JP5798193B2 - アルカリ性フィード - Google Patents
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Description
近年、タンパク質の生産は着実に増加し、そしてタンパク質は近い将来に種々の疾病の治療に利用できる最大の治療薬群になる可能性がある。タンパク質の効果は、その特異性、例えば特異的なターゲット認識および結合機能から生じる。
アミノ酸をアルカリ溶液において培養培地に加えるならば、原核細胞、特にアミノ酸栄養要求性E.coli K12株を高細胞密度で化学的に既知組成培地で培養することができることが判明した。
アミノ酸はアルカリ溶液において、20℃および中性pHにおける水中のその溶解度よりも高い濃度を有し、そして
培養した細菌細胞の乾燥細胞重量は、培養の1時点において少なくとも20g/lである。
a)ポリペプチドをコードする核酸を含む、細菌細胞、特にE.coli細胞を準備する工程、
b)準備した細胞を培養する工程、
c)培養中にアスパラギン酸塩(aspartate)、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンから選択されたアミノ酸を含むアルカリ溶液を用いてpH値を調整する工程、
d)細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、そしてこれによりポリペプチドを産生する工程
を含む、ポリペプチドを産生するための方法である。
本明細書において、原核細胞、例えばアミノ酸栄養要求性細菌細胞を培養するための方法を報告し、少なくとも1つのアミノ酸、例えば細胞が栄養要求性であるアミノ酸を、アルカリ溶液中に加える。
a)原核細胞を準備する工程、
b)原核細胞を培養する工程、
c)原核細胞の培養中に、アスパラギン酸塩(aspartate)、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンから選択されたアミノ酸を含むアルカリ溶液を用いてpH値を調整する工程
を含む。
a)ポリペプチドをコードする核酸を含むアミノ酸栄養要求性細菌細胞を準備する工程、
b)準備した細胞を培養する工程、
c)培養中に、細菌細胞が栄養要求性であるアミノ酸を含むアルカリ溶液を用いてpH値を調整する工程、
d)細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、そしてそれによりポリペプチドを産生する工程
を含む、本明細書において報告したポリペプチドを産生するための方法。
1.ポリペプチドを発現するEscherichia coli細胞を培養するための方法であって、培養は、培養中におけるアスパラギン酸塩(aspartate)、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンから選択されたアミノ酸のアルカリ溶液の添加を含むことを特徴とし、
アミノ酸はアルカリ溶液において、20℃および中性pHにおける水中のその溶解度よりも高い濃度を有し、そしてアミノ酸は30g/l以上の濃度を有し、そして
アルカリ溶液は、10%(w/v)以上のアンモニア溶液であり、そして
培養した細菌細胞の乾燥細胞重量は、培養の1時点において少なくとも20g/lである、前記方法。
a)ポリペプチドをコードする核酸を含むEscherichia coli細胞を培養する工程、
b)培養中にアスパラギン酸塩(aspartate)、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンから選択されたアミノ酸を含むアルカリ溶液を用いてpH値を調整する工程、
c)細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、そしてそれによりポリペプチドを産生する工程
を含むポリペプチドを産生するための方法であって、
アミノ酸は、アルカリ溶液において30g/l以上の濃度を有し、そして
アルカリ溶液は、10%(w/v)以上のアンモニア溶液である、前記方法。
培養液の吸光度を、DR2800光度計(Hach-Lange, Dusseldorf, Germany)を用いて578nmで測定した。
アンモニア溶液中のロイシンの溶解度の決定
計算された量のロイシンを、500mlのフラスコに評量した。250mlの脱イオン水の添加後、溶液をオートクレーブにかけることにより滅菌する。その後、250mlの25%(w/v)アンモニア溶液を加え、そしてロイシンが溶解したかしないかを決定する。ロイシンの溶解後、溶液の最終容量を決定した。それが500mlよりも顕著に逸脱している場合には、溶液を、再度、減量した水を用いて調製した(表3参照)。
E.coli発現プラスミドの作製および説明
テトラネクチン−アポリポタンパク質A−I融合ポリペプチドを組換え手段によって調製した。N末端からC末端の方向の発現された融合ポリペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである:
− アミノ酸メチオニン(M)、
− CDLPQTHSL(配列番号36)のアミノ酸配列を有するインターフェロン配列のフラグメント、
− GSリンカー、
− HHHHHH(配列番号37)のアミノ酸配列を有するヘキサヒスチジンタグ、
− GSリンカー、
− VVAPPAP(配列番号38)のアミノ酸配列を有するIgAプロテアーゼ開裂部位、および
− 配列番号02のアミノ酸配列を有するテトラネクチン−アポリポタンパク質A−I。
プラスミド4980(4980−pBRori−URA3−LACI−SAC)は、E.coliにおけるコアストレプトアビジンの発現のための発現プラスミドである。それは、プラスミド1966に由来する3142bp長のEcoRI/CelIIベクターフラグメント(1966−pBRori−URA3−LACI−T−リピート;EP-B 1 422 237に報告)を、435bp長のコアストレプトアビジンをコードするEcoRI/CelIIフラグメントとライゲーションすることによって作製された。
− E.coliにおける複製のためのベクターpBR322に由来する複製起点(Sutcliffe, J.G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90に記載のbp位置2517〜3160に対応)、
− E.coli pyrF突然変異株の補完によるプラスミド選択を可能とする(ウラシル栄養要求性)、オロチジン5’−リン酸デカルボキシラーゼをコードするSaccharomyces cerevisiaeのURA3遺伝子(Rose, M., et al., Gene 29 (1984) 113-124)、
− 以下を含むコアストレプトアビジン発現カセット
− Stueber, D., et al.(後記参照)に記載の合成リボソーム結合部位を含む、T5ハイブリッドプロモーター(Bujard, H., et al., Methods. Enzymol. 155 (1987) 416-433およびStueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152に記載のT5−PN25/03/04ハイブリッドプロモーター)、
− コアストレプトアビジン遺伝子、
− バクテリオファージに由来する2つの転写終結因子であるλ−T0終結因子(Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414)およびfd終結因子(Beck, E., and Zink, B., Gene 1-3 (1981) 35-58)、
− E.coli由来のlacIリプレッサー遺伝子(Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769)。
別々の溶液としてのロイシンおよびプロリンのフィーディング
この参照実施例において、アミノ酸のL−ロイシンおよびL−プロリンの別々のフィーディングと組み合わせたRiesenberg, et al.(1991、前記)によって報告された高細胞密度培養法を用いての栄養要求性E.coli株の培養を実施した。
1.0g/lのL−ロイシン、
1.0g/lのL−プロリン、および
1.0mg/lのチアミンHCl
の補充されたSambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載のM9培地であった。
27.6g/lのグルコース、
13.3g/lのKH2PO4、
4.0g/lの(NH4)2HPO4、
1.7g/lのクエン酸塩、
1.2g/lのMgSO4・7H2O、
60mg/lのクエン酸鉄(III)、
2.5mg/lのCoCl2・6H2O、
15mg/lのMnCl2・4H2O、
1.5mg/lのCuCl2・2H2O、
3mg/lのH3BO3、
2.5mg/lのNa2MoO4・2H2O、
8mg/lのZn(CH3COO)2・2H2O、
8.4mg/lのTitriplex III、および
1.3ml/lのSynperonic10%消泡剤。
5.4mg/lのチアミンHCl、並びに
1.2g/lのl−ロイシンおよびl−プロリンをそれぞれ補充した。
700g/lのグルコース、および
19.7g/lのMgSO4・7H2Oを含んでいた。
pH調節のためのアルカリ溶液に取り込まれたロイシンおよびプロリンのフィーディング
この発酵においては、アミノ酸フィーディングを、アルカリ性pH制御溶液に取り込んだ。この発酵の基本は、実施例3に使用したRiesenberg, et al., (1991、上記)によるのと同じ高細胞密度培養法である。アミノ酸のL−ロイシンおよびL−プロリンを12.5%NH3水溶液に取り込み、pH制御中にアルカリの添加と共に与えた。
1.0g/lのL−ロイシン、
1.0g/lのL−プロリン、および
1.0mg/lのチアミンHCl
の補充されたSambrook, J., et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))によるM9培地であった。
27.6g/lのグルコース、
13.3g/lのKH2PO4、
4.0g/lの(NH4)2HPO4、
1.7g/lのクエン酸塩、
1.2g/lのMgSO4・7H2O、
60mg/lのクエン酸鉄(III)、
2.5mg/lのCoCl2・6H2O、
15mg/lのMnCl2・4H2O、
1.5mg/lのCuCl2・2H2O、
3mg/lのH3BO3、
2.5mg/lのNa2MoO4・2H2O、
8mg/lのZn(CH3COO)2・2H2O、
8.4mg/lのTitriplex III、および
1.3ml/lのSynperonic10%消泡剤。
5.4mg/lのチアミンHCl、並びに
1.2g/lのl−ロイシンおよびl−プロリンをそれぞれ補充した。
700g/lのグルコース、および
19.7g/lのMgSO4・7H2Oを含んでいた。
Claims (11)
- 以下の工程
a)ポリペプチドをコードする核酸を含むエシェリキアコリィ(Escherichia coli)細胞を培養する工程、
b)培養中にアスパラギン酸塩、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンから選択されたアミノ酸を含むアルカリ溶液を用いてpH値を調整する工程、
c)細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、そしてそれによりポリペプチドを産生する工程
を含むポリペプチドを産生するための方法であって、
アミノ酸は、アルカリ溶液中において30g/l以上の濃度を有し、そして
アルカリ溶液は、10%(w/v)以上のアンモニア溶液である、前記方法。 - 細菌細胞がアミノ酸栄養要求性細胞であり、そして栄養要求性が、アスパラギン酸塩、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンから選択されたアミノ酸に対してであることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- アルカリ溶液が、9以上のpH値を有することを特徴とする、請求項1または2記載の方法。
- ポリペプチドがヒトアポリポタンパク質A1またはその誘導体であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- アポリポタンパク質A1が、配列番号01〜35から選択されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項4記載の方法。
- アポリポタンパク質A1が、配列番号01、02、34および35から選択されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項5記載の方法。
- アミノ酸が、50g/lの濃度を有することを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- アルカリ溶液が、アンモニア12.5%(w/v)のアンモニア水溶液であることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。
- アミノ酸がロイシンであることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
- アルカリ溶液がロイシンおよびプロリンを含むことを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項記載の方法。
- アルカリ溶液が12.5%(w/v)のアンモニア溶液であり、そして各々50g/lの濃度のアミノ酸のロイシンおよびプロリンを含むことを特徴とする、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
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