LU86676A1 - Adn de superoxyde dismutase de manganese humaine,son expression dans les bacteries et procede de recuperation de superoxyde dismutase de manganese humaine - Google Patents

Description

I* " I · * i . ' > β * i - 1 - "ADN de Superoxyde dismutase de manganèse humaine, son expression dans les bactéries et procédé de récupération de Superoxyde dismutase de manganèse humaine".

La présente invention est relative à de l'ADN et plus particulièrement à de l'ADNc de superoxyde dismutase de manganèse humaine, à son expression dans les bactéries et à un procédé de récupération de superoxyde dismutase de manganèse humaine 5 La superoxyde dismutase (SOD) et le phénomène des radicaux libres d'oxygène (C^-) ont été découverts en 1968 par McCord et Fridovich [McCord 3.M. et Fridovich I.,3. Biol. Chem. 244, 6049-55 (1969)]. Les radicaux de superoxyde et d'autres composés oxygénés fortement réactifs sont produits dans chaque cellule qui 10 respire sous la forme de sous-produits provenant des dommages provo qués par oxydation à une série étendue de macromolécules et de composants cellulaires [voir, à cet égard, Fridovich I., Advances in Inorganic Biochemistry, éds. Eichhorn G.L. et Marzilli L.G. (Elsevier/North Holland, New York), pp 67-90 (1979), Freeman B.A. et Crapo 3.D., Labo-15 ratory Inverstion 47,412-26 (1982)]. Un groupe de métalloprotéines connues comme superoxyde dismutases catalyse la réaction d'oxydo- réduction 20^- + ^r{+-^2*^2 +®2 et ^orrne a^ns^ un mécanisme de défense contre la toxicité de l'oxygène.

Il existe plusieurs formes connues de SOD contenant 20 différents métaux et différentes protéines. Les métaux présents dans les SOD sont le fer, le manganèse, le cuivre et le zinc. Toutes les formes connues de SOD catalysent la même réaction. On trouve ces - enzymes dans plusieurs groupes évolutionnaires. On trouve principalement des superoxyde dismutases contenant du fer dans les cellules procaryo-25 tiques. On a trouvé des superoxyde dismutases contenant du cuivre et du zinc pratiquement dans tous les organismes eucaryotiques [Steinman H.M., Superoxide Dismutase, éd. Oberley L.W. (CRC Press, _ Floride), pp 11-68 (1982)]. On a trouvé des superoxyde dismutases contenant du manganèse dans les organismes allant des micro- orga-30 nismes à l'être humain.

4 - 2 - 1 * é *

Puisque chaque macromolécule biologique peut servir de cible à l’action endommageante des nombreux radicaux superoxyde, on s'est intéressé au potentiel thérapeutique des SOD. La littérature · scientifique laisse supposer que les SOD peuvent être utilisées dans 5 une large gamme d'applications cliniques. Celles-ci englobent la pré vention de l'oncogénèse et de l'accroissement des tumeurs, ainsi que * la diminution des effets cytotoxique et cardiotoxique des médicaments anti cancéreux [Oberley L.W. et Buettner G.R., Cancer Research 39, 1141-49 (1979)], la protection des tissus ischémiques [McCord 3.M.

10 et Roy R.S., Can. J. Physiol. Pharma. 60,1346-52 (1982)] et la protection des spermatozoïdes [Alvarez 3.G. etStorey B.T., Biol. Reprod. 28,1129-36 (1983)]. De plus, on étudie également l’effet des SOD sur le processus de vieillissement [Talmasoff 3.M., Ono T. et Cutler R.G., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77,2777-81 (1980)].

15 L'exploration du potentiel thérapeutique des SOD

humaines a été limitée principalement à cause de leur disponibilité limitée.

Les superoxyde dismutases sont également intéressantes en raison de leurs propriétés antiinflammatoires [Huber \V. et Menander-20 Huber K.B., Clinics in Rheum. Dis. 6,465-98 (1980)]. La superoxyde dismutase bovine (orgotéine) s'est révélée présenter des propriétés antiinflammatoires et est actuellement vendue dans un certain nombre de pays européens comme produit pharmaceutique pour l'être humain. Elle est également vendue aux Etats-Unis comme produit vétérinaire, 25 en particulier pour le traitement des tendons enflammés chez le cheval.

Toutefois, les apports d'orgotéine sont limités. Les techniques antérieures impliquant sa récupération au départ de cellules bovines ou d'autres cellules animales sont sérieusement limitées et l'orgotéine ainsi obtenue peut produire des réactions allergiques chez l'être humain 30 du fait de son origine non humaine.

La superoxyde dismutase de cuivre-zinc (CuZn SOD) est la forme la mieux étudiée et la mieux caractérisée des diverses formes de superoxyde dismutases.

La CuZn SOD humaine est une protéine métallique 35 dimère composée de sous-unités identiques liées de façon non covalente, chacune de ces sous-unités ayant un poids moléculaire de 16.000 daltons - 3 - X A- Λ ‘4 , λ et contenant un atome de cuivre et un atome de zinc [Hartz 3.W. et Deutsch H.F., J. Biol. Chem. 247,7043-50 (1972)]. Chaque sous-unité est formée de 153 acides aminés dont la séquence a été établie [Oabusch J.R., Färb D.L., Kerschensteiner D.A. et Deutsch H.F., Biochemistry 5 19,2310-16 (1980) ainsi que Barra D., Martini F., Bannister 3.V., Schinina M.W., Rotîlio W.H., Bannister W.H. et Bossa F., FEBS Letters 120, - 53-56 (1980)].

L'ADNc encodant de la superoxyde dismutase de CuZn humaine a été cloné [Lieman-Hurwitz 3., Dafni N., Lavie V. 10 et Groner Y., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79,2808-11 (1982)]. La séquence complète de l'ADN cloné a également été déterminée [Sherman L., Dafni N., Lieman-Hurwitz 3. et Groner Y., Proc. Natl . Acad. Sei. USA 80,5465-69 (1983)]. De plus, les vecteurs d'expression contenant de l'ADN encodant de la superoxyde dismutase pour la production 15 et la récupération de superoxyde dismutase dans les bactéries ont été décrits [ demande de brevet européen N° 0131843, publiée le 23 janvier 1985 ainsi que Hallewell et coll., Nucleic Acides Res. 5, (1985)]. L'expression d'un ADN de superoxyde dismutase et la production de SOD dans les levures ont également été décrites demande de brevet 20 européen N° 0138111 publiée le 24 avril 1985).

Récemment, l'emplacement du gène de CuZn SOD sur le chromosome humain 21 a été caractérisé [EMBO 3ournal, Vol. 4, N° 1, pp. 77-84 (janvier 1985)] et de récents développements relatifs à la superoxyde dismutase de CuZn ont été résumés (Résumés de la 25 4ème Conférence Internationale sur les superoxydes et superoxyde dismutases, Rome, Italie, septembre 1-6, 1985).

On en connaît beaucoup moins au sujet de la superoxyde dismutase de manganèse (MnSOD). La MnSOD d'E. coli K-12 a récemment été clonée et caractérisée [Touati D., 3ournal of Bacterio-30 logy 155,1078-87 (1983)]. Barra et coll. ont décrit une séquence de 196 acides aminés pour le polypeptide de MnSCD isolé au départ de cellules de foie humaines [Barra D., Schinina M.E., Simmaco M., Bannister 3.V., Bannister W.H., Rotilio G. et Bossa F., 3. Biol. Chem. 259,12595-601 (octobre 1984)]. Les descriptions de la technique antérieure diffèrent 35 toutefois concernant la structure de la molécule de MnSOD, en particulier lorsqu'elle comporte deux ou quatre sous-unités de polypeptide - 4 - 4 * * Λ * « j « identiques [Barra D., Shinina M.E., Simmaco M., Bannister 3.V., Bannister W.H., Rotilio G. et Bossa F., 3. Biol. Chem. 259,12595-61 (25 octobre 1984) ainsi que McCord 3.M., Boyle 3.A., Day 3r. E.D., Rizzolo L.3. et Salin M.L., Superoxide and Superoxide Dimutase, Michaelson 5 A.M., McCord 3.M. et Fridovich I. (éds) Academie Press, Londres pp.

129-138 (1977)]. Toutefois, il est clair que le polypeptide de MnSOD ~ et le polypeptide de CuZn SOD ne sont pas homologues [Barra D.,

Shinina M.E., Simmaco M., Bannister 3.V., Bannister W.H., Rotilio G. et Bossa F., 3. Biol. Chem. 259,12595-601 (octobre 1984)]. Les 10 homologies des séquences d'acides aminés de MnSOD et FeSOD provenant de diverses sources ont également été comparées [Harris 3.1. et Steinman H.M., Superoxide and Superoxide Dismutase, Michelson A.M., McCord 3.M. et Fridovich I. éds., Academie Press, Londres,pp. 225-230, (1977)].

15 Baret et coll. ont révélé dans une étude sur rats que la demi-vie de la MnSOD humaine est sensiblement plus longue que la demi-vie de la SOD de cuivre humaine; ils ont également révélé dans 1 'étude sur rats que la MnSOD humaine et la SOD de cuivre de rat ne sont pas efficaces à titre d'agents antiinflammatoires tandis 20 que la SOD de cuivre bovine et la SOD de cuivre humaine sont extrêmement actives [Baret A., 3adot G. et Michelson A.M., Biochemical Pharmacology 33,2755-60 (1er septembre 1984)].

McCord et coll. ont précisé que la superoxyde dismutase de manganèse humaine d'origine naturelle protège mieux les leuco-25 cytes polymorphonueléaires (PMN) humains encours de phagocytose des radicaux libres du type superoxyde que ne le font les superoxyde dismutases de CuZn bovine ou porcine dans des essais "in vitro" [McCord 3.M. et Salin M.L., Movement, Metabolism and Bactericidal Mechanisms of Phagocytes, Ross A., Patriarca P.L., Romeo D. (éds) pp. 257-264 30 (1977)].

La présente invention concerne la préparation d'une molécule d'ADNc encodant le polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine ou un analogue ou mutant de celui-ci. Elle concerne également l'introduction de cet ADNc dans des vecteurs 35 d'expression bactériens efficaces .pour produire des polypeptide de - 5 - 4 . * 4 *

MnSOD humaine, analogue, mutant et enzyme dans des bactéries, de manière à récupérer le polypeptide de MnSOD humaine, analogue, mutant ou enzyme produit par voie bactérienne. La présente invention concerne également les polypeptides de MnSOD humaine, leurs analogues 5 ou mutants ainsi récupérés et leurs applications.

La présente invention prévoit en outre un procédé - de production de MnSOD humaine enzymatiquement active dans des bactéries, ainsi qu'un procédé de récupération et de purification de cette MnSOD humaine enzymatiquement active.

10 La présente invention est également relative à l'uti lisation de superoxyde dismutase de manganèse humaine ou de ses analogues ou mutants pour catalyser la réduction des radicaux superoxyde en peroxyde d'hydrogène et oxygène moléculaire. La présente invention concerne en particulier l'utilisation de MnSOD produite par 15 voie bactérienne ou de ses analogues ou mutants pour réduire les lésions de reperfusion faisant suite à une ischémie et pour prolonger la période de survie d'organes isolés excisés. Elle concerne également l'utilisation de MnSOD ou de ses analogues produits par voie bactérienne pour traiter les inflammations.

20 On a isolé au départ de cellules T humaines une molécule d'ADN qui comprend de l'ADNc encodant le polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine ou un analogue ou mutant de celui-ci. On a découvert la séquence de. nucléotides d'une molécule d'ADN à double brin qui encode le polypeptide de superoxyde 25 dismutase de manganèse humaine ou un analogue ou mutant de celui-ci.

La séquence d'un brin encodant le polypeptide ou un analogue de celui-ci est représentée sur la figure 1, à partir du nucléotide 115 en aval jusqu'au nucléotide 708 inclusivement. D'autres séquences encodant l'analogue ou le mutant peuvent être essentiellement similaires au 30 brin encodant le polypeptide. La séquence de nucléotides d'un brin d'une molécule d'ADN à double brin qui encode un prépeptide de 24 acides aminés est également représentée sur la figure 1, par le nucléotide 43 jusqu'au nucléotide 114 inclusivement.

La molécule d'ADNc à double brin ou n'importe quelle 35 autre molécule d'ADN à double brin qui contient un brin nucléotidique a - 6 - * * * » * « « * * ayant la séquence d'encodage du polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine ou d'un analogue ou mutant de celui-ci, peut être incorporée dans un véhicule de clonage, tel qu'un plasmide ou virus. Chaque molécule d'ADN peut être introduite dans une cellule, 5 soit procaryotique, par exemple bactérienne, soit eucaryotique, par exemple une levure ou une cellule de mammifère, en utilisant des méthodes connues, qui ne sont pas limitées aux méthodes impliquant des véhicules de clonage contenant chaque molécule.

L'ADNc ou l'ADN encodant le polypeptide de super-10 oxyde dismutase de manganèse humaine ou un analogue ou mutant de celui-ci est de préférence incorporé dans un plasmide, par exemple le pMSE-4 ou pMSARB4, et est ensuite introduit dans une cellule hôte appropriée où l'ADN peut être exprimé et le polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine (hMnSOD) ou son analogue ou mutant 15 produit. Des cellules hôtes avantageuses sont l'Escherichia coli, en particulier l'E. coli M255 et l'E. coli A1645. Le plasmide pMSE-4 dans la souche d'E. coli A4255 a été déposé auprès de l'American Type Culture Collection sous le N° ATCC 53250. Le plasmide pMSÂRB4 peut être obtenu comme indiqué sur la figure 4, et décrit dans la 20 description des figures.

On peut cultiver ou faire croître les cellules dans lesquelles ces molécules d'ADN ont été introduites suivant des méthodes bien connues des spécialistes de la technique sous des conditions appropriées permettant la transcription de l'ADN en ARNm et l'expression 25 de l'ARNm sous la forme de protéine. On peut ensuite récupérer la protéine de superoxyde dismutase de manganèse résultante.

On peut également préparer des compositions vétérinaires et pharmaceutiques contenant de la MnSOD humaine ou des analogues ou mutants de celle-ci ainsi que des supports appropriés. 30 On peut utiliser cette superoxyde dismutase de manganèse humaine ou ses analogues ou mutants pour catalyser la réaction suivante : 202" + 2H 5 H2O2 + O2 et réduire ainsi les lésions aux cellules provoquées par les radicaux superoxyde.

35 . 7 - « * * * 4 1

On peut, d'une manière particulière, utiliser ces enzymes ou analogues ou mutants pour réduire les lésions provoquées par une reperfusion faisant suite à une ischémie, pour accroître le temps de survie d'organes isolés excisés ou bien encore pour traiter 5 des inflammations.

La présente invention est relative à un procédé de production de superoxyde dismutase de manganèse humaine enzymatique-ment active ou d'un analogue ou mutant de celle-ci dans une cellule ς bactérienne. La cellule bactérienne contient et est capable d'exprimer 10 une séquence d'ADN encodant la superoxyde dismutase de manganèse ou son analogue ou mutant. Le procédé comprend le maintien de la cellule bactérienne sous des conditions appropriées et dans un milieu de production approprié. Le milieu de production est complété par une certaine quantité de Mn++ de telle sorte que la concentration 15 en Mn++ disponible pour la cellule dans le milieu soit supérieure à environ 2 ppm.

Suivant une forme de réalisation préférée de l'invention, la cellule bactérienne est une cellule d'Escherichia coli contenant un plasmide qui contient une séquence d'ADN encodant pour le polypeptide 20 de superoxyde dismutase de manganèse humaine, par exemple pMSE-4 ou pMSüRB^ dans une souche d'E. coli A4255. La concentration en Mn++ dans le milieu de production se situe aux alentours de 50 à 1500 ppm, des concentrations de 150 à 750 ppm s'avérant avantageuses.

La présente invention concerne également un procédé 25 de récupération de superoxyde dismutase de manganèse ou d'un analogue de celle-ci des cellules bactériennes qui la contiennent. Les cellules sont d'abord traitées pour récupérer une faction protéique contenant les. protéines présentes dans les cellules, notamment la superoxyde dismutase de manganèse humaine ou un analogue ou mutant de celle-ci, 50 la fraction protéique étant ensuite traitée pour récupérer la superoxyde dismutase de manganèse humaine ou son analogue ou mutant. Suivant une forme de réalisation préférée de l'invention, les cellules sont d'abord traitées pour séparer les protéines solubles des protéines insolubles _ et des débris de parois cellulaires et les protéines solubles sont récupé- 55 rées. On traite ensuite les protéines solubles pour séparer, par exemple « - 8 - » * 4 « ( * sous la forme d'un précipité, une fraction des protéines solubles contenant l'hMnSOD ou un analogue ou mutant de celle-ci et on récupère la fraction contenant l'hMnSOD ou son analogue ou mutant. On traite ensuite la fraction de protéines solubles récupérée pour récupérer sépa-5 rément la superoxyde dismutase de manganèse humaine ou son analogue.

Une forme de réalisation plus préférée de l'invention concerne un procédé de récupération de superoxyde dismutase de manganèse humaine ou d'un analogue ou mutant de celle-ci au départ de cellules bactériennes qui contiennent de la superoxyde dismutase de 10 manganèse humaine ou son analogue ou mutant. Le procédé consiste tout d'abord à isoler les cellules bactériennes du milieu de production et à les mettre en suspension dans une solution appropriée ayant un pH d'environ 7,0 à 8,0. Les cellules sont ensuite rompues et centrifugées et le surnageant résultant est chauffé pendant environ 30 à 120 15 minutes à une température se situant entre 55 et 65°C, de préférence pendant 45 à 75 minutes à 58-62°C, et plus avantageusement 1 heure à 60°C, et est ensuite refroidi à une température en-dessous de 10°C, de préférence à 4°C. Tout précipité qui se forme est séparé, par exemple par centrifugation, et le surnageant refroidi est dialysé contre un 20 tampon approprié, par exemple un tampon de phosphate de potassium 2 mM ayant un pH d'environ 7,8. La dialyse se fait de préférence par ultrafiltration en utilisant une membrane de filtration plus petite que 30K. En même temps que la dialyse ou après celle-ci, on peut concentrer éventuellement le surnageant refroidi à un volume appro-25 prié, par exemple à 0,03 de son volume initial. On élue ensuite le produit de rétention sur une colonne de chromatographie d'échange d'anions avec une solution tamponnée appropriée, par exemple une solution de tampon phosphate de potassium d'au moins 20 mM d'un pH de 7,8. Les fractions d'éluant contenant de la superoxyde dismutase 30 sont recueillies, rassemblées et dialysées contre de l'acétate de potas sium d'environ 40 mM à pH 5,5. Les fractions rassemblées, dialysées sont ensuite éluées dans une colonne de chromatographie d'échange de cations avec un gradient linéaire d'acétate de potassium allant d'environ 40 à environ 200 mM et à un pH de 5,5. Les fractions de 35 pointe contenant la superoxyde dismutase sont recueillies et rassemblées .

- 9 - ' a * « «

Les fractions de pointe rassemblées peuvent ensuite être éventuellement dialysées contre une solution appropriée, par exemple de l'eau ou une solution tampon de phosphate de potassium d'environ 10 mM d'un pH d'environ 7,8.

5 L'invention concerne également la super oxyde dis- mutase de manganèse humaine enzymatiquement active, purifiée ou ses analogues, par exemple la met-hMnSOD, ou mutants produits par les procédés de la présente invention.

. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES

10 Figure 1 : Séquence d'ADNc de MnSOD humaine

La figure 1 représente la séquence nucléotidique d'un brin d'une molécule d'ADN à double brin encodant la superoxyde dismutase de manganèse humaine ainsi que la séquence de' 198 acides aminés de la MnSOD humaine correspondant à la séquence d'ADN. 15 La figure 1 représente également la séquence nucléotidique d'un brin d'une molécule d'ADN à double brin encodant un prépeptide à la MnSOD humaine mature formé de 24 acides aminés et la séquence d'acides aminés correspondant à cette séquence d'ADN. Sont également représentées les séquences non traduites 5' et 3'.

20 Figure 2 : Construction de pMSE-4 : Plasmide d'expression de MnSOD humaine

Le plasmide pMS8-4, contenant de la MnSOD sur une insertion d'EcoRI (R^) a été digéré complètement par des enzymes de restriction Ndel et Narl. Le grand fragment a été isolé et lié -25 à un oligomère de synthèse, ainsi qu'on l'a représenté sur la figure 2. Le plasmide résultant pMS8-NN contient la région de codage pour la MnSOD mature, précédée d'un codon d'initiation d'ATG. Le plasmide ci-dessus a été digéré par de l'EcoRI, les extrémités ayant été remplies par du fragment de Polymérase I de Klenow et à nouveau clivées par 30 de la Ndel. Le petit fragment abritant le gène de MnSOD a été introduit dans du pSODoi 13 qui a été traité par des Ndel et Stul. On peut obtenir le pSODo<, 13 comme décrit dans la demande de brevet aux Etats-Unis d'Amérique N°644.245 du 27 août 1984, qui est incorporée ici à titre de référence. On a pu obtenir ainsi le plasmide pMSE-4 contenant 35 la région de codage de MnSOD précédée du site de liaison ribosomique - 10 - ‘ * * 4 f cil et sous le contrôle du promoteur de Le plasmide pMSE-4 a été déposé à l'American Type Culture Collection sous le N° ATCC 53250. Figure 3 : Effet de la concentration en Mn++ sur l'activité de SOD produite dans E. Coli 5 Le schéma de la figure 3 montre la relation. entre l'activité spécifique en unités/mg de MnSOD soluble recombinante produite par la souche d'E. coli A4255 contenant le plasmide pMSE-4 sous des conditions de non induction (32°C) et d'induction (42°C), et la concentration en Mn++ (parties par million) dans le milieu de crois-10 sance.

Figure k : Construction de pMS Δ RBfr : plasmide d'expression de MnSOD humaine

Le vecteur d'expression de Tet , pARB, a été obtenu au départ de pSODß^T-11 par une digestion totale avec de l'EcoRI 15 suivie d'un clivage partiel par des enzymes de restriction BamHI.

Le pSODß LT-l 1 a été déposé à l'American Type Culture Collection (ATCC) sous le N° 53Ψ68. Le plasmide digéré a été lié à un oligomère de synthèse 5'- AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3' 20 3'- GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5' ce qui a permis d'obtenir le pARB contenant le promoteur de^\ P^.

Le fragment d'EcoRI du plasmide d'expression de MnSOD pMSE-4, contenant le site de liaison ribosomique cil et la séquence de codage totale de l'enzyme mature, a été introduit dans le site 25 d'EcoRI propre du pARB. Le plasmide résultant, pMSARB4, contient le gène de MnSOD sous le contrôle du X et du site de liaison ribosomique cil et confère de la résistance à la tétracycline.

On a isolé une molécule d'ADN à double brin qui comprend de l'ADNc encodant un polypeptide de superoxyde dismutase 30 de manganèse humaine ou un analogue ou mutant de celui-ci au départ d'une cuvée d'ADN de cellules T humaines. On a découvert la séquence nucléotidique d'une molécule d'ADN à double brin qui encode le polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine ou un analogue ou mutant de celui-ci. La séquence d'un brin de molécule d'ADN enco-35 dant le polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine « - 11 - ou un analogue de celui-ci est représentée sur la figure 1 et comprend les nucléotides N° 115 à 708 inclusivement. La séquence d'un brin encodant un analogue ou mutant d'hMnSOD est sensiblement similaire à celle du brin encodant le polypeptide d'hMnSOD. La séquence nucléo- 5 tidique du prépeptide de la superoxyde dismutase de manganèse humaine est également représentée sur la figure 1. Les nucléotides N° 43 à 114 inclusivement codent pour ce prépeptide.

Les procédés de préparation de l'ADNc et de détermination de la séquence d'ADN encodant le polypeptide de superoxyde 10 dismutase de manganèse humaine ou ses analogue ou mutant sont bien connus des spécialistes de la technique et sont décrits d'une manière plus complète ci-après. De plus, maintenant que l'on a découvert la séquence d'ADN qui encode la superoxyde dismutase de manganèse humaine, on peut utiliser des méthodes de synthèse connues pour préparer 15 des molécules d'ADN contenant des portions de cette séquence.

Les véhicules de clonage usuels, tels que les plasmides, par exemple le pBR322, les virus ou les bactériophages, par exemple \, peuvent être modifiés ou aménagés en utilisant des méthodes connues de manière à produire de nouveaux véhicules de clonage qui contiennent 20 de l'ADNc encodant le polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine ou ses analogues ou mutants. D'une façon similaire, ces véhicules de clonage peuvent être modifiés ou aménagés de manière à ce qu'ils contiennent des molécules d'ADN, dont un brin comprend un segment ayant la séquence représentée sur la figure 1 pour le poly-25 peptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine ou des segments sensiblements similaires à celui-ci. Les molécules d'ADN introduites peuvent être obtenues par diverses méthodes impliquant des synthèses enzymatique ou chimique.

Les véhicules de clonage résultants sont des entités 50 chimiques qui ne se produisent pas dans la nature et qui ne peuvent être créés que par la technologie moderne habituellement appelée '' la technologie d’ADN recombinant. Le véhicule de clonage est de préférence un plasmide, par exemple le pMSE-4 ou pMS RB4. Ces véhicules de clonage peuvent être introduits dans des cellules, soit 35 - 12 - Λ * « « procaryotiques, par exemple bactériennes (Escherichia coli, B.subtilis, etc.) soit eucaryotiques, par exemple des levures ou des cellules de mammifère, en utilisant des méthodes bien connues des spécialistes de la technique, telles que la transformation, la transfection, etc.

5 Les cellules dans lesquelles les véhicules de clonage sont introduits contiendront ainsi de l'ADNc encodant le polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine ou un analogue ou mutant de celui-ci si l'ADNc était présent dans le véhicule de clonage ou bien contiendront de l'ADN qui comporte un brin, dont la totalité ou une partie de celui-ci 10 a la séquence du polypeptide de MnSOD humaine représentée sur la figure 1 ou une séquence essentiellement similaire à celle-ci, si cet ADN était présent dans le véhicule de clonage.

Les Escherichia coli sont des cellules hôtes avantageuses pour les véhicules de clonage de la présente invention. Une 15 souche auxotrophe d'E. coli actuellement préférée est la souche A1645 qui a été déposée à l'American Type Culture Collection à Rockville, Maryland, Etats-Unis d'Amérique, contenant le plasmide pApoE-Ex2, sous le N° ATCC 39787. Tous les dépôts effectués à l'American Type Culture Collection dont question dans le présent brevet ont été réalisés 20 conformément au Traité de Budapest sur la reconnaissance interna tionale du dépôt de micro- organismes.

On a obtenu la souche A1645 au départ de la souche A1637 par sélection du Gal+ (apte à fermenter le galactose) et de la perte de résistance à la tétracycline. Elle contient encore des élé-25 ments de phage \. Son phénotype est C600 r m+ gal+ thr leu lacz bl (\cI857 AHlABamHl N+).

On a obtenu la souche A1637 au départ de la souche C600 en introduisant un transposon contenant le gène de résistance à la tétracycline dans l'opéron de galactose ainsi que les éléments 30 de phage λ comprenant les éléments responsables de la synthèse du répresseur cl. La souche C600 est disponible auprès de l'American ~ Type Culture Collection sous le N° ATCC 23724.

Les souches prototrophiques d1 Escherichia coli qui permettent une expression de polypeptide de haut niveau même lorsqu 1 35 on les fait croître dans un milieu minimal sont encore plus avanta- -13 - * * tageuses à titre d'hôtes pour l'expression de gènes encodant la superoxyde dismutase de manganèse. Une souche prototrophique actuellement préférée est la souche A4255. La souche M255 contenant le plasmide pMSE-Ψ a été déposée auprès de l'American Type Culture Collection 5 sous le N° ATCC 53250.

Les cellules résultantes dans lesquelles a été introduit de l'ADN encodant le polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine ou un analogue ou mutant de celui-ci peuvent être traitées^ par exemple mises à croître ou cultivées, suivant les nécessités, sous 10 des conditions appropriées connues des spécialistes de la technique, de manière à ce que l'ADN dirige l'expression de l'information génétique encodée par l'ADN, par exemple dirige l'expression du polypeptide d'hMnSOD ou d'un analogue ou mutant de celui-ci, la cellule exprimant le polypeptide d'hMnSOD ou de son analogue ou mutant, qui peut ensuite 15 être récupéré.

Telle qu'utilisée dans le cadre du présent brevet, l'expression "superoxyde dismutase" (SOD) signifie une enzyme ou un polypeptide agissant sur les radicaux superoxyde ou libres . d'oxygène à titre de récepteurs, ou qui catalyse les réactions de dismutation 20 suivantes : 20 . 2H+ -> 02 ♦ H202 L'expression "superoxyde dismutase de manganèse" (MnSOD) telle qu'utilisée dans le cas présent, désigne une molécule de superoxyde dismutase quelconque contenant l'élément manganèse, sous l'une quelconque 25 de ses formes chimiques.

L'expression "polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine" telle qu'utilisée dans le cas présent, désigne un polypeptide de 198 acides aminés dont une partie de la séquence d'acides aminés est représentée par la figure 1; la terminaison N de 30 la séquence est la lysine encodée par les nucléotides 115-117 de la figure 1 et la terminaison COOH de la séquence est la lysine encodée ~ par les nucléotides 706-708 de la figure 1.

L'expression "complexe de polypeptide au manganèse" telle qu'utilisée dans le cas présent, désigne une molécule qui comprend 35 un polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine dans i t - lit - un complexe, le manganèse étant sous l'une quelconque de ses formes chimiques, et qui a l'activité enzymatique de la superoxyde dismutase de manganèse humaine d'origine naturelle.

L'expression "superoxyde dismutase de manganèse 5 humaine" telle qu'utilisée dans le cas présent, désigne une molécule qui comprend au moins deux polypeptides de superoxyde dismutase de manganèse humaine sous la forme d'un complexe avec le manganèse sous l'une quelconque de ses formes chimiques et qui a l'activité enzymatique de la superoxyde dismutase de manganèse humaine d'origine 10 naturelle.

L'expression "analogue de polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine" telle qu'utilisée dans le cas présent, désigne un polypeptide qui comprend un polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine à l'une ou l'autre des extrémités 15 ou aux deux extrémités desquelles sont fixés un ou plusieurs acides aminés additionnels.

L'expression "analogue de complexe de polypeptide au manganèse" telle qu'utilisée dans le cas présent, désigne une molécule qui comprend un complexe de polypeptide au manganèse, dont la portion 20 de polypeptide comprend un ou plusieurs acides aminés additionnels fixés à l'une ou l'autre des extrémités ou aux deux extrémités.

L'expression "analogue de superoxyde dismutase de manganèse humaine" telle qu'utilisée dans le cas présent, désigne une molécule qui comprend au moins deux polypeptides dont au moins 25 l'un d'entre eux est un analogue de polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine, sous la forme d'un complexe avec le manganèse sous l'une quelconque de ses formes chimiques, et qui a l'activité enzymatique de la superoxyde dismutase de manganèse humaine d'origine naturelle.

30 L'expression "mutant de polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine" telle qu'utilisée dans le cas présent, désigne un polypeptide comportant une séquence d'acides aminés sensiblement identique à celle du polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine mais différant de celle-ci par un ou plusieurs 35 acides aminés.

- 15 - Λ * • * L'expression "mutant de complexe de polypeptide au manganèse" désigne une molécule qui comprend un mutant de polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine sous la forme d'un complexe avec le manganèse sous l'une quelconque de ses formes 5 chimiques et qui a l'activité enzymatique de la superoxyde dismutase de manganèse.

L'expression "mutant de superoxyde dismutase de manganèse humaine" telle qu'utilisée dans le cas présent, désigne une molécule qui comprend au moins deux polypeptides dont au moins 10 l'un de ces polypeptides est un mutant de polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine sous la forme d'un complexe avec le manganèse sous l'une quelconque de ses formes chimiques et qui a l'activité enzymatique de la superoxyde dismutase de manganèse humaine d'origine naturelle.

15 Les mutants de polypeptide d'hMnSOD et d'hMnSOD

qui entrent dans le cadre de la présente invention peuvent être préparés par mutation de la séquence d'ADN représentée par la figure 1, séquence dont la terminaison N est la lysine encodée par les nucléotides 115-117 et dont la terminaison COOH est encodée par les nucléotides 706-708. 20 L'ADN peut être muté par des méthodes bien connues des spécialistes de la technique, voir par exemple Bauer et coli., Gene 37,73-81 (1985). La séquence mutée peut être introduite dans des vecteurs d'expression appropriés tels que décrits dans le cas présent, qui sont introduits dans des cellules qui sont ensuite traitées de telle 25 sorte que l'ADN muté dirige l'expression des mutants de polypeptide d'hMnSOD et des mutants d'hMnSOD.

On suppose que la forme enzymatiquement active de la superoxyde dismutase de manganèse humaine est une protéine comportant au moins deux, éventuellement quatre sous-unités identiques, 30 dont chacune d'entre elles comporte approximativement 198 acides aminés dans la séquence représentée par la figure 1 pour la superoxyde dismutase de manganèse humaine, la terminaison N de cette séquence étant constituée par la lysine encodée par les nucléotides 115-117 de la figure 1 et la terminaison COOH de cette séquence étant consti-35 tuée par la lysine encodée par les nucléotides 706-708 de la figure 1.

- 16 - , , *

On peut préparer la MnSOD humaine ou ses analogues ou mutants à partir de cellules dans lesquelles l'ADN ou l'ADNc encodant la superoxyde dismutase de manganèse humaine ou ses analogues ou mutants ont été introduits. On peut utiliser cette MnSOD humaine 5 ou ses analogues ou mutants pour catalyser la dismutation ou la réduc tion univalente de l'anion superoxyde en présence de protons pour former du peroxyde d'hydrogène, tel que représenté par l'équation suivante :

MnSOD humaine 10 202- + 2 H+ -> H202 + 02

On peut également préparer des compositions vétérinaires et pharmaceutiques qui contiennent des quantités efficaces d'hMnSOD ou d’un ou plusieurs analogues ou mutants d'hMnSOD et un support approprié. Ces supports sont bien connus des spécialistes 15 de la technique. L'hMnSOD ou son analogue ou mutant peut être administré directement ou sous la forme d'une composition à l'être humain ou à l'animal, par exemple pour traiter un sujet souffrant d'inflammations ou pour réduire des lésions provoquées au sujet par les radicaux libres d'oxygène lors d'une reperfusion faisant suite à une ischémie 20 ou lors d'une transplantation d'organes. L'hMnSOD ou son analogue ou mutant peut également être ajouté directement ou sous la forme d'une composition au milieu de perfusion d'un organe isolé, pour réduire les lésions provoquées à un organe isolé par les radicaux libres d'oxygène lors d'une perfusion après excision, en prolongeant ainsi la durée d'exis-25 tance de l'organe. De plus, on peut utiliser l'hMnSOD ou son analogue ou mutant pour réduire les lésions neurologiques lors d'une perfusion faisant suite à une ischémie ou pour traiter une dysplasie pulmonaire bronchique.

On a également découvert un procédé de production 30 de superoxyde dismutase de manganèse humaine enzymatiquement active ou d'un analogue ou mutant de celle-ci dans une cellule bactérienne. La cellule bactérienne contient et est capable d'exprimer une séquence d'ADN encodant la superoxyde dismutase de manganèse humaine ou un analogue ou mutant de celle-ci. Le procédé consiste 35 à maintenir la cellule bactérienne sous des conditions appropriées - 17 - « t * « * et dans un milieu de production approprié. Le milieu de procduction est complété par une certaine quantité de Mn++ de manière à ce que la concentration en Mn++ dans le milieu soit supérieure d1 environ 2 ppm.

La cellule bactérienne peut être une bactérie quel-5 conque dans laquelle a été introduite une séquence d'ADN encodant la superoxyde dismutase de manganèse humaine par des techniques d'ADN recombinant. La bactérie doit être capable d'exprimer la séquence d'ADN et de donner le produit protéique. Les conditions et le milieu de production appropriés varieront suivant l'espèce et la 10 souche de bactéries.

La cellule bactérienne peut contenir la séquence d'ADN encodant la superoxyde dismutase ou son analogue dans le corps d'une molécule d'ADN de vecteur, telle qu'un plasmide. Le vecteur ou plasmide est construit par des techniques d'ADN recombinant de 15 telle sorte que la séquence encodant la SOD soit incorporée en une position appropriée dans la molécule.

Suivant une forme de réalisation préférée de l'invention, la cellule bactérienne est une cellule d'Escherichia coli. Une souche auxotrophe préférée d'E. coli est la souche A1645. Une souche 20 prototrophe préférée d'E. coli est la souche A4255. La cellule d'E.

coli de la présente invention contient un plasmide qui encode pour la superoxyde dismutase de manganèse humaine ou pour un analogue ou mutant de celle-ci.

Suivant une forme de réalisation préférée de la pré-25 sente invention, la cellule bactérienne contient le plasmide pMSE-4. Un procédé de construction de ce plasmide est décrit dans la description des figures et le plasmide lui-même est décrit dans l'exemple 2. Ce plasmide a été déposé sous le N° ATCC 43250.

Suivant une autre forme de réalisation préférée 30 de la présente invention, la cellule bactérienne contient le plasmide pMSARB4. Un procédé de construction de ce plasmide est décrit dans la description des figures et le plasmide lui-même est décrit dans l'exemple 5. Ce plasmide peut être construit à partir du pSOD^^T-11 1 qui a été déposé à l'American Type Culture Collection sous le N° 35 53468.

- 18 - J l· % *

Suivant des formes de réalisation spécifiques de l'invention, un analogue de superoxyde dismutase de manganèse humaine enzymatiquement actif est obtenu par la souche d'E. coli M255 contenant le plasmide pMSE-4 et par la souche d'E. coli M255 contenant 5 le plasmide pMSARB4.

Le milieu de production approprié pour la cellule bactérienne peut être n'importe quel type de milieu de croissance acceptable, tel qu'un hydrolysat de caséine ou un milieu BL. (bouillon de Luria), ce dernier étant préféré. Les conditions de croissance 10 appropriées varieront avec la souche d'E. coli et le plasmide qu'elle contient; par exemple la souche d'E. coli A4255 contenant le plasmide pMSE-4 est incubée à k2°C et maintenue à cette température pendant une durée d'environ 1 à 5 heures. Les conditions de température, de durée, d'agitation et d'aération appropriées pour faire croître l'inoculum 15 et pour faire croître la culture à une densité désirée avant la phase de production ainsi que pour maintenir la culture dans la période de production peuvent varier et sont bien connues des spécialistes de la technique.

La concentration en ions Mn++ dans le milieu qui 20 est nécessaire à la production de MnSOD enzymatiquement active variera en fonction du type de milieu utilisé.

Dans les milieux de croissance du type BL , on a constaté que des concentrations en Mn++ de 150 ppm à 750 ppm s'avéraient efficaces. Il est préférable que dans tous les types complexes 25 de milieu de croissance. la concentration en Mn++ dans le milieu soit de l'ordre de 50 à 1500 ppm.

Les ingrédients spécifiques de la matière première, de la culture ainsi que du milieu d'inoculation et de production appropriés peuvent varier et sont connus des spécialistes de la technique. 30 L'invention concerne également un procédé de récu pération de superoxyde dismutase de manganèse humaine ou d'un analo-s gue ou mutant de celle-ci au départ de cellules bactériennes qui les contiennent. Les cellules sont d'abord traitées pour récupérer une fraction protéique contenant les protéines présentes dans les cellules, 35 notamment la superoxyde dismutase de manganèse humaine ou son analogue ou mutant, la fraction protéique étant ensuite traitée pour - 19 - récupérer la superoxyde dismutase de manganèse humaine ou son analogue ou mutant.

Suivant une forme de réalisation préférée de l'invention, on traite d'abord les cellules pour séparer les protéines solubles 5 des protéines non solubles et des débris de parois cellulaires et on récupère ensuite les protéines solubles. On traite ensuite les protéines solubles ainsi récupérées pour séparer, par exemple sous la forme d'un précipité, une fraction des protéines solubles contenant la superoxyde dismutase de mangenèse humaine ou son analogue ou mutant 10 et on récupère la fraction. On traite ensuite la fraction pour récupérer séparément la superoxyde dismutase de manganèse humaine ou son analogue ou mutant.

On donne ci-après une description d'une forme de réalisation plus avantageuse de l'invention. Tout d'abord, on isole les 15 cellules bactériennes du milieu de production et on les met en suspension dans une solution appropriée ayant un pH d'environ 7,0 ou 8,0. Les cellules sont ensuite rompues et centrifugées. On chauffe le surnageant résultant pendant une période d'environ 30 à 120 minutes à une température se situant approximativement entre 55 et 65°C, de préférence 20 pendant 45 à 75 minutes à une température de 58 à 62°C et plus avan tageusement pendant 1 heure à 60°C, et on le refroidit ensuite en-dessous de 10°C, de préférence aux alentours de 4°C. On sépare tout précipité qui peut se former en cours de refroidissement, par exemple par centrifugation et on dialyse ensuite le surnageant refroidi contre un tampon 25 approprié. On dialyse de préférence le surnageant refroidi par ultra filtration en utilisant une membrane de filtration plus petite que 30 K, avantageusement de 10 K. Des tampons appropriés sont les tampons de phosphate de potassium 2 mM ayant un pH d'environ 7,8. Après ou en même temps que cette dialyse, on peut éventuellement concentrer 30 le surnageant refroidi à un volume approprié; on a constaté, par exemple, qu'il était avantageux de concentrer le surnageant à 0,03 du volume = initial de surnageant. On élue ensuite le produit de rétention sur une colonne de chromatographie d'échange d'anions avec une solution tamponnée appropriée, par exemple une solution tampon de phosphate 35 de potassium d'au moins 20 mM ayant un pH d'environ 7,8. Les fractions - 20 - ’ » t » 4 *

d'éluant contenant la superoxyde dismutase sont recueillies, rassemblées et dialysées contre de l'acétate de potassium d'environ 40 mM, pH de 5,5. Les fractions rassemblées, dialysées sont ensuite éluées dans une colonne de chromatographie d'échange de cations ayant un gradient 5 linéaire en acétate de potassium (KOAC) d'environ 40 à environ 200 mM

et un pH de 5,5. On recueille et on rassemble les fractions de pointe contenant la superoxyde dismutase. On peut ensuite éventuellement dialyser les fractions de pointe rassemblées contre une solution appropriée, par exemple de l'eau ou une solution tampon de phosphate de 10 potassium d'environ 10 mM d'un pH d'environ 7,8.

L'invention concerne également la superoxyde dismutase de manganèse humaine purifiée, c'est-à-dire essentiellement exempte d'autres substances d'origine humaine, ou bien ses analogues ou mutants obtenus par les procédés de la présente invention. Elle 15 concerne en particulier un analogue de superoxyde dismutase de manganèse humaine comportant au moins deux polypeptides, dont au moins l'un d'entre eux a la séquence d'acides aminés représentée par la figure 1, séquence dont la terminaison N est constituée par la lysine encodée par les nucléotides 115-117 de la figure 1 et dont la terminaison COOH 20 est constituée par la lysine encodée par les nucléotides 706-708 de la figure 1 plus un résidu de méthionine additionnel à la terminaison N (Met- hMnSOD). Une forme de réalisation préférée de la présente invention concerne la Met-hMnSOD purifiée ayant une activité spécifique de 3500 unités/mg.

25 EXEMPLES

Les exemples qui suivent sont donnés pour faciliter la compréhension de l'invention mais ne limitent en aucun cas le cadre de celle-ci. Les exemples ne donnent pas de description détaillée des méthodes usuelles utilisées pour la construction des vecteurs, l'intro-30 duction des gènes encodant les polypeptides dans ces vecteurs ou l'introduction des plasmides résultants dans les hôtes. Les exemples ne donnent pas de description détaillée des méthodes usuelles utilisées pour examiner les polypeptides produits par ces systèmes de vecteurs d'hôtes ou pour déterminer l'identité de ces polypeptides par coloration d'activité 35 de gels de concentration isoéiectriques (IEF). Ces méthodes sont bien I * - 21 - connues des spécialistes de la technique et sont décrites dans de nombreuses publications, notamment dans les publications suivantes : T. Maniatis E.F. Fritish et 3. Sombrook, Molecular Cloning : A Labora-tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982).

5 3.M. McCord et I. Fridovich, 3. Biol. Chem. 244,6049-55 (1969).

C. Beauchamp et I. Fridovich, Anal. Biochem. 4^,276-87 (1971).

Exemple 1

Afin d’identifier des clones d'ADNc de MnSOD, on synthétise des sondes d'oligomères mixtes suivant la séquence d'acides 10 aminés publiée [Harris 3.1. et Steinman H.M., Superoxide and Superoxide Dismutase, Michelson A.M., McCord 3.M. et Fridovich I. éds., Academie Press, Londres, pp. 225-230; (1977) ainsi que Barra D., Schinina M.E., Simmaco M., Bannister 3.V., Bannister W.H., Rotilio G. et Bossa F., 3. Biol. Chem. 259,12595-601(25 octobre 1984)].

15 sonde 5'- séquence de 30 mères de AAi5 à AA^ [Harris 3.1. et Steinman H.M., Superoxide and Superoxide Dismutase, Michelson A.M., McCord 3.M. et Fridovich I. éds., Academie Press, Londres, pp. 225-230; (1977) ainsi que Barra D., Schinina M.E., Simmaco M., Bannister 3.V., Bannister W.H., Rotilio G. et Bossa F., 3. Biol Chem. 259,12595-601(25 octobre 20 1984)].

5' 3'

TTGCATAATTTGTGCCTTAATGTGTGGTTC T G T G

G G

25 sonde 3' - séquence de 32 mères de AA^g à AA^ [Barra D., Shinina M.E., Simmaco M., Bannister 3.V., Bannister W.H., Rotilio G. et Bossa F., 3. Biol. Chem. 259,12595-601 (25 octobre 1984)] 5' 3'

TCTGTTACGTTTTCCCAGTTTATTACGTTCCA 30 GG GG

La sonde 5' formée de 30 nucléotides correspond aux acides aminés r 15 à 24 de la MnSOD mature. La sonde 3' formée de 32 nucléotides correspond aux acides aminés 179 à 189 de la MnSOD mature. La sonde 5' est une sonde mixte formée de 36 séquences différentes, 35 comme indiqué ci-dessus. La sonde 3' est une sonde mixte formée de - 22 - « J _ * 16 séquences différentes, comme indiqué ci-dessus. (Lorsque plus d'un nucléotide est représenté en une position donnée, le brin d'ADN est synthétisé avec des quantités équimolaires de chacun des nucléotides représentés, en donnant ainsi la sonde mixte).

5 On utilise la sonde 5' pour sélectionner 300.000 plaques d'une cuvée d'ADNc de cellules T dans le vecteur \gt-10. L'hybridation à des réplications de plaque de phage immobilisées sur des filtres de nitrocellulose est réalisée suivant des processus standards (Maniatis et coll. supra), à l'exception que l'on réalise l'hybridation 10 à 50°C dans du 8x5SC pendant 16 heures. On lave ensuite les filtres à 50°C avec du 5xSSC et 0,1 % de SDS. Trois plaques positives sont isolées et appelées Phi MS8, Phi MSI et Phi MS13.

Les produits de digestion d'ADN à l'EcoRI provenant de Phi MS8 et Phi MSI montrent qu'ils contiennent tous deux des 15 insertions d'ADNc d'approximativement 800 bp de long, qui hybrident les deux sondes d'oligonucléotides 5' et 3'. Le Phi MS 13 ne porte qu'une insertion d'ADNc de 450 bp, qui hybride uniquement la sonde d'extrémité 5'.

Les insertions d'EcoRI des trois clones de phage 20 sont subclonées dans le site d'EcoRI de pBR322, ce qui donne ainsi respectivement les pMS8-4, pMSl-4 et pMS13. L'analyse de restriction et l'hybridation en les sondes d'oligonucléotides 5' et 3' révèlent l'existance de modèles similaires à la fois pour les pMS8-4 et pMSl-4. La carte de restriction suivante montrant l'orientation 5' -3' 25 a été déduite des deux plasmides.

5'

LL PvuII PvuII Seal &âml S£ül RI

\J V/ \ / K* \J vf — _ I ^ 1 1 1 » 1------ t i 30 100 200 300 400 500 600 700 800

La séquence de l'insertion d'ADNc de pM58-4 est représentée sur la figure 1. La séquence d'acides aminés prédite diffère de la séquence d'acides aminés publiée [Barra D., Schinina M.E.,

Simmaco M., Bannister 3.V., Bannister W.H., Rotilio G. et Bossar F., 35 3. Biol. Chem. 259,12595-601 (25 octobre 1984)] par le fait que Glu « * - 23 - apparaît à la place de Gin en trois endroits (AA 42, 88, 108) et par le fait que deux acides aminés additionnels, Gly et Trp., apparaissent entre AA 123-124. L'analyse séquentielle de pMSl-4 et pMSIJ révèle que les trois clones de MnSOD ont une origine indépendante et confirme ^ ces différences par rapport à la séquence d'acides aminés publiée.

La séquence en amont de la lysine N-terminale de MnSOD mature laisse prévoir une séquence pré peptidique de 24 acides aminés.

Exemple 2 ^ Construction de pMSE-4 : Plasmide d'expression de MnSOD humaine

Amp.R

Le point de départ pour la construction de pMSE-4 est le plasmide pMS8-4, que l’on obtient comme décrit dans l'exemple 1. Le plasmide pMS8-4, contenant de l'ADNc de MnSOD humaine sur ^ une insertion d'EcoRI, est totalement digéré par des enzymes de restriction Ndel et Narl. Le grand fragment est isolé et lié au moyen d'un oligomère synthétique, comme décrit sur la figure 2. Le plasmide résultant, pMS8-NN, contient la région de codage pour la MnSOD mature, précédée d'un codon d'initiation d'ATG. Le plasmide ci-dessus est ^ digéré par EcoRI, les extrémités étant remplies par un fragment de Polymérase I de Klenow et à nouveau clivées par Ndel. On introduit le petit fragment contenant le gène de MnSOD dans pSOD 13, que l'on traite par Ndel et Stul. On peut obtenir le pSOD 13 comme décrit dans la demande de brevet aux Etats-Unis d'Amérique N°644.245 du ^ 27 août 1984, citée ici à titre de référence. Ceci permet d'obtenir le plasmide pMSE-4 contenant la région de codage de MnSOD précédée du site de liaison ribosomique cil et sous le contrôle du promoteur de X P^. Le plasmide pMSE-4 a été déposé à l'American Type Culture Collection sous le N° ATCC 53250. Toutes les méthodes utilisées dans on les processus décrits ci-dessus sont essentiellement les mêmes que celles décrites par Maniatis, supra.

Exemple 3

Expression de la MnSOD humaine recombinante

On introduit le plasmide pMSE-4 dans la source d'Esche-richia coli A4255 en utilisant des méthodes connues. On fait croître ensuite la souche d'E. coli 4255, contenant pMSE-4, à 32°C dans du ! - 24 - > ι * milieu de bouillon de Luria (BL) contenant 100 g/ml d'ampicilline jusqu'à ce que la densité optique (DO) à 600 nm soit égale à 0,7. On réalise l'induction à 42°C. Les échantillons prélevés à divers intervalles de temps sont séparés par électrophorèse sur des gels pour électropho-5 rèse de dodécyl sulfate de sodium - poiyacrylamide (SDS-PAGE). Les gels montrent des augmentations de niveaux de MnSOD humaine jusqu'à une post-induction de 120 minutes, stade auquel la protéine de MnSOD recombinante est formée de 27 % de protéines cellulaires totales, ce pourcentage étant déterminé par balayage au moyen d'un gel de 10 coloration bleue de Cocmassie. Le traitement par ultrasons d'échantillons pendant 90 secondes dans un dispositif à ultrasons W-375 et le partage des protéines en fractions soluble (s) en non soluble (p) par centrifugation à 10.000 g pendant 5 minutes montrent que la majeure partie de la MnSOD recombinante produite est non soluble. La fraction pro-15 téique soluble induite contient une activité en SOD qui n'est que légèrement plus élevée que la contre-partie non induite, comme on peut le constater par l'utilisation de méthodes standards. Voir McCord et coll,, supra. Apparemment, une partie de la MnSOD trouvée dans la fraction soluble est inactive. Ceci laisse supposer que la majeure partie 20 de la MnSOD humaine produite sous les conditions décrites dans cet exemple est en fait inactive.

Exemple 4

Effet de Mn++ dans des milieux de croissance sur l'activité et la solubilité de MnSOD

25 L'addition de Mn++ en concentrations croissantes jusqu'à 450 ppm aux milieux de croissance d'E. coli A4255, contenant du pMSE-4, avant une induction de 2 heures à 42°C n'a pas d'effet défavorable sur la production globale de MnSOD humaine. Une analyse des fractions protéiques soumises aux ultrasons soluble (s) et non soluble 30 (p) sur un gel électrophorétique de dodécyl sulfate de sodium - poiyacryl amide (SDS-PAGE), montre une solubilisation accrue de la protéine recombinante avec des concentrations en Mn++ accrues (Tableau 1). Un examen de l'activité de la SOD (voir McCord et coll., supra) laisse supposer qu'il y a une corrélation entre les concentrations en Mn++ 35 accrues dans les milieux de croissance et la solubilité accrue de la - 25 - I *

MnSOD avec une valeur optimale apparente à la concentration en Mn++ de 150 ppm dans les milieux (figure 3). De plus, les concentrations en Mn++ accrues activent l'enzyme soluble préalablement inactive. Les fractions protéiques solubles de cultures induites se développant à 5 ces teneurs en Mn++ montrent une augmentation de l'activité en SOD

allant jusqu'à 60 fois par rapport aux fractions protéiques solubles de cultures non induites se développant à ces teneurs en Mn++. La coloration d'activité de gels de concentration isoélectriques (IEF) (voir Beauchamp et coll., supra) révèle que les multiples formes de 10 la MnSOD recombinante sont identiques à celles de MnSOD de foie humain, naturelle.

Les résultats relatifs à la production de MnSOD humaine par E. coli A1645 contenant du pMSE-4 sont similaires à ceux décrits ci-dessus.

15 ' Tableau 1 % de MnSOD % de MnSOD Unités d'activité

Mn++ humaine soluble humaine soluble spécifique (ppm) par rapport à la des protéines /mg de protéines

MnSOD humaine bactériennes solubles 20 totale induite solubles 0 30,6 7,2 30 50 72,7 15,4 241 100 78,0 16,9 356 25 150 82,9 18,8 606 200 82,0 20,8 338 250 79,2 20,4 380 300 80,8 20,3 381 450 89,2 22,4 323 30 35 » * - 26 -

Exemple 5

Construction de pMSARB4 : Plasmided1 expression de MnSOD humaine T +R Tet

R

On obtient le vecteur d'expression de Tet , pARB, 5 à partir de pSODßjT-ll par une digestion totale avec de l'EcoRl suivie d'un clivage partiel par des enzymes de restriction BamHI. Le pSODp^T-11 a été déposé à l'American Type Culture Collection sous le N° 53468. Le plasmide digéré est lié au moyen d'un oligomère de synthèse 5' - AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3' : 10 3' - GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5' ce qui conduit à l'obtention de pÄRB contenant le promoteur de X P^.

Le fragment d'EcoRI du plasmide d'expression de MiSCD pMSE-4, contenant le site de liaison ribosomique cil et la séquence de codage totale pour l'enzyme mature, est introduit dans le site d'EcoRI 15 particulier du pARB. Le plasmide résultant pMSARB4 contient le gène de MnSOD sous le contrôle de X P^ et du site de liaison ribosomique cil qui confère une résistance à la tétracycline (figure 4).

Exemple 6

Expression de MnSOD humaine à partir de pMSARB4 20 On introduit le plasmide pMSARB4 dans la souche d'Escherichia coli A4255, en utilisant des méthodes connues. On fait croître des cultures à 42°C dans du bouillon de Luria (BL) contenant différentes concentrations de Mn++, jusqu'à ce que la densité optique (DO) à 600 nm atteigne 6,7. On réalise l'induction à 42°C. Les échan-25 tillons prélevés à différents intervalles de temps sont traités par électro phorèse sur SDS-PAGE. La teneur en hMnSOD s'accroît avec la période d'induction jusqu'à 120 minutes, stade auquel elle comprend environ 15 % de la totalité des protéines cellulaires» pourcentage déterminé par un balayage au moyen d'un gel de coloration bleue de Coomassie. 30 La MnSOD induite est solubl equelle que soit la concentration en Mn++ dans les milieux de croissance · Ceci contraste avec les observations effectuées pour le plasmide pMSE-4 d'Amp . (Voir exemple 4). Toutefois, le niveau d'expression et l'activité de SOD maximale dépendent du complément de Mn++ (Tableau 2).

35 - 27 - i * * ' TABLEAU 2

Expression de MnSOD dans E. coli A4255 (pMSARB4) % de hMnSOD soluble Unités d'activité ppm Mn++ des protéines spécifique /mg de 5 bactériennes solubles protéines solubles

El 32° 42° 0 10,9 8,0 23 50 19,8 8,0 227 10 100 16,0 8,0 241 200 17,0 10,0 278 300 16,0 9,3 238

Exemple 7 15 Purification de MnSOD humaine recombinante enzymatiquement active

On fait fermenter une souche d'E. coli A4255 contenant le plasmide pMSARB4 dans du BL complété par 750 ppm de Mn++ à une température de 32°C jusqu'à une A600 de 17,0. On réalise l'induction de l'expression de MnSOD humaine par une élévation 20 de la température jusqu'à 42°C pendant 2 heures, stade auquel la culture atteint une A600 de 43,0. Les cellules sont recueillies par centrifugation et remises en suspension (2/10 du volume initial) dans du tampon phosphate 50 mM (pH de 7,8) contenant 250 mM de NaCl. Les bactéries sont rompues par un double passage à travers du Dynomill et centri-25 fugées, les débris cellulaires étant écartés. On chauffe le surnageant pendant 1 heure à 60°C, on le refroidit à4°C, on concentre le surnageant clair à 0,03 de son volume initial et on le dialyse contre du tampon phosphate de potassium 2 mM (pH 7,8) sur une unité d'ultrafiltration de Pelicon pourvue d'une membrane de 10 K. On charge la préparation 30 enzymatique brute sur une colonne DE52, on la lave intimement avec

du tampon phosphate de potassium 2 mM (pH 7,8) et on l'élue avec du tampon phosphate de potassium 20 mM (pH 7,8). Les fractions rassemblées contenant l'enzyme sont dialysées contre de l'acétate de potassium 40 mM (pH 5,5), introduites dans une colonne CM52 et éluées 35 avec un gradient linéaire d'acétate de potassium 40 - 200 mM (pH

t ψ * - 28 - de 5,5). Les fractions de pointe contenant la MnSOD humaine sont rassemblées, dialysées contre de l'eau, ajustées à pH 7,8 avec un tampon de phosphate de potassium 10 mM et congelées à -20°C.

La MnSOD humaine recombinante obtenue a une pureté supérieure à 99 %, avec une activité spécifique d'environ 3500 unités/mg. Le rendement global du processus de purification est d'environ 30 % (Tableau 3).

Les séquences de l'enzyme purifiée montrent la présence d'une méthionine additionnelle à l'acide aminé à terminaison r de N comparativement à la MnSOD humaine connue [Barra D., Schinina M.E., Simmaco M., Bannister 3.V., Bannister W.H., Rotilio G. et Bossar F., J. Biol. Chem. 259,12595-601 (25 octobre 1984)].

Une analyse de la teneur en métal par absorption atomique révèle l'existence d'environ 0,77 atome de Mn par sous-unité enzymatique. Ceci est en concordance avec les résultats publiés [McCord J.M., Boyle J.A., Day Jr. E.D., Rizzolo L.J. et Salin M.L., Superoxide and Superoxide Dismutase, Michaelson A.M., McCord 3.M. et Fridovich I. (éds) Academie Press, Londres pp. 129-138 (1977)].

â * - 29 - <υ 3 er

•'S OjO

o c •·<υ ία. 'ίΤ Γχ O CN O

M sï -h CT\ IO CO o vitl +ü » ^ m K ΙΛ £ —I —« -H (N cn ' > s *4-» o < 0) +-> c 03

C

3 ε O C3S Ο Ο ΓΛ R ^ o 00 ΓΛ 00 ΙΛ

<U ^ J

*“ c <u 0) ^

.2 p Q

^ 2 -O O g n Cc^ ^ 'Ί ^ °1 \p < Î: $ - oo n ·ο * oj

[U * C

J Q “ . g cq q ε < § δ HC <+Η S iu oj S ' § T3 T= - c 5 ό o o £ V ° ο o ^ Os! £ (d^M Oj-OhTeP ex O C) CN (N '03 G ·= ~o .~ '01 1-4-4 3 3 O 03 Q-c ία, 03

'R

v i+H

ο ξ .2 Q.

(U QJ

0 5 ε

^ C N

E _ .2 <= g U ï l ô i u.

U ^ '(1) C N 3 ^ u ΙΛ ^ 2 <U +j -U Q.

9" S 5 o eu 2 -j) o3 cd 03 j4-, r ) L· h ω o; +.1 a i-i 3 tu ω ω eu

Cd cd 3 4_i +j —, c C "3 cd cd π3 u X Ο 3 3 > 3 3 i- — —< 1/) ι/l Ct W Μ * - 30 - 1 . *

Il doit être entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisation ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre du présent brevet.

5 10 15 20 25 30 35

Claims (70)

1. ADN purifié encodant un polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine ou un analogue ou mutant de celui-ci.

2. Molécule d'ADN qui comprend de l'ADNc en- 5 codant un polypeptide de superopxyde dismutase de manganèse humaine ou un analogue ou mutant de celui-ci.

3. Molécule d'ADN à double brin qui encode un prépolypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine ou un analogue ou mutant de celui-ci, dont un brin comprend essentielle lement la séquence de nucléotides représentée par la figure 1, partant du nucléotide numéro^ en aval jusqu'au nucléotide numéro 708.

4. Molédule d'ADN à double brin qui encode un polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine ou un analogue ou mutant de celui-ci, dont un brin comprend essentiellement 15 la séquence de nucléotides représentée par la figure 1, partant du nucléotide numéro 115 en aval jusqu'au nucléotide numéro 708 inclusivement.

5. Véhicule de clonage qui comprend la molécule d'ADN de la revendication 1.

6. Plasmide qui comprend la molécule d'ADN de la revendication 1.

7. Plasmide suivant la revendication 6, appelé pMSE-4, ayant la carte de restriction représentée par la figure 2 et déposé dans la souche d'E. coli A4255 sous le N° ATCC 52350.

8. Plasmide suivant la revendication 6, appelé pMSÂRB4, et ayant la carte de restriction représentée par la figure 1 2 3 4 Cellule dans laquelle l'ADN de la revendication 2 1 a été introduit.

10. Cellule procaryotique suivant la revendication 9. 3 Cellule bactérienne suivant la revendication 9. 4 Cellule suivant la revendication 11, contenant 35 le plasmide pMSE-Ψ déposé sous le N° ATCC 53250. -32- « ( *

13. Cellule suivant la revendication 11, contenant le plasmide pMS&RB4.

14. Cellule eucaryotique suivant la revendication 9.

15. Procédé de production d'un polypeptide de super oxyde dismutase de manganèse humaine ou d'un analogue ou mutant de celui-ci, caractérisé en ce qu'il comprend le traitement d'une cellule suivant la revendication 9 de telle sorte que l'ADN dirige l'expression du polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine ou *0 de son analogue ou mutant et que la cellule exprime le polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine ou de son analogue ou mutant, et la récupération de la cellule du polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine ou de son analogue ou mutant ainsi exprimé.

16. Polypeptide purifié comprenant 222 acides aminés ayant la séquence représentée par la figure 1, séquence dont la terminaison N est constituée par la méthionine encodée par les nucléotides 43-45 de la figure 1 et dont la terminaison COOH est constituée par la lysine encodée par les nucléotides 706-708 de la figure 1.

17. Polypeptide purifié formé essentiellement de 222 acides aminés ayant la séquence représentée par la figure 1, séquence dont la terminaison N est constituée par la méthionine encodée par les nucléotides 43-45 de la figure 1 et dont la terminaison COOH est constituée par la lysine encodée par les nucléotides 706-708 de 23 la figure 1.

18. Polypeptide produit bactériennement comprenant 198 acides aminés ayant la portion de séquence d'acides aminés représentée par la figure 1, séquence dont la terminaison N est constituée par la lysine encodée par les nucléotides 115-117 de la figure 1 et 30 dont la terminaison COOH est constituée par la lysine encodée par les nucléotides 706-708 de la figure 1.

19. Polypeptide produit bactériennement exempt de substances d'origine humaine, lequel polypeptide comprend 198 acides aminés ayant la portion de séquence d'acides aminés représentée 33 par la figure 1, séquence dont la terminaison N est constituée par 4 - * « « - 33 - la lysine encodée par les nucléotides 115-117 de la figure 1 et dont la terminaison COOH est constituée par la lysine encodée par les nucléotides 706-708 de la figure 1.

20. Polypeptide produit bactériennement formé 5 essentiellement de 198 acides aminés ayant la portion de séquence d'acides aminés représentée par la figure 1, polypeptide dont la terminaison N est encodée par les nucléotides 115-117 de la figure 1 et t dont la terminaison COOH est constituée par la lysine encodée par les nucléotides 706-708 de la figure 1.

21. Polypeptide produit bactériennement exempt de substances d'origine humaine formé essentiellement de 198 acides aminés ayant la portion de séquence d'acides aminés représentée par la figure 1, polypeptide dont la terminaison N est constituée par la lysine encodée par les nucléotides 115-117 de la figure 1 et dont la 15 terminaison COOH est constituée par la lysine encodée par les nucléotides 706-708 de la figure 1.

22. Superoxyde dismutase de manganèse humaine comprenant au moins deux polypeptides répondant chacun à la revendication 19.

23. Procédé de production d'un polypeptide suivant la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend le traitement d'une cellule contenant de l'ADN encodant et capable de diriger l'expression du polypeptide de telle sorte que la cellule exprime le polypeptide, et la récupération de la cellule du polypeptide ainsi exprimé. 25 2k. Superoxyde dismutase de manganèse humaine ou un analogue de celle-ci résultant de l'expression dans des bactéries de la séquence d'ADN représentée par la figure 1, partant du nucléotide numéro 115 en aval jusqu'au nucléotide numéro 708.

25. Un polypeptide 30 (a) encodé par de l'ADN de superoxyde dismutase de manganèse humaine, (b) pouvant être produit dans des bactéries, et (c) pouvant catalyser la réaction suivante : 202- + 2 H+ -5- H202 + O2 ^ 26. Composition vétérinaire comprenant une quantité 35 efficace d'une superoxyde dismutase de manganèse humaine suivant - 34 - I f * la revendication 22 et un support approprié.

27. Composition pharmaceutique comprenant une quantité efficace d'une superoxyde dismutase de manganèse humaine suivant la revendication 22 et un support approprié.

28. Procédé de catalyse de la réaction :

20 I + 2 H+ -> H202 + 02 qui comprend la mise en contact des réactifs sous des conditions appropriées avec de la superoxyde dismutase de manganèse humaine ou un analogue de celle-ci suivant la revendication 24.

29. Procédé pour réduire les lésions à des cellules provoquées par des radicaux superoxyde, qui comprend la catalyse de la réduction des radicaux superoxyde suivant la revendication 28.

30. Procédé pour réduire les lésions à un sujet apparaissant lors d'une reperfusion faisant suite à une ischémie, qui comprend 15 l'administration au sujet d'une quantité efficace de superoxyde dismu tase de manganèse humaine ou d'un analogue de celle-ci suivant la revendication 24.

31. Procédé pour prolonger la période de survie d'organes isolés, excisés, qui comprend l'addition d'une quantité efficace 20 de superoxyde dismutase de manganèse humaine suivant la revendication 24 au milieu de perfusion.

32. Procédé pour traiter un sujet souffrant d'inflammations, qui comprend l'administration au sujet d'une quantité efficace de superoxyde dismutase de manganèse humaine ou d'un analogue de 25 celle-ci suivant la revendication 24.

33. Procédé de production de superoxyde dismutase de manganèse humaine enzymatiquement active ou d'un analogue? de celle-ci dans une cellule bactérienne qui contient et qui est capable d'exprimer une séquence d'ADN encodant la superoxyde dismutase 30 ou son analogue, caractérisé en ce qu'il comprend le maintien de la cellule bactérienne sous des conditions appropriées et dans un milieu de production approprié, le milieu de production étant complété d'une quantité de Mn++ de telle sorte que la concentration en Mn++ dans ^ le milieu soit supérieure à environ 2 ppm. Λ * « * * Α - 35 - Λ·

34. Procédé suivant la revendication 33, caractérisé en ce que la cellule bactérienne est une cellule d'Escherichia coli.

35. Procédé suivant la revendication 33, caractérisé 5 en ce que la cellule bactérienne contient un plasmide, le plasmide contenant la séquence d'ADN encodant la superoxyde dismutase de manganèse ou son analogue incorporé dans la cellule. ^ 36. Procédé suivant la revendication 33, caractérisé en ce que le milieu de production approprié est un milieu d'hydrolysat 10 de caséine.

37. Procédé suivant la revendication 33, caractérisé en ce que le milieu de production approprié est un milieu BL.

38. Procédé suivant la revendication 33, caractérisé en ce que la concentration en Mn++ est d'environ 50 à environ 1500 ppm.

39. Procédé suivant la revendication 38, caractérisé en ce que la concentration en Mn++ est d'environ 150 ppm.

40. Procédé suivant la revendication 38, caractérisé en ce que la concentration en Mn++ est d'environ 750 ppm.

41. Procédé suivant la revendication 34, caractérisé 20 en ce que la cellule bactérienne est la souche d'Escherichia coli A4255 contenant le plasmide pMSE-4 déposé sous le N° ATCC 53250.

42. Procédé suivant la revendication 35, caractérisé en ce que le plasmide est le pMSE-4 ayant la carte de restriction représentée par la figure 2 et déposé sous le N° ATCC 53250.

43. Procédé suivant la revendication 34, caractérisé en ce que la cellule bactérienne est la souche d'Escherichia coli A4255 contenant le plasmide pMSÀRB4 ayant la carte de restriction représentée par la figure 4.

44. Procédé suivant la revendication 35, caractérisé 30 en ce que le plasmide est le pMSARB4 ayant la carte de restriction représentée par la figure 4.

45. Superoxyde dismutase de manganèse humaine produite par voie bactérienne, ou analogue ou mutant de celle-ci. ^ 46. Polypeptide ayant essentiellement la même 35 séquence d'acides aminés qu'un polypeptide de superoxyde dismutase - 36 - humaine, ce polypeptide ayant été préparé dans un micro-organisme unicellulaire.

47. Procédé de récupération de superoxyde dismutase de manganèse humaine ou d'un analogue de celle-ci de cellules bacté- 5 riennes qui contiennent de la superoxyde dismutase de manganèse humaine, caractérisé en ce qu'il comprend : (a) le traitement des cellules bactériennes de manière à récupérer -* une fraction protéique contenant les protéines présentes dans les cellules, notamment la superoxyde dismutase de manganèse humaine; 10 et (b) le traitement de la fraction protéique de manière à récupérer la superoxyde dismutase de manganèse humaine.

48. Procédé suivant la revendication 47, caractérisé en ce qu'il comprend : 15 (a) le traitement des cellules pour séparer les protéines solubles des protéines insolubles et des débris de parois cellulaires; (b) la récupération des protéines solubles; (c) le traitement des protéines solubles ainsi récupérées pour séparer une fraction des protéines solubles contenant la superoxyde dismu- 20 tase de manganèse humaine ou son analogue; (d) la récupération de la fraction de protéines solubles contenant la superoxyde dismutase de manganèse humaine ou son analogue; (e) le traitement de la fraction de protéines solubles contenant la superoxyde dismutase de manganèse humaine ou son analogue de 25 manière à récupérer séparément la superoxyde dismutase de manga nèse humaine ou son analogue.

49. Procédé suivant la revendication 47, caractérisé en ce qu'il comprend : (a) l'isolement des cellules bactériennes du milieu de production; 30 (b) la mise en suspension des cellules bactériennes isolées dans une solution appropriée ayant un pH d'environ 7,0 à environ 8,0; (c) la rupture des cellules bactériennes en suspension; (d) la centrifugation des cellules bactériennes rompues; (e) le chauffage du surnageant résultant pendant une période allant 35 d'environ 30 à environ 120 minutes à une température de l'ordre d'environ 55 à environ 65°C; - 37 - f # * « * < (f) le refroidissement du surnageant chauffé à une température en-dessous d'environ 10°C; (g) la séparation de tout précipité du surnageant refroidi; (h) la dialyse du surnageant refroidi contre un tampon approprié; 5 (i) l'élution du produit de rétention sur une colonne de chromatographie d'échange d'anions par une solution tamponnée appropriée; (j) la collecte et le rassemblement des fractions de Péluant contenant ? la superoxyde dismutase de manganèse humaine; (k) la dialyse des fractions rassemblées contre de l’acétate de potassium 10 d'environ 40 mM (pH 5,5); (l) l'élution des fractions rassemblées dialysées dans une colonne de chromatographie d'échange de cations avec un gradient linéaire d'acétate de potassium allant d'environ 40 à environ 200 mM (pH 5,5); et 15 (m) la collecte et la récolte des fractions de pointe de l'éluant contenant la superoxyde dismutase.

50. Procédé suivant la revendication 49, caractérisé en ce que dans l'étape (e) on chauffe le surnageant résultant pendant environ 45 à environ 75 minutes à une température d'environ 58 à 20 environ 62°C.

51. Procédé suivant la revendication 49, caractérisé en ce que l'on chauffe le surnageant pendant environ 60 minutes à une température d'environ 60°C.

52. Procédé suivant la revendication 49, caractérisé 25 en ce que dans l'étape (f) on refroidit le surnageant chauffé à une température d'environ 4°C.

53. Procédé suivant la revendication 49, caractérisé en ce que dans l'étape (g) on sépare le précipité par centrifugation.

54. Procédé suivant la revendication 49, caractérisé 30 en ce que dans l'étape (h) on dialyse le surnageant refroidit par ultra filtration en utilisant une membrane de filtration plus petite que 30K.

55. Procédé suivant la revendication 49, caractérisé en ce que dans l'étape (h) le tampon approprié est un tampon de phos- ^ phate de potassium 2 mM ayant un pH d'environ 7,8.

56. Procédé suivant la revendication 49, caractérisé ♦ -38- 1. l C . 4. " « en ce que dans l'étape (i) la solution tamponnée est du phosphate de potassium d'au moins 20 mM et a un pH d'environ 7,8.

57. Procédé suivant la revendication 49, caractérisé en ce qu'après la dialyse du surnageant refroidi, on concentre le sur- 5 nageant dialysé en un volume approprié.

58. Procédé suivant la revendication 57, caractérisé en ce que le volume approprié est d'environ 0,03 du volume de départ - du surnageant. * 59. Procédé suivant la revendication 49, caractérisé 10 en ce qu'il comprend en outre la dialyse des fractions de pointe rassemblées contre une solution appropriée.

60. Procédé suivant la revendication 59, caractérisé en ce que la solution appropriée est de l'eau.

61. Procédé suivant la revendication 59, caractérisé 15 en ce que la solution appropriée est une solution tampon constituée par un tampon de phosphate de potassium d'environ 10 mM, d'un pH d'environ 7,8.

62. Procédé suivant la revendication 49, caractérisé en ce que la superoxyde dismutase est de la superoxyde dismutase 20 humaine.

63. Procédé suivant la revendication 49, caractérisé en ce que la superoxyde dismutase est de la superoxyde dismutase de manganèse humaine.

64. Superoxyde dismutase de manganèse humaine 25 ou un analogue de celle-ci, purifiée par le procédé de la revendication 47.

65. Superoxyde dismutase de manganèse humaine essentiellement exempte d'autres substances d'origine humaine.

66. Molécule d'origine non naturelle ayant une activité 30 de superoxyde dismutase de manganèse humaine comprenant au moins * deux polypeptides de superoxyde dismutase de manganèse humaine.

67. Polypeptide de superoxyde dismutase de man ganèse humaine comprenant un polypeptide de 198 acides aminés, dont une portion de la séquence d'acides aminés est représentée par la 35 figure 1, séquence dont la terminaison N est constituée par la lysine « < i ·« e - 39 - λ encodée par les nucléotides 115-117 de la figure I et dont la terminaison COOH est constituée par la lysine encodée par les nucléotides 706-708 de la figure 1.

68. Complexe de polypeptide au manganèse compre- 5 nant un polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine sous la forme d'un complexe avec le manganèse sous l'une quelconque de ses formes chimiques, lequel complexe a l'activité' enzymatique de la superoxyde dismutase de manganèse humaine d’origine naturelle. a 69. Superoxyde dismutase de manganèse humaine 10 comprenant au moins deux polypeptides de superoxyde dismutase de manganèse humaine sous la forme d’un complexe avec le manganèse sous l'une quelconque de ses formes chimiques et ayant l'activité enzymatique de la superoxyde dismutase de manganèse humaine d'origine naturelle.

70. Analogue de polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine comprenant un polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine à l'une ou aux deux extrémités duquel sont fixés un ou plusieurs acides aminés additionnels.

71. Analogue de complexe de polypeptide au manga- 20 nèse comprenant un complexe de polypeptide au manganèse, dont la partie polypeptide comprend un ou plusiuers acides aminés additionnels fixés à l'une ou à chacune de ses extrémités.

72. Analogue de superoxyde dismutase de manganèse humaine comprenant au moins deux polypeptides dont au moins l'un 25 est un analogue de polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine, sous la forme d'un complexe avec le manganèse sous l'une quelconque de ses formes chimiques, cet analogue de dismutase ayant l'activité enzymatique de la superoxyde dismutase de manganèse humaine d'origine naturelle.

73. Mutant de polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine comprenant un polypeptide ayant une séquence d'acides aminés sensiblement identique à celle du polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine mais différant de celle-ci par un ou plusieurs acides aminés.

74. Mutant de complexe de polypeptide au manganèse t i ê - w - comprenant un mutant de polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine sous la forme d'un complexe avec le manganèse sous l'une quelconque de ses formes chimiques, lequel mutant a l'activité enzymatique de la superoxyde dismutase de manganèse.

75. Mutant de superoxyde dismutase de manganèse humaine comprenant au moins deux polypeptides dont au moins l'un d'entre eux est un mutant de polypeptide de superoxyde dismutase de manganèse humaine sous la forme d'un complexe avec le manganèse sous l'une quelconque de ses formes chimiques et qui a l'activité enzy-10 matique de la superoxyde dismutase de manganèse humaine d'origine naturelle.

76. Analogue de superoxyde dismutase de manganèse humaine comprenant au moins deux polypeptides, dont au moins l'un d'entre eux a la séquence d'acides aminés représentée par la figure 15 1, séquence dont la terminaison N est constituée par la lysine encodée par les nucléotides 115-117 de la figure 1 et dont la terminaison COOH est constituée par la lysine encodée par les nucléotides 706-708 de la figure 1, plus un résidu de méthionine additionnel à la terminaison N.

77. Analogue de superoxyde dismutase de manganèse humaine purifié suivant la revendication 76, ayant une activité spécifique supérieure à environ 3500 unités/mg.

78. ADN de superoxyde dismutase de manganèse humaine, son expression dans les bactéries et procédé de récupération 25 de superoxyde dismutase de manganèse humaine, tels que décrits ci-dessus, notamment dans les exemples donnés. Dessins : ............planches _jfcl..pages dont..............page de garde 30 ______.,2a... pages de description r ______pages de revendicatiôil ......abrégé descriptif Luxembourg, le 20 MOV.1S86 Le mandataire : Me Alain Rukavina 35