CN115806923A - 一种含有脂酰辅酶a氧化酶基因的工程菌及其在制备10-羟基-2-癸烯酸中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌及其在制备10‑羟基‑2‑癸烯酸中的应用，属于微生物发酵技术领域。本发明含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌中包括脂酰辅酶A氧化酶基因和脂酰辅酶A硫酯酶基因，所述脂酰辅酶A氧化酶基因来源于热带假丝酵母或解脂耶氏酵母。本发明采用来自热带假丝酵母和解脂耶氏酵母的脂酰辅酶A氧化酶，联合现有的脂酰辅酶A硫酯酶，共同转化10‑羟基癸酸，显著提高10‑羟基‑2‑癸烯酸的转化率，实现以低值10‑羟基癸酸生产高附加值10‑羟基‑2‑癸烯酸的过程。

Description

一种含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌及其在制备10-羟 基-2-癸烯酸中的应用

技术领域

本发明涉及一种含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌及其在制备10-羟基-2-癸烯酸中的应用，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)作为蜂王浆的质量指标，具有抗菌、降低血糖、提高免疫力等各种优良性能。近年来，人们生活水平不断提升，对个人健康及相关健康产业也更加重视，对具有多种生理活性的10-HDA也越来越关注。该化合物的结构如下：

迄今为止，获取10-HDA的方法主要有提取法、化学合成法、微生物发酵法。提取方法较多，包括乙醚萃取法、乙醇提取法等。但是蜂王浆中10-HDA的含量较少，难以满足市场的广泛需求，且提取成本较高。自上世纪六十年代以来，多种化学合成10-HDA的途径被人们设计出来应用生产，如Doebmer缩合法，该方法的底物是1,6-己二醇，产率是61％；缩合法，该方法以γ-溴丁烯酸乙酯Grignard和有机镁化合物为底物，经过两者缩合生成10-HDA，该方法的产率达到70％。以上实验方法均可以得到10-HDA，但是化学合成法具有不可避免的缺点，比如：生产条件苛刻，易产生污染等，而且原料不易获得、合成路线较长、产率偏低，且化学合成存在着顺反异构问题，产品单一性差。所以基于生物合成方法生产10-HDA成为研究的新方向。

中国专利文献CN 109402182 A(申请号201811126048.1)公开了一种利用大肠杆菌工程菌静息细胞制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，步骤如下：(1)构建含有重组质粒pET-28a-ydiI的大肠杆菌工程菌；(2)取含有重组质粒pET-28a-ydiI的大肠杆菌工程菌，制备诱导细胞；(3)将诱导细胞经转化培养基培养，制得静息细胞，然后向培养基中加入10-羟基癸酸，制备10-羟基-2-癸烯酸。该专利文献的10-羟基-2-癸烯酸的合成途径：以10-羟基癸酸为反应底物，依赖β氧化的前两步，形成反式双键后，经过大肠杆菌酯酰辅酶A硫酯酶ydiI水解辅酶A，释放10-羟基-2-癸烯酸。

中国专利文献CN 109897870 A(申请号201910088897.0)公开了一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，步骤如下：(1)构建重组质粒pBbB5K-P450融合酶、重组质粒pBbB5K-FadK、重组质粒pBbB5K-MCAD、重组质粒pBbB5K-YdiI；(2)构建pBbB5K-ydiI-MCAD-FadK-P450融合酶组合质粒；(3)融合酶组合质粒转化大肠杆菌，经筛选，诱导培养，制得诱导细胞；(4)将诱导细胞经转化培养基培养，制得静息细胞，然后向培养基中加入癸酸，培养，制得10-羟基-2-癸烯酸。该专利文献的10-羟基-2-癸烯酸的合成途径：利用底物癸酸经两步法生产10-HDA，第一步反应先由癸酸到反式-2-癸烯酸，癸酸在脂酰CoA合成酶FadK的作用下加上辅酶A形成癸酰-CoA，然后癸酰-CoA在脂酰CoA脱氢酶MCAD的作用下将癸酰-CoA的羧基邻位(β-位)，脱下两个氢原子转化为反式-癸烯酰-CoA，最后反式-癸烯酰-CoA在脂酰CoA硫酯酶YdiI的作用下脱掉辅酶A形成反式-2-癸烯酸；第二步反应为反式-2-癸烯酸在P450融合酶的作用下末端羟基化形成10-羟基-2-癸烯酸。

中国专利文献CN 113106109 A(申请号202110211118.9)公开了一种突变酶CYP153A M228L及其在合成10-羟基-2-癸烯酸中的应用，具体涉及的突变酶CYP153A M228L是将CYP153A酶第228位的氨基酸由M突变为L；以癸酸为原料两步法生物合成10-羟基-2-癸烯酸的方法，主要包括构建优化后重组质粒pCDFDuet-1-MaMACS-PpFadE、优化后重组质粒pET21b-CYP153A M228L-CPR_BM3、优化后重组质粒pET28a-SUMO-ctYdiI；构建大肠杆菌重组菌制得静息细胞，进一步培养制得10-羟基-2-癸烯酸。该专利文献在专利文献CN109897870 A(申请号201910088897.0)的基础上进行了优化，利用两步法生成10-HDA，且其中的脂酰CoA脱氢酶基因PpFadE、脂酰CoA合成酶基因MaMACS、酰辅酶A硫酯酶基因ctydiI与中国专利文献CN109897870A(申请号：201910088897.0)中脂酰CoA脱氢酶基因MCAD、脂酰CoA合成酶基因FadK、酰辅酶A硫酯酶基因ydiI并非相同基因，烷烃羟化酶CYP153A是将228位的氨基酸由M变为L，10-羟基-2-癸烯酸的转化率提高至54.6％。

开发更多样的10-羟基-2-癸烯酸合成途径，对于10-羟基-2-癸烯酸的工业化生产仍然是有必要的。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌，并利用该工程菌以10-羟基癸酸为底物一步反应制备10-羟基-2-癸烯酸。

本发明在前期研究的基础上，进一步构建表达元件，完善10-羟基-2-癸烯酸合成途径的关键酶，提供一种以10-羟基癸酸为底物利用基因工程菌一步反应制备10-羟基-2-癸烯酸的方法。

术语说明：

脂酰辅酶A氧化酶：acyl-CoA oxidase，简写为ACO。

脂酰辅酶A硫酯酶：acyl-CoA thioeaterase，简写为ACOT。

本发明的技术方案如下：

一种含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌，所述工程菌中包括脂酰辅酶A氧化酶基因和脂酰辅酶A硫酯酶基因。

根据本发明优选的，所述脂酰辅酶A氧化酶基因来源于热带假丝酵母或解脂耶氏酵母，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4；所述脂酰辅酶A硫酯酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.5。

进一步优选的，所述脂酰辅酶A氧化酶基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.3。

进一步优选的，所述脂酰辅酶A氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9，所述脂酰辅酶A硫酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.10。

根据本发明优选的，所述基因工程菌的宿主菌为大肠杆菌或酿酒酵母。

上述含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌的构建方法，步骤如下：

(1)构建重组质粒pETDuet-1-ACO、pET28a-SUMO-ACOT、pESC-URA-SUMO-ACOT；

所述脂酰辅酶A氧化酶ACO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3或SEQ ID NO.4所示，所述脂酰辅酶A硫酯酶ACOT基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(2)将步骤(1)的重组质粒pETDuet-1-ACO和pET28a-SUMO-ACOT共同转化到大肠杆菌中，经筛选、鉴定后，得到大肠杆菌基因工程菌；将步骤(1)的重组质粒pETDuet-1-ACO和pESC-URA-SUMO-ACOT共同转化到酿酒酵母中，经筛选、鉴定后，得到酿酒酵母基因工程菌。

上述含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌在以10-羟基癸酸为底物制备10-羟基-2-癸烯酸中的应用。

本发明一种优选的技术方案，利用上述含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌以10-羟基癸酸为底物制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，步骤如下：

将上述构建的大肠杆菌基因工程菌经诱导培养后制得诱导细胞，将诱导细胞接入转化培养基中，并加入10-羟基癸酸，37℃发酵培养制得10-羟基-2-癸烯酸。

根据本发明优选的，所述诱导培养为：将大肠杆菌基因工程菌接入含有浓度50μg/mL卡那霉素和40μg/mL链霉素的液体LB培养基中，在37℃振荡培养至菌液OD₆₀₀为0.8～1.2，降温至16～20℃适应1小时后，加入IPTG至浓度为0.5mM，继续诱导培养20～25小时，分离细胞，制得诱导细胞。

进一步优选的，所述分离细胞是在5000rpm条件下离心15min，收集细胞沉淀，然后用100mM、pH 7.2-7.4的PBS缓冲液洗涤细胞沉淀。

根据本发明优选的，所述转化培养基组份如下，均为质量百分比：

甘油1％，葡萄糖0.4％，卡那霉素50μg/mL、链霉素40μg/mL，余量为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液。

根据本发明优选的，加入10-羟基癸酸至浓度为0.1g/L。

根据本发明优选的，将10-羟基癸酸溶解于二甲基亚砜，再加入到转化培养基中。

本发明一种优选的技术方案，利用上述含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌以10-羟基癸酸为底物制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，步骤如下：

将上述构建的酿酒酵母基因工程菌经诱导培养后制得诱导细胞，将诱导细胞接入转化培养基中，并加入10-羟基癸酸，30℃发酵培养制得10-羟基-2-癸烯酸。

根据本发明优选的，所述诱导培养为：将酿酒酵母基因工程菌接入含有浓度100μg/mL氨苄霉素和40μg/mL链霉素的液体YPD培养基中，在30℃振荡筛选培养至菌液OD₆₀₀为0.8～1.2，降温至16～20℃适应1小时后，加入2％半乳糖，继续诱导培养48～55小时，分离细胞，制得诱导细胞。

进一步优选的，所述分离细胞是在5000rpm条件下离心15min，收集细胞沉淀，然后用100mM、pH 7.2-7.4的PBS缓冲液洗涤细胞沉淀。

根据本发明优选的，所述转化培养基组份如下，均为质量百分比：

甘油1％，葡萄糖0.4％，氨苄霉素100μg/mL、链霉素40μg/mL，余量为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液。

根据本发明优选的，加入10-羟基癸酸至浓度为0.1g/L。

根据本发明优选的，将10-羟基癸酸溶解于二甲基亚砜，再加入到转化培养基中。

本发明未作出详细说明的步骤均按照本领域常规操作进行。

有益效果：

1、本发明将生物合成10-羟基-2-癸烯酸的关键酶进行整合，将脂酰辅酶A氧化酶基因和脂酰辅酶A硫酯酶基因共同转入宿主菌中，实现10-羟基-2-癸烯酸表达元件的高效表达，并经过诱导培养后，可以以静息细胞的形式以10-羟基癸酸为底物发酵一步法生产10-羟基-2-癸烯酸，实现以低值10-羟基癸酸生产高附加值10-羟基-2-癸烯酸的过程。

2、本发明通过优化10-羟基-2-癸烯酸的合成途径，并优化转化过程中的相关条件。本发明经过预实验发现，并非所有的微生物都含有由10-羟基癸酸到10-羟基-2-癸烯酸的合成途径，经过进一步的优选，采用来自热带假丝酵母和解脂耶氏酵母的脂酰辅酶A氧化酶，联合现有的脂酰辅酶A硫酯酶，共同转化10-羟基癸酸，显著提高10-羟基-2-癸烯酸的转化率，尤其是构建的大肠杆菌基因工程菌(BL21)/pETDuet-1-^CtACO₂、pET28a-SUMO-YdiI和(BL21)/pETDuet-1-^CtACO₅、pET28a-SUMO-YdiI，其转化率分别达到了85％和92％，构建的酿酒酵母基因工程菌Sc./pETDuet-1-^CtACO₂、pESC-URA-SUMO-YdiI和Sc./pETDuet-1-^CtACO₅、pESC-URA-SUMO-YdiI，其转化率都达到了82％，转化率得到了显著的提升，从而使10-羟基-2-癸烯酸的工业化生产成为可能。

附图说明

图1为实施例1中不同菌种对10-羟基癸酸底物的消耗量变化图。

图2为重组质粒pETDuet-1-^CtACO₅的结构示意图；

图3为实施例3中对于重组菌中pETDuet-1质粒上ACO基因的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道M为marker，1为^CtACO₂，2为^CtACO₄，3为^CtACO₅，4为^YlACO；

图4为重组菌诱导产物的SDS-PAGE图，M为marker，1为重组菌(BL21)/pETDuet-1-^CtACO₂、pET28a-SUMO-YdiI，2为重组菌(BL21)/pETDuet-1-^CtACO₄、pET28a-SUMO-YdiI，3为重组菌(BL21)/pETDuet-1-^CtACO₅、pET28a-SUMO-YdiI，4为重组菌(BL21)/pETDuet-1-^YlACO₂、pET28a-SUMO-YdiI，其中，目的蛋白脂酰辅酶A硫酯酶YdiI的大小为15kDa，脂酰辅酶A氧化酶^CtACO₂的大小为78kDa，脂酰辅酶A氧化酶^CtACO₄的大小为79kDa，脂酰辅酶A氧化酶^CtACO₅的大小为74kDa，脂酰辅酶A氧化酶^YlACO的大小为78kDa；

图5为发酵产物10-羟基-2-癸烯酸的质谱图。

图6为实施例5基因工程菌发酵产物10-羟基-2-癸烯酸的产量变化图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。实施例中未作详细说明的操作方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。

生物材料来源：

脂酰辅酶A氧化酶^CtACO₂基因：来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis MYA-3404)，Genbank Accession No.XM_002548031.1，核苷酸序列为SEQ ID NO.1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.6。

脂酰辅酶A氧化酶^CtACO₄基因：来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis strainMYA-3404)，Genbank Accession No：CP047872.1；其核苷酸序列为SEQ ID NO.2，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.7。

脂酰辅酶A氧化酶^CtACO₅基因：来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis strainMYA-3404)，Genbank Accession No:CP047872.1；其核苷酸序列为SEQ ID NO.3，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.8。

脂酰辅酶A氧化酶^YlACO基因：来源于解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica strainW29)，Genbank Accession No:CP028451.1；其核苷酸序列为SEQ ID NO.4，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.9。

脂酰辅酶A硫酯酶YdiI基因在中国专利文献CN 113106109 A(申请号202110211118.9)中有记载，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5，编码的氨基酸序列为SEQ IDNO.10。

本发明中所用的试剂及药品均为普通市售产品。

实施例1：不同菌株代谢10-羟基癸酸的验证：

通过对热带假丝酵母、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、谷氨酸棒状杆菌、枯草芽孢杆菌、解脂耶氏酵母、酿酒酵母等不同菌株进行10-羟基癸酸底物发酵检测，发现热带假丝酵母和解脂耶氏酵母具有代谢10-羟基癸酸合成10-羟基-2-癸烯酸的能力。具体步骤如下：

(1)菌种活化：将不同菌株均以1％的接种量接种至50mL的液体培养基中培养活化，培养条件如下：

热带假丝酵母：YPD培养基，30℃、200rpm振荡培养48h，

大肠杆菌：LB培养基，37℃、200rpm振荡培养48h，

金黄色葡萄球菌：LB培养基，37℃、200rpm振荡培养48h，

谷氨酸棒状杆菌：LB培养基，37℃、200rpm振荡培养48h，

枯草芽孢杆菌：LB培养基，37℃、200rpm振荡培养48h，

解脂耶氏酵母：YPD培养基，30℃、200rpm振荡培养48h，

酿酒酵母：YPD培养基，30℃、200rpm振荡培养48h，

培养基组份包括如下，均为质量百分比：

LB培养基：酵母浸粉0.5％，蛋白胨1％，NaCl 1％，用NaOH调pH至7.0，

YPD培养基：酵母浸粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％；

(2)菌体转接：取上述活化菌株菌液1mL接入50mL的液体培养基中，培养条件与菌种活化时相同，培养至菌液OD₆₀₀为0.8，降温至16℃适应1小时后，加入IPTG使培养基中IPTG浓度为0.5mM，按照活化时的培养温度，200rpm培养20h；

(3)收集菌体：分别取上述菌液50mL，5000rpm、4℃离心15min，收集菌体；

(4)用100mM的PBS缓冲液(pH 7.2-7.4)洗涤沉淀三次，并用转化培养基重悬菌体，转化培养基包含甘油1％，葡萄糖0.4％，余量为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液，加入10-羟基癸酸使培养基中10-羟基癸酸浓度为0.1g/L，按照活化时的培养温度、200rpm反应48h，得发酵液。

发酵液硅烷化处理：取1mL发酵液于2mL离心管中，加入1mL 4M HCl溶液，涡旋离心，100℃加热10min，再于-80℃冷藏15min，室温融化后，加入1mL乙酸乙酯，涡旋离心，将有机相收集到新管中，加入100μL N,O-双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺振荡混匀，70℃水浴40min后备用。

气相色谱-质谱检测生成产物及底物消耗：气相色谱以氮气为载气，恒流模式，进样体积1μL，分流进样，分流比为1：50，进样温度250℃，50℃保持1min，以15℃/min升至250℃，保持10min。

发酵过程中，菌株发酵液中10-羟基癸酸的含量变化如图1所示，计算不同菌株对10-羟基癸酸的消耗率，计算结果如下表：

表1：不同菌株10-羟基癸酸的消耗率

菌株	消耗率
		热带假丝酵母	100％
大肠杆菌	2％
		金黄色葡萄球菌	1％
谷氨酸棒状杆菌	1％
		枯草芽孢杆菌	1％
解脂耶氏酵母	100％
		酿酒酵母	7％

由上表数据可知，反应48h后，热带假丝酵母和解脂耶氏酵母对10-羟基癸酸的消耗率为100％，而大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、谷氨酸棒状杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母基本不能消耗10-羟基癸酸。

现有技术公开的10-羟基-2-癸烯酸的合成途径为：由底物癸酸先反应生成反式-2-癸烯酸，反式-2-癸烯酸再经末端羟基化形成10-羟基-2-癸烯酸，如中国专利文献CN109897870 A(申请号201910088897.0)和中国专利文献CN 113106109 A(申请号202110211118.9)。本发明在研究的过程中，还构建了10-羟基-2-癸烯酸另外一种合成途径，先将底物癸酸经末端羟基化生成10-羟基癸酸，10-羟基癸酸再经β氧化生成10-羟基-2-癸烯酸。但是在前期的研究中发现，该合成途径中，在生成10-羟基癸酸后，由10-羟基癸酸生成10-羟基-2-癸烯酸的反应活性较弱，造成大量中间产物10-羟基癸酸的累积，由10-羟基癸酸生成10-羟基-2-癸烯酸为该合成途径的限速步骤。在中国专利文献CN 109402182 A(申请号201811126048.1)的技术方案中，以10-羟基癸酸为底物生产10-羟基-2-癸烯酸，也会出现产物时有时无的不稳定现象。本发明通过上述实验发现，并非所有的菌株都可以代谢10-羟基癸酸生成10-羟基-2-癸烯酸，β氧化途径上的酶可能是影响10-羟基癸酸生成10-羟基-2-癸烯酸的关键因素。

实施例2：重组质粒的构建

重组质粒pETDuet-1-^CtACO₂、pETDuet-1-^CtACO₄、pETDuet-1-^CtACO₅、pETDuet-1-^YlACO、pET28a-SUMO-YdiI、pESC-URA-SUMO-YdiI的合成：

其中，脂酰辅酶A氧化酶^CtACO₂、^CtACO₄、^CtACO₅、^YlACO基因的核苷酸序列分别如SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示，所述脂酰辅酶A硫酯酶YdiI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；以及脂酰辅酶A氧化酶^CtACO₂、^CtACO₄、^CtACO₅、^YlACO基因编码的蛋白质氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9所示，脂酰辅酶A硫酯酶YdiI基因编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ IDNO.10所示；

所述重组质粒pETDuet-1-^CtACO₂、pETDuet-1-^CtACO₄、pETDuet-1-^CtACO₅、pETDuet-1-^YlACO、pET28a-SUMO-YdiI、pESC-URA-SUMO-YdiI均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。其中，构建的重组质粒pETDuet-1-^CtACO₅的结构示意图如图2所示。

实施例3：大肠杆菌基因工程菌的构建

(1)大肠杆菌感受态细胞的制备

①挑取大肠杆菌BL21单菌落(或挑取保存菌种)接种至50mL液体LB培养基，37℃、200rpm过夜培养；

②取1mL大肠杆菌菌液接种于50mL液体LB培养基中，37℃、200rpm培养至菌液OD₆₀₀为0.5-0.6左右；

③将菌液放置于冰水混合物上10min，同时预冷50mL离心管；

④将菌液转移到离心管中，4℃，3700rpm离心10min收集菌体；

⑤每个离心管中加入10mL预冷的0.1M CaCl₂溶液，重悬菌体，再加入30mL预冷的0.1M CaCl₂溶液，颠倒混匀，冰上静置20min；

⑥4℃，3700rpm离心10min收集菌体，按照与步骤④中菌液的体积比为3：125的比例加入预冷的含有15％甘油的0.1M的CaCl₂溶液，重悬菌体，得感受态细胞；

⑦将感受态细胞分装，并于-80℃冻存。

(2)大肠杆菌中重组质粒的转化

①将重组质粒pETDuet-1-^CtACO₂和pET28a-SUMO-YdiI为一组、pETDuet-1-^CtACO₄和pET28a-SUMO-YdiI为一组、pETDuet-1-^CtACO₅和pET28a-SUMO-YdiI为一组、pETDuet-1-^YlACO和pET28a-SUMO-YdiI为一组，每组中两种质粒的体积比为1：1，共10μL，分别加入到100μL新鲜制备的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；

②42℃热激90s，然后迅速置于冰浴中冷却3min；

③加入900μL LB培养基，37℃，200rpm振荡培养60min；

④3700rpm离心10min收集菌体，弃上清，沉淀用100μL液体LB培养基重悬；

⑤取上述菌液100μL，将大肠杆菌菌液涂布于带有50μg/mL卡那霉素和40μg/mL链霉素的LB固体培养基；

⑥LB固体培养基于37℃培养箱中正置30min，待菌液被吸干后，倒置平板于37℃培养12-16h。

(3)阳性克隆的鉴定：

①菌落PCR鉴定

挑取上述培养出的单菌落，将大肠杆菌接种至1mL含有50μg/mL卡那霉素和40μg/mL链霉素的LB培养基，37℃、200rpm振荡培养6-8h；吸取2μL菌液，按照50μL PCR反应体系，进行菌落PCR鉴定，出现目的条带且条带单一的，显示菌落为阳性克隆；

通过菌落PCR分别验证pETDuet-1质粒上的ACO基因，本实验所有设计的引物序列如表2所示，其中，PCR扩增ACO产物琼脂糖凝胶电泳图如图3所示：

表2：引物序列

②蛋白表达及可溶性鉴定

取上述菌液900μL，大肠杆菌中加入IPTG至浓度为0.5mM，诱导培养20小时；12000rpm离心1min，收集菌体，加入2倍上样缓冲液，重悬菌体，100℃水浴变性10min，用SDS-PAGE检测蛋白表达，结果如图4所示，显示为阳性克隆。

③菌样测序

将用以上两种方法鉴定后的阳性克隆，送至测序公司进行测序，进一步证明构建的阳性克隆的正确性。

最终构建得到大肠杆菌基因工程菌：

(BL21)/pETDuet-1-^CtACO₂、pET28a-SUMO-YdiI，

(BL21)/pETDuet-1-^CtACO₄、pET28a-SUMO-YdiI，

(BL21)/pETDuet-1-^CtACO₅、pET28a-SUMO-YdiI，

(BL21)/pETDuet-1-^YlACO、pET28a-SUMO-YdiI。

实施例4：酿酒酵母基因工程菌的构建

(1)酿酒酵母感受态细胞的制备

①挑取酿酒酵母单菌落(或挑取保存菌种)接种至50mL液体YPD培养基，30℃、200rpm过夜培养；

②取1mL酿酒酵母菌液接种于50mL液体YPD培养基中，30℃、200rpm培养至菌液OD₆₀₀为3.0-5.0左右；

③将10mL YPD过夜培养物稀释至OD₆₀₀为0.2～0.4左右；

④将菌液置于30℃恒温摇床中继续培养3～6h，使其OD₆₀₀达到0.6～1.0左右；

⑤将菌液转移到离心管中，4℃，3700rpm离心10min收集菌体；

⑥用10mL预冷的浓度为100mM的PBS缓冲液(pH7.4)重悬菌体，4℃，3700rpm离心10min收集菌体；

⑦每个离心管中加入1mL TE/LiAc溶液，重悬菌体，得感受态细胞；

⑧将感受态细胞分装，并于-80℃冻存。

(2)酿酒酵母中重组质粒的转化

①将重组质粒pETDuet-1-^CtACO₂和pESC-URA-SUMO-YdiI为一组、pETDuet-1-^CtACO₄和pESC-URA-SUMO-YdiI为一组、pETDuet-1-^CtACO₅和pESC-URA-SUMO-YdiI为一组、pETDuet-1-^YlACO和pESC-URA-SUMO-YdiI为一组，每组中两种质粒的体积比为1：1，共2μL，分别加入到50μL新鲜制备的感受态细胞中，加入500μL转化用溶液(PEG/LiAc，DMSO)，轻轻混匀，冰浴30min；

②30℃恒温摇床培养1h，每隔15min弹击管壁混匀；

③加入900μL液体YPD培养基，30℃，200rpm振荡培养60min；

④3700rpm离心10min收集菌体，弃上清，沉淀用100μL TE重悬；

④取上述菌液100μL，将酿酒酵母菌液涂布于带有100μg/mL氨苄霉素和40μg/mL链霉素的YPD固体培养基；

⑤YPD固体培养基于37℃培养箱中正置30min，待菌液被吸干后，倒置平板于37℃培养12-16h。

(3)阳性克隆的鉴定：

①菌落PCR鉴定

挑取上述培养出的单菌落，将酿酒酵母接种至1mL含有100μg/mL氨苄霉素和40μg/mL链霉素的YPD培养基，30℃、200rpm振荡培养6-8h；吸取2μL菌液，按照50μL PCR反应体系，按照实施例3的方法进行菌落PCR鉴定，验证pETDuet-1质粒上的ACO基因，出现目的条带且条带单一的，显示菌落为阳性克隆；

②蛋白表达及可溶性鉴定

取上述菌液900μL，酿酒酵母中加入2％半乳糖，诱导培养48小时，12000rpm离心1min，收集菌体，加入2倍上样缓冲液，重悬菌体，100℃水浴变性10min，按照实施例3的方式用SDS-PAGE检测蛋白表达，筛选阳性克隆；

③菌样测序

将用以上两种方法鉴定后的阳性克隆，送至测序公司进行测序，进一步证明构建的阳性克隆的正确性。

最终构建得到酿酒酵母基因工程菌：

Sc./pETDuet-1-^CtACO₂、pESC-URA-SUMO-YdiI，

Sc./pETDuet-1-^CtACO₄、pESC-URA-SUMO-YdiI，

Sc./pETDuet-1-^CtACO₅、pESC-URA-SUMO-YdiI，

Sc./pETDuet-1-^YlACO、pESC-URA-SUMO-YdiI。

实施例5：利用基因工程菌制备10-羟基-2-癸烯酸

(1)菌种活化：

将实施例3构建的大肠杆菌基因工程菌以1％的接种量接种至50mL含有50μg/mL卡那霉素和40μg/mL链霉素的液体LB培养基中，在37℃、200rpm振荡培养12h；

将实施例4构建的酿酒酵母基因工程菌以1％的接种量接种至50mL含有100μg/mL氨苄霉素和40μg/mL链霉素的液体YPD培养基中，在30℃、200rpm振荡培养12h；

(2)菌体转接：

取上述大肠杆菌基因工程菌活化菌株菌液1mL接入50mL含有50μg/mL卡那霉素和40μg/mL链霉素的液体LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养至菌液OD₆₀₀为0.8；降温至16℃适应1小时后，加入IPTG至浓度为0.5mM，37℃、200rpm继续诱导培养20小时；

取上述酿酒酵母基因工程菌活化菌株菌液1mL接入50mL含有100μg/mL氨苄霉素和40μg/mL链霉素的液体YPD培养基中，30℃、200rpm振荡培养至菌液OD₆₀₀为0.8，降温至16℃适应1小时后，加入2％半乳糖，30℃、200rpm继续诱导培养48小时；

(3)收集菌体：分别取以上培养的菌液50mL，5000rpm、4℃离心15min，收集菌体；

(4)用100mM的PBS缓冲液(pH 7.2-7.4)洗涤菌体三次，并用转化培养基重悬菌体接入转化培养基；大肠杆菌转化培养基包含甘油1％，葡萄糖0.4％，卡那霉素50μg/mL和链霉素40μg/mL，余量为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液，将10-羟基癸酸溶解于二甲基亚砜，再加入到转化培养基中，使培养基中10-羟基癸酸浓度为0.1g/L，37℃反应24h，得发酵液；酿酒酵母转化培养基包含甘油1％，葡萄糖0.4％，氨苄霉素100μg/mL和链霉素40μg/mL，余量为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液，将10-羟基癸酸溶解于二甲基亚砜，再加入到转化培养基中，使培养基中10-羟基癸酸浓度为0.1g/L，30℃反应24h，得发酵液。

发酵液硅烷化处理：取1mL发酵液于2mL离心管中，加入1mL 4M HCl溶液，涡旋离心，100℃加热10min，再于-80℃冷藏15min，室温融化后，加入1mL乙酸乙酯，涡旋离心，将有机相收集到新管中，加入100μL N,O-双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺振荡混匀，70℃水浴40min后备用。

气相色谱-质谱检测生成产物：气相色谱-质谱以氦气为载气，恒流模式，进样体积1μL，分流进样，分流比为1：50，进样温度250℃，50℃保持1min，以15℃/min升至250℃，保持10min。

发酵产物10-羟基-2-癸烯酸的质谱图如图5所示。

重组菌发酵生产10-羟基-2-癸烯酸的产量变化如图6所示。

检测的10-羟基-2-癸烯酸的产量及计算得到的转化率如表3所示：

表3：各基因工程菌10-羟基-2-癸烯酸的产量及转化率

由以上数据可知，初始宿主菌中由于缺少10-羟基-2-癸烯酸合成的关键酶，所以无法合成10-羟基-2-癸烯酸。当向宿主菌种转化脂酰辅酶A氧化酶基因和脂酰辅酶A硫酯酶基因后，制备得到的基因工程菌可以以10-羟基癸酸为底物一步合成10-羟基-2-癸烯酸，其合成途径大致为：脂酰辅酶A氧化酶催化10-羟基癸酸合成10-羟基-2-癸烯酰辅酶A，脂酰辅酶A硫酯酶催化10-羟基-2-癸烯酰辅酶A脱除辅酶A后合成10-羟基-2-癸烯酸，其转化率为36-92％。尤其是大肠杆菌基因工程菌(BL21)/pETDuet-1-^CtACO₂、pET28a-SUMO-YdiI和(BL21)/pETDuet-1-^CtACO₅、pET28a-SUMO-YdiI，其转化率分别达到了85％和92％，酿酒酵母基因工程菌Sc./pETDuet-1-^CtACO₂、pESC-URA-SUMO-YdiI和Sc./pETDuet-1-^CtACO₅、pESC-URA-SUMO-YdiI，其转化率都达到了82％，转化率得到了显著的提升。

Claims (10)

1.一种含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌，其特征在于，所述工程菌中包括脂酰辅酶A氧化酶基因和脂酰辅酶A硫酯酶基因。

2.如权利要求1所述的含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌，其特征在于，所述脂酰辅酶A氧化酶基因来源于热带假丝酵母或解脂耶氏酵母，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4；所述脂酰辅酶A硫酯酶基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.5。

3.如权利要求2所述的含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌，其特征在于，所述脂酰辅酶A氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9，所述脂酰辅酶A硫酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.10。

4.如权利要求1所述的含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌，其特征在于，所述工程菌的宿主菌为大肠杆菌或酿酒酵母。

5.权利要求1所述的含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

(1)构建重组质粒pETDuet-1-ACO、pET28a-SUMO-ACOT、pESC-URA-SUMO-ACOT；

所述脂酰辅酶A氧化酶ACO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4所示，所述脂酰辅酶A硫酯酶ACOT基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(2)将步骤(1)的重组质粒pETDuet-1-ACO和pET28a-SUMO-ACOT共同转化到大肠杆菌中，经筛选、鉴定后，得到大肠杆菌基因工程菌；将步骤(1)的重组质粒pETDuet-1-ACO和pESC-URA-SUMO-ACOT共同转化到酿酒酵母中，经筛选、鉴定后，得到酿酒酵母基因工程菌。

6.权利要求1所述的含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌在以10-羟基癸酸为底物制备10-羟基-2-癸烯酸中的应用。

7.利用含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌以10-羟基癸酸为底物制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，其特征在于，步骤如下：

将权利要求5构建的大肠杆菌基因工程菌经诱导培养后制得诱导细胞，将诱导细胞接入转化培养基中，并加入10-羟基癸酸，37℃发酵培养制得10-羟基-2-癸烯酸。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：

i.所述诱导培养为：将大肠杆菌基因工程菌接入含有浓度50μg/mL卡那霉素和40μg/mL链霉素的液体LB培养基中，在37℃振荡培养至菌液OD₆₀₀为0.8～1.2，降温至16～20℃适应1小时后，加入IPTG至浓度为0.5mM，继续诱导培养20～25小时，分离细胞，制得诱导细胞；优选的，所述分离细胞是在5000rpm条件下离心15min，收集细胞沉淀，然后用100mM、pH 7.2-7.4的PBS缓冲液洗涤细胞沉淀；

ii.所述转化培养基组份如下，均为质量百分比：

甘油1％，葡萄糖0.4％，卡那霉素50μg/mL、链霉素40μg/mL，余量为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液；

iii.加入10-羟基癸酸至浓度为0.1g/L；

iv.将10-羟基癸酸溶解于二甲基亚砜，再加入到转化培养基中。

9.利用含有脂酰辅酶A氧化酶基因的工程菌以10-羟基癸酸为底物制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，其特征在于，步骤如下：

将权利要求5构建的酿酒酵母基因工程菌经诱导培养后制得诱导细胞，将诱导细胞接入转化培养基中，并加入10-羟基癸酸，30℃发酵培养制得10-羟基-2-癸烯酸。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：

i.所述诱导培养为：将酿酒酵母基因工程菌接入含有浓度100μg/mL氨苄霉素和40μg/mL链霉素的液体YPD培养基中，在30℃振荡筛选培养至菌液OD₆₀₀为0.8～1.2，降温至16～20℃适应1小时后，加入2％半乳糖，继续诱导培养48～55小时，分离细胞，制得诱导细胞；优选的，所述分离细胞是在5000rpm条件下离心15min，收集细胞沉淀，然后用100mM、pH 7.2-7.4的PBS缓冲液洗涤细胞沉淀；

ii.所述转化培养基组份如下，均为质量百分比：

甘油1％，葡萄糖0.4％，氨苄霉素100μg/mL、链霉素40μg/mL，余量为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液；

iii.加入10-羟基癸酸至浓度为0.1g/L；

iv.将10-羟基癸酸溶解于二甲基亚砜，再加入到转化培养基中。

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