CN114958703A - 一种利用油脂合成丁二酸的重组菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种利用油脂合成丁二酸的重组菌及其构建方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114958703A
CN114958703A CN202210677606.3A CN202210677606A CN114958703A CN 114958703 A CN114958703 A CN 114958703A CN 202210677606 A CN202210677606 A CN 202210677606A CN 114958703 A CN114958703 A CN 114958703A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
coenzyme
coa
seq
propionyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210677606.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114958703B (zh
Inventor
刘修涛
熊鹏
商贺
刘哲
曹心彤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong University of Technology
Original Assignee
Shandong University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong University of Technology filed Critical Shandong University of Technology
Priority to CN202210677606.3A priority Critical patent/CN114958703B/zh
Publication of CN114958703A publication Critical patent/CN114958703A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114958703B publication Critical patent/CN114958703B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01298—3-Hydroxypropionate dehydrogenase (NADP+) (1.1.1.298)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01075—Malonyl CoA reductase (malonate semialdehyde-forming)(1.2.1.75)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
    • C12Y501/99—Racemaces and epimerases (5.1) acting on other compounds (5.1.99)
    • C12Y501/99001—Methylmalonyl-CoA epimerase (5.1.99.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y504/00—Intramolecular transferases (5.4)
    • C12Y504/99—Intramolecular transferases (5.4) transferring other groups (5.4.99)
    • C12Y504/99002—Methylmalonyl-CoA mutase (5.4.99.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y602/00—Ligases forming carbon-sulfur bonds (6.2)
    • C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
    • C12Y602/01017—Propionate--CoA ligase (6.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y604/00—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4)
    • C12Y604/01—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4.1)
    • C12Y604/01002—Acetyl-CoA carboxylase (6.4.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y604/00—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4)
    • C12Y604/01—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4.1)
    • C12Y604/01003—Propionyl-CoA carboxylase (6.4.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/05—Alcaligenes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/59—Biological synthesis; Biological purification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种利用油脂合成丁二酸的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。为了提供一种利用油脂为碳源的重组菌生产丁二酸。本发明提供的重组菌是以真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)为出发菌株，过表达乙酰辅酶A羧化酶的基因accBC、丙酰辅酶A合酶的基因pcs、丙二酸单酰辅酶A还原酶的基因mcr、丙酰辅酶A羧化酶的基因pcc、甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶的基因mcE和甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的基因mcM，得到重组菌。本发明在一定程度上可以减轻丁二酸合成过程中对化石原料的依赖，符合国家“双碳战略”需求，具有广阔的发展前景及应用潜力。

Description

一种利用油脂合成丁二酸的重组菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用油脂合成丁二酸的重组菌及其构建方法与应用。
背景技术
丁二酸是一种C4二元羧酸，是TCA循环的关键中间体。作为一种被广泛研究的高附加值化学品，丁二酸在农业、化工、医药和生物降解塑料等领域有着广泛的应用。丁二酸作为重要的平台化合物，可以转化为诸多工业化学品，如1,4-丁二醇、丁二烯和四氢呋喃等。当前其市场潜力每年超过270万吨，产值超150亿美元/年。随着节能减排需求的倡导，当前越来越多的研究聚焦在丁二酸的生物制备中，以替代高耗能的化学合成过程。通过微生物代谢工程等手段，构建丁二酸生物合成菌株，以可再生资源作为发酵底物，促进工程菌株的生长和丁二酸的生产，这种方案逐步受到大家的重视。利用生物法进行丁二酸的制备具有明显优点，其原料来源广泛且价格低廉,污染小,环境友好,且在生产过程中能够利用CO2，一定程度上可以降低温室效应的影响，从而具有广阔的发展潜力。
油脂来源广泛，价格低廉，并且以油脂为碳源生成乙酰辅酶A的过程中，没有碳原子损失，较葡萄糖为碳源时，具备较高的碳原子经济性，但油脂为碳源时，难以被宿主细胞利用。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种利用油脂为碳源的重组菌生产丁二酸。
本发明提供一种利用油脂合成丁二酸的重组菌，所述重组菌是以真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)为出发菌株，过表达乙酰辅酶A羧化酶的基因accBC、丙酰辅酶A合酶的基因pcs、丙二酸单酰辅酶A还原酶的基因mcr、丙酰辅酶A羧化酶的基因pcc、甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶的基因mcE和甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的基因mcM，得到重组菌。
进一步地限定，所述的编码乙酰辅酶A羧化酶的基因accBC的不同亚基在NCBI中基因ID分别为accB:947758、accC:947761；丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR在NCBI中的蛋白质ID为AAS20429.1；丙酰辅酶A合酶Pcs在NCBI中的蛋白质ID为AAL47820.2；编码丙酰辅酶A羧化酶的基因pcc在NCBI中的基因ID为1100367；甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶McE在NCBI中的蛋白质ID为ACL23899.1；编码甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的基因mcM在NCBI中的基因ID为5826972。
进一步地限定，将丙酰辅酶A羧化酶PCC进行突变，将第220位的天冬酰胺突变为异亮氨酸，第391位的异亮氨酸突变为苏氨酸；将丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR进行突变，将第940位的天冬酰胺残基突变为缬氨酸残基，第1106位的赖氨酸残基突变为色氨酸残基，第1114位的丝氨酸残基突变为精氨酸残基。
本发明提供一种上述的重组菌在生产丁二酸中的应用。
本发明提供一种制备上述的重组菌的方法，其特征在于，所述方法的步骤如下：
步骤1：利用pBBR1MCS-1质粒过表达乙酰辅酶A羧化酶的基因accBC、丙酰辅酶A合酶的基因pcs获得重组质粒1；
步骤2：利用pBBR1MCS-4质粒过表达丙二酸单酰辅酶A还原酶的基因mcr、丙酰辅酶A羧化酶的基因pcc、甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶的基因mcE、甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的基因mcM获得重组质粒2；
步骤3：将步骤1和步骤2获得的获得重组质粒1和重组质粒2共转到真养产碱杆菌，得到重组菌。
本发明提供一种生产丁二酸的方法，所述方法的步骤如下：所述方法的步骤如下：将上述的重组菌置于含有油脂的培养基，发酵培养至少48小时。
进一步地限定，所述培养基的成分如下：油脂、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化铵、酵母粉、碳酸氢钠、硫酸镁和微量元素。
进一步地限定，所述油脂为大豆油、花生油和棕榈油的任意一个或任意多个。
进一步地限定，所述培养基的成分如下：10g/L油脂、15.2g/L十二水合磷酸氢二钠、3g/L磷酸二氢钾、0.5g/L氯化钠、1g/L氯化铵、0.5g/L酵母粉、1g/L碳酸氢钠、0.5g/L硫酸镁和0.1％(v/v)微量元素。
进一步地限定，所述微量元素为：6.0g/L七水合硫酸亚铁，2.0g/L硼酸，2.0g/L四水合氯化锰，0.8g/L四水合钼酸铵，0.2g/L五水合硫酸铜。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌中乙酰辅酶A羧化酶的accB与accC亚基在pBBR1MCS-1质粒中共用同一个Plac启动子进行表达；丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR的N端MCR-N在pBBR1MCS-4质粒中使用Plac,P2-51启动子进行表达；丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR的C端MCR-C在pBBR1MCS-4质粒中使用Plac启动子进行表达；甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶的基因mcE与甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的基因mcM在pBBR1MCS-4质粒中，共用同一个Plac启动子进行表达；丙酰辅酶A合酶的基因pcs在pBBR1MCS-1质粒中使用Plac启动子进行表达；丙酰辅酶A羧化酶的基因pcc在pBBR1MCS-4质粒中使用Plac启动子进行表达。
有益效果：本发明以真养产碱杆菌H16为宿主菌，通过过表达关键基因乙酰辅酶A羧化酶基因accBC、丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr、丙酰辅酶A合酶基因pcs、丙酰辅酶A羧化酶基因pcc、甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶基因mcE、甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶基因mcM，获得工程菌。通过关键酶基因的表达调控，工程菌能够以油脂为唯一碳源，高效合成丁二酸。通过发酵优化，工程菌以棕榈油为碳源时，发酵48h，可以得到10.1g/L的丁二酸。
具体实施方式
下面通过实例来进一步阐明本发明。但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。
所用酶试剂购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自美国OMEGA公司，同源重组用的试剂盒为南京诺唯赞公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
培养基配方：
1)种子液摇瓶培养基
TSB培养基：15g/L胰蛋白胨、5g/L大豆蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl，其余为水，121℃，20min灭菌。
2)摇瓶发酵培养基
基本改良培养基：10g/L油脂，15.2g/L十二水合磷酸氢二钠，3g/L磷酸二氢钾，0.5g/L氯化钠，1g/L氯化铵，0.5g/L酵母粉，1g/L碳酸氢钠，0.5g/L硫酸镁，0.1％(v/v)微量元素。其中油脂可以为大豆油、花生油、棕榈油。
微量元素母液的配方：6.0g/L七水合硫酸亚铁，2.0g/L硼酸，2.0g/L四水合氯化锰，0.8g/L四水合钼酸铵，0.2g/L五水合硫酸铜。
在实际培养过程中，需要向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，添加的抗生素为终浓度100mg/L的氨苄青霉素和50mg/L氯霉素。
实施例1.载体pBBR1MCS-1-accBC-pcs的构建
(1)获取来源于大肠杆菌的乙酰辅酶A羧化酶基因accBC(各个亚基在NCBI中基因ID分别为accB:947758、accC:947761)，是以大肠杆菌的基因组为模板，通过PCR扩增获得，引物：5'-actaaagggaacaaaagctgggtaccgatggatattcgtaagattaaaaa-3'(SEQ ID NO.1)和5'-CTCGAGGGGGGGCCGGTACCTTATTTTTCCTGAAGACCGAGTTTTT-3'(SEQ ID NO.2)，然后利用回收试剂盒回收目的片段，获得accBC基因片段。
(2)将质粒pBBR1MCS-1利用KpnI进行酶切线性化，加入DpnI去甲基化后，回收产物，并与上述accBC基因片段，按照同源重组试剂盒中的步骤，利用同源重组的方式进行连接。
连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布在加有50mg/L氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pBBR1MCS-1-accBC后，然后通过测序方式鉴定。
(3)获取来源于橙色绿曲挠菌的丙酰辅酶A合酶基因pcs(在NCBI中蛋白的ID为AAL47820.2)，是以橙色绿曲挠菌的基因组为模板，通过PCR扩增获得(引物5’-atttcacacaggaaacagctatgatcgacactgcgccccttgc-3’(SEQ ID NO.3)和5’-TATAGGGCGAATTGGAGCTCCTACCGCTCGCCGGCCGTCCACGCC-3’(SEQ ID NO.4)，然后利用回收试剂盒回收目的片段，获得pcs基因片段。
(4)将质粒pBBR1MCS-1-accBC利用SacI进行酶切线性化，加入DpnI去甲基化后，回收产物，并与上述pcs基因片段，按照同源重组试剂盒中的步骤，利用同源重组的方式进行连接。连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布在加有50mg/L氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pBBR1MCS-1-accBC-pcs后，然后通过测序方式鉴定。
实施例2.丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR的拆分、突变与工程质粒的构建
(1)获取来源于橙色绿曲挠菌的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr(在NCBI中蛋白的ID为AAS20429.1)，是以橙色绿曲挠菌的基因组为模板，通过PCR扩增获得(引物：5'-atgggcagcagccatcaccatcatc-3'(SEQ ID NO.5)和5'-TTACACGGTAATCGCCCGTCCGCGAT-3'(SEQ ID NO.6))，然后利用回收试剂盒回收目的片段，获得mcr基因。
(2)mcr-N基因片段的获取：以上述mcr基因为模板，通过PCR进行扩增(引物：5'-ctttaagaaggagatataccatgggcagcagccatcaccatcatc-3'(SEQ ID NO.7)和5'-TTAAATGTTGGCAGGGATGTTGAGG-3'(SEQ ID NO.8))，然后利用回收试剂盒回收目的片段，获得mcr-N的基因片段(SEQ ID NO.9)。
(3)mcr-C基因片段的获取：以上述mcr基因为模板，通过PCR进行扩增(引物：5'-atttcacacaggaaacagctatgagcgccaccaccggcgcacgca-3'(SEQ ID NO.10)和5'-CCCCCGGGCTGCAGGAATTCTTACACGGTAATCGCCCGTCCGCGA-3'(SEQ ID NO.11))，然后利用回收试剂盒回收目的片段，获得mcr-C基因片段(SEQ ID NO.12)。
(4)以基因合成的方式获取Plac启动子序列，Plac启动子序列为SEQ ID NO.13：taatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcaca caggaaacagct
(5)将Plac与mcr-C基因片段利用搭桥PCR的方式进行连接，搭桥引物序列为5'-gataagcttgatatcgaattctaatgtgagttagctcactcattag-3'(SEQ ID NO.14)和5'-CCCCCGGGCTGCAGGAATTCTTACACGGTAATCGCCCGTCCGCGA-3'(SEQ ID NO.15)，然后通过胶回收的方式，获得Plac-mcr-C基因片段。
(6)将质粒pBBR1MCS-4利用EcoRI进行酶切线性化，加入DpnI去甲基化后，回收产物，并与上述Plac-mcrC基因片段，按照同源重组试剂盒中的步骤，利用同源重组的方式进行连接。
连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布在加有100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pBBR1MCS-4-Plac-mcrC后，然后通过测序方式鉴定。
(7)以质粒pBBR1MCS-4-Plac-mcrC为模板，利用PCR进行反向扩增(引物：5'-accttgccgaccgcgtggtcagtggtgagacat-3(SEQ ID NO.16)'和5'-ATGTCTCACCACTGACCACGCGGTCGGCAAGGT-3'(SEQ ID NO.17))，扩增产物经DpnI去甲基化后，回收产物，并转化E.coli DH5α，然后涂布在加有100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板上，然后通过测序方式鉴定阳性克隆，获得pBBR1MCS-4-Plac-mcrC(N940V)质粒。
(8)以pBBR1MCS-4-Plac-mcrC(N940V)质粒为模板，利用PCR进行反向扩增(引物：5'-ttccgggtagcgcgctggattgccctgagtga-3'(SEQ ID NO.18)和5'-TCACTCAGGGCAATCCAGCGCGCTACCCGGAA-3'(SEQ ID NO.19))，扩增产物经DpnI去甲基化后，回收产物，并转化E.coliDH5α，然后涂布在加有100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板上，然后通过测序方式鉴定阳性克隆，获得pBBR1MCS-4-Plac-mcrC(N940V/K1106W)质粒。
(9)以pBBR1MCS-4-Plac-mcrC(N940V/K1106W)质粒为模板，利用PCR进行反向扩增(引物：5'-ctgagtgatggtgcccgtctcgcgctggtca-3'(SEQ ID NO.20)和5'-TGACCAGCGCGAGACGGGCACCATCACTCAG-3'(SEQ ID NO.21))，扩增产物经DpnI去甲基化后，回收产物，并转化E.coli DH5α，然后涂布在加有100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板上，然后通过测序方式鉴定阳性克隆，获得pBBR1MCS-4-Plac-mcrC(N940V/K1106W/S1114R)质粒。
(10)以基因合成的方式获取Plac,P2-51启动子序列，Plac,P2-51启动子序列为SEQ IDNO.22gatatcgaattcactttacactttaagcttcatatgtttatgttgtgtggaagagctcgggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacc
(11)将Plac,P2-51与mcr-N基因片段利用搭桥PCR的方式进行连接，搭桥引物序列为5'-gtcgacggtatcgataagcttgatatcgaattcactttacacttta-3'(SEQ ID NO.23)和5'-TGAGTGAGCTAACTCACATTATTAAATGTTGGCAGGGATGTTGAGG-3'(SEQ ID NO.24)，然后通过胶回收的方式，获得Plac,P2-51-mcrN基因片段。
(12)将pBBR1MCS-4-Plac-mcrC(N940V/K1106W/S1114R)质粒利用HindIII进行酶切线性化，加入DpnI去甲基化后，回收产物，并与上述Plac,P2-51-mcrN基因片段，按照同源重组试剂盒中的步骤，利用同源重组的方式进行连接。连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布在加有100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pBBR1MCS-4-Plac,P2-51-mcrN-Plac-mcrC(N940V/K1106W/S1114R)后，然后通过测序方式鉴定。
实现丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR被拆分为两部分MCR-N与MCR-C。其中MCR-N包括第1-549个氨基酸残基部分；MCR-C包括第550-1219个氨基酸残基部分。其中将MCR的第940位的天冬酰胺残基突变为缬氨酸残基，第1106位的赖氨酸残基突变为色氨酸残基，第1114位的丝氨酸残基突变为精氨酸残基。
实施例3.丙酰辅酶A羧化酶PCC的突变与工程质粒的构建
(1)获取来源于橙色绿曲挠菌的丙酰辅酶A羧化酶基因pcc(在NCBI中基因ID为1100367)，是以橙色绿曲挠菌的基因组为模板，通过PCR扩增获得(引物5'-tttcacacaggaaacagctatgaacgaacatatggatcatttct-3'(SEQ ID NO.25)和5'-TGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTTTACAGCGGAATATTGCCATGTTTC-3'(SEQ ID NO.26))，再利用回收试剂盒回收目的片段，获得pcc基因片段。
(2)将Plac与pcc基因片段利用搭桥PCR的方式进行连接，搭桥引物序列为5'-cagcccgggggatccactagttaatgtgagttagctcactca-3'(SEQ ID NO.27)和5'-CCCCCGGGCTGCAGGAATTCTTACACGGTAATCGCCCGTCCGCGA-3'(SEQ ID NO.28)，然后通过胶回收的方式，获得Plac-pcc基因片段。
(3)将pBBR1MCS-4-Plac-mcrC(N940V/K1106W/S1114R)质粒利用SpeI进行酶切线性化，加入DpnI去甲基化后，回收产物，并与上述Plac-pcc基因片段，按照同源重组试剂盒中的步骤，利用同源重组的方式进行连接。连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布在加有100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pBBR1MCS-4-Plac-pcc-Plac,P2-51-mcrN-Plac-mcrC(N940V/K1106W/S1114R)后，然后通过测序方式鉴定。
(4)以质粒pBBR1MCS-4-Plac-pcc-Plac,P2-51-mcrN-Plac-mcrC(N940V/K1106W/S1114R)为模板，利用PCR进行反向扩增(引物：5'-ATAATGCAGTGAGTGGTATTGCACATTTTAGCG-3'(SEQ IDNO.29)和5'-ATACCACTCACTGCATTATGAATACCTGCGCC-3'(SEQ ID NO.30))，扩增产物经DpnI去甲基化后，回收产物，并转化E.coli DH5α，然后涂布在加有100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板上，然后通过测序方式鉴定阳性克隆，获得pBBR1MCS-4-Plac-pcc(N200I)-Plac,P2-51-mcrN-Plac-mcrC(N940V/K1106W/S1114R)质粒。
(5)以质粒pBBR1MCS-4-Plac-pcc(N200I)-Plac,P2-51-mcrN-Plac-mcrC(N940V/K1106W/S1114R)为模板，利用PCR进行反向扩增(引物：5'-GAAAGTTACCCTGATTACTCGCAAAGCCTATG-3'(SEQ IDNO.31)和5'-GTAATCAGGGTAACTTTCGGCACGGTTGCTTCT-3'(SEQ ID NO.32))，扩增产物经DpnI去甲基化后，回收产物，并转化E.coli DH5α，然后涂布在加有100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板上，然后通过测序方式鉴定阳性克隆，获得pBBR1MCS-4-Plac-pcc(N200I/I391T)-Plac,P2-51-mcrN-Plac-mcrC(N940V/K1106W/S1114R)质粒。
实现丙酰辅酶A羧化酶PCC进行突变，其中PCC的第220位的天冬酰胺突变为异亮氨酸，第391位的异亮氨酸突变为苏氨酸。
实施例4.甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶的基因mcE与甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的基因mcM的扩增与工程质粒构建
(1)获取来源于橙色绿曲挠菌的甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶基因mcE，是以橙色绿曲挠菌的基因组为模板，通过PCR扩增获得(引物5'-atgttcaccgctgttgaccacatcgg-3'(SEQ ID NO.33)和5'-AGCGATGTGGTGCATACCCGGACCTTTTTCACGCAGGAAA-3'(SEQ ID NO.34)，再利用回收试剂盒回收目的片段，获得甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶基因mcE。
(2)获取来源于橙色绿曲挠菌的甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶基因mcM，是以橙色绿曲挠菌的基因组为模板，通过PCR扩增获得(引物5'-gaaaaaggtccgggtatgcaccacatcgcttaccgtgttg-3(SEQ ID NO.35)'和5'-TTAAGCAGCAACACCTTTCAGACGT-3'(SEQ ID NO.36))，再利用回收试剂盒回收目的片段，获得甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶基因mcM。
(3)将上述甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶基因mcE与甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶基因mcM通过搭桥PCR的方式进行连接，(引物5'-atgttcaccgctgttgaccacatcgg-3'(SEQ IDNO.37)和5'-TTAAGCAGCAACACCTTTCAGACGT-3'(SEQ ID NO.38))，获得mcEM基因，并利用回收试剂盒回收目的片段。
(4)以pBBR1MCS-4-Plac-pcc(N200I/I391T)-Plac,P2-51-mcrN-Plac-mcrC(N940V/K1106W/S1114R)质粒为模板，利用PCR进行反向扩增(引物：5'-aggtgttgctgcttaaggtaccggccccccctcgaggtc-3'(SEQ ID NO.39)和5'-AACAGCGGTGAACATCGGTACCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGT-3'(SEQ IDNO.40)，扩增产物经DpnI去甲基化后，与mcEM基因按照同源重组试剂盒中的步骤，利用同源重组的方式进行连接。连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布在加有100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，获得工程质粒pBBR1MCS-4-Plac-mcEM-Plac-pcc(N200I/I391T)-Plac,P2-51-mcrN-Plac-mcrC(N940V/K1106W/S1114R)。
实施例5.能够利用油脂的工程菌株的构建及工程菌株以油脂为碳源合成丁二酸
(1)将实施例1与实施例4中获得的载体，利用电转方式导入真养产碱杆菌H16(许懿,陈荣辉,赖瑞华,等.真养产碱杆菌H16合成聚-β-羟基丁酸酯的培养基优化[J].厦门大学学报(自然科学版),2011,50(5):942-946.)细胞中，涂布在含有100mg/L氨苄青霉素和50mg/L氯霉素的TSB固体平板上；涂布后的平板置于30℃恒温培养箱，继续培养至长出单克隆。
(2)将上述获得的单克隆，转接至含有5ml的TSB液体培养基的试管中，并在试管内添加终浓度为100mg/L的氨苄青霉素和50mg/L的氯霉素。试管在30℃摇床中220rpm培养20h后，按照1:50的比例接种到含有100mL的基本改良液体培养基(10g/L大豆油，15.2g/L十二水合磷酸氢二钠，3g/L磷酸二氢钾，0.5g/L氯化钠，1g/L氯化铵，0.5g/L酵母粉，1g/L碳酸氢钠，0.5g/L硫酸镁，0.1％(v/v)微量元素)的250mL摇瓶中，并在摇瓶内添加终浓度为100mg/L的氨苄青霉素、50mg/L的氯霉素、40mg/L的生物素、50μM的IPTG，30℃、220rpm条件下进行培养。每隔12h添加1g/L的碳酸氢钠、40mg/L的生物素，每隔24h添加50μM的IPTG，48h终止发酵。可以得到10.1g/L的丁二酸。
以10g/L花生油，15.2g/L十二水合磷酸氢二钠，3g/L磷酸二氢钾，0.5g/L氯化钠，1g/L氯化铵，0.5g/L酵母粉，1g/L碳酸氢钠，0.5g/L硫酸镁，0.1％(v/v)微量元素为基本改良液体培养基，可以得到8.4g/L的丁二酸。
以10g/L棕榈油，15.2g/L十二水合磷酸氢二钠，3g/L磷酸二氢钾，0.5g/L氯化钠，1g/L氯化铵，0.5g/L酵母粉，1g/L碳酸氢钠，0.5g/L硫酸镁，0.1％(v/v)微量元素为基本改良液体培养基，可以得到9.1g/L的丁二酸。
对比例1.
重组菌是以真养产碱杆菌为出发菌株，在该菌株中利用pBBR1MCS-1质粒过表达乙酰辅酶A羧化酶的基因accBC、丙酰辅酶A合酶的基因pcs；利用pBBR1MCS-4质粒过表达丙二酸单酰辅酶A还原酶的基因mcr、丙酰辅酶A羧化酶的基因pcc、甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶的基因mcE、甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的基因mcM，得到重组菌。
编码乙酰辅酶A羧化酶的基因accBC的不同亚基在NCBI中基因ID分别为accB:947758、accC:947761；丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR在NCBI中的蛋白质ID为AAS20429.1(基因序列为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12)；丙酰辅酶A合酶Pcs在NCBI中的蛋白质ID为AAL47820.2(基因序列为SEQ ID NO.43)；编码丙酰辅酶A羧化酶的基因pcc在NCBI中的基因ID为1100367(基因序列为SEQ ID NO.41)；甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶McE在NCBI中的蛋白质ID为ACL23899.1(基因序列为SEQ ID NO.42)；编码甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的基因mcM在NCBI中的基因ID为5826972。
在以大豆油为碳源时，重组菌发酵：
丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR和丙酰辅酶A羧化酶PCC均不突变，丁二酸产量为5.7g/L。
丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR突变，丙酰辅酶A羧化酶PCC不突变时，丁二酸产量为8.7g/L。
丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR不突变，丙酰辅酶A羧化酶PCC突变时，丁二酸产量为6.9g/L。
对比例2.
以葡萄糖为碳源时，重组菌发酵，丁二酸产量为3.75g/L。
重组菌也可以以葡萄糖为碳源，但是本实验是有氧发酵。在有氧发酵条件下，每分子葡萄糖的氧化过程会释放两分子CO2，而油脂的氧化过程，不存在碳损失。所以以油脂为碳源时，碳原子经济性最好。
SEQ ID NO.1
actaaagggaacaaaagctgggtaccgatggatattcgtaagattaaaaa
SEQ ID NO.2
CTCGAGGGGGGGCCGGTACCTTATTTTTCCTGAAGACCGAGTTTTT
SEQ ID NO.3
Atttcacacaggaaacagctatgatcgacactgcgccccttgc
SEQ ID NO.4
TATAGGGCGAATTGGAGCTCCTACCGCTCGCCGGCCGTCCACGCC
SEQ ID NO.5
Atgggcagcagccatcaccatcatc
SEQ ID NO.6
TTACACGGTAATCGCCCGTCCGCGAT
SEQ ID NO.7
ctttaagaaggagatataccatgggcagcagccatcaccatcatc
SEQ ID NO.8
TTAAATGTTGGCAGGGATGTTGAGG
SEQ ID NO.9
atgggcagcagccatcaccatcatcaccacagccaggatccgagcggaacaggacgactggcaggaaagattgcgttaattaccggtggcgccggcaatatcggcagtgaattgacacgtcgctttctcgcagagggagcgacggtcattattagtggacggaatcgggcgaagttgaccgcactggccgaacggatgcaggcagaggcaggagtgccggcaaagcgcatcgatctcgaagtcatggatgggagtgatccggtcgcggtacgtgccggtatcgaagcgattgtggcccgtcacggccagatcgacattctggtcaacaatgcaggaagtgccggtgcccagcgtcgtctggccgagattccactcactgaagctgaattaggccctggcgccgaagagacgcttcatgccagcatcgccaatttacttggtatgggatggcatctgatgcgtattgcggcacctcatatgccggtaggaagtgcggtcatcaatgtctcgaccatcttttcacgggctgagtactacgggcggattccgtatgtcacccctaaagctgctcttaatgctctatctcaacttgctgcgcgtgagttaggtgcacgtggcatccgcgttaatacgatctttcccggcccgattgaaagtgatcgcatccgtacagtgttccagcgtatggatcagctcaaggggcggcccgaaggcgacacagcgcaccattttttgaacaccatgcgattgtgtcgtgccaacgaccagggcgcgcttgaacgtcggttcccctccgtcggtgatgtggcagacgccgctgtctttctggccagtgccgaatccgccgctctctccggtgagacgattgaggttacgcacggaatggagttgccggcctgcagtgagaccagcctgctggcccgtactgatctgcgcacgattgatgccagtggccgcacgacgctcatctgcgccggcgaccagattgaagaggtgatggcgctcaccggtatgttgcgtacctgtgggagtgaagtgatcatcggcttccgttcggctgcggcgctggcccagttcgagcaggcagtcaatgagagtcggcggctggccggcgcagactttacgcctcccattgccttgccactcgatccacgcgatccggcaacaattgacgctgtcttcgattgggccggcgagaataccggcgggattcatgcagcggtgattctgcctgctaccagtcacgaaccggcaccgtgcgtgattgaggttgatgatgagcgggtgctgaattttctggccgatgaaatcaccgggacaattgtgattgccagtcgcctggcccgttactggcagtcgcaacggcttacccccggcgcacgtgcgcgtgggccgcgtgtcatttttctctcgaacggtgccgatcaaaatgggaatgtttacggacgcattcaaagtgccgctatcggtcagctcattcgtgtgtggcgtcacgaggctgaacttgactatcagcgtgccagcgccgccggtgatcatgtgctgccgccggtatgggccaatcagattgtgcgcttcgctaaccgcagccttgaagggttagaatttgcctgtgcctggacagctcaattgctccatagtcaacgccatatcaatgagattaccctcaacatccctgccaacatttaa
SEQ ID NO.10
atttcacacaggaaacagctatgagcgccaccaccggcgcacgca
SEQ ID NO.11
CCCCCGGGCTGCAGGAATTCTTACACGGTAATCGCCCGTCCGCGA
SEQ ID NO.12
atgagcgccaccaccggcgcacgcagtgcatcggtcggatgggcggaaagcctgatcgggttgcatttggggaaagttgccttgattaccggtggcagcgccggtattggtgggcagatcgggcgcctcctggctttgagtggcgcgcgcgtgatgctggcagcccgtgatcggcataagctcgaacagatgcaggcgatgatccaatctgagctggctgaggtggggtataccgatgtcgaagatcgcgtccacattgcaccgggctgcgatgtgagtagcgaagcgcagcttgcggatcttgttgaacgtaccctgtcagcttttggcaccgtcgattatctgatcaacaacgccgggatcgccggtgtcgaagagatggttatcgatatgccagttgagggatggcgccataccctcttcgccaatctgatcagcaactactcgttgatgcgcaaactggcgccgttgatgaaaaaacagggtagcggttacatccttaacgtctcatcatactttggcggtgaaaaagatgcggccattccctaccccaaccgtgccgattacgccgtctcgaaggctggtcagcgggcaatggccgaagtctttgcgcgcttccttggcccggagatacagatcaatgccattgcgccgggtccggtcgaaggtgatcgcttgcgcggtaccggtgaacgtcccggcctctttgcccgtcgggcgcggctgattttggagaacaagcggctgaatgagcttcacgctgctcttatcgcggctgcgcgcaccgatgagcgatctatgcacgaactggttgaactgctcttacccaatgatgtggccgcactagagcagaatcccgcagcacctaccgcgttgcgtgaactggcacgacgttttcgcagcgaaggcgatccggcggcatcatcaagcagtgcgctgctgaaccgttcaattgccgctaaattgctggctcgtttgcataatggtggctatgtgttgcctgccgacatctttgcaaacctgccaaacccgcccgatcccttcttcacccgagcccagattgatcgcgaggctcgcaaggttcgtgacggcatcatggggatgctctacctgcaacggatgccgactgagtttgatgtcgcaatggccaccgtctattaccttgccgaccgcgtggtcagtggtgagacattccacccatcaggtggtttgcgttacgaacgcacccctaccggtggcgaactcttcggcttgccctcaccggaacggctggcggagctggtcggaagcacggtctatctgataggtgaacatctgactgaacaccttaacctgcttgcccgtgcgtacctcgaacgttacggggcacgtcaggtagtgatgattgttgagacagaaaccggggcagagacaatgcgtcgcttgctccacgatcacgtcgaggctggtcggctgatgactattgtggccggtgatcagatcgaagccgctatcgaccaggctatcactcgctacggtcgcccagggccggtcgtctgtacccccttccggccactgccgacggtaccactggtcgggcgtaaagacagtgactggagcacagtgttgagtgaggctgaatttgccgagttgtgcgaacaccagctcacccaccatttccgggtagcgcgctggattgccctgagtgatggtgcccgtctcgcgctggtcactcccgaaactacggctacctcaactaccgagcaatttgctctggctaacttcatcaaaacgacccttcacgcttttacggctacgattggtgtcgagagcgaaagaactgctcagcgcattctgatcaatcaagtcgatctgacccggcgtgcgcgtgccgaagagccgcgtgatccgcacgagcgtcaacaagaactggaacgttttatcgaggcagtcttgctggtcactgcaccactcccgcctgaagccgatacccgttacgccgggcggattcatcgcggacgggcgattaccgtgtaa
SEQ ID NO.13
taatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagct
SEQ ID NO.14
gataagcttgatatcgaattctaatgtgagttagctcactcattag
SEQ ID NO.15
CCCCCGGGCTGCAGGAATTCTTACACGGTAATCGCCCGTCCGCGA
SEQ ID NO.16
accttgccgaccgcgtggtcagtggtgagacat
SEQ ID NO.17
ATGTCTCACCACTGACCACGCGGTCGGCAAGGT
SEQ ID NO.18
ttccgggtagcgcgctggattgccctgagtga
SEQ ID NO.19
TCACTCAGGGCAATCCAGCGCGCTACCCGGAA
SEQ ID NO.20
ctgagtgatggtgcccgtctcgcgctggtca
SEQ ID NO.21
TGACCAGCGCGAGACGGGCACCATCACTCAG
SEQ ID NO.22
gatatcgaattcactttacactttaagcttcatatgtttatgttgtgtggaagagctcgggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacc
SEQ ID NO.23
gtcgacggtatcgataagcttgatatcgaattcactttacacttta
SEQ ID NO.24
TGAGTGAGCTAACTCACATTATTAAATGTTGGCAGGGATGTTGAGG
SEQ ID NO.25
tttcacacaggaaacagctatgaacgaacatatggatcatttct
SEQ ID NO.26
TGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTTTACAGCGGAATATTGCCATGTTTC
SEQ ID NO.27
cagcccgggggatccactagttaatgtgagttagctcactca
SEQ ID NO.28
CCCCCGGGCTGCAGGAATTCTTACACGGTAATCGCCCGTCCGCGA
SEQ ID NO.29
ATAATGCAGTGAGTGGTATTGCACATTTTAGCG
SEQ ID NO.30
ATACCACTCACTGCATTATGAATACCTGCGCC
SEQ ID NO.31
GAAAGTTACCCTGATTACTCGCAAAGCCTATG
SEQ ID NO.32
GTAATCAGGGTAACTTTCGGCACGGTTGCTTCT
SEQ ID NO.33
atgttcaccgctgttgaccacatcgg
SEQ ID NO.34
AGCGATGTGGTGCATACCCGGACCTTTTTCACGCAGGAAA
SEQ ID NO.35
gaaaaaggtccgggtatgcaccacatcgcttaccgtgttg
SEQ ID NO.36
TTAAGCAGCAACACCTTTCAGACGT
SEQ ID NO.37
atgttcaccgctgttgaccacatcgg
SEQ ID NO.38
TTAAGCAGCAACACCTTTCAGACGT
SEQ ID NO.39
aggtgttgctgcttaaggtaccggccccccctcgaggtc
SEQ ID NO.40
AACAGCGGTGAACATCGGTACCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGT
SEQ ID NO.41
atgaacgaacatatggatcatttctacaccaaacgtaaacaggcagaagaaggtggcggccgtgaaaaactggcacagcagcgtcagaaaggtaaactgaccgcccgcgaacgcattatttttctgctggatcaggatagttttattgaactgcatccgtttatggaaagccaggtgctgacccgtgaacagcgtatgctgggtgacggtgttgttaccggttatggtaccattgatggtcgcagcgtttatgtttttgcacaggattttaccgtgtatggtggtgccctgggtgaaacccatgcccgcaaaatttgcgcactgatggatctggccgccaaaaataaggcaccgattattggtctgaatgatagcggtggtgcccgtattcaggaaggtgttctgagcctggatggttatggccatattttctatcgtaatgttctgtatagcggtgttattccgcagattagcgttattctgggtccgtgtgcaggcggtgccgtttatagcccggccctgaccgattttatttttatggccgaacagaccggtcgtatgtttattaccggcccgaaagttattgaaaaagttaccggtgaacaggtggatgccgaaagtctgggcggcgcaggtattcataatgcagtgagtggtattgcacattttagcggccataccgaaaaagaagttctgaccggtgtgcgtaaactgctgagttatctgccgctgaatggccgtaccaccgaaccgaaaccggaaaaagaagcaagccgtccgctgctgaatcgtctggttccggccgataccaccaaaccgtatgatgtgcgtaaagttattcgcgaactggccgatccgcagagctttttcgaaattcagccgtttttcgcaaaaaatattgttattggtttcgcacgtctgggtgaaaaagccattggtattgtggcaagtcagccgaaacatctggcaggtagtctgaccattgatgccgcagataaagcagcacgttttattcgtttttgtgatgcatttgatatcccgctgctgaccgtggaagatgtgccgggttttctgccgggcattcagcaggaacataatggtattattcgccatggcgcaaaactgctgtttgcctatgcagaagcaaccgtgccgaaagttaccctgattactcgcaaagcctatggtggcgcatatgtggccatgaatagcaaagccattggcgccgatctggtttttgcctggccgaatgccgaaattgcagttatgggtccggaaggtgcagcaagcattctgtatgaaaaagaaattaaggccagcgccgatccgcaaaaaaccaaacgtgaaaaaaccgcagaatataaaaagcagaatgcaggcccgtataaagcagccgcatgcggcatggtggatgatattattctgccggaagaaagtcgcggtcgtctgattcaggcatttcatatgctgacccataaaaccgaagaacgtccgaaaaagaaacatggcaatattccgctgtaa
SEQ ID NO.42
Atgttcaccgctgttgaccacatcggtctggttgttgctgacctggaatctgctatcgacttctaccgtaccgctttcgacgttaccgaatgggaacgtatcgaactgccggaacgtcacgctgctatcggtgttgctcgtttcggtgacaccctgatagaactgatagctccgacctctgaccaggcttctttcgctcgtttcctgcgtgaaaaaggtccgggttaa
SEQ ID NO.43
atgatcgacactgcgccccttgccccaccacgggcgccccgctctaatccgattcgggatcgagttgattgggaagctcagcgcgctgctgcgctggcagatcccggtgcctttcatggcgcgattgcccggacagttatccactggtacgacccacaacaccattgctggattcgcttcaacgagtctagtcagcgttgggaagggctggatgccgctaccggtgcccctgtaacggtagactatcccgccgattatcagccctggcaacaggcgtttgatgatagtgaagcgccgttttaccgctggtttagtggtgggttgacaaatgcctgctttaatgaagtagaccggcatgtcacgatgggctatggcgacgaggtggcctactactttgaaggtgaccgctgggataactcgctcaacaatggtcgtggtggtccggttgtccaggagacaatcacgcggcggcgcctgttggtggaggtggtgaaggctgcgcaggtgttgcgtgatctgggcctgaagaagggtgatcggattgctctgaatatgccgaatattatgccgcagatttattatacggaagcggcaaaacgactgggtattctgtacacgccggtcttcggtggcttctcggacaagactctttccgaccgtattcacaatgccggtgcacgagtggtgattacctctgatggtgcgtaccgcaacgcgcaggtggtgccctacaaagaagcgtataccgatcaggcgctcgataagtatattccggttgagacggcgcaggcgattgttgcgcagaccctggccaccttgcccctgactgagtcgcagcgccagacgatcatcaccgaagtggaggccgcactggccggtgagattacggttgagcgctcggacgtgatgcgtggggttggttctgccctcgcaaagctccgcgatcttgatgcaagcgtgcaggcaaaggtgcgtacagtactggcgcaggcgctggtcgagtcgccgccgcgggttgaagctgtggtggttgtgcgtcataccggtcaggagattttgtggaacgaggggcgagatcgctggagtcacgacttgctggatgctgcgctggcgaagattctggccaatgcgcgtgctgccggctttgatgtgcacagtgagaatgatctgctcaatctccccgatgaccagcttatccgtgcgctctacgccagtattccctgtgaaccggttgatgctgaatatccgatgtttatcatttacacatcgggtagcaccggtaagcccaagggtgtgatccacgttcacggcggttatgtcgccggtgtggtgcacaccttgcgggtcagttttgacgccgagccgggtgatacgatatatgtgatcgccgatccgggctggatcaccggtcagagctatatgctcacagccacaatggccggtcggctgaccggggtgattgccgagggatcaccgctcttcccctcagccgggcgttatgccagcatcatcgagcgctatggggtgcagatctttaaggcgggtgtgaccttcctcaagacagtgatgtccaatccgcagaatgttgaagatgtgcgactctatgatatgcactcgctgcgggttgcaaccttctgcgccgagccggtcagtccggcggtgcagcagtttggtatgcagatcatgaccccgcagtatatcaattcgtactgggcgaccgagcacggtggaattgtctggacgcatttctacggtaatcaggacttcccgcttcgtcccgatgcccatacctatcccttgccctgggtgatgggtgatgtctgggtggccgaaactgatgagagcgggacgacgcgctatcgggtcgctgatttcgatgagaagggcgagattgtgattaccgccccgtatccctacctgacccgcacactctggggtgatgtgcccggtttcgaggcgtacctgcgcggtgagattccgctgcgggcctggaagggtgatgccgagcgtttcgtcaagacctactggcgacgtgggccaaacggtgaatggggctatatccagggtgattttgccatcaagtaccccgatggtagcttcacgctccacggacgctctgacgatgtgatcaatgtgtcgggccaccgtatgggcaccgaggagattgagggtgccattttgcgtgaccgccagatcacgcccgactcgcccgtcggtaattgtattgtggtcggtgcgccgcaccgtgagaagggtctgaccccggttgccttcattcaacctgcgcctggccgtcatctgaccggcgccgaccggcgccgtctcgatgagctggtgcgtaccgagaagggggcggtcagtgtcccagaggattacatcgaggtcagtgcctttcccgaaacccgcagcgggaagtatatgcggcgctttttgcgcaatatgatgctcgatgaaccactgggtgatacgacgacgttgcgcaatcctgaagtgctcgaagagattgcagccaagatcgctgagtggaaacgccgtcagcgtatggccgaagagcagcagatcatcgaacgctatcgctacttccggatcgagtatcacccaccaacggccagtgcgggtaaactcgcggtagtgacggtgacaaatccgccggtgaacgcactgaatgagcgtgcgctcgatgagttgaacacaattgttgaccacctggcccgtcgtcaggatgttgccgcaattgtcttcaccggacagggcgccaggagttttgtcgccggcgctgatattcgccagttgctcgaagagattcatacggttgaagaggcaatggccctgccgaataacgcccatcttgctttccgcaagattgagcgtatgaataagccgtgtatcgcggcgatcaacggtgtggcgctcggtggtggtctggaattcgccatggcctgccattaccgggttgccgatgtctatgccgaattcggtcagccagagattaatctgcgcttgctacctggttatggtggcacgcagcgcttgccgcgcctgttgtacaagcgcaacaacggcaccggtctgctccgagcgctggagatgattctgggtgggcgtagcgtaccggctgatgaggcgctggagctgggtctgatcgatgccattgctaccggcgatcaggactcactgtcgctggcatgcgcgttagcccgtgccgcaatcggcgccgatggtcagttgatcgagtcggctgcggtgacccaggctttccgccatcgccacgagcagcttgacgagtggcgcaaaccagacccgcgctttgccgatgacgaactgcgctcgattatcgcccatccacgtatcgagcggattatccggcaggcccataccgttgggcgcgatgcggcagtgcatcgggcactggatgcaatccgctatggcattatccacggcttcgaggccggtctggagcacgaggcgaagctctttgccgaggcagtggttgacccgaacggtggcaagcgtggtattcgcgagttcctcgaccgccagagtgcgccgttgccaacccgccgaccattgattacacctgaacaggagcaactcttgcgcgatcagaaagaactgttgccggttggttcacccttcttccccggtgttgaccggattccgaagtggcagtacgcgcaggcggttattcgtgatccggacaccggtgcggcggctcacggcgatcccatcgtggctgaaaagcagattattgtgccggtggaacgcccccgcgccaatcaggcgctgatctatgttctggcctcggaggtgaacttcaacgatatctgggcgattaccggtattccggtgtcacggtttgatgagcacgaccgcgactggcacgttaccggttcaggtggcatcggcctgatcgttgcgctgggtgaagaggcgcgacgcgaaggccggctgaaggtgggtgatctggtggcgatctactccgggcagtcggatctgctctcaccgctgatgggccttgatccgatggccgccgatttcgtcatccaggggaacgacacgccagatggatcgcatcagcaatttatgctggcccaggccccgcagtgtctgcccatcccaaccgatatgtctatcgaggcagccggcagctacatcctcaatctcggtacgatctatcgcgccctctttacgacgttgcaaatcaaggccggacgcaccatctttatcgagggtgcggcgaccggtaccggtctggacgcagcgcgctcggcggcccggaatggtctgcgcgtaattggaatggtcagttcgtcgtcacgtgcgtctacgctgctggctgcgggtgcccacggtgcgattaaccgtaaagacccggaggttgccgattgtttcacgcgcgtgcccgaagatccatcagcctgggcagcctgggaagccgccggtcagccgttgctggcgatgttccgggcgcagaacgacgggcgactggccgattatgtggtctcgcacgcgggcgagacggccttcccgcgcagtttccagcttctcggcgagccacgcgatggtcacattccgacgctcacattctacggtgccaccagtggctaccacttcaccttcctgggtaagccagggtcagcttcgccgaccgagatgctgcggcgggccaatctccgcgccggtgaggcggtgttgatctactacggggttgggagcgatgacctggtagataccggcggtctggaggctatcgaggcggcgcggcaaatgggagcgcggatcgtcgtcgttaccgtcagcgatgcgcaacgcgagtttgtcctctcgttgggcttcggggctgccctacgtggtgtcgtcagcctggcggaactcaaacggcgcttcggcgatgagtttgagtggccgcgcacgatgccgccgttgccgaacgcccgccaggacccgcagggtctgaaagaggctgtccgccgcttcaacgatctggtcttcaagccgctaggaagcgcggtcggtgtcttcttgcggagtgccgacaatccgcgtggctaccccgatctgatcatcgagcgggctgcccacgatgcactggcggtgagcgcgatgctgatcaagcccttcaccggacggattgtctacttcgaggacattggtgggcggcgttactccttcttcgcaccgcaaatctgggtgcgccagcgccgcatctacatgccgacggcacagatctttggtacgcacctctcaaatgcgtatgaaattctgcgtctgaatgatgagatcagcgccggtctgctgacgattaccgagccggcagtggtgccgtgggatgaactacccgaagcacatcaggcgatgtgggaaaatcgccacacggcggccacttatgtggtgaatcatgccttaccacgtctcggcctaaagaacagggacgagctgtacgaggcgtggacggccggcgagcggtag
SEQUENCE LISTING
<110> 山东理工大学
<120> 一种利用油脂合成丁二酸的重组菌及其构建方法与应用
<130>
<160> 43
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
actaaaggga acaaaagctg ggtaccgatg gatattcgta agattaaaaa 50
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ctcgaggggg ggccggtacc ttatttttcc tgaagaccga gttttt 46
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
atttcacaca ggaaacagct atgatcgaca ctgcgcccct tgc 43
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tatagggcga attggagctc ctaccgctcg ccggccgtcc acgcc 45
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
atgggcagca gccatcacca tcatc 25
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
ttacacggta atcgcccgtc cgcgat 26
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcacca tcatc 45
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
ttaaatgttg gcagggatgt tgagg 25
<210> 9
<211> 1689
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
atgggcagca gccatcacca tcatcaccac agccaggatc cgagcggaac aggacgactg 60
gcaggaaaga ttgcgttaat taccggtggc gccggcaata tcggcagtga attgacacgt 120
cgctttctcg cagagggagc gacggtcatt attagtggac ggaatcgggc gaagttgacc 180
gcactggccg aacggatgca ggcagaggca ggagtgccgg caaagcgcat cgatctcgaa 240
gtcatggatg ggagtgatcc ggtcgcggta cgtgccggta tcgaagcgat tgtggcccgt 300
cacggccaga tcgacattct ggtcaacaat gcaggaagtg ccggtgccca gcgtcgtctg 360
gccgagattc cactcactga agctgaatta ggccctggcg ccgaagagac gcttcatgcc 420
agcatcgcca atttacttgg tatgggatgg catctgatgc gtattgcggc acctcatatg 480
ccggtaggaa gtgcggtcat caatgtctcg accatctttt cacgggctga gtactacggg 540
cggattccgt atgtcacccc taaagctgct cttaatgctc tatctcaact tgctgcgcgt 600
gagttaggtg cacgtggcat ccgcgttaat acgatctttc ccggcccgat tgaaagtgat 660
cgcatccgta cagtgttcca gcgtatggat cagctcaagg ggcggcccga aggcgacaca 720
gcgcaccatt ttttgaacac catgcgattg tgtcgtgcca acgaccaggg cgcgcttgaa 780
cgtcggttcc cctccgtcgg tgatgtggca gacgccgctg tctttctggc cagtgccgaa 840
tccgccgctc tctccggtga gacgattgag gttacgcacg gaatggagtt gccggcctgc 900
agtgagacca gcctgctggc ccgtactgat ctgcgcacga ttgatgccag tggccgcacg 960
acgctcatct gcgccggcga ccagattgaa gaggtgatgg cgctcaccgg tatgttgcgt 1020
acctgtggga gtgaagtgat catcggcttc cgttcggctg cggcgctggc ccagttcgag 1080
caggcagtca atgagagtcg gcggctggcc ggcgcagact ttacgcctcc cattgccttg 1140
ccactcgatc cacgcgatcc ggcaacaatt gacgctgtct tcgattgggc cggcgagaat 1200
accggcggga ttcatgcagc ggtgattctg cctgctacca gtcacgaacc ggcaccgtgc 1260
gtgattgagg ttgatgatga gcgggtgctg aattttctgg ccgatgaaat caccgggaca 1320
attgtgattg ccagtcgcct ggcccgttac tggcagtcgc aacggcttac ccccggcgca 1380
cgtgcgcgtg ggccgcgtgt catttttctc tcgaacggtg ccgatcaaaa tgggaatgtt 1440
tacggacgca ttcaaagtgc cgctatcggt cagctcattc gtgtgtggcg tcacgaggct 1500
gaacttgact atcagcgtgc cagcgccgcc ggtgatcatg tgctgccgcc ggtatgggcc 1560
aatcagattg tgcgcttcgc taaccgcagc cttgaagggt tagaatttgc ctgtgcctgg 1620
acagctcaat tgctccatag tcaacgccat atcaatgaga ttaccctcaa catccctgcc 1680
aacatttaa 1689
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
atttcacaca ggaaacagct atgagcgcca ccaccggcgc acgca 45
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
cccccgggct gcaggaattc ttacacggta atcgcccgtc cgcga 45
<210> 12
<211> 2016
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
atgagcgcca ccaccggcgc acgcagtgca tcggtcggat gggcggaaag cctgatcggg 60
ttgcatttgg ggaaagttgc cttgattacc ggtggcagcg ccggtattgg tgggcagatc 120
gggcgcctcc tggctttgag tggcgcgcgc gtgatgctgg cagcccgtga tcggcataag 180
ctcgaacaga tgcaggcgat gatccaatct gagctggctg aggtggggta taccgatgtc 240
gaagatcgcg tccacattgc accgggctgc gatgtgagta gcgaagcgca gcttgcggat 300
cttgttgaac gtaccctgtc agcttttggc accgtcgatt atctgatcaa caacgccggg 360
atcgccggtg tcgaagagat ggttatcgat atgccagttg agggatggcg ccataccctc 420
ttcgccaatc tgatcagcaa ctactcgttg atgcgcaaac tggcgccgtt gatgaaaaaa 480
cagggtagcg gttacatcct taacgtctca tcatactttg gcggtgaaaa agatgcggcc 540
attccctacc ccaaccgtgc cgattacgcc gtctcgaagg ctggtcagcg ggcaatggcc 600
gaagtctttg cgcgcttcct tggcccggag atacagatca atgccattgc gccgggtccg 660
gtcgaaggtg atcgcttgcg cggtaccggt gaacgtcccg gcctctttgc ccgtcgggcg 720
cggctgattt tggagaacaa gcggctgaat gagcttcacg ctgctcttat cgcggctgcg 780
cgcaccgatg agcgatctat gcacgaactg gttgaactgc tcttacccaa tgatgtggcc 840
gcactagagc agaatcccgc agcacctacc gcgttgcgtg aactggcacg acgttttcgc 900
agcgaaggcg atccggcggc atcatcaagc agtgcgctgc tgaaccgttc aattgccgct 960
aaattgctgg ctcgtttgca taatggtggc tatgtgttgc ctgccgacat ctttgcaaac 1020
ctgccaaacc cgcccgatcc cttcttcacc cgagcccaga ttgatcgcga ggctcgcaag 1080
gttcgtgacg gcatcatggg gatgctctac ctgcaacgga tgccgactga gtttgatgtc 1140
gcaatggcca ccgtctatta ccttgccgac cgcgtggtca gtggtgagac attccaccca 1200
tcaggtggtt tgcgttacga acgcacccct accggtggcg aactcttcgg cttgccctca 1260
ccggaacggc tggcggagct ggtcggaagc acggtctatc tgataggtga acatctgact 1320
gaacacctta acctgcttgc ccgtgcgtac ctcgaacgtt acggggcacg tcaggtagtg 1380
atgattgttg agacagaaac cggggcagag acaatgcgtc gcttgctcca cgatcacgtc 1440
gaggctggtc ggctgatgac tattgtggcc ggtgatcaga tcgaagccgc tatcgaccag 1500
gctatcactc gctacggtcg cccagggccg gtcgtctgta cccccttccg gccactgccg 1560
acggtaccac tggtcgggcg taaagacagt gactggagca cagtgttgag tgaggctgaa 1620
tttgccgagt tgtgcgaaca ccagctcacc caccatttcc gggtagcgcg ctggattgcc 1680
ctgagtgatg gtgcccgtct cgcgctggtc actcccgaaa ctacggctac ctcaactacc 1740
gagcaatttg ctctggctaa cttcatcaaa acgacccttc acgcttttac ggctacgatt 1800
ggtgtcgaga gcgaaagaac tgctcagcgc attctgatca atcaagtcga tctgacccgg 1860
cgtgcgcgtg ccgaagagcc gcgtgatccg cacgagcgtc aacaagaact ggaacgtttt 1920
atcgaggcag tcttgctggt cactgcacca ctcccgcctg aagccgatac ccgttacgcc 1980
gggcggattc atcgcggacg ggcgattacc gtgtaa 2016
<210> 13
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg 60
tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagct 110
<210> 14
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
gataagcttg atatcgaatt ctaatgtgag ttagctcact cattag 46
<210> 15
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
cccccgggct gcaggaattc ttacacggta atcgcccgtc cgcga 45
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
accttgccga ccgcgtggtc agtggtgaga cat 33
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
atgtctcacc actgaccacg cggtcggcaa ggt 33
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
ttccgggtag cgcgctggat tgccctgagt ga 32
<210> 19
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
tcactcaggg caatccagcg cgctacccgg aa 32
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
ctgagtgatg gtgcccgtct cgcgctggtc a 31
<210> 21
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 21
tgaccagcgc gagacgggca ccatcactca g 31
<210> 22
<211> 127
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 22
gatatcgaat tcactttaca ctttaagctt catatgttta tgttgtgtgg aagagctcgg 60
gaattgtgag cggataacaa ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag 120
atatacc 127
<210> 23
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 23
gtcgacggta tcgataagct tgatatcgaa ttcactttac acttta 46
<210> 24
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 24
tgagtgagct aactcacatt attaaatgtt ggcagggatg ttgagg 46
<210> 25
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 25
tttcacacag gaaacagcta tgaacgaaca tatggatcat ttct 44
<210> 26
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 26
tggcggccgc tctagaacta gtttacagcg gaatattgcc atgtttc 47
<210> 27
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 27
cagcccgggg gatccactag ttaatgtgag ttagctcact ca 42
<210> 28
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 28
cccccgggct gcaggaattc ttacacggta atcgcccgtc cgcga 45
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 29
ataatgcagt gagtggtatt gcacatttta gcg 33
<210> 30
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 30
ataccactca ctgcattatg aatacctgcg cc 32
<210> 31
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 31
gaaagttacc ctgattactc gcaaagccta tg 32
<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 32
gtaatcaggg taactttcgg cacggttgct tct 33
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 33
atgttcaccg ctgttgacca catcgg 26
<210> 34
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 34
agcgatgtgg tgcatacccg gacctttttc acgcaggaaa 40
<210> 35
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 35
gaaaaaggtc cgggtatgca ccacatcgct taccgtgttg 40
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 36
ttaagcagca acacctttca gacgt 25
<210> 37
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 37
atgttcaccg ctgttgacca catcgg 26
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 38
ttaagcagca acacctttca gacgt 25
<210> 39
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 39
aggtgttgct gcttaaggta ccggcccccc ctcgaggtc 39
<210> 40
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 40
aacagcggtg aacatcggta cccagctttt gttcccttta gt 42
<210> 41
<211> 1524
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 41
atgaacgaac atatggatca tttctacacc aaacgtaaac aggcagaaga aggtggcggc 60
cgtgaaaaac tggcacagca gcgtcagaaa ggtaaactga ccgcccgcga acgcattatt 120
tttctgctgg atcaggatag ttttattgaa ctgcatccgt ttatggaaag ccaggtgctg 180
acccgtgaac agcgtatgct gggtgacggt gttgttaccg gttatggtac cattgatggt 240
cgcagcgttt atgtttttgc acaggatttt accgtgtatg gtggtgccct gggtgaaacc 300
catgcccgca aaatttgcgc actgatggat ctggccgcca aaaataaggc accgattatt 360
ggtctgaatg atagcggtgg tgcccgtatt caggaaggtg ttctgagcct ggatggttat 420
ggccatattt tctatcgtaa tgttctgtat agcggtgtta ttccgcagat tagcgttatt 480
ctgggtccgt gtgcaggcgg tgccgtttat agcccggccc tgaccgattt tatttttatg 540
gccgaacaga ccggtcgtat gtttattacc ggcccgaaag ttattgaaaa agttaccggt 600
gaacaggtgg atgccgaaag tctgggcggc gcaggtattc ataatgcagt gagtggtatt 660
gcacatttta gcggccatac cgaaaaagaa gttctgaccg gtgtgcgtaa actgctgagt 720
tatctgccgc tgaatggccg taccaccgaa ccgaaaccgg aaaaagaagc aagccgtccg 780
ctgctgaatc gtctggttcc ggccgatacc accaaaccgt atgatgtgcg taaagttatt 840
cgcgaactgg ccgatccgca gagctttttc gaaattcagc cgtttttcgc aaaaaatatt 900
gttattggtt tcgcacgtct gggtgaaaaa gccattggta ttgtggcaag tcagccgaaa 960
catctggcag gtagtctgac cattgatgcc gcagataaag cagcacgttt tattcgtttt 1020
tgtgatgcat ttgatatccc gctgctgacc gtggaagatg tgccgggttt tctgccgggc 1080
attcagcagg aacataatgg tattattcgc catggcgcaa aactgctgtt tgcctatgca 1140
gaagcaaccg tgccgaaagt taccctgatt actcgcaaag cctatggtgg cgcatatgtg 1200
gccatgaata gcaaagccat tggcgccgat ctggtttttg cctggccgaa tgccgaaatt 1260
gcagttatgg gtccggaagg tgcagcaagc attctgtatg aaaaagaaat taaggccagc 1320
gccgatccgc aaaaaaccaa acgtgaaaaa accgcagaat ataaaaagca gaatgcaggc 1380
ccgtataaag cagccgcatg cggcatggtg gatgatatta ttctgccgga agaaagtcgc 1440
ggtcgtctga ttcaggcatt tcatatgctg acccataaaa ccgaagaacg tccgaaaaag 1500
aaacatggca atattccgct gtaa 1524
<210> 42
<211> 228
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 42
atgttcaccg ctgttgacca catcggtctg gttgttgctg acctggaatc tgctatcgac 60
ttctaccgta ccgctttcga cgttaccgaa tgggaacgta tcgaactgcc ggaacgtcac 120
gctgctatcg gtgttgctcg tttcggtgac accctgatag aactgatagc tccgacctct 180
gaccaggctt ctttcgctcg tttcctgcgt gaaaaaggtc cgggttaa 228
<210> 43
<211> 5469
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 43
atgatcgaca ctgcgcccct tgccccacca cgggcgcccc gctctaatcc gattcgggat 60
cgagttgatt gggaagctca gcgcgctgct gcgctggcag atcccggtgc ctttcatggc 120
gcgattgccc ggacagttat ccactggtac gacccacaac accattgctg gattcgcttc 180
aacgagtcta gtcagcgttg ggaagggctg gatgccgcta ccggtgcccc tgtaacggta 240
gactatcccg ccgattatca gccctggcaa caggcgtttg atgatagtga agcgccgttt 300
taccgctggt ttagtggtgg gttgacaaat gcctgcttta atgaagtaga ccggcatgtc 360
acgatgggct atggcgacga ggtggcctac tactttgaag gtgaccgctg ggataactcg 420
ctcaacaatg gtcgtggtgg tccggttgtc caggagacaa tcacgcggcg gcgcctgttg 480
gtggaggtgg tgaaggctgc gcaggtgttg cgtgatctgg gcctgaagaa gggtgatcgg 540
attgctctga atatgccgaa tattatgccg cagatttatt atacggaagc ggcaaaacga 600
ctgggtattc tgtacacgcc ggtcttcggt ggcttctcgg acaagactct ttccgaccgt 660
attcacaatg ccggtgcacg agtggtgatt acctctgatg gtgcgtaccg caacgcgcag 720
gtggtgccct acaaagaagc gtataccgat caggcgctcg ataagtatat tccggttgag 780
acggcgcagg cgattgttgc gcagaccctg gccaccttgc ccctgactga gtcgcagcgc 840
cagacgatca tcaccgaagt ggaggccgca ctggccggtg agattacggt tgagcgctcg 900
gacgtgatgc gtggggttgg ttctgccctc gcaaagctcc gcgatcttga tgcaagcgtg 960
caggcaaagg tgcgtacagt actggcgcag gcgctggtcg agtcgccgcc gcgggttgaa 1020
gctgtggtgg ttgtgcgtca taccggtcag gagattttgt ggaacgaggg gcgagatcgc 1080
tggagtcacg acttgctgga tgctgcgctg gcgaagattc tggccaatgc gcgtgctgcc 1140
ggctttgatg tgcacagtga gaatgatctg ctcaatctcc ccgatgacca gcttatccgt 1200
gcgctctacg ccagtattcc ctgtgaaccg gttgatgctg aatatccgat gtttatcatt 1260
tacacatcgg gtagcaccgg taagcccaag ggtgtgatcc acgttcacgg cggttatgtc 1320
gccggtgtgg tgcacacctt gcgggtcagt tttgacgccg agccgggtga tacgatatat 1380
gtgatcgccg atccgggctg gatcaccggt cagagctata tgctcacagc cacaatggcc 1440
ggtcggctga ccggggtgat tgccgaggga tcaccgctct tcccctcagc cgggcgttat 1500
gccagcatca tcgagcgcta tggggtgcag atctttaagg cgggtgtgac cttcctcaag 1560
acagtgatgt ccaatccgca gaatgttgaa gatgtgcgac tctatgatat gcactcgctg 1620
cgggttgcaa ccttctgcgc cgagccggtc agtccggcgg tgcagcagtt tggtatgcag 1680
atcatgaccc cgcagtatat caattcgtac tgggcgaccg agcacggtgg aattgtctgg 1740
acgcatttct acggtaatca ggacttcccg cttcgtcccg atgcccatac ctatcccttg 1800
ccctgggtga tgggtgatgt ctgggtggcc gaaactgatg agagcgggac gacgcgctat 1860
cgggtcgctg atttcgatga gaagggcgag attgtgatta ccgccccgta tccctacctg 1920
acccgcacac tctggggtga tgtgcccggt ttcgaggcgt acctgcgcgg tgagattccg 1980
ctgcgggcct ggaagggtga tgccgagcgt ttcgtcaaga cctactggcg acgtgggcca 2040
aacggtgaat ggggctatat ccagggtgat tttgccatca agtaccccga tggtagcttc 2100
acgctccacg gacgctctga cgatgtgatc aatgtgtcgg gccaccgtat gggcaccgag 2160
gagattgagg gtgccatttt gcgtgaccgc cagatcacgc ccgactcgcc cgtcggtaat 2220
tgtattgtgg tcggtgcgcc gcaccgtgag aagggtctga ccccggttgc cttcattcaa 2280
cctgcgcctg gccgtcatct gaccggcgcc gaccggcgcc gtctcgatga gctggtgcgt 2340
accgagaagg gggcggtcag tgtcccagag gattacatcg aggtcagtgc ctttcccgaa 2400
acccgcagcg ggaagtatat gcggcgcttt ttgcgcaata tgatgctcga tgaaccactg 2460
ggtgatacga cgacgttgcg caatcctgaa gtgctcgaag agattgcagc caagatcgct 2520
gagtggaaac gccgtcagcg tatggccgaa gagcagcaga tcatcgaacg ctatcgctac 2580
ttccggatcg agtatcaccc accaacggcc agtgcgggta aactcgcggt agtgacggtg 2640
acaaatccgc cggtgaacgc actgaatgag cgtgcgctcg atgagttgaa cacaattgtt 2700
gaccacctgg cccgtcgtca ggatgttgcc gcaattgtct tcaccggaca gggcgccagg 2760
agttttgtcg ccggcgctga tattcgccag ttgctcgaag agattcatac ggttgaagag 2820
gcaatggccc tgccgaataa cgcccatctt gctttccgca agattgagcg tatgaataag 2880
ccgtgtatcg cggcgatcaa cggtgtggcg ctcggtggtg gtctggaatt cgccatggcc 2940
tgccattacc gggttgccga tgtctatgcc gaattcggtc agccagagat taatctgcgc 3000
ttgctacctg gttatggtgg cacgcagcgc ttgccgcgcc tgttgtacaa gcgcaacaac 3060
ggcaccggtc tgctccgagc gctggagatg attctgggtg ggcgtagcgt accggctgat 3120
gaggcgctgg agctgggtct gatcgatgcc attgctaccg gcgatcagga ctcactgtcg 3180
ctggcatgcg cgttagcccg tgccgcaatc ggcgccgatg gtcagttgat cgagtcggct 3240
gcggtgaccc aggctttccg ccatcgccac gagcagcttg acgagtggcg caaaccagac 3300
ccgcgctttg ccgatgacga actgcgctcg attatcgccc atccacgtat cgagcggatt 3360
atccggcagg cccataccgt tgggcgcgat gcggcagtgc atcgggcact ggatgcaatc 3420
cgctatggca ttatccacgg cttcgaggcc ggtctggagc acgaggcgaa gctctttgcc 3480
gaggcagtgg ttgacccgaa cggtggcaag cgtggtattc gcgagttcct cgaccgccag 3540
agtgcgccgt tgccaacccg ccgaccattg attacacctg aacaggagca actcttgcgc 3600
gatcagaaag aactgttgcc ggttggttca cccttcttcc ccggtgttga ccggattccg 3660
aagtggcagt acgcgcaggc ggttattcgt gatccggaca ccggtgcggc ggctcacggc 3720
gatcccatcg tggctgaaaa gcagattatt gtgccggtgg aacgcccccg cgccaatcag 3780
gcgctgatct atgttctggc ctcggaggtg aacttcaacg atatctgggc gattaccggt 3840
attccggtgt cacggtttga tgagcacgac cgcgactggc acgttaccgg ttcaggtggc 3900
atcggcctga tcgttgcgct gggtgaagag gcgcgacgcg aaggccggct gaaggtgggt 3960
gatctggtgg cgatctactc cgggcagtcg gatctgctct caccgctgat gggccttgat 4020
ccgatggccg ccgatttcgt catccagggg aacgacacgc cagatggatc gcatcagcaa 4080
tttatgctgg cccaggcccc gcagtgtctg cccatcccaa ccgatatgtc tatcgaggca 4140
gccggcagct acatcctcaa tctcggtacg atctatcgcg ccctctttac gacgttgcaa 4200
atcaaggccg gacgcaccat ctttatcgag ggtgcggcga ccggtaccgg tctggacgca 4260
gcgcgctcgg cggcccggaa tggtctgcgc gtaattggaa tggtcagttc gtcgtcacgt 4320
gcgtctacgc tgctggctgc gggtgcccac ggtgcgatta accgtaaaga cccggaggtt 4380
gccgattgtt tcacgcgcgt gcccgaagat ccatcagcct gggcagcctg ggaagccgcc 4440
ggtcagccgt tgctggcgat gttccgggcg cagaacgacg ggcgactggc cgattatgtg 4500
gtctcgcacg cgggcgagac ggccttcccg cgcagtttcc agcttctcgg cgagccacgc 4560
gatggtcaca ttccgacgct cacattctac ggtgccacca gtggctacca cttcaccttc 4620
ctgggtaagc cagggtcagc ttcgccgacc gagatgctgc ggcgggccaa tctccgcgcc 4680
ggtgaggcgg tgttgatcta ctacggggtt gggagcgatg acctggtaga taccggcggt 4740
ctggaggcta tcgaggcggc gcggcaaatg ggagcgcgga tcgtcgtcgt taccgtcagc 4800
gatgcgcaac gcgagtttgt cctctcgttg ggcttcgggg ctgccctacg tggtgtcgtc 4860
agcctggcgg aactcaaacg gcgcttcggc gatgagtttg agtggccgcg cacgatgccg 4920
ccgttgccga acgcccgcca ggacccgcag ggtctgaaag aggctgtccg ccgcttcaac 4980
gatctggtct tcaagccgct aggaagcgcg gtcggtgtct tcttgcggag tgccgacaat 5040
ccgcgtggct accccgatct gatcatcgag cgggctgccc acgatgcact ggcggtgagc 5100
gcgatgctga tcaagccctt caccggacgg attgtctact tcgaggacat tggtgggcgg 5160
cgttactcct tcttcgcacc gcaaatctgg gtgcgccagc gccgcatcta catgccgacg 5220
gcacagatct ttggtacgca cctctcaaat gcgtatgaaa ttctgcgtct gaatgatgag 5280
atcagcgccg gtctgctgac gattaccgag ccggcagtgg tgccgtggga tgaactaccc 5340
gaagcacatc aggcgatgtg ggaaaatcgc cacacggcgg ccacttatgt ggtgaatcat 5400
gccttaccac gtctcggcct aaagaacagg gacgagctgt acgaggcgtg gacggccggc 5460
gagcggtag 5469

Claims (10)

1.一种利用油脂合成丁二酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)为出发菌株，过表达乙酰辅酶A羧化酶的基因accBC、丙酰辅酶A合酶的基因pcs、丙二酸单酰辅酶A还原酶的基因mcr、丙酰辅酶A羧化酶的基因pcc、甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶的基因mcE和甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的基因mcM，得到重组菌。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的编码乙酰辅酶A羧化酶的基因accBC的不同亚基在NCBI中基因ID分别为accB:947758、accC:947761；丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR在NCBI中的蛋白质ID为AAS20429.1；丙酰辅酶A合酶Pcs在NCBI中的蛋白质ID为AAL47820.2；编码丙酰辅酶A羧化酶的基因pcc在NCBI中的基因ID为1100367；甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶McE在NCBI中的蛋白质ID为ACL23899.1；编码甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的基因mcM在NCBI中的基因ID为5826972。
3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，将丙酰辅酶A羧化酶PCC进行突变，将第220位的天冬酰胺突变为异亮氨酸，第391位的异亮氨酸突变为苏氨酸；将丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR进行突变，将第940位的天冬酰胺残基突变为缬氨酸残基，第1106位的赖氨酸残基突变为色氨酸残基，第1114位的丝氨酸残基突变为精氨酸残基。
4.权利要求1-3任意一项所述的重组菌在生产丁二酸中的应用。
5.一种制备权利要求1或2所述的重组菌的方法，其特征在于，所述方法的步骤如下：
步骤1：利用pBBR1MCS-1质粒过表达乙酰辅酶A羧化酶的基因accBC、丙酰辅酶A合酶的基因pcs获得重组质粒1；
步骤2：利用pBBR1MCS-4质粒过表达丙二酸单酰辅酶A还原酶的基因mcr、丙酰辅酶A羧化酶的基因pcc、甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶的基因mcE、甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的基因mcM获得重组质粒2；
步骤3：将步骤1和步骤2获得的获得重组质粒1和重组质粒2共转到真养产碱杆菌，得到重组菌。
6.一种生产丁二酸的方法，其特征在于，所述方法的步骤如下：所述方法的步骤如下：将权利要求1-3任一项所述的重组菌置于含有油脂的培养基，发酵培养至少48小时。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述培养基的成分如下：油脂、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化铵、酵母粉、碳酸氢钠、硫酸镁和微量元素。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述微量元素为：6.0g/L七水合硫酸亚铁，2.0g/L硼酸，2.0g/L四水合氯化锰，0.8g/L四水合钼酸铵，0.2g/L五水合硫酸铜。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述油脂为大豆油、花生油和棕榈油的任意一个或任意多个。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述培养基的成分如下：10g/L油脂、15.2g/L十二水合磷酸氢二钠、3g/L磷酸二氢钾、0.5g/L氯化钠、1g/L氯化铵、0.5g/L酵母粉、1g/L碳酸氢钠、0.5g/L硫酸镁和0.1％(v/v)微量元素。
CN202210677606.3A 2022-06-15 2022-06-15 一种利用油脂合成丁二酸的重组菌及其构建方法与应用 Active CN114958703B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210677606.3A CN114958703B (zh) 2022-06-15 2022-06-15 一种利用油脂合成丁二酸的重组菌及其构建方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210677606.3A CN114958703B (zh) 2022-06-15 2022-06-15 一种利用油脂合成丁二酸的重组菌及其构建方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114958703A true CN114958703A (zh) 2022-08-30
CN114958703B CN114958703B (zh) 2024-01-05

Family

ID=82963862

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210677606.3A Active CN114958703B (zh) 2022-06-15 2022-06-15 一种利用油脂合成丁二酸的重组菌及其构建方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114958703B (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102296082A (zh) * 2011-07-18 2011-12-28 南京工业大学 利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法
CN103602626A (zh) * 2013-10-12 2014-02-26 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种以油脂为原料生产甲羟戊酸的方法及其构建的基因工程菌
CN106967662A (zh) * 2017-04-28 2017-07-21 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种固定二氧化碳合成丁二酸的重组菌及其构建方法和应用
CN107119002A (zh) * 2017-04-28 2017-09-01 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种合成3‑羟基丙酸的重组菌及其构建方法和应用
CN109652434A (zh) * 2019-02-25 2019-04-19 中国科学院天津工业生物技术研究所 一株以甘油为底物生产丁二酸的重组菌及其构建方法与应用
CN111471602A (zh) * 2020-04-30 2020-07-31 山东理工大学 一种利用纤维素高效合成γ-亚麻酸的卷枝毛霉工程菌株的构建方法及应用
CN112210521A (zh) * 2019-07-11 2021-01-12 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的重组菌及其构建方法与应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102296082A (zh) * 2011-07-18 2011-12-28 南京工业大学 利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法
CN103602626A (zh) * 2013-10-12 2014-02-26 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种以油脂为原料生产甲羟戊酸的方法及其构建的基因工程菌
CN106967662A (zh) * 2017-04-28 2017-07-21 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种固定二氧化碳合成丁二酸的重组菌及其构建方法和应用
CN107119002A (zh) * 2017-04-28 2017-09-01 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种合成3‑羟基丙酸的重组菌及其构建方法和应用
CN109652434A (zh) * 2019-02-25 2019-04-19 中国科学院天津工业生物技术研究所 一株以甘油为底物生产丁二酸的重组菌及其构建方法与应用
CN112210521A (zh) * 2019-07-11 2021-01-12 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的重组菌及其构建方法与应用
CN111471602A (zh) * 2020-04-30 2020-07-31 山东理工大学 一种利用纤维素高效合成γ-亚麻酸的卷枝毛霉工程菌株的构建方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114958703B (zh) 2024-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107119002B (zh) 一种合成3-羟基丙酸的重组菌及其构建方法和应用
CN108795916B (zh) 一种赖氨酸脱羧酶突变体、其编码基因及其表达和应用
CN105813625A (zh) 生产酰基氨基酸的方法
CN110079489B (zh) 一种重组盐单胞菌以及利用其生产P(3HB-co-4HB)的方法
CN107384847B (zh) 一种高效转化木糖生产乙二醇的重组菌及其应用
Wei et al. An environmentally friendly strategy for cadaverine bio-production: in situ utilization of CO2 self-released from L-lysine decarboxylation for pH control
CN114874964A (zh) 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用
Jiang et al. Enhanced low molecular weight poly-γ-glutamic acid production in recombinant Bacillus subtilis 1A751 with zinc ion
CN109593702B (zh) 一种基因工程菌株实现全细胞转化合成l-苯乳酸的方法
CN114807206A (zh) 合成聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)的菌株及其构建方法和应用
CN109112090B (zh) 一种戊二酸的全生物合成的方法
CN113444713A (zh) 一种L-赖氨酸脱羧酶SpLDC及其在产1，5-戊二胺上的应用
CN107227286B (zh) 一株高产琥珀酸的基因工程菌及其构建方法与应用
CN111411128B (zh) 一种生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法及其应用
CN108913724A (zh) 一种以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸的制备方法及其相应重组细胞和应用
KR102311152B1 (ko) 메탄으로부터 3-하이드록시부티레이트-3-하이드록시프로피오네이트 공중합체(poly(3HB-co-3HP)) 생산능을 가지는 형질전환 메탄자화균 및 이를 이용한 3-하이드록시부티레이트-3-하이드록시프로피오네이트 공중합체의 제조방법
CN114958703B (zh) 一种利用油脂合成丁二酸的重组菌及其构建方法与应用
CN108004275B (zh) 一种产己二酸的大肠杆菌重组菌及其应用
CN108473993A (zh) 中链氨基羧酸的生产方法
CN107119003B (zh) 一种利用葡聚糖合成3-羟基丙酸的重组菌及其构建方法和应用
CN115806923A (zh) 一种含有脂酰辅酶a氧化酶基因的工程菌及其在制备10-羟基-2-癸烯酸中的应用
US11760988B2 (en) L-aspartate alpha-decarboxylase mutant and application thereof
CN105779513B (zh) 利用重组大肠杆菌以甘油为碳源发酵生产琥珀酸的方法
WO2018233703A1 (zh) 一种精细调控共聚物中4-羟基丁酸组成比例的基因盒及其应用
KR101725454B1 (ko) 하프니아 알베이 유래의 라이신 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터, 숙주세포 및 이를 이용한 카다베린의 생산방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant