CN116064439A - 一种高密度发酵产god的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高密度发酵产GOD的方法，将种子液接种到经过灭菌处理的发酵培养基中进行发酵培养；采用温度和pH两阶段控制和分段补料技术，结合尾气分析，在发酵期间通过OD、溶氧、OUR和RQ联合反馈调节控制发酵过程中的风量、转速和补料速度，实现GOD的高效胞外表达，下罐酶活达50000U/mL以上，比酶活5000U/mg以上。本发明方法以甘油为唯一碳源，不经过甲醇诱导，操作安全、简单，成本低，GOD产量和纯度高，利于后续分离纯化，便于工业化扩大生产。

Description

一种高密度发酵产GOD的方法
技术领域
本发明涉及GOD发酵技术领域，更具体地说是涉及一种高密度发酵产GOD的方法。
背景技术
葡萄糖氧化酶(简称GOD)是一种需氧脱氢酶，通常与过氧化氢酶联合发挥催化作用。有氧条件下，GOD能够专一性地催化氧化β-D葡萄糖生成葡萄糖酸内酯和过氧化氢，其中过氧化氢在过氧化氢酶的作用下分解生成水，葡萄糖酸内酯随后自发水解或在内酯酶的作用下水解成葡萄糖酸。GOD因其具有的氧化还原性，在食品、饲料、医药、生物等行业被广泛应用，具有广阔的应用前景。
目前工业上主要利用黑曲霉和青霉生产GOD，但发酵过程中存在产生真菌毒素、发酵副产物较多等不利于后期酶分离的缺点，人们纷纷采取异源表达重组的方式来解决上述问题。毕赤酵母表达系统作为一种成熟的外源蛋白表达系统，具有生长迅速、易于培养、表达量高及成本较低的优点，常被用于黑曲霉和青霉GOD基因的异源表达。张娟等(申请号：CN201410606913.8)公开了一种强化毕赤酵母高密度发酵产葡萄糖氧化酶的方法，采用甘露醇混合流加、两步式甲醇流加等策略，在3L发酵罐上酶活达到1634.7U/mL。高庆华等(申请号：CN201711406416.3)采用体积比为20:1的甲醇和山梨醇对毕赤酵母进行诱导发酵，下罐酶活达到905U/mL。顾磊(2014)等通过对GOD进行定点突变以及改造P.pastoris的翻译加工和转运的过程，提高了GOD的表达能力，在3L发酵罐中，GOD分泌产量达到1972U/mL。魏东升(2021)等通过共表达多个辅助折叠因子和强化碳代谢途径，获得GOD高产菌，在50L反应器中胞外GOD产量可达到6656.6U/g。这些高密度培养且多为甲醇诱导型表达，组成型表达较少。与甲醇诱导型表达系统相比，组成型表达系统不需要把碳源从甘油更换到甲醇，因此避免了储藏和运输甲醇的花费和危害，更适合工业化生产外源蛋白。目前，有学者成功得到了可以在毕赤酵母中高效启动GOD基因表达的组成型启动子，但表达量低，不利于大规模生产。
因此，提供一种更适合工业化大规模生产、安全、无污染的高密度表达GOD的毕赤酵母和方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种毕赤酵母高密度发酵产葡萄糖氧化酶的方法。以重组毕赤酵母为出发菌株，经种子培养后转入发酵罐进行发酵，采用温度和pH两阶段控制和分段补料技术，结合尾气分析，在发酵期间通过OD、溶氧、OUR和RQ联合反馈调节控制发酵过程中的风量、转速和补料速度，实现GOD的高效胞外表达，本发明方法以甘油为唯一碳源，不经过甲醇诱导，操作安全、简单，成本低，GOD产量和纯度高，利于后续分离纯化，便于工业化扩大生产。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种重组毕赤酵母，所述毕赤酵母为将GOD基因转化至毕赤酵母GS115体内构建得到。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的重组毕赤酵母菌株在高密度发酵产GOD中的应用。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种高密度发酵重组毕赤酵母产GOD的发酵培养基，其特征在于，包括：将甘油200g、硫酸铵100g、硫酸钙9.3g、硫酸钾182g、氢氧化钾41.3g、磷酸267mL、水8.5L、硫酸镁149g和PTM143mL。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种高密度发酵重组毕赤酵母产GOD的发酵培养基的制备方法，其特征在于，过程包括：
①称取、灭菌：将甘油200g、硫酸铵100g、硫酸钙9.3g、硫酸钾182g、氢氧化钾41.3g、磷酸267mL和水9L混合并加入发酵罐中，115-121℃，灭菌20-30min；
②冷却：将灭菌后的发酵罐进循环水冷却至30℃；
③混合：将149g的硫酸镁和43mL的PTM1单独灭菌，并于接种前一同放入发酵罐中，得到发酵培养基。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种高密度发酵产GOD的方法，其特征在于，以权利要求1所述的重组毕赤酵母和权利要求3所述的发酵培养基进行发酵，过程包括：
(1)培养重组毕赤酵母，获得种子液；
(2)将步骤(1)所得种子液以10％的接种量接种到经过灭菌处理的发酵培养基中进行发酵培养；发酵罐初始搅拌转速为200～250r/min，罐压为0.02～0.03MPa，通风比为0.5～0.8VVM，温度为30℃，流加质量浓度为17％的氨水调pH至6.0，待菌体生长至发酵罐内溶氧为5％-10％时，通过调节搅拌转速、风量和罐压将溶氧维持在5-10％，耗氧速率由0.4-0.7molO2/L/h上升至35-45molO2/L/h；
(3)当发酵罐内甘油浓度耗尽后，OUR下降至15-20molO2/L/h，开始流加补料，OUR逐渐回升；调节补料流加速度12-14g/L/h，维持RQ值在0.6-0.8；RQ值大于0.8，降低补料速率至10-12g/L/h；RQ值小于0.6，提高补料速率至14-15g/L/h；OD600＝100-150时，降温至25-28℃，流加质量浓度为17％的氨水调pH至6.5，流加补料不变；当OUR值开始下降时，发酵结束，得到GOD发酵液。
作为上述技术方案优选的技术方案，步骤(1)中种子液的制备过程包括下述步骤：
①将重组毕赤酵母菌液以1％的接种量接种至一级种子培养基中，在30℃、220r/min条件下培养10-12h，获得一级种子液；
②将步骤①获得的一级种子液以2％的接种量接种至二级种子培养基中，在30℃、220r/min条件下培养10-12h，得到重组毕赤酵母种子液。
作为上述技术方案优选的技术方案，所述一级种子液和二级种子液的培养基均为酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，甘油10g/L。
作为上述技术方案优选的技术方案，所述步骤(3)中的流加补料分为两种，发酵罐内甘油浓度耗尽后先补加补料1，补料1的组分为50％甘油和1.2％的PTM1混合液体，补料1流加结束后开始流加补料2，补料2的组分为50％甘油、1.2％PTM1和2％氮源的混合液体。
作为上述技术方案优选的技术方案，所述补料1的流加总体积为发酵初体积的1/5；所述氮源包括但不限于尿素、磷酸氢二铵、硫酸铵等无机氮源和蛋白胨、酵母粉。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明达到的技术效果是：
(1)本发明利用的是毕赤酵母的组成型表达，发酵过程中仅用甘油为碳源，不需要甲醇诱导，避免了储藏和运输甲醇的花费和危害，不存在安全和环境污染问题，更适合外源基因的工业化扩大生产；
(2)毕赤酵母的组成型表达一般采用恒温恒pH培养，本发明采用温度和pH两阶段控制和分段补料技术，在发酵期间通过OD、溶氧、OUR和RQ联合反馈调节控制发酵过程中的风量、转速和补料速度，补料后采取降温和提高pH的方式，有利于外源蛋白的翻译后修饰和正确重叠，促进GOD的高效表达；
(3)本发明采用分段流加的方式，在发酵中后期采用碳氮源混合补料的方式，及时补充氮源，维持一定的C/N比，提高宿主菌的存活力，减少因菌体裂解造成大量胞内蛋白酶释放对外源蛋白的降解作用，可以有效减少发酵液中杂蛋白数量，GOD比酶活大大提高，重组蛋白纯度高，有利于后续分离纯化和工业放大；
(4)本发明结合尾气分析，通过OUR和RQ对发酵过程进行调节。补料前阶段，OUR值突然下降表明酵母的营养物质缺失，需要及时补料。补料期间，OUR值上升及RQ值下降表明毕赤酵母的营养物质减少，需要增加补料流加速率，OUR值下降及RQ值上升表明毕赤酵母的营养物质过剩，需要降低补料流加速率。根据OUR及RQ的变化趋势能够快速调整补料速率，提高甘油的利用效率，实现了GOD在重组毕赤酵母的高效胞外表达，下罐酶活达50000U/mL以上。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1构建重组毕赤酵母
(1)表达载体构建：扩增GOD基因，使用同源重组方式将GOD连接至pPIC9K载体，构建pPIC9K-GOD表达载体。
(2)重组菌的构建和筛选：将表达载体pPIC9K-GOD进行线性化处理，纯化后电转化毕赤酵母GS115，利用GS115组氨酸缺陷型特征，在MD平板上进行筛选。将阳性克隆经PCR验证及测序后筛选到正确的重组菌，即为重组毕赤酵母。
实施例2制备种子液
(1)一级种子液(25mL/150mL三角瓶)培养
配制一级种子培养基(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，甘油10g/L，121℃灭菌30min)，按1％的接种量接种重组毕赤酵母，30℃、220r/min条件下培养10-12h，获得一级种子液，测其OD600＝3-6；
(2)二级种子液(1L/5L三角瓶)培养
配制二级种子培养基(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，甘油10g/L，121℃灭菌30min)，将一级种子液以2％的接种量接种至二级种子培养基中，30℃、220r/min条件下培养10-12h，得到重组毕赤酵母种子液，测OD600＝5-8。
实施例3制备发酵培养基
①称取、灭菌：将甘油200g、硫酸铵100g、硫酸钙9.3g、硫酸钾182g、氢氧化钾41.3g、磷酸267mL和水9L混合并加入发酵罐中，115-121℃，灭菌20-30min；
②冷却：将灭菌后的发酵罐进循环水冷却至30℃；
③混合：将149g的硫酸镁和43mL的PTM1单独灭菌，并于接种前一同放入发酵罐中，得到发酵培养基。
以实施例2的重组毕赤酵母种子液和实施例3的发酵培养基发酵产GOD，如实施例4-实施例8；
实施例4
接种OD600＝7.23的种子液，发酵罐初始搅拌转速为200r/min，罐压为0.02MPa，通风比为0.5VVM，温度为30℃，流加质量浓度为17％的氨水调pH至6.0。待菌体生长至发酵罐内溶氧为5％-10％时，通过调节搅拌转速、风量和罐压将溶氧维持在5-10％，耗氧速率由0.5molO2/L/h上升至35.4molO2/L/h；
发酵至27h，OUR下降至18.1molO2/L/h，发酵罐内甘油浓度耗尽，开始流加补料1(补料1组分为50％甘油和1.2％的PTM1混合液体，总体积为2L)，OUR逐渐回升。初始补料流加速度13.5g/L/h，维持RQ值在0.73左右。发酵36h，OD600＝125时，降温至25℃，流加质量浓度为17％的氨水调pH至6.5，RQ值降至0.50，提高补料速率至14.75g/L/h；发酵40h补料1流加结束，开始流加补料2(补料2组分为50％甘油、1.2％PTM1和9.4％硫酸铵的混合液体)，流速不变；发酵57h，RQ值升至0.75，降低补料速率至12.5g/L/h。发酵84h，RQ值升至0.93，降低补料速率至10.5g/L/h。发酵140h，OUR大幅下降，发酵结束，此时GOD酶活57710U/mL，比酶活5719U/mg。
实施例5
接种OD600＝5.39的种子液，发酵罐初始搅拌转速为250r/min，罐压为0.025MPa，通风比为0.6VVM，温度为30℃，流加质量浓度为17％的氨水调pH至6.0。待菌体生长至发酵罐内溶氧为5％-10％时，通过调节搅拌转速、风量和罐压将溶氧维持在5-10％，耗氧速率由0.6molO2/L/h上升至40.3molO2/L/h；
发酵至25h，OUR下降至17.5molO2/L/h，发酵罐内甘油浓度耗尽，开始流加补料1(补料1组分为50％甘油和1.2％的PTM1混合液体，总体积为2L)，OUR逐渐回升。初始补料流加速度12g/L/h，维持RQ值在0.65左右。发酵39h，OD600＝107时，降温至27℃，流加质量浓度为17％的氨水调pH至6.5，RQ值降至0.55，提高补料速率至14.25g/L/h；发酵41.5h补料1流加结束，开始流加补料2(补料2组分为50％甘油、1.2％PTM1和4.3％尿素的混合液体)，流速不变；发酵66h，RQ值升至0.73，降低补料速率至13g/L/h。发酵90h，RQ值升至0.89，降低补料速率至11.5g/L/h。发酵131h，OUR大幅下降，发酵结束，此时GOD酶活56164U/mL，比酶活5783U/mg。
实施例6
接种OD600＝6.53的种子液，发酵罐初始搅拌转速为200r/min，罐压为0.03MPa，通风比为0.8VVM，温度为30℃，流加质量浓度为17％的氨水调pH至6.0。待菌体生长至发酵罐内溶氧为5％-10％时，通过调节搅拌转速、风量和罐压将溶氧维持在5-10％，耗氧速率由0.4molO2/L/h上升至37.5molO2/L/h；
发酵至30h，OUR下降至19.4molO2/L/h，发酵罐内甘油浓度耗尽，开始流加补料1(补料1组分为50％甘油和1.2％的PTM1混合液体，总体积为2L)，OUR逐渐回升。初始补料流加速度12.7g/L/h，维持RQ值在0.69。发酵36h，OD600＝137时，降温至28℃，流加质量浓度为17％的氨水调pH至6.5，RQ值降至0.54，提高补料速率至14.5g/L/h；发酵45h补料1流加结束，开始流加补料2(补料2组分为50％甘油、1.2％PTM1和9.4％磷酸氢二铵的混合液体)，流速不变；发酵54h，RQ值升至0.68，降低补料速率至13.5g/L/h。.发酵90h，RQ值升至0.85，降低补料速率至11.2g/L/h。发酵134h，OUR大幅下降，发酵结束，此时GOD酶活61076U/mL，比酶活5874U/mg。
实施例7
接种OD600＝6.19的种子液，发酵罐初始搅拌转速为200r/min，罐压为0.025MPa，通风比为0.7VVM，温度为30℃，流加质量浓度为17％的氨水调pH至6.0。待菌体生长至发酵罐内溶氧为5％-10％时，通过调节搅拌转速、风量和罐压将溶氧维持在5-10％，耗氧速率由0.7molO2/L/h上升至43.9molO2/L/h；
发酵至28h，OUR下降至16.7molO2/L/h，发酵罐内甘油浓度耗尽，开始流加补料1(补料1组分为50％甘油和1.2％的PTM1混合液体，总体积为2L)，OUR逐渐回升。初始补料流加速度12.5g/L/h，维持RQ值在0.75左右。发酵33h，OD600＝129时，降温至27℃，流加质量浓度为17％的氨水调pH至6.5，RQ值降至0.57，提高补料速率至14.2g/L/h；发酵43h，补料1流加结束，开始流加补料2(补料2组分为50％甘油、1.2％PTM1和2％蛋白胨的混合液体)，流速不变；发酵60h，RQ值升至0.71，降低补料速率至13.5g/L/h。发酵87h，RQ值升至0.90，降低补料速率至10.75g/L/h。发酵128h，OUR大幅下降，发酵结束，此时GOD酶活59032U/mL，比酶活5718U/mg。
实施例8
接种OD600＝7.93的种子液，发酵罐初始搅拌转速为250r/min，罐压为0.02MPa，通风比为0.6VVM，温度为30℃，流加质量浓度为17％的氨水调pH至6.0。待菌体生长至发酵罐内溶氧为5％-10％时，通过调节搅拌转速、风量和罐压将溶氧维持在5-10％，耗氧速率由0.4molO2/L/h上升至39.1molO2/L/h；
发酵至25h，OUR下降至15.6molO2/L/h，发酵罐内甘油浓度耗尽，开始流加补料1(补料1组分为50％甘油和1.2％的PTM1混合液体，总体积为2L)，OUR逐渐回升。初始补料流加速度13.75g/L/h，维持RQ值在0.79左右。发酵33h，OD600＝143时，降温至25℃，流加质量浓度为17％的氨水调pH至6.5，RQ值降至0.53，提高补料速率至14.7g/L/h；发酵39.5h，补料1流加结束，开始流加补料2(补料2组分为50％甘油、1.2％PTM1和2％酵母粉的混合液体)，流速不变；发酵63h，RQ值升至0.65，降低补料速率至13.7g/L/h。发酵93h，RQ值升至0.83，降低补料速率至11.5g/L/h。发酵131h，OUR大幅下降，发酵结束，此时GOD酶活61262U/mL，比酶活5842U/ml。
对比例1
接种OD600＝5.11的种子液，发酵罐初始搅拌转速为250r/min，罐压为0.025MPa，通风比为0.6VVM，温度为30℃，流加质量浓度为17％的氨水调pH至6.0。待菌体生长至发酵罐内溶氧为5％-10％时，通过调节搅拌转速、风量和罐压将溶氧维持在5-10％；
发酵至25h，发酵罐内甘油浓度耗尽，溶氧回升，开始流加补料(组分为50％甘油和1.2％的PTM1混合液体)，温度和pH维持不变。流加过程中通过调节补料速度控溶氧维持在5％-10％，若溶氧回升则提高补料速度，若溶氧下降则放慢补料速度。发酵165h，OD略有下降，酶活几乎不变，发酵结束，此时GOD酶活3040U/mL，比酶活1096U/mg。
对比例2
接种OD600＝6.49的种子液，发酵罐初始搅拌转速为200r/min，罐压为0.03MPa，通风比为0.7VVM，温度为30℃，流加质量浓度为17％的氨水调pH至6.0。待菌体生长至发酵罐内溶氧为5％-10％时，通过调节搅拌转速、风量和罐压将溶氧维持在5-10％；
发酵至24h，发酵罐内甘油浓度耗尽，溶氧回升，开始流加补料(组分为50％甘油和1.2％的PTM1混合液体)，温度和pH维持不变。流加过程中通过调节补料速度控溶氧维持在5％-10％，若溶氧回升则提高补料速度，若溶氧下降则放慢补料速度。发酵167h，OD略有下降，酶活几乎不变，发酵结束，此时GOD酶活3364U/mL，比酶活929U/mg。
对比例3
接种OD600＝5.95的种子液，发酵罐初始搅拌转速为250r/min，罐压为0.02MPa，通风比为0.5VVM，温度为30℃，流加质量浓度为17％的氨水调pH至6.0。待菌体生长至发酵罐内溶氧为5％-10％时，通过调节搅拌转速、风量和罐压将溶氧维持在5-10％；
发酵至29h，发酵罐内甘油浓度耗尽，溶氧回升，开始流加补料(组分为50％甘油和1.2％的PTM1混合液体)。发酵39h，OD600＝110时，降温至25℃，流加质量浓度为17％的氨水调pH至6.5。流加过程中通过调节补料速度控溶氧维持在5％-10％，若溶氧回升则提高补料速度，若溶氧下降则放慢补料速度。发酵165h，OD略有下降，酶活几乎不变，发酵结束，此时GOD酶活17388U/mL，比酶活2821U/mg。
对比例4
接种OD600＝6.22的种子液，发酵罐初始搅拌转速为200r/min，罐压为0.02MPa，通风比为0.5VVM，温度为30℃，流加质量浓度为17％的氨水调pH至6.0。待菌体生长至发酵罐内溶氧为5％-10％时，通过调节搅拌转速、风量和罐压将溶氧维持在5-10％；
发酵至27h，发酵罐内甘油浓度耗尽，溶氧回升，开始流加补料1(补料1组分为50％甘油和1.2％的PTM1混合液体，总体积为2L)。发酵37h，OD600＝112时，降温至25℃，流加质量浓度为17％的氨水调pH至6.5；发酵42h补料1流加结束，开始流加补料2(补料2组分为50％甘油、1.2％PTM1和9.4％磷酸氢二铵的混合液体)。流加过程中通过调节补料速度控溶氧维持在5％-10％，若溶氧回升则提高补料速度，若溶氧下降则放慢补料速度。发酵152h，OD略有下降，酶活几乎不变，发酵结束，此时GOD酶活40560U/mL，比酶活4143U/mg。
对比例5
接种OD600＝5.69的种子液，发酵罐初始搅拌转速为250r/min，罐压为0.02MPa，通风比为0.7VVM，温度为30℃，流加质量浓度为17％的氨水调pH至6.0。待菌体生长至发酵罐内溶氧为5％-10％时，通过调节搅拌转速、风量和罐压将溶氧维持在5-10％；
发酵至26h，发酵罐内甘油浓度耗尽，溶氧回升，开始流加补料1(补料1组分为50％甘油和1.2％的PTM1混合液体，总体积为2L)。发酵35h，OD600＝126时，降温至25℃，流加质量浓度为17％的氨水调pH至6.5；发酵40h补料1流加结束，开始流加补料2(补料2组分为50％甘油、1.2％PTM1和2％酵母粉的混合液体)。流加过程中通过调节补料速度控溶氧维持在5％-10％，若溶氧回升则提高补料速度，若溶氧下降则放慢补料速度。发酵150h，OD略有下降，酶活几乎不变，发酵结束，此时GOD酶活41466U/mL，比酶活4197U/mg。
对比1和对比2是不同临界发酵初始条件下恒温恒PH、没有分段补料和反馈条件时的结果，对比3是在1、2的基础上分段控温和PH，对比4和5是在对比3基础上增加分段补料，分有机氮和无机氮的举例。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种高密度发酵产GOD的方法，其特征在于，过程包括：
(1)培养重组毕赤酵母，获得种子液；
(2)将步骤(1)所得种子液以10％的接种量接种到经过灭菌处理的发酵培养基中进行发酵培养；发酵罐初始搅拌转速为200～250r/min，罐压为0.02～0.03MPa，通风比为0.5～0.8VVM，温度为30℃，流加质量浓度为17％的氨水调pH至6.0，待菌体生长至发酵罐内溶氧为5％-10％时，通过调节搅拌转速、风量和罐压将溶氧维持在5-10％，耗氧速率由0.4-0.7molO2/L/h上升至35-45molO2/L/h；
(3)当发酵罐内甘油浓度耗尽后，OUR下降至15-20molO2/L/h，开始流加补料，OUR逐渐回升；调节补料流加速度12-14g/L/h，维持RQ值在0.6-0.8；RQ值大于0.8，降低补料速率至10-12g/L/h；RQ值小于0.6，提高补料速率至14-15g/L/h；OD600＝100-150时，降温至25-28℃，流加质量浓度为17％的氨水调pH至6.5，流加补料不变；当OUR值开始下降时，发酵结束，得到GOD发酵液。
2.根据权利要求1所述的一种高密度发酵产GOD的方法，其特征在于，步骤(1)中，重组毕赤酵母为将GOD基因转化至毕赤酵母GS115体内构建得到，种子液的制备过程包括下述步骤：
①将重组毕赤酵母菌液以1％的接种量接种至一级种子培养基中，在30℃、220r/min条件下培养10-12h，获得一级种子液；
②将步骤①获得的一级种子液以2％的接种量接种至二级种子培养基中，在30℃、220r/min条件下培养10-12h，得到重组毕赤酵母种子液。
3.根据权利要求1所述的一种高密度发酵产GOD的方法，其特征在于，步骤2)中的发酵培养基包括：甘油200g、硫酸铵100g、硫酸钙9.3g、硫酸钾182g、氢氧化钾41.3g、磷酸267mL、水8.5L、硫酸镁149g和PTM143mL。
4.根据权利要求3所述的一种高密度发酵产GOD的方法，其特征在于，步骤2)中的发酵培养基的制备过程包括：
①称取、灭菌：将甘油200g、硫酸铵100g、硫酸钙9.3g、硫酸钾182g、氢氧化钾41.3g、磷酸267mL和水9L混合并加入发酵罐中，115-121℃，灭菌20-30min；
②冷却：将灭菌后的发酵罐进循环水冷却至30℃；
③混合：将149g的硫酸镁和43mL的PTM1单独灭菌，并于接种前一同放入发酵罐中，得到发酵培养基。
5.根据权利要求4所述的一种高密度发酵产GOD的方法，其特征在于，所述一级种子液和二级种子液的培养基均为酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，甘油10g/L。
6.根据权利要求5所述的一种高密度发酵产GOD的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的流加补料分为两种，发酵罐内甘油浓度耗尽后先补加补料1，补料1的组分为50％甘油和1.2％的PTM1混合液体，补料1流加结束后开始流加补料2，补料2的组分为50％甘油、1.2％PTM1和2％氮源的混合液体。
7.根据权利要求6所述的一种毕赤酵母高密度发酵产GOD的方法，其特征在于，所述补料1的流加总体积为发酵初体积的1/5；所述氮源包括但不限于尿素、磷酸氢二铵、硫酸铵等无机氮源和蛋白胨、酵母粉。
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