CN102296082A - 利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法 - Google Patents
利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102296082A CN102296082A CN2011102007425A CN201110200742A CN102296082A CN 102296082 A CN102296082 A CN 102296082A CN 2011102007425 A CN2011102007425 A CN 2011102007425A CN 201110200742 A CN201110200742 A CN 201110200742A CN 102296082 A CN102296082 A CN 102296082A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- acid
- gene
- fermentation
- escherichia coli
- succinic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 81
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 title claims abstract description 39
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 33
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 25
- 230000004127 xylose metabolism Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 title claims abstract description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 4
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 62
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 42
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N alpha-D-xylose Chemical compound O[C@@H]1CO[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N 0.000 claims description 35
- 229960003487 xylose Drugs 0.000 claims description 35
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 33
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 claims description 29
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 claims description 29
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 20
- 150000002085 enols Chemical class 0.000 claims description 20
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 20
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 claims description 20
- 101150041530 ldha gene Proteins 0.000 claims description 19
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 16
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 15
- 108010008221 formate C-acetyltransferase Proteins 0.000 claims description 12
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 12
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 10
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 10
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 10
- 101710104378 Putative malate oxidoreductase [NAD] Proteins 0.000 claims description 10
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 claims description 10
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 9
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 9
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 claims description 9
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 claims description 9
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 claims description 7
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 claims description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 98
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 98
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 56
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 40
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 37
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 34
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 33
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 32
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 18
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 18
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 18
- OGWLTJRQYVEDMR-UHFFFAOYSA-F tetramagnesium;tetracarbonate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[O-]C([O-])=O.[O-]C([O-])=O.[O-]C([O-])=O.[O-]C([O-])=O OGWLTJRQYVEDMR-UHFFFAOYSA-F 0.000 description 16
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 13
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 13
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 13
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 13
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 12
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 12
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 12
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 12
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 12
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 10
- XZNUGFQTQHRASN-XQENGBIVSA-N apramycin Chemical compound O([C@H]1O[C@@H]2[C@H](O)[C@@H]([C@H](O[C@H]2C[C@H]1N)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](N)[C@@H](CO)O1)O)NC)[C@@H]1[C@@H](N)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O XZNUGFQTQHRASN-XQENGBIVSA-N 0.000 description 10
- 229950006334 apramycin Drugs 0.000 description 10
- 241000609240 Ambelania acida Species 0.000 description 9
- 239000010905 bagasse Substances 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 7
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 4-Butyrolactone Chemical compound O=C1CCCO1 YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004631 polybutylene succinate Substances 0.000 description 2
- 229920002961 polybutylene succinate Polymers 0.000 description 2
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 241000948980 Actinobacillus succinogenes Species 0.000 description 1
- 241000722954 Anaerobiospirillum succiniciproducens Species 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000029538 [Mannheimia] succiniciproducens Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002053 acidogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OVYQSRKFHNKIBM-UHFFFAOYSA-N butanedioic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O.OC(=O)CCC(O)=O OVYQSRKFHNKIBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005431 greenhouse gas Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 101150070013 pfl gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- -1 poly butylene succinate Polymers 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000013599 spices Nutrition 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 1
- 239000001117 sulphuric acid Substances 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
- C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
- C12Y401/01031—Phosphoenolpyruvate carboxylase (4.1.1.31)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物工程技术领域，涉及利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法及其发酵生产丁二酸的方法。本发明通过分子生物学手段改造大肠杆菌的ATP生物合成途径，过量表达与该途径有关的酶的活性，有效的提高了大肠杆菌胞内ATP的总量，使重组大肠杆菌能够利用木糖代谢生长，大幅度提高了丁二酸的合成效率。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法。
背景技术
丁二酸（succinic acid）又称琥珀酸，被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料等行业，作为C4平台化合物，可用于合成1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯 (PBS) 类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一。
丁二酸的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法，利用微生物发酵法转化可再生资源（葡萄糖、木糖等），由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可以吸收固定CO2，能有效缓解温室效应，开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，今年来成为研究的热点。丁二酸的生产菌株主要集中在Anaerobiospirillum succiniciproducens、Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens、重组谷氨酸棒杆菌和重组E.coli。利用野生菌株生产丁二酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，阻碍了其工业化进程。E.coli 由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛用于研究以获得产丁二酸优秀菌株。
E.coli野生菌株生产丁二酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，因此可以敲除或失活其中的乳酸脱氢酶(LDH)基因和丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性以减少副产物的生成。但是，由于敲除了PFL基因，导致菌株不能生产乙酸，从而使伴随乙酸生成的ATP减少，最终导致重组大肠杆菌不能利用木糖代谢生长，并且生产丁二酸。
玉米芯是农业生产中比较常见的废弃物，由于其成分含有大量纤维素，因此其水解液对微生物发酵来说，是一种很好的可持续利用的绿色碳源，但其水解液含有高浓度木糖，因此大肠杆菌NZN111不能利用玉米芯水解液发酵生产丁二酸。姜岷等将玉米芯按料液比1∶5 (质量体积比)配制玉米芯料液，物料粒径250～380μm，H2SO4用量3% (体积分数)，水解温度126℃，反应时间215 h，利用活性炭吸附及Ca (OH) 2中和等方式，对玉米芯多组分糖液进行脱毒脱盐处理，总糖质量浓度为50 g/L，其中木糖占80%以上。
稻草秸秆是重要的一类可再生生物质资源。目前，除了在造纸业工业方面的利用，绝大多数被废弃，严重浪费了资源并且污染了环境。其主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，因此其水解液对微生物发酵来说，是一种很好的可持续利用的绿色碳源，但其水解液含有高浓度木糖，因此不能利用木糖的大肠杆菌菌株不能利用稻草秸秆水解液发酵生产丁二酸，陶文沂等通过稀硫酸121℃处理稻草秸秆1 h，再用20 g/L的NaOH于121℃处理秸秆1 h，葡萄糖和木糖二者总质量浓度都达50 g/L左右。
甘蔗渣是甘蔗制糖时榨糖之后剩下的主要成分，因此其水解液对微生物发酵来说，是一种很好的可持续利用的绿色碳源，但其水解液含有高浓度木糖，因此不能利用木糖的大肠杆菌菌株不能利用稻草秸秆水解液发酵生产丁二酸，约含有50%的纤维素通过粉碎以及碱/氧化法预处理可得到总糖质量为50 g/L，其中木糖占80%以上。
在大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶生成草酰乙酸，在此过程中没有ATP的生成，但是在Bacillus subtilis中，磷酸烯醇式丙酮酸是通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶生成草酰乙酸的，在此过程中有ATP的生成，并且Millard等在大肠杆菌中过量表达E. coli ppc和pck，研究发现过量表达ppc可以使琥珀酸作为混合酸发酵的主要产物，且产量较出发菌株提高3.5倍，而过量表达pck对发酵结果没有影响，但在ppc缺陷菌株中，pck的过量表达能够提高琥珀酸的产量。
发明内容
本发明的技术目的在于提供了一种基于ATP生物合成系统改造后的大肠杆菌菌株的构建方法，达到菌株的构建方法简单方便，构建得到的菌株发酵方法简单可行，易于工业化，产酸能力强的目的，从而大大降低了生产成本，提高经济效益。
为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案。
利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤： （1）以缺乏乳酸脱氢酶基因（ldhA），丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）活性的E.coli NZN111菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）基因，得到同时缺乏ldhA、pflB和PPC的感受态菌株；
（2）单独纯化扩增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（pck）基因，或者纯化扩增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（pck）基因，以及选择自苹果酸酶（sfcA）基因、苹果酸脱氢酶（mdh）基因或丙酮酸羧化酶（pyc）基因这三种基因中的一种，构建得到单独过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，或者过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，以及选择自苹果酸酶、苹果酸脱氢酶或丙酮酸羧化酶这三种酶中的一种的表达质粒；
（3）将步骤（2）所述的质粒导入步骤（1）得到的感受态菌株，获得阳性转化子；
（4）利用步骤（3）的阳性转化子单独过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，或者过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，以及选择自苹果酸酶、苹果酸脱氢酶或丙酮酸羧化酶这三种酶中的一种，恢复其在厌氧条件下代谢木糖的能力，得到可利用木糖代谢产丁二酸基因工程菌。
具体的，利用本发明所述的上述方法可以细分为下述几个具体方法。
A、过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，得到能够高效利用木糖生长并产丁二酸的大肠杆菌Escherichia coli BA204： 以缺乏乳酸脱氢酶基因（ldhA），丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）活性的E.coli NZN111菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）基因，得到同时缺乏ldhA、pflB和PPC的感受态菌株；
合成一对5’端带有酶切位点的引物，以Bacillus subtilis基因组DNA为模板，纯化扩增出的pck基因后，表达质粒pTrc99a用与引物所设计的酶切位点一致的酶双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pck； 将质粒pTrc99a-pck导入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZN111菌株的感受态，获得的阳性转化子即为Escherichia coli BA204；
利用Escherichia coli BA204过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，恢复其在厌氧条件下代谢木糖的能力。
B、过量共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和苹果酸酶，得到能够高效利用木糖生长并产丁二酸的大肠杆菌Escherichia coli BA205：
以缺乏乳酸脱氢酶基因（ldhA），丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）活性的E.coli NZN111菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）基因，得到同时缺乏ldhA、pflB和PPC的感受态菌株；
合成一对5’ 端带有相同酶切位点的引物，以Bacillus subtilis基因组DNA为模板，纯化扩增出的pck基因后，已构建的重组质粒pTrc99a-sfcA用与引物所设计的酶切位点一致的酶单酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-sfcA-pck；
将质粒pTrc99a-sfcA-pck导入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZN111菌株的感受态，获得的阳性转化子即为Escherichia coli BA205；
利用Escherichia coli BA205共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和苹果酸酶，恢复其在厌氧条件下代谢木糖的能力。
C、过量共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和苹果酸脱氢酶，使其能够高效利用木糖生长并产丁二酸，获得大肠杆菌Escherichia coli BA206：
以缺乏乳酸脱氢酶基因（ldhA），丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）活性的E.coli NZN111菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）基因，得到同时缺乏ldhA、pflB和PPC的感受态菌株；
合成一对5’ 端带有相同酶切位点的引物，以Bacillus subtilis基因组DNA为模板，纯化扩增出的pck基因后，已构建的重组质粒pTrc99a-mdh用与引物所设计的酶切位点一致的酶单酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-mdh-pck；
将质粒pTrc99a-mdh-pck导入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZN111菌株的感受态，获得的阳性转化子即为Escherichia coli BA206；
利用Escherichia coli BA206共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和苹果酸脱氢酶，恢复其在厌氧条件下代谢木糖的能力。
D、过量共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和丙酮酸羧化酶，使其能够高效利用木糖生长并产丁二酸，获得大肠杆菌Escherichia coli BA207：
以缺乏乳酸脱氢酶基因（ldhA），丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）活性的E.coli NZN111菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）基因，得到同时缺乏ldhA、pflB和PPC的感受态菌株；
合成一对5’ 端带有相同酶切位点的引物，以Bacillus subtilis基因组DNA为模板，纯化扩增出的pck基因后，已构建的重组质粒pTrc99a-pyc用与引物所设计的酶切位点一致的酶单酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pyc-pck；
将质粒pTrc99a-pyc-pck导入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZN111菌株的感受态，获得的阳性转化子即为Escherichia coli BA207；
利用Escherichia coli BA207共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和丙酮酸羧化酶，恢复其在厌氧条件下代谢木糖的能力。
本发明的有益效果在于：
首先，厌氧发酵过程中产大量诸如乙酸等对菌株有毒害作用的副产物，因此考虑两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段进行产酸发酵。也可以选择性地采用膜分离技术，达到分离菌体的目的，再进而用于厌氧发酵。具体步骤如下：采用两阶段发酵模式，划线-80℃冻存管保藏的菌液到含有氨苄青霉素的平板，挑取平板上长出的单菌落到5 ml LB培养基的试管，1%（v/v）接种量接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.8-1.0左右时用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵。发酵结果表明，新构建的和大肠杆菌ATP生物合成途径有关的基因工程菌Escherichia coli BA 204、Escherichia coli BA 205、Escherichia coli BA 206和Escherichia coli BA 207恢复了厌氧条件下代谢木糖的能力，并高效利用木糖产丁二酸。
其次，本发明通过分子生物学手段改造大肠杆菌的ATP生物合成途径，提高ATP供给，补充木糖转运和代谢过程中的能量供给，使重组大肠杆菌能够持续利用木糖生长并使其高效合成丁二酸的方法未见公开，而这种应用将大大推进丁二酸产业的进步和发展。
附图说明
图1 重组质粒pTrc99a-pck的构建图谱。
图2重组质粒pTrc99a-sfcA-pck的构建图谱。
图3重组质粒pTrc99a-mdh-pck的构建图谱。
图4重组质粒pTrc99a-pyc-pck的构建图谱。
图5 PCR产物pck的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
图6重组质粒pTrc99a-pck的单双酶切鉴定图。
图7重组质粒pTrc99a-sfcA-pck的单双酶切鉴定图。
图8重组质粒pTrc99a-mdh-pck的单双酶切鉴定图。
图9重组质粒pTrc99a-pyc-pck的单双酶切鉴定图。
具体实施方式
下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
本发明所述的安普霉素抗性基因的来源是：pIJ773，获得自南京师范大学邵蔚蓝教授处。
本发明所述的能够诱导表达λ重组酶的质粒的来源是：pKD46，购自Introvegen公司。
本发明所述的能够诱导产生FLP重组酶的质粒的来源是：pCP20，购自Introvegen公司。
本发明所述的Bacillus subtilis基因组的来源是：购自中国典型培养物保藏中心。
本发明所述的表达质粒用pTrc99a的来源是：购自Introvegen公司。
本发明所述的出发菌株E.coli NZN111的来源是：Biotechnol Bioeng, 2001, 74:89～95。
实施例1
本实施例说明构建过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表达质粒，恢复重组菌株在厌氧条件下代谢木糖的能力，得到菌株Escherichia coli BA204。
1、以缺乏乳酸脱氢酶基因（ldhA），丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）活性的E.coli NZN111菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）基因，得到同时缺乏ldhA、pflB和PPC的感受态菌株。
利用同源重组技术敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因：以两侧带有FRT位点的安普霉素抗性基因为模板，利用高保真PCR扩增系统，并设计两端带有PPC同源片段的扩增引物，成功扩增出线性DNA同源片段； 在出发菌株NZN111中导入能够诱导表达λ重组酶的质粒，使在电转入线性DNA片段后，可以抑制菌体内部的核酸外切酶，防止线性片段的分解，同时进行同源重组，通过抗性筛选获得阳性重组子；导入能够诱导产生FLP重组酶的质粒，在诱导后，利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的均极为已经敲除抗性的NZN111菌株。
2、构建过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表达质粒，其过程包括：
（1） 合成带有SacI 和XbaI酶切位点的引物，
上游引物：5’- CGAGCTCATGAACTCAGTTGATTTGACCG -3’；
下游引物：5’- GCTCTAGAGCATTCCGTCAATTAAAACAAG -3’。
（2） 以Bacillus subtilis基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：94℃，5 min；(94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 100 s，35个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的pck基因和表达质粒pTrc99a分别用SacI和XbaI双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pck。
3、将质粒pTrc99a-pck导入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZN111菌株的感受态，获得的阳性转化子即为Escherichia coli BA204。
实施例2
本实施例说明构建共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和苹果酸酶的表达质粒，恢复重组菌株在厌氧条件下代谢木糖的能力，得到菌株Escherichia coli BA205。
1、以缺乏乳酸脱氢酶基因（ldhA），丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）活性的E.coli NZN111菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）基因，得到同时缺乏ldhA、pflB和PPC的感受态菌株（同实施例1）。
2、构建共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和苹果酸酶的表达质粒，其过程包括：
（1）合成上下游都带有HindIII酶切位点的引物，
上游引物：5’- CCCAAGCTTATGAACTCAGTTGATTTGACCG -3’；
下游引物：5’- CCCAAGCTTGCATTCCGTCAATTAAAACAAG-3’。
(2) 以Bacillus subtilis基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：94℃，5 min；(94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 100 s，35个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的pck基因和表达质粒pTrc99a-sfcA分别用HindIII单酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-sfcA-pck。
3、将质粒pTrc99a-sfcA-pck导入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZN111菌株的感受态，获得的阳性转化子即为Escherichia coli BA205。
实施例3
本实施例说明构建共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和苹果酸脱氢酶的表达质粒，恢复重组菌株在厌氧条件下代谢木糖的能力，得到菌株Escherichia coli BA206。
1、以缺乏乳酸脱氢酶基因（ldhA），丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）活性的E.coli NZN111菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）基因，得到同时缺乏ldhA、pflB和PPC的感受态菌株（同实施例1）。
2、构建共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和苹果酸脱氢酶的表达质粒，其过程包括：
（1）合成上下游都带有HindIII酶切位点的引物，
上游引物：5’- CCCAAGCTTATGAACTCAGTTGATTTGACCG -3’；
下游引物：5’- CCCAAGCTTGCATTCCGTCAATTAAAACAAG-3’。
(2) 以Bacillus subtilis基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：94℃，5 min；(94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 100 s，35个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的pck基因和表达质粒pTrc99a-mdh分别用HindIII单酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-mdh-pck。
3、将质粒pTrc99a-mdh-pck导入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZN111菌株的感受态，获得的阳性转化子即为Escherichia coli BA206。
实施例4
本实施例说明构建共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和丙酮酸羧化酶的表达质粒，恢复重组菌株在厌氧条件下代谢木糖的能力，得到菌株Escherichia coli BA207。
1、以缺乏乳酸脱氢酶基因（ldhA），丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）活性的E.coli NZN111菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）基因，得到同时缺乏ldhA、pflB和PPC的感受态菌株（同实施例1）。
2、构建共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和丙酮酸羧化酶的表达质粒，其过程包括：
（1）合成上下游都带有HindIII酶切位点的引物，
上游引物：5’- CCCAAGCTTATGAACTCAGTTGATTTGACCG -3’；
下游引物：5’- CCCAAGCTTGCATTCCGTCAATTAAAACAAG-3’。
(2) 以Bacillus subtilis基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：94℃，5 min；(94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 100 s，35个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的pck基因和表达质粒pTrc99a-pyc分别用HindIII单酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pyc-pck。
3、将质粒pTrc99a-pyc-pck导入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZN111菌株的感受态，获得的阳性转化子即为Escherichia coli BA207。
实施例5
本实施例说明实施例1的新构建的重组大肠杆菌BA204与出发菌株大肠杆菌NZN111发酵产酸能力的对比。
大肠杆菌Escherichia coli BA204能够高效利用木糖发酵，并大量积累丁二酸，采用两阶段发酵方式，其特征在于按1% (v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6左右用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48 h。
有氧阶段培养基为：LB+ Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)。
厌氧阶段培养基为：LB+木糖(20 g/L)+碱式碳酸镁0.48 g+Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)+0.3 mM IPTG。
发酵结果见表1。
表1 Escherichia coli BA204 与出发菌株发酵产酸的结果比较
注:ND表示未检测到。
实施例6
本实施例说明新构建的重组大肠杆菌BA204与出发菌株大肠杆菌NZN111发酵产酸能力的对比。
大肠杆菌Escherichia coli BA204能够高效利用玉米芯水解液发酵，并大量积累丁二酸，采用两阶段发酵方式，其特征在于按1% (v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6左右用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48 h。
有氧阶段培养基为：LB+ Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)。
厌氧阶段培养基为：LB+玉米芯水解液(总糖20 g/L)+碱式碳酸镁0.48 g+Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)+0.3 mM IPTG。
发酵结果见表2。
表2 Escherichia coli BA204 与出发菌株发酵产酸的结果比较
注:ND表示未检测到。
实施例7
本实施例说明新构建的重组大肠杆菌BA204与出发菌株大肠杆菌NZN111发酵产酸能力的对比。
大肠杆菌Escherichia coli BA204能够高效利用稻草秸秆水解液发酵，并大量积累丁二酸，采用两阶段发酵方式，其特征在于按1% (v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6左右用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48 h。
有氧阶段培养基为：LB+ Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)。
厌氧阶段培养基为：LB+稻草秸秆水解液(总糖20 g/L)+碱式碳酸镁0.48 g+Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)+0.3 mM IPTG。
发酵结果见表3。
表3 Escherichia coli BA204 与出发菌株发酵产酸的结果比较
注:ND表示未检测到。
实施例8
本实施例说明新构建的重组大肠杆菌BA204与出发菌株大肠杆菌NZN111发酵产酸能力的对比。
大肠杆菌Escherichia coli BA204能够高效利用甘蔗渣水解液发酵，并大量积累丁二酸，采用两阶段发酵方式，其特征在于按1% (v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6左右用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48 h。
有氧阶段培养基为：LB+ Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)。
厌氧阶段培养基为：LB+甘蔗渣水解液(总糖20 g/L)+碱式碳酸镁0.48 g+Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)+0.3 mM IPTG。
发酵结果见表4.
表4 Escherichia coli BA204 与出发菌株发酵产酸的结果比较
注:ND表示未检测到。
实施例9
本实施例说明新构建的重组大肠杆菌BA205与出发菌株大肠杆菌NZN111发酵产酸能力的对比。
大肠杆菌Escherichia coli BA205能够高效利用木糖发酵，并大量积累丁二酸，采用两阶段发酵方式，其特征在于按1% (v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6左右用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48 h。
有氧阶段培养基为：LB+ Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)。
厌氧阶段培养基为：LB+木糖(20 g/L)+碱式碳酸镁0.48 g+Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)+0.3 mM IPTG。
发酵结果见表5。
表5 Escherichia coli BA205与出发菌株发酵产酸的结果比较
注:ND表示未检测到。
实施例10
本实施例说明新构建的重组大肠杆菌BA205与出发菌株大肠杆菌NZN111发酵产酸能力的对比。
大肠杆菌Escherichia coli BA205能够高效利用玉米芯水解液发酵，并大量积累丁二酸，采用两阶段发酵方式，其特征在于按1% (v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6左右用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48 h。
有氧阶段培养基为：LB+ Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)。
厌氧阶段培养基为：LB+玉米芯水解液(总糖20 g/L)+碱式碳酸镁0.48 g+Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)+0.3 mM IPTG。
发酵结果见表6。
表6 Escherichia coli BA205 与出发菌株发酵产酸的结果比较
注:ND表示未检测到。
实施例11
本实施例说明新构建的重组大肠杆菌BA205与出发菌株大肠杆菌NZN111发酵产酸能力的对比。
大肠杆菌Escherichia coli BA205能够高效利用稻草秸秆水解液发酵，并大量积累丁二酸，采用两阶段发酵方式，其特征在于按1% (v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6左右用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48 h。
有氧阶段培养基为：LB+ Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)。
厌氧阶段培养基为：LB+稻草秸秆水解液(总糖20 g/L)+碱式碳酸镁0.48 g+Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)+0.3 mM IPTG。
发酵结果见表7。
表7 Escherichia coli BA205 与出发菌株发酵产酸的结果比较
注:ND表示未检测到。
实施例12
本实施例说明新构建的重组大肠杆菌BA205与出发菌株大肠杆菌NZN111发酵产酸能力的对比。
大肠杆菌Escherichia coli BA205能够高效利用甘蔗渣水解液发酵，并大量积累丁二酸，采用两阶段发酵方式，其特征在于按1% (v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6左右用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48 h。
有氧阶段培养基为：LB+ Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)。
厌氧阶段培养基为：LB+甘蔗渣水解液(总糖20 g/L)+碱式碳酸镁0.48 g+Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)+0.3 mM IPTG。
发酵结果见表8。
表8 Escherichia coli BA205 与出发菌株发酵产酸的结果比较
注:ND表示未检测到。
实施例13
本实施例说明新构建的重组大肠杆菌BA206与出发菌株大肠杆菌NZN111发酵产酸能力的对比。
大肠杆菌Escherichia coli BA206能够高效利用木糖发酵，并大量积累丁二酸，采用两阶段发酵方式，其特征在于按1% (v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6左右用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48 h。
有氧阶段培养基为：LB+ Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)。
厌氧阶段培养基为：LB+木糖(20 g/L)+碱式碳酸镁0.48 g+Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)+0.3 mM IPTG。
发酵结果见表9。
表9 Escherichia coli BA206与出发菌株发酵产酸的结果比较
注:ND表示未检测到。
实施例14
本实施例说明新构建的重组大肠杆菌BA206与出发菌株大肠杆菌NZN111发酵产酸能力的对比。
大肠杆菌Escherichia coli BA206能够高效利用玉米芯水解液发酵，并大量积累丁二酸，采用两阶段发酵方式，其特征在于按1% (v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6左右用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48 h。
有氧阶段培养基为：LB+ Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)。
厌氧阶段培养基为：LB+玉米芯水解液(总糖20 g/L)+碱式碳酸镁0.48 g+Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)+0.3 mM IPTG。
发酵结果见表10。
表10 Escherichia coli BA206 与出发菌株发酵产酸的结果比较
注:ND表示未检测到。
实施例15
本实施例说明新构建的重组大肠杆菌BA206与出发菌株大肠杆菌NZN111发酵产酸能力的对比。
大肠杆菌Escherichia coli BA206能够高效利用稻草秸秆水解液发酵，并大量积累丁二酸，采用两阶段发酵方式，其特征在于按1% (v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6左右用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48 h。
有氧阶段培养基为：LB+ Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)。
厌氧阶段培养基为：LB+稻草秸秆水解液(总糖20 g/L)+碱式碳酸镁0.48 g+Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)+0.3 mM IPTG。
发酵结果见表11。
表11 Escherichia coli BA206 与出发菌株发酵产酸的结果比较
注:ND表示未检测到。
实施例16
本实施例说明新构建的重组大肠杆菌BA206与出发菌株大肠杆菌NZN111发酵产酸能力的对比。
大肠杆菌Escherichia coli BA206能够高效利用甘蔗渣水解液发酵，并大量积累丁二酸，采用两阶段发酵方式，其特征在于按1% (v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6左右用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48 h。
有氧阶段培养基为：LB+ Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)。
厌氧阶段培养基为：LB+甘蔗渣水解液(总糖20 g/L)+碱式碳酸镁0.48 g+Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)+0.3 mM IPTG。
发酵结果见表12。
表12 Escherichia coli BA206 与出发菌株发酵产酸的结果比较
注:ND表示未检测到。
实施例17
本实施例说明新构建的重组大肠杆菌BA207与出发菌株大肠杆菌NZN111发酵产酸能力的对比。
大肠杆菌Escherichia coli BA207能够高效利用木糖发酵，并大量积累丁二酸，采用两阶段发酵方式，其特征在于按1% (v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6左右用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48 h。
有氧阶段培养基为：LB+ Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)。
厌氧阶段培养基为：LB+木糖(20 g/L)+碱式碳酸镁0.48 g+Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)+0.3 mM IPTG。
发酵结果见表13。
表13 Escherichia coli BA207与出发菌株发酵产酸的结果比较
注:ND表示未检测到。
实施例18
本实施例说明新构建的重组大肠杆菌BA207与出发菌株大肠杆菌NZN111发酵产酸能力的对比。
大肠杆菌Escherichia coli BA207能够高效利用玉米芯水解液发酵，并大量积累丁二酸，采用两阶段发酵方式，其特征在于按1% (v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6左右用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48 h。
有氧阶段培养基为：LB+ Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)。
厌氧阶段培养基为：LB+玉米芯水解液(总糖20 g/L)+碱式碳酸镁0.48 g+Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)+0.3 mM IPTG。
发酵结果见表14。
表14 Escherichia coli BA207 与出发菌株发酵产酸的结果比较
注:ND表示未检测到。
实施例19
本实施例说明新构建的重组大肠杆菌BA207与出发菌株大肠杆菌NZN111发酵产酸能力的对比。
大肠杆菌Escherichia coli BA207能够高效利用稻草秸秆水解液发酵，并大量积累丁二酸，采用两阶段发酵方式，其特征在于按1% (v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6左右用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48 h。
有氧阶段培养基为：LB+ Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)。
厌氧阶段培养基为：LB+稻草秸秆水解液(总糖20 g/L)+碱式碳酸镁0.48 g+Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)+0.3 mM IPTG。
发酵结果见表15。
表15 Escherichia coli BA207 与出发菌株发酵产酸的结果比较
注:ND表示未检测到。
实施例20
本实施例说明新构建的重组大肠杆菌BA207与出发菌株大肠杆菌NZN111发酵产酸能力的对比。
大肠杆菌Escherichia coli BA207能够高效利用甘蔗渣水解液发酵，并大量积累丁二酸，采用两阶段发酵方式，其特征在于按1% (v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6左右用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48 h。
有氧阶段培养基为：LB+ Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)。
厌氧阶段培养基为：LB+甘蔗渣水解液(总糖20 g/L)+碱式碳酸镁0.48 g+Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)+0.3 mM IPTG。
发酵结果见表16。
表16 Escherichia coli BA207 与出发菌株发酵产酸的结果比较
注:ND表示未检测到。
Claims (1)
1.一种利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）以缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的大肠杆菌菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，得到同时缺乏ldhA、pflB和PPC的感受态菌株；
(2) 单独纯化扩增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，或者纯化扩增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，以及选择自苹果酸酶基因、苹果酸脱氢酶基因或丙酮酸羧化酶基因这三种基因中的一种，构建得到单独过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，或者过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，以及选择自苹果酸酶、苹果酸脱氢酶或丙酮酸羧化酶这三种酶中的一种的表达质粒；
（3）将步骤（2）所述的质粒导入步骤（1）得到的感受态菌株，获得阳性转化子；
（4）利用步骤（3）的阳性转化子单独过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，或者过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，以及选择自苹果酸酶、苹果酸脱氢酶或丙酮酸羧化酶这三种酶中的一种，恢复其在厌氧条件下代谢木糖的能力，得到可利用木糖代谢产丁二酸基因工程菌。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011102007425A CN102296082A (zh) | 2011-07-18 | 2011-07-18 | 利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法 |
| CN2012101022051A CN102618477A (zh) | 2011-07-18 | 2012-04-10 | 利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法 |
| PCT/CN2012/078817 WO2013010483A1 (zh) | 2011-07-18 | 2012-07-18 | 利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011102007425A CN102296082A (zh) | 2011-07-18 | 2011-07-18 | 利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102296082A true CN102296082A (zh) | 2011-12-28 |
Family
ID=45356757
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2011102007425A Pending CN102296082A (zh) | 2011-07-18 | 2011-07-18 | 利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法 |
| CN2012101022051A Pending CN102618477A (zh) | 2011-07-18 | 2012-04-10 | 利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2012101022051A Pending CN102618477A (zh) | 2011-07-18 | 2012-04-10 | 利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (2) | CN102296082A (zh) |
| WO (1) | WO2013010483A1 (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102399738A (zh) * | 2011-07-18 | 2012-04-04 | 南京工业大学 | 一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法 |
| WO2013010483A1 (zh) * | 2011-07-18 | 2013-01-24 | 南京工业大学 | 利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法 |
| CN103131663A (zh) * | 2013-03-07 | 2013-06-05 | 天津工业生物技术研究所 | 提高丁二酸产量的重组菌及构建方法 |
| CN103320366A (zh) * | 2013-07-10 | 2013-09-25 | 南京工业大学 | 一株厌氧利用合成培养基高产丁二酸大肠杆菌的筛选及其应用 |
| CN106167772A (zh) * | 2016-06-21 | 2016-11-30 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种高产丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和应用 |
| CN106544285A (zh) * | 2016-12-07 | 2017-03-29 | 江南大学 | 一种强化光滑球拟酵母合成丙酮酸方法 |
| CN114958703A (zh) * | 2022-06-15 | 2022-08-30 | 山东理工大学 | 一种利用油脂合成丁二酸的重组菌及其构建方法与应用 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105779513B (zh) * | 2016-05-10 | 2019-12-06 | 华东理工大学 | 利用重组大肠杆菌以甘油为碳源发酵生产琥珀酸的方法 |
| CN110951660B (zh) * | 2019-12-19 | 2021-12-03 | 江南大学 | 一株固定co2产苹果酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101255405B (zh) * | 2008-04-11 | 2011-06-08 | 南京工业大学 | 新构建的高产苹果酸基因工程菌及其生产苹果酸的方法 |
| CN102296082A (zh) * | 2011-07-18 | 2011-12-28 | 南京工业大学 | 利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法 |
-
2011
- 2011-07-18 CN CN2011102007425A patent/CN102296082A/zh active Pending
-
2012
- 2012-04-10 CN CN2012101022051A patent/CN102618477A/zh active Pending
- 2012-07-18 WO PCT/CN2012/078817 patent/WO2013010483A1/zh active Application Filing
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102399738A (zh) * | 2011-07-18 | 2012-04-04 | 南京工业大学 | 一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法 |
| WO2013010483A1 (zh) * | 2011-07-18 | 2013-01-24 | 南京工业大学 | 利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法 |
| CN102399738B (zh) * | 2011-07-18 | 2013-12-04 | 南京工业大学 | 一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法 |
| CN103131663A (zh) * | 2013-03-07 | 2013-06-05 | 天津工业生物技术研究所 | 提高丁二酸产量的重组菌及构建方法 |
| CN103320366A (zh) * | 2013-07-10 | 2013-09-25 | 南京工业大学 | 一株厌氧利用合成培养基高产丁二酸大肠杆菌的筛选及其应用 |
| CN106167772A (zh) * | 2016-06-21 | 2016-11-30 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种高产丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和应用 |
| CN106167772B (zh) * | 2016-06-21 | 2019-05-17 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种高产丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和应用 |
| CN106544285A (zh) * | 2016-12-07 | 2017-03-29 | 江南大学 | 一种强化光滑球拟酵母合成丙酮酸方法 |
| CN106544285B (zh) * | 2016-12-07 | 2019-07-02 | 江南大学 | 一种强化光滑球拟酵母合成丙酮酸方法 |
| CN114958703A (zh) * | 2022-06-15 | 2022-08-30 | 山东理工大学 | 一种利用油脂合成丁二酸的重组菌及其构建方法与应用 |
| CN114958703B (zh) * | 2022-06-15 | 2024-01-05 | 山东理工大学 | 一种利用油脂合成丁二酸的重组菌及其构建方法与应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102618477A (zh) | 2012-08-01 |
| WO2013010483A1 (zh) | 2013-01-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102296082A (zh) | 利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法 | |
| Strazzera et al. | Volatile fatty acids production from food wastes for biorefinery platforms: A review | |
| Sun et al. | Efficient production of lactic acid from sugarcane molasses by a newly microbial consortium CEE-DL15 | |
| Ghimire et al. | A review on dark fermentative biohydrogen production from organic biomass: process parameters and use of by-products | |
| Bakonyi et al. | Review on the start-up experiences of continuous fermentative hydrogen producing bioreactors | |
| Lu et al. | Characteristics of hydrogen and methane production from cornstalks by an augmented two-or three-stage anaerobic fermentation process | |
| Chen et al. | Efficient and repeated production of succinic acid by turning sugarcane bagasse into sugar and support | |
| Zhang et al. | Simultaneous saccharification and fermentation of xylo-oligosaccharides manufacturing waste residue for l-lactic acid production by Rhizopus oryzae | |
| CN102329765B (zh) | 一种高产l-丙氨酸的xz-a26菌株及构建方法与应用 | |
| Lo et al. | Cellulosic hydrogen production with a sequencing bacterial hydrolysis and dark fermentation strategy | |
| CN101255405B (zh) | 新构建的高产苹果酸基因工程菌及其生产苹果酸的方法 | |
| CN102174602B (zh) | 一种利用生物质发酵生产l-乳酸的方法 | |
| Murali et al. | Fermentation of wet-exploded corn stover for the production of volatile fatty acids | |
| CN101240259B (zh) | 新构建的高产富马酸基因工程菌及其生产富马酸的方法 | |
| CA2726054A1 (en) | Method of producing yeast biomass | |
| Kumar et al. | High rate hydrogen fermentation of cello-lignin fraction in de-oiled jatropha waste using hybrid immobilized cell system | |
| Huang et al. | Bioaugmentation combined with biochar to enhance thermophilic hydrogen production from sugarcane bagasse | |
| Guo et al. | Efficient production of lactic acid from sucrose and corncob hydrolysate by a newly isolated Rhizopus oryzae GY18 | |
| CN102399738B (zh) | 一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法 | |
| CN102643774B (zh) | 一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法 | |
| CN103865869A (zh) | 一株产α-酮基丁酸的基因工程菌及其应用 | |
| CN102864116B (zh) | 产丁二酸基因工程菌及其构建及应用 | |
| CN102643775A (zh) | 产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法 | |
| Dinamarca et al. | Process parameters affecting the sustainability of fermentative hydrogen production: A short review | |
| Wen et al. | Optimization of liquid fermentation of microbial consortium WSD-5 followed by saccharification and acidification of wheat straw |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20111228 |