CN105420265B - 一种过量表达atp酶的基因工程醋酸菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一种过量表达atp酶的基因工程醋酸菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌的构建方法，包括如下步骤：a.将乙醛脱氢酶启动子、ATP酶基因以及可在醋酸菌中稳定复制的质粒依次连接，得到重组质粒；b.将经过a步骤得到的重组质粒转入醋酸菌中，即得。本发明还提供该构建方法得到的过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌及其应用。本发明的过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌，能够增加醋酸菌中ATP酶的表达量，在醋酸发酵中能够提高发酵效率，降低生产成本。

Description

一种过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌及其构建方法和应用。
背景技术
食醋是全球消费量最大的调味品之一，其主要成分是醋酸，而醋酸不仅是食品工业最重要的辅料，而且是食品、医药、化工、纺织等领域广泛应用的化合物之一。醋酸菌(Acetic acid bacteria)是一类能将乙醇氧化成醋酸等产物的细菌，有些还能氧化葡萄糖为葡萄糖酸，在医药、食品等领域应用广泛。醋酸菌是革兰氏阴性菌，化能异养型，严格好氧，最常见是醋杆菌属(Acetobacter)葡萄糖杆菌属(Gluconobacter)以及葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter)等，其中醋杆菌属和葡萄糖杆菌属由于具有较高的乙醇氧化和醋酸耐受能力，常用于醋酸的发酵生产。
醋酸的发酵是在醋酸菌脱氢酶系的作用下完成从乙醇到醋酸的氧化反应，主要分为二个阶段：乙醇在乙醇脱氢酶(Alcohol Dehydrogenase,ADH)的催化下氧化成乙醛，接着由乙醛脱氢酶(Aldehyde Dehydrogenase,ALDH)氧化成醋酸。发酵过程中菌体浓度、乙醇浓度、菌体内催化酶的活性以及辅酶浓度，都是影响产酸速率的重要因素，而发酵过程中醋酸的积累会对菌体活性产生较大影响。因此，提高醋酸菌的醋酸耐受性对于醋酸发酵工业具有重大意义。近年来对于醋酸菌醋酸耐受性的研究中发现，各种耐酸机制大多需要消耗ATP以实现对醋酸的耐受,因此高效快速的能量供应是醋酸菌在高酸发酵环境中进行正常生理代谢的重要保障。其中，ATP酶(ATPase)在菌体能量代谢中起着重要的作用。
三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)是一种核苷酸(又叫腺苷三磷酸)，是体内组织细胞一切生命活动所需能量的直接来源，被誉为细胞内能量的“分子货币”，储存和传递化学能，蛋白质、脂肪、糖和核苷酸的合成都需它参与，可促使机体各种细胞的修复和再生，增强细胞代谢活性。ATP酶，又称为三磷酸腺苷酶，是一类能将三磷酸腺苷(ATP)催化水解为二磷酸腺苷(ADP)和磷酸根离子的酶，这是一个释放能量的反应。ATP酶可水解ATP释放能量,其活性可反映细胞能量水平。生物体内大多反应都需要能量，醋酸菌发酵乙醇产醋酸并将其体内的醋酸转运出体外都需要能量供应。有研究表明醋酸菌对醋酸的耐受性与能量相关，但ATP酶在生物体内的浓度较低，制约了发酵的效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够提升ATP酶表达量、减少能源消耗、提升生产效率、降低生产成本的一种过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌，本发明还提供该基因工程醋酸菌的构建方法和应用。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌的构建方法，包括如下步骤：
a.将乙醛脱氢酶启动子、ATP酶基因以及可在醋酸菌中稳定复制的质粒依次连接，得到重组质粒；
b.将经过a步骤得到的重组质粒转入醋酸菌中，即得。
本发明中，优选的方案为所述乙醛脱氢酶启动子来源于巴氏醋杆菌。
本发明中，优选的方案为所述可在醋酸菌中稳定复制的质粒为pBBRR1MCS-4质粒；所述重组质粒为pBBR-paldh-ATPase质粒。
本发明中，优选的方案为所述a步骤具体包括如下步骤：
Ι.以巴氏醋杆菌基因组为模板，进行PCR反应，得到乙醛脱氢酶启动子序列，所述乙醛脱氢酶启动子序列如序列SEQ ID No:1所示；
其中PCR反应所用到的引物对为：
paldh-1：5'-CGCGGATCC CGGAATCCTGAAAACGGG-3'；
paldh-2：5'-AGCACTAGT CATGACCAATACCTTTGTATGT-3'；
PCR反应的条件为：94-95℃预变性5分钟，94-95℃30秒s，50-60℃20秒，72℃20-40秒，25-30个循环后72℃10分钟；
Ⅱ.将质粒pBBR1MCS-4和步骤Ι得到的SEQ ID No:1序列分别用限制性内切酶BamHI和Spe I处理，处理时间为2-12h、环境温度为37℃；纯化回收，将酶切纯化后的质粒和SEQID No:1序列按摩尔比1:0.2-5混合，然后利用T4DNA连接酶进行连接反应，反应温度为14-16℃，反应时间为4-12小时；接着将连接产物转入大肠杆菌DH 5α感受态中，获得重组质粒pBBR-Paldh；
Ⅲ.以巴氏醋杆菌基因组为模板，进行PCR反应，得到ATP酶基因序列，所述ATP酶基因序列如序列SEQ ID No:2所示；
其中PCR反应所用到的引物对为：
ATPase-1：5'-AGCACTAGTATGTGGTCTAAACCGATCACA-3'；
ATPase-2：5'-TGCTCTAGATCACGCTCTAGAGAGGCTG-3'；
PCR反应条件为：94-95℃预变性5分钟，94-95℃30秒，50-60℃20秒，72℃1-2分钟，25-30个循环后72℃10分钟；
Ⅳ.将步骤Ⅱ得到的重组质粒pBBR-Paldh、步骤Ⅲ得到的ATP酶基因序列分别用限制性内切酶Spe I和Xba I处理，处理时间为2-12h、环境温度为37℃；纯化回收，将酶切纯化后的质粒和ATP酶基因序列按摩尔比1:0.2-5混合，然后利用T4DNA连接酶进行连接反应，反应温度为14-16℃，反应时间为4-12小时；然后将连接产物转入大肠杆菌DH 5α感受态中，获得重组质粒pBBR-Paldh-ATPase。
本发明中，优选的方案为所述b步骤中采用电激转化法将a步骤得到的重组质粒转入醋酸菌中。
本发明中，优选的方案为所述b步骤中的醋酸菌选自葡糖杆菌、醋杆菌和葡糖酸醋杆菌。
本发明还提供由上述构建方法得到的过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌。
本发明还提供该过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌在醋酸发酵中应用，所述醋酸发酵以乙醇或含有乙醇的酒醪为原料。
本发明中，所述的过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌在醋酸发酵中应用，具体包括如下步骤：将过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌在培养基中进行扩繁培养，然后将扩繁培养后的过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌和原料一起置于发酵罐中，进行发酵；具体的，所述醋酸发酵的方式可以为分批发酵、补料分批发酵或分割发酵。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明通过构建含有ATPase的重组质粒并转入醋酸菌中，获得过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌，从而提高醋酸菌体内乙醇转化为醋酸过程和生长代谢所需要的能量。
(2)本发明利用乙醛脱氢酶启动子控制重组质粒中ATP酶的表达，实现了乙醛脱氢酶和ATP酶的同时合成，具有协同效果。当培养基中不含有乙醇时，该启动子不进行ATP酶的重组表达，提高了菌体的稳定性，并且，通过比较原始菌株和基因工程菌株生长曲线，发现基因工程质粒对菌体生长没有影响。
(3)利用该基因工程醋酸菌以乙醇为主要原料进行醋酸发酵具有发酵延迟期短，发酵速率高等优点，从而减少能源消耗、提高生产效率、提高企业效益。
下面结合附图及具体实施方式对本发明进行详细说明。
附图说明
图1为本发明实施例1的基因工程醋酸菌和原始菌株在第一组发酵培养基中的醋酸发酵比较数据图；
图2为本发明实施例1的基因工程醋酸菌和原始菌株在第二组发酵培养基中的醋酸发酵比较数据图；
图3本发明实施例2的基因工程醋酸菌和原始菌株以含乙醇8％、醋酸浓度10g/L的培养基中的醋酸发酵比较数据图；
图4本发明实施例3的基因工程醋酸菌和原始菌株以苹果酒为原料的醋酸发酵比较数据图；
其中，图1-图2中，基因工程醋酸菌为含有重组质粒pBBR-Paldh-ATPase的Acetobacter pasteurianus CGMCC 3089基因工程菌，原始菌株为Acetobacterpasteurianus CGMCC 3089菌株；
图3中，基因工程醋酸菌为含有重组质粒pBBR-Paldh-ATPase的AcetobacteracetiCGMCC1.1809基因工程菌，原始菌株为Acetobacter acetiCGMCC1.1809菌株；
图4中，基因工程醋酸菌为含有重组质粒pBBR-Paldh-ATPase的GluconobacteroxydansCGMCC 1.49基因工程菌，原始菌株为Gluconobacter oxydansCGMCC 1.49菌株。
具体实施方式
一种过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌的构建方法，包括如下步骤：
a.将乙醛脱氢酶启动子、ATP酶基因以及可在醋酸菌中稳定复制的质粒依次连接，得到重组质粒；
b.将经过a步骤得到的重组质粒转入醋酸菌中，即得。
本发明中，优选的方案为所述乙醛脱氢酶启动子来源于巴氏醋杆菌。
本发明中，优选的方案为所述可在醋酸菌中稳定复制的质粒为pBBRR1MCS-4质粒；所述重组质粒为pBBR-paldh-ATPase质粒。
本发明中，优选的方案为所述a步骤具体包括如下步骤：
Ι.以巴氏醋杆菌基因组为模板，进行PCR反应，得到乙醛脱氢酶启动子序列，所述乙醛脱氢酶启动子序列如序列SEQ ID No:1所示；
其中PCR反应所用到的引物对为：
paldh-1：5'-CGCGGATCC CGGAATCCTGAAAACGGG-3'；(下划线部分为BamH I酶切位点)；
paldh-2：5'-AGCACTAGT CATGACCAATACCTTTGTATGT-3'；(下划线部分为Spe I酶切位点)；
PCR反应的条件为：94-95℃预变性5分钟，94-95℃30秒s，50-60℃20秒，72℃20-40秒，25-30个循环后72℃10分钟；
SEQ ID No:1序列：5'-cggaatcctg aaaacgggtt ttgtcatgtt gcagcatgagctcacaaacg actctttttg tccttacgcc gatgtttctc atgatgatta tccttttgat ggttgcttggtctattggcc tgcctgaatc tagcgcgcca tcaccctttt attaggacaa tatgaaagtg aaatttccactaaaaaacat ttctcaggat cattattttt atatcaaaat gaacatgctt aaaaattaat cacaacgtgcagatcaatgc cgaaaaaatg tgcgttcccg atgctgcttt tggtgcgggt tttatgtgtt ctctatcatgaaaaatttat atatggctgc ggcatatcac ggaaataatt tcatattatg ttagaaatcc ttttatttttaataagtttt ctaagatcac ttaccagaat aataattcct ttccgtcata aaattctgtt gacatatacggaatgaatct gtcccatttc gttatcgaaa catacaaagg tattggtcat g-3'；
Ⅱ.将质粒pBBR1MCS-4和步骤Ι得到的SEQ ID No:1序列分别用限制性内切酶BamHI和Spe I处理，处理时间为2-12h、环境温度为37℃；纯化回收，将酶切纯化后的质粒和SEQID No:1序列按摩尔之比1:0.2-5混合，然后利用T4DNA连接酶进行连接反应，反应温度为14-16℃，反应时间为4-12小时；接着将连接产物转入大肠杆菌DH 5α感受态中，获得重组质粒pBBR-Paldh；
Ⅲ.以巴氏醋杆菌基因组为模板，进行PCR反应，得到ATP酶基因序列，所述ATP酶基因序列如序列SEQ ID No:2所示；
其中PCR反应所用到的引物对为：
ATPase-1：5'-AGCACTAGTATGTGGTCTAAACCGATCACA-3'；(下划线部分为Spe I酶切位点)；
ATPase-2：5'-TGCTCTAGATCACGCTCTAGAGAGGCTG-3'；(下划线部分为Xba I酶切位点)；
PCR反应条件为：94-95℃预变性5分钟，94-95℃30秒，50-60℃20秒，72℃1-2分钟，25-30个循环后72℃10分钟；
SEQ ID No:2序列：5'-atgtggtcta aaccgatcac aactgcatca gatgtggcgctttttgtcac gacacggtta ggagaggctt gtacgcttgc ggaatgtgcg gtggagccgt tatcgggcaggattatgaca cagacagaca tgaacggggc atcagccgca acacggctgg ggccattggc agtttaccagcagcgtattg cagcggggga actcaagagt gatccagacc agctgcgtgt aataacgcgg ctgaacaccttgtggcagga actggcaagc atgccagctt tggctgcgcc atcacccgcg caggggatgg aaggcaaggccaaaggcttg ctggccgggc tggcccgcag gttgcgcccg caggcagata catctgccac ccgcccggtgcgcccgcgtg ggctgtatat tgtgggccgt gtagggcgcg gcaaaaccat ggtgatggat ctgttctacgcctgcgcgcc cgtgcagaaa aaggagcgca tccacttttt gcgcttcatg caggatgtgc accgtgatctgcatgatctt aaagccgcca accccaatat ggcagacccc attccgccgc tggccaaaac cattgccagcaaggcgcagc ttttgtgctt tgatgagttt caggtgaacg acattgccga tgccatgatt ctggggcggctgtttgaggc cctgtttgcc aatggggtgg tgattgtggc cacctccaac acagaacctt cgcagttgttccaaaaccgc cccggcgcag atgcgtttaa accgtttatt gccgttatcc agcgtgaact ggatacgattgagctggatt cgccgcgtga ttaccgccgt gggcgtgagc aggaccgtga aacatggctt gtgcctgcggattctcaggc caaaagcagg ctggacagaa tttttgcccg ctatgcaggg gatgaaaagg caggcccggtagacctgaag ttcagtgggc gggtgtttga ggtggatcag gcggcaggcc cggtgtgccg gtttgatttcaactctttgt gtggcaagcc gcgtgggccg aacgattatc tggcgctggc caaacgcttt ccggtggtgattgtcgataa cattccaagc atggggcagg atgatgccaa ccttgcccgg cgcttcatca cgctcatagatgccttgtac gacaacggaa atctgctgtt tgcctcggct gatgcgcagc ccgaccagct gtttacagatggggatggtg cagatgcgtt tgcacgcacg gcatcacgtc tcgctgagat gggaagtgaa agctggctggagcatggggc gcaggctgcg caacaggccc acagcctctc tagagcgtga-3'；
Ⅳ.将步骤Ⅱ得到的重组质粒pBBR-Paldh、步骤Ⅲ得到的ATP酶基因序列分别用限制性内切酶Spe I和Xba I处理，处理时间为2-12h、环境温度为37℃；纯化回收，将酶切纯化后的质粒和ATP酶基因序列按摩尔比1:0.2-5混合，然后利用T4DNA连接酶进行连接反应，反应温度为14-16℃，反应时间为4-12小时；然后将连接产物转入大肠杆菌DH 5α感受态中，获得重组质粒pBBR-Paldh-ATPase。
本发明中，优选的方案为所述b步骤中采用电激转化法将a步骤得到的重组质粒转入醋酸菌中。
具体的，可以采用如下电激转化方法：
①挑取一株醋酸菌接种于YPG培养基(酵母膏3-10g/L蛋白胨5-20g/L葡萄糖5-30g/L)中，30℃、220转/分钟预培养12-24小时，至OD550≥0.6，制备种子液；取1mL预培养的种子液接入装有50-100mL YPG培养基的三角瓶中，30℃、220转/分钟培养10-24小时，至OD600到0.5-0.6；
②将装有菌液的三角瓶置于冰浴上冷却15-30分钟，4℃下5000转/分钟离心3-10分钟，弃上清；
③加80mL预冷至0℃的10％甘油(质量比)溶液重悬菌体，使菌体充分扩散后于4℃条件下5000转/分钟离心3-10分钟，弃上清；
④重复步骤③两次后，加3-5mL预冷的10％甘油溶液，摇匀，置于冰浴中，分装至小离心管中，每管100μL，加入构建好的重组质粒5-10μL，将该混合液加入到预冷的电脉冲杯内冰浴1-5分钟；
⑤打开电脉冲仪，1.0-2.5kV电压电激后，迅速加入1mL预冷的无菌YPG培养基，混匀后转入试管中，30℃缓慢振荡培养2-6小时后，涂布到加有适当氨苄青霉素的选择平板上，30℃倒置24-60小时，获得含有重组质pBBR-Paldh-ATPase的基因工程醋酸菌。
本发明中，优选的方案为所述b步骤中的醋酸菌选自葡糖杆菌、醋杆菌和葡糖酸醋杆菌。进一步优选的是，醋酸菌选自醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)、氧化葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter oxydans)和巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)，更优选的醋酸菌为巴氏醋杆菌CGMCC 3089或巴氏醋杆菌NBRC3283。
本发明涉及的引物的制备、PCR反应、核苷酸片段的纯化、回收、酶切、连接、DNA导入、核苷酸序列人工合成等操作是本领域技术人员所熟知的，可以依据例如《分子克隆》(科学出版社，第二版，2002年)中记载的方法。
本发明还提供由上述构建方法得到的过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌。
本发明还提供该过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌在醋酸发酵中应用，所述醋酸发酵以乙醇或含有乙醇的酒醪为原料。
本发明中，所述的过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌在醋酸发酵中应用，具体包括如下步骤：将过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌在培养基中进行扩繁培养，然后将扩繁培养后的过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌和原料一起置于发酵罐中，进行发酵；具体的，所述醋酸发酵的方式可以为分批发酵、补料分批发酵或分割发酵。
醋酸发酵的工艺可以采用如下步骤：
(1)培养基的制备：培养基中必须具备微生物生长所需的营养成分，如葡萄糖或乙醇等碳源，尿素、铵盐、酵母浸膏或酵母粉等氮源以及磷酸盐(磷源)和硫酸盐(硫源)等；另外还需要钠、钾、镁、钙、锌、铁、锰、铜、钴、硼和钼等金属离子，每种金属离子的含量大约在0.001mg/L-500mg/L；培养基中乙醇浓度为30-200g/L。
(2)种子培养：利用250-1000mL的摇瓶，装有如上所述培养基30-100mL，接入含有重组质粒pBBR-Paldh-ATPase的基因工程醋酸菌进行摇瓶培养，摇床转速为100-300转/分钟，温度为27-30℃，培养时间为20-30小时，制备种子液。
(3)醋酸发酵：醋酸发酵可在发酵罐中进行，发酵罐接种量为5％-20％(体积比)，温度为27-35℃。发酵过程中向发酵罐中通入空气，每分钟通气量为1：0.05-0.25v/v(液体与气体的体积比)。发酵方式可以是分批发酵、补料分批发酵或分割发酵。
分批发酵结束醋酸浓度可达到30-150g/L，发酵时间24-160小时。
补料分批发酵过程中连续补加乙醇，控制发酵液中乙醇浓度为10-40g/L，发酵结束醋酸浓度可达到80-200g/L，发酵时间60-150小时。
分割发酵每次取出发酵液20％-50％(体积比)，补充同体积的新鲜培养基，每批发酵结束醋酸浓度可达到30-150g/L，发酵时间24-100小时。
本发明的基因工程醋酸菌可应用于发酵生产醋酸，以乙醇或含有乙醇的酒醪为原料。
本发明的基因工程醋酸菌可应用于发酵生产苹果醋，以苹果酒为原料。
实施例1
一种过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌，其构建方法包括如下步骤：
a.将乙醛脱氢酶启动子、ATP酶基因以及可在醋酸菌中稳定复制的质粒依次连接，得到重组质粒；
b.将经过a步骤得到的重组质粒转入醋酸菌中，即得。
具体的，所述a步骤具体包括如下步骤：
(1)重组质粒pBBR-Paldh的构建
以Acetobacter pasteurianus CGMCC 3089(购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。)基因组为模板，利用引物paldh-1和paldh-2进行PCR反应，扩增获得乙醛脱氢酶启动子Paldh序列，PCR反应体系如下：
组分体积(μl)
模板DNA 5μl；
10×Buffer 5μl；
dNTP(25mmol/L) 4μl；
Padh-1(20μmol/L) 1μl；
Padh-2(20μmol/L) 1μl；
Pfu DNA聚合酶(5U/μl) 1μl；
dd H2O 33μl；
PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，94℃30秒s，56℃20秒，72℃30秒，26个循环后72℃10分钟。
将乙醛脱氢酶启动子Paldh序列和质粒pBBR1MCS-4(Kovach M E,Elzer P H,Steven Hill D,et al.Four new derivatives of the broad-host-range cloningvector pBBR1MCS,carrying different antibiotic-resistance cassettes.Gene,1995,166(1):175-176)分别用限制性内切酶BamHⅠ和SpeⅠ处理(37℃，4小时)，利用PCR产物纯化试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)分别回收目的片段，将酶切后的质粒和乙醛脱氢酶启动子Paldh序列按1:3(物质的量之比)的比例进行连接反应(16℃，12小时)；连接产物转入大肠杆菌DH 5α，经筛选获得重组质粒pBBR-Paldh。
(2)重组质粒pBBR-Paldh-ATPase的构建
以Acetobacter pasteurianus CGMCC 3089基因组为模板，利用引物ATPase-1和ATPase-2进行PCR，扩增获得ATP酶序列，PCR反应体系如下：
组分体积(μl)
模板DNA 5μl；
10×Buffer 5μl；
dNTP(25mmol/L) 4μl；
pqq-1(20μmol/L) 1μl；
pqq-2(20μmol/L) 1μl；
Pfu DNA聚合酶(5U/μl) 1μl；
dd H2O 33μl；
PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，94℃30秒s，54℃20秒，72℃3分钟，26个循环后72℃10分钟。
将获得ATP酶序列和质粒pBBR-Paldh分别用限制性内切酶SpeⅠ和XbaⅠ处理(37℃，4小时)，利用PCR产物纯化试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)分别回收目的片段，将酶切后的质粒和ATPase序列按1:3(物质的量之比)的比例进行连接反应(16℃，12小时)；连接产物转入大肠杆菌DH5α，经筛选获得重组质粒pBBR-Paldh-ATPase。
(3)重组表达ATP酶的巴氏醋杆菌基因工程菌的获得
①Acetobacter pasteurianus CGMCC 3089感受态细胞的制备：
挑取Acetobacter pasteurianus CGMCC 3089接种于YPG培养基中，30℃、220转/分钟预培养12小时，至OD550约0.6，取1mL预培养的菌液接入装有100mL YPG培养基的250mL三角瓶中，30℃、220转/分钟培养8h，至OD600约0.6；将装有菌液的三角瓶置于冰浴上冷却20分钟，4℃下5000转/分钟离心5分钟，弃上清；加80mL预冷至0℃的10％甘油(质量比)溶液重悬菌体，使菌体充分扩散后于4℃下5000转/分钟离心8分钟，弃上清；加3mL预冷的10％甘油溶液摇匀，置于冰浴中，获得Acetobacter pasteurianus CGMCC 3089感受态细胞。
②质粒pBBR-Paldh-ATPase的电激转化
取100μL Acetobacter pasteurianus CGMCC 3089感受态细胞于小离心管中，加入10μL构建好的重组质粒pBBR-Paldh-ATPase，混合均匀后加入到预冷的电脉冲杯内冰浴3分钟；打开电脉冲仪，按设定的转化程序进行电激(2.0kV)；向电脉冲杯内迅速加入1mL预冷的无菌YPG培养基，混匀后，转入试管中，30℃缓慢振荡培养2小时后，涂布到加有适当抗生素的选择平板上，30℃倒置培养48小时，获得含有重组质粒pBBR-Paldh-ATPase的Acetobacter pasteurianus CGMCC 3089基因工程菌。
(4)然后利用含有重组质粒pBBR-Paldh-ATPase的Acetobacter pasteurian usCGMCC 3089基因工程菌和原始菌株醋酸发酵比较：
a.制备种子液：分别从斜面取含有重组质粒pBBR-Paldh-ATPase的Acetobacterpasteurianus CGMCC 3089基因工程菌和Acetobacter pasteurianus CGMCC 3089原始菌接种于种子培养基中，在30℃，160转/分钟条件下摇床培养24小时。按10％(v/v)的接种量转接入新鲜的种子培养基中进行放大培养。种子培养基组成:葡萄糖20g/L，酵母膏15g/L，乙醇3.5％(v/v)，其余为水。
b.醋酸发酵：按10％的接种量，将种子液接种至含有发酵培养基的发酵罐中，在30℃条件下进行醋酸发酵；发酵培养基分为两组；第一组发酵培养基组成：葡萄糖20g/L，酵母膏15g/L，乙醇8％(v/v)，醋酸10g/L，MgSO42g/L，CaCl23g/L，其余为水；第二组培养基为含有8％(v/v)乙醇的苹果酒。然后在30℃，通风量1∶0.15(v/v)/min条件下发酵生产醋酸，并每5h测试一次醋酸浓度，具体结果参见图1-图2。
实施例2
利用含有重组质粒pBBR-Paldh-ATPase的Acetobacter acetiCGMCC1.1809基因工程菌发酵生产醋酸
(1)质粒转化
①Acetobacter acetiCGMCC1.1809感受态细胞的制备：
挑取Acetobacter acetiCGMCC1.1809接种于YPG培养基中，30℃、220转/分钟预培养12小时，至OD550约0.6，取1mL预培养的菌液接入装有100mL YPG培养基的250mL三角瓶中，30℃、220转/分钟培养8h，至OD600约0.6；将装有菌液的三角瓶置于冰浴上冷却20分钟，4℃下5000转/分钟离心5分钟，弃上清；加80mL预冷至0℃的10％甘油(质量比)溶液重悬菌体，使菌体充分扩散后于4℃下5000转/分钟离心8分钟，弃上清；加3mL预冷的10％甘油溶液摇匀，置于冰浴中，获得Acetobacter acetiCGMCC1.1809感受态细胞。
②质粒pBBR-Paldh-ATPase的电激转化
取100μL Acetobacter acetiCGMCC1.1809感受态细胞于小离心管中，加入10μL构建好的重组质粒pBBR-Paldh-ATPase，混合均匀后加入到预冷的电脉冲杯内冰浴3分钟；打开电脉冲仪，按设定的转化程序进行电激(2.0kV)；向电脉冲杯内迅速加入1mL预冷的无菌YPG培养基，混匀后，转入试管中，30℃缓慢振荡培养2小时后，涂布到加有适当抗生素的选择平板上，30℃倒置培养48小时，获得含有重组质粒pBBR-Paldh-ATPase的AcetobacteracetiCGMCC1.1809基因工程菌。
(2)制备种子液
分别从斜面取含有重组质粒pBBR-Paldh-ATPase的AcetobacteracetiCGMCC1.1809基因工程菌和Acetobacter acetiCGMCC1.1809原始菌接种于种子培养基中，在30℃，160转/分钟条件下摇床培养24小时。按10％(v/v)的接种量转接入新鲜的种子培养基中进行放大培养。
种子培养基组成:葡萄糖20g/L，酵母膏15g/L，乙醇3.5％(v/v)，其余为水。
(2)醋酸发酵
按10％的接种量，将种子液接种至含有发酵培养基的发酵罐中，在30℃条件下进行醋酸发酵。
发酵培养基组成：葡萄糖20g/L，酵母膏15g/L，乙醇8％(v/v)，醋酸10g/L，MgSO42g/L，CaCl23g/L，其余为水。
利用含有重组质粒pBBR-Paldh-ATPase的Acetobacter acetiCGMCC1.1809基因工程菌在30℃，通风量1∶0.15(v/v)/min条件下发酵生产醋酸，50h发酵结束，醋酸终浓度为85g/L，初始醋酸浓度10g/L，则乙醇转酸率约为94.4％，平均产酸速率约为1.5g/(L·h)。
利用原始Acetobacter aceti CGMCC1.1809在30℃，通风量1∶0.15(v/v)/min条件下发酵生产醋酸，并每5h测试一次醋酸浓度，具体结果参见图3；66h发酵结束，醋酸终浓度为78g/L，初始醋酸浓度10g/L，则乙醇转酸率约为86.7％，平均产酸速率约为1.2g/(L·h)。
实施例3
利用含有重组质粒pBBR-Paldh-ATPase的Gluconobacter oxydansCGMCC1.49基因工程菌发酵生产苹果醋
(1)质粒转化
①Gluconobacter oxydansCGMCC 1.49感受态细胞的制备：
挑取Gluconobacter oxydansCGMCC 1.49接种于YPG培养基中，30℃、220转/分钟预培养12小时，至OD550约0.6，取1mL预培养的菌液接入装有100mL YPG培养基的250mL三角瓶中，30℃、220转/分钟培养8h，至OD600约0.6；将装有菌液的三角瓶置于冰浴上冷却20分钟，4℃下5000转/分钟离心5分钟，弃上清；加80mL预冷至0℃的10％甘油(质量比)溶液重悬菌体，使菌体充分扩散后于4℃下5000转/分钟离心8分钟，弃上清；加3mL预冷的10％甘油溶液摇匀，置于冰浴中，获得Gluconobacter oxydansCGMCC 1.49感受态细胞。
②质粒pBBR-Paldh-ATPase的电激转化
取100μL Gluconobacter oxydansCGMCC 1.49感受态细胞于小离心管中，加入10μL构建好的重组质粒pBBR-Paldh-ATPase，混合均匀后加入到预冷的电脉冲杯内冰浴3分钟；打开电脉冲仪，按设定的转化程序进行电激(2.0kV)；向电脉冲杯内迅速加入1mL预冷的无菌YPG培养基，混匀后，转入试管中，30℃缓慢振荡培养2小时后，涂布到加有适当抗生素的选择平板上，30℃倒置培养48小时，获得含有重组质粒pBBR-Paldh-ATPase的Gluconobacter oxydansCGMCC 1.49基因工程菌。
(2)制备种子液
从斜面取含有重组质粒pBBR-Paldh-ATPase的Gluconobacter oxydansCGMCC1.49基因工程菌于种子培养基中，在30℃，160转/分钟条件下摇床培养25小时。按10％(v/v)的接种量转接入新鲜的种子培养基中进行放大培养。
种子培养基组成:葡萄糖20g/L，酵母膏15g/L，乙醇3.5％(v/v)，其余为水。
(3)苹果醋发酵
按10％(v/v)的接种量，接种至含有苹果酒的发酵罐中，在30℃条件下进行苹果醋发酵。苹果酒中乙醇含量为8％(v/v)。
利用含有重组质粒pBBR-Paldh-ATPase的Gluconobacter oxydansCGMCC1.49基因工程菌在30℃，通风量1∶0.1(v/v)/min条件下发酵生产苹果醋，大约50h发酵结束，醋酸终浓度为73g/L，则乙醇转酸率约为91.3％，平均产酸速率约为1.46g/(L·h)。
利用普通Gluconobacter oxydansCGMCC 1.49在30℃，通风量1∶0.1(v/v)/min条件下发酵生产苹果醋，并每5h测试一次醋酸浓度，具体结果参见图4；大约68h发酵结束，醋酸终浓度为70g/L，则乙醇转酸率约为87.5％，平均产酸速率约为1.23g/(L·h)。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Figure IDA0000882124560000011
Figure IDA0000882124560000021
Figure IDA0000882124560000031
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Claims (4)

1.一种过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌在醋酸发酵中应用，所述醋酸发酵以乙醇或含有乙醇的酒醪为原料，其特征在于，该过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌由以下步骤构建而得：
a．将乙醛脱氢酶启动子、ATP酶基因以及可在醋酸菌中稳定复制的质粒依次连接，得到重组质粒；所述乙醛脱氢酶启动子来源于巴氏醋杆菌；可在醋酸菌中稳定复制的质粒为pBBRR1MCS-4质粒；重组质粒为pBBR-paldh-ATPase质粒；所述乙醛脱氢酶启动子序列如序列SEQ ID No:1所示；b．将经过a步骤得到的重组质粒转入醋酸菌中，即得。
2.根据权利要求1所述的过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌在醋酸发酵中应用，其特征在于，所述a步骤具体包括如下步骤：
Ι.以巴氏醋杆菌基因组为模板，进行PCR反应，得到乙醛脱氢酶启动子序列，所述乙醛脱氢酶启动子序列如序列SEQ ID No:1所示；
其中PCR反应所用到的引物对为：
paldh-1：5'- CGCGGATCC CGGAATCCTGAAAACGGG-3'；
paldh-2：5'-AGCACTAGT CATGACCAATACCTTTGTATGT -3'；
PCR反应的条件为：94-95 ℃预变性5 分钟，94-95 ℃ 30秒s，50-60 ℃ 20秒，72 ℃20-40秒，25-30个循环后72℃ 10 分钟；
Ⅱ.将质粒pBBR1MCS-4和步骤Ι得到的SEQ ID No:1序列分别用限制性内切酶BamH I和Spe I处理，处理时间为2-12h、环境温度为37 ℃；纯化回收，将酶切纯化后的质粒和SEQ IDNo:1序列按摩尔比1:0.2-5混合，然后利用T4 DNA连接酶进行连接反应，反应温度为14-16℃，反应时间为4-12小时；接着将连接产物转入大肠杆菌DH 5α感受态中，获得重组质粒pBBR-Paldh；
Ⅲ.以巴氏醋杆菌基因组为模板，进行PCR反应，得到ATP酶基因序列，所述ATP酶基因序列如序列SEQ ID No:2所示；
其中PCR反应所用到的引物对为：
ATPase-1：5'- AGCACTAGTATGTGGTCTAAACCGATCACA-3' ；
ATPase-2：5'- TGCTCTAGATCACGCTCTAGAGAGGCTG-3'；
PCR反应条件为：94-95℃预变性5分钟，94-95℃ 30秒，50-60℃ 20秒，72℃ 1-2分钟，25-30个循环后72℃ 10 分钟；
Ⅳ.将步骤Ⅱ得到的重组质粒pBBR-Paldh、步骤Ⅲ得到的ATP酶基因序列分别用限制性内切酶Spe I和Xba I处理，处理时间为2-12h、环境温度为37 ℃；纯化回收，将酶切纯化后的质粒和ATP酶基因序列按摩尔比1:0.2-5混合，然后利用T4 DNA连接酶进行连接反应，反应温度为14-16 ℃，反应时间为4-12小时；然后将连接产物转入大肠杆菌DH 5α感受态中，获得重组质粒pBBR-Paldh-ATPase。
3.根据权利要求1所述的过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌在醋酸发酵中应用，其特征在于，所述b步骤中采用电激转化法将a步骤得到的重组质粒转入醋酸菌中。
4.根据权利要求1所述的过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌在醋酸发酵中应用，具体包括如下步骤：将过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌在培养基中进行扩繁培养，然后将扩繁培养后的过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌和原料一起置于发酵罐中，进行发酵。
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