CN101255405B - 新构建的高产苹果酸基因工程菌及其生产苹果酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种构建高产苹果酸基因工程菌株Escherichia coli JM127的方法及其产酸的方法，其构建过程主要包括失活或敲除兼性微生物中具有使苹果酸脱水反应和降解丙酮酸能力的酶，并超量表达NAD再生的酶。利用已构建的一株大肠杆菌进行两阶段发酵实验，其步骤如下：(1)将活化的大肠杆菌接种于富集培养基，好气培养，提高生物量；(2)将有氧培养得到的菌液膜处理后，转接于含有20～100g/L葡萄糖，一定浓度碳酸盐的LB培养基中，厌氧发酵生产苹果酸。

Description

新构建的高产苹果酸基因工程菌及其生产苹果酸的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一株高产苹果酸重组菌株的构建，还涉及利用该菌株发酵生产苹果酸的方法。

背景技术

苹果酸是人体内部循环的重要中间产物，易被人体吸收，因此作为优异的食品添加剂和功能性食品广泛应用于食品、医疗和保健等领域。目前苹果酸生产以富马酸或马来酸为原料，加压与水蒸汽共热形成DL-苹果酸，也可以糠醛为原料，经双氧水处理，在超声波作用下转变而成。化学法由于生产工艺比较复杂，工艺条件要求高，分离精制技术难度大，加之原料为化工产品，成本高和环境污染等原因使得苹果酸的应用受到限制。

苹果酸的生物合成法包括酶催化转化法和微生物发酵法。20世纪90年代中期出现的酶催化转化法一般都是以富马酸为底物，利用具有高活性富马酸酶的微生物细胞或富马酸酶，采用细胞反应器或固定化酶，将富马酸转化成L-苹果酸。但原料富马酸供应不足，且价格昂贵，限制了该方法的应用前景。随着石油危机的出现，使得人们加大了对微生物发酵法制备苹果酸的研究力度，这一时期人们用来发酵制备苹果酸的微生物主要是霉菌，其中黄曲霉Asp.flavu为重点研究的对象，具体包括黄曲霉Asp.flavu，末曲霉Asp.oryzae，寄生曲霉Asp.parasiticus。Takao等报道先用少根根霉(Rhizopus ahirrizus)或华根霉(Rhizopu chinensis)把糖质原料转化成富马酸，然后利用膜醭毕赤酵母(Pichamembrane aefaciens faciens)、普通变形杆菌(proteus vulgaris)及宛氏拟青霉(paeciomycesvarioti)之一，把富马酸转化成L-苹果酸的研究，但转化率不高(J.Ferment.Techno，1983，61：643～645)。山东食品发酵工程实验室等人多年来致力于直接发酵法生产L-苹果酸的研究，并且从土壤中分离筛选、诱变获得一株直接利用淀粉质原料生产L-苹果酸的高产菌株Aspergillus flavus HA5800，经条件优化，7000升发酵罐产酸达8.68％，糖酸转化率达83.5％，发酵周期112小时，为L-苹果酸产业化奠定了基础。(中国食品添加剂，2003，3：52～56)。

发酵法生产苹果酸可以利用可再生资源(葡萄糖，淀粉等)和二氧化碳，不仅摆脱了对石化原料的依赖，而且开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径。因此，以微生物发酵法生产苹果酸的研究与开发正在美国、日本等国家深入地进行着。但霉菌生长速度慢，产品生产强度偏低，开发对营养条件需求简单、生长迅速、收率高的苹果酸酸生产菌株是加速生物法替代石化法生产的关键。

利用大肠杆菌来发酵生产苹果酸，是利用了大肠杆菌生长快速、培养条件简单、安全性好、易操作易改造等诸多优点，实现苹果酸优质高产工业化生产的方向。而提高大肠杆菌的发酵产酸能力，可以用多种方法，包括重新筛选优良菌株、通过传统的物理化学方法进行菌种诱变以及用现代遗传育种技术、基因工程方法来提高菌种的产酸能力等。Soon Ho Hong等人报道了构建产琥珀酸基因工程菌的方法，原理是敲除野生大肠杆菌中的丙酮酸甲酸裂解酶基因(PFL)和乳酸脱氢酶基因(LDH)，减少甚至不产副产物甲酸、乳酸、乙酸以及乙醇等，使更多的代谢流流向琥珀酸(Biotechnol Bioeng，2001，74：89～95)。在此基础下，如果能够敲除FUM，则可以阻断苹果酸到富马酸的反应，使产物以苹果酸的形式积累。

采用基因工程手段构建高产苹果酸的大肠杆菌以及利用该基因工程菌用于厌氧发酵生产苹果酸的方法未见公开，而这种应用将大大推进苹果酸产业的进步和发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能高产苹果酸的基因工程菌株及其构建方法，并利用该菌株厌氧发酵生产苹果酸，达到菌株的构建方法简单方便，构建得到的菌株发酵方法简单可行，易于工业化，产酸能力强的目的，从而大大降低生产成本，提高经济效益。

为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案：

1、高产苹果酸基因工程菌株Escherichia coli JM127的构建

本发明构建到的基因工程菌株，分类命名为埃希氏菌属大肠埃希氏菌Escherichiacoli JM127，其保藏号登记号为CGMCC No.2300。

本发明以缺乏乳酸脱氢酶基因(LDH)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(PFL)活性的菌株NZN111为出发菌株，利用同源重组技术敲除富马酸酶FUM基因，并过量表达苹果酸酶后，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，获得Escherichia coli JM127，重组菌株的代谢途径如图1所示。具体步骤如下：

(1)利用同源重组技术敲除富马酸酶FUM基因：

本发明以两侧带有FRT位点的安普霉素抗性基因为模板，利用高保真PCR扩增系统，并设计两端带有FUM同源片段的扩增引物，成功扩增出线性DNA同源片段；

同时，在出发菌株中导入能够诱导表达λ重组酶的质粒，使在电转入线性DNA片段后，可以抑制菌体内部的核酸外切酶，防止线性片段的分解，同时进行同源重组，通过抗性筛选获得阳性重组子；

然后，利用FRT位点的存在，敲除抗性基因。本发明利用诱导表达FLP重组酶后成功将抗性基因敲除，达到无痕敲除的目的，其中实现过程如下：导入能够诱导产生FLP重组酶的质粒，在诱导后，利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的菌即为已经敲除抗性的菌株；

(2)过量表达苹果酸酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，获得Escherichiacoli JM127：

合成一对5’端带有酶切位点的引物，以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，纯化扩增出的sfcA基因后，表达质粒pTrc99a用与引物所设计的酶切位点一致的酶双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-sfcA；

将质粒pTrc99a-sfcA导入之前消除安普霉素抗性菌株的感受态，获得的阳性转化子即为Escherichia coli JM127；

在成功敲除FUM基因后，超量表达苹果酸酶，恢复在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力。

2、基因工程菌株Escherichia coli JM127的发酵生产苹果酸

厌氧发酵过程中产生大量诸如乙酸等对菌株有毒害作用的副产物，因此考虑采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段进行产酸发酵。也可选择性地采用膜分离技术，达到分离菌体的目的，再进而用于厌氧发酵。具体步骤为：

采用两阶段发酵模式，按1％(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD₆₀₀至0.8～1.0左右用0.7mM的IPTG诱导至OD₆₀₀＝3左右时，按接种量10％转接至血清瓶中厌氧发酵。

或者，采用两阶段发酵模式，按1％(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD₆₀₀至0.8～1.0左右用0.7mM的IPTG诱导至OD₆₀₀＝3左右时，经膜处理后，按接种量10％转接至血清瓶中厌氧发酵。

发酵结果表明新构建的重组大肠杆菌Escherichia coli JM127能大量积累苹果酸，富马酸、丁二酸积累较少，相比出发菌株的终产物为丁二酸，且无苹果酸积累的特征，新构建的重组大肠杆菌Escherichia coli JM127产酸特征变化巨大。

而采用膜过滤后转接厌氧发酵48h，17.5g/L初始葡萄糖可产9.7g/L苹果酸。未经膜处理的也能达到8.1g/L的苹果酸，得率46％，生产强度0.17g/(L·h)。当以80g/L葡萄糖为初始糖浓度时，苹果酸产量最高，为29.5g/L。

本发明的有益效果在于利用代谢工程手段，对大肠杆菌进行目标产物途径的强化，以及切断副产物的生成途径，使代谢流更多地流向苹果酸。并利用该菌株进行两阶段发酵实验，结果显示可生产较高浓度的苹果酸，为利用大肠杆菌工业化生产苹果酸打下基础。

附图说明

图1Escherichia coli JM127的代谢途径

图2线性DNA片段的电泳鉴定图

图3同源重组阳性重组子的电泳鉴定图

图4NZN111(pTrc99a-sfcA)敲除富马酸酶前后的有机酸产物比较

本发明的微生物保藏日期为2007年12月25日，保藏单位全称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号：CGMCC No.2300。

具体实施方式

下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。

实施例1

本实施例说明利用同源重组技术敲除亲本大肠杆菌NZN111中富马酸酶fum基因，得到消除安普霉素抗性菌株的过程。

1、利用LB培养基，于37℃、有氧条件下培养大肠杆菌NZN111至OD₆₀₀＝0.4～0.6，制备成电转感受态。

2、将重组质粒电转入感受态的大肠杆菌NZN111。电击条件为：200Ω，25μF，电击电压2.3kV，电击时间4～5ms。电击后迅速将菌体加入预冷1mL的SOC培养基，150r/min、30℃培养1h之后涂布于带氨苄青霉素(amp)的LB培养基平板筛选出阳性转化子NZN111(pKD46)。

3、在LB培养基中加入10mM的L-阿拉伯糖，于30℃下诱导质粒pKD46表达出λ重组酶，制成电转感受态。

4、以两侧带有FRT位点的安普霉素抗性基因为模板，利用高保真PCR扩增系统，以质粒pIJ773为模板，并设计两端带有FUM同源片段的扩增引物，扩增出线性DNA同源片段，引物序列如下：

上游带同源臂引物H1-P1，下划线为同源片段：

5’-CGGCACGCCATTTTCGAATAACAAATACAGAGTTACAGGCTGGAAGCTATT

CCG GGGATCCGTCGACC-3’

下游带同源臂引物H2-P2，下划线为同源片段：

5’-TTACTTAGTGCAGTTCGCGCACTGTTTGTTGACGATTTGCTGGAAGAA

TGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’

反应体系：带同源臂的上下游引物(100pmol/μL)各0.5；μL模板DNA(100ng/μL)0.5μL；10×buffer 5μL；dNTPs(10mM)各1μL；DMSO(100％)2.5μL；Pyrobest DNA聚合酶(2.5U/μL)1μL；ddH₂O 36/35.5μL；总体积50μL。

反应条件：94℃，2min；(94℃，45sec；50℃，45sec；72℃，90sec；10个循环)；(94℃，45sec；55℃，45sec；72℃，90sec；15个循环)；72℃，5min。

线性DNA片段的鉴定如图2。

5、电转线性DNA片段至已诱导表达λ重组酶的NZN111(pKD46)感受态，并涂布于带安普霉素的LB平板筛选出阳性重组子，并进行了PCR鉴定，电泳图如图3所示。

6、阳性重组子制备成感受态后倒入能诱导表达FLP重组酶的质粒pCP20，于42℃热激表达FLP重组酶后即可消除安普霉素抗性。利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的菌即为已经敲除抗性的菌株。

敲除了富马酸酶后的有机酸产物比较如图4所示。

实施例2

本实施例说明构建超量表达苹果酸酶的表达质粒，恢复重组菌株在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，得到菌株Escherichia coli JM127的过程。

1、构建超量表达苹果酸酶的表达质粒，其过程包括：

(1)合成带有Nco I和Hind III酶切位点的引物，

上游引物：5’-CATGCCATGGATATTCAAAAAAGAGTGAGTG-3’

下游引物：5’-CCCAAGCTTTTAGATGGAGGTACGGC-3’

(2)以大肠杆菌K12为模板，菌落PCR，反应条件为95℃，1.5min，63℃，1.0min，72℃，1.5min，共35个循环。纯化扩增出的sfcA基因后，表达质粒pTrc99a分别用Nco I和Hind III双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-sfcA。

2、将质粒pTrc99a-sfcA导入实施例1中消除安普霉素抗性菌株的感受态。获得的阳性转化子即为本发明的新构建菌株Escherichia coli JM127。

实施例3

本实施例说明新构建的重组大肠杆菌JM127与NZN111(pTrc99a-sfcA)发酵产酸能力的对比。

大肠杆菌NZN111(CGSC7726)当导入质粒pTrc99a-sfcA，过量表达苹果酸酶基因，恢复了NZN111在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，且有高产量的琥珀酸积累。构建的重组大肠杆菌Escherichia coli JM127，在无氧条件下生长时，它产苹果酸，富马酸，琥珀酸，乙酸的混合酸，其中苹果酸是主要产物。为了考察富马酸酶活性降低后对产酸的影响，采用两阶段发酵模式，按1％(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD₆₀₀至0.8～1.0左右用0.7mM的IPTG诱导至OD₆₀₀＝3左右时，按接种量10％转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48h。

有氧阶段培养基为：LB+kan(卡那霉素30μg/mL)+amp(氨苄青霉素100μg/mL)

厌氧阶段培养基为：LB+葡萄糖(20g/L)+碳酸镁(15g/L)+kan(30μg/mL)+amp(100μg/mL)

发酵结果见表1。

表1敲除富马酸酶对NZN111(pTrc99a-sfcA)发酵产酸的影响

注：ND表示未检测到

实施例4

本实施例说明将膜处理方法应用到新构建的重组大肠杆菌Escherichia coli JM127发酵生产苹果酸的产酸能力比较。

大肠杆菌Escherichia coli JM127，在有氧发酵阶段产生一定量乙酸，会影响第二阶段厌氧发酵过程菌体的生长，因此采用膜过滤处理，截流下菌体后，经洗脱后作为接种物进行厌氧发酵。

为了考察其对菌体生物量及产物的影响，采用两阶段发酵模式，按1％(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD₆₀₀至0.8～1.0左右用0.7mM的IPTG诱导至OD₆₀₀＝3左右时，经膜处理后，转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48h，并以不经膜处理的接种物作为对照。

有氧阶段培养基为：LB+kan(30μg/mL)+amp(100μg/mL)

厌氧阶段培养基为：LB+葡萄糖(20g/L)+碳酸镁(15g/L)+kan(30μg/mL)+amp(100μg/mL)

发酵结果见表2。

表2膜处理后对JM127发酵产酸及菌体生物量的影响

注：ND表示未检测到

实施例5

本实施例中考察了大肠杆菌Escherichia coli JM127对葡萄糖耐受性。随着起始葡萄糖浓度的提高，80g/L葡萄糖下，单位体积的菌体量基本不变，进一步提高葡萄糖浓度，菌体生长受到抑制，见表3。同时对不同浓度下苹果酸的产量进行了考察。采用两阶段发酵模式，按1％(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD₆₀₀至0.8～1.0左右用0.7mM的IPTG诱导至OD₆₀₀＝3左右时，按接种量10％转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48h。

有氧阶段培养基为：LB+kan(30μg/mL)+amp(100μg/mL)

厌氧阶段培养基为：LB+葡萄糖(20g/L)+碳酸镁(15g/L)+kan(30μg/mL)+amp(100μg/mL)

发酵结果见表3。

表3不同葡萄糖浓度下JM127的产苹果酸能力

Claims (8)

1.一种高产苹果酸的基因工程菌，其分类命名为埃希氏菌属大肠埃希氏菌Escherichiacoli JM127，其保藏号登记号为CGMCC No.2300。

2.一种构建权利要求1所述高产苹果酸的基因工程菌的方法，其特征在于：以缺乏乳酸脱氢酶基因(LDH)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(PFL)活性的菌株NZN111为出发菌株，利用同源重组技术敲除富马酸酶(FUM)基因，并过量表达苹果酸酶后，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，获得大肠杆菌Escherichia coli JM127。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征包括以下构建步骤：

1)利用同源重组技术敲除富马酸酶(FUM)基因

以两侧带有FRT位点的安普霉素抗性基因为模板，利用高保真PCR扩增系统，并设计两端带有FUM同源片段的扩增引物，成功扩增出线性DNA同源片段；

在出发菌株中导入能够诱导表达λ重组酶的质粒，并电转化导入DNA同源线性片段进行同源重组，通过抗性筛选得到阳性重组子；

导入能够诱导产生FLP重组酶的质粒，在诱导后，利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的菌株即为消除了安普霉素抗性菌株的感受态；

2)合成一对5’端带有酶切位点的引物，以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，纯化扩增出的sfcA基因后，表达质粒pTrc99a用与引物所设计的酶切位点一致的酶双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-sfcA；

将质粒pTrc99a-sfcA导入之前消除安普霉素抗性菌株的感受态，获得的阳性转化子即为Escherichia c0li JM127。

4.一种利用权利要求1所述的高产苹果酸的基因工程菌Escherichia coli JM127发酵生产苹果酸的方法，其特征在于采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的采用两阶段发酵方式按1％(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD₆₀₀至0.8～1.0用0.7mM的IPTG诱导至OD₆₀₀＝3时，按接种量10％转接至血清瓶中厌氧发酵。

6.一种利用如权利要求4所述的高产苹果酸的基因工程菌Escherichia coli JM127发酵生产苹果酸的方法，其特征在于发酵在经历有氧发酵阶段后采用膜分离过程，再进而用于厌氧发酵。 

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的采用两阶段发酵方式按1％(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD₆₀₀至0.8～1.0用0.7mM的IPTG诱导至OD₆₀₀＝3时，经膜处理后，按接种量10％转接至血清瓶中厌氧发酵。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述的膜分离过程采用的膜为微滤膜。 

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