PT86332B - Processo para a preparacao de interferao gama de cavalo, de adn que codifica para este interferao e de anticorpos monoclonais contra o mesmo, como de agentes terapeuticos contendo estes produtos - Google Patents

Processo para a preparacao de interferao gama de cavalo, de adn que codifica para este interferao e de anticorpos monoclonais contra o mesmo, como de agentes terapeuticos contendo estes produtos Download PDF

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Description

MEMÓRIA DESCRITIVA
A presente invenção tem por objecto um processo para a preparação de interferão gama de cavalo (interferão gama equino, EqlFN-^f), de sequências de ADN que codificam pa ra este polipeptídeo, de vectores e de organismos hospedeiros que contêm estas sequências bem como o próprio EqIFN-)p. E ain da objecto da presente invenção um processo para a preparação stutU:.
de sequências parciais de ADU que codificam para polipeptídeos que se distiguem estruturalmente do polipeptídeo EqIFN-y natural. Descreve-se igualmente a utilização desta proteína.
Os interferões são proteínas que são segregadas por células eucarióticas depois de infecções por vírus ou de outros estímulos e que por sua vez possuem a capacidade de proteger as células de infecções por vírus. Actualmente são conhecidas três classes de interferões denominadas por inter ferão-OC, interferão-β e interferão-(abreviadamente IPH-Qt, IPlT-β e IEJST-lf)· Estes interferões diferem nas respectivas constituições e actividades. De facto os interferões tanto podem regular as células do sistema imunitário como influenciar a diferenciação das células e o crescimento de tumores.
F. wheelock descobriu em 1965 um polipeptídeo que protege determinadas células de infecções por vírus (Science 149, 310 (1965)). Os polipeptídeos com estas propriedades fo. ram denominados interferão imune, interferão tipo II, interferão-gama ou IFN-Y, se bem que se trate neste caso dum poli peptídeo pertencente à classe das linfoquinas* Além do inter ferão-^ humano são conhecidos até agora interferão-^ bovino, murino e da ratazana. Todos os interferões-^ conhecidos até agora encontram-se sob forma glicosilada, não exercendo a gli colização no entanto qualquer influência sobre a actividade biológica (Keller et al., J. Biol. Chem. 258, 8010 (1983)).
Durante muito tempo admitiu-se que os interferões eram específicos para uma determinada espécie. Mo entanto in vestigações in vitro demonstraram que preparados de IFN de bovino desencadeiam uma actividade antiviral em macacos e em humanos (Tovey, M.G. et al. J.Gen. Vir 1 36, 341-344 (1977)). Esta actividade interespecífica está possivelmente relaciona da com a maior ou menor homologia entre os genes ou entre as proteínas: em virtude das quantidades reduzidas dos interfeΛ»
rões animais não foi possível verificar esta hipótese.
Apesar da actividade interespecífica verificada observam-se durante a utilização de interferões de espécies estranhas actividades secundárias, tais como actividade de antigene, as quais não se podem tolerar para utilização tera pêutica.
Uma vez que, por outro lado, a manutenção de ani mais úteis e animais domésticos apresenta um significado eco nómico considerável, nota-se a necessidade de interferões pa ra diferentes espécies que possam ser usados em medicina veterinária.
A disponibilidade de interferões animais de alta pureza de diferentes espécies ofereceria para além disso a oportunidade de investigar o mecanismo da acção dos interferões de modo a servir de modelo de estudo que poderia ser utilizado para auxiliar o estudo da acção no Homem.
As primeiras investigações com interferões animais foram levadas a efeito com preparados obtidos a partir de material celular natural; o rendimento e a pureza dos interferões preparados de acordo com esses processos eram incompatíveis com a sua utilização para a preparação de medicamentos.
Por meio do desenvolvimento da técnica de ADN re combinante é possível levar microorganismos a produzir proteínas heterólogas. Deste modo foram, por exemplo, produzidos interferões humanos (Hu-IFN) e mais recentemente também dife rentes interferões não humanos.
Constitui um objectivo da presente invenção proporcionar um processo para a preparação de interferão-^ de ca valo por via de engenharia genética bem como das sequências de ADN necessárias para aquela preparação.
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Este objectivo foi conseguido, de acordo com a presente invenção, mediante a utilização da técnica conheci da como técnica das sondas. Como sonda foi usada uma sequên cia de ADN conhecida da literatura derivada do interferãohumano. (Gray e Goeddel; Nature 298, 859-863 (1982)).
No entanto são do mesmo modo apropriadas para son. das sequências parciais ou integrais dos outros interferõesComo material de partida para a investigação serviu um banco de ADN originário de tecidos normais de cavalo. Nesta investigação foi isolado pela primeira vez o gene que codifi ca para o EqlEN-y com os respectivos domínios adjacentes da fórmula I seguinte:
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TTATC TTTGGAAAATATAAATTTAAT TATGTGAG CATTTACTTGAGAGGT TC TGG GATGG 4277
AAAGTAGTTCAAATAGTTTAGCTTAGGAGAGAAAGGTTTGTTTGTGCGTCGTGCGTGAAG 4337
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Constitui um facto digno de menção a circunstância de que o EqIFN-Γ, bem como todos os interferões-# tornados conhecidos até agora, é codificado em cada organismo por um gene que apresenta sequências que interrompem o gene estru tural: o gene é constituído por exões e por intrões, sendo a proteína codificada apenas pelos exões. Os intrões apenas podem ser compreendidos por determinados sistemas, por exemplo por sistemas de células de mamíferos. Para outros sistemas, por exemplo em E. coli, não devem ser usadas as sequências de ΑΏΝ que contêm intrões.
Um objectivo adicional da presente invenção é, em consequência, a obtenção de sequências de. ADN isentas de intrões que codificam para EqlFN- .
Este objectivo pode ser alcançado de acordo com duas vias diferentes.
1. Fora do núcleo celular, no qual tem lugar a transcrição, os intrões são cortados no citoplasma e os fragmentos de ARN dos exões são reunidos, resultando o ARNm das proteínas eucarióticas. E possível copiar este ARNm convertendo -o em ADN por aoção duma enzima, a transcritase inversa, sendo o ADN obtido designado por ”ADN cópia” (ADNc).
1 5 10 15
TAT TAC TGC CAG GCC GCG TTT TTT AAA GAA ATA GAA AAC CTA AAG
20 25 30
GAA TAT TTT AAC GCA AGA AAC CCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG COT
35 40 45
CTT TTO CTG GAT ATC TTG AAG AAC TGG AAA GAG GAT AGT GAC AAA
50 55 60
AAA ATA ΑΤΓ CAG AGC CAA ATC GTC TCC TAC TTC AAA CTC TTT
65 70 75
GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAG AGC ATG GAC ACC
80 85 90
ATO AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC AGC AGC ACC AGC
95 100 105
AAG CTG GAA GAC TTC GAA AAG CTG ATT GAG ATT GGG GTA AAT GAT
110 115 120
CTG AAG GTC CAG CGC AAA GGA ATA AGT GAA GTC ATG AAA GTG ATG
125 130 135
AAT GAT CTG TGG CGG AAA GGT AAG CTG AGG AAG CGG AAG AGG AGT
140 145
GAG AAT CGA TTT CGA GGC GGG AGA GGG TTG GAA TAG
Fórmula II
Este ADN sem intrões pode ser em seguida inserido num plasmídeo adequado, o qual pode ser utilizado em seguida, em conjunto com um organismo hospedeiro, por exemplo E. coli, para a produção de proteínas eucarióticas, no caso presente de EqIPN-f. A ocorrência de degenerescência do código genético constitui uma desvantagem deste procedimento. Esta degenerescência conduz nomeadamente a que diferentes organismos utilizem para os mesmos ácidos aminados diferentes codões. No caso duma adaptação não óptima do ADN utilizado pode ocorrer uma pior expressão duma proteína eucariótica num sistema procarió tico.
2. A outra possibilidade de obtenção d.uma sequência de ADN i senta de intrões para um gene eucariótico consiste em sin tetizar por via de síntese química a sequência de ADN sem intrões desde que se conheça a sequência de ADN do crornos. soma.
Gonsidera-se como especialmente adequada para atingir o objectivo da presente invenção a sequência de ADN de acordo com a Fórmula III
-11 5 10 15
ATG TAG TAG TGG GAG GGT GGT TTG TTT AAA GAA ATC GAA AAG CTG AAA 20 25 30
GAA TAC TTG AAG GGT GGT AAG CGA GAC GTT GGT GAC GGT GGT GGG
35 40 45
CTG TTC CTG GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA
50 55 60
AAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTG
65 70 75
GAA AAC GTG AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT
80 85 90
ATG AAA GAA GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TGG ACT TCT
95 100 105
AAA CTG GAA GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC
110 115 120
CTG AAA GTT CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG
125 130 135
AAC GAG CTG TGT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TGT
140 145
CAG AAC CCA TTG CGT GGT CGT CGT GCT GTT CAG TAA
Fórmula III a qual pode ser preparada de acordo com técnicas conhecidas em si.
Foram sintetizados 16 diferentes oligonucleótidos em duas variantes. A primeira variante integral codifica para EqIFN-Γ maduro com 146 ácidos aminados mais uma metionina de início (Fórmula III) e a segunda para um polipeptídeo encurta do em 3 ácidos aminados na extremidade amino-terminal.
-1 1 5 10 15
ATG GAG GCT GCT TTG TTT MA GAA ATG GAA. AAG GTG AAA GAA TAG TTC
20 25 30
AAG GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG CTG TTC CTG
35 40 45
GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAG TCT GAC AAA AAG ATC ATC
50 55 60
CAG TCT CAG ATG GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC GAA AAC CTG
70 75
AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT ATC AAA GAA
80 85 90
GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT AAA CTG GAA
95 100 105
GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC CTG AAA GTT
110 115 120
CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG AAC GAC CTG
125 130 135
TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT CAG AAC CCA
140 143
TTC CGT GGT CGT CGT GCT GTT CAG TAA
Fórmula Illa
Ambas as variantes podem ser facilmente modificadas acoplando em vez do tripleto ATG que codifica para a metio nina uma sequência que codifica para um peptídeo de sinal hidrófobo, por exemplo com a fórmula IV.
ATG AAT TAT AGA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT TTG GGT TCT TCT ACC
Fórmula IV
Por meio duma sequência de sinal como a referida activa-se a secreção do polipeptídeo pretendido a partir do citoplasma do organismo hospedeiro. Nesta operação a proteína é processada e o peptídeo de sinal é eliminado; obtém-se a proteína madura. As células de organismos hospedeiros, como por exemplo E. coli, que não possuem a capacidade de processar polipeptídeos que contêm sequências de sinal, devem ser desin tegradas a fim de se isolar o polipeptídeo não maduro. Também constitui um objectivo da presente invenção um processo para a preparação destes EqlFN-Jps não maduros com sequências peptídicas de sinal integrais ou parciais.
- 14 *
A metionina de início pode ser eliminada por méto dos conhecidos, por exemplo por meio de CNBr ou de CNC1, a fim de se obter EqlPN-JP maduro.
Esta sequência de ADN codifica para EqlFN-JP mas contém exclusivamente aqueles codões que são utilizados por genes próprios da célula que são expressos em alto grau em E. coli (Gouny e Gautier, Nucl. Acids Res. 10, 7055 (1982)).
Constitui ainda um objectivo adicional da presente invenção a preparação de EqIFN-Ρ sob forma homogénea e pura agora conseguida pela primeira vez.
Como já referido, o isolamento e a purificação de EqlEN-í' a partir de material celular natural não constitui uma solução satisfatória para o objectivo em vista. De acordo com a presente invenção são utilizadas para este objectivo as sequências de ADN das Fórmulas II, III e Illa. Estas sequências são integradas em vectores apropriados com as respectivas sequências de regulação. Os polipeptídeos formados são isolados e purificados de acordo com técnicas conhecidas em sio
Os polipeptídeos obtidos correspondem à fórmula seguinte:
10 15
Tyr Tyr Cys Gin Ala Ala Phe Phe Lys Glu Ile Glu Asn Leu Lys
20 25 30
Glu Tyr Phe Asn Ala Arg Asn Pro Asp Vai Gly Asp Gly Gly Pro
35 40 45
Leu Phe Leu Asp Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Asp Ser Asp Lys
50 55 60
Lys Ile Ile Gin Ser Gin Ile Vai Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe
65 70 75
Glu Asn Leu Lys Asp Asn Gin Vai Ile Gin Lys Ser Met Asp Thr
80 85 90
Ile Lys Glu Asp Leu Phe Vai Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr Ser
95 100 105
Lys Leu Glu Asp Phe Gin Lys Leu Ile Gin Ile Pro Vai Asn Asp
110 115 120
Leu Lys Vai Gin Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Vai Met
125 130 135
Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser
140 145
Gin Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg Ala Leu Gin ***
Fórmula V
ou
Gin Ala Ala Phe Phe Lys Glu Ile Glu Asn Leu Lys
Glu Tyr Phe Asn Ala Arg Asn Pro Asp Vai C-ly Asp Gly Gly Pro
Leu Phe Leu Asp Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Asp Ser Asp Lys
Lys Ile Ile Gin Ser Gin Ile Vai Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe
Glu Asn Leu Lys Asp Asn Gin Vai Ile Gin Lys Ser Met Asp Thr
Ile Lys Glu Asp Leu Phe Vai Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr Ser
Lys Leu Glu Asp Phe Gin Lys Leu Ile Gin Ile Pro Vai Asn Asp
Leu Lys Vai Gin Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Vai Met
Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser
Gin Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg Ala Leu Gin ***
Fórmula Va
Quando se utiliza a sequência cromossomal (Fórmu la II) obtem-se, após transformação de células de mamíferos, o EqIFN-p na forma glicosilada em que ocorre naturalmente (EqIFN-$ autêntico).
As sequências de acordo com as fórmulas II, III e Illa são es pecialmente adequadas para a preparação de EqlFN-^s em micro, organismos, em especial para a preparação de EqIFN-$’s em E. coli, resultando neste caso a expressão do polipeptídeo sob forma não glicosilada.
Um objectivo adicional da presente invenção é cons.
tituído pela preparação de modificações dos naturais.
E possível preparar modificações numa proteína, por exemplo, seja por derivatização da proteína ou por fragmentação da proteína por meio de digestão enzimática, seja por modificação da sequência de ADN que codifica para a proteína por supressão ou por fragmentação e por meio de expressão destas sequências num organismo hospedeiro apropriado.
I De acordo com a presente invenção as sequências de ADN que codificam para as modificações de EqlEff-jp são preparadas por síntese química. A fim de tornar possível uma manipulação simples do gene para modificações de sectores isola dos são introduzidos nas sequências de ADN vários sítios de corte singulares por enzimas de restrição.
Obtêm-se outras formas modificadas dos EqlFN-^s de acordo com a presente invenção integrando em vectores apro priados os diferentes oligonucleótidos isolados ou em diferen tes combinações contendo as sequências de regulação correspon dentes, cultivando organismos hospedeiros transformados com aqueles vectores e isolando e purificando as proteínas forma) das.
Para alcançar os objectivos referidos foi isolado ADN de alto peso molecular a partir dum tecido de cavalo, de preferência de fígado, de acordo com uma modificação dum processo de Blin e Stafford (Blin, U.; Stafford, P. W. Mucl. Acids Res. (1976), 3, 2303-2308), fragmentando-se este ADN estatisticamente por meio de endonucleases especiais. Os diferentes fragmentos maiores obtidos deste modo foram separados de acordo com a dimensão, de preferência para formação de fragmentos de 10 a 23 kb, a fim de serem clonados num vector, por exemplo num vector lambda, por exemplo no vector lambda EMB13A. Em seguida estes vectores, após transformação num or- 17 -
ganísmo hospedeiro, por exemplo em B. coli, foram multiplicados. Este banco de ADN equina foi examinado por meio duma sonda” de interferão gama humano sob condições de hibridação não críticas. Estas condições não críticas possibilitam a des coberta de sequências de ADN que apresentam as diferenças em relação às sondas”.
Estas sondas” tanto podem ser obtidas por digestão de plasmídeos conhecidos da literatura com enzimas de res trição como por meio de síntese química mediante técnicas de I síntese de oligonucleótidos conhecidas em si. Estas sondas apresentam a sequência que codifica para o HuIFN-jÇ. Foi possí vel identificar cinco clones lambda que davam sinais positivos de hibridação.
A partir destes fagos recombinantes isolados foi purificado o ADN de acordo com métodos habituais. Os ADNs fágicos, após digestão com diferentes enzimas de restrição seguida de análise de Southern (Southern, J. Mol. Biol. 98: 503 -517, 1975), foram caracterizados por hibridação com as sondas de HuIFN-Ç4. Um fragmento singular que híbrida BamHI de
4,6 kb de dimensão do clone lambda Eq-$2 foi isolado e foi clonado no sítio de corte BamHI do plasmídeo pUG9 (Vieira e } Messing, Gene 19: 259-268, 1982).
Após transformação de E. coli por exemplo da estirpe JM101 foi preparado ADN plasmídico a partir das colónias obtidas por meio dum processo de minipreparação (Birnboim e Doly, Nucl. Acids Res. 7: 1513-1523, 1979) e foi carac. terizado por digestão com enzimas de restrição. Um plasmídeo com a inserção BamHI pretendida foi denominado pAHlll. As orlas da inserção BamHI do plasmídeo pAHlll foram sequenciadas após integração no vector M13mp8 ou M13mp9 (Vieira e Messing, Gene 19, 259-268, 1982) de acordo com o método de didesoxi (Sanger et al., Froc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467, 1977). Uma comparação da sequência com o gene do interferão
gama humano (Gray e Goeddel, Nature 298: 859-863, 1982) mostra uma alta homologia com as regiões 5' e 3' não codificantes. Em consequência concluiu-se que se tinha isolado o gene do EqON-y integral.
A inserção BamHI de 4,6 kb de comprimento do pias, mídeo pAHlll foi integralmente sequenciada de acordo com o mé todo de didesoxi. A sequência inteira do fragmento BamHI foi estudada por combinação de sequências parciais do subclone M13 que foram obtidas por clonagem dirigida de fragmentos de | restrição (EcoRI, HindIII, PstI, PstI-BglII e HindIII-BamHI) nos vectores cortados correspondentes M13mp8 ou M13mp9. Foram obtidas outras sequências, enquanto que o fragmento BamHI-BglII de 2,0 kb e o fragmento PstI de 2,0 kb foram clonados no vector M13mp8 de acordo com o método de shotgun”. As sequências parciais obtidas foram reunidas por meio dum programa de computador a fim de se obter a sequência total de 4664 pb de comprimento que se apresenta na Fig. 1.
Por meio de análise computorizada do quadro de leitura livre e de comparação com interferões gama de outras espécies (Gray e Goeddel, Nature 298: 859-863; Gray e Goeddel, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 5842-5846, 1983; Dijkema et I al.» EMBO J. 4: 761-767, 1985; Cerretti et al., J. Immunology 136: 4561-4564, 1986) determinou-se 0 domínio de codificação para a proteína do gene do interferão gama do cavalo. A região que codifica para a proteína está interrompida por três intrões, estando codificados no primeiro exão 0 peptídeo hidrófobo de sinal de 20 ácidos aminados de comprimento e 18 ácidos aminados do polipeptídeo do EqlFN-^ maduro (bases 366-479). 0 segundo exão codifica para os ácidos aminados 19 a 41 (bases 1639 a 1707), 0 terceiro exão codifica para os ácidos aminados 42 a 102 (bases 1803 a 1985) e 0 quarto exão codifica para os ácidos aminados 103 a 146 (bases 3307 a 3441). Nas posições 4010 e 4020 encontram-se duas sequências de sinal (AATAAA) para a poliadenilação do ARNm. Nas posições 86 a
do polipeptídeo EqlFN-^ maduro encontra-se o único sítio potencial de N-glicosilação (ASN-Ser-Ser), o qual coincide com o segundo sítio de N-glicosilação do interferão gama bovi no (Asn-Gly-Ser) (Fig. 2). 0 polipeptídeo EqIFN-(P maduro contém de modo surpreendente apenas um único resíduo de cisteína na posição 3# tendo sido, por analogia com os interferões humano e murino naturais, provavelmente eliminados no corpo por via proteolítica os três primeiros ácidos aminados amino-terminais (neste caso Tyr-Tyr-Cys).
A fim de expressar EqIFN-]f recombinante na sua forma madura em Escherichi coli foi construído um gene sintético a partir de oligonucleótidos. Este codifica para a mesma sequência de ácidos aminados que o gene natural do EqlFN-J' mas contém exclusivamente os codões para os únicos ácidos ami nados que são utilizados em genes próprios de E. coli de alto grau de expressão (Gouy e Gautier, Nucl. Acids Res. 10: 7055-7074, 1982). Adicionalmente são inseridos vários sítios de corte singulares de enzimas de restrição os quais tornam possível uma fácil manipulação do gene para a modificação de sec tores isolados. 0 gene sintético para EqlFN-^ foi construído em duas variantes a partir de um total de 16 diferentes oligo nucleótidos. A primeira variante codifica para o EqlFN-^Q madu ro com 146 ácidos aminados mais a metionina de início, a segunda forma codifica para um polipeptídeo encurtado na extremidade amino-terminal em 3 ácidos aminados (Tyr-Tyr-Cys) mais a metionina de início, tal como provavelmente este deverá apresentar-se naturalmente no organismo.
A estrutura do gene sintético do EqlFN-J' é apresentada na Fig. 3. Os oligonucleótidos utilizados para a preparação foram sintetizados por meio dum sintetizador de ADN modelo 381A da sociedade Applied Biosystems, sendo em seguida purificados e separados dos sais presentes por electroforese.
Os oligonucleótidos caracterizados na Fig. 3 têm a seguinte estrutura:
EG-1 5’-TACTACTGCC AGGGTGCTTT CTTTAAAGAA ATGGAAAAGG TGAAAGAATA GTTCAAGGGT CG-3’
EG-2 5’-TTGAAGTATT GTTTGAGGTT TTGGATTTCT TTAAAGAAAG CAGGCTGGCA GTAGTA-3’
EG-3 5’-TAAGCGAGAG GTTGGTGAGG GTGGTGCGCT GTTCCTGGAO ATGCTGAAAA AGTGGAAAGA AGACTCTG-3»
EG-4 5’-TTCTTTCCAG TTTTTGAGGA TGTGGAGGAA GAGGGGAGGA CGGTCAGCAA CGTGTGGGTT AGGAGGG-3’
EG-5 5r-ACAAAAAGAT CATGCAGTCT GAGATGGTTT GTTTGTACTT CAAACTGTTG GAAAACCTGA AAGACAACC-31
EG-6 5 *-TTTCAGGTTT TGGAACAGTT TGAAGTAGAA AGAAAGGATG TGAGAGTGGA TGATCTTTTT GTGAGAGTG-3’
EG-7 51-AGGTTATGCA GAAATGGATG GAGAGTATGA AAGAAGATGT GTTGGTTAAA TTGTTGAAGT CG-31
EG-8 5’-TGGACGAGTT GAAGAATTTA AGGAAGAGAT GTTGTTTGAT AGTGTCCATC GATTTCTGGA TAAGGTGGTT GTG-3’
EG-9 5’-TGGACTTCTA AACTGGAAGA CTTCCAGAAA GTGATCGAGA TGCGAGTTAA GGAGGTGAAA-3’
EG-10 5’-GCTGAACTTT GAGGTCGTTA ACTGGGATGT GGATGAGTTT GTGGAAGTCT TCGAGTTTAG AAG-3’
EG-11 5’-GTTGAGCGTA AGGCTATGTG TGAAGTGATG AAAGTTATGA AGGAGCTGTG TCCAAAAGCT AA-3*
EG-12 5’-CGCAGGTTAG GTTTTGGAGA CAGGTGGTTC ATAAGTTTGA TCAGTTCAGA GATAGCCTTA C-3»
EG-13 5’-GOTGCGTAAA CGTAAAGGTT CTGAGAAGCG ATTGGGTGGT GGTGGTGGTC TTGAGTAAG-3’
EG-14 5’-GATCCTTACT GAAGAGGACG ACGACCAGGG AATGGGTTGT GAGAACGTTT ACGTTTA-3 *
EG-15 5’-CAGGGTGCTT TGTTTAAAGA AATGGAAAAC GTGAAAGAAT ACTTCAACGC TGG-3’
EG-16 5’-TTGAAGTATT CTTTGAGGTT TTGGATTTCT TTAAAGAAAG
GAGGCTG-3»
A construção do gene sintético do EqlFN-^ foi levada a efeito em duas secções. A primeira parte do gene foi preparada por meio dos oito oligonucleótidos EG-1 a EG-8 até ao sítio de corte Sall e a segunda fracção do gene foi preparada a partir dos seis oligonucleótidos EG-9 a BG-14 depois do sítio de corte Sall até ao sítio de corte BamHI. Para a forma do EqlBN-'^ encurtada em três ácidos aminados na extremi dade amino-terminal foram utilizados, em vez dos oligonucleótidos EG-1 e EG-2, os oligonucleótidos EG-15 e EG-16.
Consideram-se abrangidas no âmbito da presente in venção não apenas as sequências genicas que codificam especificamente para os interferões da presente invenção mas igualmente as modificações que podem ser obtidas facilmente e por meio de técnicas de rotina por mutação, fragmentação, transpo sição ou adição. Todas as sequências, que codificam para os interferões da presente invenção (isto é, que apresentam o es pectro de actividade biológica descrito) e que em comparação com as sequências apresentadas são degeneradas, estão igualmente incluídas; os especialistas desta matéria estão em posi ção de efectuar a degenerescência das sequências de ADN das regiões de codificação. Do mesmo modo estão abrangidas todas as sequências que codificam para um polipeptídeo com o espectro de actividade dos interferões da presente invenção e as que hibridam com as sequências apresentadas (ou com partes destas) sob condições críticas (por exemplo sob condições que provocam a selecção de acordo com uma homologia superior a 85$, de preferência superior a 90%).
A hibridação é levada a efeito em SSO 6 x/solução de Denhardt 5 x/SDS a 0,1 % a 65°C* A exigência das condições reflecte-se na fase de crescimento. Deste modo, para uma selec. ção para sequências de ADN com cerca de 85 % ou mais de homologia são apropriadas as condições constituídas por SSC 0,2 x x/SDS a 0,01 %/65°C e para uma selecção com uma homologia de 90 % ou mais as condições constituídas por SSC 0,1 x/SDS 0,01% • /65°C.
Os genes de interferão de acordo com a presente invenção podem ser integrados em qualquer organismo sob condi ções que conduzam a altos rendimentos. Os hospedeiros e os vectores apropriados são conhecidos dos especialistas na maté ria; como exemplo, pode fazer-se referência a EP-A-0 093 619.
São preferidos para a expressão especialmente pro cariontes, por exemplo E. coli K 12 da estirpe 294 (ATCC Na 31 446) ou B. coli X1776 (ATCC Na 31 537). Do mesmo modo que as estirpes mencionadas podem também ser usadas as estirpes E. coli W 3110 (P-, Lambda-, prototrófico, ATCC JP 27 325), bacilos como Bacillus subtilis e outras enterobacteriáceas, como Salmonella typhimurium ou Serratia marescens e vários Pseudomonades.
Em geral podem usar-se em ligação com estes hospedeiros vectores plasmídicos que contêm sequências de regula ção originárias de espécies que são compatíveis com as células do hospedeiro. 0 vector comporta habitualmente, além dum sítio de replicação, sequências de reconhecimento que possibi litam a selecção fenotípica das células transformadas. Por exemplo, E. coli é habitualmente transformado com pBR322, um plasmídeo originário da espécie E. coli (Bolivar, et al., Gene 2, 95 (1977)). 0 plasmídeo pBR322 contém genes para resistência è ampicilina e à tetraciclina e oferece portanto a pos sibilidade de identificar as células transformadas. 0 plasmídeo pBR322 ou também outros plasmídeos devem além disso conter promotores ou devem ser guarnecidos com promotores que possam ser usados por microorganismos para a expressão das próprias proteínas. Os promotores mais usados na preparação de ADN recombinante compreendem o sistema de beta-lactamase (penicilinase) e o sistema do promotor de lactose (Ohang et al., Nature 275, 615 (1978); Itakura et al., Science 198, 1056 (1977); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)) e o sistema promotor d· triptofano (trp) (Goeddel et al., Nucleic Acids Res, 8, 4057 (1980); EP-A-0 036 776). Alem destes promotores especialmente adequados também se podem desenvolver ou- 23 -
tros promotores microbianos utilizáveis. A sequência genica para os interferões da presente invenção pode ser usada, por exemplo, sob a regulação do promotor esquerdo do bacteriófago lambda (P-^). Este promotor tem a propriedade de ser especialmente fácil de dirigir de forma efectiva. E conhecido o facto de ser possível dirigir o promotor por meio do repressor lamb da do sítio de corte por restrição adjacente. Um alelo sensível à temperatura deste gene repressor pode ser introduzido num vector que contenha uma sequência do EqIFN-)f. Quando se eleva a temperatura a 42°C o repressor é inactivado e o promo tor é activado. Por meio da utilização deste sistema e possível estabelecer um banco de clones que contenham uma sequência de IPN funcional adjacente a um sítio de ligação ribossomal em várias distâncias do promotor lambda P·^. Estes clones podem em seguida ser experimentados, seleccionando-se os que possuírem o rendimento mais elevado.
A expressão e a tradução duma sequência que codifique para as proteínas da presente invenção pode ser levada a efeito também sob a regulação de outros sistemas reguladores que podem comportar-se como homólogos” em relação ao organismo sob a forma não transformada. Deste modo, por exemplo, o ADN cromossomal duma estirpe de E. coli dependente de lacto se contém um operão de lactose ou operão Lac, que possibilita a decomposição da lactose por meio da libertação da enzima be. ta-galactosidase.
Os elementos de regulação Lac podem ser obtidos a partir do bacteriófago lambda-placb» que é infeccioso para E. coli. 0 operador Lac do fago pode ser formado por transdução a partir da mesma espécie bacteriana.
Os sistemas de regulação utilizados no processo da presente invenção podem também ser provenientes de ADN plasmídico próprio do organismo. 0 sistema promotor-operador
Lac pode ser induzido por meio de IPTG.
- 24 Também podem ser usados do mesmo modo outros sistemas promotor-operador ou partes destes: por exemplo o opera dor de arabinose, o operador E^ de colicina, o operador de ga lactose, o operador de fosfatase alcalina, o operador trp, o operador A de xilose, o promotor tac, etc..
Além de microorganismos procarióticos também se podem usar eucarióticos, como por exemplo culturas de leveduras. 0 microorganismo eucariótico mais usado é a levedura Saccharomyces oerevisiae, embora se possa em geral dispor de numerosas outras espécies. Para expressão em Saccharomyces usa-se por exemplo o plasmídeo YRp7 (Stinchcomb et al., Matur 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschumper et al., Gene 10, 157 (1980) e o plasmídeo YEpl3 (Bwach et al., Gene 8, 121-133 (1979)). 0 plasmídeo YRp7 contém o gene TRPI que apresenta uma marca de selecção para um mutante de levedura que é incapaz de crescer em meio isento de triptofano; por exemplo ATCC 44 076.
A presença da deficiência TRPI como característica do genoma da levedura hospedeira constitui portanto um meio poderoso de detectar a transformação quando a cultura é levada a efeito sem triptofano. Dum modo semelhante comporta-se o plasmídeo YEpl3, o qual contém o gene de levedura 1EU 2, que é usado para suplemento dum mutante IiEU 2-menos. As sequências de promotor apropriadas para vectores de leveduras compreendem a região de flanco 5’ do gene de ADH I (Ammerer
G., Methods of Enzymology 101, 192-201 (1983)), 3-fosfoglicerato-quinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) ou outras enzimas glicolíticas (Kawasaki e Fraenkel, BBRC 108, 1107-1112 (1982)) como enolase, gliceraldeíd.o-3-fos fato-de-hidrogenase, hexoquinase, piruvato-descarboxilase, fosfofrutoquinase, glucose-6-fosfato-isomerase, fosfoglucose-isomerase e glucoquinase. Ma construção de plasmídeos de expressão apropriados podem ser inseridas as sequências de terminação associadas com estes genes igualmente no vector de ex
pressão na extremidade 3’ da sequência a expressar, a fim de possibilitar a poliadenilação e a terminação do ARNm.
Outros promotores que apresentam ainda além disso a vantagem de terem a transcrição regulada pelas condições de crescimento são a região do promotor do gene para álcool-de-h.idrogenase-2, isocitocromo 0, fosfatase ácida, enzimas de decomposição relacionadas com o metabolismo do azoto, a acima referida gliceraldeído-3-fosfato-de-hidrogenase e enzimas res. ponsáveis pelo processamento de maltose e de galactose. Podem ser usados promotores que são regulados por meio do local do tipo de emparelhamento da levedura, por exemplo promotores dos genes BARI, WL, STE2, STE3 e STE5 em sistemas de regula ção pela temperatura por meio da utilização de mutações sir dependentes da temperatura (Rhine Pb.. D. Thesis, Universidade de Oregon, Eugene, Oregon (1979), Herskowitz e Oshima, The Mo lecular Biology of the Yeast Saccharomyces, parte I, 181-209 (1981), Cold Spring Harbor Laboratory). Estas mutações influenciam a expressão dos blocos integrados do tipo de emparelha mento em repouso de leveduras e, deste modo, indirectamente os promotores dependentes do tipo de emparelhamento. Em geral, no entanto, é apropriado qualquer vector plasmídico que conte nha um promotor compatível com leveduras e sequências originais de replicação e de terminação.
Além de microorganismos, também constituem organismos hospedeiros adequados culturas de organismos multicelu lares. Em princípio qualquer cultura como as referidas é utilizável, tanto de animais vertebrados como de animais inverte brados. ITo entanto apresentam maior interesse as células de animais vertebrados, uma vez que a cultura de células de animais vertebrados (cultura de tecidos) se tornou nos últimos anos um método de rotina (Tissue culture, Academic Press, Kru se e Patterson, Editores (1973)). Exemplos destas linhas de células hospedeiras utilizáveis são constituídos pelas linhas de células VERO, células HeLa, células 0Η0 e linhas de células
WI38, BHK, COS-7 e MDCK. Os vectores de expressão para estas células contêm habitualmente (quando necessário) um ponto de início de replicação, um promotor, que está localizado antes do gene a expressar, em conjunto com todos os locais necessários de ligação de ribossomas, locais de corte de ARN, locais de poliadenilação e sequências de terminação de transcrição.
Quando se utilizam células de mamíferos é frequen te que as funções de regulação dos vectores de expressão sejam provenientes de material virai. Por exemplo os promotores usados habitualmente são provenientes do adenovírus 2 de polioma e do vírus de símio 40 (SV 40), sendo este último especialmente importante. Os promotores finais precoce e tardio de SV 40 são especialmente úteis, uma vez que ambos são facil mente obteníveis a partir do vírus sob a forma dum fragmento, que contém também o local de replicação virai do SV 40. (ELers et al., Nature 273, 113 (1978)). Também podem ser usados frag mentos menores ou maiores do SV 40, contanto que contenham a sequência de cerca de 250 pb que vai do sítio de corte HindIII até ao sítio de corte Bgll no ponto de replicação virai. Além disso é igualmente possível e muitas vezes aconselhável utilizar sequências de promotor e de regulação que estão normalmente acopladas com as sequências genicas pretendidas, contanto que estas sequências de regulação sejam compatí veis com os sistemas das células hospedeiras.
Pode prever-se um ponto de início de replicação tanto por meio da construção do vector correspondente, a fim de introduzir um ponto de início exógeno, por exemplo proveniente de SV 40 ou de outras origens virais (por exemplo de polioma, adeno, VSV, PBV, etc.), como por meio do mecanismo de replicação cromossomal da célula hospedeira. Quando o vector é integrado no cromossoma da célula hospedeira, é suficien te o último método referido.
De preferência as sequências de ADN da presente
invenção são também expressas no plasmídeo de expressão pER103 (E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237-248 (1983.) e EP-A-0 115 613 - depositado na DSM sob o número DSM 2773 em 20 de Dezembro de 1983), no plasmídeo parpER33 (EP-A-0 115 613) ou no plasmídeo pRHlOO, uma vez que estes vectores contêm todos elementos de regulação que conduzem a uma taxa elevada de expressão dos genes clonados. De acordo com a presente invenção usa-se como vector de expressão para o gene sinté. tico do EqIFN-)Ç o plasmídeo pRHlOO, que contém o promotor de triptofano regulável proveniente de Serratia mercescens e um I local artificial de ligação de ribossomas. Para preparação do plasmídeo de expressão pRHlOO, linearizou-se o plasmídeo pER103 (Eva Dworkin-Rastl et al., Gene 21 (1983) 237-248, EP-A-0 115 613) com a endonuclease de restrição HindIII e eli minou-se o resíduo de fosfato 5’ terminal.
Este ADN plasmídico foi misturado com os oligonucleótidos fosforilados d(AGCTTAAAGATGAGCT) e d(CATCTTTA) sendo em seguida ligado. A mistura reaccional de ligase foi dige rida com a endonuclease de restrição Saci e foi ligada por adição de PNK T4. Os oligonucleótidos foram preparados de modo análogo ao descrito em EP-A-0 115 613. Transformou-se E. coli HB 101 com esta mistura reaccional de ligase e incubou-se.
| Das colónias de bactérias resultantes escolheram-se arbitrariamente e a partir destas colónias isolaram-se os plasmídeos em microescala (Birnboim e Doly, Nucl. Acids Res. 7 (1979) 1513-1523). 0 ADN resultante foi cortado com a endonuclease de restrição Saci e os fragmentos foram separados num gel de agarose (1$, tampão TBE 1 x). A migração do ADN correspondente a uma molécula de ADN linear de 4 400 pb de comprimento confirma a integração dum local de reconhecimento Saci no plasmídeo. Um destes plasmídeos foi seleccionado arbitrariamente. Oom 0 ADN obtido por meio duma minipreparação a partir desse plasmídeo transformou-se novamente E. coli HB101. Escolheu-se uma das bactérias transformadas resultantes e cultivou-se numa escala mais elevada. 0 plasmídeo isolado a partir
dessa cultura foi cortado com as endonucleases de restrição EcoRI e BAMHI, o ADN foi separado num gel de agarose a 1 % e o fragmento menor foi isolado a partir do gel por electroelui ção. Este fragmento EcoRI-BamHI de cerca de 460 pb de comprimento foi sequenciado de acordo com a técnica de Sanger. (Fo Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (1977) 5463-5467). 0 plasmídeo analisado deste modo foi denominado pRHlOO.
plasmídeo foi cortado integralmente com Saci e as extremidades desalinhadas do ADN foram rectificadas por tratamento com o fragmento de Klenow (Amersham) na presença dos fosfatos dos quatro desoxinucleótidos. A reacção foi feita parar por extracção com fenol/clorofórmio e o ADN foi concentrado por precipitação com etanol. Por meio deste tratamen to resultou na ligação ao promotor um ADN de extremidades ali nhadas na ligação ao promotor de triptofano, o qual termina com o codão de tradução ”ATG. 0 ADN do plasmídeo linearizado foi cortado com BamHI e a fracção do vector foi isolada.
vector plasmídico pRHlOO assim preparado foi misturado com os oligonucleótidos ligados EG-1 a EG-8 e EG-9 a EG-14 e foi incubado em tampão de ligação com ligase de ADN T4. Transformaram-se células de E. coli tornadas competentes, de preferência JM101, com esta mistura de ligação e deixou-se incubar dum dia para o outro. A partir dos transformantes obti dos isolou-se o ADN plasmídico por um processo de miniprepara ção e determinou-se a respectiva estrutura por análise de res. trição e sequenciação da inserção HindIII-BamHI. Um plasmídeo com a estrutura pretendida para a expressão de EqIFN-)Ç maduro foi denominado pEqG-YYCl.
De modo em tudo análogo clonaram-se os oligonucleótidos EG-15, 16, EG-3 a EG-8 e EG-9 a EG-14 no vector pRHlOO, a fim de obter o EqIFN-ft encurtado em três ácidos aminados. Um plasmídeo com a estrutura pretendida foi denominado pEqG-QAAl.
A transformação das células com o veículo pode ser
conseguida por meio duma variedade de processos. Por exemplo pode ser efectuada pela acção de cálcio, lavando as células numa solução contendo magnésio e adicionando o ADIT ás células suspensas numa solução contendo cálcio ou expondo as células a um coprecipitado de AD1T e fosfato de cálcio. Antes de passat à fase de expessão do gene, cultivam-se as células num meio que permita a selecção das células transformadas.
A fim de detectar a expressão da actividade de in terferão por E. coli JM101 contendo o plasmídeo pEqG-YYCl ou o plasmídeo pEqG-QAAl, desintegraram-se as células depois da incubação num meio de cultura apropriado e ensaiou-se o sobre, nadante depois de filtração esterilizante por meio duma análi se que media o efeito citopático (GPE) de VSV ou de EMGV. Para este efeito usaram-se células HBL-6 (ATCG CGL 57, células de epiderme de pele de cavalo), que tinham sido infectadas com vírus de estomatite vesicular (VSV) e/ou com A549 (APGC CCL185» linha de células de carcinoma de pulmão humano) infec. tada com vírus de encefalomiocardite (EMGV).
A detecção dos interferões de cavalo expressos foi levada a efeito por marcação das proteínas em células MaxL Proteínas codificadas por plasmídeos podem ser marcadas in vivo de modo selectivo mediante a utilização da técnica de célu las Maxi (Sanear, A. et al., J. Bacteriol., 137, 692-693 (1979)). A estirpe de E. coli GSR6O3 (GGSC 5830) não possui qualquer mecanismo para a reparação dos defeitos causados por raios UV. Por meio de radiação com uma dose adequada de raios UV destrói-se o cromossoma bacteriano mas alguns dos ADITs dos plasmídeos, muito mais pequenos e existentes em maior número de cópias por célula, conservam-se, pelo contrário, funcionais. Após matar todas as células não danificadas que se multiplicam com o antibiótico D-cicloserina e depois de se ter esgotado o ARHm endogéneo ficaram nas células restantes apenas genes nos plasmídeos que se transcrevem e traduzem. As proteínas formadas podem ser marcadas por meio de S-metioni
na radioactiva e restreadas. Transformou-se E. coli GSR 603 com os plasmídeos de expressão de acordo com métodos habituais e as bactérias transformadas foram seleccionadas em placas de agar contendo ampicilina. A preparação de células Maxi e das proteínas marcadas foi levada a efeito de acordo com o procedimento de A. Sanear. Para padrão de peso molecular usou-se uma mistura de proteínas metiladas com (Amersham). Para testemunhos de comparação utilizaram-se os plasmídeos pER103 contendo apenas o promotor sem o gene de interferão e o plasmídeo pER21/l que contém duas cópias do gene humano do IPNI -&22arg.
Para caracterização dos produtos preparados de acordo com a presente invenção são apropriados os métodos de análise conhecidos biológicos e imunológicos para interferão. Uma vez que os interferões apresentam actividade antiviral própria nos métodos de análise PFU e GPE, utiliza-se para diferenciar o EqIFN-£ da presente invenção do EqlFN-ace/ /ou EqIFN-β as diferentes antigenidad.es destes interferões.
Os polipeptídeos da presente invenção não são neu tralizados pelos anti-soros contra EqlFN-ote/ou contra EqlFN-β. Outros critérios de diferenciação apropriados são a labiI lidade perante os ácidos dos polipeptídeos da presente invenção e a sensibilidade perante o dodecilsulfato de sódio (SDS). Tanto a incubação dos polipeptídeos com uma solução de SDS a 0,2% como a incubação a pH 2 durante algumas horas a 4°G pr£ voca uma rápida perda total da actividade antiviral. Nas mes. mas condições os EqIPN-oC e EqIFN-β são estáveis.
Para detectar o número tdal de sequências do genoma de cavalo que apresentam alto grau de homologia com o ge ne do interferão, digeriu-se integralmente ADN de cavalo de alto peso molecular com as enzimas de restrição correspondentes e separaram-se os fragmentos de ADN de acordo com a respectiva dimensão. Depois de transferência de Southern para ,ίκΛ..,
filtros de nitrocelulose, desnaturação e fixação do ADN, hibridou-se cada filtro com sondas de translação de posição. Cç> mo sonda para o EqIFN-Jf utilizou-se um fragmento do plasmídeo pEqG-YYCl que contém a sequência de codificação para o interferão maduro total. Os filtros foram em seguida lavados sob condições críticas. Efectuou-se uma autor-radiografia em pelí cuia DuPont Oronex para raios X utilizando folhas de amplificação Kodak Lanex-Regular durante 7 dias a -80°G.
Em seguida levou-se a efeito a transformação do hospedeiro, a expressão do gene e a fermentação ou a cultura de células sob condições apropriadas para a expressão das pro. teínas da presente invenção. Após estas operações é possível extrair o produto do modo habitual por meio de métodos de separação cromatográfica conhecidos, obtendo-se deste modo um material que contém as proteínas com ou sem sequências guia e de terminação. Os interferões da presente invenção podem ser expressos com uma sequência guia na extremidade N-terminal (Pre-INN), a qual pode ser retirada por algumas células hospe deiras. Se tal não ocorre, torna-se necessária a eliminação do polipeptídeo guia (quando existente) a fim de se obter IPN maduro. Alternativamente é possível modificar o clone de IFN de tal modo que a proteína madura seja produzida directamente no microorganismo em vez do Pre-IFN. Para esse fim pode ser u sada a sequência do precursor da feromona de emparelhamento de levedura MF-alfa-1, a fim de possibilitar uma maturação” correcta da proteína fusionada e a libertação dos produtos no meio de cultura ou no espaço periplasmídico. A sequência de ADN para o IFN maduro ou funcional pode ser ligada com MP-alfa-1 n.o presumível sítio de corte catepsínico (depois de Lys-Arg) na posição 256 do codão de iniciação ATG (Kurjan, Herskowitz, Cell 30, 933-943 (1982)).
No esquema geral que se segue descreve-se um processo de acordo com o qual se pode purificar EqIFN-p a partir de bactérias.
1. Extracção das células num tampão de lise (cerca de pH 8) de elevada condutividade por meio da passagem através dum homogeneizador sob alta pressão; arrefecimento d.o efluente num banho de gelo.
2. Precipitação do ADN por adição de polietilenimina com agi tação a uma temperatura de por exemplo 4°C.
3. Precipitação por efeito de pH das proteínas bacterianas, mantendo-se ainda o EqlFN-^ em solução.
4. Centrifugação dos sólidos a 4°C.
5. Concentração do sobrenadante (após novo ajustamento do pH) por exemplo por ultrafiltração.
6. Diâlise do concentrado contra um tampão de baixa condutividade.
7. Separação dos sólidos por centrifugação, conservando-se o EqIPN-^p em solução.
8. Cromatografia de permuta iónica em carboximetilcelulose, eluição com um gradiente de força iónica crescente.
9. Cromatografia em gel de fosfato de cálcio e eluição com um gradiente de força iónica crescente.
10. Cromatografia de permuta iónica em carboximetilcelulose sob condições fracas de desnaturação e eluição com um gra diente de força iónica crescente.
11. Separação por meio de cromatografia de filtração em gel.
processo referido possibilita a obtenção de material com um grau de pureza superior a 95
Nesta altura convém notar que o processo da presente invenção não se destina apenas a preparar os interferões que foram descritos explicitamente mas também igualmente
- 33 J
todas as modificações destes polipeptídeos que não alteram de modo essencial a respectiva actividade de ΙΒΝ-^ de cavalo. Bs tas modificações compreendem, por exemplo, o encurtamento da molécula, por exemplo na extremidade N-terminal ou C-terminal, troca de ácidos aminados por outros resíduos e ligação química ou ‘biológica da molécula a outras moléculas, sejam estas i nertes ou activas. Nas últimas modificações referidas pode tratar-se por exemplo de moléculas híbridas de um ou de vários dos interferões da seguinte invenção e/ou dos interferões aouf conhecidos.
Com base nos respectivos espectros de actividade, os novos interferões obtidos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para qualquer tipo de tratamento para o qual os interferões conhecidos também são usados. Estas aplicações incluem, por exemplo, herpes, rinovírus, vírus do aborto equino, diferentes tipos de cancro e outras doenças se. melhantes. Os novos interferões podem ser usados isoladamente ou em combinações com outros interferões conhecidos ou com ou tros produtos biologicamente activos, por exemplo com IFN-alfa, IL-2, outros imuno-moduladores e outros produtos semelhan tes ·
Os interferões da presente invenção podem ser administrados por via parenteral no caso de tratamentos antitumorais ou antivirais e no caso de os mesmos apresentarem propriedades imunossupressivas. A dosagem e a posologia podem ser semelhantes às usadas oportunamente nas investigações clínicas de interferões, por exemplo, cerca de 1 a 10 x 10θ unidades diárias e, em preparados com um grau de pureza superior a 1 %9 até, por exemplo, 5 x 10 unidades diárias.
Por exemplo, para a preparação duma forma de apre. sentação conveniente para utilização parenteral, pode ser dis. solvido um IPN bacteriano obtido de acordo com a presente invenção sob uma forma substancialmente homogénea numa quantida
de de 3 mg de EqlFN-^ em 25 ml de albumina de soro animal a 5$, de preferência em albumina de soro de cavalo/cão. Esta sçj lução é então passada através dum filtro bacteriológico e a solução filtrada é distribuída assepticamente por 100 frascos, ficando cada um a conter 6 x 10^ unidades de IFN puro adequado para administração parenteral. Até à utilização, os frascos são de preferência conservados a baixa temperatura (-20° 0). As substâncias obtidas de acordo com a presente invenção podem ser formuladas de modo conhecido a fim de se obterem agentes utilizáveis farmaceuticamente, para o que os polipeptí I deos da presente invenção são misturados com uma substância veicular farmaceuticamente aceitável. Substâncias veiculares e a respectiva formulação são descritas por E. W. Martin em Remington’s Bharmaceutical Sciences, aqui expressamente referido. Os interferões da presente invenção são misturados com uma determinada quantidade da substância veicular a fim de se produzir um agente farmacêutico apropriado para um emprego eficiente nos utilizadores (pacientes). Considera-se preferida uma aplicação por via parenteral.
A presente invenção refere-se adicionalmente a um processo para a preparação de anticorpos monoclonais contra os polipeptídeos da presente invenção e a células de hibrido| mas que produzem estes anticorpos. Consideram-se preferidas as linhas de células de hibridomas e os anticorpos monoclonais provenientes destas que reagem de modo específico com o EqlFN-gama. 0 processo para a preparação destes anticorpos mo noclonais oaracteriza-se por se imunizar um mamífero de peque no porte, por exemplo um coelho ou um rato, com os polipeptídeos da presente invenção, provocar-se a fusão de linfócitos B do animal imunizado com células de mieloma, clonarem-se as células de hibridoma formadas, em seguida cultivarem-se in vi tro ou por injecção em ratos e isolarem-se os anticorpos a partir das culturas.
A invenção refere-se ainda a colunas de cromato- 35 -
grafia por imuno-afinidade e a conjuntos de análise (kits”) para análise imunológica que contêm estes anticorpos.
De acordo com o processo da presente invenção imu nizam-se ratos por exemplo ratos Balb/c, de modo conhecido. Para este fim, numa forma preferida de concretização, injectam-se os polipeptídeos da presente invenção com uma cadência aproximadamente semanal ou a intervalos superiores durante vá rias semanas, por exemplo durante 5 a 12 semanas, até se ter formado um número suficiente de linfócitos B produtores de an ticorpos.
Os orgãos que contêm linfócitos B, por exemplo as células de baço, dos ratos imunizados sao retiradas e são fun didas com células de mieloma que, em virtude duma mutação, não tenham capacidade de crescer num meio de cultura selectivo. Células de mieloma como estas são conhecidas, como por exemplo as designadas pelos símbolos S63-Ag8, X63-Ag8.6.5.3, MPC-11, NSl-Ag4/l, MOPC-21 NS/1 ou SP 2/0. De acordo com uma forma preferida de concretização provoca-se a fusão de células de baço de ratos imunizados com células de mieloma da linha de células X63-Ag8.6.5.3. A fusão é levada a efeito de acordo com uma técnica conhecida em si por mistura dos linfóci tos B e das células de baço com adição dum agente fusogéneo de células, como seja polietilenoglicol, vírus Sendai, cloreto de cálcio ou lisolecitina. De preferência a fusão é provocada na presença de polietilenoglicol, por exemplo com um peso molecular entre 1000 e 4000. Depois da fusão cultivam-se os híbridos obtidos de acordo com técnicas conhecidas em si num meio de cultura selectivo complementado com hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT). As células de mieloma não fusionadas não são capazes de crescer neste meio e morrem bem como os linfócitos normais.
Os sobrenadantes das culturas de hibridomas podem ser analisados por meio dum processo conhecido em si a fim de
verificar o respectivo conteúdo em anticorpos específicos, por exemplo por análise radioimunológica ou por aglutinação0 As células de hibridoma que produzem anticorpos com a especificidade requerida são seleccionadas e separadas a partir da mistura de diferentes células de hibridomas resultante da fusão por clonagem. Para esse fim preparam-se culturas provenientes cada uma do crescimento de uma única célula isolada por meio duma técnica conhecida em si chamada técnica da diluição limitante (limiting dilution”).
Para produção em massa os clones das células de hibridomas que produzem os anticorpos com a especificidade pretendida são cultivados in vitro em meios conhecidos em si ou então são injectados em ratos para multiplicação. De acordo com uma forma de concretização preferida as células de hibridoma são injectadas em ratos tratados com pristano, o líquido ascítico é retirado e os anticorpos são isolados por precipitação com solução de sulfato de amónio.
Os anticorpos específicos obtidos a partir destas células de hibridomas podem ser usados de modo conhecido em si para a preparação de colunas de cromatografia de imuno-afí nidade. Numa forma de realização preferida da invenção faz-se I reagir um material d.e suporte adequado (em suspensão numa solução tampão) com uma solução dos anticorpos; as fracções não ligadas são em seguida separadas por lavagem e os locais de ligação do material de suporte que não estejam preenchidos são bloqueados.
Os anticorpos podem também ser usados com fins te rapêuticos.
Os anticorpos específicos obtidos por meio das cé lulas de hibridomas podem ser usados de modo conhecido em si para a preparação de conjuntos de análise (”test-kits”). Estes conjuntos de análise podem ser baseados em diferentes mé- 37 -
todos, por exemplo em análises radioimunológica, aglutinação de látex, ensaios de mancha, análises radioimunológicas compe titivas ou de sandwich”, análises enzimo-imunológicas, ensaios de imuno-fluorescência ou imunoquímicas enzimáticas.
São abrangidos no âmbito da presente invenção em pormenor:
Um processo para a preparação de polipeptídeos es_ sencialmente sob forma pura
- com as propriedades biológicas e imunológicas do interferão gama de cavalo (EqlFN-gama) *,
- essencialmente isentos de outras proteínas de origem animal;
isentos de glicosilação nativa;
- apresentando o ácido aminado metionina antes do primeiro á eido aminado da extremidade N-terminal;
- contendo um peptídeo guia;
- contendo a sequência de ácidos aminados
1 5 10 15
Tyr Tyr Cys Gin Ala Ala Phe Phe Lys Glu Ile Glu Asn Leu Lys
20 25 30
Glu Tyr Phe Asn Ala Arg Asn Pro Asp Vai Gly Asp Gly Gly Pro
35 40 45
Leu Phe Leu Asp Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Asp Ser Asp Lys
50 55 60
Lys Ile Ile Gin Ser Gin Ile Vai Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe
65 70 75
Glu Asn Leu Lys Asp Asn Gin Vai Ile Gin Lys Ser Met Asp Thr
80 85 90
Ile Lys Glu Asp Leu Phe Vai Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr Ser
95 100 105
Lys Leu Glu Asp Phe Gin Lys Leu Ile Gin Ile Pro Vai Asn Asp
110 115 120
Leu Lys Vai Gin Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Vai Met
125 130 135
Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser
140 145
Gin Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg Ala Leu Gin ***
ou
Gin Ala Ala Phe Phe Lys Glu Ile Glu Asn Leu Lys
Glu Tyr Phe Asn Ala Arg Asn Pro Asp Vai Gly Asp Gly Gly Pro
Leu Phe Leu Asp Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Asp Ser Asp Lys
Lys Ile Ile Gin Ser Gin Ile Vai Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe
Glu Asn Leu Lys Asp Asn Gin Vai Ile Gin Lys Ser Met Asp Thr
Ile Lys Glu Asp Leu Phe Vai Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr Ser
Lys Leu Glu Asp Phe Gin Lys Leu Ile Gin Ile Pro Vai Asn Asp
Leu Lys Vai Gin Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Vai Met
Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser
Gin Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg Ala Leu Gin ***
Um proce sso pars a preparaçÊ io de uma molécul .a de
ADN que codifica para:
- um polipeptídeo com as propriedades biológicas e imunológicas do EqlFN-gama;
- um polipeptídeo conforme acima referido;
Um processo para a preparação das seguintes moléculas de ADN:
- o gene para o EqlFN-gama natural e integral;
- o nucleótido
ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GGG ATT
TTG GGT TCT TCT ACC TAT TAC TGC CAG GCC GGG TTT TTT AAA GAA
—I N T R Ã 0 1-
ATA GAA AAC CTA AAG GAA TAT TTT GTAAGTATGACOTTTTAATAATACTTAC
TTGTGGTTGAAATGACTGAACGTTGTCTTGGAGTTGGATCTCTGATAGGGTGTCCTCTCT ACTCGACAGTCATGTTGAGAAGACTGGGTGTTATTTTCTCTGTTTGTTGACTGGATGAGT TTTTCTTTTTTTTAGTAAATGATCTAGATATTGCTTTAACCCTCTGCTCAATTTGCTATA gagacttagagagggttcatgaatcttccaaaagatgggcttaacaggtttataaagcat agtgaagttgacaattttgtggtgagaagccactgaattgtgataagtcaagtagtgtgg ACATTGAAAAAATGACTAGCTATTAGTTTCTAACTTCTCAGGTTACTATGATGGTGACAA TAAAAGGTCAAGATTAGCATTAAAATGGTAATCTGAAATAATTGATCAGTTAAAGAAGGC GCTGTCCTGAAAGGTTTGGCTGAAAAAAAATGACTTTCAGGTGTTTTCCTCCAAAAAATG ATTTTAAAATCTTACTGCCGCGTTTGTGTTAGCTGTGAAGTACTCTGGAACTCAGTCAAT TGCTGAGATTTTGTACGAGTTATAAGCTGGCTTATATTTAAAAAATTTTTTTGTTTTTGT TTTATGAGTTTCTTTTAAAATGTTATTTATGGTTAATTAAAATAGTTTTTGCATTTTAAA TATTTTATTATTTGTCCAAAATTTAGCTATTTTAATTATAGTTGGA6CTCTCTTTTAGA6
CTGACATAAGACCATAGGGGAGGCACAGATAGATGTGATGGAGCCGTGTACCAGACGGGG GCAGTATCTTATAGTGGGTTGCCTTTGCTGATCTTTTTACTAGAGTTGAAATTATTTGCT TTTCCTTCCTATGGTTATTTGGGACTATTGAAGTATGACCAGCCGTGTTGAGTTCATCTG TAATATTGTAA.TTCAA6GGTTACACTAGAAAATAAGAAAGCTAAAACAGCACGATAATCT TTGGCTAGATCCAACACAATAGCTTTTGGGAATACTTATTGTTAGAACTAAACAGAGGGT TGAAAAGAAAATCAGTGAATACTGTCAGCATCTGAGTTCAATAAAACGTGAAGTACATTT
TTAGGGCAATTCATGGACTAATTGTAAACCAAGTTTTCGTTCCTTTTTCAG AAG GGA
AGA AAG GGA GAT GTA GGG GAT GGT GGG CGT CTT TTC CTG GAT ATC
---------------------1 Η T R Ã O 2TTG AAG AAC TGG AAA GAG GTAAGCTAAGTATTTCCATTTGGTTGATTTTCCTGT
TGCTTATTTTCTGGTGGATGAATTCACACCAACCTCTCTTTGTGCTCTTTTCTCCCTAG
GAT AGT GAC AAA AAA ATA ATT CAG AGC CAA ATC CTC TCG TTG TAC
TTC AAA CTG TTT GAA AAC TTG AAA GAT AAC GAG GTC ATT CAA AAG
AGG ATG GAT ACG ATG AAG GAG GAC CTG TTG GTT AAG TTG TTT AAC
AGC AGC AGG AGG AAG CTG CAA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT
-----------1 Μ T R Ã Ο 3------------------------------CCG GTGAGGAGATCTTAATTCTTTCTTTGGTTTCATTACAGAGGTTCTTGCAAAGTGCT TACGTOGGAGAAAGTAGAAATGAACTATGAAATGAACCCGTGGCCAAAAGTCGTCCTTGC TAATTCCATTTGTGGTTTGAGAGACTTTGCTAAGTCAGTATGGGAATGATTTAAATTTGT GATTTGGGGAAATGCTGGCACTATGACTACTGCAGAAAGGCAGGTGAAGGGACAAATCOA GTGAGGAGGGGGCAGTGAAGAAGTGGAGGGGAGTCTGGAGAAGCAGGTCTCTCCTTGCCG
GTTGTTCGTGAGATGAAATCCTCCTGCTTTGGATGGGAGGCTGCGTGTCTTGGTGGAAAG AGCAGTGGGAGGAGGGAGAAGATTTGTGCTCCTCCCAGCTCAGCCACCAAGAAACTGTGA CCTCAGATGAATCACAGGGGTGGCTGGGGGTGAGTTTCCTGATCTTAAAAGAGGCCTATT GGGTTCACTAAAATTTCTATGATCTTCTTTGCTCTATAATCCTTCAATTCTGTGGACAGA aaatgaaatgaggtaggagaaagaaatagcctttgaagaggttcttgggcattccactgc GAGGCTCTGGTCAACCTTCATACTCTGCAGCCCAAGAAGAGGCAAGACCATTTGTCTGTT TTTGGaAATGCAAATAGGCGGCATTTATACCTGACGAAAGAACTGTTCTGTCAACTTTTG gatactgggctatcttggctggagaaatgcttagggtcccaaagtttctgtcatgaaatt gtcttgagtctttaaatttatggcttctcgaagctgagagataactttaagcataaagac aaattacattttccaacattttc-tctaagagacaaagacctccacatgggtttgggtttg gggtggatctaaatgggcttgaatgagaaggggagggtgttgttatgactatgtttagaa GAGAAAACAGAGGTTTGGAGAGGTTAAGTC-GCTGGTTGAAAGTCAGAGTTATTGCACAGA CAGGATTGGAACCCATATGTTTTGTCCGTGCACTTTAGGGTTCTTTTCGCTACATAATTT TGAGAATTCTGTACCAGTCAATTTAAGGATGTGTGATGTTCCCCATCGTATTACAGCAGA ACGAGCAATTTAATTATAATTTTAGTCTTAACTGCTGAAGAAAGCAGCATTACATATTAA GCTAACATATTCCTGGTGAAAGCAACTTTTTGAAAGGAATATTTCTATTTTCATGGACCA TGACAGTAGCACAGCCTGATGGCTTGTATGGCTGAAACTAATTTTGCTGTTTTCTTTCCC
AATAG GTA AAT GAT CTG AAG GTG CAG GGC AAA GOA ATA AGT GAA CTG
ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTG TGG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG
CGG AAG AGG AGT CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GGG TTG CAA ***
TAG
ou
TAT TAC TGC CAG GCC GGG TTT TTT AAA GAA
-----1 N T R A O 1--------ATA GAA AAC CTA AAG GAA TAT TTT GTAAGTATGACCTTTTAATAATACTTAC TTGTGGTTGAAATGACTGAACGTTGTCTTGGAGTTGGATCTCTGATAGGCTGTCCTCTCT actcgagagtcatcttgagaagactgggtgttattttgtctgtttgttgactggatgagt TTTTCTTTTTTTTACTAAATGATCTAGATATTGCTTTAACCCTCTGCTCAATTTGGTATA GAGACTTAGAGAGGGTTCATGAATCTTCGAAAAGATGGGCTTAACAGGTTTATAAAGCAT agtgaagttgacaattttgtggtgagaagccactgaattgtgataagtcaagtagtgtgg ACATTGAAAAAATGACTAGCTATTAGTTTGTAACTTCTGAGGTTACTATGATGGTGACAA TAAAAGGTCAAGATTAGCATTAAAATGGTAATCTGAAATAATTGATCAGTTAAAGAAGGC GCTGTCCTGAAAGGTTTGGCTGAAAAAAAATCACTTTCAGGTGTTTTCCTCCAAAAAATG attttaaaatcttactgccccgtttgtgttagctgtgaagtactctggaactcagtgaat TGCTGAGATTTTGTACGAGTTATAAGCTGGCTTATATTTAAAAAATTTTTTTGTTTTTGT TTTATGAGTTTCTTTTAAAATGTTATTTATGGTTAATTAAAATAGTTTTTGCATTTTAAA TATTTTATTATTTGTCGAAAATTTAGCTATTTTAATTATAGTTGGAGOTCTCTTTTAGAG CTGACATAAGAGCATAGGGGAGGCACAGATAGATGTGATGGAGGGCTGTAGGAGAGGGGG GCAGTATCTTATAGTGGGTTGCCTTTGCTGATCTTTTTACTAGACTTGAAATTATTTGCT TTTCGTTCCTATGGTTATTTGGGACTATTGAAGTATCACCAGCCCTGTTGAGTTGATCTG TAATATTGTAATTCAAGGGTTACACTAGAAAATAAGAAAGCTAAAACAGCACGATAATCT ttgggtagatgcaagagaataggttttgggaatagttattgttagaactaaagagagggt TGAAAAGAAAATCAGTGAATACTGTCAGCATGTGAGTTCAATAAAACGTGAAGTACATTT | TTAGGGCAATTGATGGACTAATTGTAAAGCAAGTTTTGGTTGGTTTTTGAG AAC GGA
AGA AAC CCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG COT GTT TTG GTG GAT ATC
---------------------1 N T R Ã O 2TTG AAG AAC TGG AAA GAG GTAAGCTAAGTATTTCGATTTGGTTGATTTTGCTGT
TGCTTATTTTCTGGTGGATGAATTGACACCAACCTCTCTTTGTGCTCTTTTCTCCCTAG
GAT AGT GAC AAA AAA ATA ATT CAG AGC CAA ATC GTC TGC TTC TAC
TTC AAA CTC TTT GAA AAG TTG AAA GAT AAC GAG GTC ATT CAA AAG
AGC ATG GAC ACC ATC AAG GAG GAC GTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC
AGC AGC ACC AGC AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT
-----------1 Ν T R Â 0 3-------------------------------CCG GTGAGGAGATCTTAATTCTTTCTTTGGTTTCATTAOAGAGGTTCTTGCAAAGTGCT
TACGTCCGAGAAAGTAGAAATGAACTATGAAATGAAGCCGTGGCCAAAACTCCTCCTTCC TAATTCCATTTGTGGTTTGAGAGACTTTGCTAAGTCAGTATGGGAATCATTTAAATTTGT GATTTGGGGAAATGCTGGCACTATGACTACTGCACAAAGGCAGGTGAAGGGACAAATCCA GTGAGGAGGGGGCAGTGAAGAAGTGGAGGGGAGTCTGGAGAAGCAGGTGTCTCCTTGGCC CTTGTTCGTGAGATGAAATCCTCCTGCTTTGGATGGGAGGCTGCGTGTCTTGGTGGAAAG
AGCAGTGGGAGGAGGGAGAAGATTTGTGGTCCTCCCAGCTCAGCCACaAAGAAACTGTGA ( CGTGAGATGAATCACAGGCCTGGCTGGGGCTCAGTTTCCTCATCTTAAAAGAGGCCTATT gggttcactaaaatttctatgatcttctttgctctataatcctacaattctgtggacaga aaatgaaatgaggtaggagaaagaaatagcctttgaagaggttcttgggcattccactgc
CAGGCTCTGGTCAACCTTCATACTCTGCAGCCCAAGAAGAGGCAAGACCATTTGTCTGTT TTTGGAAATGCAAATAGGCGGCATTTATACCTCACGAAAGAACTGTTCTGTCAACTTTTG gatactgggctatcttggctggagaaatccttaggctcccaaactttctctcatgaaatt gtcttgagtctttaaatttatggcttctcgaagctgagagataáctttaággataaagac aaattacattttccaacattttgtctaagagacaaagacctccacatgcgtttgggtttg GCGTGGATCTAAATGGGCTTGAATGAGAAGGGGAGGGTGTTGTTATGACTATGTTTAGAA GAGAAAAGAGAGGTTTGGAGAGGTTAAGTGGCTGGTTGAAAGTCAGAGTTATTGOACACA OAGGATTCGAACCCATATGTTTTGTCCCTCCACTTTAGGGTTCTTTTCGCTAOATAATTT TGAGAATTCTGTACGAGTGAATTTAAGGATGTGTGATGTTCCCGATCCTATTAGAGCACA ACCAGCAATTTAATTATAATTTTAGTCTTAACTGCTGAAGAAAGCAGCATTACATATTAA I GCTAACATATTCCTGGTGAAAGCAACTTTTTGAAAGGAATATTTCTATTTTCATGGACCA
TGACAGTAGCACAGCCTGATGGCTTGTATGCCTGAAACTAATTTTGCTGTTTTCTTTCCC
AATAG GTA AAT GAT CTG AAG GTC CAG GGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC
ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG
CGG AAG AGG AGT CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA
TAG
ou
1 5 10 15
TAT TAG TGC CAG GGC GGG TTT TTT AAA GAA ATA GAA AAG GTA AAG
20 25 30
GAA TAT TTT AAC GGA AGA AAC GCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG COT
35 40 45
CTT TTC CTG GAT ATC TTG AAG AAC T6G AAA GAG GAT AGT GAG AAA
50 55 60
AAA ATA ATT CAG AGC CAA ATC GTC TCG TTC TAC TTC AAA GTC TTT
65 70 75
GAA AAG TTG AAA GAT AAG GAG GTC ATT CAA AAG AGC ATG GAG AGC
80 85 90
ATO AAG GAG GAG GTG TTG GTT AAG TTG TTT AAG AGG AGC AGC AGG
95 100 105
AAG GTG GAA GAG TTG GAA AAG GTG ATT GAG ATT CGG GTA AAT GAT
110 115 120
GTG AAG GTC CAG CGG AAA GOA ATA AGT GAA GTC ATO AAA GTG ATG
125 130 135
AAT GAT GTG TCG CCC AAA GGT AAC CTG AGG AAG GGG AAG AGG AGT
140 145
CAG AAT GGA TTT GGA GGG GGG AGA GGG TTG CAA TAG
ou
-1 1 5 10
ATG TAG TAC 1 TGC ι GAG ι GGT ' GGT ' TTG 1 TTT AAA ι GAA ATG GAA AAG ' OTG .
20 25 30
GAA TAC TTC AAC GGT CGT AAC CGA GAG GTT GGT GAG GGT GGT GGG
35 40 45
CTG TTC GTG GAC ATG GTG AAA AAG TG6 AAA GAA GAG TCT GAG AAA
50 55 60
AAG ATC ATC GAG TCT CAG ATC GTT TGT TTG TAG TTC AAA GTG TTC
65 70 75
GAA AAC CTG AAA GAG AAC GAG GTT ATC CAG AAA TGG ATG GAC ACT
80 85 90
ATG AAA GAA GAT CTG TTG GTT AAA TTG TTC AAC TCG TGG ACT TCT
95 100 105
AAA CTG GAA GAG TTC CAG AAA CTG ATG CAG ATC CCA GTT AAG GAG
110 115 120
CTG AAA GTT GAG CGT AAG GCT ATC TGT GAA CTG ATC AAA GTT ATG
125 130 135
AAG GAG CTG TGT CCA AAA GCT AAC GTG CGT AAA CGT AAA GGT TGT
140 145
CAG AAC GCA TTC CGT GGT CGT CGT GCT GTT CAG TAA
ou
-1 1 ATG CAG GCT GCT TTC ! 5 TTT AAA GAA ATC 10 GAA AAC ' CTG AAA GAA TAC 0
20 25 30
AAC GGT CGT AAC CCA GAG GTT GGT GAG GGT GGT CCG CTG TTG CTG
35 40 45
GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA AAG ATC ATC
50 55 60
GAG TCT CAG ATC GTT TGT TTC TAC TTC AAA CTG TTC GAA AAG GTG
65 70 75
AAA GAC AAC CAG GTT ATG CAG AAA TCG ATG GAC ACT ATC AAA GAA
80 85 90
GAT CTG TTC GTT. AAA TTC TTC AAG TCG TGG ACT TGT AAA GTG GAA
95 100 105
GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC CTG AAA GTT
110 115 120
CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA GTG ATC AAA GTT ATG AAG GAG CTG
125 130 135
TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT CAG AAC CGA
140 143
TTC CGT GGT GGT GGT GCT GTT GAG TAA
eventualmente contendo adicionalmente a sequência guia
ATG AAT TAT AGA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GGG ATT
TTG GGT TCT TCT ACC
ou a sequência ATG,
- moléculas de ADN que hibridam com uma das moléculas de ADN acima referidas sob condições que permitem o reconhecimento com um grau de homologia superior a 85^t de preferência superior a 90%, podendo estas moléculas de ADN ter origem natural, sintética ou semi-sintética e que podem ser relacionadas cnm estas moléculas de ADN, por mutação, por substituição de nucleótidos, por supressão de nucleótidos, por inserção ou inversão de nucleótidos e que codificam para polipeptídeos com a actividade biológica e imunológica do EqlFN-gama.
Um processo para a preparação de: moléculas que contêm os nucleótidos:
EG-1 ou 5’-TACTAOTGGG AGGCTGCTTT GTTTAAAGAA ATCGAAAACC TGAAAGAATA GTTGAACGGT GG-3’
EG-2 5 ’-TTGAAGTATT CTTTCAGGTT TTCGATTTCT TTAAAGAAAG GAGCGTGGGA GTAGTA-3*
ou
EG-3 5’-TAAGCGAGAG GTTGGTGACG GTGGTGCGCT GTTCCTGGAC
ATCGTGAAAA ACTGGAAAGA AGAGTCTG-3’
ou
EG-4 5»-TTCTTTCCAG TTTTTCAGGA TGTCGAGGAA CAGGGGACGA
CCGTCACCAA CGTGTGGGTT ACGAGGG-31
ou
EG-5 5’-ACAAAAAGAT CATCCAGTCT GAGATGGTTT CTTTCTAGTT
GAAAGTGTTC GAAAACGTGA AAGACAACC-3 '
ou
EG-6 5’-TTTGAGGTTT TCGAACAGTT TGAAGTAGAA AGAAACGATC
TGAGAGTGGA TGATCTTTTT GTCAGAGTC-3’
ou
EG-7 5’-AGGTTATCGA GAAATCGATG GAGACTATGA AAGAAGATGT
GTTCGTTAAA TTGTTCAAGT GG-3 ’ ou
EG-8 5‘-TGGAGGAGTT GAAGAATTTA ACGAACAGAT OTTGTTTGAT
AGTGTCCATC GATTTCTGGA TAACCTGGTT GTO-3’ ou
EG-9 5'-TGGACTTCTA AAGTGGAAGA CTTCGAGAAA. GTGATCGAGA
TCCCAGTTAA CGACCTGAAA-3’ ou
EG-1O 5’-GCTGAACTTT GAGGTCGTTA AGTGGGATGT GGATGAGTTT
CTGGAAGTGT TCCAGTTTAG AAG-3’ ou
EG-11 5’-GTTGAGGGTA AGGGTATGTC TGAACTGATC AAAGTTATGA
AGGACCTGTC TGGAAAAGCT AA-3’ ou
EG-12 5’-GGCAGGTTAG GTTTTGGAGA CAGGTCGTTC ATAACTTTGA
TGAGTTCAGA GATAGCOTTA G-3’ ou
EG-13 5’-CCTGCGTAAA GGTAAAGGTT CTCAGAACCG ATTGGGTGGT
CGTGGTGGTC TTCAGTAAG-3’ ou
EG-14 5’-GATCCTTAGT GAAGAGGAGG ACGACGAGGG AATGGGTTCT
GAGAAGGTTT ACGTTTA-3 * ou
EG-15 5’-CAGGGTGGTT TCTTTAAAGA AATGGAAAAG GTGAAAGAAT
AGTTCAAGGG TCG-3’ ou
EG-16 5’-TTGAAGTATT GTTTCAGGTT TTGGATTTGT TTAAAGAAAG
GAGGGTG-3’
qu© codificam para domínios parciais do EqlFN-gama e dos poli peptídeos codificados por estas moléculas de ADN·
- moléculas de ADN que hibridam com uma das moléculas de ADN acima referidas sob condições que permitem o reconhecimento com um grau de homologia superior a 85%, de preferência superior a 90%, podendo estas moléculas de ADN ter origem natural, sintética ou semi-sintética e que podem ser relacionadas com estas moléculas de ADN por mutação, por substituição de nucleótidos, por supressão de nucleótidos, por inserção ou inversão de nucleótidos e que codificam para domínios parciais do EqlFN-gama, bem como dos polipeptídeos codificados por estas moléculas de ADN.
Um processo para a preparação de moléculas de ADN recombinante, por exemplo vectores, de preferência plasmídeos, que contêm:
- uma inserção que codifica para um dos polipeptídeos acima referidos;
- uma molécula de ADN acima referida;
- uma molécula de ADN acima referida em ligação funcional com uma sequência de regulação de expressão, replicáveis em microorganismos, como sejam organismos procarióticos, por exemplo E. coli, organismos eucarióticos, por e xemplo Saccharomyces cerevisiae, e células de mamíferos, por exemplo células de cavalo;
- pelo menos duas das moléculas de ADN designadas por EG-1 a EG-16 acopladas em qualquer combinação entre si ou em ligação funcional com uma sequência de regulação de expressão, replicáveis em microorganismos, como sejam organismos procarióticos, por exemplo E. coli, organismos eucarióticos, por exemplo Saccharomyces cerevisiae, e células de mamíferos, por exemplo células de cavalo;
Um processo para a preparação de moléculas de ADN recombinante, como sejam os plasmídeos pAHlll, pRH281/5,
pRH282/5, pGNl, pGN3, pGN20, pEqG-QAA2 ou pEQG-QAA3.
Um processo para a preparação de organismos hospe. deiros transformados com uma das moléculas de ADN recombinante acima mencionada^ por exemplo organismos procarióticos, de preferência E. coli, especialmente E. coli JM1O1 ou HB101, or ganismos eucarióticos, por exemplo Saccharomyces cerevisiae, ou linhas de células de mamíferos, por exemplo linhas de célu las de cavalo.
processo da presente invenção para a preparação de polipeptídeos caracteriza-se por
a) transformarem-se organismos hospedeiros, por exemplo os organismos acima referidos, com informação genética que codifica para os polipeptídeos mencionados, de preferência com as moléculas de ADN recombinante acima referidas,
b) expressar a informação nos organismos hospedeiros resul tando na produção dos polipeptídeos mencionados e
c) isolar os polipeptídeos produzidos.
São ainda abrangidos no âmbito da presente invenção:
Um processo para a preparação de um agente terapêutico para o tratamento por exemplo de cavalos caracterizado por se incorporar como princípio activo uma quantidade activa de um polipeptídeo obtido de acordo com o processo da presente invenção juntamente com substancias veiculares farma cêuticas inertes.
Um processo para a preparação de anticorpos monoclonais contra os polipeptídeos da presente invenção caracterizado por se imunizar um animal hospedeiro com um destes polipeptídeos, provocar a fusão de linfócitos B do referido ani mal hospedeiro com células de mieloma, subclonar as linhas de
células híbridas que segregam os anticorpos monoclonais e cul tivar as referidas linhas de células híbridas in vitro ou in vivo.
Um processo para a preparação de linhas de células que segregam os anticorpos monoclonais contra os polipeptídeos da presente invenção.
Um processo para a preparação de anticorpos monoclonais que neutralizam integralmente ou em parte a actividade dos polipeptídeos da presente invenção ou que se ligam especificamente a um dos referidos polipeptídeos.
Um processo para a preparação dum agente terapêutico caracterizado por se incorporar um anticorpo monoclonal obtido de acordo com o processo da presente invenção.
Um processo para a análise qualitativa e/ou quanti tativa dum dos polipeptídeos da presente invenção caracteriza do por se utilizar para a análise um anticorpo monoclonal obtido de acordo com o processo da presente invenção.
Um processo para a purificação dum dos polipeptídeos da presente invenção mediante a utilização dum dos anticorpos monoclonais acima referidos.
Um processo para a preparação dum conjunto de aná lise (”test kit”) para a análise dos polipeptídeos da presente invenção contendo um dos anticorpos monoclonais acima refe ridos.
Legendas das figuras:
Figura 1: Sequência de ADN do fragmento BamHI de 4664 pb de comprimento de lambda Eq-^2. Dá-se a sequência de á eidos aminados codificada e a localização dos in- 50
troes. Os ácidos aminados com numeração negativa in dicam o peptídeo de sinal hidrófobo. 0 único local potencial de N-glicosilaçao do EqIFN-)f maduro na po sição 86-88 está sublinhado. As sequências CCATC e TATAAAA importantes para a ligação da polimerase de ARN estão sublinhadas, bem como duas sequências de sinal para a poliadenilação do ARNm (AATAAA).
Figura 2: Comparação da sequência de ácidos aminados de inter ferões gama de diferentes espécies. Os ácidos amina dos contendo a letra ”S” antes da numeração indicam o peptídeo de sinal. A sequência de consenso” é apresentada em letras maiúsculas para os ácidos aminados que são idênticos em todos os interferões gama e em letras minúsculas para os ácidos aminados que ocorrem em mais de 75^ dos interferões gama.
Figura 35 Representação esquemática dos oligonucleótidos usados para a síntese total do gene do interferão gama de cavalo. E apresentado o comprimento de cada oligonucleótido bem como a respectiva numeração. Os sí tios de corte por restrição que ocorrem uma única vez n.o interior do gene sintético estão numerados.
I Figura 4í Comparação das sequências que codificam para o EqlEN maduro do gene natural (eq) e do gene sintético (syn) optimizado para a expressão em E. coli. As ba ses em que se verificam diferenças estão marcadas com asteriscos.
Figura 5: Quadro da utilização de codões para o EqIFN-ΙΓ maduro. Na fila da esquerda indica-se a primeira base, no meio a segunda base e à direita a terceira base do codão. 0 quadro apresenta o número dos codões usados para cada ácido aminado no gene natural bem como, entre parêntesis, o número dos codões usados do gene sintético.
Figura 6: Construção do plasmídeo de expressão pRHlOO.
Figura 7: Construção © mapa de restrição do plasmídeo pGN20.
Os exemplos que se seguem destinam-se a elucidar a invenção em pormenor, sem de qualquer modo restringir o seu âmbito.
Materiais
Os materiais de partida foram em parte adquiridos no comércio e em parte obtidos do EMBL, em Heidelberg. As estirpes E. coli JM1O1, pUC9 e M13mp8 são originárias dos Bethesda Research Laboratories, as estirpes de E. coli com o fac tor de supressão sup F, por exemplo E. coli NM526, 538 e 539 e o vector lambda-EMBL3 ou 3A são originários do EMBL e podem também ser obtidos da firma Stehelin de Basileia (Suiça).
1. Isolamento do ADN de cavalo
Moeu-se tecido de cavalo congelado, por exemplo fígado de cavalo, em azoto líquido até se obter um pó fino e incubou-se em EDTA 0,5 M, tris.HCl 10 mM a pH 8,0, SDS a 0,5 $ e 0,1 mg/ml de proteinase K (20 ml/g de tecido) duI rante 3 horas a 55°C. A solução viscosa obtida foi liberta, da de proteínas por uma extracção com fenol e 3 extracções com fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25/24/1 em volume), foi dialisada contra tris.HCl 50 mM a pH 8,0, EDTA 10 mM e NaCl 10 mM e o ADN foi precipitado com 2 volumes de etanol. Após secagem completa sob vácuo, dissolveu-se o ADN em tampão TE (tris.HCl 10 mM a pH 8,0 e EDTA 1 mM) a 4°C e centrifugou-se com 1,273 g de CsCl/ml de solução durante 62 horas com 40 000 rpm a 20°C (rotor Sorvall 50Ti)o 0 gradiente de CsCl foi retirado gota a gota, as fracções contendo o ADN foram dialisadas contra tampão TE e em seguida o ADN foi precipitado com dois volumes de etanol, la vado com etanol a 70 seco e novamente dissolvido em tam pão TE (4°C).
preparado final de ADN apresentou-se isento de
ARN e tinha um comprimento superior a 50 kb (determinado por electroforese num gel de agarose a 0,45%)·
2. Digestão parcial com endonucleases e fraccionamento primitivo de ADN de cavalo
Incubaram-se duas vezes 50 jug de ADN de cavalo com 1,6 unidades de Sau3A em 450 Jul de meio reaccional (tris.HCl 10 mM a pH 7,5, MgOlg 10 mM e ditiotreitol 1 mM) a 37°0. Depois de 15, 25 e 40 minutos colheram-se alíquotas de 150 μ! e trataram-se com EDTA 15 mM. Por aquecimento durante 10 minutos a 70°C provocou-se a paragem da reac ção. Depois de adicionar acetato de sódio 0,3 M a pH 6,0 precipitou-se o ADN com 2,5 volumes de etanol. Após nova dissolução em tampão TE, o ADN foi separado por dimensão por electroforese em gel de agarose a 0,45 % em tampão ΤΒΞ (tris a 10,8 g/1, ácido bórico a 5,5 g/1, EDTA dissódico a 0,93 g/1) a cerca de 1 V/cm dum dia para o outro. De acordo com marcas de dimensão (ADN lambda digerido duplamente com EcoRI e HindIII e digerido com HindIII) a placa de gel com o ADN foi cortada no comprimento correspondente a 10 a 23 kb, o ADN foi isolado a partir do gel por electroeluiI ção num tubo de diálise durante 3 horas a 300 V (tampão
TBE 0,1 x) e purificado numa coluna de Elutip-D (Schleicher und Schull) de acordo com as instruções do fabricante e finalmente foi precipitado com etanol.
A fim de evitar a ligação dos fragmentos de ADN de cavalo entre si, que poderia levar por um lado a híbridos artificiais de sequências de ADN de cavalo e por outro lado a fracções de ADN demasiadamente grandes e portanto já não susceptíveis de serem acondicionadas em fagos lambda, as fracções de ADN de cavalo fraccionadas de acordo com a dimensão foram desfosforiladas. Rara esse fim, o ADN foi incubado em 140 pl de meio reaccional (tris.HCl 50 mM «τΙ\'ϊ
pH 9,5, MgClg 10 mM, acetato de zinco 0,1 mM, espermidina mM) com 5 unidades de fosfatase intestinal de bovino (BIP) durante 30 minutos a 37°C e, depois de se adicionarem mais unidades da enzima, foi novamente incubado durante 30 minutos. Após adição de EDTA até uma concentração final de 25 mM o ADN foi extraído 1 vez com fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25/24/1 em volume), 2 vezes com clorofórmio/álcool isoamílico (24/1 em volume) e 3 vezes com éter dietíli co, precipitado com etanol, seco e dissolvido em tampão TE 0,1 x ·
3. Formação do banco de ADN do genoma de cavalo
Os fragmentos de ADN de cavalo desfosforilados de 10 a 23 kb foram clonados num vector lambda, por exemplo em lambda-EMBL3 ou lambda-3A (Frischauf, A.M. et al. J. Mol. Biol., 170, 827-842 (1983)) com extremidades coesivas G-A-T-C, obtidos por eliminação do fragmento BamHI interno do ADN do fago.
vector foi cultivado numa estirpe de E. coli com o factor de supressão sup F, por exemplo em E. coli NM526, 538 ou 539 (Frischauf, A.M. et al. J. Mol. Biol., 170, 827-842 (1983)), em meio LB (Miller; Experiments in Molecular Genetics; Oold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York) com MgSO^ 5 mM, foi precipitado com poli etilenoglicol e foi purificado por dupla centrifugação em gradiente de densidade com CsCl (solução de CsCl a 0,71 g/ /ml, 40 horas a 45 000 rpm, 20°0). Após diálise contra tam pão TE o ADN fágico foi libertado das proteínas por duas extracções com fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25/24/ /1 em volume) e duas extracções com clorofórmio/álcool iso. amílico (24/1 em volume) e foi isolado por precipitação com etanol.
Para obtenção do fragmento final de EMBL3A digeri ram-se integralmente com BamHI 50 pg de ADN fágico durante
horas a 37°C em 450 μΐ de meio de reacção (tris.HCl 10 mM pH 7,5» MgClg 10 mM, ditiotreitol 1 mM), provocou-se a paragem da reacção com EDTA 15 mM durante 10 minutos a 70° C e o ADK foi precipitado com etanol.
A fim de evitar nova ligação, o fragmento médio foi ainda cortado com EcoRI e o oligonucleótido lateral foi eliminado por precipitação com isopropanol.
ADIT lambda digerido com BamHI foi digerido inte gralmente com EcoRI durante 2 horas a 37°C em 450 μΐ de tris.HCl 10 mM a pH 7,5, UaCl 100 mM, MgClg 10 mM e a reaç. ção foi feita parar por adição de EDTA 15 mM e aquecimento durante 10 minutos a 70°C. Após adição de acetato de sódio até uma concentração final de 0,3 M, os 3 fragmentos maiores foram precipitados com 0,6 volumes de isopropanol durante 15 minutos a 0°C, lavados 2 vezes com acetato de sódio 0,45 M/0,6 volumes de isopropanol e 1 vez com acetato de sódio 0,3/2,5 volumes de etanol e dissolvidos em 15 μΐ de tampão TE 0,1 x. Os adaptadores BamHl/EcoRI ficam, com esta técnica, em solução. Os fragmentos de EMBL3A (8 pg) são misturados com cerca de 5 pg de ADIT de cavalo de 10 a 23 kb e com 10 unidades de ligase de ADIT T4 (UEH), incuban do-se dum dia para o outro a 14°C e durante um dia a 4°C em 50 μΐ de meio de ligação (tris.HCl 66 mM pH 7,2, HaCl 0,1 M, MgClg 10 mM, EDTA 1 mM ditiotreitol 5 mM, ATP 0,5 mM). A mistura de ADIT ligada foi acondicionada em partículas maduras de fago lambda por meio dum sistema de acondicionamento lambda in vitro (Scalenghe, F, et al., Chromoso ma, 82, 205-216 (1981)).
Os componentes deste sistema, isto é, o extracto por ultra-sons (SE), o lisado por congelação-descongelação (FTL) e os tampões Ml e A foram preparados de acordo com
Scalenghe, F. et al. em Chromosoma, 82, 205-216 (1981). In cubaram-se alíquotas de 10 μΐ da mistura de ADIT ligado du- 55 -
rante 2 minutos à temperatura ambiente com 25 p.1 de SE, que tinha sido descongelado durante 30 minutos, trataram-se com 100 jal de FTL, igualmente descongelado durante o mesmo período, e incubaram-se novamente durante 60 minutos è tem peratura ambiente. A mistura de acondicionamento foi diluí da com 150 μΐ de diluente lambda (tris.HCI 100 mM pH 7,5, MgSO^ 10 mM, EDTA 1 mM) e foi conservada a 4°C.
4. Clonagem e sequenciação do gene do interferão gama de cavalo (EqINF-fr)
A. Isolamento dum clone do gene integral do EqlFN-^ banco de ADN de cavalo foi utilizado para infeç. ção da estirpe E. coli NM528 (supF). Uma cultura bacteriana, conservada em lavagem dum dia para o outro em meio LB (10 g/1 de triptona, 5 g/1 de extracto de levedura, 10 g/1 de NaCl, pH 7,4) com 0,2 % de maltose, foi ajustada em MgSO^ 10 mM a uma densidade óptica (600 nm) de 2,0. Amostras de 0,5 ml desta suspensão foram infectadas com 50 000 pfu (unidades de formação de placas) de fagos lambda da bi blioteca de ADN e foram distribuídas com uma camada de agar brando de LB sobre placas de agar de LB com MgSO^ 10 mM (diâmetro 13,5 cm). No total submeteram-se a selecção
1,5 χ 10θ fagos lambda recombinantes. Depois de incubados dum dia para o outro a 37°C foram preparadas a partir dos fagos de cada placa duas réplicas em nitrocelulose (Benton e Davis, Science, 196: 180-182, 1977). Após desnaturação do ADN fágico (1 min em NaOH 0,5 N, NaCl 1,5 M), neutralização (2 vezes 3 min em tris.HCl 0,5 M pH 7,5, NaCl 1,5 M) e enxaguamento (1 min em 2xSSC, IxSSC, NaCl 0,15 M, citrato de sódio 15 mM), os filtros foram secos ao ar e o ADN foi fixado por aquecimento durante 2 horas a 80°C. Os filtros foram lavados dum dia para o outro a 65°C numa solução de NaCl 1,5 M, tris.HCl 10 mM a pH 8,0 e SDS a 0,1 % e foram pré-hibridados durante 4 a 6 horas a 65°C (solução de hibridação: NaCl 0,9 M, NaHglO^ 50 mM, pH 7,4, EDTA 5
mM, ficol a 0,1 $, polivinilpirrolidona a 0,1 %, albumina de soro de bovino a 0,1 %, SDS a 0,1 20 mg/ml de ADN de esperma de salmão revestido e desnaturado).
A hibridação teve lugar numa solução fresca com 10^ cpm por filtro duma ”sonda” de HuIFN-^, marcada por isótopos radioactivos de acordo com as técnicas habituais, durante 20 horas a 65°G. 0s filtros foram lavados sob condições não estritas em 3xSS0 com SDS a 0,1 % a 65°C e em seguida foram secos e submetidos a auto-radiografia. Após três pas. sagens de purificação em placa foi possível identificar 5 clones lambda que deram sinais positivos de hibridação.
ADN destes fagos recombinantes isolados foi purificado por métodos habituais (Maniatis et al., ibid.). 0s ADNs fágicos foram caracterizados com diferentes enzimas de restrição e por análise de Southern (Southern, Jo Mol. Biol. 98: 503-517, 1975) por hibridação com a sonda” de HuIFN-^. Isolou-se um único fragmento BamHI do cio ne lambda Eq-^2 de 4,6 kb de comprimento que hibridou e este fragmento foi clonado no sítio de corte BamHI do plasmídeo pUC9 (Vieira e Messing, Gene 19: 259-268, 1982)0 Depois de transformação de E. coli JM101, preparou-se ADN plasmídico a partir das colónias obtidas por meio dum pro cesso de minipreparaçao (Birnboim e Doly, Nucl. Acids Res. 7: 1513-1523, 1979) e este ADN foi caracterizado por digestão com enzimas de restrição. Um plasmídeo com a inser ção BamHI pretendida foi denominado pAHlll. As regiões ex tremas da inserção BamHI do plasmídeo pAHlll foram sequen ciadas depois de integração no vector M13mp8 ou M13mp9 (Vieira e Messing, Gene 19, 259-268, 1982) de acordo com o método de didesoxi (Sanger et al., Broc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467, 1977). Uma comparação de sequências com o gene do interferão gama humano (Gray e Goeddel, Nature 298: 859-863, 1982) mostrou existir ura alto grau de homologia com as regiões não codificantes 5’ e 3*. Em con sequência concluiu-se que se tinha isolado o gene do
EqlFN-^ integral.
B. Sequenciação do gene do interferão gama de cavalo do clone lambda Eq-^2.
A inserção BamHI de 4,6 kb de comprimento do pias, mídeo pAHlll foi sequenciada integralmente de acordo com o método de didesoxi. A sequência integral do fragmento BamHI foi determinada por combinação de sequências parciais de subclones M13 que tinham sido obtidas por clonagem dirigida de fragmentos de restrição (EcoRI, HindIII, Pstl, PstI-BglII, HindIII-BamHI) nos vectores cortados de modo correspondente M13mp8 ou M13mp9. Foram obtidas sequên cias parciais adicionais por clonagem do fragmento BamHI-BglII de 2,0 kb de comprimento ou do fragmento Pstl de 2,0 kb de comprimento no vector M13mp8 pelo método de ”per digonada (shotgun method”). Os dois fragmentos de ADN fo ram desintegrados em pequenos pedaços por ultra-sons, as extremidades dos ADNs foram alinhadas por incubação com po limerase de ADN de E. coli (fragmento de Klenow) na presen ça duma concentração de 0,1 mM dos trifosfatos de todos os quatro desoxinucleótidos (tampão de reacção: tris.HGl 50 mM pH 7,5, MgClg 10 mM, ditiotreitol 1 mM, albumina de soro de bovino a 0,5 mg/ml: 1 h a 25°0). Depois de uma separação em função das dimensões das fracções num gel de agarose, os fragmentos de ADN de comprimento entre cerca de 0,4 e 1,0 kb foram isolados e ligados no sítio de corte Smal do vector M13mp8. As sequências parciais obtidas foram reunidas por meio dum programa de computador na sequên cia total de 4664 pb de comprimento que é apresentada na Fig. 1.
Por meio de análise computorizada do quadro de lei tura aberto e por comparação com genes de interferão gama de outras espécies (Gray e Goeddel, Nature 298: 859-863;
Gray e Goeddel, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 5842-5846,
1983; Dijkema et al., ΞΜΒΟ J. 4: 761-767, 1985; Cerretti
et al., J. Immunology 136: 4561-4564, 1986) determinou-se o domínio de codificação de proteínas do gene do interferão gama equino. A região de codificação de proteínas está interrompida por três intrões, sendo codificados pelo primeiro exão o peptídeo de sinal hidrófobo de 20 ácidos aminados de comprimento e 18 ácidos aminados do polipeptídeo EqlFN-^ maduro (bases 366 a 479). 0 segundo exão codifica para os ácidos aminados 19 a 41 (bases 1639 a 1707), o ter ceiro exão codifica para os ácidos aminados 42 a 102 (bases 1803 a 1985) e o quarto exão codifica para a extremida de carboxi-terminal com os ácidos aminados 103 a 146 (bases 3307 a 3441). Nas posições 4010 e 4020 encontram-se duas sequências de sinal (AATAAA) para a poliadenilação do ARNm. Nas posições 86 a 88 do polipeptídeo EqIFNT-]f maduro encontram-se os únicos sítios potenciais de N-glicosilação (ASN-Ser-Ser), os quais coincidem com os dois sítios de N-glicosilação do interferão gama de bovino (Asn-Gly-Ser) (Fig. 2). 0 polipeptídeo EqIFN-)p maduro contém surpreenden temente apenas um único resíduo de cisteína na posição 3, tendo sido verosívelmente hidrolisados no organismo por via proteolítica os três primeiros ácidos aminados amino-terminais (neste caso Tyr-Tyr-Cys), por analogia com os interferões gama naturais humano e murino.
5. Preparação dum gene sintético para o EglPN-^ maduro
A fim de expressar EqIFN-ft recombinante na sua forma madura em E, coli, foi construído um gene sintético a partir de oligonucleótidos. Este gene codifica para a mes ma sequência que o gene natural do EqlFN-^ com a diferença de apenas conter codões para ácidos aminados que são usados pelos genes próprios de E. coli com alto grau de expressão (Gouy e Gautier, Nucl. Acids Res. 10: 7055-7074, 1982). Adicionalmente foram integrados vários sítios de corte por enzimas de restrição singulares que possibilitam uma fácil manipulação do gene para a alteração de alguns segmentos. 0 gene sintético para o EqIFN-$ foi construído
em duas variantes a partir d.um total de 16 oligonucleótidos diferentes. A primeira variante codifica para o EqlFNmaduro com 146 ácidos aminados mais a metionina de início, a segunda forma para polipeptídeo encurtado na extremidade amino-terminal em 3 ácidos aminados (Tyr-Tyr-Cys) mais a metionina de início, como presumivelmente deveria ocorrer no organismo natural.
A estrutura do gene sintético do EqIFN-$ está representada na Fig. 3· Os oligonucleótidos utilizados para a sua preparação foram sintetizados por meio dum sintetiza_ dor de ADN da firma Applied Biosystems modelo 381A, tendo sido purificados por electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante a 12 % (7 M em ureia) e libertados dos sais residuais por meio de cromatografia através de Sephadex G-25 (Pharmacia).
Reunião dos oligonucleótidos para formação do gene sintético do EqlFN-f
A síntese do gene sintético do EqlFN-Y foi levada a efeito em duas fracções. A primeira parte do gene foi preparada a partir dos oito oligonucleótidos EG-1 a EG-8 até ao sítio de corte Sall e a segunda metade do gene a partir dos seis oligonucleótidos EG-9 a EG-14 a seguir ao sítio de corte Sall até ao sítio de corte BamHI. Para a forma encurtada em três ácidos aminados na extremidade ami no-terminal do EqlFN-^ foram utilizados em vez dos oligonu cleótidos EG-1 e EG-2 os oligonucleótidos EG-15 e EG-16.
Os dois oligonucleótidos complementares entre si foram sempre fosforilados aos pares na extremidade 5*. De cada vez incubaram-se 100 pmol dos dois oligonucleótidos (p. ex. EG-3 e EG-4 ou EG-5 e EG-6, etc.) em 9 jul de tampão de quinase (tris.HCl 70 iriM pH 7,6, MgClg 10 mM, ditiotreitol 5 mM) e 2 μθί de /T^-^P-ZATP (Amersham) com 10 unidades de polinucleótidoquinase T4 (New england Biolabs)
durante 10 min a 37 °C, adicionou-se 1 jul duma solução 10 mM de AT? e incubou-se novamente durante 50 min. a 37 °C. A reacção foi feita parar por aquecimento a 95 °0 durante 10 minutos. A fim de evitar que mais tarde as extremidades do ADN se pudessem ligar, os oligonucleótidos EG-1, EG-15, EG-9 e EG-14 não estavam fosforilados. Foram misturados lo go depois da inactivação da polinucleotidoquinase com o oligonucleótido complementar em cada caso, aquecidos a 95° 0 durante 5 minutos e em seguida arrefecidos à temperatura ambiente.
As misturas dos oligonucleótidos EG-1+2 (ou, para a segunda forma EG-15+16), EG-3+4, EG-5+6 e EG-7+8 foram reunidas, tratados com 1 μΐ de NaCl 5 M, aquecidos durante 5 min a 70°C e arrefecidos à temperatura ambiente. A esta solução foram adicionados 5 jil de ATP 10 mM, 2 pl de ditio treitol, 1,5 μΐ de tampão de ligação lOx (tris.HCl 0,66 M pH 7,2, NaCl 1 M, MgClg 100 mM, EDTA 10 mM, ditiotreitol 50 mM) e 80 unidades de ligase de ADN T4 (New England Biolabs) e incubou-se durante 48 horas a 4°C. 0 decurso da reacção de ligação foi seguido por separação por electrofo rese em gel dos fragmentos de ADN d.uma pequena amostra da reacção num gel de poliacrilamida a 5%> não desnaturante se. guida de auto-radiografia. Do mesmo modo os seis oligonucleótidos EG-9 a EG-14 foram ligados entre si. A reacção foi feita parar por extracção com fenol/clorofórmio e o ADN foi recuperado por precipitação com etanol.
6, Construção do plasmídeo de expressão pRH 100
Todas as reacções enzimáticas foram levadas a efeito nas condições prescritas pelos fornecedores.
Linearizaram-se 7 pg do plasmídeo pER103 (Eva
Dworkin-Rastl et al., Gene 21 (1983) 237-248, EP-A-0 115
613) em 50 pl de meio de reacção com a endonuclease de res trição HindIII. Após uma hora de incubação a 37°C adiciona
ram-se 50 jul de tampão OIP 2x (tampão OIP 2x = tris 20 mM, pH=9,2, EDTA 0,2 mM). Os resíduos de fosfato 5’ terminais foram eliminados por adição de 2 unidades de fosfatase alcalina de intestino de vitela (CIP); incubou-se durante 30 minutos a 45 °G. A reacção foi feita parar por adição de 4 μΐ de solução de EDTA 0,5 mM e de 10 μΐ de tris 1 M a pH= =8,0. As proteínas foram eliminadas por dupla extracção com fenol seguida de uma extracção com fenol/clorofórmio» 0 ADN foi precipitado a partir da fase aquosa apos adição de 0,1 vol. de solução de acetato de sódio 3 M a pH=5,5 e de 250 ml de etanol e 0 precipitado de ADN, depois de sepa rado por centrifugação, foi lavado uma vez com etanol a 70 $. 0 ADN foi seco e 0 sólido obtido foi por fim dissolvido em 20 μΐ de tampão TE (tris 10 mM pH = 8,0, EDTA 1 mM).
Alíquotas de 1 μ§ dos oligonucleótidos preparados por síntese d(AGCTTAAAGATGAGOT) e d(CATCTTTA) foram fosforiladas em 10 μΐ cada uma de solução reaccional com adição de 10 unidades de PNK-T4 (polinucleotidoquinase) e de ATPr 1 mM. A reacção decorreu a 37°C e durou 45 minutos. A reac ção foi interrompida por aquecimento durante 10 minutos a 70 °C.
Misturaram-se amostras de 5 μΐ da solução do pias mídeo e dos oligonucleótidos fosforilaclos e aqueceu-se a mistura durante 5 minutos a 70°C. Em seguida arrefeceu-se a solução a 0°C, adicionaram-se 2 μΐ de tampão de ligase lOx (tris 500 mM, pH = 7,5), MgCl2 100 mM, DTT 200 mM (ditiotreitol), ATPr 1 mM, 500 jag/ml de BSA (albumina de soro de bovino) bem como 2 μΐ de água e 10 unidades de ligase de ADN T4. A reacção teve uma duração de 40 horas e foi le vada a efeito a 4°C. A reacção foi interrompida por aqueci mento durante 10 minutos a 70°C.
μΐ desta reacção de ligase foram digeridos numa solução com 0 volume total de 30 μΐ com 10 unidades da en-
donuclease de restrição Saci (New Bngland Biolabs) durante 3 horas a 37 °C. A reacção foi interrompida por aquecimento durante 10 minutos a 70°C. 5 μΐ desta mistura reaccional foram submetidos a ligação num volume total de 30 μΐ com 10 unidades de PNK-T4 a 14°0 durante 16 horas.
Trataram-se 200 μΐ de células competentes de E. coli HB101 com 10 μΐ desta reacção de ligação. As bactérias foram conservadas 45 minutos no gelo e em seguida aquecidas durante 2 minutos a 42 °C, a fim de permitir a absorção do ADN. Em seguida a suspensão bacteriana foi novamente incubada durante 10 minutos a 0°C. Por fim as bactérias transformadas foram depositadas num meio de agar de LB contendo 50 pg/ml de ampicilina.
Das colónias de bactérias resultantes foram escolhidas 12 aleatoriamente e isolaram-se os plasmídeos destas colónias em microescala (Birnboim e Doly, Nucl. Acids Res, 7 (1979) 1513-1523). 0 ADN resultante foi cortado com a endonuclease de restrição Saci e foi separado num gel de agarose (1 $, tampão de PBE Ix). A migração do ADN como uma molécula linear de cerca de 4 400 pb de dimensão confirma a integração dum sítio de reconhecimento Saci no plss mídeo. Um destes plasmídeos foi escolhido aleatoriamente. Transformou-se novamente E. coli HB101 com ADN proveniente duma minipreparação a partir deste plasmídeo. Seleccionou-se uma colónia das bactérias transformadas resultantes e cultivou-se esta em maior escala. 0 plasmídeo daí isolado foi cortado com as endonucleases de restrição EcoRI e BamHI, separou-se o ADN num gel de agarose a 1 % e o fragmento menor foi isolado do gel por electroeluição. Este fragmento de ADN EcoRI-BamHI de cerca de 460 pb foi sequen ciado de acordo com Sanger (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (1977) 5463-5467). 0 plasmídeo assim isolado foi denominado pRHlOO.
7· Integração do gene sintético de EqlFN- , no plasmídeo de expressão pRHlOO
Cortaram-se integralmente com Saci 10 pg do plasmídeo pRHlOO em 100 pl de tampão de reacção e em seguida inactivou-se a enzima por aquecimento durante 10 minutos a 70°C. As extremidades salientes do ADN foram alinhadas por tratamento com o fragmento de Klenow (Amersham) na presença dos trifosfatos dos quatro desoxinucleótidos cada um na concentração de 10 mM (30 min a 25°C). A reacção foi feita parar por extracção com fenol/clorofórmio e o ADN foi concentrado por precipitação com etanol. Por meio deste trata mento resultou na junção do promotor de triptofano uma extremidade truncada que termina com o codão de início de tradução ”ATG”. 0 ADN plasmídico foi recortado com BamHI e a fracção correspondente ao vector foi isolada num gel de agarose.
Misturaram-se 50 ng do vector plasmídico pRHlOO obtido como descrito com 20 pmol dos oligonucleótidos EG-1 a EG-8 e EG-9 a EG-14 e incubou-se a mistura em 10 pl de tampão de ligação (tris.HCl 66 mM pH 7,2, NaCl 100 mM, MgClg 10 mM, EDTA 1 mM, ditiotreitol 5 mM, ATP 1 mM) com uma unidade de ligase de ADN T4 (Boehringer Mannheim) durante 24 horas a 14°C. Transformaram-se células de Eo coli JM101 tornadas competentes por tratamento com cloreto de cálcio e incubou-se dum dia para o outro a 37 °C. A partir dos transformantes obtidos isolou-se o ADN plasmídico por um processo de minipreparação e comprovou-se a estrutura da inserção HindIII-BamHI por análise de restrição e sequenciação. Um plasmídeo com a estrutura pretendida para a expressão do EqlFN-J' maduro foi denominado pEqG-YYCle De modo completamente análogo clonaram-se os oligonucleótidos EG-15, 16 EG-3 a EG-8 e EG-9 a EG-14 no vector pRHlOO a fim de se obter o EqlFN-^ encurtado em três ácidos aminados . Um plasmídeo com a estrutura pretendida foi denominado pEqG-QAAl.
8. Expressão da actividade de interferão por Ξ. coli JM101 contendo o plasmídeo pEq-YYOl ou o plasmídeo pEqG-QAAl
Incubaram-se 100 ml da cultura bacteriana a 37°C com agitação vigorosa no seguinte meio isento de triptofano (composição por litro de meio): 10 g de (Nl-I^gPO^, 3,5 g de KgPO^ a pH 7,3 com NaOH, 0,5 g de NaCl, 21 g de ácidos casamínicos (hidrolisados por ácido), 11 g de glucose, MgS04 1 mM, CaCl2 0,1 mM, 1 mg de tiamina.HCl, 20 mg de L-cisteína, 20 mg de ácido 3-β -indolacrílico (IAA, indutor para o operão do triptofano), e opcionalmente 50 a 100 mg de ampicilina. Em seguida concentrou-se a massa bacteriana por centrifugação durante 5 minutos a 4000 rpm, suspendeu-se com 1/10 do volume da cultura de tris.HOl 50 ml·.'! a pH 8,0 e NaOl 30 mM e destroçaram-se as células por meio de uma sonda de ultra-sons (20 kHz, 100 Watt) com arrefecimen to duas vezes durante 30 segundos. Os resíduos celulares foram eliminados por centrifugação a 10 000 rpm durante 10 minutos (4°C) e o sobrenadante foi analisado depois de esterilizado por filtração a fim de determinar a actividade de interferão, medindo o efeito citopático (OPE) do vírus vesicular da estomatite (VSV) ou do vírus da encefalomiocardite (EMOV).
Sistema de ensaio: Oélulas NBL-6 (ATOO COE 57, células de epiderme de cavalo)/VSV A549 (ATOO OCL 185, linha de células do carcinoma do pulmão humano)/ /EMCV título em células A 549 foi normalizado em unidades internacionais com padrão de interferão humano.
9. Detecção do interferão de cavalo expresso por marcação das proteínas em células maxi
As proteínas codificadas por plasmídeos podem ser
marcadas selectivamente in vivo por utilização da técnica de células Maxi. Transformou-se Ξ. coli GSR603 segundo as técnicas habituais com os plasmídeos de expressão e as bactérias transformadas foram seleccionadas em placas de a gar contendo ampicilina. A preparação das células Maxi e a marcação da proteína foram levadas a efeito de acordo com o procedimento de A. Sanear (ver acima). As células foram cultivadas em 15 ml de meio (ver Exemplo 8) sem ácido indo lacrílico a 37 °C até uma ΰΟθθθ ητη=0,5 e 10 ml desta cultura foram irradiados numa cápsula de Petri durante 5 segundos a 50 cm de distancia duma lâmpada germicida de UV (15 Watt) com agitação oscilante e foram em seguida incubados de novo durante uma hora a 37°G. As culturas foram tratadas com 100 jug/ml de D-cicloserina e foram em seguida incu badas durante 14 horas a 37 °G, recolhendo-se depois as bac térias por centrifugação. As células foram lavadas duas ve zes com 5 ml de solução salina de Hershey, foram suspensas em 5 ml de meio de Hershey com 20 pg/ml de ácido indolacrí lico e foram incubadas durante 2 horas a 37 °G. A cada cultura foram adicionados 5 pCi/ml de '^S-metionina (1000 Gi/ /mmol) e agitou-se durante uma hora a 37°G. As células foram separadas e lisadas num tampão de electroforese conten do SDS e 2-mercaptoetanol e as proteínas foram separadas
I num gel de poliacrilamida a 15
Solução salina de Hershey (por litro) Meio de Hershey (por
100 ml de solução salina de Hershey)
5,4 g de UaGl 2 ml de glucose a 20 %
3,0 g de KC1 0,5 ml de treonina a 2 %
1,1 g de NH4G1 1,0 ml de leucina a 1 %
15 mg de CaGl2.2H20 1,0 ml de prolina a 2 %
0,2 g de MgCl2.6H20 1,0 ml de arginina a 2 %
0,2 mg de FeCl^.óHgO 1,0 ml de tiamina . a 0,1 %
mg de KH2P04
12,1 g de tris.HCl pH 7,4
Obteve-se um auto-radiograma do gel seco depois de 2 dias de exposição sobre película de raios X Dupont Gronex utilizando uma folha de ampliação Kodak lanex-Regular a -80°G, Gomo padrão de peso molecular usou-se uma mis tura de proteínas “^G-metilada (Amersham). Para comparação utilizaram-se o plasmídeo pER103 que apenas contém o promo tor sem gene do interferão e o plasmídeo pER21/l, que contém duas cópias do gene humano do IPN-tX2arg.
1θ· Detecção de sequências com que hibridam com EqIFN-Τ no ADN genómico de cavalo
Para a detecção do número total de sequências no genoma de cavalo que apresentam alto grau de homologia com o gene do interferão EqIFN-)£ procedeu-se como se segue. Di geriram-se integralmente 30 jug de ADN de cavalo de alto pe so molecular (Exemplo 1) com 100 unidades das enzimas de restrição correspondentes em 300 μΐ de volume de reacção, e amostras de 10 μg deste ADN cortado foram separadas uma em cada pista dum gel de agarose a 0,8 % de acordo com a dimensão dos fragmentos.
Depois de transferência de Southern sobre filtros de nitrocelulose, desnaturação e fixação, cada filtro foi hibridado com cerca de 6 χ 10 θ cpm de sonda” marcada radioactivamente (17 horas a 65 °G, SSC 5x, solução de Denhardt 5x, SDS a 0,1 %, 20 jug/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado). Para sonda para o EqlFN-^ utilizou-se um fragmento do plasmídeo pEqG-YYGl que codifica para o in terferão maduro integral. Os filtros foram em seguida lava dos sob condições críticas: 4 vezes durante 45 minutos a 65°C com SSG 0,3x (NaCl 45 mM, citrato trissódico 4,5 mM), SDS a 0,1 %.
A auto-radiografia foi levada a efeito sobre pelí cuia de raios X DuPont Cronex utilizando uma folha de ampliação Kodak Lanex-Regular durante 7 dias a -80°C.
11. Expressão de interferão gama equino (QAA) em E* coli HB101/pEqG-QAA2 e HB101/pEqG-QAA3
A fim de conseguir uma melhor expressão utilizaram-se a) vectores de expressão melhorados e b) um sítio de ligação ribossomal melhorado. Os vectores de expressão melhorados baseiam-se no promotor de trp de Serratia mares cens (Sma) que foi adaptado na região -35 à região de consenso -35 por permuta de bases (pRH281), ou num promotor de trp híbrido que possui a primeira região abundante em A/T de Escherichia coli (Eco) ou a segunda região rica em A/T mais o promotor de Sma (pRH282, S. Itoh, gene 44 (1966), 29-36). Para sítio de ligação ribossomal foi utili zado o da enterotoxina de E. coli.
a) pRH281/5
Os seguintes oligonucleótidos foram preparados por meio dum sintetizador de ADN 381A da firma Applied Biosys temsí
Trp-1: 5’-AATTGAGGCTG-3’
Trp-3: 5»-ATGGCTAAAAGATTGTGCAAAAAGAGGGTTGAGATTGGCTTCGGGAAGGA
GTTAACTAGTACAGA-3’
I Trp-5: 5’-AGTTGACGGGTCGAGAGGGTAAGGAGGTTTAATATGAGOTGGAAT TCAT-3 ’
Trp-2: 5 ’ -TTAGGGATGAGGGTG-3 ’
Trp-4: 5’-GGTGAAGTTGTGTAGTAGTTAAGTGGTTGGGGAAGGCAATGTGAACGGT CTTTTTGGAGAATGTT-31
Trp-6 .· 5 ’-GGATGAATTCGAGCTGATATTAAACCTCGTTACCGTGTCGAGG-3 ’
Fosforilaram-se separadamente 100 pmol de cada um dos oligonucleótidos Trp-2 a Trp-5 em 10 μΐ. Hibridaram-se por aquecimento e arrefecimento lento Trp-1 e Trp-2, Trp-3 e
Trp-4 bem como Trp-5 e Trp-6. As soluções de cada par de oligonucleótidos foram reunidas e ligadas por adição de ligase de ADN T4. Cortaram-se duplamente com EcoRI e Ciai 3 jug do
plasmídeo pAT153. Após purificação do fragmento maior tratou-se este com cerca de 20 pmol de oligonucleótidos e ligou-se. 0 ADN foi por fim transformado em E. coli HB101 e os plasmídeos de algumas das colónias resultantes foram isolados. 0 fragmento Pst-HindIII que continha o promotor foi sequenciado. Depois de confirmação da sequência pretendida seleccionou-se um plasmídeo e denominou-se pRH281/5.
A sequência da fracção do promotor era:
51-GAATTGAGGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACATTGC
3’-CTTAACTGGGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTGTCCCAACTGTAACG
Xhol
-10 |início da transcrição
CTTCGCGAAGGAGTTAACTAGTAGAGAAGTTGAGGGGTGGAGACGGTAAG gaagcggttggtcaattgatgatgtgttcaagtggggaggtctgggattg RBS SstI EcoRI Ciai
GAGGTTTAATATGAGCTCGAATTCATCGAT-3’ GTCCAAATTATACTGGAGGTTAAGTAGGTA-5’
As vantagens dos novos vectores de expressão são:
1) região -35 óptima no promotor de trp de Sma
2) um sítio Xhol singular antes do sítio de ligação ribossomal (RBS) que permite a permuta do RBS por outro
3) 0 plasmídeo de expressão contém um início de tradução à distancia de 5 nucleótidos do RBS
4) 0 G destes ATG*s é a primeira base da sequência de reconhe cimento de SstI (GAGCTG). Por corte com SstI seguido da re produção duma extremidade alinhada obtém-se um vector de expressão com um início de tradução ATG disponível ao qual
se pode ligar um gene estranho que oomece com. a primeira base do quadro de leitura.
5) A ligação RBS-ATG não contém qualquer G ou 0
6) Através da escolha da sequência de oligonucleótidos na extremidade 5* foi destruído o sítio de corte EcoRI originalo Deste modo é possível gerar na extremidade do promotor um. sítio de multiclonagem composto por SstI, EcoRI, Ciai e HindIIl (já na parte de pAT153).
b) pRH282/5
Do mesmo modo construiu-se o vector de expressão pRH282/5. Os oligonucleótidos Trp-1 e Trp-2 foram substituídos pelos oligonucleótidos Trp-7 e Trp-8:
Trp-7: 5 ’ -AATTGCGCGTTGTGGATAATGTTTTTTGGGGGGAGATGATGATGCT-3 ’
Trp-8: 5 ’ -TTAGGGATCAGGATGATGATGTGGGGGGAAAAAACATTATGCAGAAGG
GGC-3 ’
A sequência da fracção do promotor no plasmídeo pRH282/5 é:
5’-GAATTGGGGGTTGTGGATAATGTTTTTTGGGGGGAGATOATGATGCTGAT
3’-CTTAAGGGGGAAGAGGTATTACAAAAAAGGGGGGTGTAGTAGTAGGAGTA
GGGTAAAAGATTGTGGAAAAAGAGGGTTGAGATTGGGTTGGGGAACCAGT GGGATTTTGTAAGAGGTTTTTGTGGGAAGTGTAACGGAAGCGGTTGGTGA
Xhol
-10 |início da transcrição RBS
TAACTAGTACACAAGTTCACGGCTCGAGACGGTAAGGAGGTTTAATATGA
ATTGATGATGTGTTCAAGTGGGGAGGTGTGCGATTGCTCGAAATTATAGT r
SstI EcoRI Glal
GCTCGAATTGATCGAT-3’
GGAGGTTAAGTAGCTA-5’
c) pGNl
Gortou-se duplamente com BamHI e Sall 1 pg de pUC18. A partir de 10 pg de EqG-QAAl isolou-se igualmente por corte duplo com BamHI-SalI a segunda metade do gene sintético do interferão gama de cavalo e desfosforilou-se. Ligaram-se cerca de 20 ng de vector com 100 ng da inserção e transformou -se o ADN em E. coli JM101. Verificou-se o plasmídeo duma colónia por digestão com enzimas de restrição e denominou-se es. te plasmídeo pGNl.
d) pGN3
A primeira metade do gene sintético foi combinada com os locais de ligação ribossomal dos oligonucleótidos:
EqG-1: 5’-AGCTTGGGTGGAGAGGTTGAGGTGATTTATGCAGGCTGGTTTCTTTAAAG
AAATGGAAAACCTGAAAGAATAGTTCAAGGCTGGTAACCGAGACGTTGGT-3’
EqG-2: 5’-GAGGGTGGTGCGCTGTTGOTGGACATOGTGAAAAAOTGGAAAGAAGACTC TGACAAAAAGATCATCCAGTCTGAG-3’
EqG-3: 5’-ATGGTTTCTTTCTACTTCAAACTGTTCGAAAAGCTGAAAGAGAAOCAGGT TATCCAGAAATCGATGGACACTATCAAAGAAGATCTGTTCGTTAAATTCT TCAACTCGTGGAGTGCG-3’
EqG-4: 5’-AATTGGGAGTGGAGGAGTTGAAGAATTTAAGGAAGAGATCTTGTTTGATA GTGTGGATCGATTTGTGGATAACGTGGTTGTGTTTCAGGTTTTCGAAGAG TTTGAAGTAGAAAGAAACGATCTGAGACTG-3‘
EqG-5: 5'-GATGATGTTTTTGTCAGAGTGTTCTTTGGAGTTTTTCAGGATGTCGAGGA ACAGCGGACCACCGTCACCAACGTC-3’
EqG-6: 5’-TGGGTTACGAGGGTTGAAGTATTGTTTCAGGTTTTGCATTTCTTTAAAGA AAGGAGGGTGCATAAATCAGGTCAAGCTGTCGAGGGA-3*
Fracções de 50 pmol dos oligonucleótidos foram fosforiladas do seguinte modo: EqG-2 juntamente com EqG-5 em
μΐ, EqG-3 e EqG-8 isoladamente cada um em 8 pl, A reacção com quinase foi interrompida por aquecimento a 100°C. Ao oligonucleótido EqG-3 adicionaram-se 50 pmol de EqG-4 (1 pl) e a EqG-8 50 pmol de EqG-1 (1 μΐ). As soluções foram novamente aquecidas a 100°0 e arrefecidas lentamente. As soluções dos pa res de oligonucleótidos foram reunidas e ligadas com ligase de ADN T4 num volume total de 30 μΐ, cortaram-se duplamente com EcoRI e HindIII 2 μg de pUC18, purificou-se num gel a fracção do vector e dissolveu-se esta em 50 μΐ de água. Ligaram-se 40 ng do vector e cerca de 2 pmol dos oligonucleótidos ligados em 10 jul e por fim transformou-se o ADN em E. coli JM101.
A inserção EcoRI-HindIII de alguns dos plasmídeos resultantes foi transclonada em M13mp9 e a sequência foi comprovada. Um plasmídeo com a sequência pretendida foi seleccio nado e denominado pGN3.
e) pGN20
Cortaram-se duplamente cerca de 3 μg de pGNl e de pGN3 com HindIII e Sall. Purificaram-se num gel a inserção de pGN3 e a metade vector/2 do gene do interferão gama equino de pGNl. Ligaram-se 0,2 μg de pGN3 com cerca de 0,05 μβ da inser ção de pGN3 e transformou-se o ADN em Ξ. coli JM101. 0 plasmí deo dum dos clones resultantes foi seleccionado depois de com provação com enzimas de restrição e foi denominado pGN20.
f) pEqG-QAA2 e pEqG-QAA3
A partir de cerca de 10 μg de pGN20 isolou-se a inserção XhoI-EcoRI que contém o gene sintético do interferão gama de cavalo juntamente com o local de ligação rfbossomal da enterotoxina II de E. coli (C.H. Lee et al., Infect. Immun. 42 (1983), 264-268; S.L, Moseley et al., Infect. Immun. 39 (1983), 1167-1174). Cortaram-se duplamente pRH281/5 e pRH282/ /5 com Xhol e EcoRI. Ligaram-se 20 ng do vector com 20 ng da • inserção e transformou-se o ADN em E. coli JM101. Algumas co- 72
lónias foram seleccionadas, os plasmídeos foram isolados e foram comprovados por meio de enzimas de restrição. Escolheu -se um de cada um dos plasmídeos e denominaram-se pEqG-QAA2 (vector: pRH281/5) e pEqG-QAA3 (vector: pRH282/5).
g) Ensaio no lisado da actividade de interferão gama
Uma cultura de E. coli HB101/pEqG-QAA2 ou HB1O1/ /pEqG-QAA3 deixada em crescimento dum dia para o outro foi di luída com LB/AMP (LB: 10 g/1 de triptona, 5 g/1 de extracto de levedura, 5 g/1 de NaCl, 50 mg/1 de ampicilina) e foi nova mente incubada a 37 °C. Quando se atingiu uma densidade óptima (a 600 nm) de 0,3 adicionaram-se 50 mg/1 de ácido indolacrílico e incubou-se novamente a cultura a 37°0. As bactérias foram separadas por centrifugação e desintegradas por ultrassons. 0 sobrenadante filtrado esterilmente foi experimentado em células NBL-6 (ATCC CCL 57) para determinação da activida de de interferão gama, utilizando-se para esse efeito como vírus o vírus da estomatite vesicular (VSV). Os lisados das duas culturas de bactérias transformadas (E. coli HBlOl/pEqG-QAA2 e HB101/pEqG-QAA3) apresentaram uma actividade de inter ferão de cerca de 0,1 a 1 milhão de unidades/ml. Para comparação analisou-se um lisado preparado de modo idêntico de E. coli HB101/pRH281. Este lisado de comparação continha menos de 100 unidades/ml.

Claims (1)

  1. Processo para a preparação dum polipeptídeo sob forma essencialmente madura apresentando as propriedades bio lógicas e imunológicas do interferão gama de cavalo (EqlFN-gama) eventualmente isento de glicosilação nativa caracterizado por
    a) se transformar um microorganismo hospedeiro apropriado com a informação genética que codifica para o polipeptídeo pre. tendido,
    b) cultivai' o microorganismo hospedeiro transformado num meio de cultura apropriado e
    c) isolar o referido polipeptídeo.
    - 23 Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por o polipeptídeo obtido conter a sequência de ácidos aminados da fórmula
    Σ Gin Ala Ala Phe Phe Lys Glu Ile Glu Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Asn Ala Arg Asn Pro Asp Vai Gly Asp Gly Gly Pro Leu Phe Leu Asp Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Asp Ser Asp Lys Lys Ile Ile Gin Ser Gin Ile Vai Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Glu Asn Leu Lys Asp Asn Gin Vai Ile Gin Lys Ser Met Asp Thr Ile Lys Glu Asp Leu Phe Vai Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr Ser Lys Leu Glu Asp Phe Gin Lys Leu Ile Gin Ile Pro Vai Asn Asp Leu Lys Vai Gin Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Vai Met Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gin Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg Ala Leu Gin
    em que
    Σ representa nm átomo de hidrogénio, ou uma das sequências guia Tyr Tyr Cys-, guia-, Met Tyr Tyr Cys-, Η-Tyr Tyr Cys ou Met-.
    - 32 Processo para a preparação duma molécula de ADN caracterizado por se acoplarem pelo menos duas das sequências seguintes:
    EG-1 5’-TACTAGTGGC AGGOTGCTTT GTTTAAAGAA ATGGAAAACC
    TGAAAGAATA CTTGAACGCT CG-3’
    EG-2 5’-TTGAAGTATT GTTTCAGGTT TTCGATTTGT TTAAAGAAAG
    CAGCGTGGCA GTAGTA-3’
    EG-3 5’-TAAGGOAGAC GTTGGTGACG GTGGTCCGGT GTTGGTGGAG
    ATGGTGAAAA AGTGGAAAGA AGAGTCTG-3’
    EG-4 5’-TTCTTTCCAG TTTTTCAGGA TGTCCAGGAA CAGGGGACGA
    CCGTGACCAA CGTCTGGGTT AGGAGGG-3’
    EG-5 5’-ACAAAAAGAT CATGCAGTGT GAGATGGTTT GTTTCTAGTT
    CAAAGTGTTC GAAAACOTGA AAGAGAAGC-3 ’
    EG-6 5»-TTTGAGGTTT TCGAACAGTT TGAAGTAGAA AGAAAGGATC
    TGAGACTGGA TGATCTTTTT GTCAGAGTC-3’
    EG-7 5’-AGGTTATCGA GAAATGGATG GAGACTATCA AAGAAGATCT
    GTTGGTTAAA TTCTTGAACT GG-3‘
    EG-8 5’-TGGACGAGTT GAAGAATTTA AGGAAGAGAT GTTGTTTGAT
    AGTGTGGATC GATTTCTGGA TAACCTGGTT GTG-3’
    EG-9 5’-TGGACTTGTA AACTGGAAGA CTTCCAGAAA CTGATGCAGA
    TGCCAGTTAA GGACCTGAAA-3’
    EG-10 5’-GCTGAAGTTT CAGGTGGTTA AGTGGGATGT GGATCAGTTT
    CTGGAAGTGT TGGAGTTTAG AAG-3 ‘
    EG-11 5’-GTTCAGGGTA AGGGTATGTC TGAAGTGATG AAAGTTATGA
    AGGACCTGTG TGGAAAAGCT AA-3’
    EG-12 5’-GGCAGGTTAG CTTTTGGAGA CAGGTCGTTC ATAAGTTTGA
    TGAGTTCAGA GATAGGGTTA C-3’
    EG-13 5’-GCTGCGTAAA CGTAAAGGTT GTGAGAAGCC ATTGGGTGGT
    CGTCGTGCTC TTCAGTAAG-3’
    EG-14 5’-GATGCTTAGT GAAGAGCAGG ACGAGGAGGG AATGGGTTGT
    GAGAACGTTT ACGTTTA-3’
    EG-15 5’-GAGGCTGCTT TCTTTÁAAGA AATGGAAAAO GTGAAAGAAT
    ACTTGAACGC TCG-3’
    EG-16 5'-TTGAAGTATT CTTTGAGGTT TTG ATTTGT TTAAAGAAAG
    CAGGGTG-3’ em combinações quaisquer entre si ou por adicionalmente se substituir na sequência resultante destas combinações um ou mais tripletos por outros tripletos que codifiquem para os mesmos ácidos aminados.
    - 4« Processo para a obtenção duma molécula de ADN con tendo uma sequência de acordo com a fórmula
    R1 TAG TGG GAG GCG GGG TTT TTT AAA GAA
    ---------1 IT T R Ã 0 1--------ATA GAA AAG CTA AAG GAA TAT TTT GTAAGTATGACGTTTTAATAATACTTAC TTGTGGTTGAAATGACTGAACGTTGTGTTGGAGTTGGATGTCTGATAGGGTGTGGTGTGT agtggacagtgatgttgagaagactgggtgttattttgtctgtttgttgagtggatgagt
    TTTTCTTTTTTTTACTAAATGATCTAGATATTGCTTTAAGGGTGTGCTCAATTTGCTATA I gagacttagagagggttgatgaatgttggaaaagatggggttaacaggtttataaaggat
    AGTGAAGTTGACAATTTTGTGGTGAGAAGGCACTGAATTGTGATAAGTGAAGTAGT6TG6 agattgaaaaaatgagtaggtattagtttctaagttgtcaggttactatgatggtgagaa
    TAAAAGGTGAAGATTAGCATTAAAATGGTAATGTGAAATAATTGATGAGTTAAAGAAGGC
    GCTGTGGTGAAAGGTTTGGCTGAAAAAAAATGAGTTTGAGGTGTTTTCCTGCAAAAAATG
    ATTTTAAAATGTTAGTGGGGCGTTTGTGTTAGGTGTGAAGTACTGTGGAACTGAGTGAAT
    TGCTGAGATTTTGTACGAGTTATAAGGTGGGTTATATTTAAAAAATTTTTTTGTTTTTGT
    TTTATGAGTTTCTTTTAAAATGTTATTTATGGTTAATTAAAATAGTTTTTGCATTTTAAA TATTTTATTATTTGTGCAAAATTTAGCTATTTTAATTATAGTTGGAGCTCTGTTTTAGAG GTGACATAAGAGCATAGGGGAGGCACAGATAGATGTGATGGAGGGGTGTAGGAGAGGGGG ggagtatgttatagtgggttgggtttgctgatgtttttactagagttgaaattatttggt TTTCGTTCGTATGGTTATTTGGGAGTATTGAAGTATGAGGAGGCCTGTTGAGTTGATGTG
    TAATATTGTAATTGAAGGGTTACACTAGAAAATAAGAAAGGTAAAAGAGGACGATAATGT
    TTGGCTACATCCAACACAATAGCTTTTGGGAATACTTATTGTTAGAACTAAACAGAGGGT
    TGAAAAGAAAATCAGTGAATACTGTGAGCATCTGAGTTCAATAAAACGTGAAGTACATTT
    TTAGGGCAATTGATGGACTAATTGTAAACCAAGTTTTCCTTCCTTTTTCAG AAC GOA
    AGA AAC CCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG CCT CTT TTC CTG GAT ATC
    ---------------------1 N T R Â O 2TTG AAG AAC TGG AAA GAG GTAAGCTAAGTATTTCGATTTGGTTGATTTTCCTGT
    TGCTTATTTTCTGGTGGATGAATTCÀCACGAACCTCTCTTTGTGCTCTTTTCTTCCTAG
    GAT AGT GAC AAA AAA ATA ATT CAG AGC GAA ATC GTC TGC TTC TAC TTC .AAA CTG TTT GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAG AGC ATG GAC ACC ATC AAG GAG GAC GTG TTC GTT AAG TTC TTT AâC AGC AGC ACC AGC AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT
    -----------1 N T R Ã O 3------------------------------CCG GTGAGGAGATCTTAATTGTTTCTTTGC-TTTCATTACAGAGGTTCTTGCAAAGTGCT TACGTCGCAGAAAGTAGAAATGAACTATGAAATGAACCCGTGGCCAAAACTCCTCCTTCC > TAATTCCATTTGTGCTTTGAGAGACTTTGGTAAGTCAGTATGGGAATCATTTAAATTTGT
    GATTTGGGGAAATGCTGGCACTATGACTACTGCACAAAGGCAGGTGAAGGGACAAATCGA
    GTGAGGAGGGGGC±lGTGAAGAAGTGGAGGGGAGTCTGGAGAAGOAGGTCTCTGCTTGCCG
    CTTGTTCGTGAGATGAAATOTTCCTGCTTTGGATGGGAGGCTGCGTGTCTTGGTGGAAAG AGCAGTGGGAGGAGGGAGAAGATTTGTGCTCCTCCCAGCTCAGCCACCAAGAAACTGTGA
    CCTCAGATGAATCACAGGCCTGGCTGGGGCTCAGTTTCCTCATGTTAAAAGAGGCCTATT
    GGGTTCACTAAAATTTCTATGATCTTCTTTGCTCTATAATCCTACAATTCTGTGGACAGA
    AAATGAAATGAGGTAGGAGAAAGAAATAGCCTTTGAAGAGGTTGTTGGGCAT.TCCACTGC
    CaGGCTCTGGTCAACCTTCATACTCTGCAGCCCAAGAAGAGGCAAGACCATTTGTCTGTT
    TTTGGAAATGCAAATAGGCGGCATTTATACCTCACGAAAGAACTGTTCTGTCAACTTTTG
    GATACTGGGCTATCTTGGCTGGAGAAATCCTTAGGCTCCCAAACTTTCTCTCATGAAATT
    GTGTTGAGTGTTTAAATTTATGGCTTGTCGAAGCTGAGAGATAACTTTAAGCATAAAGAG
    AAATTACATTTTGGAACATTTTGTCTAAGAGACAAAGAGCTCCACATGCCTTTGGGTTTG
    GCGTGGATGTAAATGGGGTTGAATGAGAAGGGGAGGGTGTTGTTATGACTATGTTTAGAA GAGAAAACAGAGGTTTGGAGAGGTTAAGTGGCTGGTTCAAAGTCAGAGTTATTGCACACA CAGGATTCGAACGCATATGTTTTGTCGGTGGACTTTAGGGTTGTTTTGGGTAGATAATTT TGAGAATTCTGTACCAGTGAATTTAAGGATGTGTGATGTTCGCCATCGTATTAGAGCACA ACCAGCAATTTAATTATAATTTTAGTCTTAACTGCTGAAGAAAGCAGGATTACATATTAA GCTAACATATTCCTGGTGAAAGCAACTTTTTCAAAGGAATATTTCTATTTTCATGGACCA TGACAGTAGOACAGCCTGATGGCTTGTATGCCTGAAACTAATTTTGCTGTTTTCTTTCCG
    AATAG GTA AAT GAT CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC
    ATG AAA GTG ATG AAT GAT GTG TCG GCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG
    GGG AAG AGG AGT CAG AAT GCA TTT CGA GGC GGG AGA GGG TTG CAA ***
    TAG ou
    R2 GCC GCG TTT TTT AAA GAA -----1 N T R Ã O 1-------ATA GAA AAC CTA AAG GAA TAT TTT GTAAGTATGACCTTTTAATAATACTTAC TTGTGGTTGAAATGACTGAACGTTGTCTTGGAGTTGGATCTCTGATAGGCTGTCCTCTCT ACTGGAGAGTCATGTTGAGAAGACTGGGTGTTATTTTCTCTGTTTGTTGACTGGATGAGT TTTTGTTTTTTTTACTAAATGATCTAGATATTGGTTTAACCCTCTGCTCAATTTGCTATA GAGACTTAGAGAGGGTTCATGAATCTTCCAAAAGATGGGCTTAAGAGGTTTATAAAGCAT AGTGAAGTTGACAATTTTGTGGTGAGAAGCCAGTGAATTGTGATAAGTCAAGTAGTGTGG ACATTGAAAAAATGACTAGCTATTAGTTTCTAACTTCTCAGGTTACTATGATGGTGAGAA TAAAAGGTCAAGATTAGCATTAAAATGGTAATCTGAAATAATTGATOAGTTAAAGAAGGC GCTGTCCTGAAAGGTTTGGCTGAAAAAAAATCACTTTCAGGTGTTTTGCTCCAAAAAATG ATTTTAAAATCTTACTGCCCCGTTTGTGTTAGCTGTGAAGTAGTCTGGAACTCAGTGAAT TGGTGAGATTTTGTACGAGTTATAAGCTGGCTTATATTTAAAAAATTTTTTTGTTTTTGT TTTATGAGTTTCTTTTAAAATGTTATTTATGGTTAATTAAAATAGTTTTTGCATTTTAAA TATTTTATTATTTGTCCAAAATTTAGCTATTTTAATTATAGTTGGAGCTCTCTTTTAGAG GTGACATAAGACCATAGGGGAGGCAGAGATAGATGTGATGGAGCGCTGTAOCAGACGGGG GGAGTATCTTATAGTGGGTTGCCTTTGGTGATCTTTTTACTAGACTTGAAATTATTTGCT
    TTTCCTTCCTATGGTTATTTGGGACTATTGAAGTATGACCAGCCGTGTTGAGTTGATCTG TAATATTGTAATTCAAGGGTTACACTAGAAAATAAGAAAGTGAAAACAGGAGGATAATCT TTGGCTAGÀTCGAACACAATAGGTTTTGGGAATACTTATTGTTAGAACTAAACAGAGGGT TGAAAAGAAAATCAGTGAATACTGTGAGGATCTGAGTTCAATAAAACGTGAAGTAGATTT
    TTAGGGGAATTCATGGACTAATTGTAAACGAAGTTTTCGTTGCTTTTTGAG AAG GCA
    AGA AAC GCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG CCT CTT TTC CTG GAT ATC
    ---------------------1 N T ,R Ã 0 2TTG AAG AAC TGG AAA GAG GTAAGGTAAGTATTTCCATTTGGTTGATTTTCGTGT
    TGCTTATTTTGTGGTGGATGAATTGACAGGAACCTGTGTTTGTGGTGTTTTGTGCGTAG
    GAT AGT GAC AAA AAA ATA ATT GAG AGG CAA ATC
    GTC TGG TTG TAG
    TTG AAA CTC TTT GAA AAC TTG AAA GAT AAC GAG GTC ATT CAA AAG
    AGC ATG GAC ACC ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAA
    AGG AGC ACC AGC AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT
    -----------1 N T R Â 0 3-----------------------------GCG GTGAGGAGATCTTAATTCTTTCTTTGGTTTCATTACAGAGGTTCTTGCAAAGTGCT TAGGTCCGAGAAAGTAGAAATGAAGTATGAAATGAACCCGTGGCCAAAACTCCTCGTTCC TAATTCCATTTGTGGTTTGAGAGACTTTGCTAAGTCAGTATGGGAATCATTTAAATTTGT GATTTGGGGAAATGGTGGCACTATGACTATTGCAOAAAGGCAGGTGAAGGGACAAATCGA GTGAGGAGGGGGGAGTGAAGAAGTGGAGGGGAGTGTGGAGAAGGAGGTGTGTCCTTGGCG CTTGTTCGTGAGATGAAATCCTGCTGCTTTGGATGGGAGGCTGCGTGTCTTGGTGGAAAG AGCAGTGGGAGGAGGGAGAAGATTTGTGCTGCTGCGAGGTOAGGGAGCAAGAAAGTGTGA CCTCAGATGAATGACAGGCGTGGCTGGGGCTGAGTTTGGTCATCTTAAAAGAGGGGTATT GGGTTCACTAAAATTTCTATGATCTTCTTTGCTCTATAATCGTACAATTCTGTGGAGAGA AAATGAAATGAGGTAGGAGAAAGAAATAGGCTTTGAAGAGGTTGTTGGGGATTGCACTGG CAGGCTCTGGTCAAGCTTCATAGTCTGCAGCCCAAGAAGAGGOAAGACCATTTGTCTGTT TTTGGAAATGCAAATAGGCGGCATTTATACCTCACGAAAGAACTGTTGTGTGAACTTTTG GATACTGGGCTATCTTGGCTGGAGAAATCCTTAGGCTCCCAAACTTTGTGTCATGAAATT GTC TTGAGTCTTTAAATTTATGGCTTG TC GAAGCTGAGAGATAACTTTAAGCATAAAGAG
    AAATTACATTTTCCAACATTTTGTCTAAGAGACAAAGACCTCCACATGCCTTTGGGTTTG
    GCGTGGATCTAAATGGGGTTGAATGAGAAGGGGAGGGTGTTGTTATGACTATGTTTAGAA
    GAGAAAACAGAGGTTTGGAGAGGTTAAGTGGCTGGTTCAAAGTCAGAGTTATTGCACACA
    CAGGATTCGAACCCATATGTTTTGTCCCTCCACTTTAGGGTTCTTTTGGCTACATAATTT TGAGAATTCTGTACCAGTCAATTTAAGGATGTGTGATGTTCCCOATCCTATTACAGCACA ACCAGCAATTTAATTATAATTTTAGTOTTAACTGGTGAAGAAAGGAGCATTACATATTAA GGTAACATATTCCTGGTGAAAGCAACTTTTTCAAAGGAATATTTCTATTTTCATGGAGCA
    TGACAGTAGCAGAGCCTGATGGCTTGTATGCCTGAAACTAATTTTGCTGTTTTCTTTCCC
    AATAG GTA AAT GAT GTG AAG GTC CAG CGC AAA GOA ATA AGT GAA CTG
    ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTG TCG CGC AAA GCT AAC CTG AGG AAG
    CGG AAG AGG AGT GAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA
    TAG ou.
    R1 TAC TGC CAG GCC GCG TTT TTT AAA GAA ATA GAA AAC CTA AAG GAA TAT TTT AAC GCA AGA AAC CCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG CGT CTT TTC CTG GAT ATC CTG AAG AAC TGG AAA GAG GAT AGT GAC AAA AAA ATA ATT CAG AGC CAA ATC GTC TCC TTC TAC TTC AAA CTG TTT GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAG AGC ATG GAC ACC ATC AAG GAG GAC GTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC AGG AGG ACC AGC AAG CTG GAA GAC TTG CAA AAG CTG ATT CAG ATT CCG GTA AAT GAT CTG AAG GTG CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTG ATC AAA GTG ATG AAT. GAT GTG TCG CCG AAA GCT AAC CTG AGG AAG CGG AAG AGG AGT CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA TAG ou R2 GCC GCG TTT TTT AAA GAA ATA GAA AAC CTA AAG GAA TAT TTT AAC GCA AGA AAC CCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG COT CTT TTC CTG GAT ATC TTG AAG AAC TGG AAA GAG GAT AGT GAC AAA AAA ATA ATT CAG AGG CAA ATC GTC TCC TTC TAC TTC AAA CTG TTT
    GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTG ATT CAA AAG AGG ATG GAC ACC ΑΤΟ AAG GAG GAC CTG TTG GTT AAG TTG TTT AAC AGC AGC ACC AGC AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG GTG ATT CAG ATT CCG GTA AAT GAT CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG CGG AAG AGG AGT CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA TAG ou R1 TAC TGC CAG GCT GCT TTG TTT AAA GAA ALG GAA AAC CTG MA. GAA TAC TTG AAC GCT CGT AAG CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG CTG TTC CTG GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA AAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTG TAC TTC AAA CTG TTC GAA AAC CTG AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT ATC AAA GAA GAT CTG TTG GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT AAA CTG GAA GAC TTC GAG AAA CTG ATC CAG ATG CGA GTT AAC GAG CTG AAA GTT CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG AAC GAG CTG TCT CCA AAA GGT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT CAG AAG CCA TTC CGT GGT CGT GGT GCT CTT CAG TAA ou R2 GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA GAA TAC ® AAC GCT CGT AAC CGA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG CTG TTC GTG GAC ATC GTG AAA AAG TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA AAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC GAA AAC CTG AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT ATG AAA GAA GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT AAA CTG GAA GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAG GAC CTG AAA GTT CAG CGT AAG GCT ATG TCT GAA GTG ATC AAA GTT ATG AAC GAC CTG TCT CCA AAA GCT AAC CTC- CGT AAA CGT AAA CGT TCT CAG AAC CCA TTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAA em que B 1 significa ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT TTG GGT TCT TCT ACC TAT,
    ATG TAT ou
    TAT e
    R significa
    ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG
    ATT TTG GGT TCT TCT ACC CAG,
    ATG CAG ou
    CAG, ou uma sequência derivada desta por alteração dum ou de vários tripletos por outros tripletos que codificam para os mes mos ácidos aminados ou sequências complementares ou de ADIT de cadeia dupla contendo as referidas sequências complementares ou duma molécula de ADIT que híbrida com o ADIT anteriormente definido sob condições em que permite reconhecer um grau de homologia superior a 85$, de preferência superior a 90$, podendo estas sequências de ADIT ser sintetizadas por via natural ou ser de origem semi-sintética, bem como as respectivas alterações obteníveis por mutação, substituição de nucleótidos, supressão de nucleótidos, inserção de nucleótidos ou inversão de nucleótidos que codificam para um polipeptídeo com a actividade biológica e imunológica do EqlFIF-gama ou contendo uma das sequências referidas na reivindicação 6 ou contendo o plasmídeo pAHlll caracterizado por se obter as referidas moléculas de ADIT por meio de técnicas recombinantes.
    - 5g Processo de acordo com a reivindicação 4, caracte. rizado por a molécula de ADU obtida estar em ligação funcional com uma sequência de regulação de expressão e por ser replicável em microorganismos, de preferência em procariontes ou em eucariontes, especialmente em E. coli e em Saccharomyces cerevisae, ou em células de mamíferos, especialmente em células de cavalo, ou ser o plasmídeo pEqG-QAAl, pEqG-QAA2 ou pEqG-QAA3.
    - 6a -
    Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2 caracterizado por o polipeptídeo obtido ser codificado por meio da informação genética contida numa molécula de ADN obtida de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 5.
    - 72 -
    Processo para a preparação de um organismo hospedeiro caracterizado por se transformar um organismo apropriado, de preferência um procariante, especialmente E. coli, sen do preferido de modo especial E. coli JM101 ou B. coli HB101, ou um eucarionte ou uma linha de células de mamífero, especial mente uma linha de células de cavalo, com uma molécula de ADN leoombinante obtida de acordo com qualquer das reivindicações 4 ou 5.
    - 8s -
    I Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2 ou 6 caracterizado por o organismo hospedeiro ser obtido de acordo com a reivindicação 7.
    - -
    Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2, 6 ou 8, caracterizado por a informação genética utilizada para transformação do organismo hospedeiro estar con tida numa molécula de ADN recombinante obtida de acordo com a reivindicação 5.
    Processo para a preparação dum agente para tratamento terapêutico caracterizado por se incorporar como princí pio activo uma quantidade activa dum polipeptídeo preparado de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2, 6, 8 ou 9, em conjunto com adjuvantes ou com veículos farmaceuticamente inertes.
    - lia _
    Processo para a preparação de anticorpos monoclonais contra os polipeptídeos da presente invenção caracteriza do por se imunizar um animal hospedeiro com um dos polipeptídeos obtidos de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2, 6, 8 ou 9, provocar-se a fusão de linfócitos B do referido animal hospedeiro com células de mieloma, subclonarem-se as li nhas de células híbridas que segregam o anticorpo monoclonal e cultivarem-se estas linhas de células in vitro ou in vivo.
    - 123 „
    Processo para a preparação duma linha de células híbrida que segrega um anticorpo monoclonal contra um dos polipeptídeos obtidos de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2, 6, 8 ou 9, caracterizado por se provocar a fusão de lin fócitos B dum animal imunizado com um dos referidos polipeptí deos com células de mieloma.
    - 133 -
    Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por 0 anticorpo monoclonal obtido neutralizar de modo específico completa ou parcialmente a acção dos polipeptídeos obtidos de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2, 6, 8 ou 9 ou se ligar de modo específico a um dos referidos polipeptídeos.
    - 84 - 142
    Processo para a preparação dum agente terapêutico caracterizado por se incorporar um anticorpo monoclonal quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações 11 ou 13.
    - 15 s -
    Processo para análise qualitativa e/ou quantitati va ou para a purificação dum dos polipeptídeos obtidos de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2, 6, 8 ou 9, caracterizado por se utilizar para a análise um anticorpo monoclonal obtido de acordo com qualquer das reivindicações 11 ou 13.
    - 16 § -
    Processo para a preparação dum conjunto da análise de polipeptídeos caracterizado por se incorporar um anticorpo monoclonal obtido de acordo com qualquer das reivindica ções 11 ou 13.
    A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã, em 10 de Dezembro de 1986, sob o ns P 36 42 096.4.
PT86332A 1986-12-10 1987-12-10 Processo para a preparacao de interferao gama de cavalo, de adn que codifica para este interferao e de anticorpos monoclonais contra o mesmo, como de agentes terapeuticos contendo estes produtos PT86332B (pt)

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