KR20200058090A

KR20200058090A - 미생물 발효액의 재사용에 의한 미생물 배양 방법

Info

Publication number: KR20200058090A
Application number: KR1020180142660A
Authority: KR
Inventors: 정우철; 이경묵; 김재형; 강동균; 김철웅; 최정윤
Original assignee: 주식회사 엘지화학
Priority date: 2018-11-19
Filing date: 2018-11-19
Publication date: 2020-05-27
Also published as: KR102542396B1

Abstract

유기용매 추출 후 남은 미생물 발효액에 잔존하는 유기용매를 제거하여, 이를 미생물 발효액으로 재사용함으로써 미생물을 배양하는 방법에 관한 것이다. 또한, 비정제 글리세롤에 포함된 불순물을 함께 제거함으로써 이를 미생물 배양에 활용하는 미생물 배양 방법에 관한 것이다.

Description

미생물 발효액의 재사용에 의한 미생물 배양 방법 {Method for culturing microorganism by reusing fermented liquid of microorganism}

유기용매 추출 후 남은 미생물 발효액에 잔존하는 유기용매를 제거하여, 이를 미생물 배양액으로 재사용함으로써 미생물을 배양하는 방법에 관한 것이다. 또한, 비정제 글리세롤에 포함된 불순물을 함께 제거하여 이를 미생물 발효 기질로서 활용하는 미생물 배양 방법에 관한 것이다.

미생물 발효공정으로 바이오케미칼, 바이오연료, 또는 바이오플라스틱과 같은 바이오 기반 제품을 생산할 수 있는데, 이러한 바이오 기반 제품을 회수하는 방법 중 하나가 액액추출 또는 반응추출과 같은 추출법이다.

그러나, 유기용매를 이용하여 미생물 발효액으로부터 바이오 기반 제품을 추출하는 경우, 미생물 발효액이 바이오 기반 제품이 녹아 있는 유기용매층(유기상)과 수용액층(수상)으로 분리되는데, 유기용매층을 제거하더라도 수용액층에 유기용매가 여전히 남아 있어 많은 양의 발효 폐액이 발생하게 된다. 따라서 추출을 통한 바이오 제품 회수 후 미생물 발효액으로부터의 잔존상인 수용액층을 폐액으로 처리하지 않고 발효 공정에 재사용하기 위해서는 수용액층에 남아있는 유기용매를 발효 독성이 없는 수준으로 제거하는 것이 필요하다. 이를 위해 물 또는 유기용매를 증류하거나 흡착제를 이용하여 제거하는 공정 등이 적용되지만, 이는 추가적인 공정이 필요하므로 공정 비용의 상승을 초래한다.

한편, 친환경 대체 에너지 중 하나인 바이오 디젤은 최근 생산량이 꾸준히 증가하고 있다. 바이오 디젤은 식물성 오일 등을 화학적으로 처리하여 제조하는데, 트랜스에스테르화 반응에 의해서 지방산의 메틸에스터인 바이오 디젤이 생성되게 되며, 이 과정에서 지방에 존재하던 글리세롤이 부산물로 생성되며, 생성된 부산물에 별다른 처리를 하지 않은 것을 통상 비정제 글리세롤(crude glycerol)이라고 한다.

이러한 바이오 디젤의 생산에서 나오는 부산물인 비정제 글리세롤은 가격이 저렴하여 다양한 분야에 응용이 모색되고 있으며, 최근에는 미생물 발효 공정에서 새로운 Feed-stock으로 주목받고 있다. 그러나, 비정제 글리세롤은 글리세롤 외에도 메탄올, soap, ash, 지방산 등의 불순물들을 함유하고 있기 때문에, 이를 그대로 미생물 배양에 사용할 경우에는 미생물의 성장 및 활성이 떨어지고, 다량의 거품(foam)이 발생하는 등 여러 가지 문제가 발생한다.

이에 따라, 비정제 글리세롤을 여과(filtering), 산처리, 유기 용매 추출 등의 과정을 통해 고농도의 글리세롤로 정제하는 방법이 이용되어 왔다. 이러한 방법들은 높은 농도 및 순도의 글리세롤을 얻을 수 있지만, 다수의 공정이 적용됨에 따라 공정 비용이 증가하기 때문에, 비정제 글리세롤의 경제적 이점을 떨어뜨리는 문제가 있다.

따라서, 미생물 발효 공정을 통해 생산된 바이오 기반 제품을 유기용매 추출을 통해 추출한 후 남은 미생물 발효액으로부터 잔존하는 유기용매를 제거하여 발효 공정에 재사용하고, 동시에 비정제 글리세롤 내 불순물을 제거하여 미생물 발효 공정에 발효 기질로서 활용하도록 하는 기술의 개발이 요구된다.

국내특허공개 제10-2010-0100916호 (2010.09.15)

본 발명은 유기용매 추출 후 남은 미생물 발효액에 잔존하는 유기용매를 제거하여, 이를 미생물 배양액으로 재사용함과 동시에, 비정제 글리세롤에 포함된 불순물을 함께 제거하여 글리세롤을 미생물 배양에 활용하는 미생물 배양 방법을 제공한다.

일예로, 유기용매를 포함하는 미생물 발효액에 비정제 글리세롤(crude glycerol)을 첨가하여 혼합하는 단계; 상기 혼합된 용액의 pH 를 2 내지 8로 조절하는 단계; 상기 용액에 칼슘 염을 첨가하는 단계; 상기 용액을 층분리하여 수용액 층을 회수하는 단계; 및 상기 회수된 수용액 층에 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 미생물 배양 방법을 제공한다.

본 발명의 한 측면에 따라, 하기의 단계를 포함하는 미생물 배양 방법이 제공된다:

유기용매를 포함하는 미생물 발효액에 비정제 글리세롤(crude glycerol)을 첨가하여 혼합하는 단계 (단계 1);

상기 혼합된 용액의 pH 를 2 내지 8로 조절하는 단계 (단계 2);

상기 용액에 칼슘 염을 첨가하는 단계 (단계 3);

상기 용액을 층분리하여 수용액 층을 회수하는 단계 (단계 4); 및

상기 회수된 수용액 층에 미생물을 배양하는 단계 (단계 5).

이하, 각 단계 별로 본 발명을 상세히 설명한다.

(단계 1)

단계 1은, 유기용매를 포함하는 미생물 발효액에 비정제 글리세롤(crude glycerol)을 첨가하여 혼합하는 단계이다.

여기에서, 유기용매를 포함하는 미생물 발효액은, 미생물을 발효하여 미생물로부터 생산된 물질을 유기용매로 추출하여 제거한 후 남은 수상(aqueous phase)일 수 있다. 유기용매를 이용하여 미생물 발효액으로부터 미생물이 생산한 물질들을 추출하는 경우, 미생물 발효액이, 미생물이 생산한 물질이 녹아 있는 유기용매층(유기상)과 수용액층(수상)으로 분리되는데, 유기용매층을 제거하더라도 수용액층에는 여전히 유기용매가 남아 있어 많은 양의 발효 폐액이 발생하게 된다. 이에, 본 발명의 일 예는 미생물 발효액을 유기용매를 사용하여 추출 시, 유기용매층을 제거한 후 남은 미생물 발효액을 새로운 미생물 발효 공정에 재사용하기 위한 것이다. 그러나, 본 발명이 상기 예에 제한되는 것은 아니며, 어떠한 이유로든 유기용매를 포함하여, 미생물 발효 공정에 사용하기 위해서는 유기용매를 발효 독성이 없는 수준으로 제거할 필요가 있는, 미생물 배양 배지 또는 미생물 배양액에 적용될 수 있다.

여기에서, 미생물로부터 생산된 물질은, 이소부탄올 또는 바이오부탄올과 같은 알코올류를 포함하는 바이오연료; 폴리락트산(PLA), 폴리하이드록시알카노에트(polyhydroxyalkanoate: PHA) 또는 바이오-나일론과 같은 바이오플라스틱; 또는 락트산 또는 숙신산과 같은 유기산을 포함하는 바이오케미칼 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예로, 미생물로부터 생산된 물질은 3-히드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic acid; 3-HP)일 수 있다.

용어 '비정제 글리세롤'이란, 비누화, 고압 가수분해 또는 천연 오일 및 지방의 알콜과의 에스테르교환 등의 산업적 공정의 부산물인 글리세롤을 말하며, 예를 들어, 식물성 오일 및/또는 동물성 지방으로부터의 바이오디젤 제조에서 나온 부산물로서 회수된 미정제 글리세롤을 예시할 수 있다. 일반적으로 바이오 디젤 100 ㎏ 생산시 약 10 ㎏의 비정제 글리세롤이 부산물로 생성되는 것으로 알려져 있다. 비정제 글리세롤은 글리세롤 외에도 메탄올, soap, ash, 지방산 등의 불순물들을 함유하며, 일반적으로 80 내지 85 wt%의 글리세롤을 포함한다.

일 예로, 상기 비정제 글리세롤은 그대로 사용할 수도 있으나, 바람직하게는 물을 첨가하여 글리세롤의 농도가 10 내지 70%인 비정제 글리세롤 용액으로 사용한다. 이때 글리세롤의 농도는 물의 무게 대비 글리세롤의 무게를 의미한다.

(단계 2)

단계 2는, 유기용매를 포함하는 미생물 발효액과 비정제 글리세롤을 혼합한 용액의 pH를 2 내지 8로 조절하는 단계이다.

비정제 글리세롤 용액은 강염기이며, 일반적으로 pH는 11 이상이다. 이에 본 발명에서는 상기 비정제 글리세롤 용액의 pH를 2 내지 8로, 보다 바람직하게는 6 내지 7로 조절한다. 상기 pH의 조절은 산(acid)을 첨가하여 조절할 수 있으며, 예를 들어 염산, 황산, 인산, 질산, 탄산, 붕산, 플루오린화 수소(HF), 또는 옥살산을 첨가하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 적절한 산을 첨가할 수 있다.

(단계 3)

단계 3은, 상기 단계 2에서 pH 를 조절한, 유기용매를 포함하는 미생물 발효액과 비정제 글리세롤이 혼합된 용액에 칼슘 염을 첨가하는 단계이다.

이론적으로 제한 되는 것은 아니나, 미생물 배양시 비정제 글리세롤에 포함되어 있는 불순물 중 soap 성분 및 지방산이 미생물 배양을 방해하는데, 칼슘 염을 첨가하면 이러한 soap 성분 및 지방산이 가지고 있는 음전하(negative charge)의 작용기가 Ca²⁺와 결합하면서 응집되어, 빠르게 수용액 층과 분리될 수 있다.

상기 칼슘 염의 첨가는 CaCl₂, CaO, Ca(NO₃)₂, Ca(OH)₂, 또는 CaS를 첨가하여 수행할 수 있다. 또한, 상기 칼슘 염의 첨가량은, 비정제 글리세롤 내 글리세롤 1 kg 대비 1 내지 10 g일 수 있다.

(단계 4)

단계 4는, 상기 단계 3에서 칼슘 염을 첨가한, 유기용매를 포함하는 미생물 발효액과 비정제 글리세롤이 혼합된 용액을 층분리하여 수용액 층을 회수하는 단계이다.

앞서 설명한 바와 같이, 단계 3에서 칼슘 염을 첨가하면 비정제 글리세롤에 포함되어 있는 불순물 중 soap 성분 및 지방산이 응집되어 수용액 층과 분리가 일어난다. 칼슘 염을 첨가하면 곧바로 층 분리가 진행되며, 칼슘 염 첨가로부터 약 30분이 지나면 불순물이 포함된 지질층과 글리세롤이 포함된 수용액 층으로 층분리가 실질적으로 완료된다. 이 때, 미생물 발효액에 잔존하는 유기용매는 칼슘 염 첨가로 soap 성분 및 지방산이 응집된 지질층으로 추출되어 제거 될 수 있다.

상기 수용액 층의 회수는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 디캔팅, 여과 등의 방법으로 회수할 수 있다.

(단계 5)

단계 5는, 상기 단계 4에서 회수한 수용액 층에 미생물을 배양하는 단계이다. 상기 회수한 수용액층은 유기용매가 발효 독성이 없는 수준으로 감소 내지 제거되어 있으며, 비정제 글리세롤로부터 불순물이 제거된 글리세롤이 발효 기질로 포함되어 있어, 미생물을 배양하는 것이 가능하다.

상기 미생물은 글리세롤을 발효 기질로 사용하여 배양할 수 있는 미생물이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 상기 미생물은 상기 미생물은 에스케리치아(Escherichia) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 세라티아(Serratia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 살모넬라(Salmonella) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 크렙시엘라(Klebsiella) 속, 또는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 미생물을 사용할 수 있다. 구체예로, Escherichia coli DH5a, E. coli JM109, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E coli B 또는 E. coli XL1-Blue를 사용할 수 있다.

또한, 상기 미생물은 바이오연료, 바이오플라스틱, 또는 바이오케미칼을 생산하는 미생물일 수 있다. 이를 위하여, 상기 미생물은 목적하는 바이오연료, 바이오플라스틱, 또는 바이오케미칼을 보다 효율적으로 생산하기 위하여 특정 유전자가 도입되거나 제거되도록 유전공학적으로 조작된 미생물일 수 있다.

예를 들어, 상기 미생물은 3-HP 생성능을 가지고 있거나 3-HP 생산능을 가지도록 유전적으로 조작된 균주일 수 있다. 상기 3-HP 의 생산은 균주 내에서 생산되는 것, 세포 내에서 생산되어 세포 외부로 분비되는 것, 또는 그 조합을 포함한다. 글리세롤과 같은 탄소 기질로부터 3-HP를 생합성하는 경로로는 여러 경로가 알려져 있지만, 대표적인 예시는 다음과 같다: 우선, 글리세롤 디하이드라타제(glycerol dehydratase: GDH)에 의해 글리세롤이 탈수 반응을 통해 중간체인 3-히드록시프로피온알데히드 (3-Hydroxypropionaldehyde: 3-HPA)로 전환되며, 알데히드 디하이드로게나제(aldehyde dehydrogenase: ALDH)에 의해 3-히드록시프로피온알데히드(3-HPA)가 산화되어 3-HP가 된다.

따라서, 상기 미생물은 3-HP 생산을 더욱 증대시키기 위하여, 3-HP를 생합성하는 경로에 관여하는 효소의 유전자들이 추가로 도입된 미생물일 수 있다. 예를 들어, 글리세롤 디하이드라타제를 코딩하는 유전자 및/또는 알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자가 추가로 도입된 미생물일 수 있다.

용어, "글리세롤 디하이드라타제 (glycerol dehydratase)" 또는 "디올 디하이드라타제(diol dehydratase)"는 글리세롤에서 3-히드록시프로피온알데히드 (3-HPA)로의 전환을 촉매화하는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 글리세롤 디하이드라타제 또는 디올 디하이드라타제는 코엔자임 B12 의존성이거나 비의존성일 수 있다. 상기 효소는, 이에 제한되는 것은 아니나, 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii), 클로스트리디움 파스튜리아늄(Clostridium pasteurianum), 살모넬라 타이티무리움(Salmonella typhimurium), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 또는 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) 등 유래일 수 있다. 상기 효소는, 그 유래에 관계없이, 글리세롤에서 3-히드록시프로피온알데히드 (3-HPA)로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 가지는 효소라면 본원의 범주에 포함되며, 이를 코딩하는 유전자로는 dhaB 를 예시할 수 있다.

용어, "알데히드 디하이드로게나제(aldehyde dehydrogenase)"는 알데히드를 카르복실산으로 전환시키는 효소로서, 본원에서는 3-히드록시프로피온알데히드(3-HPA)에서 3-히드록시프로피온산(3-HP)으로의 전환을 촉매화하는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 알데히드 디하이드로게나제는 그 유래에 관계없이, 3-히드록시프로피온알데히드(3-HPA)에서 3-히드록시프로피온산(3-HP)으로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 가지는 효소라면 본원의 범주에 포함된다.

또한, 본원에서는 미생물에 3-HP 생산을 더욱 증대시키기 위하여, 글리세롤 디하이드라타제를 재활성화시키기 위한 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제를 코딩하는 유전자를 추가로 포함할 수도 있다.

용어, "글리세롤 디하이드라타제 리액티바제 (glycerol dehydratase reactivase)"는 글리세롤 디하이드라타제 가 작용하는 동안 비가역적으로 불활성화되는 것을 다시 활성화하여 촉매 활성을 유지시키는 작용을 하는 효소이다. 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제로는 일반적으로 알려진 어느 것이라도 사용할 수 있으며, 예를 들어, 클랩시엘라 속(Klebsiella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 살모넬라 속 (Salmonella sp.) 균주 등에서 유래할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제는 DhaFG, GdrAB, DdrAB 등일 수 있으며, 이를 암호화하는 유전자는 dhaFG, gdrAB, ddrAB 등을 예시할 수 있다.

상기 미생물의 배양은 본 발명에 따라 불순물이 제거된 비정제 글리세롤을 사용한다는 점을 제외하고는, 당업계에 알려진 배지와 배양 조건에 따라 배양할 수 있다.

예를 들어, 배양에 사용되는 배지는 미생물에 맞추어 조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 이를 위하여, 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원, 인원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 구체적인 배지의 종류는 LB(Luria Bertani) broth, SD(Sabouraud Dextrose) broth, YM(Yeast medium) broth, SA(Sabouraud agar) 배지, YT(Yeast extract tryptone) broth, M9 최소배지, M17 배지와 같은 배지를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

배지 내 탄소원으로는 글리세롤을 포함할 수 있다. 그 외에, 단당류, 올리고당류, 다당류, 단일탄소기질, 또는 그의 혼합물을 예시할 수 있다. 예를 들어 글루코즈와 프럭토즈와 같은 단당류; 수크로즈, 말토즈 또는 락토즈와 같은 올리고당류; 녹말 또는 셀룰로오스와 같은 다당류; 메탄올, 포름알데히드 또는 포르메이트와 같은 단일탄소기질을 예시할 수 있다. 또한, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급알콜류; 글리세롤 등의 다가알콜류; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

배지 내 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다.

배지 내 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함하거나, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기된 원료들은 배양 과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 필요에 따라, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.

또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 발효 조건은 호기, 마이크로 호기, 혐기 조건에서 배양할 수 있으며, 배양물의 호기 상태(aerobic condition)를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예를 들어, 공기)를 주입할 수 있다. 배양 온도 및 배양 시간은 사용하는 숙주세포의 특성을 고려하여 적절히 선택하여 수행할 수 있다.

또한, 상기 미생물 배양은 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 또는 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

발효 배지로부터 생산 물질(예, 3-HP)을 회수하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 3-HP는 원심분리, 크로마토그래피, 추출, 여과, 침전, 또는 이들의 조합을 수행함으로써 세포 배지로부터 얻을 수 있다.

(단계 1 내지 단계 5의 반복)

한편, 단계 5에서 미생물 배양에 의해 미생물이 바이오연료, 바이오플라스틱, 또는 바이오케미칼 등의 물질을 생산할 수 있으며, 이러한 물질들을 회수하기 위하여 미생물 발효액을 유기용매로 추출할 수 있다.

이 경우, 유기용매 추출법에 의하여 미생물 발효액으로부터 미생물이 생산한 물질들을 추출할 수 있으며, 유기용매 추출 후 남은 미생물 발효액을 단계 1의 "유기용매를 포함하는 미생물 발효액" 으로 사용하여 다시 단계 1 내지 단계 5를 포함하는 새로운 미생물 발효 공정을 시작할 수 있다.

따라서, 본원의 단계 1에서, "유기용매를 포함하는 미생물 발효액"은, 미생물을 발효하여 미생물로부터 생산된 물질을 유기용매로 추출하여 제거한 후 남은 수상일 수 있다. 또한, 상기 미생물의 발효는, 글리세롤을 함유하는 배지에서 수행된 것일 수 있다.

또한, 상기 글리세롤을 함유하는 배지는,

비정제 글리세롤 용액의 pH 를 2 내지 8 로 조절하는 단계;

상기 비정제 글리세롤 용액에 칼슘 염을 첨가하는 단계; 및

상기 비정제 글리세롤 용액을 층분리하여 수용액 층을 회수하는 단계

를 포함하는 방법에 의하여 수득된 수용액 층을 함유하는 배지일 수 있다.

이 때 위의 각 단계는, 상술한 단계 2 내지 단계 5의 각 특징들을 그대로 포함할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 미생물 배양 방법은, 간단하면서도 빠른 방법으로 비정제 글리세롤의 불순물과 미생물 발효액의 수상 내에 존재하는 유기용매를 동시에 제거하여, 글리세롤과 미생물 발효액을 새로운 발효 공정에 바로 재사용할 수 있는 효과가 있다.

본원의 일 실시예에 따른 미생물 배양 공정을 예시한 공정도이다.

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 3-HP 발효액의 제조

글리세롤 디하이드라타제를 코딩하는 유전자(dhaB), 알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자(aldH) 및 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제를 코딩하는 유전자(gdrAB)를 포함하는 플라스미드 pCDF 를 준비하였다. 사용한 플라스미드는 pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH 로, pCDFDuetJ23 벡터는 pCDFDuet-1 벡터의 프로모터 부분을 J23101과 J23100 프로모터로 치환한 벡터이다. 여기서 사용한 dhaB (약 2.7 kb; dhaB1, dhaB2, dhaB3)와 gdrAB 유전자 (약 2.2 kb; gdrA, gdrB)는 크렙시엘라 뉴모니아의 염색체에서 아래의 프라이머 및 NEB Q5 DNA 폴리머라제를 이용해 NEB에서 제공하는 조건을 사용하여 증폭하였다:

- dhaB-gdrA-F 프라이머: GAATTCATGAAAAGATCAAAACGATTTGCAGTCCT (서열번호 1)

- dhaB-gdrA-R 프라이머: AAGCTTGATCTCCCACTGACCAAAGCTGG (서열번호 2)

- gdrB-F 프라이머: AAGCTTAGAGGGGGCCGTCATGTCGCTTTCACCGCCAG (서열번호 3)

- gdrB-R 프라이머: CTTAAGTCAGTTTCTCTCACTTAACGGC (서열번호 4)

크렙시엘라 뉴모니아의 염색체 상에 dhaB123와 gdrA 유전자가 나란히 위치해 있어 같이 증폭하였고, gdrB는 dhaB123, gdrA와 반대 방향으로 위치해 있기 때문에 gdrB만 따로 증폭하였으며, 이 때 NEB Q5 DNA 폴리머라제를 이용하였으며, 조건은 NEB에서 제공하는 조건을 사용하였다. 그 후 dhaB123, gdrA 유전자는 제한 효소 EcoRI과 HindIII을, gdrB 유전자는 제한 효소 HindIII과 AflII을 이용하여 J23101 프로모터 아래에 클로닝하였다. aldH는 J23100 프로모터 아래에 클로닝하였으며, 아래의 프로모터를 이용하여 E. coli K12 MG1655 염색체로부터 증폭하였고, 이 때 아래의 프라이머 및 NEB Q5 DNA 폴리머라제를 이용하였으며, 조건은 NEB에서 제공하는 조건을 사용하였다.

- aldH-F 프라이머: ggtaccatgaattttc atcatctggc (서열번호 5)

- aldH-R 프라이머: catatgtcaggcctccaggcttat (서열번호 6)

aldH는 제한효소 KpnⅠ과 NdeⅠ을 이용하여 J23108 프로모터 아래에 클로닝하였다. 이상의 클로닝을 통해 pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH 플라스미드를 제작하였다. 상기 플라스미드를 E. coli W3110 (KCCM 40219)에 전기 천공 장치 (Bio-Rad, Gene Pulser Xcell)를 사용한 전기천공법으로 도입하여, 본원의 일 실시예에 따른 3-HP 생산 균주를 제조하였다.

배지로는 Na₂HPO₄ 6 g/L, KH₂PO₄ 3 g/L, NaCl 0.5 g/L, NH₄Cl 1 g/L, 1M MgSO₄ 2 mL 및 1M CaCl₂ 0.1 mL 를 함유한 M9 배지를 사용하였고, 글리세롤 70g/L를 기질로 사용하여 30℃ 및 pH 7.0에서 500rpm 및 1vvm 조건으로 24시간 발효시켜(2L) 3-HP를 생산하였다. 중성제로는 Ca(OH)₂를 사용하였다. 상기 발효를 통해 생산된 3-HP 발효 산물을 6000rpm 에서 10분간 원심분리 원심분리하여 미생물 세포를 제거하였다. 세포가 제거된 3-HP를 포함하는 발효액을 더욱 정제하기 위하여, 2~3 중량% 활성탄을 첨가하여 교반한 후, 원심분리 또는 여과를 통해 3-HP 활성탄 정제액을 수득하였다. 3-HP 발효액의 최종 3-HP 생산량은 57.0 g/L였다.

실시예 2. 3-HP 발효액의 반응추출

실시예 1에서 생산된 Ca 염 형태의 3-HP 발효액을 황산 적정하여 Gypsum을 제거하고 유기산 3-HP (pH3)으로 전환하였다. 3-HP 발효액 (약 56.5 g/L, 2L)과 반응추출 용매 (옥탄올:1.4L, 트리옥틸아민: 0.6L)를 섞어 교반 후 발효액과 용매를 층분리 실행하였다. 3-HP 반응추출 효율은 약 42.3%로 수상에 남은 3-HP 발효액의 농도는 약 32.6 g/L 였다.

실시예 3. 새로운 미생물 발효를 위한 재사용 연구

약 80 내지 85%의 글리세롤을 함유한 비정제 글리세롤(crude glycerol) 200 g을, 실시예 2에서 반응추출 후 회수한 2L의 수상과 혼합하여 녹였다. 5N 염산을 이용하여 비정제 글리세롤 혼합액의 pH를 6.8까지 낮추었다. 분별 깔때기에 상기 비정제 글리세롤 용액을 넣고 200 g/L의 CaCl₂ 용액(16 mL)을 넣은 후 혼합하고 약 30분 동안 그대로 두었다. 층분리가 일어나는 것을 확인하였으며, 수용액 층만 회수하였다. 상기 회수된 수용액 층을 멸균한 M9배지와 혼합한 후, 글리세롤 농도가 70 g/L가 될 때까지 증류수를 넣었다. 여기에 실시예 1에서 제조한 3-HP 생산 균주 E. coli W3110를 접종하여 배양함으로써 3-HP발효를 진행하였다.

비교예로서, 약 80 내지 85%의 글리세롤을 함유한 비정제 글리세롤(crude glycerol)을 상기와 같은 방법으로 pH 조절 및 칼슘 염 첨가를 통해 전처리하여 500 - 600 g/L의 비정제 글리세롤(crude glycerol) 수용액(300ml)을 수득하고, 이를 실시예 2에서 반응추출 후 회수한 1.5L 의 수상 및 멸균한 M9 배지와 혼합한 후, 글리세롤 농도가 70 g/L(총부피 2L)가 될 때까지 증류수를 넣어 혼합하였다. 여기에 실시예 1에서 제조한 3-HP 생산 균주 E. coli W3110를 접종하여 배양함으로써 3-HP발효를 진행하였다.

그 결과, pH 조정 및 칼슘염 첨가를 통하여 비정제 글리세롤 내 불순물 및 잔존 유기용매를 제거한 3-HP의 발효액의 경우, 발효 전 17.3 g/L 였던 3-HP의 농도가 24시간 발효 후, 67.0 g/L로 상승한 것으로 확인되었다. 반면, 비교예의 경우 발효 전 17.3 g/L 였던 3-HP 농도가 발효 후에도 동일하게 17.3 g/L 로 나타나, 결과적으로 3-HP 가 전혀 생성되지 않은 것으로 확인되었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> LG CHEM, LTD. <120> Method for culturing microorganism by reusing fermented liquid of microorganism <130> DPP20181917KR <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dhaB-gdrA-F primer <400> 1 gaattcatga aaagatcaaa acgatttgca gtcct 35 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dhaB-gdrA-R primer <400> 2 aagcttgatc tcccactgac caaagctgg 29 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gdrB-F primer <400> 3 aagcttagag ggggccgtca tgtcgctttc accgccag 38 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gdrB-R primer <400> 4 cttaagtcag tttctctcac ttaacggc 28 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aldH-F primer <400> 5 ggtaccatga attttcatca tctggc 26 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aldH-R primer <400> 6 catatgtcag gcctccaggc ttat 24

Claims

유기용매를 포함하는 미생물 발효액에 비정제 글리세롤(crude glycerol)을 첨가하여 혼합하는 단계 (단계 1);
상기 혼합된 용액의 pH 를 2 내지 8로 조절하는 단계 (단계 2);
상기 용액에 칼슘 염을 첨가하는 단계 (단계 3);
상기 용액을 층분리하여 수용액 층을 회수하는 단계 (단계 4); 및
상기 회수된 수용액 층에 미생물을 배양하는 단계 (단계 5)를 포함하는,
미생물 배양 방법.
제1항에 있어서,
상기 유기용매를 포함하는 미생물 발효액은,
미생물을 발효하여 미생물로부터 생산된 물질을 유기용매로 추출하여 제거한 후 남은 수상인 것을 특징으로 하는, 미생물 배양 방법.
제2항에 있어서,
상기 미생물의 발효는 글리세롤을 함유하는 배지에서 수행되는 것인, 미생물 배양 방법.
제3항에 있어서,
상기 글리세롤을 함유하는 배지는,
비정제 글리세롤 용액의 pH 를 2 내지 8 로 조절하는 단계;
상기 비정제 글리세롤 용액에 칼슘 염을 첨가하는 단계; 및
상기 비정제 글리세롤 용액을 층분리하여 수용액 층을 회수하는 단계
를 포함하는 방법에 의하여 수득된 수용액 층을 함유하는 배지인 것을 특징으로 하는, 미생물 배양 방법.
제2항에 있어서,
상기 미생물로부터 생산된 물질이 바이오케미칼, 바이오연료 또는 바이오플라스틱인, 미생물 배양 방법.
제2항에 있어서,
상기 미생물로부터 생산된 물질이 3-히드록시프로피온산(3-HP)인, 미생물 배양 방법.
제1항 또는 제4항에 있어서,
상기 pH 조절은 염산, 황산, 인산, 질산, 탄산, 붕산, 플루오린화 수소(HF), 또는 옥살산을 첨가하여 수행하는,
미생물 배양 방법.
제1항 또는 제4항에 있어서,
상기 혼합된 용액의 pH 를 6 내지 7로 조절하는 것인, 미생물 배양 방법.
제1항 또는 제4항에 있어서,
상기 칼슘 염은 CaCl₂, CaO, Ca(NO₃)₂, Ca(OH)₂, 또는 CaS인,
미생물 배양 방법.
제1항 또는 제4항에 있어서,
상기 칼슘 염의 첨가량은, 비정제 글리세롤 내 글리세롤 1 kg 대비 1 내지 10 g인, 미생물 배양 방법.