JPS60118196A - インタ−フェロンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、インターフェロンの製造法に関する。

さらに詳しくは、本発明は、ヒトインターフェロン遺伝
子を組み入れた発現ベクターを持つ鍬生物を、特定の合
成培地に培養し、該インターフェロン金著量蓄積せしめ
、これを採取することを６ｆＩ微とするヒトインターフ
ェロンの製造法に関する。

インターフェロン（以下、「工Ｆ」と略称することもお
る。）は、高等動物の測胞がウィμスや核酸などの刺激
によって誘発されて産生ずる蛋白質であシ、抗つイμス
作用、抗腫瘍作用などを有する。

ヒトの工Ｆには、現在、α型、β型およびγ型の３種の
性状の異なるタイプが存在することが知られてお９、α
型およびβ型はウィμスや核酸で、γ型はマイト−ジエ
ンなどで誘発される。従ってその製造法としてはヒト細
胞または株化細胞の培養による方法がとられてきたが、
その生産量は極めて少なく、大規模な臨床試験や治療薬
として使用するに必要な量の供給は不可能である。しか
るに、近年、遺伝子操作技術の進歩によって、α。

β、γ型のいずれも、工Ｆ産生遺伝子を組入れた発現ベ
クターを持つ大腸菌などの培養物から生物学的に活性な
蛋白質として、比較的容易に得られるようになった〔ネ
イチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　２８４　＋３１６（１９
８０）；ネイチャー　２８７，４１１、□ （１９８０）ｉデロシーデイングズ・オプ・ザ・ナシ、
すμ・アカデミ−・オプ・サイエンシズ・オプ・ザ・ユ
ナイテッド・スティン・オグ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅ
ｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄ
ｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎ
ｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ　＋以下
において、Ｐｒｏｃ。

Ｈａｔ、　Ａｃａｄ、　８ｃｉ、−Ｕ、Ｓ、Ａ、と略称
する。）■。

５２３０（１９８０）；ヌクレイツク・アシツなリサー
チ　（Ｎａｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
）　８ｅ４０５７（１９８０！ネイチヤー　２９５．５
０３（１９８２））。しかし、その生産量は、工業的な
ヒトエＦの製造法としては、必ずしも十分なものとはい
えない。

このような状況に鑑み、本発明者らは、工Ｆ産生遺伝子
を組入れた発現ベクターを持つ微生物の培養法について
、種々検討を重ねたところ、上記微生物は従来主として
天然物を有機窒素源とする培地において培養されてきた
が、これを特定の完全合成培地に変換し、培養すること
によって著しく高収量の工Ｆが得られることを見い出し
、これに基づいてさらに研究した結果、本発明を完成し
た。

本発明は、インターフェロン産生遺伝子を組入れた発現
ベクターを持つ微生物を、Ｌ−グμタミン酸と鉄イオン
源とを添加した合成培地において培養し、培養物からイ
ンターフェロンを採取することを特徴とするインターフ
ェロンの製造法である。

ヒトエＦには、α型、β型およびγ型の３種が知られ、
特にα型については多くの分子種が存在し、Ａ、Ｂ、Ｃ
，Ｄ、Ｆ、Ｈ１工、Ｊなどの遺伝子がクローニングされ
、大腸菌で発現することが知られている（日本特開昭５
７−７９８９７号公報、ヨーロッパ特許出願公開１１に
４３９８０公報参照）。またβ型工Ｆ遺伝子（日本特開
昭５７−１４０７９３号公報参照）およびｒ型工Ｆ遺伝
子（日本特開昭５８−９０５１４号公報参照）も大腸菌
で発現されるに至っているが、これらいずれの遺伝子、
またはその他のヒトエＦ遺伝子であっても、宿主微生物
で発現するものであれば、そのいずれの１Ｆ生産にも本
発明を適用することが可能である。

工Ｆ遺伝子を宿主微生物特に大腸菌で効率よく発現させ
るために、その発現ベクター用のプフスミドとしては、
Ｃｏｌ’Ｂ工　由来のｐＢＲ３２２ｃジーン（Ｇｅｎｅ
）　２．９５　（１９７７））が最もよく利用されるが
、その他のプフスミドであっても、大腸菌内で複製保持
されるものであれば、いずれも用いることができる。そ
の例としては、ｐＢＲ３１３〔ジーン２−　７５　（１
９７７））、　ｐＢＲ３２４゜ｐＢＲ３２５ｃジーン４
．　１２１　（１９７Ｂ））、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３
２８Ｃジーン９，２８７（１９８０））。

ｐｘｙ２２８９ｃジーン３．１　（１９７８））、ｐＫ
Ｙ２７００Ｃ生化学５２，７７０（１９８０）：）、ｐ
ＡＣＹＣ１７７、ｐＡｃＹｃ１８４ｃジャーナ〃・オプ
・バクテリオロジ−（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ）１３４．１１４１（１９７Ｂ））、
ｐＲＫ２４８．ｐＲＫ６４６、ｐＤＦ４１　Ｃメソッズ
・イン・エンジ−モロジー（Ｍｅｅｈｏｄａ　ｉｎ　Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　６Ｂ　＋　２６８（，１９７９
））などが挙げられる。

また、バクテリオファージ、たとえばλファージを使用
したλｇｔ　系のλｇｔ−λＣ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、　５ｃｉ−Ｕ、８．Ａ、　７１．４５７９　
（１９７４）　）　。

λｇｔ−λＢ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、８ｃｉ
、Ｕ、Ｓ、Ａ。

７２．３４１６（１９７５））、λＤａｍ　（ジーン１
．２５５（１９７７））やシャロンベクター〔サイエン
ス（５ｃｉｅｎｃｅ）　１９６．１６１（１９７７）；
　リサーチ〃・オプ・ビーロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌｏ
ｆＶｉｒｏｌｏｇｙ）　２ジ、５５５（１９７９））、
ａ雌状７アージに使用したベクターなども発現ベクター
、！＝して使用可能である。

工Ｆ遺伝子はプロモーターの下流に連結されていること
が好ましく、該プロモーターとしては、トリプトファン
（ｔｒｐ）プロモーター、フクトース（ｌａｃ　）プロ
モーター、蛋白質鎖伸長因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモー
ター＋　ｒｅｃ　Ａ遺伝子プロモーター、λファージの
増殖に関与するλＰＬ、１ＡＰｐ、プロモーターなどが
あげられるが、これらのいずれを用いたものであっても
よい。

工Ｆ産生遺伝子を組み入れた発現ベクターの構築は、公
知の方法に従って行なえばよい。たとえば、α型工Ｆに
関しては、ネイチャー（にａｔｕｒｅ　）第２８７巻４
１１頁（１９８０年）、ＤＮＡ第１巻１２５頁（１９８
２年）、ニュークレイツク・アシッズ・リサーチ第１１
巻２９２７頁（１９８３年）１日本特開昭５７−７９８
９７号公報（ヨーロッパ特許出願公開第４３．９８０号
公報）などに記載の方法、β型工Ｆに関しては、ニュー
クレイツク・アシッズ・リサーチ第８巻４０５７頁（１
９８０年）　＋　Ｐｒｏｃ、　ｍａｔ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ＊Ｕ、Ｂ、Ａ、第７７巻５２３０頁（１９８０年
）、ニュークレイツク・アシッズ・リサーチ第１１巻４
６７Ｔ頁（１９８３年）９日本特開昭５７−１４０７９
３号公報などに記載の方法、γ型工Ｆに関しては、ネイ
チャー第２９５４５０３頁（１９８２年）、η本特開昭
５８−９０５１４号公報。

日本特開昭５８−１８９１９７号公報９日本特許出願昭
５８−１７６０９０号明細書１日本特許出願昭５８−４
５７２３号明澗書に記載された方法などが挙げられる。

工Ｆ産生遺伝子を組入れた発現ベクターを導入する宿主
菌としては、大腸菌が用いられるが、なかでも大腸菌に
一１２株由来のものが、取扱い、安全性の面から特に好
ましい。該大腸菌に一１２株由来のものとしては、たと
えば大腸菌２９４株。

Ｗ３１１０株、Ｃ−６００株、Ｘ１７７６株などが挙げ
られる。また、これらの変異株でもよい。

上記２９４株としては、Ｐｒｏｃ、　Ｈａｔ、　Ａｃａ
ｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、８．Ａ、　７３．４１７４（１９７６）
に記載されている株が挙げられる。また、上記２９４株
としては、ジ・アメリカン−タイプ・力μチャー−コレ
クション（Ｔｈｅ　Ａｍ＠ｒｌｃａｎ　’［’ｙｐｅ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅＣ！ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　＋以下、ＡＴ
ＣＣと略称する。）カタログ・オプ・ストレインズ（Ｃ
ａｔａｌｏｇｕｅ　ｏｆＳｔｒａｉｎｓ）　Ｉ第１５版
１９８２年にＡＴＣＣ３１４４６として掲載されている
株が挙げられる。

さらに上記２９４株としては、財団法人発酵研究所に昭
和５７年３月２３日付けで工ｙｏ　１４１７１として寄
託されている（日本特開昭５８−１８９１９７号公報参
照）株が挙げられる。

上記３１１０株としては、ＡＴＣＣカタログ・オプ・ス
トレインズエ第１５版１９８２年にＡＴｃｃ　２７３２
５として掲載されている株が挙げられる。

上記Ｃ−６００株としては、ＡＴＣＣカタログ・オブ・
ストレインズエ第１５版１９Ｂ２年ＫＡＴＣＣ２３７２
４として掲載されている株が挙げられる。

上記Ｘ１７７６株としては、ザ・リサーチ！・オプ・イ
ン７エクシヤス・デイジージズ（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ
　□ｆ　工ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ）　
１３７＋６６８（＋９７８）に掲載されている株が挙げ
られる。また上記Ｘ１７７６株としては、米国特許第４
．１９０，４９５号公報にｈＴｃｃ　３１２４４（ＡＴ
ＣＣカタログ・オプｅストレインズエ第１５版１９８２
年に掲載。）として記載されている株などが挙げられる
。

工Ｆ産生遺伝子金組入れた発現ベクター（プフスミド、
ベクターまたは）１−ジベクター）を宿主菌に導入する
方法としては、公知の方法に従えばよい。該方法として
は、たとえばリサーチμ・オプ・モレキュラー・バイオ
ロジー（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ）　５３．１５９（１９７０）。

メリッズ・イン・エンジ−モロジー　ｆｌ１３　、２５
３（１９７９）、ジーン且、２７９（１９７Ｂ）などに
記載の方法などが挙げられる。

本発明に用いられる合成培地とは、その成分がすべて分
かっているものをいう。

該合成培地は、たとえば公知の無機塩を主体とする培地
〔例、Ｍ−９培地（下記表１参照）。

Ｄａｖｉ８培地など〕を用いることができるが、また下
記の表３に示す無機塩組成のＴ８Ｍ−３培地なども有利
に利用できる。

なお、種培養培地としては、通常の天然培地たとえばニ
ュートリエンドブロスやＬ−ブロスなどを用いてもよく
、また表４に示す合成培地（８８−１培地）もより有利
に使用出来る。

（以下金白） 本発明方法において用いられるＬ−グルタミン酸は、塩
の形のものを使用してもよい。該塩としては、たとえば
ナトリウム複、カリウム塩、アンモニウム塩などが挙げ
られる。該Ｌ−グμタミン酸またはその塩の添加量は、
合成培地１リツターあな力、Ｌ−グルタミン酸として、
約０．１ないし１０ｆである。

本発明方法で用いられる鉄イオン源とは、溶液にしたと
きに鉄イオンとなる物質あるいは鉄イオンの形で利用さ
れる物質をいう。該鉄イオン源の例としては、たとえば
塩化第１鉄、塩化第２鉄。

硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、リン酸第２鉄、硝酸第２鉄、
クエン酸第２鉄、乳酸第１鉄などが挙げられる。該鉄イ
オン源の添加量は、合成培地１リツターあたり鉄イオン
として約１０　ないし１０−３５ 七μである。

添加すると、より目的物の収量が増大することがあるの
で有利である。

上記亜鉛イオン源とは、溶液にしたときに亜鉛イオンと
なる物質あるいは亜鉛イオンの形で利用される物質金い
う。該亜鉛イオン源の例としては、たとえば塩化亜鉛、
塩基性炭酸亜鉛、硝酸亜鉛。

硫酸亜鉛、リン酸亜鉛などが挙げられる。該亜鉛イオン
源の添加量は、合成培地１リツターらたり亜鉛イオンと
して約１０　ないし１０　モμである。

上紀銅イオン源とは、溶液にしたときに銅イオンとなる
物質あるいは銅イオンの形で利用される物質をいう。該
銅イオン源の例としては、たとえば硫酸銅、塩化第２銅
、塩化第し鴫１次酸銅、酢酸銅などが挙げられる。該銅
イオン源の添加量は、合成培地１リツターあたシ銅イオ
ンとして約１０ないし１０　モμである。４勘、４μ４
４−はッ唖膏→→吟− また宿主菌が栄養要求性を示す場合には要求するアミノ
酸（例、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン。

Ｌ−／’　チオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン。

Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−トリプトファンな
ど）を約１０ないし１０００ｑ＃の割合で適宜添加する
ことが必要である。ビタミン類（例、パントテン酸力〃
シウム、塩化コリン、葉酸、１−イノシト−μ、ニコチ
ンアミド、ピリドキサ−μ塩酸、リボ７フビるビタミン
Ｄ２など）はビタミン要求性変異株を用いない限シ特に
必要でないが、ビタミンＤ２の約１ないし１００１８１
７ｅ添加によって醗酵が安定化する傾向があり、適宜添
加することが望ましい。また宿主菌がビタミン要求性で
ある場合には要求ビタミンを約１ないし１００ｑ／＃添
加することが必要である。

培地に添加する炭素源は、培養期間中、約０．１ないし
５％（Ｗ／Ｖ　）に保つようにすると、目的とする工Ｆ
が著量蓄積されるので有利である。該炭素源としては、
たとえばグルコース、グリセロ−μ、マμドース、ソμ
ピトーμなどが挙げられる。

インターフェロン遺伝子を組入れたプラスミドには、通
常抗生物質耐性の選択マークが付与されておシ、この場
合には、耐性を示す抗生物質（例、テトラサイクリン。

アンピシリンなど）を培地に添加すると、プラスミドを
保持した株のみ選択的に増殖させるために有利である。

培養は、通常、攪拌培養によって行なわれる。

培地中の酸素濃度を飽和溶存酸素濃度の約５％（Ｖ／Ｖ
）以上になるように保ちつつ培養を行なうと、目的とす
る工Ｆの生産量が増大されるので有利である。そのため
に、培養途中に純酸素を空気と混合して通気することも
効果的である。

本発明の培養における培地のｐＨは、通常的５ないし７
．５に調整するのが好ましい。培養温度は約１５ないし
４５℃、さらに好ましくは約２０ないし４２°Ｃである
。培養時間は、約３ないし７２時間である。

本発明の発酵に於て工Ｆは通常菌体内に蓄積されるので
、培養物中に蓄積された工Ｆ’ｉ採取するには、まず菌
体を遠心分離や濾過によって集め、これよシエＦ′！ｉ
−抽出することにより行なわれる。

工Ｆを効率よく抽出させるためには、たとえば超音波処
理、リゾチーム処理、界面活性剤などの化学薬品による
処理などが行われる。

このようにして抽出された工Ｆの精製は、従来からの蛋
白質あるいはペプチドの精製法、たとえば硫安塩析、ア
μコーμ沈鍛、イオン交換カフムクロマトグフフィー、
セ〃ロースカフムクロマトグフフィー、ゲｙｖｙｉ過法
などの適用により行なわれる。特にモノクローナル抗体
法と組合せることによって極めて高純度の標品を得るこ
とが可能である。

すなわち、たとえば抽出操作を施した液を遠心分離して
上清を得、これをたとえば、モノクローナルカラムフム
にかけ、カラムを洗滌後、たとえば０．２Ｍ酢酸、０．
１％トリトン、　（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ１００および０
　、１５　Ｍ　ＮａＣ１で溶出する。この操作において
、インターフェロンはモノクローナル抗体カラムに特異
的に吸着されるため、高純度の標品を容易に得ることが
出来る。〔α型工Ｆの精製については、サイＩンティフ
ィック・アメリカン（５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ　）　２４３　ｒ　６６（１９８０）参照。γ
型工Ｆの精製については、日本特許出願昭５８−１７６
０９１号明細書参四〕かくして得られるたとえばヒト白
血球ＩＦａＡ蛋白質は、ウシ腎臓由来Ｍ　Ｄ　Ｂ　ＫＭ
胞に対する水泡性ロ内炎つイμス（Ｖ８Ｖ）の細胞変性
効果阻止試験による抗ウイルス活性測定において１ｏ８
ＴＪ／Ｍ１以上の比活性を示す。また、ヒト免疫工Ｆ蛋
白賀は、ヒト竿膜由来のＷ工ＳＨｉ胞に対する水泡性ロ
内炎つィμス（Ｖ８Ｖ）の細胞変性効果阻止試験による
抗ウィルス活性泪ＩＪ定において１０７７１７１１４９
以上の比活性を示す〔日本特許出願昭５８−１７６０９
１号明Ｍ書参照〕。

本発明によって製造されるヒトエＶ蛋白質類は、同じ組
換え体を用い、天然培地で培養して得られるものと、そ
の理化学的性質、生物学的性質が全く同じである。

したがって、本発明の方法により製造されたＩＦは、従
来の方法で製造された工Ｆと同様の目的に同様の用法に
よｐ使用することができる。

ＴＦは、抗つイ〃ス作用、抗腫瘍作用、細胞増殖阻害作
用、免疫抑制作用などを有するので、工Ｆは、哺乳動物
（例、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ。

マウス、ラットなど）のウイμヌ惑染症、腫瘍などの治
療に用いることができる。たとえば（１工Ｆを抗つイμ
ス剤、抗腫瘍剤、細胞増殖阻害剤。

免疫抑制剤として用いるＫは、たとえば工Ｆを自体公知
の薬理的に許容しうる担体、賦形剤、希釈剤などと混合
して、注射剤として非経口的に静０１１（注射又は筋肉
注射などにより投与する。その投与量は正常人１日当シ
約１０万ないし１億単位好ましくけ約１００万ないし５
０００万単位である。

また、上記ヒト以外の哺乳動物に対しての投与量は、２
００口ないし２００万単位／＃／日、さらに好ましくは
約２万ないし１００万単位／＃７日である。

以下に、実験例および実施例を挙げて本発明をさらに具
体的に説明する。

実験例１ 前記したＭ−９培地またはＴＳＭ−３培地に、次素諒と
してグルコース’ｋＬＯｆ／ｌの割合で添加し、これに
グルタミン酸ナトリウムを添加した培地と添加しない培
地とに大腸菌２９４（Ａ’［’ＣＣ３１４４６）／ｐＬ
ｅ　工Ｆ　Ａ　ｔｒｐ　２５株（特開昭５７−７９８９
７号公報、ヨーロッパ特許出願公開第４３９８０号公報
参照）全接種し３７”Ｃで１６時間培養して、その生育
を調べ、表５の結果を得た。

Ｍ−９培地　３０　２８０　３４０ ＴＳＭ−３培地　３５　２８０−３３０実験例２ Ｔ　８　Ｍ　−３培地に２５　ｆ　／ｅｃｏｐ’ｖコー
スおよＵ４９／（ｌのＬ−グルタミン酸ナトリウム金添
加した培地２．５１を５ｇ容ジャーファーメングーに仕
込み、これに表６に記した金属塩を夫々添加した培地に
、ヒト白血球ＩＦ−αＡｆｉ伝子を組入れたプラスミド
を持つ大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）／ｐＬｅ　
ＩＦ　Ａ　ｔｒｐ　２５株の種培養物５０ｇ１ｔ接種し
、通気ｆｉ２　、５　（１／分、撹拌１１０００ｒｐ、
３７℃で培養した。培養途中、菌の生育につれて培養温
度を３７″Ｃからたとえば３３°Ｃ１２９°ｂ 養途中でグルコース濃度が１％以下になった時２．５％
苑新しくグμコース′ｆ、添加して２７時間培ｇ！を続
けた。また培養中ｐＨはアンモニア水にてｐＥ［６，８
に保った。その時の菌の生育およびヒト白血球インター
７エ四ンαＡの生産量を調べ、表６の結果を得た。

（注）※クレット光電光度計にて菌の濁度を測定※※蓄
積される工Ｆを抗ウィルス活性で測定し、鉄、銅および
亜鉛イオンを添加した場合の生産量を１００とし、相対
的な値で表わした。

実験例３ 表ＴのＬ−シード培地または前記した８８−１シ一ド培
地５０ｗ１を２００ｇ？容三角フラスコに仕込み、これ
に５１ｊｆｌ／（ｌの塩酸テトフサイクリンを添加した
後、ヒト白血球工Ｆ−αＡ遺伝子會組入れたプフスミド
を持つ大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）／ｐｉｅ　
工Ｆ　Ａ　ｔｒｐ　２５を接種し、３７°Ｃで１２時間
および１６時間夫々培養した。

次に前記したＴｓｍ−３培地に２５ｆ／ｅのグルコース
、４ｆ／１４のＬ−グμタミン酸ナトリウム、２７Ｗ／
ｇのＦｅＣｌ３−６Ｈ２０、８ｍｌ／　１４　（７）ｃ
ｕｓｏ４−５Ｈ２ｏ、　８　Ｗ／　ｅのＺｎＳＯ４−７
Ｈ７２０，７０１１９／１の塩酸チアミンおよび５１１
ｆ／１１のテトフサイクリン塩酸塩金添加した培地２．
５ｅを５ｅ容ジャーファーメンタ−に仕込み、これに上
記種培養物を接種して実験例２と同じ条件で培養し、生
育およびヒト白血球工Ｆの生産性を測定し、表８の結果
を得た。

（注）※クレット光電光度計にて菌の濁度を測定し、Ｌ
−シード培地を用いた場合の１８時間目の生育上１００
とした場合の相対的な生育度で表わした。

※※蓄積される工Ｆを抗ウィルス活性で測定し、Ｌ−シ
ード培地金用いた場合の１８時間目の生産性を１００と
した場合の相対的な値で表わした。

表８から明らかなように、天然培地（Ｌ−シード培地）
の種培養物を用いるよりも、合成培地（８８−１シード
培地）の種培養を用いた方が主醗酵での菌の増殖が早ま
シ、工Ｆの生産量が増大することがわかる。

実験例４ ｓｓ−ｔシード培地５０ゴを２００ロｙｔｔｌ容三角フ
フヌコ仕込み、これに５Ｍｆ／ｅの塩酸テトフサイクリ
ンを添加した後、ヒト白血球工Ｆ−αＡ遺伝子を組入れ
たプフスミド金持つ大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６
）／ｐＬｅ　工Ｆ　Ａ　’ｔｒｐ２５株を接種し、３７
℃で１６時間培養した。次ＩｃＴｓＭ−３培地に４ｆ！
／６０）Ｌ−りｌｌ’ミ７Ｎｌｌナトリウム、２７呼カ
筋塩化第２鉄、８ダ、θの硫酸銅、８Ｍｙ／ム硫酸亜鉛
＋　７０　＝／　／りの塩酸チアミンおよび５１１１１
１／ｌのテＦヲサイクリン塩酸塩を添加した培地２．５
１宛を５１容ジャーファーメンタ−に仕込み、これにグ
〃コーヌを表ｔに示す条件で添加した。上記種培養物を
接種した後、通気量２．５１１７分、攪拌１０００ｒ、
ｐ、ｍ、、３７°Ｃで培養を開始し、菌の増殖につれて
培養温度を３７°Ｃから３３℃、２９℃、２５℃と遂次
低下させることによって溶存酸素濃度が飽和酸素濃度の
１０％以上になる様に保った。培養中ｐＨはアンモニア
水にてｐＨ６、８に調整し、２７時間培養を続けた。そ
の時の菌の生育およびヒト白血球工Ｆ−ａＡの生産量ｔ
−調べ、表９の結果を得た。

※　クレット光電光度計にて菌の濁度ｆｔ測定し１実験
Ｎａ４−１の場合の生育’ｋｌＯＤとして相対価で表わ
した。

※※蓄積される工Ｆ？抗ウィルス活性で測定し、実験Ｎ
ａ４−１の場合の生産性′ｆ：１ｏｏとした場合の相対
的な値で表わした。

第７表から明らかなように、実験＆４−１．４−２．４
−３の場合には、菌の生育および工Ｆ−ａＡの生産性が
著しく高いことが分かる。

実施例１ ヒト白血球１Ｆ−αＡ遺伝子を組入れた発現プラスミド
を持つ大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）／ｐＬｅ　
工Ｆ　Ａ　ｔｒｐ　２５株を、（１）Ｍ−９培地にグル
コース２５ｆ／ｌ　、力ｆミ／酸５ｊ’／６　、ビタミ
ンＢ１　塩酸塩７０岬／ｅおよび塩酸テトラサイクリン
５Ｉノ／４１！添加した培地（天然培地）あるイＵ（２
）Ｍ　−９培地ＶＣグｙｖｓ−ス２５ｆ／（１、Ｌ−グ
ルタミン酸ナトリウム４　ｇ／　ｅ　、’Ｉ”　ｅ　ｃ
１３　”　６　Ｈ２０２７’ｆ　／ｌ　ｌＣｕ　Ｓ　ｏ
４−５　％　ｏ８　’ｆ　／　ｇ　、Ｚ　ｎ　ｓＯ４”
７Ｈ２０８呼／ｌ　、ビタミンＢｔ　塩酸塩７０ｑ／ｌ
。

塩酸テトラサイクリン５Ｗｖ／［、Ｌ−プロリン５０Ｈ
ｌ／１１およびＬ−ｏイｙｙ５０”ｌ’ｆ／ｅ’ｅ添加
した培地（合成培地）夫々２．！Ｍ’ｅ仕込んだ５ｅ容
ジャーファーメンタ−へ接種し、通気２．５＃／分。

撹拌１０００　ｒ、ｐ、ｍ、、　３７℃で培養を開始し
１途中ＯＤ　３０００１　テ３３℃、　５０００　ＫＩ
Ｔ　テ２９℃。

７０００　ＫＵで２５℃に温度を下げて４８時間培培養
続けた。培養中溶存酵素濃度は５％以上に保たれた。途
中培養液中のグルコース濃度が１％以下に低下した時、
２５１／１１の割合でグルコースを添加した。その結果
を表１０に示す。

※　蓄積される工Ｆを抗つイμス活性で測定し、天然培
地での生産性″ｆ；ｃ＋００とした場合の牢に度が値で
表わした。

上記表１０から明らかなように、（２）合成培地に本発
明の化合物ｔ−添加した培地を用いると、工Ｆの生産性
は著しく増大した。

実施例２ 実施例１で得られた（２）合成培地培養液２ｇを遠心分
離して菌体を集め、これを１００ｓｙｌの１０％シュク
ロース、０．２ＭＮａＣ１，１０ｍＭエチレンジアミン
テトラアセテート（ＥＤＴＡ　）、ｌＱｍＭスベ〃ミジ
ン、２ｍＭフエ二μメチ／Ｉ／メμホニμフμオライド
（ＰＭＳＦ）、０．２１１ｆ／ゴリゾチームを含む５０
　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣＩ（ｐＨ７，６）に懸濁し、
４°Ｃで１時間攪拌したのち、３７°Ｃで５分間保温し
、これを式らに超音波破砕器（アルチック社製、米国）
で、０°Ｃ４０秒処理した。この溶菌液１ｋｌｌ、３０
０Ｘノで１時間遠心分離して上清９５ｍ１を集めた。

この上清９５ｇ１を１ｍＭ　ＦＤＴＡ、０．１５Ｍ体カ
ラム（２０ｍｌ　）にかけた。

ＴＥＮで十分洗浄したのち、さらに０．１％トｐＨ，４
、５ニ１４整したのちＣＭセルロースカヲムに吸着させ
、十分洗浄後、Ｑ　、　１５Ｍ　Ｎａ１ｌ金含む０．０
２５Ｍ酢酸アンモニウムｌｌ！貧液（ｐＨ５，０）にて
溶出した。再び活性画分を集めて凍結乾燥に付し３２０
ｑのヒト白血球工Ｆ−ａＡ粉末を得た。

このものの５ＤＳ−ポリアクリルアミトゲμ電気泳動法
による分子量は、１９０００±１０００であった。また
、ここで得られた最終のヒト白血球工Ｆ蛋白質の比活性
は２Ｘ１０８　Ｕ／岬であった。また、その他の理化学
的性状、アミノ酸組成。

ペプチドマツピングにおいて、従来の培地で生産される
遺伝子組換えヒト白血球工Ｆと全く同一の挙動を示した
。

実施例３ ヒト免疫工ｒ遺伝子を組入れた発現プラスミドを持つ大
腸菌２９４（工ｙｏ　１４１７１）／ｐＨ工Ｔ−１ｒｐ
　２１０１株〔日本特許出願昭５８−１７６０９０号明
細書参照〕を、（１）’１’８Ｍ−３培地１１Ｃグルー
１−ス２５ｆ／（１、酵母ｚキス２０ｙ／１および塩酸
テトラサイクリン５’ｌｆ／（ｌ添加した培地（天然培
地）と（２）　Ｔ　Ｓ　Ｍ　−３培地にグルコース２５
ｆ／１．Ｌ−グ ＦｅＣｌ３−６Ｈ２０　２　”ｒｌｌｆ／ｌ　、ＣｕＳ
Ｏ４−５Ｈ２０　Ｆ３ｇｆ／ｌ。

ＺｎＳＯ４”７Ｈ２０８ｔ！ｆ／（１，Ｎｎｆ−！ミ７
７０ｍ１／ｅおよび塩酸テトラサイクリン５＃／ｅｔ−
添加した培地（合成培地）夫々２．５ｅを仕込んだ５ａ
容ジヤー７アーメングーに接種し、通気２　、５ｇ／分
。

攪拌１０００ｒ、ｐ、ｍ、＋　３７℃で培養を開始し、
途中ＯＤが２０００クレット単位になった時３３°Ｃに
、４０００クレット単位になった時２９℃に、６０００
クレット単位になった時２５℃に下げ、２６時間培養を
行った。培養液のｐＨはアンモニア水で６．８に保ち、
途中培養液中のグルコース濃度が１％以下になった時、
２５ｆ／（ｌの割合でグルコースを添加した。その結果
、天然培地（１）での工Ｆ−７生産性を１００とすると
合成培地（２）での生産性は５５０であった。

実施例４ 実施例３で得られた合成培地培養液２．４ｅを遠心分離
して菌体を集め、これを１２０ｍ／の１０％シュクロー
ス、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭスベμミヂｙ　、　
２ｍＭ　ＰＭＳＦ　、０　、２１１１／ｒｒｒｌリゾチ
ームを含む５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ　（ｐｉ（７，６
）に懸濁し、４℃で１時間撹拌したのち、３７”Ｃで５
分間保温し、これを更に超音波破砕器（アルチック社製
。

米国）で、０℃４０秒処卯した。この溶菌液を１１．３
００Ｘｆで１時間遠心分離して上清１１５ｖｔｌを集め
た。

この上清１１５ｒｓｌｋＴ　Ｅ　Ｎで３６０ｇｆｆに希
釈したのち、抗ＩＦ−γ抗体カラム（２５＊ｌＣ日本特
許出願昭５８−１７６０９１号明和書の実施例１２およ
び１３参照。〕にかけ、ＴＥＭで十分洗浄したのち、Ｉ
Ｍ　Ｍａｉｌ、　０．１％）ウィーン２０を含む２０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，０）でさらに洗浄し
、次に２Ｍグアニジン・塩酸塩（シグマ社製、米国）を
含むＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，０）で溶出し、得られ
た活性−分１００ｙａｌを０．１＋５％Ｎａ２　ａｐｏ
　４　Ｉ　Ｑ　−０２％Ｋ）Ｉ２ＰＯ４，０，８％Ｎａ
Ｃ１＋　０．０２％ＭＣＩからなる緩衝液に対して、４
°Ｃで１８時間透析した。

ここで得られた最終のヒト免疫工Ｆ蛋白質の量は４７Ｍ
’／であシ、その比活性は２Ｘ１０　Ｕ／岬であった。

また、ここで得られた標品の５Ｄ８−ポリアクリルアミ
ド電気泳動法による分子量は、１８０００±１０００で
あり、それ以外の理化学的性状・アミ／酸組成、ペプチ
ドマツピングにおいて、従来の培地で生産される遺伝子
組換えヒト免疫ＩＦと全く同一の挙動金示した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）、インターフェロン産生遺伝子を組入れた発現ベ
   クターを持つ飯生物を、Ｌ−グμタミン酸と鉄イオン源
   とを添加した合成培地忙おいて培養し、培養物からイン
   ターフェロンを採取すること金特徴とするインターフェ
   ロンの製造法。 （２）、培地にさらに亜鉛イオン源を添加する特許請求
   の範囲第１項記戦の製造法。 （４）、インターフェロン産生遺伝子がヒト白血球イン
   ターフェロン遺伝子である特許請求の範囲第１ないし３
   項記載の製造法。 （５）、インターフェロン産生遺伝子がヒト免疫インタ
   ーフェロン遺伝子である特許請求の範囲第１ないし３項
   記載の製造法。 （６）、Ｌ−りｆｉ／タミン酸を約０看ないｌ、１０１
   １／１１゜鉄イオン源を約１０　ないしＩＱ　ｍｏ１／
   ｌ添加する特許請求の範囲第１ないし５項記載の製造法
   。 （７）、亜鉛イオン源を約１１１ｒ　ないし１（ｒ　ｍ
   ｏｌ／ｇｌｆＳ加する特許請求の範囲第２ないし６項記
   載の製造法。 （８）、銅イオ７＆を約１　（ｌｒ５ナイＬ　１　［ｒ
   ３ｍｏｌ／ｇｉ７ＪＬ１ｊる特許請求の範囲第３ないＬ
   ７項記載の製造法。 （９）、培地中の戻素源を約０．１ないし５％に保ち９
   つ培養する特許請求の範囲第１ないし８項記載の製造法
   。 ００、培地中の酸素濃度ヲ始和溶存酸素濃度の約５％以
   上になるように保ちつつ培養する特許請求の範囲第１な
   いし９項記載の製造法。