ES2558751T3 - Alimento alcalino - Google Patents

Abstract

Un método para producir un polipéptido comprende las etapas de: a) cultivar una célula de Escherichia coli que comprende un ácido nucleico codificante del polipéptido, b) ajustar el valor del pH durante el cultivo, con una solución alcalina que comprende un aminoácido seleccionado de entre aspartato, ácido aspártico, glutamina, ácido glutámico, histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano y tirosina, c) recuperar el polipéptido a partir de la célula o del medio de cultivo, produciendo de esta manera el polipéptido, en el que el aminoácido presenta una concentración en la solución alcalina de 30 g/l o superior, y en el que la solución alcalina es una solución de amonio de 10% (p/v) o superior.

Description

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Se preparó el polipéptido de fusión de tetranectina-apolipoproteína A-I por medios recombinantes. La secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión expresado en la dirección N-a C-terminal es la siguiente: -el aminoácido metionina (M), -un fragmento de una secuencia de interferón que presenta la secuencia de aminoácidos CDLPQTHSL (SEC ID nº 36), -un conector GS, -una etiqueta hexa-histidina que presenta la secuencia de aminoácidos HHHHHH (SEC ID nº 37), -un conector GS, -un sitio de corte de IgA proteasa que presenta la secuencia de aminoácidos VVAPPAP (SEC ID nº 38), y -una tetranectina-apolipoproteína A-I que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 02.

Los polipéptidos de fusión de tetranectina-apolipoproteína A-I tal como se ha indicado anteriormente son polipéptidos precursores a partir de los que se liberaron los polipéptidos de fusión de tetranectina-apolipoproteína A-I mediante corte enzimático in vitro utilizando IgA proteasa.

El gen de fusión codificante del polipéptido precursor se ensambló mediante métodos y técnicas de recombinación conocidos mediante conexión de los segmentos de ácidos nucleicos apropiados. Las secuencias de ácidos nucleicos preparadas mediante síntesis química se verificaron mediante secuenciación del ADN. El plásmido de expresión para la producción de tetranectina-apolipoproteína A-I se preparó tal como se indica a continuación.

Construcción del plásmido de expresión de E. coli

El plásmido 4980 (4980-pBRori-URA3-LACI-SAC) es un plásmido de expresión para la expresión de la estreptavidina nuclear en E. coli. Se generó mediante ligación del fragmento de vector EcoRI/CelII de 3.142 pb derivado del plásmido 1966 (1966-pBRori-URA3-LACI-T-repetición, informado en la patente EP nº B 1 422 237) con un fragmento EcoRI/CelII codificante de la estreptavidina nuclear de 435 pb de longitud.

El plásmido de expresión de E. coli de estreptavidina nuclear comprende los elementos siguientes: -el origen de replicación del vector pBR322 para la replicación en E. coli (correspondiente a las posiciones de pb

2.517 a 3.160 según Sutcliffe J.G. et al., Quant. Biol. 43:77-90, 1979), -el gen URA3 de Saccharomyces cerevisiae codificante de la orotidina 5'-fosfato descarboxilasa (Rose M. et al., Gene 29:113-124, 1984), que permite la selección de plásmido mediante complementación de las cepas mutantes

E. coli pyrF (auxotrofia para el uracilo), -el casete de expresión de la estreptavidina nuclear, que comprende: -el promotor T5 híbrido (promotor híbrido T5-PN25/03/04 según Bujard H. et al., Methods Enzymol. 155:416-433, 1987, y Stueber D. et al., Immunol. Methods IV:121-152, 1990), incluyendo un sitio de unión ribosómica sintético según Stueber D. et al. (ver anteriormente), -el gen de la estreptavidina nuclear, -dos terminadores de transcripción derivados de bacteriófago, el terminador λ-T0 (Schwarz E. et al., Nature 272:410-414, 1978) y el terminador fd (Beck E. y Zink B., Gene 1-3:35-58, 1981), -el gen represor lacI de E. coli (Farabaugh P.J., Nature 274:765-769, 1978).

El plásmido de expresión final para la expresión del polipéptido precursor de tetranectina-apolipoproteína A-I se preparó cortando el gen estructural de la estreptavidina nuclear del vector 4980 utilizando el sitio de corte único por endonucleasa de restricción EcoRI y CelII e insertando el ácido nucleico flanqueado por el sitio de restricción EcoRII/CelII codificante del polipéptido precursor en el fragmento de vector EcoRI/CelII-4980 de 3.142 pb de longitud.

Ejemplo 3

Alimentación de leucina y prolina como soluciones separadas

En el presente ejemplo de referencia se llevó a cabo el cultivo de una cepa de E. coli auxotrófica mediante un método de cultivo de alta densidad celular tal como se informa en Riesenberg et al. (1991, supra) en combinación con la alimentación separada de los aminoácidos L-leucina y L-prolina.

Se utilizó la cepa E. coli K12 CSPZ-2 (leuB, proC, trpE, th-1, ΔpyrF). La cepa se transformó con un plásmido de expresión para la producción de una proteína terapéutica y se mantuvo como banco de inóculo primario en ampollas que contenían 1 ml de la cepa cultivada en medio de precultivo definido hasta una densidad óptica (determinada a 578 nm) de aproximadamente 1 y 1 ml de glicerol al 85% (v/v) y se almacenó a -80ºC.

El medio de precultivo definido era un medio M9 según Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) complementado con

1,0 g/l de L-leucina,

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mediante la adición de las alimentaciones 2 y 3. Tras 16 horas, se había consumido la glucosa, indicado por el acusado incremento del valor de pO2. En este tiempo se modificó la temperatura del cultivo de 37ºC a 28ºC. Tras 15 minutos adicionales, se inició el control pO2-alimentación y se controló la pO2 a 50% mediante la adición de la alimentación 1, incrementando continuamente la agitación y la tasa de aireación hasta los máximos respectivos, de

1.400 rpm y 20 l/min. Se redujo continuamente la tasa de crecimiento de 0,15 hasta aproximadamente 0,05 l/h. Concomitantemente, se redujo en etapas la velocidad del agitador tras 36 horas de cultivo. Una vez ya no pudo determinarse ningún incremento más de la densidad óptica, se terminó la fermentación y se enfriaron las células bacterianas a 4ºC durante la noche, antes de la recolección.

Al final de la fermentación el rendimiento de biomasa total era de 49,4 g/l (materia seca). Durante la fermentación prácticamente no se excretó acetato, aunque hacia el final las concentraciones se incrementaron acusadamente hasta 7 g/l. La formación de proteína recombinante rindió 9,96 g/l. El volumen de caldo de cultivo excedía el volumen de trabajo normal del fermentador y se incrementó a 11,8 l.

Se repitió la fermentación, resultando en una densidad óptica final de 130, un rendimiento de biomasa final de 50,6 g/l y un rendimiento de proteína recombinante de 9,0 g/l; el volumen del caldo de cultivo al final de la fermentación era de 12,2 l.

Ejemplo 4

Alimentación de leucina y prolina incorporada en la solución de álcali para la regulación del pH

En la presente fermentación se incorporó la alimentación de aminoácido en la solución alcalina de control del pH. La base de dicha fermentación era el mismo método de cultivo a alta densidad celular según Riesenberg et al. (1991, supra) tal como se utiliza en el Ejemplo 3. Se incorporaron los aminoácidos L-leucina y L-prolina en la solución acuosa de NH3 al 12,5% y se alimentación con adición de álcali durante el control del pH.

Se utilizó la cepa E. coli K12 CSPZ-2 (leuB, proC, trpE, th-1, ΔpyrF). La cepa se transformó con un plásmido de expresión para la producción de una proteína terapéutica y se mantuvo como banco de inóculo primario en ampollas que contenían 1 ml de la cepa cultivada en medio de precultivo definido hasta una densidad óptica (determinada a 578 nm) de aproximadamente 1 y 1 ml de glicerol al 85% (v/v) y se almacenó a -80ºC.

El medio de precultivo definido era un medio M9 según Sambrook J. et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) complementado con:

1,0 g/l de L-leucina, 1,0 g/l de L-prolina, y 1,0 mg/l de tiamina-HCl.

Para la fermentación, se utilizó un medio de lote según Riesenberg et al. (1991, supra):

27,6 g/l de glucosa, 13,3 g/l de KH2PO4, 4,0 g/l de (NH4)2HPO4, 1,7 g/l de citrato, 1,2 g/l de MgSO4*7H2O, 60 mg/l de citrato de hierro (III), 2,5 mg/l de CoCl2*6H2O, 15 mg/l de MnCl2*4H2O, 1,5 mg/l de CuCl2*2H2O, 3 mg/l de H3BO3, 2,5 mg/l de Na2MoO4*2H2O 8 mg/l de Zn(CH3COO)2*2H2O, 8,4 mg/l de Titriplex III, y 1,3 ml/l de agente antiespumante Synperonic al 10%.

El medio de lote se complementó co: 5,4 mg/l de tiamina-HCl y 1,2 g/l de L-leucina y L-prolina, respectivamente.

La solución de alimentación 1 contenía: 700 g/l de glucosa y 19,7 g/l de MgSO4*7H2O.

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Claims (1)

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