CN102649970B - 利用大肠埃希氏菌ba305发酵生产丁二酸的方法 - Google Patents

利用大肠埃希氏菌ba305发酵生产丁二酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，涉及利用大肠埃希氏菌BA305发酵生产丁二酸的方法。通过提高大肠埃希氏菌BA305对ATP的供给，在两阶段发酵过程中提高丁二酸生产效率，并在循环利用细胞产丁二酸的过程中，保持生产性能，延长丁二酸生产能力。

Description

利用大肠埃希氏菌BA305发酵生产丁二酸的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及利用大肠埃希氏菌BA305发酵生产丁二酸的方法，具体的，是利用高效循环利用细胞产丁二酸基因工程菌发酵生产丁二酸的方法，通过提高ATP供给，在两阶段发酵过程中提高丁二酸生产效率，并在循环利用细胞产丁二酸的过程中，保持生产性能，延长丁二酸生产能力。
背景技术
丁二酸（succinic acid）又称琥珀酸，被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料等行业，作为C4平台化合物，可用于合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯 (PBS) 类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一。
丁二酸的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法，利用微生物发酵法转化可再生资源，由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可以吸收固定CO2，能有效缓解温室效应，开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，今年来成为研究的热点。丁二酸的生产菌株主要集中在Anaerobiospirillum succiniciproducens、Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens、重组谷氨酸棒杆菌和重组大肠杆菌。其中利用野生菌株生产丁二酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，阻碍了其工业化进程。而重组大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛用于研究以获得产丁二酸优秀菌株。
在大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PPC) 生成草酰乙酸，在此过程中没有ATP的生成，但是在Bacillus subtilis中，磷酸烯醇式丙酮酸是通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶 (PCK) 生成草酰乙酸的，在此过程中有ATP的生成，并且Millard等在大肠杆菌中过量表达E. coli ppc和pck，研究发现过量表达ppc可以使琥珀酸作为混合酸发酵的主要产物，且产量较出发菌株提高3.5倍，而过量表达pck对发酵结果没有影响，但在ppc缺陷菌株中，pck的过量表达能够提高琥珀酸的产量，这是由于PPC的Km 比PCK小100倍，因此只有在ppc缺陷菌株中，pck的过量表达才能够提高琥珀酸的产量。
玉米芯是农业生产中比较常见的废弃物，由于其成分含有大量纤维素，因此其水解液对微生物发酵来说，是一种很好的可持续利用的绿色碳源，但其稀酸水解液含有高浓度木糖，因此现有技术中大多数产丁二酸大肠杆菌不能利用玉米芯水解液发酵生产丁二酸。姜岷等将玉米芯按料液比1:5 (质量体积比)配制玉米芯料液，物料粒径250～380μm，H2SO4用量3% (体积分数)，水解温度126℃，反应时间215 h，利用活性炭吸附及Ca(OH)2中和等方式，对玉米芯多组分糖液进行脱毒脱盐处理，总糖质量浓度为50 g/L，其中木糖占80%以上。
稻草秸秆是重要的一类可再生生物质资源。目前，除了在造纸业工业方面的利用，绝大多数被废弃，严重浪费了资源并且污染了环境。其主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，因此其水解液对微生物发酵来说，是一种很好的可持续利用的绿色碳源，但其水解液含有高浓度木糖，因此现有技术中大多数产丁二酸大肠杆菌不能利用稻草秸秆水解液发酵生产丁二酸，陶文沂等通过稀硫酸121℃处理稻草秸秆1 h，再用20 g/L的NaOH于121℃处理秸秆1h，葡萄糖和木糖二者总质量浓度达50 g/L左右。
甘蔗渣是甘蔗制糖时榨糖之后剩下的主要成分，因此其水解液对微生物发酵来说，是一种很好的可持续利用的绿色碳源，但其水解液含有高浓度木糖，因此现有技术中大多数产丁二酸大肠杆菌不能利用稻草秸秆水解液发酵生产丁二酸，约含有50%的纤维素通过粉碎以及碱/氧化法预处理可得到总糖质量为50 g/L，其中木糖占80%以上。
糖蜜是工业制糖过程中，蔗糖结晶后，剩余的不能结晶，但仍含有较多糖的液体残留物。余炜等将糖蜜与水1:1混匀，用浓硫酸（5 mol/L）将其pH调至2.0,于100℃加热20 min，并用15%的石灰乳中和处理，总糖质量为600 g/L，葡萄糖和果糖各占50%。
利用大肠杆菌生产丁二酸的发酵模式主要包括专一性厌氧发酵及两阶段发酵。专一性厌氧发酵时，菌株生长缓慢，丁二酸终浓度和收率低。Vemuri等人利用大肠杆菌AFP111(PYC)两阶段发酵，其厌氧阶段可完成1.1g/g的丁二酸收率和1.3 g/(L·h)的丁二酸生产强度(Applied Envirmental Microbiology. 2002,68,1715-1727)。但如果考虑有氧阶段消耗的糖及花费的时间，收率和生产强度下降。Andersson等人通过及时回收厌氧发酵细胞并转化新鲜培养基继续厌氧丁二酸生产，解除了产物抑制，延长了丁二酸的生产时间，在相同时间内较两阶段发酵，产物浓度提高了60%；但由于厌氧发酵过程中ATP供给不足，菌体密度、细胞比生产强度都不断下降(Bioprocess and Biosystems Engineering. 2010,33,711-718)。因此，若能提高ATP的供给，将可大幅度提高菌体厌氧发酵能力，保持细胞比生产强度，延长丁二酸发酵时间。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种高效循环利用细胞产丁二酸基因工程菌的构建及其发酵生产丁二酸的方法，具体是一株产丁二酸基因工程菌，通过提高ATP供给，在两阶段发酵过程中提高丁二酸生产效率，并在循环利用细胞产丁二酸的过程中，保持生产性能，延长丁二酸生产能力。
为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案：
一、本发明提供一株产丁二酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BA305，其保藏号登记号为CCTCC NO：M2012102。
本发明所述的大肠埃希氏菌 BA305的构建方法，其特征在于以缺乏乳酸脱氢酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大肠杆菌为出发菌株，利用同源重组技术敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因和磷酸转运系统(PTS)中的ptsG基因，并过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（PCK）后，得到高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖，并且高效利用各种比例混合糖以及纤维素水解液生长并产丁二酸的大肠埃希氏菌 BA305。重组菌株大肠埃希氏菌 BA305的代谢途径如图1所示。
进一步地，所述的具体构建步骤如下：
（1） 以缺乏乳酸脱氢酶基因（ldhA），丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）活性的E.coli NZN111菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）基因和PTS转运系统中的ptsG基因，得到同时缺乏ldhA、pflB、ppc和ptsG的感受态菌株；     （2）纯化扩增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（pck）基因，构建得到过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表达质粒；
（3）将步骤（2）所述的质粒导入步骤（1）得到的感受态菌株，获得阳性转化子；
（4）利用步骤（3）的阳性转化子过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（PCK），恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖，以及各种比例混合糖和纤维素水解液的能力，得到高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖，并且高效利用各种比例混合糖以及纤维素水解液生长并产丁二酸的大肠埃希氏菌 BA305。
本发明以缺乏乳酸脱氢酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大肠杆菌NZN111为出发菌株，利用同源重组技术敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因和PTS转运系统中的ptsG基因，并过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，使其高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖，并且高效利用各种比例混合糖以及纤维素水解液生长并产丁二酸。这种通过分子生物学手段提高菌株ATP生物合成能力，高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖，使菌株能够高效利用各种比例混合糖以及纤维素水解液代谢生长，大量提高丁二酸的产量及生产能力的方法未见公开，而这种应用将大大推进丁二酸产业的进步和发展。
其次，利用本发明所述的菌株大肠埃希氏菌 BA305的发酵结果表明新构建的重组大肠杆菌大肠埃希氏菌 BA305能够高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖，并且高效利用各种比例混合糖以及纤维素水解液发酵，并大量积累丁二酸，相比出发菌株，不能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖，各种比例混合糖和纤维素水解液发酵，没有丁二酸积累的特征，其产酸特征变化巨大。
二、利用本发明所述的大肠埃希氏菌 BA305发酵生产丁二酸的方法，其特征在于循环利用重组大肠杆菌细胞生产丁二酸：
（1）利用重组大肠杆菌采用两阶段发酵生产丁二酸
用LB培养基活化菌体，将大肠埃希氏菌 BA305接种入发酵罐，发酵培养基为LB培养基并添加碳源，通入空气或纯氧进行有氧培养，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6用0.3 mM的IPTG诱导，继续有氧培养15h至OD600=19，停止通入空气或纯氧，通入CO2并添加碳源进行厌氧发酵产酸，同时添加中和剂调控pH值6.4-6.8；
（2）当步骤（1）的培养基中测定无残糖时，两阶段发酵结束；通过无菌离心或无菌膜过滤获得菌体细胞，并将菌体细胞继续加入新鲜LB培养基及碳源，重复厌氧发酵丁二酸的步骤。
进一步地，本发明所述的中和剂应理解为发酵技术中可以使用的各种中和剂，本发明中应包括但不限于碱式碳酸镁、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾。
其中，本发明所述的碳源包括但不限于葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、果糖或者其组合；还包括玉米芯水解液、稻草秸秆水解液、糖蜜水解液或者甘蔗渣水解液。
其中，步骤（2）中测定无残糖的标准为：菌体细胞碳源的消耗速率下降至0.6 g/(L·h)。
本发明的有益效果在于：
首先，本发明所使用的大肠埃希氏菌（Escherichia coli） BA305是以缺乏乳酸脱氢酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大肠杆菌NZN111为出发菌株，利用同源重组技术敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因和PTS转运系统中的ptsG基因，并过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，使菌株提高厌氧发酵过程中ATP的供给能力，并在循环利用细胞产丁二酸的过程中，保持生产性能，延长丁二酸生产能力的方法未见公开，而这种应用将大大推进丁二酸产业的进步和发展。图1 为Escherichia coli BA305的代谢途径。
其次，现有技术的利用菌体细胞连续转化发酵的碳源均只实现在葡萄糖的局限应用中，而本发明由于所述的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BA305提高了厌氧发酵过程中ATP的供给能力，因此其可利用除葡萄糖以外的各种碳源实现连续转化，加大了该菌株的实用范围，缩减了工业发酵丁二酸的成本。
附图说明
图1 Escherichia coli BA305的代谢途径。
本发明的微生物的分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BA305，其保藏日期为2012年4月8日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称为 CCTCC，地址为：中国. 武汉. 武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2012102。
具体实施方式
下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
本发明所用的对照菌株E.coli AFP111和E.coli NZN111的感受态菌株的来源有两处：
（1）Biotechnol Bioeng, 2001, 74: 89～95。申请人首先通过查阅到该生物材料的上述文献出处，并联系了发表人系美国芝加哥大学的David P. Clark教授，并邮件请求其赠与该生物材料，并免费获得了该生物材料；且申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料；
（2）该生物材料还在中国专利（申请号96198547.X，申请日1996.10.31，授权日2003年1月1日，授权公告号CN1097632C）的专利文献中公开并获得授权。
本发明所述的大肠埃希氏菌 BA305的构建方法：
一、利用同源重组技术敲除出发菌株NZN111中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因，得到消除安普霉素抗性菌株的过程。
1、利用LB培养基，于37℃、有氧条件下培养大肠杆菌NZN111至OD600=0.4～0.6，制备成电转感受态。
2、将质粒pKD46电转入感受态的大肠杆菌NZN111。电击条件为：200 Ω，25 μF，电击电压2.3 kV，电击时间4～5 ms。电击后迅速将菌体加入预冷1 mL的SOC培养基，150 r/min、30℃培养1 h之后涂布于带氨苄青霉素(amp)的LB培养基平板筛选出阳性转化子大肠杆菌NZN111 (pKD46)。
3、在LB培养基中加入10 mM的L-阿拉伯糖，于30℃下诱导质粒pKD46表达出λ重组酶，制成电转感受态。
4、以两侧带有FRT位点的安普霉素抗性基因为模板，利用高保真PCR扩增系统，以质粒pIJ773为模板，并设计两端带有PPC同源片段的扩增引物，扩增出线性DNA同源片段，引物序列如下：
上游带同源臂引物H1-P1，下划线为同源片段：
5’-ATGAACGAACAATATTCCGCATTGCGTAGTAATGTCAGTATGCTCGGCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’。
下游带同源臂引物H2-P2，下划线为同源片段：
5’-AGCACGAGGGTTTGCAGAAGAGGAAGATTAGCCGGTATTACGCATACCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’。
反应体系：带同源臂的上下游引物(100 pmol/μL)各0.5 μL；模板DNA(100 ng/μL) 0.5 μL；10×buffer 5 μL；dNTPs (10 mM)各1 μL；DMSO(100%) 2.5 μL；Pyrobest DNA聚合酶(2.5 U/μL)1 μL；ddH2O 36/35.5 μL；总体积50 μL。
反应条件：94℃，2 min；(94℃ 45 sec；50℃ 45 sec；72℃ 90 sec；10个循环)；(94℃ 45 sec；50℃ 45 sec；72℃ 90 sec；15个循环)；72℃，5 min。
5、电转线性DNA片段至已诱导表达λ重组酶的大肠杆菌NZN111(pKD46)感受态，并涂布于带安普霉素的LB平板筛选出阳性重组子，并进行PCR鉴定。
6、阳性重组子制成感受态后倒入能诱导表达FLP重组酶的质粒pCP20，于42℃热激表达FLP重组酶后即可消除安普霉素抗性。利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的均极为已经敲除抗性的菌株。
二、利用步骤一得到的已敲除ppc基因的菌株，再次利用同源重组技术敲除PTS转运系统中ptsG基因，得到消除安普霉素抗性菌株：
1、利用LB培养基，于37℃、有氧条件下培养已实施案例1得到的已敲除ppc基因的菌株至OD600=0.4～0.6，制备成电转感受态。
2、将质粒pKD46电转入此感受态细胞中。电击条件为：200 Ω，25 μF，电击电压2.3 kV，电击时间4～5 ms。电击后迅速将菌体加入预冷1 mL的SOC培养基，150 r/min、30℃培养1 h之后涂布于带氨苄青霉素(amp)的LB培养基平板筛选出阳性转化子大肠杆菌NZN111/△ppc (pKD46)。
3、在LB培养基中加入10 mM的L-阿拉伯糖，于30℃下诱导质粒pKD46表达出λ重组酶，制成电转感受态。
4、以两侧带有FRT位点的安普霉素抗性基因为模板，利用高保真PCR扩增系统，以质粒pIJ773为模板，并设计两端带有ptsG基因同源片段的扩增引物，扩增出线性DNA同源片段，引物序列如下：
上游带同源臂引物H1-P1，下划线为同源片段：
5’- ATGTTTAAGAATGCATTTGCTAACCTGCAAAAGGTCGGTAAATCGCTG
ATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’。
下游带同源臂引物H2-P2，下划线为同源片段：
5’- TTAGTGGTTACGGATGTACTCATCCATCTCGGTTTTCAGGTTATCGGA
TGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’。
反应体系：带同源臂的上下游引物(100 pmol/μL)各0.5 μL；模板DNA(100 ng/μL) 0.5 μL；10×buffer 5 μL；dNTPs (10 mM)各1 μL；DMSO(100%) 2.5 μL；Pyrobest DNA聚合酶(2.5 U/μL)1 μL；ddH2O 36/35.5 μL；总体积50 μL。
反应条件：94℃，2 min；(94℃ 45 sec；50℃ 45 sec；72℃ 90 sec；10个循环)；(94℃ 45 sec；50℃ 45 sec；72℃ 90 sec；15个循环)；72℃，5 min。
5、电转线性DNA片段至已诱导表达λ重组酶的大肠杆菌NZN111/△ppc (pKD46)感受态，并涂布于带安普霉素的LB平板筛选出阳性重组子，并进行PCR鉴定。
6、阳性重组子制成感受态后倒入能诱导表达FLP重组酶的质粒pCP20，于42℃热激表达FLP重组酶后即可消除安普霉素抗性。利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的均极为已经敲除抗性的菌株。
三、构建过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表达质粒，能够高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖，并且高效利用各种比例混合糖以及纤维素水解液发酵，并大量积累丁二酸，得到菌株大肠埃希氏菌 BA305的方法：
1、  构建过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表达质粒，其过程包括：
（1）    合成带有SacI和XbaI酶切位点的引物，
 上游引物：5’- CGAGCTCATGAACTCAGTTGATTTGACCG -3’；
下游引物：5’- GCTCTAGAGCATTCCGTCAATTAAAACAAG -3’。
（2）        以Bacillus subtilis基因组为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：94℃，5 min；(94℃ 45 s，53℃ 45 s，72℃ 100 s，35个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的pck基因后，表达质粒用pTrc99a分别用SacI和XbaI双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pck。质粒pTrc99a-pck的双酶切电泳鉴定如图6所示。
将质粒pTrc99a-pck导入实施案例2中同时缺乏ldhA、pflB、ppc和ptsG的感受态菌株，获得的阳性转化子即为本发明的新构建菌株Escherichia coli BA305。
实施例1
本实施例说明大肠埃希氏菌 BA305与出发菌株NZN111以及对照菌株AFP111，循环利用葡萄糖发酵生产丁二酸情况对比。
首先用LB培养基活化菌体，将大肠埃希氏菌 BA305按1%(v/v)接种量接种入7.5L发酵罐装液量为3L的LB培养基并添加15 g/L葡萄糖，以0.5 L/min的速度通入空气或纯氧，当有氧培养菌体OD600至0.4用0.3 mM的IPTG诱导，有氧培养15h至OD600=19，停止通入空气或纯氧，以0.5 L/min的速度通入CO2进行厌氧发酵产酸，添加葡萄糖最高浓度不超过30 g/L，同时添加中和剂碱式碳酸镁调控pH值6.4。当细胞葡萄糖的消耗速率下降至0.6 g/(L·h)，检测培养基中葡萄糖含量，通过无菌膜过滤获得菌体细胞，在新鲜LB培养基中添加葡萄糖浓度不超过30 g/L，厌氧生物转化合成丁二酸。出发菌株NZN111以及对照菌株AFP111采用相同的培养以及发酵方式。
发酵结果见表1、表2和表3。
表1 Escherichia coli BA305循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 30 29.2 ND ND ND ND ND
2 30 30 29.1 ND ND ND ND ND
3 30 30 29 ND 0.3 ND 0.5 ND
4 30 30 28.9 ND 0.5 ND 0.3 ND
注:ND表示未检测到。
表2 Escherichia coli NZN111循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 30 20.2 ND 5.4 ND 3.7 ND
2 30 25 17.6 ND 3.6 ND 2.1 ND
3 30 20 13.5 ND 2.1 ND 1.2 ND
4 30 12 8.2 ND 1.1 ND 0.5 ND
注:ND表示未检测到。
表3 Escherichia coli AFP111循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 30 27.2 ND ND ND 1.2 ND
2 30 25 23.1 ND ND ND ND ND
3 30 20 17 ND 0.2 ND 1.5 ND
4 30 12 10.2 ND 0.5 ND 0.9 ND
注:ND表示未检测到。
实施例2
本实施例说明大肠埃希氏菌 BA305与出发菌株NZN111以及对照菌株AFP111，循环利用木糖发酵生产丁二酸情况对比。
首先用LB培养基活化菌体，将大肠埃希氏菌 BA305按1%(v/v)接种量接种入7.5L发酵罐装液量为3L的LB培养基并添加15 g/L木糖，以0.5 L/min的速度通入空气或纯氧，当有氧培养菌体OD600至0.6用0.3 mM的IPTG诱导, 有氧培养15h至OD600=19，停止通入空气或纯氧，以0.5 L/min的速度通入CO2进行厌氧发酵产酸，添加木糖最高浓度不超过30 g/L，同时添加碳酸钠调控pH值6.8。当细胞木糖的消耗速率下降至0.6 g/(L·h)，检测培养基中木糖含量，通过无菌离心获得菌体细胞，在新鲜LB培养基中添加木糖浓度不超过30 g/L，厌氧生物转化合成丁二酸。出发菌株NZN111以及对照菌株AFP111采用相同的培养以及发酵方式。
发酵结果见表4、表5和表6。
表4 Escherichia coli BA305循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 30 29.2 ND ND ND ND ND
2 30 30 29.1 ND ND ND ND ND
3 30 30 29 ND 0.3 ND 0.5 ND
4 30 30 28.9 ND 0.5 ND 0.3 ND
注:ND表示未检测到。
表5 Escherichia coli NZN111循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 1 0.5 ND ND ND 0.3 ND
2 30 0 0 ND ND ND ND ND
3 30 0 0 ND ND ND ND ND
4 30 0 0 ND ND ND ND ND
注:ND表示未检测到。
表6 Escherichia coli AFP111循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 1 0.5 ND ND ND 0.3 ND
2 30 0 0 ND ND ND ND ND
3 30 0 0 ND ND ND ND ND
4 30 0 0 ND ND ND ND ND
注:ND表示未检测到。
实施例3
本实施例说明大肠埃希氏菌 BA305与出发菌株NZN111以及对照菌株AFP111，循环利用果糖发酵生产丁二酸情况对比。
首先用LB培养基活化菌体，将大肠埃希氏菌 BA305按1%(v/v)接种量接种入7.5L发酵罐装液量为3L的LB培养基并添加15 g/L果糖，以0.5 L/min的速度通入空气或纯氧，当有氧培养菌体OD600至0.5用0.3 mM的IPTG诱导, 有氧培养15h至OD600=19，停止通入空气或纯氧，以0.5 L/min的速度通入CO2进行厌氧发酵产酸，添加果糖最高浓度不超过30 g/L，同时添加碳酸氢钠调控pH值6.6。当细胞果糖的消耗速率下降至0.6 g/(L·h)，检测培养基中果糖含量，通过无菌离心获得菌体细胞，在新鲜LB培养基中添加果糖浓度不超过30 g/L，厌氧生物转化合成丁二酸。出发菌株NZN111以及对照菌株AFP111采用相同的培养以及发酵方式。
发酵结果见表7、表8和表9。
表7 Escherichia coli BA305循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 30 29.2 ND ND ND ND ND
2 30 30 29.1 ND ND ND ND ND
3 30 30 29 ND 0.3 ND 0.5 ND
4 30 30 28.9 ND 0.5 ND 0.3 ND
注:ND表示未检测到。
表8 Escherichia coli NZN111循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 30 20.2 ND 5.4 ND 3.7 ND
2 30 25 17.2 ND 3.4 ND 2.1 ND
3 30 20 13.3 ND 2.1 ND 1.2 ND
4 30 12 8.2 ND 1.1 ND 0.5 ND
注:ND表示未检测到。
表9 Escherichia coli AFP111循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 30 27.2 ND ND ND 1.2 ND
2 30 25 23.3 ND ND ND ND ND
3 30 20 17 ND 0.1 ND 1.5 ND
4 30 12 10.2 ND 0.6 ND 0.9 ND
注:ND表示未检测到。
实施例4
本实施例说明大肠埃希氏菌 BA305与出发菌株NZN111以及对照菌株AFP111，循环利用阿拉伯糖发酵生产丁二酸情况对比。
首先用LB培养基活化菌体，将大肠埃希氏菌 BA305按1%(v/v)接种量接种入7.5L发酵罐装液量为3L的LB培养基并添加15 g/L阿拉伯糖，以0.5 L/min的速度通入空气或纯氧，当有氧培养菌体OD600至0.5用0.3 mM的IPTG诱导, 有氧培养15h至OD600=19，停止通入空气或纯氧，以0.5 L/min的速度通入CO2进行厌氧发酵产酸，添加阿拉伯糖最高浓度不超过30 g/L，同时添加碳酸钾调控pH值6.5。当细胞阿拉伯糖的消耗速率下降至0.6 g/(L·h)，检测培养基中阿拉伯糖含量，通过无菌膜过滤获得菌体细胞，在新鲜LB培养基中添加阿拉伯糖浓度不超过30 g/L，厌氧生物转化合成丁二酸。出发菌株NZN111以及对照菌株AFP111采用相同的培养以及发酵方式。
发酵结果见表10、表11和表12。
表10 Escherichia coli BA305循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 30 29.2 ND ND ND ND ND
2 30 30 29.1 ND ND ND ND ND
3 30 30 29 ND 0.3 ND 0.5 ND
4 30 30 28.9 ND 0.5 ND 0.3 ND
注:ND表示未检测到。
表11 Escherichia coli NZN111循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 30 20.2 ND 5.4 ND 3.7 ND
2 30 25 17.6 ND 3.6 ND 2.1 ND
3 30 20 13.5 ND 2.1 ND 1.2 ND
4 30 12 8.2 ND 1.1 ND 0.5 ND
注:ND表示未检测到。
表12 Escherichia coli AFP111循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 30 27.2 ND ND ND 1.2 ND
2 30 25 23.1 ND ND ND ND ND
3 30 20 17 ND 0.2 ND 1.5 ND
4 30 12 10.2 ND 0.5 ND 0.9 ND
注:ND表示未检测到。
实施例5
本实施例说明大肠埃希氏菌 BA305与出发菌株NZN111以及对照菌株AFP111，循环利用玉米芯水解液发酵生产丁二酸情况对比。
首先用LB培养基活化菌体，将大肠埃希氏菌 BA305按1%(v/v)接种量接种入7.5L发酵罐装液量为3L的LB培养基并添加总糖含量为15 g/L的玉米芯水解液，以0.5 L/min的速度通入空气或纯氧，当有氧培养菌体OD600至0.5用0.3 mM的IPTG诱导, 有氧培养15h至OD600=19，停止通入空气或纯氧，以0.5 L/min的速度通入CO2进行厌氧发酵产酸，添加玉米芯水解液使得总糖含量最高浓度不超过30 g/L，同时添加碳酸氢钾调控pH值6.7。当细胞玉米芯水解液的消耗速率下降至0.6 g/(L·h)，检测培养基中玉米芯水解液含量，通过无菌离心获得菌体细胞，在新鲜LB培养基中添加玉米芯水解液使得总糖浓度不超过30 g/L，厌氧生物转化合成丁二酸。出发菌株NZN111以及对照菌株AFP111采用相同的培养以及发酵方式。
发酵结果见表13、表14和表15。
表13 Escherichia coli BA305循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 30 29.2 ND ND ND ND ND
2 30 30 29.1 ND ND ND ND ND
3 30 30 29 ND 0.3 ND 0.5 ND
4 30 30 28.9 ND 0.5 ND 0.3 ND
注:ND表示未检测到。
表14 Escherichia coli NZN111循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 6 3.2 ND 2.4 ND 0.7 ND
2 30 4 1.6 ND 1.6 ND 0.1 ND
3 30 3 1.5 ND 1.1 ND 0.2 ND
4 30 1 0.2 ND 0.1 ND 0.5 ND
注:ND表示未检测到。
表15 Escherichia coli AFP111循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 6 5.2 ND ND ND 0.7 ND
2 30 4 3.6 ND ND ND 0.1 ND
3 30 3 2.5 ND ND ND 0.2 ND
4 30 1 0.2 ND ND ND 0.5 ND
注:ND表示未检测到。
实施例6
本实施例说明大肠埃希氏菌 BA305与出发菌株NZN111以及对照菌株AFP111，循环利用稻草秸秆水解液发酵生产丁二酸情况对比。
首先用LB培养基活化菌体，将大肠埃希氏菌 BA305按1%(v/v)接种量接种入7.5L发酵罐装液量为3L的LB培养基并添加总糖含量为15 g/L稻草秸秆水解液，以0.5 L/min的速度通入空气或纯氧，当有氧培养菌体OD600至0.4用0.3 mM的IPTG诱导, 有氧培养15h至OD600=19，停止通入空气或纯氧，以0.5 L/min的速度通入CO2进行厌氧发酵产酸，添加稻草秸秆水解液使得总糖含量最高浓度不超过30 g/L，同时添加碱式碳酸镁调控pH值6.8。当细胞稻草秸秆水解液的消耗速率下降至0.6 g/(L·h)，检测培养基中稻草秸秆水解液含量，通过无菌膜过滤获得菌体细胞，在新鲜LB培养基中添加稻草秸秆水解液使得总糖浓度不超过30 g/L，厌氧生物转化合成丁二酸。出发菌株NZN111以及对照菌株AFP111采用相同的培养以及发酵方式。
发酵结果见表16、表17和表18。
表16 Escherichia coli BA305循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 30 29.2 ND ND ND ND ND
2 30 30 29.1 ND ND ND ND ND
3 30 30 29 ND 0.3 ND 0.5 ND
4 30 30 28.9 ND 0.5 ND 0.3 ND
注:ND表示未检测到。
表17 Escherichia coli NZN111循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 6 3.3 ND 2.4 ND 0.7 ND
2 30 4 1.6 ND 1.6 ND 0.1 ND
3 30 3 1.4 ND 1.1 ND 0.2 ND
4 30 1 0.2 ND 0.1 ND 0.5 ND
注:ND表示未检测到。
表18 Escherichia coli AFP111循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 6 5.1 ND ND ND 0.7 ND
2 30 4 3.6 ND ND ND 0.1 ND
3 30 3 2.1 ND ND ND 0.2 ND
4 30 1 0.2 ND ND ND 0.5 ND
注:ND表示未检测到。
实施例7
本实施例说明大肠埃希氏菌 BA305与出发菌株NZN111以及对照菌株AFP111，循环利用甘蔗渣水解液发酵生产丁二酸情况对比。
首先用LB培养基活化菌体，将大肠埃希氏菌 BA305按1%(v/v)接种量接种入7.5L发酵罐装液量为3L的LB培养基并添加总糖含量为15 g/L的甘蔗渣水解液，以0.5 L/min的速度通入空气或纯氧，当有氧培养菌体OD600至0.6用0.3 mM的IPTG诱导, 有氧培养15h至OD600=19，停止通入空气或纯氧，以0.5 L/min的速度通入CO2进行厌氧发酵产酸，添加甘蔗渣水解液使得总糖含量最高浓度不超过30 g/L，同时添加碱式碳酸镁调控pH值6.4。当细胞甘蔗渣水解液的消耗速率下降至0.6 g/(L·h)，检测培养基中甘蔗渣水解液含量，通过无菌膜过滤获得菌体细胞，在新鲜LB培养基中添加甘蔗渣水解液使得总糖浓度不超过30 g/L，厌氧生物转化合成丁二酸。出发菌株NZN111以及对照菌株AFP111采用相同的培养以及发酵方式。
发酵结果见表19、表20和表21。
表19 Escherichia coli BA305循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 30 29.2 ND ND ND ND ND
2 30 30 29.1 ND ND ND ND ND
3 30 30 29 ND 0.3 ND 0.5 ND
4 30 30 28.9 ND 0.5 ND 0.3 ND
注:ND表示未检测到。
表20 Escherichia coli NZN111循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 6 3.2 ND 2.4 ND 0.7 ND
2 30 4 1.4 ND 1.6 ND 0.1 ND
3 30 3 1.6 ND 1.1 ND 0.2 ND
4 30 1 0.2 ND 0.1 ND 0.5 ND
注:ND表示未检测到。
表21 Escherichia coli AFP111循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 6 5.2 ND ND ND 0.7 ND
2 30 4 3.6 ND ND ND 0.1 ND
3 30 3 2.2 ND ND ND 0.2 ND
4 30 1 0.4 ND ND ND 0.5 ND
注:ND表示未检测到。
实施例8
本实施例说明大肠埃希氏菌 BA305与出发菌株NZN111以及对照菌株AFP111，循环利用糖蜜水解液发酵生产丁二酸情况对比。
首先用LB培养基活化菌体，将大肠埃希氏菌 BA305按1%(v/v)接种量接种入7.5L发酵罐装液量为3L的LB培养基并添加总糖含量为15 g/L的糖蜜水解液，以0.5 L/min的速度通入空气或纯氧，当有氧培养菌体OD600至0.4用0.3 mM的IPTG诱导，有氧培养15h至OD600=19，停止通入空气或纯氧，以0.5 L/min的速度通入CO2进行厌氧发酵产酸，添加糖蜜水解液使得总糖含量最高浓度不超过30 g/L，同时添加碱式碳酸镁调控pH值6.4。当细胞糖蜜水解液的消耗速率下降至0.6 g/(L·h)，检测培养基中糖蜜水解液含量，通过无菌离心获得菌体细胞，在新鲜LB培养基中添加糖蜜水解液使得总糖浓度不超过30 g/L，厌氧生物转化合成丁二酸。出发菌株NZN111以及对照菌株AFP111采用相同的培养以及发酵方式。
发酵结果见表22、表23和表24。
表22 Escherichia coli BA305循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 30 29.2 ND ND ND ND ND
2 30 30 29.1 ND ND ND ND ND
3 30 30 29 ND 0.3 ND 0.5 ND
4 30 30 28.9 ND 0.5 ND 0.3 ND
注:ND表示未检测到。
表23 Escherichia coli NZN111循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 30 20.2 ND 5.4 ND 3.7 ND
2 30 25 17.6 ND 3.6 ND 2.1 ND
3 30 20 13.5 ND 2.1 ND 1.2 ND
4 30 12 8.2 ND 1.1 ND 0.5 ND
注:ND表示未检测到。
表24 Escherichia coli AFP111循环利用发酵生产丁二酸的结果
循环利用批次 时间(h) 耗糖(g/L) 丁二酸(g/L) 苹果酸(g/L) 丙酮酸(g/L) 甲酸(g/L) 乙酸(g/L) 乳酸(g/L)
1 30 30 27.2 ND ND ND 1.2 ND
2 30 25 23.1 ND ND ND ND ND
3 30 20 17 ND 0.2 ND 1.5 ND
4 30 12 10.2 ND 0.5 ND 0.9 ND
注:ND表示未检测到。

Claims (1)

1.一种利用大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BA305发酵生产丁二酸的方法，其特征在于：首先用LB培养基活化菌体，将大肠埃希氏菌 BA305按体积比1%接种量接种入7.5L发酵罐装液量为3L的LB培养基并添加15 g/L阿拉伯糖，以0.5 L/min的速度通入空气或纯氧，当有氧培养菌体OD600至0.5用0.3 mM的IPTG诱导, 有氧培养15h至OD600=19，停止通入空气或纯氧，以0.5 L/min的速度通入CO2进行厌氧发酵产酸，添加阿拉伯糖最高浓度不超过30 g/L，同时添加碳酸钾调控pH值6.5，当细胞阿拉伯糖的消耗速率下降至0.6 g/L·h，检测培养基中阿拉伯糖含量，通过无菌膜过滤获得菌体细胞，在新鲜LB培养基中添加阿拉伯糖浓度不超过30 g/L，厌氧生物转化合成丁二酸；所述大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BA305的保藏编号为CCTCC NO：M2012102。
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