CN103068967B - 碱性进料 - Google Patents

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Abstract

本文报道了一种培养细菌细胞的方法，包括加入在碱性溶液中的氨基酸用于pH调节。此外，一个方面是用于产生多肽的方法，包括下述步骤：a)提供包含编码多肽的核酸的细菌细胞，b)培养提供的细胞，c)在培养过程中用包含氨基酸的碱性溶液调节pH，d)从细胞或培养基中回收多肽并由此产生多肽。

Description

碱性进料
本文报道了一种原核细胞(如大肠杆菌菌株)在化学成分限定的培养基中高细胞密度培养从而产生多肽的方法，其中氨基酸通过浓缩的碱性溶液(同时调节培养基的pH并作为氮源)进料。
发明背景
近年来，蛋白质的生产已经稳步增加并且蛋白质可能成为最大的一群用于治疗近代各种疾病的治疗剂。蛋白质的影响来自于它们的特异性，如特异性靶标识别和结合功能。
将细胞培养物用在发酵过程中以产生物质，特别地蛋白质。区分下述两种过程：即其中细胞培养物未被遗传修饰并且形成它们本身的代谢产物和其中将生物以使它们产生更大量的它们本身的物质如蛋白或产生外源物质的方式进行遗传修饰。给产生所述物质的生物提供营养性培养基，所述营养性培养基保证生物的存活并且能够产生需要的靶标化合物。已知很多用于这些目的的培养基，所述培养基能够使特定宿主的培养最优化。
由Riesenberg(Riesenberg，D.，等，Curr.Opin.Biotechnol(目前生物技术观点).2(1991)380-384)和Horn(Horn，U.，等，Appl.Microbiol.Biotechnol(应用微生物生物技术).46(1996)524-532)报道大肠杆菌的高细胞密度培养。Riesenberg，D.和Guthke，R.(Appl.Microbiol.Biotechnol(应用微生物生物技术).51(1999)422-430)报道了微生物的高细胞密度培养。由Shiloach，J.和Fass，R.(Biotechnol.Advances23(2005)345-357)综述了培养大肠杆菌到高细胞密度。
在WO91/10721中，报道了一种在搅拌的锅炉发酵器中高细胞密度发酵大肠杆菌的方法。在WO97/29190中报道了质粒DNA生产和纯化的方法。在DD295867中报道了通过控制溶氧浓度和氧传递速率来控制需氧水下微生物培养物的生长。在EP0866876中报道了通过高细胞密度发酵在大肠杆菌中制备重组蛋白的方法。
在WO03/048374中，报道了用于制备芳香族氨基酸代谢物或其衍生物的方法。在WO97/21829中报道了通过高细胞密度发酵在大肠杆菌中制备重组蛋白的方法。
发明概述
已经发现如果将氨基酸以碱性溶液加入培养基中，可以以高细胞密度在化学成分限定的培养基中培养原核细胞，尤其是氨基酸营养缺陷型大肠杆菌K12菌株。
本文报道的一个方面是以高细胞密度培养细菌细胞，尤其是大肠杆菌细胞的方法，其中细胞表达重组多肽，其中所述培养包括在培养过程中加入氨基酸的碱性溶液，所述氨基酸选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，
其中氨基酸在碱性溶液中具有这样的浓度，所述浓度比其在20℃和中性pH的水中的溶解度高，并且
其中在培养中的一个时刻培养的细菌细胞的干细胞重量是至少20g/l。
本文报道的一个方面是用于生产多肽的方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供细菌细胞，尤其是大肠杆菌细胞，其包含编码多肽的核酸，
b)培养提供的细胞，
c)在培养的过程中用包含氨基酸的碱性溶液调节pH值，所述氨基酸选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，
d)从细胞或培养基中回收多肽并且由此产生多肽。
本文报道的另一个方面是在培养细菌细胞的过程中使用包含氨基酸的碱性溶液来调节pH值。
此外，本文报道的一个方面是氨基酸的碱性溶液作为在培养细菌细胞的过程中的进料的应用，其中所述氨基酸选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸并且培养多达干细胞重量20g/l以上。
下面是如前所述的所有方面的具体实施方案。
在一个实施方案中，氨基酸是水溶性差的氨基酸。在一个实施方案中，所述细菌细胞是氨基酸营养缺陷型细胞并且营养缺陷是关于选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的氨基酸。在另一个实施方案中，细菌细胞是大肠杆菌细胞或其突变体。在另一个实施方案中，氨基酸在20℃的水中具有50g/l以下的溶解度。在又一个实施方案中，氨基酸在20℃的水中具有40g/l以下的溶解度。在又一个实施方案中，氨基酸选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在又一个实施方案中，氨基酸选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、亮氨酸、色氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，氨基酸是亮氨酸。在又一个实施方案中，氨基酸在碱性溶液中具有高于其在20℃的水中溶解度的浓度。在一个实施方案中，所述溶解度是在20℃的水中的溶解度的两倍，在另一个实施方案中，所述溶解度是在20℃的水中的溶解度的三倍。在另一个实施方案中，所述溶解度高于在20℃和在pH6-8的pH值在水中的溶解度。在一个实施方案中，氨基酸在碱性溶液中具有25g/l以上的浓度，或在又一个实施方案中，具有30g/l以上的浓度，或在又一个实施方案中，具有35g/l以上的浓度。在一个实施方案中，氨基酸在碱性溶液中具有45g/l以上的浓度。在一个实施方案中，氨基酸在碱性溶液中具有约50g/l的浓度。在又一个实施方案中，碱性溶液具有9以上的pH值，在又一个实施方案中，具有10以上的pH值，并且在又一个实施方案中具有10.5以上的pH值。在一个实施方案中，碱性溶液是超过5％(w/v)，或10％(w/v)以上，或15％(w/v)以上的氨溶液。在一个实施方案中，碱性溶液是在水中约12.5％(w/v)的氨溶液。此外，在一个实施方案中，肽是人载脂蛋白A1或其衍生物。在又一个实施方案中，载脂蛋白A1具有选自SEQIDNO：01-SEQIDNO：35的氨基酸序列。在一个实施方案中，多肽具有选自SEQIDNO：01，SEQIDNO：02，SEQIDNO：34，或SEQIDNO：35的氨基酸序列。
发明详述
本文报道了一种用于培养原核细胞，例如氨基酸营养缺陷型细菌细胞的方法，其中将至少一种氨基酸(例如所述细胞对于该氨基酸是营养缺陷型的)，加入碱性溶液中。
还发现，如果包含至少一种氨基酸(如对于该氨基酸所述细胞具有营养缺陷)的进料在碱性溶液中被加入培养基中，可以以高细胞密度培养原核细胞，例如氨基酸营养缺陷型大肠杆菌K12菌株。当所述氨基酸在水中的溶解性差时，这尤其是有利的，并且可以通过在碱性溶液中溶解氨基酸来增加溶解度。同时，可以将碱性溶液用于调节培养基的pH值。通过在高度浓缩的单一进料溶液中组合氨基酸溶液和pH调节溶液，可以减少加入的体积，并且由此允许原核细胞的高细胞密度培养。另外，已经发现，在碱性进料溶液中至少45g/l的氨基酸浓度导致重组多肽的增加的产生。
在一个实施方案中，用于培养原核细胞的方法包括下述步骤：
a)提供原核细胞，
b)培养原核细胞，
c)在原核细胞的培养过程中用包含氨基酸的碱性溶液调节pH值，所述氨基酸选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
“氨基酸营养缺陷型原核细胞”是例如由于在包含编码相应的生物合成途径的蛋白的结构基因的基因座中突变或缺失而不能合成必需氨基酸的原核细胞。在不将相应氨基酸加入培养基中的情况下，细胞不能增殖。营养缺陷可以关于任何氨基酸。原核细胞也可以是关于一种以上氨基酸的营养缺陷型。因此，在一个实施方案中，氨基酸营养缺陷型原核细胞是关于至少一种氨基酸的营养缺陷型。在又一个实施方案中，氨基酸营养缺陷型原核细胞是关于至少一种，至少两种，至少三种，至少四种，至少五种氨基酸的营养缺陷型。在又一个实施方案中，氨基酸营养缺陷型原核细胞是至多5种、至多10种或至多15种氨基酸的营养缺陷型。在又一个实施方案中，氨基酸营养缺陷型原核细胞是关于1-5种氨基酸，或1-3种氨基酸，或关于1-2种氨基酸，或关于一种氨基酸，或关于两种氨基酸或关于三种氨基酸或关于四种氨基酸的营养缺陷型。在一个实施方案中，氨基酸营养缺陷型原核细胞是细菌细胞。
在一个实施方案中，细胞是埃希氏菌属(Escherichia)细胞，或芽孢杆菌属(Bacillus)细胞，或乳杆菌属(Lactobacillus)细胞，或棒杆菌属(Corynebacterium)细胞，或酵母(Yeast)细胞(酵母属(Saccharomyces)、念珠菌属(Candida)或毕赤酵母属(Pichia))。在又一个实施方案中，细胞是大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞，或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)细胞，或嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)细胞，或谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)细胞，或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)酵母细胞。
术语“调节值”指在整个培养过程中在预定的水平维持各个值，即持续或以预定的恒定时间间隔检查所述值，并且如果所述值在预定接受范围之外，通过加入校正流体进行改变。例如，术语“调节pH值”指在固定的时间点，即以固定的时间间隔周期性地确定培养基的pH值，并且如果确定的pH值在接受范围之外，如例如0.1pH单位或0.15pH单位或0.2pH单位，通过加入校正流体，如酸或碱性溶液，将pH值重新调节到预定的pH值。
用于培养原核细胞以及用于培养氨基酸营养缺陷型原核细胞的方法是本领域技术人员已知的(见，例如Riesenberg，D.，等，Curr.Opin.Biotechnol.2(1991)380-384)。培养可以使用任何方法。在一个实施方案中，培养是批次培养，补料分批培养，灌注培养，半连续培养，或全细胞停留或部分细胞停留培养。培养唯一的需求是必须加入碱性溶液。这种加入也可以是单进料溶液或作为组合的进料和pH调节溶液。
用于起始细胞培养的培养基可以是本领域技术人员已知的任何培养基，其中进料的氨基酸浓度在培养基中是低于5g/l，或低于7.5g/l，或低于10g/l。必须指出，各种化合物浓度必需以预期不会对细胞的生长造成不利干扰的方式进行选择。在一个实施方案中，培养基是限定的葡萄糖-无机盐培养基。
在一个实施方案中，培养是高细胞密度培养。术语“高细胞密度培养”指这样的培养方法，其中在培养中的一个时刻培养的原核细胞的干细胞重量是至少10g/l。在一个实施方案中，在培养中的一个时刻干细胞重量是至少20g/l，或至少50g/l，或至少100g/l或超过100g/l。为了达到这样的高细胞密度状态，在培养过程中加入的进料的体积和/或调节溶液的体积必需尽可能得小。例如在Riesenberg，D.，等，Appl.Microbiol.Biotechnol(应用微生物学生物技术).34(1990)77-82中报道了测定干细胞重量的方法。
在提供的培养基中的营养物在培养的过程中代谢并且必需补充以避免限制。如果氨基酸具有差的溶解度，仅能够制备并加入低浓缩的进料溶液。为了提供需要量的氨基酸，必需加入大体积的进料溶液。这导致了总培养体积的增加，培养液的稀释，并且因此对于高细胞密度方法是不利的。
20种天然存在的氨基酸的溶解度在下表中列出。
表
氨基酸天冬氨酸盐(aspartate)，天冬氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸的溶解度低于50g/l，并且因此，这些氨基酸被认为具有在水中具有差溶解度。
例如，氨基酸亮氨酸在20℃的水中具有24g/l的溶解度，并且因此溶解性差。在包含12.5％(w/v)氨的碱性溶液中，溶解度被增加到76g/l并且因此是在水中溶解度的超过三倍。同时，需要的进料体积被减少超过60％。如果同时，还将碱性溶液用于调节培养的pH值，那么可以将加入的体积甚至减少得更多。例如，氨基酸酪氨酸在20℃的水中具有0.4g/l的溶解度，并且因此溶解性差。在包含12.5％(w/v)氨的碱性溶液中，溶解度被增加到39g/l，并且因此是在水中溶解度的约100倍。
在一个实施方案中，氨基酸是天冬氨酸盐，天冬氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和/或酪氨酸。在另一个实施方案中，氨基酸是天冬氨酸盐，天冬氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，组氨酸，亮氨酸，色氨酸和/或酪氨酸。在一个实施方案中，氨基酸是亮氨酸。在一个实施方案中，氨基酸是在20℃在约7的pH值在水中具有差溶解性的氨基酸。在另一个实施方案中，氨基酸是亮氨酸和脯氨酸，或氨基酸是亮氨酸和脯氨酸和色氨酸。在另一个实施方案中，氨基酸在碱性溶液中具有比在20℃的水中的溶解度更高的溶解度。在另一个实施方案中，在碱性溶液中的溶解度是在20℃的水中溶解度的2-10倍。在一个实施方案中，氨基酸在水中具有40g/l以下的溶解度。在又一个实施方案中，氨基酸在水中具有30g/l以下的溶解度。在另一个实施方案中，氨基酸在碱性溶液中具有25g/l以上的溶解度。在另一个实施方案中，氨基酸在碱性溶液中具有30g/l以上的浓度。在又一个实施方案中，氨基酸在碱性溶液中具有35g/l以上的浓度。在另一个实施方案中，氨基酸在碱性溶液中具有50g/l以上的溶解度。
在下表中，显示在以不同的进料模式获得的具有10l工作体积的相同亮氨酸和脯氨酸营养缺陷型大肠杆菌细胞的培养容器中的培养结果。
表
由实验1和2(其中两种氨基酸作为单独的进料加入培养基中)可以看出，在培养结束时获得的总生物量和重组蛋白的产率与实验3和4(其中氨基酸作为组合的碱性进料同时加入以用于调节培养基的pH值)相比更低。此外，在实验3和4中的最终培养体积并未超过在实验1和2中的培养容器的工作体积。
在一个实施方案中，碱性溶液是在水中的12.5％(w/v)氨溶液并且包含约50g/l以上浓度的至少一种氨基酸。在一个实施方案中，碱性溶液包含约50g/l浓度的亮氨酸和脯氨酸。
可以用于在本文报道的方法中的原核细胞可以包含一种或多种氨基酸营养缺陷。例如，在亮氨酸生物合成途径中缺陷的大肠杆菌细胞可以选自LeuB6缺陷细胞13-6，χ148，χ156，χ2224，χ462，χ463，χ474，χ478，χ515，χ65，χ697，χ760，2000kMSE248，342-167，342MG，679-680，A586，A592，A593，AA100，AA7852，AA787，AB1102，AB1111，AB1115，AB1122，AB1129，AB113，AB1132，AB1133，AB114，AB1157，AB1157-D，AB1314，AB1330，AB1331，AB1881，AB1884，AB1885，AB188，CP78，CP79，CR34Thy-，CR34Thy-SR，CR34/308，CR34/313，CR34/399，CR34/43，CR34/454，CR34/500，CR34/7a，CS130，CS312，CS419，CS425，CS426，CS460，CS471，CS472，CS50，CS81，CS85，CSR06，CSR603，CSR603/pDR1996，CT28-3b，DA10，DA11，DB1161，DB1257，DE1878，DE1882，DE2345，DF225，DF41，JRG94，JS10C600r-m-，T6R，P678SSRpro-，PA20SR，PA200SR，PA201SR，PA214SRT6R，PA265SR，PA309，PDE70，PA340，PA340/T6，PA360，PA414，PAM161，PAM162，PAM163，PAM164，PAM660，PAT84，PB349，PB69，PC1，PC2，PC3，PC5，PC6，PC8，PJ1，PJ2，PJ3，PJ4，PJ5，PJC600(＝CRSR)，W208SRAzR，W2660，LAM-，W945his，WA2127，WA2379，WA2548，WA2552，WA2574，WA2899，WA921，WA946，WA960，Y10，Y46，Y53，Y70，YYC100。
在一个实施方案中，原核细胞是大肠杆菌K12细胞或大肠杆菌B细胞。
在一个实施方案中，碱性溶液是强碱性溶液。在又一个实施方案中，碱性溶液具有pH9以上，或pH10以上，或pH10.5以上的pH值。在又一个实施方案中，氨基酸在碱性溶液中的溶解度是氨基酸在水中的溶解度的至少2倍。
在一个实施方案中，本文报道的用于产生多肽的方法包括下述步骤：
a)提供包含编码多肽的核酸的氨基酸营养缺陷型细菌细胞，
b)培养提供的细胞，
c)用包含氨基酸(对于所述氨基酸所述细菌细胞是营养缺陷型)的碱性溶液调节培养过程中的pH值，
d)从细胞或培养基中回收多肽并且由此产生多肽。
发明的具体实施方案
1.一种用于培养表达多肽的大肠杆菌细胞的方法，其特征在于培养包括在培养过程中加入氨基酸的碱性溶液，所述氨基酸选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，
其中氨基酸在碱性溶液中具有高于在20℃和中性pH的水中的溶解度的浓度，并且氨基酸具有30g/l以上的浓度，并且
其中所述碱性溶液是10％(w/v)以上的氨溶液，并且
其中在培养中的一个时刻，培养的细菌细胞的干细胞重量是至少20g/l。
2.一种用于产生多肽的方法，所述方法包括下述步骤：
a)培养包含编码多肽的核酸的大肠杆菌细胞，
b)在培养过程中，用包含氨基酸的碱性溶液调节pH值，所述氨基酸选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，
c)从细胞或培养基中回收多肽并且由此产生多肽，
其中所述氨基酸在碱性溶液中具有30g/l以上的浓度，并且
其中所述碱性溶液是10％(w/v)以上的氨溶液。
3.根据前述实施方案中任一项的方法，其特征在于所述细菌细胞是氨基酸营养缺陷型细胞并且营养缺陷是关于选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的氨基酸。
4.根据前述实施方案中任一项的方法，其特征在于所述碱性溶液具有9以上的pH值。
5.根据前述实施方案中任一项的方法，其特征在于所述多肽是人载脂蛋白A1或其衍生物。
6.根据实施方案5的方法，其特征在于所述载脂蛋白A1具有选自SEQIDNO：01-35的氨基酸序列。
7.根据实施方案6的方法，其特征在于所述载脂蛋白A1具有选自SEQIDNO：01，02，34，和35的氨基酸序列。
8.根据前述实施方案中任一项的方法，其特征在于所述氨基酸具有约50g/l的浓度。
9.根据前述实施方案中任一项的方法，其特征在于所述碱性溶液是约12.5％(w/v)氨在水中的氨溶液。
10.根据前述实施方案中任一项的方法，其特征在于所述氨基酸是亮氨酸。
11.根据前述实施方案中任一项的方法，其特征在于所述碱性溶液包含亮氨酸和脯氨酸。
12.根据前述实施方案中任一项的方法，其特征在于所述碱性溶液是约12.5％(w/v)的氨溶液并且包含浓度分别为约50g/l的氨基酸亮氨酸和脯氨酸。
13.氨基酸的碱性溶液作为在细菌细胞的培养中的进料的应用，其中所述氨基酸选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，并且培养是多至20g/l以上的干细胞重量，并且氨基酸在碱性溶液中具有30g/l以上的浓度，并且碱性溶液是10％(w/v)以上的氨溶液。
14.根据实施方案13的应用，其特征在于所述细菌细胞是氨基酸营养缺陷型细胞，并且所述营养缺陷是关于选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的氨基酸。
15.根据实施方案2-12中任一项的方法，其特征在于所述大肠杆菌细胞是氨基酸营养缺陷型大肠杆菌细胞。
提供下述实施例、序列表和图以辅助理解本发明，本发明的真实范围在后附的权利要求中提出。要理解可以在不背离本发明精神的前提下对所述程序进行修改。
附图描述
图1参数绘图实施例3-单独的氨基酸进料。
图2参数绘图实施例3-单独的氨基酸进料。
图3参数绘图实施例4-组合的氨基酸进料。
图4参数绘图实施例4-组合的氨基酸进料。
材料和方法
用在578nm的DR2800光度计(Hach-Lange，Düsseldorf，Germany)来测量培养的光密度。
通过比较在SDS-Page凝胶上的标准蛋白带的体积和在发酵样品中产生的蛋白的带体积，通过光密度确定蛋白浓度。
实施例1
测定亮氨酸在氨溶液中的溶解度
将计算量的亮氨酸称重到500ml烧瓶中。在加入250ml去离子水之后，通过高压灭菌来对溶液进行灭菌。随后，加入250ml的25％(w/v)氨溶液，并且确定亮氨酸是否溶解。在亮氨酸溶解后，确定溶液的最终体积。如果其明显偏离500ml，再次用减量的水来制备溶液(见表3)。
表3
亮氨酸浓度[g/l] 17 18 19 20 21 25 30 40 50
水[ml] 250 250 250 250 250 250 250 250 250
氨溶液[ml] 250 250 250 250 250 250 250 250 250
可溶 是 是 是 是 是 是 是 是 是
最终体积[ml] 500 500 500 500 500 500 500 500 500
亮氨酸浓度[g/l] 60 70 71 72 73 74 75 76 77
水[ml] 250 250 250 250 250 250 250 250 250
氨溶液[ml] 250 250 250 250 250 250 250 250 250
可溶 是 是 是 是 是 是 是 是 不
最终体积[ml] 500 500 500 500 500 500 500 500 500
实施例2
大肠杆菌表达质粒的制备和描述
通过重组方式制备四连蛋白-载脂蛋白A-I融合多肽。表达的融合多肽从N端到C端方向的氨基酸序列如下：
-氨基酸甲硫氨酸(M)，
-具有CDLPQTHSL氨基酸序列的干扰素序列的片段(SEQIDNO：36)，
-GS接头，
-具有氨基酸序列HHHHHH(SEQIDNO：37)的六-组氨酸标记，
-GS接头，
-具有VVAPPAP的氨基酸序列(SEQIDNO：38)的IgA蛋白酶裂解位点，和
-四连蛋白-载脂蛋白A-I，其具有SEQIDNO：02的氨基酸序列。
如上所述的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合多肽是前体多肽，在体外使用IgA蛋白酶，使所述四连蛋白-载脂蛋白A-I融合多肽通过酶促裂解从所述前体多肽释放。
用已知重组方法和技术通过连接适合的核酸片段装配编码前体多肽的融合基因。通过DNA测序证实通过化学合成制备的核酸序列。用于产生四连蛋白-载脂蛋白A-I的表达质粒如下制备：
制备大肠杆菌表达质粒
质粒4980(4980-pBRori-URA3-LACI-SAC)是在大肠杆菌中表达核心-链霉抗生物素蛋白的表达质粒。其通过衍生自质粒1966(1966-pBRori-URA3-LACI-T-重复序列；在EP-B1422237中报道)的3142bp长的EcoRI/CelII-载体片段与435bp长的编码核心-链霉抗生物素蛋白的EcoRI/CelII-片段连接来产生。
核心-链霉抗生物素蛋白大肠杆菌表达质粒包含下述元件：
-用于大肠杆菌复制的来自载体pBR322的复制起点(对应于根据Sutcliffe，J.G，等，Quant.Biol.43(1979)77-90的bp位置2517-3160)，
-酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶的URA3基因(Rose，M.，等，Gene29(1984)113-124)，其允许通过大肠杆菌pyrF突变体菌株(尿嘧啶营养缺陷型)的互补来进行质粒选择，
-核心-链霉抗生物素蛋白表达盒，其包含
-T5杂合启动子(根据Bujard，H.，等，Methods.Enzymol.155(1987)416-433和Stueber，D.，等，Immunol.MethodsIV(1990)121-152的T5-PN25/03/04杂合启动子)，包括根据Stueber，D.，等(见前文)的合成核糖体结合位点，
-核心-链霉抗生物素蛋白基因，
-两个噬菌体-衍生的转录终止子，λ-T0终止子(Schwarz，E.，等，Nature(自然)272(1978)410-414)和fd-终止子(Beck，E.，和Zink，B.，Gene(基因)1-3(1981)35-58)，
-来自大肠杆菌的lacI阻遏基因(Farabaugh，P.J.，Nature(自然)274(1978)765-769)。
用于表达四连蛋白-载脂蛋白A-I前体多肽的最终表达质粒通过使用单一侧翼EcoRI和CelII限制性核酸内切酶切割位点从载体4980切除核心-链霉抗生物素蛋白结构基因并将EcoRII/CelII限制性位点侧邻的编码前体多肽的核酸插入3142bp长的EcoRI/CelII-4980载体片段来制备。
实施例3
亮氨酸和脯氨酸作为单独的溶液进料
在该参考例中，进行用Riesenberg，等，(1991，上文)报道的高细胞密度培养方法培养营养缺陷型大肠杆菌菌株联合氨基酸L-亮氨酸和L-脯氨酸的单独进料。
使用大肠杆菌K-12菌株CSPZ-2(leuB，proC，trpE，th-1，ΔpyrF)。用表达质粒转化菌株从而产生治疗蛋白并且作为安瓿中的原始种子库保存，所述安瓿中包含1ml在限定的预培养基中生长到约1的光密度(在578nm测定)的菌株和1ml甘油85％(v/v)并贮存在-80C。
限定的预培养基是根据Sambrook，J.，等，MolecularCloning：ALaboratoryManual，SecondEdition(分子克隆：实验室手册，第二版)，ColdSpringHarborLaboratoryPress(冷泉港实验室出版)，ColdSpringHarbor，N.Y(1989)的M9培养基，补充以
1.0g/lL-亮氨酸，
1.0g/lL-脯氨酸，和
1.0mg/l硫胺-HCl。
关于发酵，使用根据Riesenberg，等，(1991，前文)的分批培养基：
27.6g/l葡萄糖，
13.3g/lKH2PO4，
4.0g/l(NH4)2HPO4，
1.7g/l柠檬酸盐，
1.2g/lMgSO4*7H2O，
60mg/l柠檬酸铁(III)，
2.5mg/lCoCl2*6H2O，
15mg/lMnCl2*4H2O，
1.5mg/1CuCl2*2H2O，
3mg/lH3BO3，
2.5mg/lNa2MoO4*2H2O，
8mg/lZn(CH3COO)2*2H2O，
8.4mg/lTitriplexIII，和
1.3ml/lSynperonic10％消泡剂。
给分批培养基补充以：
5.4mg/l硫胺-HCl，和
1.2g/ll-亮氨酸和l-脯氨酸(分别的)。
进料1溶液包含：
700g/l葡萄糖，和
19.7g/lMgSO4*7H2O。
进料2溶液包含
20g/ll-亮氨酸。
进料3溶液包含
100g/ll-脯氨酸。
通过称重氨基酸，将氨基酸溶解在水中，并将溶液进行高压灭菌来制备进料2和3。随后确定溶液的pH值是约6.15(关于进料2)，和约6.43(关于进料3)。
用于pH调节的碱性溶液是12.5％(w/v)NH3水溶液。
所有的成分溶解在去离子水中。
关于预培养，用2ml原始种子库安瓿接种在1000ml具有3个隔板的Erlenmeyer-烧瓶中的300mlM9培养基中。在37℃，在旋转式振荡器上进行培养13小时，直到达到1-3的光密度(在578nm测定)。
在10lBiostatCDCU3发酵器(Sartorius，Melsungen，Germany)中进行主发酵。用6.4l无菌分批培养基加300ml预培养物开始，在37℃，pH6.9±0.2，500mbar和10l/min的通气速率进行分批发酵。在开始补充的葡萄糖耗尽后，将温度调节到28℃，并且发酵进入补料-分批模式，溶氧(pO2)保持在50％(DO-stat，见，例如Shay，L.K.，等，(1987，前文))并通过加入进料1组合恒定增加的搅拌器速率(在10小时内从550rpm-1000rpm和在16小时内从1000rpm-1400rpm)和通气速率(在10小时内，从10l/min-16l/min和在5小时内从16l/min到20l/min)进行。当pH达到最低调节限制，即pH6.70时，开始供应另外的氨基酸，伴随加入进料2(用33.8ml/h开始进行14小时，接着增加到97.6ml/h)和进料3(用6.8ml/h起始进行14小时，接着增加到19.5ml/h)。从单独的发酵轮次计算流动速率(见实施例4)以分别地精确地将相同量的氨基酸施加到培养中(独立于进料策略)。通过在70的光密度加入1mMIPTG来诱导重组治疗蛋白的表达。
在图1和2中显示该发酵的参数绘图。
在接种随后的短期滞后期后，以μtmax＝0.301/h的最大比增殖速率培养细胞。在8小时的培养后，达到pH调节下限，并通过加入12.5％NH4OH溶液将pH控制在6.70。同时，通过加入进料2和进料3起始氨基酸进料。16小时后，通过pO2值的急剧增加指示葡萄糖耗尽。此时，培养温度从37℃变化到28℃。在另外的15分钟后，起始pO2-进料控制，并通过加入进料1同时持续增加搅拌和通气速率到它们各自的最大值1400rpm和20l/min来将pO2控制在50％。生长速率持续从0.15减少到约0.051/h。伴随地，在36小时的培养后，将搅拌器速率逐步减少。当可以确定光密度没有进一步的增加时，终止发酵，并在收集前，将细菌细胞冷却到4℃过夜。
在发酵结束时，总的生物量产率是49.4g/l(干物质)。在发酵过程中，几乎没有分泌乙酸盐，但是到结束时，浓度急剧增加到7g/l。重组蛋白形成产率为9.96g/l。培养液的体积超过发酵器容器正常的工作体积并增加到11.8l。
重复发酵，并导致130的终末光密度，50.6g/l的末端生物量产率，和9.0g/l的重组蛋白产率，在发酵结束时培养液体积是12.2l。
实施例4
进料在碱性溶液中加入的亮氨酸和脯氨酸来进行pH调节
在该发酵中，将氨基酸进料加入碱性pH控制溶液中。这次发酵的基础是与实施例3中所用相同的根据Riesenberg，等，(1991，前文)的高细胞密度培养方法。将氨基酸L-亮氨酸和L-脯氨酸加入12.5％NH3水溶液中，并在pH控制过程中用碱添加物进料。
使用大肠杆菌K-12菌株CSPZ-2(leuB，proC，trpE，th-1，ΔpyrF)。用表达质粒转化菌株从而产生治疗蛋白并且作为安瓿中的原始种子库保存，所述安瓿中包含1ml在限定的预培养基中生长到约1的光密度(在578nm测定)的菌株和1ml甘油85％(v/v)并贮存在-80℃。
限定的预培养基是根据Sambrook，J.，等，MolecularCloning：ALaboratoryManual，SecondEdition(分子克隆：实验室手册，第二版)，ColdSpringHarborLaboratoryPress(冷泉港实验室出版)，ColdSpringHarbor，N.Y(1989)的M9培养基，补充以
1.0g/lL-亮氨酸，
1.0g/lL-脯氨酸，和
1.0mg/l硫胺-HCl。
关于发酵，使用根据Riesenberg，等，(1991，前文)的分批培养基：
27.6g/l葡萄糖，
13.3g/1KH2PO4，
4.0g/l(NH4)2HPO4，
1.7g/l柠檬酸盐，
1.2g/lMgSO4*7H2O，
60mg/l柠檬酸铁(III)，
2.5mg/lCoCl2*6H2O，
15mg/lMnCl2*4H2O，
1.5mg/lCuCl2*2H2O，
3mg/lH3BO3，
2.5mg/lNa2MoO4*2H2O，
8mg/lZn(CH3COO)2*2H2O，
8.4mg/lTitriplexIII，和
1.3ml/lSynperonic10％消泡剂。
给分批培养基补充以：
5.4mg/l硫胺-HCl，和
1.2g/ll-亮氨酸和l-脯氨酸(分别地)。
进料1溶液包含
700g/l葡萄糖，和
19.7g/lMgSO4*7H2O。
用于pH调节的碱性溶液是12.5％(w/v)NH3水溶液，分别补充了50g/lL-亮氨酸和50g/lL-脯氨酸。
所有的成分溶解在去离子水中。
在10lBiostatCDCU3发酵器(Sartorius，Melsungen，Germany)中进行主发酵。用6.4l无菌分批培养基加300ml预培养物开始，在37℃，pH6.9±0.2，500mbar和10l/min的通气速率进行分批发酵。在开始补充的葡萄糖耗尽后，将温度调节到28℃，并且发酵进入补料-分批模式，溶氧(pO2)保持在50％(DO-stat，见，例如Shay，L.K.，等，(Shay，L.K.，等，J.Indus.Microbiol.2(1987)79-85)并通过加入进料1组合恒定增加的搅拌器速率(在10小时内从550rpm-1000rpm和在16小时内从1000rpm-1400rpm)和通气速率(在10小时内，从10l/min-16l/min和在5小时内从16l/min到20l/min)进行。当pH达到pH6.70的调节下限时，通过加入碱供应另外的氨基酸。从加入碱的时程中，计算在实施例2中关于进料2和3的流动速率，以分别地精确地将相同量的氨基酸施加到培养中(独立于进料策略)。通过在70的光密度加入1mMIPTG来诱导重组治疗蛋白的表达。
在图3和4中显示该发酵的典型参数绘图。
在接种随后的短期滞后期后，以μtmax＝0.301/h的最大比增殖速率培养细胞。在8小时的培养后，达到pH调节下限，并通过加入分别补充了50g/lL-亮氨酸和50g/lL-脯氨酸的12.5％NH3水溶液将pH控制在pH6.70。这同时起始氨基酸进料。16小时后，耗尽了提供的葡萄糖。此时，培养温度从37℃变化到28℃。在另外的15分钟后，起始pO2-进料控制，并通过加入进料1同时持续增加搅拌和通气速率到它们各自的最大值1400rpm和20l/min来将pO2控制在50％。生长速率持续从0.15减少到约0.051/h。当可以鉴定光密度没有进一步的增加时，终止发酵，并在收集前，将细菌细胞冷却到4℃过夜。
在发酵结束时，光密度是169，并且总的生物量产率是75.7g/l(干物质)。在发酵过程中，几乎没有分泌乙酸盐，但是到结束时，浓度急剧增加到1g/l。重组蛋白形成产率为16.5g/l。培养液的体积是10.2l。
用溶解在碱性溶液中的不同量的氨基酸(33g/l的L-亮氨酸和L-脯氨酸)重复发酵。进料的氨基酸的量更少并且导致145的光密度，56.5g/l的末端生物量产率，和13.5g/l的重组蛋白产率，在发酵结束时培养液体积是9.31。

Claims (9)

1.用于产生多肽的方法，所述方法包括下述步骤：
a)培养包含编码所述多肽的核酸的大肠杆菌K12菌株细胞，
b)在培养过程中，用包含氨基酸的碱性溶液调节pH值，所述氨基酸选自亮氨酸和脯氨酸，其中所述大肠杆菌K12菌株细胞对所述氨基酸是营养缺陷型的，
c)从细胞中回收所述多肽并且由此产生所述多肽，
其中所述氨基酸在所述碱性溶液中具有30g/l以上的浓度，和
其中所述碱性溶液是10％(w/v)以上的氨溶液，和
其中所述培养的细菌细胞的干细胞重量在培养中的一个时刻是至少20g/l。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述碱性溶液具有9以上的pH值。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述多肽是人载脂蛋白A1或其衍生物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述载脂蛋白A1具有选自SEQIDNo：01-35的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述载脂蛋白A1具有选自SEQIDNo：01，02，34和35的氨基酸序列。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述氨基酸具有约50g/l的浓度。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述碱性溶液是约12.5％(w/v)的氨在水中的氨溶液。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述氨基酸是亮氨酸。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述碱性溶液包含亮氨酸和脯氨酸。
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