CN114958928B - 一种基因工程菌发酵联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的方法 - Google Patents
一种基因工程菌发酵联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种基因工程菌发酵联产3‑羟基丙酸和1,3‑丙二醇的方法，属于生物工程技术领域；本发明中，使用廉价玉米浆替代培养基中的酵母粉，降低基因工程菌EC10S7G联产3‑羟基丙酸和1,3‑丙二醇的成本，接着将整个发酵过程划分为生长阶段和生产阶段分别控制pH生产3‑羟基丙酸来提高3‑羟基丙酸和1,3‑丙二醇的联产产率；最后补料发酵实现3‑羟基丙酸和1,3‑丙二醇的高效联合生产。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基因工程菌发酵联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的方法。
背景技术
3-羟基丙酸和1,3-丙二醇是工业上两种重要的平台化合物，作为生物可降解性聚合物的前体物质和食品添加剂广泛使用。3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的生产有化学合成法和生物法两种。化学法多以不可再生资源作为原料，其生产过程能耗大，产物副产物多难以分离纯化，生产过程产生不可估量的环境污染。生物法合成3-羟基丙酸或1,3-丙二醇多以葡萄糖和甘油作为底物，其中以甘油作为底物生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇步骤简单，研究充分，原料廉价，且能解决甘油过剩的问题。
目前，微生物发酵甘油生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的培养基多为改进的低盐培养基，其中添加酵母提取物以维持细胞快速生长。但是，酵母粉是一种昂贵的氮源，增加了微生物发酵法生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的成本，并且适宜微生物生长和目标产物合成的pH一般不同，这种矛盾限制了3-羟基丙酸和1,3-丙二醇生产的高效生产。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种基因工程菌发酵联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的方法。本发明中，使用廉价玉米浆替代培养基中的酵母粉，降低基因工程菌EC10 S7G联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的成本，接着将整个发酵过程划分为生长阶段和生产阶段分别控制pH生产3-羟基丙酸来提高3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的联产产率；最后补料发酵实现3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的高效联合生产。
本发明中提供了一种基因工程菌发酵联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的方法，具体包括如下步骤：
(1)将基因工程菌EC10 S7G在LB培养基中过夜活化，得到EC10 S7G的一级种子液；
(2)将EC10 S7G一级种子液接种至改良M9-CSL培养基中培养，得到EC10 S7G的二级种子液；
(3)将EC10 S7G的二级种子液接种于改良M9-CSL培养基中，将发酵过程划分为生长阶段和生产阶段控制pH值进行补料发酵；
所述生长阶段时pH控制为7.0，调整温度、通气量、搅拌速率发酵培养至OD600达到4时，加入IPTG和维生素B12继续培养；
所述生产阶段时pH控制为8.0，调整温度、通气量、溶氧值进行发酵，然后每6h进行补料发酵联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇；
所述补料的成分含有甘油和玉米浆。
其中，所述基因工程菌EC10 S7G为在大肠杆菌E.coli W3110(DE3)的基础上表达甘油脱水酶及其再激活因子(DhaB123-GdrAB)、丙醛脱氢酶(GabD4)、1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶(YqhD)和膜结合型吡啶核苷酸转氢酶(PntAB)；敲除可溶型吡啶核苷酸转氢酶(SthA)、乳酸脱氢酶(LdhA)、乙醇脱氢酶(AdhE)、丙酮酸甲酸裂解酶(PflB)、丙酮酸氧化酶(PoxB)、磷酸乙酰转移酶(PTA)、醋酸激酶(AckA)和甘油代谢抑制因子(GlpR)；并调控了甘油激酶GlpK基因的表达量得到。
进一步的，步骤(2)中，改良M9-CSL培养基的成分为MgSO4·7H2O 0.5g/L,NH4Cl2.0g/L,NaCl 2.0g/L,玉米浆2.5mL/L,甘油40g/L和0.1M磷酸钾缓冲液,pH 7.0。
进一步的，步骤(2)中，EC10 S7G一级种子液的接种量为1％v/v，培养条件为37℃、220rpm培养12h。
进一步的，步骤(3)中，EC10 S7G二级种子液的接种量为5％v/v。
进一步的，步骤(3)中，所述生长阶段时，调整温度为37℃，初始通气量为2vvm，搅拌速率为500rpm进行发酵培养。
进一步的，步骤(3)中，IPTG用量为终浓度为0.05mM，维生素B12的用量为50-100μM。
进一步的，步骤(3)中，所述继续培养的条件为在35℃下培养至OD600为45。
进一步的，步骤(3)中，所述生产阶段时调整温通气量调整为3vvm，搅拌速率为200-800rpm，控制溶氧值为10％进行发酵。
进一步的，步骤(3)中，所述补料的成分含有800g/L甘油和50mL/L玉米浆；每6h进行补料控制甘油浓度维持在40g/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本技术通过使用廉价玉米浆代替培养基中昂贵成分酵母提取物，大幅降低生长成本；通过两阶段策略，将生长和生产阶段的pH分离，解决了细胞生长和产物生产的矛盾；所开发的两阶段pH控制策略可通过EC10 S7G以生物柴油产物废弃物甘油为底物，通过两阶段pH控制补料发酵，高效联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇。
本发明中，摒弃了传统改进的低盐培养基中的酵母提取物，替换为更为廉价的玉米浆，具有生产意义；将传统一阶段pH控制的发酵划分为生长和生产阶段，分阶段控制pH，解决了微生物生长与生产的矛盾，最大化的提高基因工程菌EC10 S7G发酵生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的能力，具有大规模工业生产的潜力。
附图说明
图1为不同培养基对工程菌EC10 S7G的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的产量影响图。
图2为不同玉米浆浓度对工程菌EC10 S7G的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的产量影响图。
图3为生产阶段不同pH对工程菌EC10 S7G的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的产量影响图。
图4为生产阶段的不同初始甘油负载对工程菌EC10 S7G的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的产量影响图。
图5为两阶段pH控制的补料发酵时工程菌EC10 S7G的代谢物随时间变化图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
在实施例中，涉及的培养基成分如下所示：
LB培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化钠；
改良MR培养基：甘油30g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，(NH4)2HPO4 4.0g/L，KH2PO46.67g/L，citric acid 0.8g/L，酵母提取物1.0g/L，pH 7.0；
改良MY培养基：MgSO4·7H2O 0.5g/L,NH4Cl 2.0g/L,NaCl 0.5g/L,KH2PO4 3.0g/L,Na2HPO4 6.0g/L，酵母提取物5.0g/L,pH 7.0；
改良M9培养基：MgSO4·7H2O 0.5g/L,NH4Cl 2.0g/L,NaCl 2.0g/L,酵母提取物1g/L和0.1M磷酸钾缓冲液,pH 7.0；
改良M9-CSL培养基：MgSO4·7H2O 0.5g/L,NH4Cl 2.0g/L,NaCl 2.0g/L,酵母提取物1g/L、0.1M磷酸钾缓冲液、0.25％(v/v)的玉米浆,pH 7.0。
实施例1：不同培养基对工程菌EC10 S7G的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量影响：
(1)将基因工程菌EC10 S7G在LB培养基中过夜活化(37℃、220rpm)，获得工程菌EC10 S7G的种子液。
(2)将EC10 S7G种子液按1％v/v接种量分别接种于改良MR培养基、改良MY培养基和改良M9培养基中37℃摇床220rpm培养4h，待OD600达到约0.8，加入0.05mM IPTG和25μM维生素B12，继续35℃摇床220rpm培养36h。
培养结束后，使用高效液相色谱法测量3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量，测量结果如图1所示。其中，液相色谱条件为：Aminex HPX-87H column色谱柱、0.4mL/min、65℃、RID检测器35℃、UV检测器210nm。
从图1中可以看出，使用改良M9培养基最适和生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇，其产量达到19.25g/L，分别比改良MR和改良MY培养基分别高9.24％和42.22％。
实施例2：玉米浆作为酵母提取物的廉价替代物用于3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的生产：
(1)将基因工程菌EC10 S7G在LB培养基中过夜活化(37℃、220rpm)，获得工程菌EC10 S7G的种子液。
(2)将EC10 S7G种子液按1％v/v接种量分别接种于改良M9培养基中，另外添加0.05％、0.1％、0.25％和0.5％(v/v)的玉米浆，37℃摇床220rpm培养4h后，OD600达到约0.8。然后加入0.05mM IPTG和25μM维生素B12，继续35℃摇床220rpm培养36h。
培养结束后，使用高效液相色谱法测量3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量，测量结果如图2示。从图2可以看出，随着玉米浆浓度的逐步增加，3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的产量以及生物量逐渐提高，并在浓度为0.25％时达到峰值。当玉米浆浓度从0.25％增加到0.5％时，乙酸产量显著增加。因此，0.25％的玉米浆为最佳浓度，此时的培养基命名为M9-CSL。与0.1％的酵母提取物相比，使用0.25％浓度的玉米浆生产性能没有明显变化。
综上，玉米浆可以代替酵母提取物，利用微生物发酵甘油生产高附加值的化学品，如3-羟基丙酸和1,3-丙二醇。
实施例3：两阶段pH控制发酵方式的建立：
(1)将基因工程菌EC10 S7G在LB培养基中过夜活化(37℃、220rpm)，获得工程菌EC10 S7G的种子液。
(2)将EC10 S7G种子液按1％v/v接种量分别接种于改良M9-CSL中，37℃摇床220rpm培养4h后，OD600达到约0.8，加入0.05mM IPTG和25μM维生素B12，继续35℃摇床220rpm培养36h。
培养结束后，使用高效液相色谱法测量3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量，测量结果如图3示。从图3中可以看出，在生长阶段产生了14.53g/L的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇。
(3)收集步骤(2)中的培养后的EC10 S7G，4℃下6000rpm离心5min，将收集的EC10S7G分别平均接种至pH不同的改良M9-CSL培养基中，其中pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。然后加入0.05mM IPTG和25μM维生素B12，继续35℃摇床220rpm培养36h。
培养结束后，使用高效液相色谱法测量生产阶段的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量，测量结果如图3所示。从图3中可以看出，生产阶段的pH对3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的产量影响巨大，pH 5.0时几乎没有产生3-羟基丙酸和1,3-丙二醇，微碱性pH 8.0最适合3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的生产，在此条件下，完全消耗完30g/L甘油，产生了22.67g/L的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇；比pH 7.0时高44.3％；值得注意的是尽管pH 9.0时3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的产量与pH 8.0相当，但此时副产物醋酸产量显著提高；而生产阶段pH 7.0可视为单一阶段发酵，因为生长阶段的pH也是7.0。
综上，本发明开发的两阶段pH控制的发酵较单一阶段发酵更具优势。
实施例4：研究两阶段pH控制发酵的最适甘油负载：
(1)将基因工程菌EC10 S7G在LB培养基中过夜活化(37℃、220rpm)，获得工程菌EC10 S7G的种子液。
(2)将EC10 S7G种子液按1％v/v接种量分别接种于改良M9-CSL中，37℃摇床220rpm培养4h后，OD600达到约0.8，加入0.05mM IPTG和25μM维生素B12，继续35℃摇床220rpm培养36h。
(3)收集步骤(2)中的培养后的EC10 S7G，4℃下6000rpm离心5min，将收集的EC10S7G分别平均接种至含有不同浓度甘油的改良M9-CSL培养基中，其中甘油的浓度为30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L。然后加入0.05mM IPTG和25μM维生素B12，继续35℃摇床220rpm培养36h。
培养结束后，使用高效液相色谱法测量生产阶段的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量，测量结果如图4所示，当甘油负载为40g/L时，3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量最高，达到29.07g/L。
实施例5：两阶段pH控制的补料发酵高效联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇：
(1)将基因工程菌EC10 S7G在LB培养基中过夜活化(37℃、220rpm)，获得工程菌EC10 S7G的一级种子液。
(2)将EC10 S7G种子液按1％v/v接种量分别接种于改良M9-CSL培养基中，37℃摇床220rpm培养12小时后，获得工程菌EC10 S7G的二级种子液。
(3)将EC10 S7G的二级种子液按5％v/v接种量分别接种于2L的改良M9-CSL培养基中，在5L发酵罐中使用上述两阶段pH控制的方式对EC10 S7G进行补料发酵，其中补料成分含有800g/L甘油和50mL/L玉米浆。
生长阶段时pH控制为7.0，调整温度37℃，初始通气量为2vvm，搅拌速率500rpm，待培养至OD600达到4时，加入0.05mM IPTG和50μM维生素B12调整发酵温度为35℃，直至OD600约为45。
所述生产阶段时pH控制为8.0，通气量调整为3vvm，控制溶氧值为10％进行发酵，并此后每6h检测一次代谢产物以及进行补料，使甘油浓度维持在40g/L左右然后每6h进行补料发酵联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇。
试验结果如图5所示，从图中可以看出，3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的产生从第6h开始，当pH调整为8.0后，3-羟基丙酸和1,3-丙二醇生产速率加快，经过66h发酵，所述工程菌EC10 S7G生产3-羟基丙酸77.34g/L和1,3-丙二醇63.16g/L，总产量为140.5g/L，生产强度为2.13g/L/h。
综上，本发明中将传统一阶段pH控制的发酵划分为生长和生产阶段来分阶段控制pH，解决了微生物生长与生产的矛盾，最大化提高基因工程菌EC10 S7G发酵联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的能力，初具大规模生产的潜力。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种基因工程菌发酵联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的方法，其特征在于，包括：
（1）将基因工程菌EC10 S7G在LB培养基中过夜活化，得到EC10 S7G的一级种子液；
（2）将EC10 S7G一级种子液接种至改良M9-CSL培养基中培养，得到EC10 S7G的二级种子液；改良M9-CSL培养基的成分为MgSO4·7H2O 0.5 g/L, NH4Cl 2.0 g/L, NaCl 2.0 g/L,玉米浆2.5mL/L, 甘油40 g/L和0.1 M磷酸钾缓冲液, pH 7.0；
（3）将EC10 S7G的二级种子液接种于改良M9-CSL培养基中，将发酵过程划分为生长阶段和生产阶段控制pH值进行补料发酵；
所述生长阶段时pH控制为7.0，调整温度、通气量、搅拌速率发酵培养至OD600达到4时，加入IPTG和维生素B12继续培养；
所述生产阶段时pH控制为8.0，调整温度、通气量、溶氧值进行发酵，然后每6h进行补料发酵联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇；
所述补料的成分含有甘油和玉米浆。
2. 根据权利要求1所述的基因工程菌发酵联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的方法，其特征在于，步骤（2）中，EC10 S7G一级种子液的接种量为1% v/v，培养条件为37℃、220 rpm培养12h。
3. 根据权利要求1所述的基因工程菌发酵联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的方法，其特征在于，步骤（3）中，EC10 S7G二级种子液的接种量为5% v/v。
4. 根据权利要求1所述的基因工程菌发酵联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述生长阶段时，调整温度为37℃，初始通气量为2 vvm，搅拌速率为500 rpm进行发酵培养。
5. 根据权利要求1所述的基因工程菌发酵联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的方法，其特征在于，步骤（3）中，IPTG用量为终浓度为0.05 mM，维生素B12的用量为50-100 μM。
6.根据权利要求1所述的基因工程菌发酵联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述继续培养的条件为在35℃下培养至OD600为45。
7. 根据权利要求1所述的基因工程菌发酵联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述生产阶段时调整温通气量调整为3 vvm，搅拌速率为200-800rpm，控制溶氧值为10%进行发酵。
8. 根据权利要求1所述的基因工程菌发酵联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述补料的成分含有800 g/L 甘油和50 mL/L玉米浆。
9. 根据权利要求1所述的基因工程菌发酵联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的方法，其特征在于，步骤（3）中，每6h进行补料控制甘油浓度维持在40 g/L。
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009140929A1 (zh) * | 2008-05-04 | 2009-11-26 | 清华大学 | 构建基因工程菌发酵联产pdo、bdo和php的方法 |
| CN104830917A (zh) * | 2015-05-27 | 2015-08-12 | 华东理工大学 | 利用微生物发酵甘油生产3-羟基丙酸的方法 |
| CN111394396A (zh) * | 2020-03-24 | 2020-07-10 | 江苏大学 | 一种微生物利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的方法 |
| CN112210524A (zh) * | 2020-09-29 | 2021-01-12 | 江苏大学 | 一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法和应用 |
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