JPS62215532A

JPS62215532A - 抗炎症剤

Info

Publication number: JPS62215532A
Application number: JP61058417A
Authority: JP
Inventors: Norio Otsu; 紀夫大津; Ichiro Nakakoshi; 中越　一郎; Hiroko Honda; 本田　浩子
Original assignee: Ube Industries Ltd
Current assignee: Ube Corp
Priority date: 1986-03-18
Filing date: 1986-03-18
Publication date: 1987-09-22

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉本発明は抗炎症剤に関する。ざらに詳しくは、単細胞微
生物特にヒト銅、亜鉛型スーパーオキシドディスムター
ゼ構造遺伝子を有する組換えＤＮＡで形質転換された単
細胞微生物中で産生されたヒトスーパーオキシドディス
ムターゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを活性成分とする抗炎症剤に関する。

〈従来技術〉スーパーオキシドディスムターゼ（以下ＳＯＤと略す）
は、次式に示す不均化反応により、スーパーオキシド（
・０２−）を消失させる醇素である。

・Ｏｔ　　−＋　・０２−＋２Ｈ＋→Ｏ！　　＋　Ｈ２
０ｔスーパーオキシドは、生体における酸１ｇ島性の中
で最も毒性の高い分子種で、炎症、未熟児ｌＩ！素網膜
症、放射線障害、ガンなどの疾病を急ぎ起こすと言われ
てる。

マツコード（Ｍｃ　Ｃｏｒｄ　）はウシの赤血球から精
製したＳＯＤに抗炎症作用のあることを見い出して報告
している［サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ＞　　１８５
５２９−５３１．１９７４年参照〕。

また、特開昭５８−１６６８５号公報には、セラチア属
菌が産生するマンガン型スーパーオキシドディスムター
ゼを含有する抗炎症剤が開示されている。しかしながら
、これらのＳＯＤは人体にとって異種タンパクであり、
免疫上の問題をひき起こす危険性を否定できない。

とｌ−８ＯＤを製造する方法として、ヒト細胞や１１［
１１＆から得る方法が知られている。

特開昭５７−１４１，２８８号公報には、ヒト細胞スー
パーオキシドディスムターゼの特異抗体結合担体を用い
て、ヒト細胞からスーパーオキシドディスムターゼを該
担体に結合させて単離する方法が開示されている。

特開昭５７−１５５．９９１号公報には、ヒト・胎盤の
水抽出液から４０〜５０％飽和硫安沈澱画分を除去した
後の７０〜８０％飽和硫安上清から、硫安分画、陰イオ
ンクＯマドグラフィー、ゲルろ過等によってスーパーオ
キシドディスムターゼを取得する方法が開示されている
。

また、特開ＩＩ！５９−９１，８８１号公報ニハ、不純
な銅、亜鉛スーパーオキシドディスムターゼを含有する
溶液を、非極性ハイポーラスポリマー系樹脂と接触させ
、次いで該樹脂を洗浄し、さらに該樹脂に吸着した銅、
亜鉛スーパーオキシドディスムターゼを溶出して精製す
る方法が開示されている。

〈発明が解決しようとする問題点〉しかしながら、前記した方法は原料を多聞に入手するこ
とが困難であるし、また比較的入手し易い原料であると
ヒト胎盤ではＳＯＤ含有綴が低いなどの欠点があり、工
業生産に適したものとは言伝予相換え法によるヒトＳＯ
Ｄの製造法を提案した。

残された問題は、かくして製造されたヒトＳＯＤが実際
に′ｖＩ素活性および薬理活性を持つか否かを明らかに
することであった。

それ故、本発明の目的は、上記残された問題を明らかに
することにある。

本発明の他の目的は、ヒト・スーパーオキシドディスム
ターゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドを含有する抗炎症剤を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、遺伝子組換え技術によって
製造した上記構造を持つポリペプチドを含有する抗炎症
剤を提供することにある。

本発明のさらに他の目的および利点は以下の説明から明
らかとなろう。

く問題点を解決するための手段及び作用〉本発明によれ
ば、本発明の上記目的及び利点は、ヒトスーパーオキシ
ドディスムターゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有す
るポリペプチドを活性成分とする抗炎症剤によって達成
される。

本発明の抗炎症剤の活性成分である上記ポリペプチドは
、例えばポジティブレギュレーションサイトを有する形
質発現調節遺伝子の下流にヒト銅、亜鉛型スーパーオキ
シドディスムターゼ構造遺伝子を有する組換えＤＮＡで
形質転換された微生物を培養し、培養物中に蓄積された
ヒト銅、亜鉛型スーパーオキシドディスムターゼ（以下
ヒトＣ０。

’；１ｎ−３ＯＤという）を採取することによって製造
される。

上記ヒトＣｕ　、Ｚｎ−８ＯＤ（７）ＣＤＮＡ合成の鋳
型として用いられるｌｌＲＮＡは正常なヒト組織〈肝臓
、胎盤、腎臓など）から分離される。組織からのＲＮＡ
の分離は、フェノール−クロロホルム法、グアニジウム
−熱フェノール法、グアニジニウム−塩化セシウム法な
どの公知の方法（Ｍ　ａｎｉａｔｉｓ、　　Ｔ　、ら、
Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃ１ｏｎｉｎ０゜１８７−１
９８．１９８２．Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　）が利用できる。次いでオ
リゴ（ｄＴ）セルロース、ポリ（ｔＪ）セファロースな
どを用いてポリ（Ａ）ティルをもったｍＲＮＡを分離す
る。

このようにして得られたｍＲＮ　Ａは、ヒトＣＬＩ　。

Ｚｎ−８ＯＤのｍＲＮ　Ａを含んｒイ６１１１ＲＮ／ｌ
１台物であるが、これをそのままｃＤ　Ｎ　Ａ合成に用
いる。まず、逆転写酵素を用いｍＲＮＡを鋳型として一
本鎖ｃＤＮＡを合成し、次いで逆転写酵素またはＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した後、適
当なベクターに組込まれた形でｃＤ　Ｎ　Ａを得る。こ
れにはｄＧ−ｄＣまたはｄＡ−ｄＴホモポリマー結合法
（Ｎ　ｅｌｓｏｎ、　　Ｔ　。

Ｓ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ　ｎｚｙｌｏｌｏｑｙ
、　　６８　、４１　。

１９７９　、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　　Ｉ　
ｎｃ、　）やＱ　ｋａｙ−ａｍ−Ｂｅｒｇ法（Ｏｋａｙ
ａｍａ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｂｅｒａ、　　Ｐ、。

Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、　　Ｂｉｏｌ、、２，１６１．１９
８２＞が利用できる。

この場合のようにｍＲＮ　Ａ混合物中の目的＋１１ＲＮ
Ａ含聞が低い場合は、効率の高いＯｋａｙａｍａ−Ｂｅ
ｒｇ法が好ましい。この方法に必要なりＮＡおよび宿主
菌はファルマシアＰ、ｔ、バイオケミカルズ社カタログ
Ｎｏ、２７−４７５０−０１とじて入手できる。

このようにして得られる組換えＤＮＡをたとえばエシェ
リヒア・コリ（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　
）　Ｘ１７７６株あるいはＤＨ１株（Ｌ　ｏｗ、　Ｂ　
、、　Ｐ　ｒｏｃ。

Ｎ　ａｔｌ、　　Ａ　ｃａｄ、　　Ｓ　ｃｉ、、　　旦
］と、１６０．１９６８　：Ｍｅｓｅｌｓｏｎ、　　Ｍ
、　ａｎｄ　Ｙｕａｎ、　　Ｒ，、Ｎａｔｕ−ｒｅ、　
２１７．１１１０．１９６８　：Ｈａｎａｈａｎ。

Ｄ、、　　Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、　　１６６．５５７
．１９８３）に導入して形質転換させる。形質転換法は
公知の方法（重定勝哉、細胞工学、ＶＯＩ、　２゜Ｎｏ
、３．６１６．１９８３）またはそれに準する方法で行
うことができる。アンピシリン耐性などの薬剤耐性によ
りまず形質転換体を選別したのち、ヒトＣｕ　、Ｚｎ　
−８ＯＤ遺伝子に対応すると考えられる塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドを化学合成しこれを３１ｐで標識
してプローブとして用い、公知のコロニーハイブリダイ
セーション法（Ｈａｎａｈａｎ、　Ｄ　、ら、Ｍｅｔｈ
ＯｄＳ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏａｙ。

１００．３３３．１９８３＞によりポジティブなシグナ
ルを示した形質転換体を選択する。これらの形質転換体
より常法に従ってプラスミドＤＮＡを単離し、ＣＤ　Ｎ
　Ａ部分の塩基配列をＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法（
Ｍａｘａｍ、　Ａ、　Ｍ、　ａｎｄ　（３ｉｌｂｅｒｔ
。

Ｗ、、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　　ｓ
ｃｉ、、　　７４゜５６０．１９７７）またはジデオキ
シ法（Ｍｅｓ−ｓｉｎｏ、Ｊ、ら、Ｎ　ｕｃｌｅｉｃ　
　Ａ　ｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ、、　　９　。

３０９．１９８１＞によって決定し、ヒトＣＬＩ。

Ｚｎ　−８ＯＤ　ｃＤＮＡの存在に確認する。確認には
、ヒト赤血球より単離されたｃｕ、　　ｚｎ−ｓ。

Ｄのアミノ酸配列（Ｊａｂｕｓｃｈ、　Ｊ、　Ｒ，、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９．２３１０．１９８０）
またはダウン症候群患者に由来する樹立細胞株より分離
されたｍＲＮ　Ａから得られたｃＤ　Ｎ　Ａの塩基配列
（Ｓ　ｈｅｒｍａｎ、　Ｌ　、ら、Ｐ　ｒｏｃ、　　Ｎ
　ａｔｌ、　　Ａ　ｃａｄ。

３ｃｉ、、　　ｓｏ、５４６５．１９８３）を参考にす
ることかできる。

次に、得られたヒトＣｕ　、Ｚｎ−８ＯＤのｃｍＮＡ＠
適当な形質発現調節遺伝子の下流に連結する。これには
トリプトファンオペロンプロモーター（ｔｒｐプロモー
ター）、ラクトースオペロンプロモーター（ｌａｃプロ
モーター）、λファージのＰＬ　プロモーター、ｔａＣ
プロモーターなどの公知のプロモーターが利用できる。

しかし、ここで注目すべきことは、生体内には０２−を
必要とする酵素の存在が知られており（大柳房彦、スー
パーオキサイドと医学、５８゜１９８１、共立出版）、
従って、０２−を消去する作用を持つＳＯＤを過剰生産
させることにより宿主菌の生理障害をひき起す可能性が
充分に考えられることである。これを避けるためには、
遺伝子の発現を抑制した状態で細胞を成育させたのち、
適当な条件下にこの抑制を解除さ往て遺伝子を発現させ
ＳＯＤを多量に産生させることが好ましい。

エシェリヒア・コリから分離されたプラスミドＣｏｔ　
　ＥＩ上に存在するコリシンＥ１３１１伝子はコリシン
Ｅ１タンパクの産生を支配している遺伝子であり、通常
の状態においてはりブレツリ・−タンバクがオペレータ
ーに結合することにより遺伝子の発現は抑制されている
が、ＤＮＡに損傷を与えるような処理、たとえば紫外線
照射、マイトマイシンＣ処理、ナリジキシン酸処理など
によりこの抑制が解除されて続発が起り、コリシンＥ１
タンパクが多量につくられる。これはいわゆる負の抑制
と呼ばれる調節機構である。これに加えて、コリシン上
１遺伝子には正の制御も存在しており（Ｊ　恒明う、生
化学、Ｖｏｌ、５６．ＮＯ，８，１０８２，１９８４＞
、ユニークな形質発１ｉ！１ｌｊＩｆｉ機構を持つ遺伝
子であって、誘発時には正の制御の効果も加わってきわ
めて多量のコリシンＥ１タンパクが産生される。ざらに
コリシンＥ１タンパクはエシェリヒア・コリに対する抗
菌性を機能とするタンパクであって、通常時の細胞の成
育には必要ないタンパクと見なし得るものであり、その
性質上、通常時のコリシン上１遺伝子の発現が厳密に抑
制されていることからも、コリシン上１遺伝子の形質発
現調節遺伝子の利用は本発明にとってきわめて有利であ
る。

Ｃｏｌ　　ＥＩＤＮＡはたとえばファルマシアＰ。

し、バイオケミカルズ社のカタログＮｏ、２７−４９１
４−０１として入手することが可能である。

また、正の制御に関与する領域、ブロモ−ター・オペレ
ーター領域、リポソーム結合領域からなるコリシン上１
遺伝子の形質発現調節遺伝子の塩基配列は既に報告され
ている（Ｅｂｉｎａ、　ｙ、ら、Ｇｅｎｅ、　　１５，
１１９．１９８１＞、なお、本発明におけるコリシン上
１遺伝子の形質発現調節遺伝子とは、第１図の−１４０
から７８番目までの塩基配列の存在を必須とするもので
ある。

コリシン上１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒト
Ｃ０、Ｚｎ　−８ＯＤ　ｃＤＮＡを連結する際に、いわ
ゆる融合タンパクを産生ずるような形での連結は、適当
な制限酵素の切断部位を利用することにより比較的容易
に行うことができる。しかし、コリシンＥ１タンパクに
由来する部分がある程度以上の長さを持っている場合、
この融合タンパクを人体に投与した際に免疫原性（抗原
性）を発揮する危険性が充分に考えられる。従って、コ
リシン上１遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ＞の直後に
ヒトＣＬＩ　、Ｚｎ　−８ＯＤのＮ末端アミノ酸コドン
が連結される形が好ましい。しかし、これを満足させて
くれるような適当な制限酵素の切断部位はどちらの遺伝
子にも存在していない。そこで、制限ａｍを用いて両方
のＤＮＡ断片を必要部分が欠失した形で切り出し、欠失
した部分は合成りＮＡ断片により補間することができる
。

合成りＮＡ断片は、たとえば同相トリエステル法（Ｍ　
１ｙｏｓｈｉ、　Ｋ　、ら、Ｎ　ＬＩＣ＋、　　Ａ　ｃ
ｉｄｓ　　Ｒｅａ、。

８．５５０７．１９８０）によりオリゴヌクレオチドを
化学合成し、これらをたとえばＴ４ＤＮＡリガーゼでつ
なぎ合せることにより得られる。合成りＮＡ断片は、も
との塩基配列を再現するものである必要は必ずしもない
。アミノ酸コドンには縮重が存在し、かつ生物の種によ
ってコドンの使用ＭＩＩが異なることは良く知られてい
る。従って、アミノ酸の配列を変えない限りにおいては
、合成りＮＡ断片の作ＩＪＪ時にどのようなコドンを選
んでも自由であるが、宿主菌中で使用頻度の高いコドン
を選択すると、遺伝子の発現量の増大が期待できる。コ
リシン上１遺伝子の形質発現調節遺伝子領域に関しては
、もとの塩基配列を再現する方が好ましいが、結果とし
て遺伝子の発現量の増加につながるような塩基配列の変
更は採用できる。

自ｔｌＷ１！Ｆｊできるベクターに、コリシン上１遺伝
子の形質発現調節遺伝子を含むＤＮＡ断片、合成りＮＡ
断片、ヒトＣｕ　、Ｚｎ　−８ＯＤＩＩＩ造遺伝子断片
を正しく組込むことにより目的の組換えＤＮＡが得られ
る。これらのＤＮＡ断片は、たとえばＴ４ＤＮＡリガー
ゼにより連結することができ、最終的に得られる組換え
ＤＮＡの構造が目的とするものである限り、ＤＮＡ断片
の連結順序には制限はない。使用するベクターは宿主微
生物内で複製可能なものであれば特に制限はなく、宿主
がエシェリヒア・コリの場合はｐＢ　Ｒ３２２が良く用
いられている。

得られた組換えＤＮＡをベクターの宿主微生物に導入し
形質転換させる。本発明では宿主微生物としてエシェリ
ヒア・コリを使用しているが、形質発現調節遺伝子、特
にコリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子が機能する
限りにおいては、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、サツカロミセス・セレビ
シェ（３ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ　）等の他の微生物も使用できる。エシェリヒア・
コリの場合はＷ３１１０株、２０ＳＯ株Ｃ６００Ｓ株な
どの名前があげられる。特にＷ３１１０株が好ましい。

Ｗ３１１０株はエシェリヒア・コリに１２株の野性株（
λ＋、Ｆ＋）から誘導されたλ−９Ｆ−株であり、栄養
要求性などその他の点では野性株と同一である（　３　
ａｃｔｖａｎｎ。

Ｂ、　Ｊ、　、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　
Ｒｅｖｉｅｗｓ、　３６゜５２５．１９７２）。

テトラサイクリン耐性などによりまず形質転換体を選択
したのち、常法に従いプラスミドＤＮＡを分離し、制限
ｉ９素地図の解析により第２次のスクリーニングを行う
。さらに誘発時のヒトＣｕ。

Ｚｎ　−８ＯＤの産生能によって目的の形質転換体を選
択する。

ＳＯＤ活性の測定法としては、チトクロームＣ−キリン
チン−キサンチンオキシダーゼを用いる方法（Ｍｃ　Ｃ
ｏｒｄ、　　Ｊ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｈ
。

！、、　　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、、２４４．６
０４９゜１９６９）、ニトロブルーテトラゾリウム＜Ｎ
８丁）−リボフラビンを用いる方法（Ｂ　ｅａｕｃｈａ
ｍｐ。

Ｃ，ａｎｄ　）”ｒｉｄｏｖｉｃｈ、　　■、、　　Ａ
ｎａｌ、　　３ｉｏｃｈｅａ＋、。

４４．２７６．１９７１）等が利用できる。ＮＢＴ−リ
ボフラビン法は簡便であり、電気泳動後のタンパクの活
性染色にも利用できるため便利である。エシェリヒア・
コリの場合について言うと、組換えＤＮＡから産生され
るヒトＣｕ　、　Ｚｎ　−８ＯＤに加えて、宿主染色体
から産生される１ｙｌｎ　−８ＯＤおよびＦｅ−８ＯＤ
が混在している。これらのＳＯＤの酵素としての作用は
同一であるが、Ｃｕ　、　Ｚｎ−８ＯＤは１〜２１１１
ＭのＯＮ−イオンによって活性が阻害されるのに対し、
Ｍｎ　−８゜Ｄ、Ｆｅ　−８ＯＤは同条件下での阻害を
受けないことから区別できる。また、これら３種のＳＯ
Ｄは分子量や等電点が互いに異なるため、電気泳動、イ
オン交換またはゲル口過カラムクロマトグラフィーによ
り分離することができる。

このようにして得られた、形質発現調節遺伝子持にはコ
リシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒトＱ
ｕ　、　ｚｎ　−８ＯＤ構造遺伝子を有する組換えＤＮ
Ａで形質転換された微生物を、その宿主微生物の増殖に
適した条件下で所定の時間培養し、その後に誘発合成を
行わせてヒトＣｕ。

Ｚｎ−８ＯＤを大量に産生させる。エシェリヒア・コリ
の場合、たとえばＬ培地、グルコースおよびカザミノ酸
を含むＭ９培地などの公知の培地により培養を行う。培
養は通常１５〜４３℃の温度で２〜２４時間行う。必要
により通気、攪拌を加えることができる。対数増殖期に
ある培養物にマイ１−マイシンＣ１ナリジキシン酸など
の桑剤を添加したり、紫外線を照射することにより誘発
合成を行わせることができる。

培養後、公知の方法で菌体を集め破砕したのち、通常知
られているタンパクの精製法に従ってヒトＣｕ　、Ｚｎ
　−８ＯＤ活性を持つタンパクを単離することによりヒ
トＣｕ　、　ｚｎ　−８ＯＤが製造できる。精製は、た
とえば熱処理、塩析、濃縮、透析、イオン交換クロ、マ
ドグラフィー、ゲル口過クロマトグラフィー、クロマト
フオーカシング、電気泳動、高速液体クロマトグラフィ
ー、アフイニテイクロマトグラフイーなどの操作を適宜
組合せて行うことができる。

かくして製造されたヒトスーパーオキシドディスムター
ゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド
は下記実施例に詳述するとおり極めて帰れた抗炎症活性
を示す。

本発明のポリペプチドは、通常の方法に従って注射剤、
錠剤、軟膏剤、カプセル剤、リポソーム製剤などの製剤
とすることができる。

本発明のポリペプチドは、抗炎症活性成分として、１日
０．０１７〜０．１７ｍｇ／ｋａ一体重の投与量を１回
〜数回に分けて、急性あるいは亜急性の炎症患者に、炎
症の治療を目的として、経口的または非経口的に投与し
得る。

以五に実施例および参考例を示す。

参考例１　ヒトＣｕ　、Ｚｎ−８ＯＤのＣｏ　Ｎ　Ａを
組込んだプラスミドｐｓＯＤ２の作製：正常分娩によっ
て得られたヒト胎盤からグアニジウム−塩化セシウム法
によってＲＮＡを分離し、ついでオリゴ（ｄＴ＞セルロ
ースを用いてポリ（Ａ）テイルをもったｍＲＮＡを分離
した。

得られたｍＲＮＡより、岡山−バーブ法に従って、ｃＤ
　Ｎ　Ａライブラリーを作成した。宿主菌として大腸菌
Ｃ８１株を用いた。

コロニーハイブリダイゼーシミン法にて、ヒトＣｕ　、
Ｚｎ−８００（７）ＣＤＮＡが組込＊しｆ＝７５スミド
ｐｓＯＤ２を保持した大腸菌ＤＨ１（ｐｓＯＤ２）株を
得た。この菌株より常法に従ってプラスミドｐｓＯＤ２
を単離した。

参考例２　ヒトＣｕ　、Ｚｎ　−３ＯＤ産生用Ｉｇ換え
ＤＮＡの作製：コリシン上１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒト
ｃｕ　、ｚｎ　−５ｏｏ構造遺伝子を連結して、ヒトｃ
ｕ　、ｚｎ　−５ｏＤを産生させるためのプラスミドは
、第３図に示すストラテジーに従って作製した。

（１）コリシン上１遺伝子の形質発現調節遺伝子断片を
組込んだプラスミドｐＡＯＫ１の作製：コリシンＥＩ　
ＤＮＡをＤｒａ工で切断し、ついで、Ｓｔｕ工で切断し
た後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で３４０
　ｂｐのＳ　ｔｕＩ　−Ｄ　ｒａＩ断片を得た。この断
片をプラスミドｐＢＲ３２２のＱｒａＩサイトに挿入し
、プラスミドＩ）ＡＯＫｌを作製した。

（２）ヒトＣｕ　、Ｚｎ　−８ＯＤ構造遺伝子断片の作
製ニプラスミドｐｓＯＤ２をＡｌｕＩで切断し、ついでＴａ
ｑＩで切断した後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法で４４０ｂｐ断片を（Ｕだ。

（３）合成りＮＡの作製：コリシン上１遺伝子の形質発現ａ節遺伝子の下流にヒト
Ｃ１、ｌｎ　−８ＯＤ構造遺伝子を連結するために、コ
リシンＥ１３４０ｂｌ）断片およびＳＯＤ構造遺伝子の
４４０ｂＤ断片で欠失している部分８４ｂｐを第４図に
示すように１２個のオリゴペプチドに分割して合成した
。

（４）ヒトＣｕ　、Ｚｎ　−８ＯＤ産生用組換えＤＮＡ
の作製ニプラスミドＩ）ＡＯＫｌのＤｒａＩサイトに、８４ｈｐ
（？）合成りＮＡと４４０ｂｐ（７）ＳＯＤ構造遺伝子
断片を挿入し、コリシン上１遺伝子の形質発現ｉｌ！１
節遺伝子の下流に、ヒトＣｕ　、Ｚｎ　−８ＯＤ構造遺
伝子が連続したヒトＣｕ　、Ｚｎ　−８００産生用組換
えＤＮＡｐＬＪＢＥ２を得た。

参考例３　ヒトｃｕ　、ｚｎ　−５ｏｏを産生する組換
え大腸菌５４５πＨＲ（１）ＵＢＥ２）株の作製：ＳＯ８培地で００ｓ　ｓ　ｏ　＝０．５５まで培養した
大１１ｊｌ！６５４５πＨＲ株をＴｒｉ）ＩついでＴｆ
ｂｌＩで処理したのち、処理液にプラスミドＤＬＪ　８
　Ｅ　２を加え、０℃で３０分間、ついで４２℃で９０
秒間熱処理して、プラスミドｐＬＩ　Ｂ　Ｅ　２を保持
する大ｍｌ１１１５４５πＨＲ（ＤＵＢＥ２＞株を得た
。

参考例４　ヒトＣ，ｕ　、Ｚｎ　−８ＯＤと実質上同一
のアミノ酸配列を有するポリペプチドの製造：カザミノ酸３０００．グルコース４００ｇ、テトラサイ
クリン１０　、Ｎａ　ｅ　ＨＰＯ４６０００、ＫＨｅ　
ＰＯ４３０００、Ｎａ　Ｃ１５０Ｑ　、ＮＨ４Ｃｌ　１
０００−　ＣＩ　Ｃ１ｉ　・２Ｈ２００，５（＋　。

Ｚｎ　８０４　・７Ｈ２００，９０を含む培地１００１
に大Ｍ菌５４５π１−ＩＲ（ｐＵＢＥ２）を接種し、ク
レット１１６まで３７℃で攪拌＜　２０００　ｒｐｍ、
　）培養後、培養液にＮａ　２　ＨＰＯ４ｅｏｏｏ　、
ＫＨ２ＰＯ４３００（１、Ｎａ　ｃ＋　５０（１、ＮＨ
４Ｃｌ１０００を含む水２１、グルコース４００ｇを含
む水１１とマイトマイシンＣ２００１１１１）を含む水
５００＋１１１を加えて誘発合成を３７℃、２時間行な
わせた。シャープレス型遠心分離機での遠心（２０００
０ｒｌ）Ｉ　、３時間）により３４４ｇの温薗体を得た
。

集菌した函体を３１の１０ｍＭトリエタノールアミンＭ
Ｗ液（ｐＨ７，０）に懸濁して、ダイノミルで破砕した
。破砕液を遠心（９０００ｒｐｇ＋、６０分）し、得ら
れた粗抽出液の全潰を３．５１とした。粗抽出液に１Ｍ
塩化第２銅水溶液０．３５ｍ１を加え、−晩攪拌したの
ち６０℃で５分間加熱処理した。生じた沈殿を９０００
ｒｐｍ　、２０分の遠心により除去した。上清から硫安
沈澱によって７０〜９５％飽和画分を回収し、透析後イ
オン交換セルロースＤＥ５２カラムクロマトグラフィー
にかけて、２０ｍＭＮａＣｌ１１度（１０１１１Ｍトリ
エタノールアミン緩衝液）で溶出しＳＯＤ活性画分を得
た。この画分から１００％飽和硫安で分離した硫安沈殿
を遠心（１５０００ｒｐｍ　、１０分）で得、透析後、
凍結乾燥してヒトＣｕ　、　７：ｎ−５ＯＯと実質上同
一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得た（９９０
８０）。

実施例　１カラゲニン浮腫抑制作用（局所投与）：鶴見（炎症動物
実験法、４２−８２．１９７５）の方法に従い、１群６
匹のラットの右後肢足踵部皮下に１％カラゲニン生食懸
濁液を０．１ｍ＋注射し、その１時間後に同様の部位に
、上記参考例４で得られたポリペプチド（以下単にＳＯ
Ｄという）の０．１％生食溶解液０．１１局所投与し、
経時的に足部容積を測定し、次式により抑制率を求めた
。

ｎ ■ｎおよびＶｔ；それぞれ起炎刺激処置前および処置後
の足部容積、ＥＣＥＣおよびＥｔ；対照群（ＳＯＤ投与せず）およびＳＯ
Ｄ投与投与法均浮腫率、結果を第５図に示した。第５図において縦軸は足部容積
（１）を示し、横軸は経過時間（時）を示す。白丸はコ
ントロール群（ｎ−６）であり、黒丸はＳＯＤ投与投与
法−６＞である。また、矢印Ａは１％カラゲニン生食懸
濁液を投与した時点であり、矢印Ｂは０．１％ＳＯＤ生
食溶解液を投与した時点である。

ＳＯＤ投与投与法浮腫抑制効果が認められ、抑制率は４
８．８％を示した。

：［２カラゲニン浮腫抑制作用（全身投与）：鶴見の方法に従
い、１群６匹のラットに０．１％ＳＯＤ生食溶解液２　
ｍＱ／　ｋｇを静脈内投与し、投与１５分後に右後肢足
踵部皮下に１％カラゲニン生食懸濁液を０．１１注射し
、経時的に足部容積を測定し、実施例１と同様に浮腫抑
制率を求めた。

結果を第６図に示した。第６図における矢印Ａ１Ｂおよ
び白丸、黒丸の意味は第５図と同じである。

その結果ＳＯＤの静脈内投与による浮腫抑制率は５０．
２％を示し、優れた抗炎症効果を示していることが判る
。

宜」ｌＬ−」− カラゲニン浮腫抑制作用（全身投与）　：鶴見の方法に
従い、１群６匹のラットの右後肢足踵部皮下に１％カラ
ゲニン生食懸濁液を０．１１注射し、その１時間後およ
び２時間後に０．１％ＳＯＤ生食溶解液２　ＩＱ／　ｋ
ｌｊを静脈内投与し、経時的に足部容積を測定し、実施
例１と同様に浮腫抑制率を求めた。

１４７図にその結果を示した。第７図における矢ＥＩＪ
Ａ、Ｂおよび白丸、黒丸の意味は第５図と岡じである。

その結果浮腫抑制率は７３．２％を示し、優れた抗炎症
効果を示していることが判る。

実施例　４血管透過性試験Ｗｈｉｔｔｌｅ　（Ｂ　ｒｉｔ、　　Ｊ　、　Ｐ　ｈａ
ｒｍａｃｏｌ、、　　２２　。

２４６−２５３．１９６４）の方法に従い、１群６匹の
マウスにＳＯＤ５Ｉｇ／ｋｇを静脈内投与し、投与２０
分後に０．５％エバンスブルー０．１１／１０ｇを静脈
内投与し、ざらに１％酢酸０．１１１１１／１０（Ｉｆ
を腹腔的投与した。その２５分後にマウスを頚椎脱臼に
より層殺し、蒸留水を５　ｍｌ／ｈｅａｄｌｌｌ腔内投
与したのち、腹腔自洗浄液を採取し全量１０１となるま
で蒸留水を加え、波長５９０ｎｍで吸光度を測定し、次
式により血管透過性抑制率を求めた。

ＣｐｃおよびＰｔ；対照群（ＳＯＤ投与せず）およびＳＯ
Ｄ投与群の平均吸光度その結果、ＳＯＤによる血管透過性抑制率は３７．５％
を示した。

実施例　５マウスにおける急性毒性試験：ｄｄＹ系雄マウス（体重３２±２ｇ）１群８匹を用いて
、ＳＯＤを生理食塩液に溶解し、静脈内（ｉ、ｖ、　）
投与した。投与層は３０　ｍ（Ｊ／　ｋＱ、１００１１
１１１／　ｋＱ、３００１Ｉｇ／ｋｇの３群である。投
与後２３ｉ！間中島症状について観察したが、各群とも
異常なく生存した。屠殺後の解剖所見においても、生理
食塩液のみを投与したコントロール群と伺ら変わるとこ
ろがなかった。従って、マウスにおける本物質の静脈内
投与のＬＤｓｏ値は３００ｍＭｋｇ以上である（第１表
参照）。

第１表　急性毒性試験

【図面の簡単な説明】

第１図はコリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子領域
の塩基配列を示したものである。ＰＢはＲＮＡポリメラ
ーゼの結合部位、Ｒ８はＲＮＡポリメラーゼの認識部位
である。太い矢印は転写の開始点と転写方向を示してい
る。破線による下線部はリポソーム結合部位を示し、ｒ
ｖｔｅｔが翻訳開始コドンの位置を示している。２カ所
存在する実線下線部は正の制皿に関与する領域である。また制限酸素ＤｒａＩの切断位置を示した。第２図は胎盤のｌｌｌＲＮＡから得られたヒトｃｕ。Ｚｎ　−８ＯＤ　ｃＤＮＡの構造遺伝子領域の塩基配列
と、塩基配列から決定されるアミノ酸配列を示した。２
カ所の下線部はコロニーハイブリダイゼーションに用い
た２種類の合成りＮＡがハイブリダイズする領域である
。第３図は組換えＤＮＡｐＵＢＥ２が作製されるまでの経
過の概略を図示したものである。第４図は合成りＮＡ断片の塩基配列と、化学合成したオ
リゴヌクレオチドの塩基配列を示したものであり、オリ
ゴヌクレオチドを結合して得られる合成りＮＡ断片は、
５一端は［）ｒａＪ断端、３一端はＴａｑＩ切断端とな
っている。＊印は第２図の塩基配列を変更した個所で２
カ所存在している。但しアミノ酸配列は変わっていない。第５図、第６図および第７図はいずれも本発明のポリペ
プチドの抗炎症活性を示す図である。第３図詮過Ｆｆｒ開　（ｇｖン第６図Ｃ，＋　　　　　２　　　　３　　　　４　　　　５＃
ｉ５時間　（晴）第７図升Ａ暗間（叶〕

Claims

【特許請求の範囲】１、ヒトスーパーオキシドディスムターゼと実質的に同
一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを活性成分とす
る抗炎症剤。２、上記ポリペプチドが単細胞微生物中で産出されたも
のである特許請求の範囲第１項に記載の抗炎症剤。３、上記単細胞微生物がポジティブレギュレーションサ
イトを有する形質発現調節遺伝子の下流にヒト銅、亜鉛
型スーパーオキシドディスムターゼ構造遺伝子を有する
組換えＤＮＡで形質転換されたものである特許請求の範
囲第２項に記載の抗炎症剤。