuuluu entsymaattinen tai kemiallinen synteesi.

Tuloksena saadut kloonausvehikkelit ovat kemiallisia kokonaisuuk-sia, joita ei esiinny luonnossa ja jotka voidaan luoda uudenai-kaisella tekniikalla, jota kuvataan yhdistelmå-DNA-tekniikkana. Kloonausvehikkeli on mieluummin plasmidi, esimerkiksi pMSE-4 tai pMS RB4. Nåma kloonausvehikkelit saatetaan vieda sisaan soluihin, joko prokaryoottisiin, esimerkiksi bakteerisoluihin (Escherichia coli, B. subtilis, jne.), tai eukaryoottisiin soluihin, eismerkiksi hiiva- tai nisåkåssoluihin, kåyttåmålla tutkimustyosså tunnettuja menetelmiå, kuten esimerkiksi trans-formaatiota, transfektiota yms. Solut, joihin kloonausvehikkelit viedaan sisaan, sisaltavat tåten cDNA:n, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidiå tai sen mutanttia tai analogia, jos cDNA oli lasna kloonausvehikkelissa, tai solut sisaltavat DNA:n, joka sisaltaa saikeen, jolla koko-naan tai jonka osalla on sekvenssi kuvassa esitettya humaani MnSOD-polypeptidiå vårten tai samankaltainen sekvenssi, jos sellainen DNA oli lasna kloonausvehikkelissa.

Escherichia colin solut ovat edullisia isantasoluja kyseessa olevan keksinnon mukaisia kloonausvehikkeleita vårten. Talla hetkella edullinen E. colin auksotroofinen kanta on A1645, joka on tallennettu the American Type Culture Collectioniin Rockvillessa, Marylandissa, USA, ja joka sisaltaa plasmidin pApoE-Ex2, ATCC-talletusnumerolla 39787. Kaikki the American 14 90353

Type Culture Collectioniin tehdyt tallennukset, joihin tassa hakemuksessa viitataan, suoritettiin Budapestin sopimuksen mukai-sesti perustuen sopimustekstiin "the International Recognition of the Deposit of Microorganisms".

A1645 saatiin Al637:sta valitsemalla Gal+:n suhteen (kyky kayt-taa galaktoosia) seka tetrasykliiniresistenssin haviamisen suhteen. Se sisaltaa vielå faagi λ:η aineosia. Sen fenotyyppi on C600 r~m+ gal+ thr- leu- lacZ- bl (λοΙ857ΔΗ1ABamHl N+).

A1637 saatiin C600:sta siirtamalla (insertoimalla) genomin osa, joka sisalsi geenin tetrasykliiniresistenssia vårten, galaktoosi-operoniin seka faagi λ:η elementteihin, jotka sisaltavat aine-osat cl-repressorin synteesia vårten. C600 on saatavissa the American Type Culture Collectionista, ATCC-talletusnumerolla 23724.

Escherichia colin fototrooppiset kannat, jotka tekevat mahdolli-seksi polypeptidiekspression korkean tason vielapå, kun niita on kasvatettu minimaalisessa elatusaineessa, ovat vielapa isantina edullisempia ekspressoitaessa geeneja, jotka koodittavat mangaani-superoksididismutaasia. Nykyisin eras edullinen kanta on A4255. Kanta A4255, joka sisaltaa plasmidin pMSE-4, on tallen-nettu the American Type Culture Collectioniin talletusnumerolla 53250.

Syntyvia soluja, joihin DNA, joka koodittaa humaani mangaani-superoksididismutaasipolypeptidia tai sen analogia tai mutant-tia, on viety sisaan, saatetaan kasitella, kun niita on kasvatettu tai viljelty tarkoituksenmukaisesti sopivissa olosuhteissa, jotka ovat aiheeseen perehtyneille tuttuja, niin etta DNA ohjaa DNA:n koodittaman geneettisen informaation ilmentymista, esimerkiksi, niin etta se ohjaa hMnSOD-polypeptidin tai sen analugin tai mutantin ilmentymista, ja solu ilmentaa hMnSOD-polypeptidia tai sen analogia tai mutanttia, joka voidaan sitten saada takaisin.

is 90 3 53

Koko tassa hakemuksessa kåytetty termi "superoksididismutaasi" (SOD tarkoittaa entsyymia tai polypeptidia, joka toimii super-oksidi- tai hapettomien radikaalien reseptorina tai joka kata-lysoi seuraavan dismutaatioreaktion: 20 2~ + 2H+ ------> 02 + H202

Termi "manqaaaisuperoksididismutaasi" (MnSOD) tassa yhteydessa kaytettyna tarkoittaa alkuaine mangaania kaikissa sen kemialli-sissa muodoissa.

Termi "humaani mangaanisuperoksididismutaasipolyDeptidi" kyseesså olevan hakemuksen yhteydessa kaytettyna tarkoittaa polypeptidia, jossa on 198 aminohappoa, ja jonka aminohapposekvenssin osa esitetaan kuvassa 1: sekvenssin N-paate on lysiini, jota koodittavat kuvan 1 nukleotidit 115-1.17, ja sekvenssin COOH-paate on lysiini, jota koodittavat kuvan 1 nukleotidit 706-708.

Termi "polynukleotidimangaanikompleksi" kyseesså olevan hakemuksen yhteydessa kaytettyna tarkoittaa molekyylia, johon sisaltyy humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidi kompleksina mangaanin kanssa, joka on misså tahansa kemiallisessa muodossa, jolla molekyylilla on luonnossa esiintyvan humaani mangaani-superoksididismutaasin entsymaattista aktiivisuutta.

Termi "humaani mangaanisuperoksididismutaasi" kyseesså olevan hakemuksen yhteydessa kaytettyna tarkoittaa molekyylia, johon sisaltyy ainakin kaksi humaani mangaanisuperoksididismutaasi-polypeptidiå kompleksina mangaanin kanssa, joka on misså tahansa kemiallisessa muodossaan, ja jolla polypeptidillå on luonnossa esiintyvån humaani mangaanisuperoksididismutaasin entsymaattista aktiivisuutta.

Termi "humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidin analogi" kyseesså olevan hakemuksen yhteydesså kåytettynå tarkoittaa polyoeptidiå, johon sisåltyy humaani mangaanisuperoksidi-dismutaasipolypeptidi, jonka joko molempiin tai toiseen pååhån on kiinnittynyt yksi tai useampia lisåksi tulevia aminohappoja.

16 90353

Termilla "polypeptidimangaanikompleksin analogi" kyseessa ole-van hakemuksen yhteydessa kaytettyna tarkoitetaan molekyylia, johon sisaltyy polypeptidimangaanikompleksi, jonka polypeptidi-osaan sisaltyy yksi tai useampia lisaksi tulevia aminohappoja, jotka ovat kiinnittyneet jompaan kumpaan tai molempiin paihin.

Termilla "humaani mangaanisuperoksididismutaasin analogi" kyseessa olevan hakemuksen yhteydessa kaytettyna tarkoitetaan molekyylia, johon sisaltyy ainakin kaksi polypeptidia, joista ainakin yksi on humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidin analogi, kompleksina mangaanin kanssa, joka on missa tahansa kemialli-sista muodoistaan, ja jonka polypeptidin analogilla on luonnos-sa esiintyvan humaani mangaanisuperoksididismutaasin entsymaat-tista aktiivisuutta.

Termilla "humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidin mutantti" kyseessa olevan hakemuksen yhteydessa tarkoitetaan polypeptidia, jonka aminohapposekvenssi on suurin piirtein yhtalai-nen humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidin kanssa, mutfca joka eroaa siita yhden tai useamman aminohapon suhteen.

Termilla "polypeptidimangaanikompleksin mutantti" tarkoitetaan molekyylia, johon sisaltyy humaani mangaanisuperoksididismutaa-sipolypeptidin mutantti kompleksina mangaanin kanssa, joka on jos-sain kemiallisista muodoistaan, ja jolla kompleksilla on mangaanisuperoksididismutaasin entsymaattista aktiivisuutta.

Termilla "humaani mangaanisuperoksididismutaasin mutantti" kyseessa olevan hakemuksen yhteydessa kaytettyna tarkoitetaan molekyylia, johon sisaltyy ainakin kaksi polypeptidia, joista polypeptideista ainakin yksi on humaani mangaanisuperoksidi-dismutaasipolypeptidin mutantti kompleksina mangaanin kanssa, joka on jossain kemiallisista muodoista,ja jolla peptidilla on luonnossa esiintyvan humaani mangaanisuperoksididismutaasin entsymaattista aktiivisuutta.

17 90353 hMnSOD-polypeptidin ja hMnSODrn mutantteja, jotka on sisållytetty kyseessa olevan keksinnon osana, voidaan valmistaa suoritta-malla kuvan 1 mukaisen DNA-sekvenssin mutaatio, jonka sekvenssin N-påate on lysiini, jota nukleotidit 115-117 koodittavat, ja jonka sekvenssin COOH-paåtettå koodittavat nukleotidit 706-708.

DNA:n mutaatio voidaan suorittaa menetelmin, jotka ovat aihee-seen perehtyneelle tuttuja, esimerkiksi menetelmån avulla, jonka Bauer et al. ovat esittåneet julkaisussa Gene 37:73-81 (1985). Sekvenssi, jolle mutaatio on suoritettu, voidaan sijoittaa valiin (insertoida) sopiviin ekspressiovektoreihin kyseessa olevassa hakemuksessa kuvatulla tavalla, jotka vektorit sitten viedaån soluihin, joita sitten kasitellaan, niin etta DNA, jolle mutaatio on suoritettu, ohjaa hMnSOD-polypeptidimutanttien ja hMnSOD-mutanttien ilmentymista.

Humaani mangaanisuperoksididismutaasin oletetaan olevan proteii-nin, jolla on ainakin kaksi, mahdollisesti nelja yhtalaista ala-yksikkoa, joista kullakin on noin 198 aminohappoa sekvenssisså, joka on esitetty kuvassa 1 humaani mangaanisuperoksididismutaa-sille ja jonka N-paassa on lysiini, joka on kuvan 1 mukaisten nukleotidien 115-117 koodittama, ja jonka sekvenssin COOH-paate on lysiini, jota koodittavat kuvan 1 nukleotidit 706-708.

Humaani MnS0D:a tai sen analogeja tai mutantteja saatetaan valmistaa soluista, joihin on viety sisaan DNA:a tai cDNA:a, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogeja tai mutantteja. Tata humaani MnS0D:a tai sen analogeja tai mutantteja saatetaan kayttaa katalysoimaan superoksidianionin dismutaatio tai yksivalenssinen pelkistyminen protonien lasna-ollessa, jotta muodostuu vetyperoksidia seuraavan yhtalon mu-kai sesti : , 0Li+ humaani MnSOD „ Λ 20^i + 2H -> H202 + 02

Voidaan myos valmistaa elainlaaketieteellisia ja farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisaltavat tehokkaita maaria hMnS0D:a 18 90 353 tai yhtå tai useampaa hMnSOD-analogia tai mutanttia seka sopi-vaa kantaja-ainetta. Sellaiset kantaja-aineet ovat aiheeseen perehtyneiden hyvin tuntemia. hMnSODra tai sen analogia tai mutanttia saatetaan annostella suoraan tai koostumuksen muodossa elåimelle tai ihmiselle, esimerkiksi, jotta voidaan hoitaa tuleh-duksia tai vahentaa vauriota, jonka hapettomat radikaalit aiheuttavat uudelleenperfuusiossa, joka seuraa verettomyytta tai elinsiirtoa. hMnSODra tai sen analogia tai mutanttia saatetaan myos lisata suoraan tai koostumuksen muodossa eriste-tyn elimen perfuusiovåliaineeseen, jotta vahennetaan eristetyn elimen vaurioitumista, jonka aiheuttavat hapettomat radikaalit elimen irrottamista seuraavan perfuusion aikana, taten pidenne-tåån elimen elinaikaa. Lisaksi hMnSODra tai sen analogia tai mutanttia saatetaan kayttaa neurologisen vaurion vahentamiseksi verettomyytta seuraavan uudelleenperfuusion aikana seka keuhko-putken ja keuhkojen kasvuhairion hoitamiseksi.

On myos keksitty menetelma entsymaattisesti aktiivisen humaani mangaanisuperoksididismutaasin tai sen analogin tai mutantin val-mistamiseksi bakteerisolussa. Bakteerisolu sisaltaa DNA-sekvens-sin seka pystyy ilmentamaan DNA-sekvenssia, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutanttia. Menetelmaan sisaltyy bakteerisolun yllapitaminen sopivissa olosuhteissa seka sopivassa tuotantovaliaineessa.

Valmistukseen kaytettavaa valiainetta taydennetaan sellaisella 11 X.L.

Mn :n maaralla, etta Mn :n konsentraatio elatusaineessa on suurempi kuin 2 miljoonasosaa.

Bakteerisolu voi olla mika tahansa bakteeri, jossa DNA-sekvenssi, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasia on viety sisaan yhdistelma-DNA-tekniikoin. Bakteerin pitaa pystya ilmentamaan DNA-sekvenssia seka valmistamaan proteiinituotetta.

Sopivat olosuhteet ja valmistukseen kaytettava elatusaine vaih-t elevat: bakteeri 1 aji n ja kannan mukaan.

19 90353

Bakteerisolu saattaa sisaltaa DNA-sekvenssin, joka koodittaa superoksididismutaasia tai analogia, vektori-DNA-molekyylin, kuten esimerkiksi plasmidin, sisalla. Vektori tai plasmidi kons-truoidaan yhdistelma-DNA-tekniikoin, jotta saadaan sekvenssi, joka koodittaa molekyylin sopivaan kohtaan sisaan liitettyå SOD: a.

Kyseessa olevan keksinnon edullisessa suoritusmuodossa bakteerisolu on Escherichia coli-solu. Edullinen E. colin auksotrofinen kanta on A1645. Edullinen E. colin prototrofinen kanta on A4255. Kyseessa olevan keksinnon mukaisen E. colin solu sisaltaa plasmidin, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismu-taasia tai sen analogia tai mutanttia.

Kyseessa olevan keksinnon edullisessa suoritusmuodossa bakteerisolu sisaltaa plasmidi pMSE-4:n. Menetelmå taman plasmidin konstruoimiseksi kuvataan kuvien selityksissa, ja plasmidia itseaan kuvataan esimerkissa 2. Tama plasmidi on tallennettu ATCC-talletusnumerolla 43250.

Kyseessa olevan keksinnon eraassa toisessa edullisessa suoritusmuodossa bakteerisolu sisaltaa plasmidin pMSARB4. Menetelmaå taman plasmidin konstruoimiseksi kuvataan kuvien selityksissa, ; ja plasmidia itseaan kuvataan esimerkissa 5. Tama plasmidi saat- ' taa olla konstruoitu pSOD/^T-11: stå, joka on tallennettu the

American Type Culture Collectioniin talletusnumerolla 53468.

Kyseessa olevan keksinnon spesifisissa suoritusmuodoissa entsy-maattisesti aktiivisen humaani mangaanisuperoksididismutaasin analogin valmistaa E. colin kannan A4255 solu, joka sisaltaa plasmidin pMSE-4, seka E. colin kannan A4255 solu, joka sisaltaa plasmidin pMSARB4.

Sopiva valmistukseen kaytettava elatusaine bakteerisolua vårten voi olla hyvaksyttavan elatusaineen mika tahansa tyyppi, kuten esimerkiksi kaseiinihydrolysaatti- tai LB (Luria Broth)-elatusaine, joista viimeksi mainittu on edullinen. Sopivat 20 90353 kasvatusolosuhteet vaihtelevat E. colin kannan ja sen sisåltå-man plasmidin mukaisesti, esimerkiksi E. coli A4255, joka sisaltaa plasmidin pMSE-4, indusoidaan 42°C:ssa ja sitå pidetaan ylla mainitussa lampotilassa noin 1-5 tunnin ajan. Sopivat låmpotila-, aika-, ravistelu- ja ilmastusolosuhteet ympin kasva-tusta seka viljelman kasvatusta vårten sopivaan tiheyteen ennen tuotantovaihetta seka viljelman yllåpitåmiseksi tuotantovaiheen aikana, saattavat vaihdella ja ne ovat tuttuja aiheeseen pereh-tyneille.

Elatusaineen Mn++-ionikonsentraatio, joka tarvitaan entsymaatti-sesti aktiivisen MnSODrn valmistamiseksi, vaihtelee kåytetyn elatusaineen tyypin mukaisesti.

LB-tyyppisessa elatusaineessa Hn++-ionikonsentraation, joka on 150-750 miljoonasosaa, on havaittu olevan tehokkaan. On edullis-ta, ettå yhdistelmatyyppisissa elatusaineissa Mn++:n konsentraa-tio on noin 50-1500 miljoonasosaa.

Sopivien varastointi-, viljely-, ymppays- seka tuotantoelatus-aineiden spesifiset aineosat saattavat vaihdella, ja ne ovat tuttuja aiheeseen perehtyneelle.

Kyseessa oleva keksinto koskee myos menetelmaa humaani mangaani-superoksididismutaasin tai sen analogin tai mutantin saamiseksi takaisin bakteerisoluista, jotka sisaltavat mainitun entsyymin. Ensin soluja kasitellaan, jotta saadaan proteiinijae, joka sisaltaa soluissa lasnaolevat proteiinit, humaani mangaanisuper-oksididismutaasi tai sen analogi tai mutantti mukaanluettuina, ja sitten proteiinijaetta kasitellaan humaani mangaanisuperoksidi-dismutaasin tai sen analogin tai mutantin saamiseksi.

Kyseessa olevan keksinnon edullisessa suoritusmuodossa soluja kasitellaan ensin liukoisten proteiinien erottamiseksi ensin liu-kenemattomista proteiineista seka solunpirstaleista, ja sitten liukoiset proteiinit saadaan takaisin. Nain saatuja liukoisia proteiineja kasitellaan sitten liukoisten proteiinien jakeen, 21 90353 joka sisaltåå humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutanttia, erottamiseksi, esimerkiksi saostami-seksi, ja jae otetaan talteen. Sitten jaetta kasitellaån erik-seen, jotta saadaan talteen humaani mangaanisuperoksididismu-taasi tai sen analogi tai mutantti.

Seuraavassa kuvataan kyseesså olevan keksinnon edullisempaa suoritusmuotoa. Ensin bakteerisolut eristetaan tuotantoela-tusaineesta, ja ne lietetaan sopivaan liuokseen, jonka pH on noin 7,0 tai 8,0. Sitten solut pirstotaan ja sentrifugoidaan. Syntyvaå supernatanttia kuumennetaan noin 30-120 minuutin ajan lampotilassa, joka on noin 55-65°C, mieluummin 45-75 minuutin ajan 58-62°C:ssa ja viela edullisemmin yhden tunnin ajan 60° C:ssar sitten se jååhdytetåan alle 10°C, mieluummin noin 4°C:een. Jaahdyttamisen aikana muodostuva saostuma poistetaan, esim. sentrifugoiden, ja sitten jaahdytetty supernatantti dialysoi-daan sopivaa puskuria vastaan. Jaahdytetty supernatantti dialy-soidaan mieluummin ultrasuodatuksen avulla, kåyttåen suodatin-membraania, joka on pienempi kuin 30K, mieluiten 10K. Sopiviin puskureihin sisåltyy 2-millimolaarinen kaliumfosfaattipuskuri, jonka pH on noin 7,8. Samanaikaisesti tåmån dialyysin kanssa tai dialyysin jålkeen jaahdytetty supernatantti saatetaan valinnaisesti konsentroida sopivaan tilavuuteen, esimerkiksi - 0,03 supernatantin alkuperaisesta tilavuudesta on havaittu sopi- vaksi. Pidattyva liuos eluoidaan sitten anioninvaihtokromatogra-; fiapylvaassa sopivasti puskuroidulla liuoksella, esimerkiksi liuoksella, jossa on vahintaan 20 millimoolia kaliumfosfaatti-: puskuria, jonka pH on noin 7,8. Jakeet, jotka sisaltavat super- oksididismutaasin, kootaan, yhdistetaan seka dialysoidaan noin 40-millimolaarista kaliumasetaattia vastaan, jonka pH on 5,5. Dialysoidut, yhdistetyt jakeet eluoidaan sitten kationinvaihto-kromatografiapylvaan lapi, jossa on kaliumasetaatin (KOAC) lineaarinen gradientti noin 40 millimoolista noin 200 millimoo-liin kaliumasetaatti ja pH on 5,5. Huippujakeet, jotka sisalsi-] vat superoksididismutaasia, kootaan ja yhdistetaan. Valinnaisesti saatetaan yhdistetyt huippujakeet sitten dialysoida sopivaa 22 90353 liuosta, esimerkiksi puskuriliuosta vastaan, joka on noin lQ_ millimolaarinen kaliumfosfaatin suhteen ja jonka pH on noin 7,8.

Kyseessa oleva keksinto koskee myos puhdistettua, esimerkiksi sellaista, jossa ei oleellisesti ole muita ihmisperaisiå aine-osia, humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogeja tai mutantteja, jotka on valmistettu kyseessa olevan keksinnon mukaisin menetelmin. Erityisesti kyseessa oleva keksinto koskee humaani mangaanisuperoksididismutaasin analogia, jonka polypep-tideillå on kuvassa 1 esitetty aminohapposekvenssi, jonka N-paate on lysiini, jota kuvan 1 nukleotidit 115-117 koodittavat, ja jonka sekvenssin COOH-paate on lysiini, jota koodittavat kuvan 1 nukleotidit 706-708, ja jossa sekvenssissa on ylimaå-rainen metioniinitåhde N-paåsså (Met-hMnSOD). Kyseessa olevan keksinnon edullinen patentinsuoritusmuoto koskee puhdistettua Met-hMnSOD: a, jonka spesifinen aktiivisuus on 3500 yksikkoa/mg.

Esimerkkeja

Esimerkkien, joita seuraavassa esitetaan kyseessa olevan keksinnon ymmartamiseksi, tarkoituksena ei ole rajoittaa keksinnon piiria eika niiden tulisi olla siten laadittuja. Kyseessa olevat esimerkit eivat sisalla yksityiskohtia tavanomaisista menetelmis-ta, joita kaytetaan vektoreiden konstruointiin, polypeptideita koodittavien geenien vientiin (insertioon) sellaisiin vektorei-h i π tai syntyvien plasmidien si i r tami.sessa i santasol ui hi n . Esimerkkeihin ei myoskaan sisally yksityiskohtaista kuvausta tavanomaisista menetelmista, joita kaytetaan maaritettaessa polypeptide ja, joita sellaiset isantavektorijarjestelmat val-mistavat tai joita kaytetaan sellaisten polypeptidien identitee-tin maarittamiseksi isoelektristen fokusointigeelien (IEF) aktii-visen varjayksen avulla. Sellaiset menetelmat ovat aiheeseen perehtyneiden hyvin tuntemia, ja niita kuvataan useissa jul-kaisuissa, esimerkiksi seuraavat julkaisut mukaan luettuina: T. Maniatis, E.F. Fritsch ja J. Sombrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982) .

23 90353 J.M. McCord ja I. Fridovich, J. Biol. Chem. 244:6049-55 (1969).

C. Beauchamp ja I. Fridovich, Anal. Biochem. 44:276-87 (1971).

Esimerkki 1

MnSOD-cDNA-kloonien identifioimiseksi syntetisoitiin seos-oligomeerikoettimia julkaistun aminohapposekvenssin mukaisesti (18, 19).

5'-koetin - 30 mer sekvenssi AA, _ - aa„, (18, 19) - Ib 24 5 ' 3 '

TTGCATAATTTGTGCCTTAATGTGTGGTTC

T G T G

G G

31-koetin - 32 mer sekvenssi AA179 - AAlgg (18) 5' 3 '

TCTGTTACGTTTTCCCAGTTTATTACGTTCCA G G G G

5'-koetin, joka koostuu 30 nukleotidista, vastaa kypsan MnSODrn aminohappoja 15-24. 3'-koetin, joka koostuu 32 nukleotidista, vastaa kypsan MnSOD:n aminohappoja 179-189. 5'-koetin on seos- koetin, joka koostuu 36 eri sekvenssista, kuten ylla on osoitet-tu. 3'-koetin on seoskoetin, joka koostuu 16 eri sekvenssista, kuten ylla on osoitettu. (Kun useampia kuin yksi nukleotidi on merkitty tiettyyn asemaan, DNA-saie syntetisoitiin kåyttaen ekvimolaarisia maaria kutakin merkittya nukleotidiå, jolloin syntyi seoskoetin.) 5'-koetinta kaytettiin seulottaessa ^gt-lO-vektoriin kloonatun T-solun cDNA-kirjaston 300 000 plakkia. Hybridisointi faagi-plakkikopioille (phage plaque replicas), jotka oli tehty liik-kumattomiksi nitroselluloosasuodattimilla, suoritettiin standar-dimenetelmin (Maniatis et al. supra) paitsi, etta hybridisointi suoritettiin 50°C:ssa, 8xSSC:ssa, 16 tunnin ajan. Sitten suodattimia pestiin 50°C:ssa 5xSSC:lla ja 0,1 /É:isella SDS:llå 90353 24

Kolme positiivista plakkia eristettiin, ja ne nimitettiin Phi MS8:ksi, Phi MSl:ksi ja Phi MSlJ:ksi.

EcoRI:n avulla Phi MS8:sta ja Phi MSl:sta saadut DNA:n pilkkou-tumistuotteet ilmaisivat, etta niilla molemmilla on cDNA-insert-tejå, jotka ovat noin 800 emasparin mittaisia ja jotka hybridi-soituvat sekå 5'- etta 3'-oligonukleotidikoettimiin. Phi MSlJrssa oli ainoastaan 450 emasparin mittainen cDNA-insertti, joka hybri-disoitui ainoastaan 5'-paatteiseen koettimeen.

Kolmen faagikloonin EcoRI-insertit alakloonattiin pBR322:n EcoRI-kohtaan, mikå vastaavasti tuotti pMS8-4:n, pMSl-4:n seka pMSlJ:n. Restriktioanalyysi ja hybridisointi 5'- ja 3'-oligo-nukleotidikoettimiin osoitti, etta seka pMS8-4:lla etta pMSl-4:llå on samanlaiset kaavat. Molemmille plasmideille on johdettu seuraava restriktiokartta, joka ilmaisee 5' - > 3’- suuntauksen.

5 ’ RI PvuII PvuII Seal Baml Stul Ri 1 i l i II l

±1 -.....1 -» I II "Ί - ~-----L

100 200 300 400 500 600 700 800 pMS8-4:n cDNA-insertin sekvenssi esitetaan kuvassa 1. Ennustet- tu aminohapposekvenssi eroaa julkaistusta aminohapposekvenssista (19) siina, etta Glu on havaittavissa Gln:n tilalla kolmessa (3) asemassa ( AA 42, 88, 108) ja valilla AA,0_, on kaksi * 123-124 ylimaaraista aminohappoa Gly ja Trp. pMSl-4:n ja pMSlJ:n sekvenssianalyysi ilmaisi, etta riippumattomasti oli johdettu kolme MnSOD-kloonia, ja varmisti nama erot julkaistuun amino-happosekvenssiin nahden.

Valmiin MnS0D:n N-terminaalisen lysiinin ylapuolella sijaitseva sekvenssi johtaa 24 aminohapon mittaiseen esipeptidisekvenssiin.

25 90353

Esimerkki 2

D

pMSE-4:n rakenne: Amp humaani MnSODrn ekspressioplasmidi

Lahtdkohta pMSE-4:n rakenteelle on plasmidi pMS8-4, joka on saatu esimerkissa 1 kuvatulla tavalla. Plasmidi pMS8-4, joka sisåltaa humaani MnSODrn cDNA:n EcoRI-insertillå, pilkottiin tay-dellisesti Ndel- ja Narl-restriktioentsyymeilla. Suuri fragment-ti eristettiin ja sidottiin synteettisen oligomeerin kanssa kuvassa 2 esitetylla tavalla. Syntyva plasmidi, pMS8~NN sisaltaa kypsaa MnSODra koodittavan alueen, jota edeltaa ATG-aloitus-kodoni. Mainittu plasmidi pilkottiin EcoRIrllå, paat tayden-nettiin polymeraasi I:n Klenow-fragmentilla, ja pilkottiin edel-leen Ndelrllå. Pieni fragmentti, joka sisalsi MnSOD-geenin, vie-tiin pSOD 13:een (suoritettiin insertio), jota oli kasitelty Ndelrllå jaStuIrlla. pSOD 13 saatetaan saada, kuten on kuvattu kasittelyn alaisessa US-patenttihakemuksessa 644 245 ja joka tahan yhteyteen on sisallytetty viitteena. Tata muodostettua plasmi-dia pMSE-4, joka sisalsi MnSODra koodittavan alueen, edelsi ribosomien sitoutumispaikka ell ja se oli /'-p -promoottorin kontrol-lin alainen. Plasmidi pMSE-4 on tallennettu the American Type Culture Collectioniin ATCC-talletusnumerolla 53250. Kaikki ylla esitetyissa valmistuksissa kaytetyt menetelmat olivat Maniatisin, supra, kuvaamia menetelmia.

Esimerkki 3

Yhdistelma humaani MnSODrn ilmentyminen

Plasmidi pMSE-4 vietiin sisaan Escherichia colin kantaan A4255 tunnettuja menetelmia kayttamalla. Sitten E. colin kantaa 4255, joka sisalsi pMSE-4rn, kasvatettiin 32°C:ssa, Luria-lihaliemi-elatusaineessa (LB), joka sisalsi ampisilliinia 100 g/ml, optiseen tiheyteen (OD) 0,7, 600 nmrsså mitattuna. Naytteille, jotka oli otettu eri aikavalein, suoritettiin elektroforeettinen :-. erotus natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyiiamidigeeleilla (SDS-PAGE). Geelit osoittivat lisaantymista humaani MnSOD-tasoissa aina 120 minuutin jalki-induktioon saakka, jossa vaiheessa yhdistelma-MnSOD-proteiini kasitti 27 % solun kokonais-proteiineista Coomassie-bluella varjatyn geelin seulonnalla 26 90 353 måaritettynå. Naytteiden 90 sekunnin mittainen aanikasittely W-375-åånikåsittelylaitteessa seka proteiinien jakaminen liukoi-siin (s) ja liukenemattomiin jakeisiin (p) sentrifugoimalla 10 OOO x g 5 minuutin ajan ilmaisi, ettå suurin osa valmistetus-ta yhdistelma-MnSOD:sta oli liukenematonta. Indusoitu, liukoi-nen proteiinijae sisalsi vain vahan enemmån SOD-aktiivisuutta kuin indusoitu vastinosa, standardimenetelmin suoritetun maari-tyksen perusteella. Katso McCord et al., supra. Nahtavasti MnSOD:n osa, joka on liukoisessa jakeessa, on inaktiivista.

Tama antaa aiheen olettaa, etta suurin osa humaani MnSODista, joka on valmistettu tassa esimerkissa kuvatuissa olosuhteissa, on vaikutukseltaan tehotonta.

Esimerkki 4 +4-

Elatusaineeseen sisåltyvån Mn :n vaikutus MnSOD:n liukoisuuteen ja aktiivisuuteen_

Mn++:n lisayksella, joka suoritettiin lisaantyvina konsentraatioi-na aina 450 miljoonasosaan saakka, E. coli A4255:n elatusaineeseen, joka sisalsi pMSE-4:a, ennen 2 tunnin mittaista induktiota 42°C:ssa, ei ollut mitaan haitallista vaikutusta humaani MnSODtn kokonaissaantoon. Liukoisten (s) seka liukenemattomien,(p), aanikasiteltyjen proteiinijakeiden analyysi, joka suoritettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesin avulla (SDS-PAGE), osoitti yhdistelmaproteiinin lisaantynytta liukoisuutta Mn++:n konsentraatioiden lisaantyessa (taulukko 1). S0D:n aktiivisuuden maarittaminen (katso McCord et al., supra) antaa aihetta olettaa, etta vallitsee korrelaatio elatusaineen lisaantyvien Mn++:n konsentraatioiden ja MnSOD:n lisåantyneen liukoisuuden valilla, elatusaineen selvan optimikonsentraation Mn++:n ollessa 150 miljoonasosaa (kuva 3). Lisaksi, lisaånty-neet Mn++:n konsentraatiot aktivoivat aiemmin inaktiivista liukoista entsyymia. Naita Mn++:n konsentraatioita kayttaen kasvatettujen, indusoitujen viljelmien liukoiset proteiinijakeet osoittavat aina 60-kertaista lisaantymista SOD:n aktiivisuudessa verrattuna liukoisiin proteiinijakeisiin, jotka on saatu indu-soimattomista viljelmista, joita on kasvatettu nailla Mn++:n 27 90353 konsentraatioilla. Isoelektrisen fokusoinnin geelien (IEF) aktiivisuusvårjåys (katso Beaucham et al., supra) ilmaisi, ettå yhdistelma MnSODrn multimuodot olivat yhtålaisia luonnon-mukaisen humaani MnSODrn multimuotojen kanssa.

Tulokset, jotka on saatu humaani MnSOD:n valmistuksen suhteen E. coli A1645:n avulla, ovat samankaltaisia kuin ylla esite-tyt tulokset.

Taulukko 1

Mn+ Prosentteja Prosentteja Spesifinen ak- (miljoo- liukoista hu- liukoista hu- tiivisuus yksi- nasosia) maani MnSOD:a maani MnSODra koitå/mg liu- indusoidusta liukoisista koisia proteii- kokonais- bakteeriperai- neja humaani sistå proteii-

MnSOD:sta neistå O 30,6 7,2 30 50 72,7 15,4 241 100 78,0 16,9 356 150 82,9 18,8 606 200 82,0 20,8 338 250 79,2 20,4 380 300 80,8 20,3 381 450 89,2 22,4 323

Esimerkki 5 pMSARB4;n rakenne: Tet humaani MnS0D:n ekspressioplasmidi

Tet ekspressioplasmidi pARB valmistettiin pSOD^T-11:sta pilk-komalla taydellisesti EcoRIrlla, jonka jalkeen suoritettiin osit-tainen pilkkominen BamHI-restriktioentsyymeilla. pSOD^T-11 on tallennettu the American Type Culture Collectioniin talletus-numerolla 53468. Pilkottu plasmidi sidottiin synteettisen oligo-meerin kanssa, jolla oli seuraava rakenne: 5’- AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3’ 3’- GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5’ jolloin saatiin pARB, joka sisalsi ^P^-promoottorin.

28 9 0 353

MnSOD:n ekspressioplasmidi pMSE-4:n EcoRI-fragmentti, joka sisalsi cll ribosomien sitoutumispaikan seka kypsan entsyymin taydellisen koodaussekvenssin , vietiin (insertoitiin) pARB:n ainoaan EcoRI-kohtaan. Syntyvå plasmidi pMSARB4 sisaltaa MnSOD-geenin, joka on λ-Ρ :n saatelyn alainen, seka cll RBS:n ja antaa resistenssin tetrasykliinille (kuva 4).

Esimerkki 6

Humaani MnSQD:n ekspressio ρΜΕΔRB 4:sta

Plasmidi pMSARB4 vietiin Escherichia colin kantaan A4255 tun-nettuja menetelmia kayttaen. Viljelmia kasvatettiin 32°C:ssa, Luria-lihaliemessa (LB), joka sisalsi erilaisia konsentraatioi-ta Mn++:a, kunnes 600 nm:ssa saavutettiin optinen tiheys (OD) 6,7. Induktio suoritettiin 42°C:ssa. Naytteille, jotka oli otettu eri aikavalein, suoritettiin elektroforeesi SDS-PAGE:1la. hMnSOD-tasoa nostettiin aina 120 minuutin mittaisen induktioajan avulla, jolloin hMnSOD muodosti noin 15 % solun kokonaisproteii-neista, Coomassie Bluella varjatyn geelin seulonnan avulla maaritettyna.

Indusoitu MnSOD oli liukoinen elatusaineen Mn++-konsentraatios-ta riippumatta. Tama on vastakohta Amp plasmidi pMSE-4:lla saaduille havainnoille. (Katso esimerkki 4.) SOD:n suurin aktiivisuus ja ekspressiotaso riippuivat kuitenkin Mn++:n lisayksesta (taulukko 2).

29 90353

Taulukko 2

MnSOD:n ekspressio E. coli A4255:ssa (pMSÅRB4)

Miljoonas- Prosenttia liu- Spesifinen aktiivisuus osaa koista hMnSODra yksikoitå/mg liukoisia

Mn++:aa liukoisista bak- proteiineja teeriperaisista proteiineista 42° 32° 42° O 10,9 8,0 23 50 19,8 8,0 227 100 16,0 8,0 241 200 17,0 10,0 278 300 16,0 9,3 238

Esimerkki 7

Entsymaattisesti aktiivisen yhdistelmå humaani MnS0D:n puhdistaminen_ E. colin kantaa A4255, jossa oli plasmidi pMSARB4, fermentoi-tiin LB:ssa, jota oli taydennetty 750 miljoonasosalla Mn++:a, 32°C:ssa, 17,0:n suuruiseen absorbanssin arvoon 600 nmrsså. Humaani MnS0D:n ekspression induktio saatiin aikaan nostamalla låmpotila 42°C:een 2 tunniksi, jolloin viljelmå saavutti A600:n arvon 43,0. Solut koottiin sentrifugoiden ja ne lietettiin uudelleen 0,2:een alkuperaista tilavuutta 50-millimolaarisessa kaliumfosfaattipuskurissa, pH 7,8, joka sisalsi 250 millimoolia NaCl. Bakteerit pirstottiin, siten etta ne lapåisivat kaksi kertaa Dynomillin, ne sentrifugoitiin ja solupirstaleet heitet-tiin pois. Supernatanttia kuumennettiin yhden tunnin ajan 60°C:ssa, se jåahdytettiin 4°C:een, ja kirkastettu superna-tantti vakevoitiin 0,O3:een alkuperaisesta tilavuudesta ja dialy-soitiin 2-millimolaarista kaliumfosfaattipuskuria vastaan, jonka pH oli 7,8, Pelicon ultrasuodatuslaitteessa, joka oli varustettu membraanilla 10K. Raaka entsyymivalmiste pantiin DE52-pylvaaseen, jota pestiin perusteellisesti 2-millimolaari-sella kaliumfosfaattipuskurilla, pH 7,8, ja eluoitiin 20-milli-molaarisella kaliumfosfaattipuskurilla, pH 7,8. Yhdistetyt jakeet, jotka sisalsivat entsyymin, dialysoitiin 40-millimolaa- 30 90 353 rista kaliumasetaattia, pH 5,5, vastaan, ne pantiin CM52-pylvåå-seen ja niita eluoitiin 40-200-millimolaarisen kaliumasetaatin, pH 5,5, lineaarisella gradientilla. Huippujakeet, jotka sisalsi-vat: humaani MnSODra, yhdistettiin, niita dialysoitiin Η£θ:3 vastaan, palautettiin 10-millimolaariseen kaliumfosfaattipusku-riin, pH 7,8, seka jaadytettiin -20°C:ssa.

Saatu yhdistelma humaan MnSOD oli enemman kuin 99 %:sesti puhdas, sen spesifinen aktiivisuus oli noin 3500 yksikkoa/mg. Puhdis-tusmenetelman kokonaissaanto oli noin 30 % (taulukko 3).

Puhdistetun entsyymin sekvensointi ilmaisee 1isametioniinin lasnaolon N-terminaalisessa aminohapossa verrattuna tunnettuun humaani MnS0D:een (19).

Metallipitoisuuden analyysi, joka suoritettiin atomiabsorption avulla, antoi noin 0,77 Mn-atomia entsyymialayksikkoa kohti.

Tama on so'pusoinnussa julkaistujen tietojen kanssa (23).

90353 31 O’

E

•h :ra H P>

4-J -H

λ: :0 ro x r~ r~- o cm o

-H i—i <J\ uo ro O

c ni ih ro lo (D Χί rH i—i oh ro C >1

<H

μη cn •h 3 tn 3 ·Ό <i) tn ί-1 α -η w CO > :Π3 S-i Q) tn

•H

E

>< :ra O σι O O ro - , - .. - ro ^ O oo o co m p O lo lo ro tn

O Ή <D

pi to

C -H

co a p

(OOCTlCM U1 Γ~ CM P

coco * « ' » · 3 m i—i oo in ^34 p p Di ή w P>

tn C

•H CO

Ti 3

C

P 'H

α pi ή

•H

ro C C id • -H r-t

O Q -H

o o> P

ϋ W PJ pi 3 C O O O O ro cm pi rH Σ P ~ ~ φ p \ Q. Di O O r~ 'tf p! m tn o rvj cm tn

E-ι ·ίι -Η rH *H

•H rO

C C -C

(BO P

to λ: α E o p x. c .c o

:r0 tB

ε ϋ

r—I *(H O

(D pi -ro pi pi cn c i p> •H fB >1 tB >1 4)

Ti pi pi Ti C rH

SZ Λ H O >1 Ή

Sh c Φ 3 PI -H

sh pi tn p1 E

tlJ Ή *H tB tfO ·Η ·Η α μη iiB pjpj >i 3 :tB pi pi -h pi pi cn tn j* c «η α tB tB p>

I tB p tB tB C

rH to pi I to 3 3 0)

: rH tn (B C tn rH rH

<D -Htncototua) pi .C E ·· P O <D W I I o -η ouid-hcoocncn > to cocirH^pinin p > >>03 Q) 3 ·Η W Σ < QLOtnOjPrHQU * 32 90 353

Kir jailisuusviit teet 1. McCord, J.M. ja Fridovich, I., J. Biol. Chem. 244: 6049-55 (1969).

2. Fridovich, I. julkaisussa Advances in Inorganic Biochemistry, toimittajat Eichhorn, G.L. ja Marzilli, L.G.

(Elsevier/North Holland, New York), ss. 67-90 (1979).

3. Freeman, B.A. ja Crapo, J.D., Laboratory Investion 47:412-26 (1982).

4. Steinman, H.M. julkaisussa Superoxide Dismutase, toimit-taja Oberley, L.W. (CRC Press, Florida), ss. 11-68 (1982).

5. Hartz, J.W. ja Deutsch, H.F., J. Biol. Chem. 247:7043-50 (1972 ) .

6. Jabusch, J.R., Farb, D.L., Kerschensteiner, D. A. ja Deutsch, H.F., Biochemistry 19:2310-16 (1980).

7. Barra, D., Martini, F., Bannister, J.V., Schinina, M.W., Rotilio, W.H., Bannister, W.H. ja Bossa, F., FEBS Letters 120:53-56 (1980).

8. Lieman-Hurwitz, J., Dafni, N., Lavie, V. ja Groner, Y., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:2808-11 (1982).

9. Sherman, L., Dafni, N., Lieman-Hurwitz, J. ja Groner, Y., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:5465-69 (1983).

10. Oberley, L.W. ja Buettner, G.R., Cancer Research 39:1141-49 (1979).

11. Huber, W ja Menander-Huber, K.B., Clinics in Rheum. Dis. 6:465-98 (1980).

12. McCord, J.M. ja Roy, R.S., Can. J. Physiol. Pharma. 60:1346-52 (1982).

33 SO 355 13. Alvarez, J.G. ja Storey, B.T., Biol. Reprod. 28:1129-36 (1983) .

14. Talmasoff, J.M., Ono, T. ja Cutler, R.G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2777-81 (1980).

15. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. ja Randall, R.J., J. Biol. Chem. 193:265-75 (1951).

16. Weser, U. ja Hartmann, H.J., FEBS Letters 17:78-80 (1971).

17. Jewett, S.LO., Latrenta, G.S. ja Beck, C.M., Arc. Biochem. Biophys. 215:116-128 (1982).

18. Harris, J.I. ja Steinman, H.M., Superoxide and Superoxide Dismutase, Michelson, A.M., McCord, J.M. ja Fridovich, I. toimittajat, Academic Press, London, ss. 225-230 (1977).

19. Barra, D., Schinina, M.E., Simmaco, M., Bannister, J.V., Bannister, W.H., Rotilio, G ja Bossa, F., J. Biol. Chem. 259:12595-601 (lokakuun 25. paivana 1984).

20. Baret, A., Jadot, G., ja Michelson, A.M., Biochemical Pharmacology 33:2755-60 (syyskuun 1.paivana 1984).

21. McCord, J.M. ja Salin, M.L., Movement, Metabolism and Bactericidal Mechanisms of Phagocytes, Ross, A., Patriarca, P.L., Romeo, D. (toimittajat) ss. 257-264 (1977).

22. Touati, D., Journal of Bacteriology 155:1078-87 (1983).

23. McCord, J.M., Boyle, J.A., Day, Jr., E.D., Rizzolo, L.J. ja Salin, M.L., Superoxide and Superoxide Dismutase,

Michaelson, A.M., McCord, J.M., ja Fridovich, I. (toimittajat) Academic Press, London ss. 129-138 (1977).

24. Eurooppalainen patenttijulkaisu 0131843 A1, julkaistu tammikuun 23. paivana, 1985, vastaten eurooppalaista patenttihakemusta 84107717.5, joka on jatetty heinakuun 3. paivana 1984, joka esittaa prioriteettivaatimuksia US-sarjanumeron 514 188 suhteen, joka on jatetty heinakuun 15. paivana 1983.

34 90 3 53 25. Hallewell, et al., Nucleic Acids Res. 5, (1985).

26. Eurooppalainen patenttijulkaisu 0138111 A1, joka on jul-kaistu huhtikuun 24. paivåna 1985, vastaten eurooppalais-ta patenttihakemusta 84111416.8, joka on jatetty syyskuun 25. paivana 1984, joka esittaa prioriteettivaatimuksia US sarjanumeron 538 607 suhteen, joka on jatetty loka-kuun 3. paivana 1983, seka US sarjanumeron 609 412 suhteen, joka on jatetty toukokuun 11. paivana 1984.

27. EMBO Journal, osa 4, No. 1, ss. 77-84 (tammikuu 1985).

28. Abstracts of the Fourth International Conference on Superoxide and Superoxide Dismutase, Rome, Italy, syyskuun 1.-6. paivina 1985.

Claims (21)

90353 35 Patenttivaatxmukset

1. Plasmidi humaani mangaanisuperoksididismutaasianalogin ilmentåmiseksi sopivassa prokarioottisessa isåntåsolussa, jolla analogilla on luonnollisesti esiintyvån humaani man-gaanisuperoksididismutaasin entsymaattista aktiivisuutta, tunnettu siitå, ettå analogi koostuu kahdesta tai neljåstå ei-kovalenttisesti liittyneestå polypeptidistå kunkin sel-laisen polypeptidin kåsittåesså 199 aminohappoa, kussakin sellaisen polypeptidin sekvenssisså on metioniini N-pååsså vålittomåsti lysiinin vieresså, jota lysiiniå koodaavat ku-vion 1 nukleotidit 115-117, ja jatkuen lysiiniin, jota koodaavat kuvion 1 nukleotidit 706-708 ja joka on polypeptidin COOH-pååsså ja ettå plasmidi kåsittåå DNA:n, joka koodaa sellaista polypeptidiå, ja sopivat sååtelyelementit jårjes-tettynå plasmidin sisåån siten, ettå sallitaan polypeptidin ilmentyminen ja humaani mangaanisuperoksididismutaasianalo-gin muodostuminen isåntåsolussa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, tunnettu siitå, ettå se on pMSE-4, joka on talletettu Escherichia coli -kannassa A4255 ATCC-numerolla 53250.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, tunnettu siitå, ettå se on pMSARB4.

4. Prokarioottinen isåntåsolu, tunnettu siitå, ettå siihen on liitetty patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen isåntåsolu, tunnettu siitå, ettå se on Escherichia coli -kannan A4255 solu, joka sisåltåå pMSE-4 -plasmidin ja joka on talletettu ATCC-numerolla 53250.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen isåntåsolu, tunnettu siitå, ettå se on Escherichia coli -solu, joka sisåltåå pMSARB4 -plasmidin.

36 S0353

7. Menetelmå humaani mangaanisuperoksididismutaasianalogin tuottamiseksi, tunnettu siitå, ettå kasvatetaan patenttivaa-timuksen 4 mukaista isåntåplasmidisysteemiå olosuhteissa, jotka sallivat humaani mangaanisuperoksididismutaasianalogin tuottamisen ja otetaan siten tuotettu analogi talteen.

8. Menetelmå entsymaattisesti aktiivisen rekombinanttisen humaani mangaanisuperoksididismutaasin tuottamiseksi kuvion 1 mukaisella DNA-sekvenssillå sisaltåen nukleotidit 115-708, jolla on sama aminohapposekvenssi ja sama biologinen aktii-visuus kuin luonnollisesti esiintyvållå humaani mangaani-superoksididismutaasilla tai sen analogilla tai mutantilla, tunnettu siitå, ettå kasvatetaan bakteerisolujen viljelmåå tuottoalustassa, jossa on ei kasvua rajoittava Mn++-måårå siten, ettå Mn++-konsentraatio alustassa on suurempi kuin 2 ppm, kun bakteerisolut kasvavat, mainittujen bakteerisolujen sisåltåesså plasmidin, joka sisåltåå DNA:n, joka koodaa humaani mangaanisuperoksididismutaasin analogia, ja solut ky-kenevåt ilmentåmåån DNA:ta, joka koodaa humaani mangaanisuperoksididismutaasin analogia ja jossa mainittua viljelmåå kasvatetaan sellaisissa sopivissa olosuhteissa, ettå DNA ilmentyy ja humaani mangaanisuperoksididismutaasin analogia tuotetaan bakteerisoluissa, ja otetaan talteen siten tuotettu entsymaattisesti aktiivinen humaani mangaanisuperoksididismutaasin analogi tai mutantti.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå bakteerisolut kåsittåvåt Escherichia coli -solut.

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmå, tunnettu si-tå, ettå plasmidi sisåltåå DNA:n, joka koodaa humaani man-gaanisuperoksididismutaasianalogia, joka analogi kåsittåå kaksi tai neljå ei-kovalenttisesti liittynyttå identtistå polypeptidiå kunkin sellaisen polypeptidin kåsittåesså 199 aminohappoa ja kussakin sellaisen polypeptidin sekvenssisså on metioniini N-pååsså vålittomåsti lysiinin vieresså, jota lysiiniå koodaavat kuvion 1 nukleotidit 115-117 ja jatkuen 37 30 353 lysiiniin, jota koodaavat kuvion 1 nukleotidit 706-708 ja joka on polypeptidin COOH-pååsså.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå plasmidi on pMSE-4 ja se on talletettu Escherichia coli -kannassa A4255 ATCC-talletusnumerolla 53250.

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå plasmidi on pMSARB4.

13. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå Mn++-konsentraatio on 50-1500 ppm.

14. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå Escherichia coli -solut ovat Escherichia coli -kan-taa A4255, joka sisåltåå plasmidin pMSE-4 ja joka on talletettu ATCC-talletusnumerolla 53250.

15. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå Escherichia coli -solut ovat Escherichia coli -kan-taa A4255, joka sisåltåå plasmidin pMSARB4.

16. Menetelmå seuraavan reaktion katalysoimiseksi: 202 + 2H+ -* H202 + 02 tunnettu siitå, ettå saatetaan reagenssit kosketuksiin sopi-vissa olosuhteissa patenttivaatimuksen 1 mukaisella plasmi-dilla ilmennetyn humaani mangaanisuperoksididismutaasin tai sen analogin kanssa.

17. Menetelmå solujen vaurioiden pienentåmiseksi in vitro, .. . jotka vauriot ovat aiheuttaneet superoksidiradikaalit, tun nettu siitå, ettå katalysoidaan superoksidiradikaalien pel-kistystå patenttivaatimuksen 16 mukaisesti.

18. Menetelmå poistettujen ja eristettyjen elinten selviy-tymisajan pidentåmiseksi, tunnettu siitå, ettå lisåtåån te- 38 90353 hokas måårå patenttivaatimuksen 1 mukaisella plasmidilla tuotettua humaani mangaanisuperoksididismutaasia perfuusio-våliaineeseen.

19. Menetelmå rekombinanttisen humaani mangaanisuperoksidi-dismutaasin, jolla on kuvion 1 mukainen DNA-sekvenssi sisål-tåen nukleotidit 115-708, tai sen analogin tai mutantin tal-teenottamiseksi bakteerisoluista, jotka sisåltåvåt humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutant-tia, tunnettu siitå, ettå (a) kåsitellåån bakteerisoluja siten, ettå saadaan talteen proteiinifraktiot, jotka sisåltåvåt proteiineja, jotka ovat låsnå soluissa mukaanlukien humaani mangaanisuperoksididis-mutaasi tai sen analogi tai mutantti; ja (b) kåsitellåån proteiinifraktiota siten, ettå saadaan talteen humaani mangaanisuperoksididismutaasi tai sen analogi tai mutantti.

20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå (a) kåsitellåån soluja, jotta erotetaan liukoiset proteiinit liukenemattomista proteiineista ja solunseinåmån jåånnoksis-tå; (b) otetaan talteen liukoiset proteiinit; (c) kåsitellåån siten talteenotettuja liukoisia proteiineja, jotta erotetaan liukoisten proteiinien fraktio, joka sisål-tåå humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutanttia; (d) otetaan talteen liukoisten proteiinien fraktio, joka sisåltåå humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutanttia; ja (e) kåsitellåån liukoisten proteiinien fraktiota, joka sisåltåå humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutanttia, jotta saadaan talteen erillisesti humaani mangaanisuperoksididismutaasi tax sen analogi tai mutantti. 39 90353

21. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmå, t--iinnaht-.ii siitå, ettå (a) eristetåån bakteerisolut tuottoalustasta; (b) suspendoidaan eristetyt bakteerisolut sopivaan liuok-seen, jonka pH on 7,0 - 8,0; (c) hajotetaan suspendoidut bakteerisolut; (d) sentrifugoidaan hajotetut bakteerisolut; (e) kuumennetaan syntynyttå supernatanttia ajan, joka vaih-telee 30 minuutista 120 minuuttiin låmpotilassa, joka vaih-telee 55°C:sta 65°C:een; (f) jååhdytetåån kuumennettu supernatantti alle l0°C:een; (g) poistetaan mahdollinen saostuma jååhdytetystå superna-tantista; (h) dialysoidaan jååhtynyt supernatantti sopivaa puskuria vastaan; (i) eluoidaan jåljelle jåånyt aine anioninvaihtokromatogra-fiakolonnilla sopivalla puskuroidulla liuoksella; (j) keråtåån ja yhdistetåån eluaattifraktiot, jotka sisåltå-våt humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutanttia; (k) dialysoidaan yhdistetyt fraktiot 40 mM kaliumasetaattia, pH 5,5, vastaan; (l) eluoidaan dialysoidut yhdistetyt fraktiot kationinvaih-tokromatografiakolonnin låpi lineaarisella 40 - 200 mM kaliumasetaatin gradientilla, pH 5,5; ja (m) keråtåån ja yhdistetåån eluentin piikkifraktiot, jotka sisåltåvåt humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutanttia. 40 9 0 3 53