JPS62226928A

JPS62226928A - 臓器機能改善剤

Info

Publication number: JPS62226928A
Application number: JP61067232A
Authority: JP
Inventors: Norio Otsu; 紀夫大津; Ichiro Nakakoshi; 中越　一郎
Original assignee: Ube Industries Ltd
Current assignee: Ube Corp
Priority date: 1986-03-27
Filing date: 1986-03-27
Publication date: 1987-10-05
Anticipated expiration: 2009-06-08
Also published as: JPH0643341B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉本発明は臓器機能改善剤に関する。さらに詳しくは、単
細胞微生物特にヒト銅、亜鉛型スーパーオキシドディス
ムターゼ構造遺伝子を有する組換えＤＮＡで形質転換さ
れた単細胞微生物中で産生されたヒトスーパーオキシド
ディスムターゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを活性成分とする臓器機能改善剤に関する
。

スーパーオキシドディスムターゼ（以下ＳＯＤと略す）
は、次式に示す不均化反応により、スーパーオキシド（
・０□−）を消失させる酵素である。

・０２−十・０２−＋２Ｈ＋→０２＋Ｈ２Ｏ２スーパー
オキシドは、生体における酸素毒性の中で最も毒性の高
い分子種で、炎症、未熟児酸素網膜症、放射線障害、ガ
ンなどの疾病を引き起こすと言われている。

ところで、近年、心臓、腎臓、肝臓、膵臓などの臓器移
植が行なわれるようになっているが、これらの臓器の移
植においでは移植臓器の血流を一時的に遮断し、血液凝
固防止のためヘパリンがリンデル液などで潅流する必要
がある。

しかして、潅流された移植臓器は生体へ移植されるまで
血液の供給を受けることが出来ないので、酸素不足とな
り、この際に電子伝達系から自由電子が放出され、移植
臓器中に活性酸素がつくられることになるという不都合
が生じる。

また、生体へ移植された臓器は、移植手術終了後血流の
再開により血液供給を受けるので、その際に移植臓器は
急激に酸素加されて細胞内のＰＯ□（酸素分圧）が上昇
し、活性酸素の産生が高まり組織障害を起こす問題もあ
る。臓器移植後に起こる拒絶反応もこの活性酸素に関係
しているとさえ云われている。

現在、臓器保存については保存剤というものはなく、ま
た拒絶反応については免疫抑制剤が使用されているが種
々の副作用が問題とされている。′一方、特開昭５°７
−１４１，２８８号公報には、ヒト細胞スーパーオキシ
ドディスムターゼの特異抗体結合担体を用いて、ヒト細
胞からスーパーオキシドディスムターゼを該担体に結合
させて単離する方法が開示されている。

特開昭５７−１５５，９９１号公報には、ヒト・胎盤の
水抽出液から４０〜５０％飽和硫安沈殿画分を除去した
後の７０〜８０％飽和硫安上清から、硫安分画、陰イオ
ンクロマトグラフィー、ゲルろ過等によってスーパーオ
キシドディスムターゼを取得する方法が開示されている
。

また、特開昭５９−９１，８８１号公報には、不純な銅
亜鉛スーパーオキシドディスムターゼを含有する溶液を
、非極性ハイポーラスポリマー系樹脂と接触させ、次い
で該樹脂を洗浄し、さらに該樹脂に吸着した銅、亜鉛ス
ーパーオキシドディスムターゼを溶出して精製する方法
が開示されている。

〈発明が解決しようとする問題点〉しかしながら、前記した方法は原料を多量に人手するこ
とが困難であるし、また比較的入手し易い原料であるヒ
ト胎盤ではＳＯＤ含有量が低いなどの火照があり、工業
生産に適したものとは言い難い。

この点を解決するため、本願出願人は、先に、＝３− 遺伝子組換え法によるヒ）ＳＯＤの製造法を提案した。

残された問題は、かくして製造されたヒトＳＯＤが実際
に酵素活性および薬理活性を持つか否かを明らかにする
ことであった。

それ故、本発明の目的は、上記残された問題を明らかに
することにある。

本発明の他の１」的は、ヒト・スーパーオキシドディス
ムターゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを含有する臓器機能改善剤を提供することにある
。

本発明のさらに他の目的は、遺伝子組換え技術によって
製造した上記構造を持つポリペプチドを含有する臓器移
植改善剤を提供することにある。

本発明のさらに他の目的および利点は以下の説明から明
らかとなろう。

〈問題、αを解決するための手段及び作用〉本発明によ
れば、本発明の一ヒ記目的及び利点はヒトスーパーオキ
シドディスムターゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有
するポリペプチドを活性成分とする臓器機能改善剤によ
って達成される。

上記ポリペプチドは、例えばポジティブレギュレーショ
ンサイトを有する形質発現調節遺伝子の下流にヒト銅、
亜鉛型スーパーオキシドディスムターゼ構造遺伝子を有
する組換えＤＮＡで形質転換された微生物を培養し、培
養物中に蓄積されたヒト銅、亜鉛型スーパーオキシドデ
ィスムターゼ（以下ヒ）　Ｃｕ、Ｚｎ　−Ｓ　ＯＤとい
う）を採取することによって製造される。

上記ヒトＣｕ、Ｚｎ−３ＯＤのｃＤＮＡ合戒の鋳型とし
て用いられるｍＲＮＡは正常なヒト組織（肝臓、胎盤、
腎臓など）から分離される。組織からのＤＮＡの分離は
、７エ７−ルークロロホルム法、グアニジニウム−熱フ
ェノール法、グアニジニウム−塩化セシウム法などの公
知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ＋゛ｒ、ら＋Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋　　１８７−１９８　ｔｌ
　９８２、Ｃｏ１ｄ　　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）が利用で鰺る。次いでオリゴ（
ｄＴ）セルロース、ポリ（Ｕ）セファロースなどを用い
てポリ（Ａ）ティルをもつｍＲＮＡを分離する。

このようにして得られたｍＲＮＡは、ヒ）Ｃｕ。

Ｚｎ−８Ｚｎ−８ＯＤ１７）を含んでいるｍＲＮＡ混合
物であるが、これをそのままｃＤＮＡ合成に用いる。ま
ず、逆転写酵素を用いｍＲＮＡを鋳型として一本頻ｃＤ
ＮＡを合成し、次いで逆転写酵素またはＤＮＡポリメラ
ーゼを用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した後、適当なベク
ターに組込まれた形でｃＤＮＡを得る。これにはｄＧ−
ｄＣまたはｄＡ−ｄ１゛ホモポリマー結合法（Ｎｅｌｓ
ｏｎ、Ｔ、　Ｓ、　、Ｍｅｔｔ＋。

ｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ３６Ｂ、４１＋
１９７９．Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐ　ｒｅｓｓ　　Ｉ　
ｎｃ、　　）やＯｋａｙａ＋ｎａ　　Ｂ　ｅｒｇ法（Ｏ
ｋａｙａｍａｔＨｏａｎｄ　　Ｂｅｒｇ＋Ｐ、　＋　　
Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｆ、、２，１６１，１．９
８２）が利用できる。

この場合のようにｍＲＮＡ混合物中の目的ｍＲＮＡ含量
が低い場合は、効率の高イＯｋａｙａｍａ−Ｂ　ｅｒｇ
法が好ましい。この方法に必要なりＮＡおよび宿主菌は
ファルマシアＰ、Ｌ、バイオケミカルズ社カタログＮｏ
、２７　４’７５０−０１として人手できる。

このようにして得られる組換えＤＮＡをたとえばエシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）
Ｘ　１７７６株あるいはＤＨ１株（Ｌｏｕ＋、Ｂ、　ｔ
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　
　、６０，１６０，１９６８；Ｍｅｓｅｌｓｏ＋＋＋Ｍ
、　　ａｎｄ　　Ｙｕａｒ＋、Ｒｏ、Ｎａｔｕｒｅｔ２
１７．１１　１　０＋１　９６８　；Ｈａｎａｈａｒ＋
＋Ｄ、＋Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ。

１６６．５５７．１９８３）に導入して形質転換させる
。形質転換法は公知の方法（重定勝哉、細胞工学、Ｖｏ
ｌ、　２．Ｎｏ、　　３，６１６．１９８３）またはそ
れに準する方法で行うことができる。アンピシリン耐性
などの薬剤耐性によりまず形質転換体を選別したのち、
ヒ）Ｃｕ、Ｚｎ　　ＳＯＤ遺伝子に対応すると考えられ
る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成しこ
れをｆｆ２ｐで標識してプローブとして用い、公知のコ
ロニーハイブリグイゼーション法（Ｈａｎａｈａｎ、　
Ｄ　、　　ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ、１０　；−，３３３＋　１．９．８３　）
によりポジティブなシグナルを示した形質転換体を選択
する。

これらの形質転換体より常法に従ってプラスミドＤＮＡ
を単離し、ｃＤＮＡ部分の塩基配列をＭａｘａ＋ａ　−
Ｇ　ｉ　Ｉｂｅｒｔ法（ＭＢＢＨ，ＡｏＭ、　ａｎｄ　
　Ｇ１１ｂｅｒｔ。

Ｗ、　　、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　
　Ｓｃｉ、　　、　’７４−、−５６０　。

１９７７）またはジデオキシ法（Ｍ　ｅｓｓｉｎｇ＋　
Ｊ　、　　ら。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　、旦−，
３０９，１９８１）によって決定し、ヒトＣｕ、Ｚｎ　
−Ｓ　ＯＤ　ｃＤ　Ｎ　Ａの存在を確認する。確認には
、ヒト赤血球より単離されたＣｕ、Ｚｎ−８ＯＤのアミ
ノ酸配列（Ｊ　ａｂｕｓｅｈ＋Ｊ、　Ｒ，ｙＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ＋Ｙ影ｙ２３１０ｗｌ　９８０）または
ダウン症候群患者に由来する樹立細胞株より分離された
＋ａＲＮＡから得られたｃＤＮＡの塩基配列（Ｓ　ｈｅ
ｒｍａｎ、　Ｌ　、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、、８０，５４６５，１９８３）を参考に
することかできる。

次に、得られたヒトＣｕ、Ｚｎ−３ＯＤ＋７）ｃＤＮＡ
を適当な形質発現調節遺伝子の下流に連結する。

これにはトリプトファンオペロンプロモーター（ｔｒｐ
プロモーター）、ラクトースオペロンプロモーター（ｌ
ａｃプロモーター）、λ７アージのＰ　プロモー９−１
ｔａｃフロモーターなどの公知のプロモーターが利用で
きる。

しかし、ここで注目すべきことは、生体内にはＧ２　を
必要とする酵素の存在が知られており（大柳善彦、スー
パーオキサイドと医学、５８．１９８１、共立出版）、
従って、０２　を消去する作用を持つＳＯＤを過剰生産
させることにより宿主菌の生理障害をひき起す可能性が
充分に考えられることである。これを避けるためには、
遺伝子の発現を抑制した状態で細胞を成をさせたのち、
適当な条件下にこの抑制を解除させて遺伝子を発現させ
ＳＯＤを多量に産生させることが好ましい。

エシェリヒア・コリから分離されたプラスミドＣｏｌ　
　Ｅｌ　　上に存在するコリシンＥ１遺伝子はコリシン
Ｅ１タンパクの産生を支配している遺伝子であり、通常
の状態においてはリプレッサータンパクがオペレーター
に結合することにより遺伝子の発現は抑制されているが
、ＤＮＡに損傷を与えるような処理、たとえば紫外線照
射、マイトマイシンＣ処理、ナリジキシン酸処理などに
よりこの抑制が解除されて誘発が起り、。コリシンＥ１
タンパクが多量につくられる。これはいわゆる負の制御
と呼ばれる調節機構である。これに加えて、フリシンＥ
１遺伝子には正の制御も存在しており（調恒明ら、生化
学、Ｖｏｌ、５６　、Ｎｏ、　　８．１．０８２．１９
８４）、ユニークな形質発現調節機構を持つ遺伝子であ
って、誘発時には正の制御の効果も加わってきわめて多
量のコリシン上１タンパクが産生される。さらにコリシ
ン上１タンパクはエシェリヒア・コリに対する抗菌性を
機能とするタンパクであって、通常時の細胞の成育には
必要ないタンパクと見なし得るものであり、その性質上
、通常時のコリシンＥ１遺伝子の発現が厳密に抑制され
ていることからも、コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節
遺伝子の利用は本発明にとってきわめて有利である。

Ｃｏｌ　　ＥＩ　　ＤＮＡはたとえばファルマシアＰ。

Ｌ、バイオケミカルズ社のカタログＮｏ、２７−４９１
４−０１として入手することが可能である。

また、正の制御に関与する領域、プロモーター・オペレ
ーター領域、リポソーム結合領域からなるコリシンＥ１
遺伝子の形質発現調節遺伝子の塩基配列は既に報告され
ている（Ｅｂｉｎｎ、Ｙ、ら、　Ｇ　ｅｎｅ。

ＬＬ、１１９．１９８１．）。なお、本発明におけるコ
リシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子とは、第１図の
−１４０から７８番目までの塩基配列の存在を必須とす
るものである。

コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒト
Ｃｕ、Ｚｎ−３ＯＤ　　ｃＤＮＡを連結する際に、いわ
ゆる融合タンパクを産生するような形での連結は、適当
な制限酵素の切断部位を利用することにより比較的容易
に行うことができる。しかし、コリシン上１タンパクに
白米する部分がある程度以上の長すを持っている場合、
この融合タンパクを人体に投与した際に免疫原性（抗原
性）を発揮する危険性が充分に考えられる。従って、コ
リシンＥ１遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の直後！
：　ヒ）　Ｃｕ、　Ｚ　ｎ　　Ｓ　ＯＤのＮ末端アミノ
酸コドンが連結される形が好ましい。しかし、これを満
足させてくれるような適当な制限酵素の切断部位はどち
らの遺伝子にも存在しない。そこで、制限酵素を用いて
両方のＤＮＡ断片を必要部分が欠失した形で切り出し、
欠失した部分は合成りＮＡ断片により補間することがで
きる。

合成りＮＡ断片は、たとえば固相トリエステル法（Ｍｉ
ｙｏｓｈｉ、に、ら、Ｎｕｃｌ、　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒ
ｅｓ、、Ｌ。

５５０７．１９８０）によりオリゴヌクレオチドを化学
合成し、これらをたとえばＴ４ＤＮＡす〃−ゼでつなぎ
合せることにより得られる。合成りＮＡ断片は、もとの
塩基配列を再現するものである必要は必ずしもない。ア
ミノ酸コドンには縮重が存在し、かつ生物の種によって
コドンの使用頻度が異なることは良く知られている。従
って、アミノ酸の配列を変えない限りにおいては、合成
りＮＡ断片の作製時にどのようなコドンを選んでも自由
であるが、宿主菌中で使用頻度の高いコドンを選択する
と、遺伝子の発現量の増大が期待できる。

コドンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子領域に関しては
、もとの塩基配列を再現する方が好ましいが、結果とし
て遺伝子の発現量の増加につながるような塩基配列の変
更は採用できる。

自律複製できるベクターに、コリシンＥ１遺伝子の形質
発現調節遺伝子を含むＤＮＡ断片、合成ＤＮＡ断片、ヒ
トＣｕ、Ｚｎ−８ＯＤ構造遺伝子断片を正しく組込むこ
とにより目的の組換えＤＮＡが得られる。これらのＤＮ
Ａ断片は、たとえばＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結する
ことができ、最終的に得られる組換えＤＮＡの構造が目
的するものである限り、ＤＮＡ断片の連結順序に制限は
ない。使用するベクターは宿主微生物内で複製可能なも
のであれば特に制限はなく、宿主がエシェリヒア・コリ
の場合はｐＢＲ３２２が良く用いられている。

得られた組換えＤＮＡをベクターの宿主微生物内に導入
し形質転換させる。本発明では宿主微生物としてエシェ
リヒア・コリを使用しているが、形質発現調節遺伝子、
特にコリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子が機能す
る限りにおいては、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　　５ｕｂｔｉ！ｉｓ）、サツカロミセス◆セレ
ビシェ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｅｅｓ　　ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）等の他の微生物も使用できる。エシェリヒ
ア・コリの場合はＷ３１１０株、２０ＳＯ株、Ｃ６００
Ｓ株などの名前があげられる。特にＷ３１１、０株が好
ましい。Ｗ３１１０株はニジエリア・フリＫ　１．２株
の野性味（λ−、Ｆ＋　）から誘導されたλ−１Ｆ−株
であり、栄養要求性などその他の点では野性味と同一で
ある（　Ｂ　ａｃｌ＋＋ｏａｎｎｙ　Ｂ　。

Ｊ　、　ｔＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｒｅｖ
ｉｅｕ＋ｓ＋−３６ｔ５２５　ｔ１９７２）。

テトラサイクリン耐性などによりまず形質転換体を選択
したのち、常法に従いプラスミドＤＮＡを分離し、制限
酵素地図の解析により第２次のスクリーニングを行う。

さらに誘発時のヒ）Ｃｕ、Ｚｎ　−Ｓ　ＯＤの産生能に
よって目的の形質転換体を選択する。

ＳＯＤ活性の測定法としては、チトクロームＣ−キサン
チン−キサンチンオキシダーゼを用いる方法（ＭｃＣｏ
ｒｄ、Ｊ、　Ｍ、ａｎｄ　　Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｌ＋、１
．。

Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、ＣＩ＋ｅｍ、　、−礼４４，６０
４９．１９６９）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢ
Ｔ）−リボフラビンを用いる方法（Ｂｅａｕｃｈａ＋ｎ
ｐ、Ｃ，ａｎｄ　　Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｈ、１．　ｔＡｎ
ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、３４，２７６．１９７１
）等が利用できる。ＮＢＴ−リボフラビン法は簡便であ
り、電気泳動後のタンパクの活性染色にも利用できるた
め便利である。エシェリヒア・コリの場合について言う
と、組換えＤＮＡがら産生されるヒ）　Ｃｕ、Ｚｎ　−
Ｓ　ＯＤに加えて、宿主染色体から産生されるＭｎ−８
ＯＤおよびＦｅ−８ＯＤが混在している。これらのＳＯ
Ｄの酵素としての作用は同一であるが、Ｃｕ、Ｚｎ　　
ＳＯＤは１〜２ＩＩＩＭのＯＮ−イオンによって活性が
阻害されるのに対し、Ｍｎ−８ＯＤ、Ｆｅ　　ＳＯＤは
同条件下での阻害を受けないことがら区別できる。また
、これら３種のＳＯＤは分子量や等電点が互いに異なる
ため、電気泳動、イオン交換またはデル口過カラムクロ
マトグラフィーによって分離することができる。

このようにして得られた、形質発現調節遺伝子特にはコ
リシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子に下流にヒ）　
Ｃｕ、Ｚｎ　−Ｓ　ＯＤ構造遺伝子を有する組換えＤＮ
Ａで形質転換された微生物を、その宿主微生物の増殖に
適した条件下で所定の時間培養し、その後に誘発合成を
行わせてヒ）Ｃｕ、Ｚｎ７ＳＯＤを大量に産生させる。

エシェリヒア・コリの場合、たとえばＬ培地、グルコー
スおよびカザミノ酸を含むＭ９培地などの公知の培地に
より培養を行う。培養は通常１５〜４３℃の温度で２〜
２４時間行う。必要により通気、攪拌を加えることがで
きる。対数増殖期にある培養物にマイトマイシンＣ、ナ
リジキシン酸などの薬剤を添加したり、紫外線を照射す
ることにより誘発合成を行わせることができる。

培養後、公知の方法で菌体を集め破砕したのち、通常知
られているタンパクの精製法に従ってヒトＣｕ、Ｚｎ−
８ＯＤ活性を持つタンパクを単離することによりヒトＣ
ｕ、Ｚｎ−８ＯＤが製造できる。

精製は、たとえば熱処理、塩析、濃縮、透析、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲル口過クロマトグラフィー、
クロマトフオーカシング、電気泳動、高速液体クロマト
グラフィー、アフイニテイクロマトグラフイーなどの操
作を適宜組合せて行うことができる。

かくして製造されたヒトスーパーオキシドディスムター
ゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド
は、例えば腸管、肝臓、腎臓、心臓等の臓器の機能を改
善する活性を示す。

本発明のポリペプチドは、通常の方法に従って注射剤、
錠剤、軟膏剤、カプセル剤、リポソーム製剤などの製剤
とすることができる。

本発明のポリペプチドは、生体から取出した臓器を生き
たまま保存するためにあるいは生体に投与して臓器機能
を改善するために使用される。臓器の保存には、例えば
１〜１０ｍｇの量が好適に用いられ、あるいは１日０．
Ｏ’１７〜０．１’７ｍＨ／ｋｇ・体重の投与量で１回
〜数回に分けて例えば各種腎疾患の治療を目的として、
経口的また非経口的に投与し得る。

以下に実施例および参考例を示す。

参考例１　ヒトＣｕ、Ｚｎ　　ＳＯＤのｃＤＮＡを組込
んだプラスミドｐｓＯＤ２の作Ｓｉ！：正常分娩によっ
て得られたヒト胎盤からグアニジウム−塩化セシウム法
によってＲＮＡを分離し、ついでオリゴ（ｄＴ）セルロ
ースを用いてポリ（Ａ）テイルをもった＋ｎＲＮＡを分
離した。

得られたｍＲＮＡより、岡山−バーブ法に従って、ｃｌ
）ＮＡライブラリーを作成した。宿主菌として大腸菌Ｄ
Ｈ１株を用いた。

コロニーハイブリグイゼーション法にて、ヒトＣｕ、Ｚ
ｎ−８ＯＤのｃＤＮＡｆＪ’ｍ込まれたプラスミｔ’　
ｐｓ　ＯＤ　２　全保持Ｌ　タ大Ｂ’に菌ＤＨＩ（ｐｓ
ＯＤ２）株を得た。この菌株より常法に従ってプラスミ
ドｐｓＯＤ２を単離した。

参考例２　ヒトＣｕ、Ｚｎ−８ＯＤ産生用組換えＤＮＡ
の作製：コリシン上１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒ）
Ｃｕ、Ｚｎ　　ＳＯＤ構造遺伝子を連結して、ヒトＣｕ
、Ｚｎ　　５ｏｌ）を産生させるためのプラスミドは、
第３図に示すストラテジーに従って作製した。

（１）　フリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子断片
を組込んだプラスミドｐＡＯＫ１の作製：コリシンＥＩ
ＤＮＡをＩ−）ｒａｌで切断し、ついで、Ｓ　ｔｕ　Ｉ
で切断した後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
で３４０ｂｐの５ｔｕＩ−Ｄｒａｌ断片を得た。この断
片をプラスミドｐＢＲ３２２のＤｒａ■サイトに挿入し
、プラスミドｐＡＯＫ１を作製した。

（２）　ヒトＣｕ、Ｚｎ−３ＯＤ構造遺伝子断片の作製
ニプラスミドｐｓＯＤ２をＡＩｕＩで切断し、ついでＴａ
ｑｌで切断した後、５％ポリアクリルアミドデル電気泳
動法で４４０ｂｐ断片を得た。

（３）合成りＮＡの作製：コリシン上１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒ）
Ｃｕ、Ｚｎ　　ＳＯＤ構造遺伝子を連結するために、コ
リシンＥｌ　　３４０ｂ、断片およびｓ。

Ｄ構造遺伝子の４４０　ｂｐｌＩＩＩ片で欠失している
部分８４ｂｐを第４図に示すように１２個のオリゴペプ
チドに分割して合成した。

（４）　ヒトＣｕ、Ｚｎ　　ＳＯＤ産生産生用比ＤＮＡ
の作ｇＪ＝プラスミドｐＡＯＫ１のＤ　ｒａ　Ｉサイトに、８４ｂ
ｐノｆｔＤ　Ｎ　Ａ　ト、４４０ｂｐのＳＯＤ構造遺伝
子断片を挿入し、コリシン上１遺伝子の形質発現調節遺
伝子の下流に、ヒトＣｕ、Ｚｎ　−Ｓ　ＯＤｖｔ造遺伝
子が連結したヒ）　Ｃｕ、Ｚｎ　−Ｓ　ＯＤ産生用組換
えＤＮＡｐＵＢＥ２を得た。

参考例３　ヒ）　Ｃｕ、Ｚｎ　−Ｓ　ＯＤを産生する組
換え大腸菌５４５πＨＲ（ｐＵＢＥ２）株の作製：ＳＯＢ培地でＯＤ　５５ｏ＝　０　、　５５まで培養し
た大腸＠５４５　ｆｆＨＲ株ヲＴｆｂＩ　ライｔ’Ｔｆ
ｂＴｌ　ｔ’処理したのち、処理液にプラスミドｐｕ　
Ｂ　Ｅ　２を加え、０℃で３０分間、ついで４２°Ｃで
９０秒間熱処理して、プラスミドｐＵ　Ｂ　Ｅ　２を保
持する大腸菌５４５πＨＲ（ｐＵＢＥ２）株を得た。

参考例４　ヒトＣｕ、Ｚｎ−３ＯＤと実質上同一のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドの製造：カザミノ酸３００ｇ、グルコース４００ｇ、テトラサイ
クリン１　ｇ、　Ｎａ２ＨＰＯ４６００ｇ、　ＫＨ２Ｐ
Ｏ４３００ｇ％ＮａＣｌ３０ｇ、　ＮＨ，Ｃ１１００ｇ
、　ＣｕＣｌ２・２Ｈ３００，５ｇ、Ｚｎ５Ｏ，・７Ｈ
２００，９ｇを含む培地１００１に大腸菌５４５πＨＲ
（ｐＵＢＥ２）を接種し、クレット１１６まで３７℃で
攪拌（２０００ｒｐｍ）培養後、培養液にＮａ２ＨＰＯ
４６００ｇ。

ＫＨ２ＰＯ＜３００ｇ、ＮａＣｌ３０ｇ５ＮＨ＜ＣＩｌ
　ＯＯｇを含む水２１．グルコース４５０ｇを含む水１
！とマイトマイシンＣ２００ｍｇを含む水５００ｍ１を
加えて誘発合成を３７℃、２時間行わせた。

シャープレス型遠心分離機での遠心（２００Ｏｒｐｍ。

３時間）により３４４ｇの温菌体を得た。

集菌した菌体を３２の１０１０１１Ｉリエタノールアミ
ン緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁して、グイノミルで破砕
した。破砕液を遠心（９０００ｒｐｍｙ６０分）し、得
られた粗抽出液の全量を３．５１とした。粗抽出液に１
Ｍ塩化第２銅水溶液０．３５ｍ１を加え、−晩攪拌した
のち６０°Ｃで５分間加熱処理した。生じた沈殿を９０
００ｒｐｍ、２０分の遠心により除去した。上清から硫
安沈殿によって７０〜９５％飽和画分を回収し、透析後
イオン交換セルロースＤＥ５２カラムクロマトグラフイ
ーにかけて、２０＋ｎＭ　　ＮａＣｌ２１ｉ度（１０ｍ
Ｍ）リエタノールアミン緩衝液）で溶出しＳＯＤ活性画
分を得た。この両分から１００％飽和硫安で分離した硫
安沈殿を遠心（１，５０００ｒｐｍ、　　１０分）で得
、透析後、凍結乾燥してヒ）　Ｃｕ、Ｚｎ　−Ｓ　ＯＤ
と実質上同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得
た（９９０ｍｇ）。

実施例１（腸管保存試験）モルモットを撲殺し、放血させたのち、回腸を摘出し、
マグヌス試験装置を用いて腸管収縮能を測定した（コン
トロール値）その後、生理食塩液５０ｍＡを入れたシャーレ（コント
ロール群）と本物質１０ｍｇを生理食塩液５０ＩＩｌｌ
の入ったシャーレ（本物質投与群）にそれぞれ収縮能測
定後の腸管を入れ、室温で２時間保存した。

保存後、再び腸管の収縮能を測定した結果、コントロー
ル群では２時間の保存により、収縮能の低下率は９２．
４％であったのに対し、投与群では２９．７％の低下率
しか示さなかった（第１表参照）。

第１表実施例２（ウサギの腎虚血に対する効果）体重２．３〜
３．６ｋｇのニューシーラント白ウサギ（雄）をコント
ロール群１０例、ヒ）Ｃｕ、Ｚｎ−８ＯＤ投与群１０例
用いた。

ウサギをベンドパルビタールＮａの静脈内投与により麻
酔し、正中切開により開腹した。右および左腎臓を周囲
組織から遊離したのち、ヘパリンＮａ１ＯＯＵ／ｋｇを
静脈内投与した。次いで生理食塩液で１％に溶解したヒ
）　Ｃｕ、Ｚｎ　−Ｓ　ＯＤ溶液を５Ｂ／ｋｇ静脈内投
与したのち、左腎臓、静脈、尿管を遮断し１時間放置し
た。遮断解除（血流再開）２分前に再びヒトＣｕ、Ｚｎ
−３ＯＤを５Ｂ／ｋｇ静脈内投与し、その後、経日的に
血液を採取し血清クレアチニン値を測定した。

その結果、クレアチニンの上昇はコントロール群に比較
し、ヒ）　Ｃｕ、Ｚｎ　−Ｓ　ＯＤ投与群では有意に低
いことが認められた（第２表および第５図参照）。

なお、第２表の値（平均信士標準偏差）および第５図の
縦軸の値は血清中のクレアチニンの濃度（■／ｄｒｔ　
）である。また第５図の黒丸はｌｌ−８ＯＤ投与群（ｎ
＝１０）であり、白丸はコントロール群（ｎ＝１０）で
ある。

実施例３（マウスにおける急性毒性試験）ｄｄＹ系雄マ
ウス（体重３２±２ｇ）１群８匹を用いて、本物質を生
理食塩液に溶解し、静脈内（ｉ。

ｖ、　）投与した。投与量は３０　ｍｇ／　ｋｇ、　　
１００　Ｂ／ｋｇ、３００　Ｂ／　ｋＨの３群である。

投与後２週間中毒症状について観察したが、各群ともに
異常なく生存した。屠殺後の解剖所見においても、生理
食塩液のみを投与したコントロール群と何ら変わるとこ
ろがなかった。従って、マウスにおける本物質の静脈内
投与におけるＬＤ５ｏ値は３００　Ｂ／　ｋｇ以上であ
る（第３表参照）。

第３表

【図面の簡単な説明】

第１図はコリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子領域
の塩基配列を示したものである。ＰＢはＲＮＡポリメラ
ーゼの結合部位、Ｒ８はＲＮＡポリメラーゼの認ａ部位
である。太い矢印は転写の開始点と転写方向を示してい
る。破線による下線部はリポソーム結合部位を示し、Ｍ
ｅｔが翻訳開始コドンの位置を示している。２カ所存在
する実線下線部は正の制御に関与する領域である。また
制限酵素ＤｒａＩの切断位置を示した。第２図は胎盤のｍＲＮＡから得られたヒ）Ｃｕ。Ｚｎ−８ＯＤ　　ｃＤＮＡの構造遺伝子領域の塩基配列
と、塩基配列から決定されるアミノ酸配列を示した。２
カ所の下線部はコロニーノへイブリダイゼーションに用
いた２種類の合成りＮＡが／）イブリグイズする領域で
ある。第３図は組換えＤＮＡ　　ｐＵＢＥ２が作ｇｌされるま
での経過の概略を図示したものである。第４図は合成りＮＡ断片の塩基配列と、化学合成したオ
リゴヌクレオチドの塩基配列を示したものであり、オリ
ゴヌクレオチドを結合しで得られる今成りＮＡ断片は、
５′端はＤｒａＩ断端、３′端はＴａｑＩ切断端となっ
ている。木部は第２図の塩基配列を変更した個所で２カ
所存在して（する。但しアミノ酸配列は変わっていない。第５図は本発明のポリペプチドの臓器機能改善活性を示
す図である。第３図Ｌｌ　　　　ｌＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　の手続補正書昭和６２年３月２４日

Claims

【特許請求の範囲】１、ヒトスーパーオキシドディスムターゼと実質的に同
一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを活性成分とす
る臓器機能改善剤。２、上記ポリペプチドが単細胞微生物中で産生されたも
のである特許請求の範囲第１項に記載の臓器機能改善剤
。３、上記単細胞微生物がポジテイブレギユレーシヨンサ
イトを有する形質発現調節遺伝子の下流にヒト銅、亜鉛
型スーパーオキシドデイスムターゼ構造遺伝子を有する
組換えＤＮＡで形質転換されたものである特許請求の範
囲第２項に記載の臓器機能改善剤。４、対象とする臓器が腸管、腎臓又は心臓である特許請
求の範囲第１項に記載の臓器機能改善剤。