CN113957064A - 一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产dpe的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产DPE的方法，属于生物工程和发酵工程技术领域。本发明公开的一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产DPE的方法，以重组枯草芽孢杆菌为出发菌株，建立OD、酶活反馈调控发酵机制，经种子培养后转入发酵罐进行枯草杆菌高密度发酵生产D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶，在发酵期间通过OD的变化、酶活增量反馈调节控制发酵过程中的风量、转速和补料速度，获得操作简单、菌体密度高、酶活效价高的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶制备方法，发酵结束菌OD600＝100‑110，酶活200‑210U/mL。

Description

一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产DPE的方法
技术领域
本发明涉及生物工程和发酵工程技术领域，更具体的说是涉及一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产DPE的方法。
背景技术
D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose3-epimerase，简称DPE)是目前利用生物法将D-果糖转化到D-阿洛酮糖最有效的酶。
现有技术中，D-阿洛酮糖3-差向异构酶的生产主要来自DPE基因的大肠杆菌的外源表达，对D-阿洛酮糖3-差向异构酶家族酶的研究大多数以大肠杆菌为表达宿主；而枯草芽孢杆菌作为一种传统的工业生产菌株，具有高效的蛋白质分泌能力，是研究外源究蛋白表达和分泌的良好系统，同时它也是一种食品级微生物。重组枯草芽孢杆菌产D-阿洛酮糖3-差向异构酶，菌OD600＝10-15，酶活在15-20U/mL；且重组枯草芽孢杆菌，发酵周期长、菌OD低，蛋白表达量低。
因此，提供一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产DPE的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产DPE的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产DPE的方法，具体步骤如下：
(1)一级种子培养：将重组枯草芽孢杆菌(基因工程菌株1A751SD-XR购于中科院天津工业研究所，构建方法记载在申请号为201610051547.3的专利文件中)按1％的接种量接种在一级种子培养基中，35℃摇瓶培养，转速为220rpm/min；
(2)二级种子培养：一级种子发酵液的OD600＝2.5-3.0时，按1％的接种量接入装有二级种子培养基的二级种子罐中，控制反应温度35℃，DO40-50％，转速为200rpm/min，pH7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压为0.04Mpa，培养8h，OD600＝3.5-4，获得二级种子罐菌种。
(3)发酵罐营养液制备：
a、将磷酸二氢钾30g、磷酸氢二钾100g、磷酸氢二钠30g、柠檬酸17g、氯化铵40g、酵母粉50g和水9L混合并加入发酵罐中，115-121℃，灭菌20-30min；
b、冷却：将灭菌后的发酵罐进循环水冷却至35℃；
c、将硫酸镁12g、PTM1微量元素10mL混合定容至100mL，50mg/mL卡那霉素10mL单独灭菌，并于接种前一同放入发酵罐中。
(4)将获得的二级种子罐菌种接入发酵罐营养液中，接种量为10％，接种后，温度控制在35℃，用15％氨水调节控制pH 7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压0.04Mpa，DO维持在40-50％，转速为400rpm/min。
(5)建立OD、酶活反馈调控发酵机制：
①产酶前阶段：当发酵4h时，菌OD600＝14-15，补料速率为10-11ml/L/h；发酵4-8h期间，根据每4h菌OD600增量调节补料速率：OD600增量在10-15，调节流加补料速率15-17ml/L/h；OD600增量大于15，补料速率降低，调至12-14ml/L/h；OD600增量小于10，增加补料速率，调至18-20ml/L/h；
②产酶阶段：发酵8h至发酵32h为产酶期，根据每8h菌OD600增量与酶活增量来调节补料速率，当酶活增量数值是OD600增量的2.5-3.0倍时，流加补料速率6-8ml/L/h；大于3.0倍时，流加补料速率3-5ml/L/h；小于2.5倍时，流加补料速率10-12ml/L/h；此阶段结束时，菌OD600＝90-95，酶活为190-195U/mL；
③产酶末期：发酵32h至36h产酶量减少，每2h菌OD600增量5-10，酶活增量8-10U/mL，流加补料速率3-5ml/L/h；发酵结束，菌OD600＝100-110，离心，得粗酶液，酶活为200-210U/mL；将所得粗酶液缓慢通过离交柱，去除阴阳离子，得到纯净酶液。
将250g葡萄糖、5g七水硫酸镁、10mL PTM1微量元素混合，用水定容至750mL，灭菌，作为补料流加。
进一步，所述一级种子培养基和二级种子培养基的组成均为：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，水定容至1L。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产DPE的方法，通过OD变化、酶活增量反馈调节控制枯草杆菌高密度发酵产D-阿洛酮糖3-差向异构酶；本发明以重组枯草芽孢杆菌为出发菌株，建立OD、酶活反馈调控发酵机制，经种子培养后转入发酵罐进行重组枯草杆菌高密度发酵生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶，在发酵期间通过OD的变化、酶活增量反馈调节控制发酵过程中的风量、转速和补料速度，获得操作简单、菌体密度高、酶活效价高的D-阿洛酮糖3-差向异构酶制备方法，发酵结束菌OD600＝100-110，酶活200-210U/mL。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产DPE的方法，具体步骤如下：
(1)150mL摇瓶种子制备
配制一级种子培养基(一级种子培养基配方：蛋白胨1.5g、酵母粉0.75g、氯化钠1.5g)，50μg/ml卡那霉素(终浓度)，pH7.0，121℃，灭菌30min。
按1％接种量接种重组枯草芽孢杆菌，35℃，220rpm，摇床培养5h，得到一级种子液。
(2)用吸光光度计测定一级种子发酵液的OD600＝2.5时，按1％的接种量转移至装有1L二级种子培养基(二级种子培养基配方：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L)的5L二级种子罐中；二级种子罐控制培养温度为35℃，DO 40-50％，转速为200rpm/min，以25％的氨水调节pH值至7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压为0.04Mpa，培养8h，OD600＝3.5-4，获得二级种子罐菌种。
(3)15L发酵罐(使用量为10L)分别称量：磷酸二氢钾30g、磷酸氢二钾100g、磷酸氢二钠30g、柠檬酸17g、氯化铵40g、酵母粉50g和水9L混合并加入发酵罐中，115℃，灭菌20min；将灭菌后的发酵罐进循环水冷却至35℃。将硫酸镁12g、PTM1微量元素10mL混合定容至100mL，50mg/mL卡那霉素10mL单独灭菌，接种前放入发酵罐中。
(4)将OD600＝3.5-4的二级种子罐菌种接入步骤(3)的发酵罐营养液中，接种量为10％，接种后，温度控制在35℃，用15％氨水调节控制pH 7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压0.04Mpa，DO维持在40-50％，转速为400rpm/min。
(5)建立OD、酶活反馈调控发酵机制：
①产酶前阶段：根据菌OD600增量调节补料速率；发酵4h，菌OD600＝14，开始补料速率10ml/L/h；发酵8h，菌OD600＝28，补料速率15.2ml/L/h，酶活11U/mL；
②产酶阶段：发酵8h至发酵32h为产酶期，根据菌OD600增量与酶活增量来调节补料速率；发酵16h，菌OD600＝42，酶活40U/mL，流加补料速率11.95ml/L/h；发酵24h，菌OD600＝70，酶活140U/mL，流加补料速率3.1ml/L/h；发酵32h，菌OD600＝96，酶活195U/mL，流加补料速率11.65ml/L/h；
③产酶末期：发酵32h至36h产酶量减少，发酵34h，菌OD600＝103，酶活205U/mL，流加补料速率5ml/L/h；发酵36h，菌OD600＝100；将发酵液离心，速率为4000rpm/min，时间20min，取上清液得到粗酶液，测得酶活200U/mL。
将250g葡萄糖、5g七水硫酸镁、10mL PTM1微量元素混合，用水定容至750mL，灭菌，作为补料流加。
(6)将所得粗酶液缓慢通过离交柱，去除阴阳离子，得到纯净酶液，测得酶活200U/mL，纯度99.8％。
实施例2
一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产DPE的方法，具体步骤如下：
(1)150mL摇瓶种子制备
配制一级种子培养基(一级种子培养基配方：蛋白胨1.5g、酵母粉0.75g、氯化钠1.5g)，50μg/ml卡那霉素(终浓度)，pH7.0，121℃，灭菌30min。
按1％接种量接种重组枯草芽孢杆菌，35℃，220rpm，摇床培养5h，得到一级种子液。
(2)用吸光光度计测定一级种子发酵液的OD600＝2.67时，按1％的接种量转移至装有1L二级种子培养基(二级种子培养基配方：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L)的5L二级种子罐中；二级种子罐控制培养温度为35℃，DO 40-50％，转速为200rpm/min，以25％的氨水调节pH值至7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压为0.04Mpa，培养8h，OD600＝3.5-4，获得二级种子罐菌种。
(3)15L发酵罐(使用量为10L)分别称量：磷酸二氢钾30g、磷酸氢二钾100g、磷酸氢二钠30g、柠檬酸17g、氯化铵40g、酵母粉50g和水9L混合并加入发酵罐中，115℃，灭菌20min；将灭菌后的发酵罐进循环水冷却至35℃。将硫酸镁12g、PTM1微量元素10mL混合定容至100mL，50mg/mL卡那霉素10mL单独灭菌，接种前放入发酵罐中。
(4)将OD600＝3.5-4的二级种子罐菌种接入步骤(3)的发酵罐营养液中，接种量为10％，接种后，温度控制在35℃，用15％氨水调节控制pH 7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压0.04Mpa，DO维持在40-50％，转速为400rpm/min。
(5)建立OD、酶活反馈调控发酵机制：
①产酶前阶段：根据菌OD600增量调节补料速率；发酵4h，菌OD600＝15，开始补料速率11ml/L/h；发酵8h，菌OD600＝28.8，补料速率15.4ml/L/h，酶活10U/mL；
②产酶阶段：发酵8h至发酵32h为产酶期，根据菌OD600增量与酶活增量来调节补料速率；发酵16h，菌OD600＝39，酶活42U/mL，流加补料速率4.5ml/L/h；发酵24h，菌OD600＝72，酶活143U/mL，流加补料速率4.9ml/L/h；发酵32h，菌OD600＝94，酶活190U/mL，流加补料速率11.6ml/L/h；
③产酶末期：发酵32h至36h产酶量减少；发酵34h，菌OD600＝104，酶活198U/mL，流加补料速率4ml/L/h；发酵36h，菌OD600＝101；将发酵液离心，速率为4000rpm/min，时间20min，取上清液得到粗酶液，测得酶活201U/mL。
将250g葡萄糖、5g七水硫酸镁、10mL PTM1微量元素混合，用水定容至750mL，灭菌，作为补料流加。
(6)将所得粗酶液缓慢通过离交柱，去除阴阳离子，得到纯净酶液，测得酶活201U/mL，纯度99.9％。
实施例3
一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产DPE的方法，具体步骤如下：
(1)150mL摇瓶种子制备
配制一级种子培养基(一级种子培养基配方：蛋白胨1.5g、酵母粉0.75g、氯化钠1.5g)，50μg/ml卡那霉素(终浓度)，pH7.0，121℃，灭菌30min。
按1％接种量接种重组枯草芽孢杆菌，35℃，220rpm，摇床培养5h，得到一级种子液。
(2)用吸光光度计测定一级种子发酵液的OD600＝3时，按1％的接种量转移至装有1L二级种子培养基(二级种子培养基配方：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L)的5L二级种子罐中；二级种子罐控制培养温度为35℃，DO 40-50％，转速为200rpm/min，以25％的氨水调节pH值至7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压为0.04Mpa，培养8h，OD600＝3.5-4，获得二级种子罐菌种。
(3)15L发酵罐(使用量为10L)分别称量：磷酸二氢钾30g、磷酸氢二钾100g、磷酸氢二钠30g、柠檬酸17g、氯化铵40g、酵母粉50g和水9L混合并加入发酵罐中，115℃，灭菌20min；将灭菌后的发酵罐进循环水冷却至35℃。将硫酸镁12g、PTM1微量元素10mL混合定容至100mL，50mg/mL卡那霉素10mL单独灭菌，接种前放入发酵罐中。
(4)将OD600＝3.5-4的二级种子罐菌种接入步骤(3)的发酵罐营养液中，接种量为10％，接种后，温度控制在35℃，用15％氨水调节控制pH 7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压0.04Mpa，DO维持在40-50％，转速为400rpm/min。
(5)建立OD、酶活反馈调控发酵机制：
①产酶前阶段：根据每4h菌OD600增量调节补料速率；发酵4h，菌OD600＝14.5，开始补料速率10.5ml/L/h；发酵8h，菌OD600＝30，补料速率13.50ml/L/h，酶活12U/mL；
②产酶阶段：发酵8h至发酵32h为产酶期，根据菌OD600增量与酶活增量来调节补料速率；发酵16h，菌OD600＝41.5，酶活43U/mL，流加补料速率7.05ml/L/h；发酵24h，菌OD600＝71.5，酶活145U/mL，流加补料速率3.3ml/L/h；发酵32h，菌OD600＝95.5，酶活193U/mL，流加补料速率11.8ml/L/h；
③产酶末期：发酵32h至36h产酶量减少；发酵34h，菌OD600＝103，酶活201U/mL，流加补料速率3.5ml/L/h；发酵36h，菌OD600＝100；将发酵液离心，速率为4000rpm/min，时间20min，取上清液得到粗酶液，测得酶活202U/mL。
将250g葡萄糖、5g七水硫酸镁、10mL PTM1微量元素混合，用水定容至750mL，灭菌，作为补料流加。
(6)将所得粗酶液缓慢通过离交柱，去除阴阳离子，得到纯净酶液，测得酶活203U/mL，纯度99.7％。
实施例4
一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产DPE的方法，具体步骤如下：
(1)150mL摇瓶种子制备
配制一级种子培养基(一级种子培养基配方：蛋白胨1.5g、酵母粉0.75g、氯化钠1.5g)，50μg/ml卡那霉素(终浓度)，pH7.0，121℃，灭菌30min。
按1％接种量接种重组枯草芽孢杆菌，35℃，220rpm，摇床培养5h，得到一级种子液。
(2)用吸光光度计测定一级种子发酵液的OD600＝2.65时，按1％的接种量转移至装有1L二级种子培养基(二级种子培养基配方：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L)的5L二级种子罐中；二级种子罐控制培养温度为35℃，DO 40-50％，转速为200rpm/min，以25％的氨水调节pH值至7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压为0.04Mpa，培养8h，OD600＝3.5-4，获得二级种子罐菌种。
(3)15L发酵罐(使用量为10L)分别称量：磷酸二氢钾30g、磷酸氢二钾100g、磷酸氢二钠30g、柠檬酸17g、氯化铵40g、酵母粉50g和水9L混合并加入发酵罐中，115℃，灭菌20min；将灭菌后的发酵罐进循环水冷却至35℃。将硫酸镁12g、PTM1微量元素10mL混合定容至100mL，50mg/mL卡那霉素10mL单独灭菌，接种前放入发酵罐中。
(4)将OD600＝3.5-4的二级种子罐菌种接入步骤(3)的发酵罐营养液中，接种量为10％，接种后，温度控制在35℃，用15％氨水调节控制pH 7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压0.04Mpa，DO维持在40-50％，转速为400rpm/min。
(5)建立OD、酶活反馈调控发酵机制：
①产酶前阶段：根据每4h菌OD600增量调节补料速率；发酵4h，菌OD600＝14，开始补料速率10ml/L/h；发酵8h，菌OD600＝29.8，补料速率13.3ml/L/h，酶活12U/mL；
②产酶阶段：发酵8h至发酵32h为产酶期，根据菌OD600增量与酶活增量来调节补料速率；发酵16h，菌OD600＝43.7，酶活45U/mL，流加补料速率10.7ml/L/h；发酵24h，菌OD600＝79.2，酶活148U/mL，流加补料速率6.3ml/L/h；发酵32h，菌OD600＝96，酶活191U/mL，流加补料速率7.9ml/L/h；
③产酶末期：发酵32h至36h产酶量减少；发酵34h，菌OD600＝104，酶活201U/mL，流加补料速率5ml/L/h；发酵36h，菌OD600＝100；将发酵液离心，速率为4000rpm/min，时间20min，取上清液得到粗酶液，测得酶活203U/mL。
将250g葡萄糖、5g七水硫酸镁、10mL PTM1微量元素混合，用水定容至750mL，灭菌，作为补料流加。
(6)将所得粗酶液缓慢通过离交柱，去除阴阳离子，得到纯净酶液，测得酶活203U/mL，纯度99.8％。
实施例5
一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产DPE的方法，具体步骤如下：
(1)150mL摇瓶种子制备
配制一级种子培养基(一级种子培养基配方：蛋白胨1.5g、酵母粉0.75g、氯化钠1.5g)，50μg/ml卡那霉素(终浓度)，pH7.0，121℃，灭菌30min。
按1％接种量接种重组枯草芽孢杆菌，35℃，220rpm，摇床培养5h，得到一级种子液。
(2)用吸光光度计测定一级种子发酵液的OD600＝2.75时，按1％的接种量转移至装有1L二级种子培养基(二级种子培养基配方：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L)的5L二级种子罐中；二级种子罐控制培养温度为35℃，DO 40-50％，转速为200rpm/min，以25％的氨水调节pH值至7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压为0.04Mpa，培养8h，OD600＝3.5-4，获得二级种子罐菌种。
(3)15L发酵罐(使用量为10L)分别称量：磷酸二氢钾30g、磷酸氢二钾100g、磷酸氢二钠30g、柠檬酸17g、氯化铵40g、酵母粉50g和水9L混合并加入发酵罐中，115℃，灭菌20min；将灭菌后的发酵罐进循环水冷却至35℃。将硫酸镁12g、PTM1微量元素10mL混合定容至100mL，50mg/mL卡那霉素10mL单独灭菌，接种前放入发酵罐中。
(4)将OD600＝3.5-4的二级种子罐菌种接入步骤(3)的发酵罐营养液中，接种量为10％，接种后，温度控制在35℃，用15％氨水调节控制pH 7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压0.04Mpa，DO维持在40-50％，转速为400rpm/min。
(5)建立OD、酶活反馈调控发酵机制：
①产酶前阶段：根据每4h菌OD600增量调节补料速率；发酵4h，菌OD600＝14，开始补料速率10ml/L/h；发酵8h，菌OD600＝30，补料速率13ml/L/h，酶活11U/mL；
②产酶阶段：发酵8h至发酵32h为产酶期，根据菌OD600增量与酶活增量来调节补料速率；发酵16h，菌OD600＝40.6，酶活43U/mL，流加补料速率4.95ml/L/h；发酵24h，菌OD600＝76.3，酶活143U/mL，流加补料速率6.93ml/L/h；发酵32h，菌OD600＝98，酶活193U/mL，流加补料速率10.7ml/L/h；
③产酶末期：发酵32h至36h产酶量减少；发酵34h，菌OD600＝108，酶活201U/mL，流加补料速率4.5ml/L/h；发酵36h，菌OD600＝105；将发酵液离心，速率为4000rpm/min，时间20min，取上清液得到粗酶液，测得酶活200U/mL。
将250g葡萄糖、5g七水硫酸镁、10mL PTM1微量元素混合，用水定容至750mL，灭菌，作为补料流加。
(6)将所得粗酶液缓慢通过离交柱，去除阴阳离子，得到纯净酶液，测得酶活201U/mL，纯度99.78％。
实施例6
一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产DPE的方法，具体步骤如下：
(1)150mL摇瓶种子制备
配制一级种子培养基(一级种子培养基配方：蛋白胨1.5g、酵母粉0.75g、氯化钠1.5g)，50μg/ml卡那霉素(终浓度)，pH7.0，121℃，灭菌30min。
按1％接种量接种重组枯草芽孢杆菌，35℃，220rpm，摇床培养5h，得到一级种子液。
(2)用吸光光度计测定一级种子发酵液的OD600＝2.85时，按1％的接种量转移至装有1L二级种子培养基(二级种子培养基配方：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L)的5L二级种子罐中；二级种子罐控制培养温度为35℃，DO 40-50％，转速为200rpm/min，以25％的氨水调节pH值至7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压为0.04Mpa，培养8h，OD600＝3.5-4，获得二级种子罐菌种。
(3)15L发酵罐(使用量为10L)分别称量：磷酸二氢钾30g、磷酸氢二钾100g、磷酸氢二钠30g、柠檬酸17g、氯化铵40g、酵母粉50g和水9L混合并加入发酵罐中，115℃，灭菌20min；将灭菌后的发酵罐进循环水冷却至35℃。将硫酸镁12g、PTM1微量元素10mL混合定容至100mL，50mg/mL卡那霉素10mL单独灭菌，接种前放入发酵罐中。
(4)将OD600＝3.5-4的二级种子罐菌种接入步骤(3)的发酵罐营养液中，接种量为10％，接种后，温度控制在35℃，用15％氨水调节控制pH 7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压0.04Mpa，DO维持在40-50％，转速为400rpm/min。
(5)建立OD、酶活反馈调控发酵机制：
①产酶前阶段：根据每4h菌OD600增量调节补料速率；发酵4h，菌OD600＝14.2，开始补料速率10.2ml/L/h；发酵8h，菌OD600＝30.7，补料速率12.5ml/L/h，酶活11.5U/mL；
②产酶阶段：发酵8h至发酵32h为产酶期，根据菌OD600增量与酶活增量来调节补料速率；发酵16h，菌OD600＝42.6，酶活42U/mL，流加补料速率7.9ml/L/h；发酵24h，菌OD600＝73.8，酶活145U/mL，流加补料速率3.6ml/L/h；发酵32h，菌OD600＝93.4，酶活193U/mL，流加补料速率10.2ml/L/h；
③产酶末期：发酵32h至36h产酶量减少；发酵34h，菌OD600＝102，酶活203U/mL，流加补料速率4ml/L/h；发酵36h，菌OD600＝101；将发酵液离心，速率为4000rpm/min，时间20min，取上清液得到粗酶液，测得酶活200U/mL。
将250g葡萄糖、5g七水硫酸镁、10mL PTM1微量元素混合，用水定容至750mL，灭菌，作为补料流加。
(6)将所得粗酶液缓慢通过离交柱，去除阴阳离子，得到纯净酶液，测得酶活201U/mL，纯度99.75％。
实施例7
一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产DPE的方法，具体步骤如下：
(1)150mL摇瓶种子制备
配制一级种子培养基(一级种子培养基配方：蛋白胨1.5g、酵母粉0.75g、氯化钠1.5g)，50μg/ml卡那霉素(终浓度)，pH7.0，121℃，灭菌30min。
按1％接种量接种重组枯草芽孢杆菌，35℃，220rpm，摇床培养5h，得到一级种子液。
(2)用吸光光度计测定一级种子发酵液的OD600＝2.8时，按1％的接种量转移至装有1L二级种子培养基(二级种子培养基配方：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L)的5L二级种子罐中；二级种子罐控制培养温度为35℃，DO 40-50％，转速为200rpm/min，以25％的氨水调节pH值至7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压为0.04Mpa，培养8h，OD600＝3.5-4，获得二级种子罐菌种。
(3)15L发酵罐(使用量为10L)分别称量：磷酸二氢钾30g、磷酸氢二钾100g、磷酸氢二钠30g、柠檬酸17g、氯化铵40g、酵母粉50g和水9L混合并加入发酵罐中，115℃，灭菌20min；将灭菌后的发酵罐进循环水冷却至35℃。将硫酸镁12g、PTM1微量元素10mL混合定容至100mL，50mg/mL卡那霉素10mL单独灭菌，接种前放入发酵罐中。
(4)将OD600＝3.5-4的二级种子罐菌种接入步骤(3)的发酵罐营养液中，接种量为10％，接种后，温度控制在35℃，用15％氨水调节控制pH 7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压0.04Mpa，DO维持在40-50％，转速为400rpm/min。
(5)建立OD、酶活反馈调控发酵机制：
①产酶前阶段：根据每4h菌OD600增量调节补料速率；发酵4h，菌OD600＝14.8，开始补料速率10.8ml/L/h；发酵8h，菌OD600＝28.5，补料速率15.80ml/L/h，酶活12.2U/mL；
②产酶阶段：发酵8h至发酵32h为产酶期，根据菌OD600增量与酶活增量来调节补料速率；发酵16h，菌OD600＝40.8，酶活48U/mL，流加补料速率6.13ml/L/h；发酵24h，菌OD600＝76.4，酶活144U/mL，流加补料速率7.05ml/L/h；发酵32h，菌OD600＝96.5，酶活193U/mL，流加补料速率10.3ml/L/h；
③产酶末期：发酵32h至36h产酶量减少；发酵34h，菌OD600＝105，酶活202U/mL，流加补料速率4ml/L/h；发酵36h，菌OD600＝103；将发酵液离心，速率为4000rpm/min，时间20min，取上清液得到粗酶液，测得酶活204U/mL。
将250g葡萄糖、5g七水硫酸镁、10mL PTM1微量元素混合，用水定容至750mL，灭菌，作为补料流加。
(6)将所得粗酶液缓慢通过离交柱，去除阴阳离子，得到纯净酶液，测得酶活205U/mL，纯度99.8％。
实施例8
一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产DPE的方法，具体步骤如下：
(1)150mL摇瓶种子制备
配制一级种子培养基(一级种子培养基配方：蛋白胨1.5g、酵母粉0.75g、氯化钠1.5g)，50μg/ml卡那霉素(终浓度)，pH7.0，121℃，灭菌30min。
按1％接种量接种重组枯草芽孢杆菌，35℃，220rpm，摇床培养5h，得到一级种子液。
(2)用吸光光度计测定一级种子发酵液的OD600＝2.9时，按1％的接种量转移至装有1L二级种子培养基(二级种子培养基配方：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L)的5L二级种子罐中；二级种子罐控制培养温度为35℃，DO 40-50％，转速为200rpm/min，以25％的氨水调节pH值至7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压为0.04Mpa，培养8h，OD600＝3.5-4，获得二级种子罐菌种。
(3)15L发酵罐(使用量为10L)分别称量：磷酸二氢钾30g、磷酸氢二钾100g、磷酸氢二钠30g、柠檬酸17g、氯化铵40g、酵母粉50g和水9L混合并加入发酵罐中，115℃，灭菌20min；将灭菌后的发酵罐进循环水冷却至35℃。将硫酸镁12g、PTM1微量元素10mL混合定容至100mL，50mg/mL卡那霉素10mL单独灭菌，接种前放入发酵罐中。
(4)将OD600＝3.5-4的二级种子罐菌种接入步骤(3)的发酵罐营养液中，接种量为10％，接种后，温度控制在35℃，用15％氨水调节控制pH 7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压0.04Mpa，DO维持在40-50％，转速为400rpm/min。
(5)建立OD、酶活反馈调控发酵机制：
①产酶前阶段：根据每4h菌OD600增量调节补料速率；发酵4h，菌OD600＝14.4，开始补料速率10.4ml/L/h；发酵8h，菌OD600＝28.6，补料速率15.3ml/L/h，酶活11.5U/mL；
②产酶阶段：发酵8h至发酵32h为产酶期，根据菌OD600增量与酶活增量来调节补料速率；发酵16h，菌OD600＝39.9，酶活45U/mL，流加补料速率6.1ml/L/h；发酵24h，菌OD600＝80.4，酶活146U/mL，流加补料速率10.1ml/L/h；发酵32h，菌OD600＝99.2，酶活195U/mL，流加补料速率7.5ml/L/h；
③产酶末期：发酵32h至36h产酶量减少；发酵34h，菌OD600＝106，酶活205U/mL，流加补料速率3.5ml/L/h；发酵36h，菌OD600＝103；将发酵液离心，速率为4000rpm/min，时间20min，取上清液得到粗酶液，测得酶活208U/mL。
将250g葡萄糖、5g七水硫酸镁、10mL PTM1微量元素混合，用水定容至750mL，灭菌，作为补料流加。
(6)将所得粗酶液缓慢通过离交柱，去除阴阳离子，得到纯净酶液，测得酶活208U/mL，纯度99.7％。
实施例9
一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产DPE的方法，具体步骤如下：
(1)150mL摇瓶种子制备
配制一级种子培养基(一级种子培养基配方：蛋白胨1.5g、酵母粉0.75g、氯化钠1.5g)，50μg/ml卡那霉素(终浓度)，pH7.0，121℃，灭菌30min。
按1％接种量接种重组枯草芽孢杆菌，35℃，220rpm，摇床培养5h，得到一级种子液。
(2)用吸光光度计测定一级种子发酵液的OD600＝2.5时，按1％的接种量转移至装有1L二级种子培养基(二级种子培养基配方：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L)的5L二级种子罐中；二级种子罐控制培养温度为35℃，DO 40-50％，转速为200rpm/min，以25％的氨水调节pH值至7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压为0.04Mpa，培养8h，OD600＝3.5-4，获得二级种子罐菌种。
(3)15L发酵罐(使用量为10L)分别称量：磷酸二氢钾30g、磷酸氢二钾100g、磷酸氢二钠30g、柠檬酸17g、氯化铵40g、酵母粉50g和水9L混合并加入发酵罐中，115℃，灭菌20min；将灭菌后的发酵罐进循环水冷却至35℃。将硫酸镁12g、PTM1微量元素10mL混合定容至100mL，50mg/mL卡那霉素10mL单独灭菌，接种前放入发酵罐中。
(4)将OD600＝3.5-4的二级种子罐菌种接入步骤(3)的发酵罐营养液中，接种量为10％，接种后，温度控制在35℃，用15％氨水调节控制pH 7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压0.04Mpa，DO维持在40-50％，转速为400rpm/min。
(5)建立OD、酶活反馈调控发酵机制：
①产酶前阶段：根据菌OD600增量调节补料速率；发酵4h，菌OD600＝15，开始补料速率11ml/L/h；发酵8h，菌OD600＝24.5，补料速率18.5ml/L/h，酶活12.8U/mL；
②产酶阶段：发酵8h至发酵32h为产酶期，根据菌OD600增量与酶活增量来调节补料速率；发酵16h，菌OD600＝38，酶活51U/mL，流加补料速率6.7ml/L/h；发酵24h，菌OD600＝74，酶活150U/mL，流加补料速率7ml/L/h；发酵32h，菌OD600＝90，酶活194U/mL，流加补料速率7ml/L/h；
③产酶末期：发酵32h至36h产酶量减少，发酵34h，菌OD600＝95，酶活204U/mL，流加补料速率10ml/L/h；发酵36h，菌OD600＝100；将发酵液离心，速率为4000rpm/min，时间20min，取上清液得到粗酶液，测得酶活210U/mL。
将250g葡萄糖、5g七水硫酸镁、10mL PTM1微量元素混合，用水定容至750mL，灭菌，作为补料流加。
(6)将所得粗酶液缓慢通过离交柱，去除阴阳离子，得到纯净酶液，测得酶活210U/mL，纯度99.8％。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (5)

1.一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产DPE的方法，第一步，培养重组枯草芽孢杆菌，获得种子液；第二步，将第一步获得的种子液接种到发酵罐营养液中；第三步，建立OD、酶活反馈调控发酵机制，制得发酵液；第四步，将第三步所得发酵液进行离心、离交，得到D-阿洛酮糖3-差向异构酶液体；其特征在于，第三步，建立OD、酶活反馈调控发酵机制：
①产酶前阶段：当发酵4h时，菌OD600＝14-15，补料速率为10-11ml/L/h；发酵4-8h期间，根据每4h菌OD600增量调节补料速率：OD600增量在10-15，调节流加补料速率15-17ml/L/h；OD600增量大于15，补料速率降低，调至12-14ml/L/h；OD600增量小于10，增加补料速率，调至18-20ml/L/h；
②产酶阶段：发酵8h至发酵32h为产酶期，根据每8h菌OD600增量与酶活增量来调节补料速率，当酶活增量数值是OD600增量的2.5-3.0倍时，流加补料速率6-8ml/L/h；大于3.0倍时，流加补料速率3-5ml/L/h；小于2.5倍时，流加补料速率10-12ml/L/h；此阶段结束时，菌OD600＝90-95，酶活为190-195U/mL；
③产酶末期：发酵32h至36h产酶量减少，每2h菌OD600增量5-10，酶活增量8-10U/mL，流加补料速率3-5ml/L/h；发酵结束，菌OD600＝100-110，酶活为200-210U/mL；
将250g葡萄糖、5g七水硫酸镁、10mL PTM1微量元素混合，用水定容至750mL，灭菌，作为补料流加。
2.根据权利要求1所述的一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产DPE的方法，其特征在于，第一步，培养重组枯草芽孢杆菌，包括：
A、一级种子培养：将重组枯草芽孢杆菌按1％的接种量接种在一级种子培养基中，35℃摇瓶培养，转速为220rpm/min；
B、二级种子培养：一级种子发酵液的OD600＝2.5-3.0时，按1％的接种量接入装有二级种子培养基的二级种子罐中，控制反应温度35℃，DO 40-50％，转速为200rpm/min，pH 7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压为0.04Mpa，培养8h，OD600＝3.5-4，获得二级种子罐菌种。
3.根据权利要求2所述的一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产DPE的方法，其特征在于，所述一级种子培养基和二级种子培养基的组成均为：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，水定容至1L。
4.根据权利要求2所述的一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产DPE的方法，其特征在于，第二步，将第一步获得的种子液接种到发酵罐营养液中，具体操作如下：将获得的二级种子罐菌种接入发酵罐营养液中，接种量为10％，接种后，温度控制在35℃，用15％氨水调节控制pH 7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压0.04Mpa，DO维持在40-50％，转速为400rpm/min。
5.根据权利要求4所述的一种重组枯草芽孢杆菌高密度发酵生产DPE的方法，其特征在于，所述发酵罐营养液的制备方法如下：
a、将磷酸二氢钾30g、磷酸氢二钾100g、磷酸氢二钠30g、柠檬酸17g、氯化铵40g、酵母粉50g和水9L混合并加入发酵罐中，115-121℃，灭菌20-30min；
b、冷却：将灭菌后的发酵罐进循环水冷却至35℃；
c、将硫酸镁12g、PTM1微量元素10mL混合定容至100mL，50mg/mL卡那霉素10mL单独灭菌，并于接种前一同放入发酵罐中。
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