CN114107148B

CN114107148B - 一种高产透明质酸的基因工程菌株及其应用

Info

Publication number: CN114107148B
Application number: CN202111338339.9A
Authority: CN
Inventors: 于慧敏; 杜岩; 李付龙
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2021-11-12
Filing date: 2021-11-12
Publication date: 2023-12-29
Anticipated expiration: 2041-11-12
Also published as: CN114107148A

Abstract

本发明提供了一种高产透明质酸的基因工程菌株及其应用，所述基因工程菌株是强化透明质酸合成过程中的果糖‑6‑磷酸到D‑葡萄糖胺‑6‑磷酸的反应。本发明的高产透明质酸的基因工程菌株是在出发菌株中同时转入谷氨酰胺‑果糖‑6‑磷酸转氨酶以及谷氨酸合成酶或谷氨酰胺合成酶，来强化透明质酸合成中的限速步骤，从而提高透明质酸的产量。本发明中的宿主谷氨酸棒杆菌是食品安全级菌株，不产生任何内毒素和外毒素。所构建的新菌株摇瓶最高产量是出发菌株的2.8倍，达到17.4g/L，具有良好的工业应用前景。

Description

一种高产透明质酸的基因工程菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物化工、合成生物学和基因工程及代谢工程领域，具体涉及一种高产透明质酸的基因工程菌株及其应用。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic acid)，又名玻尿酸，是一种线性糖胺聚糖。其单体为N-乙酰-氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸，分子量能够达到10⁵～10⁷Da。不同分子量的透明质酸具有不同的用途：分子量高于10⁶Da的高分子量透明质酸具有优异的润滑性质及粘弹性，主要用于临床医学中的关节腔注射、软骨退变修复、眼科手术等。分子量介于10⁴～10⁶Da的低分子量透明质酸主要添加于护肤品和化妆品中，能够起到良好的保湿功效，还能够增加皮肤弹性、减少皱纹。透明质酸在食品保健领域也占据一席之地：分子量低于10⁴Da的透明质酸低聚寡糖则是良好的口服保健品，能够起到增加细胞新陈代谢、预防衰老的作用。

透明质酸最初通过动物组织提取法获得，原料为雄公鸡的鸡冠。但是这种方法制备的透明质酸产量很低；与此同时，产品中可能存在动物蛋白及粘多糖，导致纯化成本较高，产品中残留的动物性蛋白原对于过敏人群也具有一定的安全隐患。上世纪八十年代，丹麦Novozyme公司首创了微生物透明质酸发酵法，使得透明质酸的大规模生产成为可能。目前，发酵法已经成为我国透明质酸生产的主要工艺。工业生产中的常用菌株为兽疫链球菌、马疫链球菌和类马链球菌等动物性致病菌，产量为6-12g/L。利用兽疫链球菌生产透明质酸也具有一定的局限性：链球菌发酵培养基中需要添加血清、小牛肉浸出液、脑心浸出液等昂贵的成分，工业生产成本很高；兽疫链球菌是动物致病菌，具有致病性风险。开发更加经济并且安全的生产透明质酸的基因工程菌株具有重要的意义。

构建生产透明质酸的基因工程菌株需要引入透明质酸合成酶，迄今为止，透明质酸已经在大肠杆菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌等多种微生物中实现了异源合成。目前，提高微生物透明质酸发酵水平的方法包括优化透明质酸合成操纵子结构、培养条件优化、敲除或者弱化透明质酸合成竞争途径等。在透明质酸合成操纵子优化方面，研究人员公开了在枯草芽孢杆菌中不同人工操纵子对透明质酸产量的影响，所生产的透明质酸分子量达到1MDa(Widner B,Behr R,Von Dollen S,et al.Hyaluronic acid production inBacillus subtilis[J].Applied and Environmental Microbiology,2005,71(7):3747-3752.)。在培养条件优化方面，研究者公开了谷氨酸棒杆菌发酵生产透明质酸过程中培养基及培养条件的优化，提高了发酵液中透明质酸的产量(Cheng F,Gong Q,Yu H,etal.High-titer biosynthesis of hyaluronic acid by recombinant Corynebacteriumglutamicum[J].Biotechnology Journal,2016,11(4):574-584.)。敲除或者弱化透明质酸合成的竞争途径方面，国外研究人员公开了通过聚集规则间隔回文重复干扰技术(CRISPRi)同时弱化磷酸戊糖途径和糖酵解途径，使枯草芽孢杆菌生产透明质酸的产量较出发菌株相比提升108％，产量达到2.26g/L，同时所生产的透明质酸分子量也有提高(Westbrook AW,Ren X,Oh J,et al.Metabolic engineering to enhance heterologousproduction of hyaluronic acid in Bacillus subtilis[J].Metabolic Engineering,2018,47:401-413.)。研究人员公开了敲除透明质酸竞争途径中的Cg0420、Cg0424基因使谷氨酸棒杆菌生产透明质酸的产量提高14.9％，摇瓶产量达到6.4g/L(Wang Y,Hu L,HuangH,et al.Eliminating the capsule-like layer to promote glucose uptake forhyaluronan production by engineered Corynebacterium glutamicum[J].NatureCommunications,2020,11(1):1-10.)。进一步的，该期刊文献还报道了通过外源添加透明质酸酶将透明质酸生产和降解偶联，发酵罐产量可达74.1g/L，此时其产品为超低分子量透明质酸(分子量区间：51-56kDa)。专利文献CN 110305827 A和研究论文则公开了通过强化透明质酸合成途径的同时弱化竞争途径构建重组谷氨酸棒杆菌，其发酵罐产量高达28.7g/L，分子量为300-500kDa(Cheng F,Yu H,Stephanopoulos G.EngineeringCorynebacterium glutamicum for high-titer biosynthesis of hyaluronic acid[J].Metabolic Engineering,2019,55:276-289.)。

本专利发明人在前期研究中对两株透明质酸产量差异明显的重组谷氨酸棒杆菌的转录组进行了差异分析，结果表明：在相同培养条件下，高产透明质酸的菌株中有多个和谷氨酸/谷氨酰胺合成代谢相关的基因明显上调。这一现象表明，谷氨酰胺/谷氨酸在透明质酸合成过程中至关重要。具体表现为：在透明质酸合成路径中，果糖-6-磷酸到D-葡萄糖胺-6-磷酸的转化过程中，转氨酶GlmS将谷氨酰胺上的氨基转移到底物果糖-6-磷酸上，生成D-葡萄糖胺-6-磷酸，相应的谷氨酰胺生成谷氨酸。每生成1分子的透明质酸前体——UDP-N-乙酰葡萄糖胺，就需要消耗1分子的谷氨酰胺。而通过协同强化转氨反应和强化谷氨酰胺(或谷氨酸)的供应来提高透明质酸产量的研究还未见报道。

发明内容

在谷氨酸棒杆菌异源合成透明质酸的过程中，需要诸多的辅因子，例如NAD⁺、UDP、谷氨酰胺等。其中谷氨酰胺是果糖-6-磷酸到D-葡萄糖胺-6-磷酸过程的辅因子，在谷氨酰胺-果糖6-磷酸转氨酶GlmS的催化下谷氨酰胺的氨基转移到果糖6-磷酸，同时谷氨酰胺生成谷氨酸。每生成一分子透明质酸前体UDP-N-乙酰葡萄糖胺就需要消耗一分子的谷氨酰胺。发明人在前期研究发现：在透明质酸合成过程中果糖-6-磷酸到D-葡萄糖胺-6-磷酸的反应为限速步骤。因此，强化该反应有助于促进产物的合成。本专利的核心就在于通过基因工程手段，协同强化转氨酶GlmS的表达以及强化谷氨酰胺合成酶(或谷氨酸合成酶)的表达，来强化限速步骤，从而提高谷氨酸棒杆菌异源生产透明质酸的产量。此外，本发明所使用的谷氨酸合成酶为NADH依赖型酶，在合成谷氨酸、强化谷氨酰胺辅因子供应的同时，还能够再生透明质酸合成所需的另一种重要辅因子NAD⁺，起到两种辅因子协同强化的效果。

一方面，本申请提供了一种高产透明质酸的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株也可单独表达谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶(GlmS)、谷氨酰胺合成酶(Cgl2229)、谷氨酰胺合成酶(Cgl2229)中的一种或一种以上。

进一步地，所述基因工程菌株同时表达谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶(GlmS)和谷氨酰胺合成酶(Cgl2229)，或者同时表达谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶(GlmS)和谷氨酸合成酶(Glt1)。

进一步地，所述谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶、谷氨酰胺合成酶来源于但不限于谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等菌株，优选来源于谷氨酸棒杆菌；谷氨酸合成酶来源于酿酒酵母。

进一步地，所述制备时所用的原始菌株为谷氨酸棒杆菌，优选地，为ATCC13032。

进一步地，所述原始菌株为中国专利申请号ZL201910495504.8中的C.glu-Δldh/AB、C.glu-Δldh/A-PdapB-B、C.glu-Δldh/A-PdapB-B-aF或者C.glu-Δldh-aEG/A-PdapB-B-aF-aE。

进一步地，所述谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶蛋白序列为SEQ ID NO.1或者在此基础上对其酶活进行突变改造的单点或多点突变所获得的突变体，优选地，其141位丙氨酸突变为亮氨酸、异亮氨酸或者甘氨酸，更优选地，突变为甘氨酸；谷氨酰胺合成酶蛋白序列为SEQ ID NO.2或者在此基础上对其酶活进行突变改造的单点或多点突变所获得的突变体，优选地，其210位天冬酰胺突变为苏氨酸、组氨酸、或者谷氨酰胺，更优选的，突变为苏氨酸；谷氨酸合成酶蛋白序列为SEQ ID NO.3或者在此基础上对其酶活进行突变改造的单点或多点突变所获得的突变体，优选的，将其306位精氨酸突变为赖氨酸、丙氨酸和异亮氨酸，更优选的，突变为赖氨酸。

进一步地，所述GlmS蛋白(又称为Cgl2271蛋白)Cgl2229蛋白、Glt1蛋白受强启动子控制。

另一方面，本申请提供了上述工程菌在生产透明质酸中的应用。

进一步地，所述应用步骤如下：

将基因工程重组菌接入培养基中，进行扩大培养，得到基因工程重组菌菌液；按照1-20％体积百分比将上述步骤获得的工程菌菌液接入发酵培养基中，进行发酵培养，得到含有透明质酸的发酵液。

进一步地，所述的扩大培养的方法为：在20-40℃、摇床转速为100-250rpm的条件下培养10-20h。

进一步地，所述的发酵培养的方法为：在20-40℃、摇床转速为100-250rpm的条件下培养培养1.5-4h时加入0.5-1.5mM IPTG诱导剂后继续培养40-72h。

进一步地，所述发酵培养基的组分为：可发酵糖类10-100g/L，无机氮源5-60g/L，有机氮源1-50g/L，KH₂PO₄ 0.1-6g/L，K₂HPO₄ 0.1-6g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1-10g/L，MnSO₄0.001-0.1g/L，FeSO₄·7H₂O 0.001-0.1g/L，谷氨酰胺或谷氨酸0.5-5g/L，3-吗啉丙磺酸(MOPS)20-50g/L，pH 6.0-8.0。

另一方面，本申请提供了上述基因工程菌的制备方法，包括如下步骤：

扩增得到谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶基因glmS、谷氨酰胺合成酶基因cgl2229、谷氨酸合成酶基因glt1，将glmS和cgl2229这两段基因插入穿梭质粒，构建表达质粒；将glmS和glt1这两段基因插入穿梭质粒，构建表达质粒；将任一种表达质粒转入到出发菌株，构建基因工程菌。

进一步的，具体方法为：

1.利用上下游引物，以谷氨酸棒杆菌基因组为模板进行聚合酶链式反应，扩增得到谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶基因glmS、其核酸序列如SEQ ID NO.4所示。同样的，利用上下游引物，以谷氨酸棒杆菌基因组为模板进行聚合酶链式反应，扩增得到谷氨酰胺合成酶基因cgl2229，其核酸序列如SEQ ID NO.5所示；以酿酒酵母基因组为模板进行聚合酶链式反应，扩增得到谷氨酸合成酶基因glt1，其核酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.将穿梭质粒进行双酶切，使用Gibson连接试剂盒将需要插入的片段连接入穿梭质粒中，得到连接产物。

3.将连接产物转化至大肠杆菌E.coli TOP10感受态细胞，涂布于抗性平板培养基，筛选阳性克隆，得到如下表达质粒：pEC-XK99E-gmlS-cgl2229、pEC-XK99E-glmS-glt1。

4.将步骤三中所构建的表达质粒pEC-XK99E-gmlS-cgl2229、pEC-XK99E-glmS-glt1中任一一种转入出发菌株中，获得同时表达有谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶和谷氨酰胺合成酶、同时表达有谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶和谷氨酸合成酶的基因工程重组菌。

进一步的，具体方法为：

1.以谷氨酸棒杆菌基因组为模板进行聚合酶链式反应，扩增并获得glmS基因序列，其核酸序列如SEQ ID NO.4所示；以谷氨酸棒杆菌基因组为模板进行聚合酶链式反应，扩增并获得cgl2229基因序列，其核酸序列如SEQ ID NO.5所示；以酿酒酵母基因组为模板进行聚合酶链式反应，扩增并获得glt1基因序列，其核酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.pEC-XK99E质粒用KpnI和SalI进行双酶切，纯化酶切产物，将扩增得到的glmS基因和cgl2229基因，以及glmS基因和glt1基因，使用Gibson连接试剂盒连入线性载体pEC-XK99E中，得到连接产物。

3.将连接产物转化至大肠杆菌E.coli TOP10感受态细胞，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养至长出单菌落。挑取单菌落进行菌落PCR验证，挑取阳性克隆进行扩大培养，提取质粒并进行测序验证。

4.将测序无误的重组质粒pEC-XK99E-glmS-cgl2229、pEC-XK99E-glmS-glt1电转化至出发菌株谷氨酸棒杆菌C.glu-Δldh/A-PdapB-B-aF中，涂布于含有5μg/mL氯霉素和25μg/mL卡那霉素的LBHIS平板上，30℃培养直至长出单菌落。挑取单菌落进行菌落PCR验证，获得含有pEC-XK99E-glmS-cgl2229、pEC-XK99E-glmS-glt1质粒的基因工程重组菌C.glu-glmS-cgl2229和C.glu-glmS-glt1。

上述发酵培养基中的糖类可选葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、淀粉水解液、纤维素、纤维素预处理液、半纤维素、木聚糖等；无机氮源可选硝酸铵、硝酸钠、硝酸钾、硫酸铵、氯化铵等；有机氮源可选玉米浆粉、玉米浆、大豆粉、酵母膏、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨等。

本申请中所述的突变体本领域技术人员可以以常规手段设计、筛选和验证功能。

除了谷氨酸棒杆菌ATCC 13032及以其为基础的基因工程菌株外，其他有产透明质酸能力的谷氨酸棒杆菌、兽疫链球菌、枯草芽孢杆菌或乳酸菌等菌株及以其为基础的基因工程菌株经过适当的验证也可用于本申请。

申请人的在先专利申请ZL201910495504.8中对C.glu-Δldh/AB、C.glu-Δldh/A-PdapB-B、C.glu-Δldh/A-PdapB-B-aF或者C.glu-Δldh-aEG/A-PdapB-B-aF-aE。的制备方法有详细的记载：

所述谷氨酸棒杆菌C.glu-Δldh/AB，是指在谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌中敲除乳酸脱氢酶基因，转入透明质酸合成酶基因和UDP-葡萄糖脱氢酶基因。

所述谷氨酸棒杆菌C.glu-Δldh/A-PdapB-B，是指在C.glu-Δldh/AB中，将UDP-葡萄糖脱氢酶基因同时置于两个启动子控制下表达。

所述谷氨酸棒杆菌C.glu-Δldh/A-PdapB-B-aF，是指在C.glu-Δldh/A-PdapB-B中，下调了果糖二磷酸醛缩酶基因的表达量，来弱化糖酵解途径。

所述谷氨酸棒杆菌C.glu-Δldh-aEG/A-PdapB-B-aF-aE，是指在C.glu-Δldh/A-PdapB-B-aF中，下调了丙酮酸脱氢酶基因的表达量。

有益效果：

本发明采用基因工程技术手段构建基因工程重组菌，在生产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌细胞中扩增并表达谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶GlmS的同时，协同表达谷氨酰胺合成酶Cgl2229和谷氨酸合成酶Glt1，通过强化透明质酸合成过程中的限速步骤——果糖-6-磷酸到D-葡萄糖胺-6-磷酸的反应，来提高透明质酸的产量。本发明所采用的谷氨酸棒杆菌宿主是食品级安全菌株，对人、畜均无致病性；所构建的基因工程重组菌株透明质酸产量高，与出发菌株相比摇瓶产量最高为17.4g/L，相比出发菌株提高2.8倍，具有良好的产业化应用前景。

附图说明

图1为重组谷氨酸棒杆菌中透明质酸合成途径示意图。其中F6P为果糖-6-磷酸，GAM6P为D-葡萄糖胺-6-磷酸；Gln为谷氨酰胺，Glu为谷氨酸。

图2为用于基因过表达质粒pEC-XK99E的示意图。

图3为携带有谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶基因和谷氨酰胺合成酶基因的谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pEC-XK99E-glmS-cgl2229的示意图。

图4为携带谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶基因和谷氨酸合成酶基因的谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pEC-XK99E-glmS-glt1的示意图。

图5为携带有谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶基因的谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pEC-XK99E-glmS的示意图。

图6为携带有谷氨酰胺合成酶基因的谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pEC-XK99E-cgl2229的示意图。

图7为携带有谷氨酸合成酶基因的谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pEC-XK99E-glt1的示意图。

图8为原始菌株C.glu-Δldh/A-PdapB-B-aF(本发明中记为C.glu-0)和基因工程菌株C.glu-glmS-cgl2229，C.glu-glmS-glt1，C.glu-glmS、C.glu-cgl2229、C.glu-glt1在500mL摇瓶中培养时的透明质酸的产量比较。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施案例对本发明做进一步说明，如未特别指明，实施例中的方法均为常规方法，下面描述的试剂如无特殊说明均可通过商业途径获得。

实施例1：携带有谷氨酰胺合成酶的重组质粒pEC-XK99E-cgl2229的构建

重组质粒pEC-XK99E-cgl2229的构建，包括如下步骤：

1.以谷氨酸棒杆菌基因组DNA为模板，以cgl2229-F1/cgl2229-R1引物通过PCR扩增谷氨酸棒杆菌的谷氨酰胺合成酶基因cgl2229；

2.利用限制性内切酶KpnI/SalI对质粒pEC-XK99E进行双酶切，并进行纯化；

3.利用Gibson试剂盒连接线性化的质粒pEC-XK99E和cgl2229基因片段。反应温度为50℃，反应时间15分钟-60分钟。

4.通过化学转化法将连接成环状的质粒转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞(购买于全式金，具体操作步骤如下：将10微升连接体系加入到100微升感受态细胞中，置于冰浴上放置30分钟，42℃热激90秒后，继续冰浴2分钟，加入900微升无抗LB培养基，置于摇床中复苏60分钟，条件为200rpm，37℃。复苏结束后涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板，挑选阳性克隆，并进行PCR验证，得到重组质粒pEC-XK99E-cgl2229。

LB培养基配方：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH＝7.0，固体平板培养基含有琼脂1.5％-2％。

引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，用无菌水溶解稀释至10μM使用。PCR扩增过程中使用的DNA聚合酶采用购自于南京Vazyme公司的Phanta Max Master 2×mix。

引物的序列如下：

cgl2229-F1：5’-ATGGAATTCGAGCTCGGTACCAAAGGAGGACACATATGAACAGCGAACAGG-3’(SEQ ID NO.7)

Cgl2229-R1：5’-GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACCTAGTAATCAAGATTG-3’(SEQ IDNO.8)

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

实施例2：携带有谷氨酸合成酶的重组质粒pEC-XK99E-glt1的构建

重组质粒pEC-XK99E-glt1的构建，包括如下步骤：

1.以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组DNA为模板，以glt1-F1/glt1-R1引物通过PCR扩增酿酒酵母的谷氨酸合成酶基因glt1；

3.利用Gibson试剂盒连接线性化的质粒pEC-XK99E和glt1基因片段。反应温度为50℃，反应时间15分钟-60分钟。

4.通过化学转化法将连接成环状的质粒转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞(购买于全式金，具体操作步骤见实施例1，得到重组质粒pEC-XK99E-glt1。

LB培养基组成见实施例1。

引物序列如下：

glt1-F1：5’-AGACCATGGAATTCGAGCTCGGTACCAAAGGAGGACACATATGCCAGTGTTGAAATCAG-3’(SEQ ID NO.9)

glt1-R1：5’-CCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTTAGACTTGACTAGCTAATTC-3’(SEQ IDNO.10)

实施例3：携带有谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶的重组质粒pEC-XK99E-glmS的构建

重组质粒pEC-XK99E-glmS的构建，包括如下步骤：

1.以谷氨酸棒杆菌基因组DNA为模板，以glmS-F1/glmS-R1为上下游引物通过PCR扩增谷氨酸棒杆菌的谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶基因glmS，并进行纯化；

2.利用限制性内切酶KpnI/SalI对质粒pEC-XK99E进行双酶切，并进行回收纯化；

3.利用Gibson试剂盒连接线性化的质粒pEC-XK99E和glmS基因片段。反应温度为50℃，反应时间15分钟-60分钟。

4.通过化学转化法将连接成环状的质粒转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞(购买于全式金，具体操作步骤见实施例1，得到重组质粒pEC-XK99E-glmS。

LB培养基组成见实施例1。

引物序列如下：

glmS-F1：5’-AGACCATGGAATTCGAGCTCGGTACCAAAGGAGGACACATATGTGTGGAATTGTTGG-3’(SEQ ID NO.11)

glmS-R1：5’-CCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTTATTCGACGGTGACAG-3’(SEQ IDNO.12)实施例4：携带有谷氨酰胺合成酶突变体的重组质粒构建

1.以N210Q-F/N210Q-R引物为上下游引物，以实施例1中所获得的质粒为模板，进行聚合酶链式反应，获得带有突变位点的线性化质粒，并进行纯化回收

2.利用Gibson Assembly试剂盒(Clonesmarter，购买于中美泰和生物技术有限公司)进行连接，并通过化学转化法转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞(购买于全式金，具体操作步骤见实施例1)。得到重组质粒pEC-XK99E-cgl2229(N210Q)

引物的序列如下：

N210Q-F：5’-GCCGACCAGATCATGACCTTCCGC-3’(SEQ ID NO.13)

N210Q-R：5’-ATGATCTGGTCGGCCATGGTGAGC-3’(SEQ ID NO.14)

实施例5：携带有谷氨酸合成酶突变体的重组质粒构建

1.以R306K-F/R306K-R引物为上下游引物，以实施例1中所获得的质粒为模板，进行聚合酶链式反应，获得带有突变位点的线性化质粒，并进行纯化回收

2.利用Gibson Assembly试剂盒(Clonesmarter，购买于中美泰和生物技术有限公司)进行连接，并通过化学转化法转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞(购买于全式金，具体操作步骤见实施例1)。得到重组质粒pEC-XK99E-glt1(R306K)

引物的序列如下：

R306K-F：5’-ATGCGCTCCAAGGAAGGTGTGATGAATTC-3’(SEQ ID NO.15)

R306K-R：5’-ACCTTCCTTGGAGCGCATCCAATTC-3’(SEQ ID NO.16)

实施例6：携带有谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶突变体的重组质粒构建

1.以A141G-F/A141G-R引物为上下游引物，以实施例1中所获得的质粒为模板，进行聚合酶链式反应，获得带有突变位点的线性化质粒，并进行纯化回收

2.利用Gibson Assembly试剂盒(Clonesmarter，购买于中美泰和生物技术有限公司)进行连接，并通过化学转化法转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞(购买于全式金，具体操作步骤见实施例1)。得到重组质粒pEC-XK99E-glmS(A141G)

引物的序列如下：

A141G-F：5’-TTTGCTTGGTGAAATTTACAATAC-3’(SEQ ID NO.17)

A141G-R：5’-AAATTTCACCAAGCAAAGAAGCAG-3’(SEQ ID NO.18)

实施例7：携带有谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶和谷氨酰胺合成酶的重组质粒pEC-XK99E-glmS-cgl2229的构建

重组质粒pEC-XK99E-glmS-cgl2229的构建，包括如下步骤：

1.以谷氨酸棒杆菌基因组DNA为模板，以glmS-F/glmS-R为上下游引物通过PCR扩增谷氨酸棒杆菌的谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶基因glmS，并进行纯化；以谷氨酸棒杆菌基因组DNA为模板，以cgl2229-F/cgl2229-R为上下游引物通过PCR扩增谷氨酸棒杆菌的谷氨酰胺合成酶基因cgl2229，并进行纯化；

3.利用Gibson试剂盒连接线性化的质粒pEC-XK99E和glmS基因片段以及cgl2229基因片段。反应温度为50℃，反应时间15分钟-60分钟。

4.通过化学转化法将连接成环状的质粒转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞(购买于全式金，具体操作步骤见实施例1，得到重组质粒pEC-XK99E-glmS-cgl2229。

LB培养基组成见实施例1。

引物序列如下：

glmS-F：5’-ATGGAATTCGAGCTCGGTACCAAAGGAGGACACATATGTGTGGAATTGTTGG-3’(SEQID NO.19)

glmS-R：5’-ATTCCTCCTTTGTCGACTTATTCGACGGTGACAG-3’(SEQ ID NO.20)

cgl2229-F：5’-TAAGTCGACAAAGGAGGAATGAACAGCGAACAGG-3’(SEQ ID NO.21)

cgl2229-R：5’-AAACAGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGCTAGTAATCAAGATTGTTTC-3’(SEQ IDNO.22)

实施例8：携带有谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶和谷氨酸合成酶的重组质粒pEC-XK99E-glmS-glt1的构建

重组质粒pEC-XK99E-glmS-glt1的构建，包括如下步骤：

1.以谷氨酸棒杆菌基因组DNA为模板，以glmS-F1/glmS-R2为上下游引物通过PCR扩增谷氨酸棒杆菌的谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶基因glmS，并进行纯化；以酿酒酵母基因组DNA为模板，以glt1-F2/glt1-R1为上下游引物通过PCR扩增酿酒酵母的谷氨酸合成酶基因glt1，并进行纯化；

3.利用Gibson试剂盒连接线性化的质粒pEC-XK99E和glmS基因片段以及glt1基因片段。反应温度为50℃，反应时间15分钟-60分钟。

4.通过化学转化法将连接成环状的质粒转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞(购买于全式金，具体操作步骤见实施例1，得到重组质粒pEC-XK99E-glmS-glt1。

LB培养基组成见实施例1。

引物序列如下：

glmS-R2：5’-TGGCATTCCTCCTTTGTCGACTTATTCGACGGTGACAG-3’(SEQ ID NO.23)

glt1-F2：5’-CGACAAAGGAGGAATGCCAGTGTTGAAATCAG-3’(SEQ ID NO.24)

glmS-F1，glt1-R1见实施例1和实施例2。

实施例9：过表达谷氨酰胺合成酶的重组透明质酸生产菌株C.glu-cgl2229构建

将实施例1中构建得到的重组质粒pEC-XK99E-cgl2229通过电转化法转入出发菌株C.glu-Δldh/A-PdapB-B-aF感受态细胞(出发重组菌株构建方法详见中国专利CN110305827A，在本专利中记为C.glu-0)。上述的电转化的具体操作为：各取10μL上述重组质粒加入到100μL C.glu-Δldh/A-PdapB-B-aF感受态细胞感受态细胞中，混合均匀之后冰浴30min，移入1mm电转杯；调节电穿孔仪的电压为1.8kV，将电转杯装入电穿孔仪，按下电击键；电击结束之后马上向电击杯中加入900μL LBHIS复苏培养基，重悬细胞，并转入1.5mL离心管。30℃，200rpm复苏2h。复苏结束后，13000rpm高速离心并除去800μL上清液，将离心下来的细胞重新悬浮，并涂布于LBHIS固体培养基上(卡那霉素25μg/mL，氯霉素5μg/mL)，置于30℃培养箱倒置培养16-24h，挑取阳性克隆利用PCR进行验证，得到基因工程重组菌株C.glu-cgl2229。

LBHIS培养基组分：酵母提取物2.5g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，脑心浸出液18.5g/L，山梨醇91g/L。

实施例10：过表达谷氨酸合成酶的重组透明质酸生产菌株C.glu-glt1构建

将实施例2中构建得到的重组质粒pEC-XK99E-glt1通过电转化法转入出发菌株C.glu-Δldh/A-PdapB-B-aF感受态细胞(出发重组菌株构建方法详见中国专利CN110305827 A，在本专利中记为C.glu-0)。上述的电转化的具体操作见实施例4，得到基因工程重组菌株C.glu-glt1。

实施例11：过表达谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶的重组透明质酸生产菌株C.glu-glmS构建

将实施例3中构建得到的重组质粒pEC-XK99E-glmS通过电转化法转入出发菌株C.glu-Δldh/A-PdapB-B-aF感受态细胞(出发重组菌株构建方法详见中国专利CN110305827 A，在本专利中记为C.glu-0)。上述的电转化的具体操作见实施例4，得到基因工程重组菌株C.glu-glmS。

实施例12：同时过表达谷氨酰胺-果糖-6-磷酸合成酶和谷氨酰胺合成酶的重组透明质酸生产菌株C.glu-glmsS-cgl2229构建

将实施例7中构建得到的重组质粒pEC-XK99E-glmS-cgl2229通过电转化法转入出发菌株C.glu-Δldh/A-PdapB-B-aF感受态细胞(出发重组菌株构建方法详见中国专利CN110305827 A，在本专利中记为C.glu-0)。上述的电转化的具体操作见实施例4，得到基因工程重组菌株C.glu-glmS-cgl2229。

实施例13：同时过表达谷氨酰胺-果糖-6-磷酸合成酶和谷氨酸合成酶的重组透明质酸生产菌株C.glu-glmS-glt1构建

将实施例8中构建得到的重组质粒pEC-XK99E-glmS-glt1通过电转化法转入出发菌株C.glu-Δldh/A-PdapB-B-aF感受态细胞(出发重组菌株构建方法详见中国专利CN110305827 A，在本专利中记为C.glu-0)。上述的电转化的具体操作见实施例4，得到基因工程重组菌株pEC-XK99E-glmS-glt1。

实施例14：基因工程菌株发酵生产透明质酸

将出发菌株、实施例9-13所构建的基因工程重组菌接种于LB液体培养基(含有5μg/mL氯霉素，25μg/mL卡那霉素)中，30℃、200rpm条件下培养12-16h后，以体积比5％的比例接入发酵培养基中。30℃、200rpm条件下培养3h，加入IPTG(终浓度1mM)，继续培养48h。发酵期间，每12h用6M NaOH调节pH至7.2.。在第24h时补加碳源，维持糖浓度在5-10g/L。

发酵培养基的配方为：葡萄糖40g/L，硫酸铵30g/L，玉米浆粉20g/L，KH₂PO₄ 1g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MnSO₄ 0.01g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，MgSO₄ 5g/L，3-吗啉丙磺酸20-50g/L，谷氨酰胺2g/L。

取1mL上述所得的发酵液加入3mL的无水乙醇，4℃下放置1h；13000rpm离心10min，除去上清后室温下倒置1h，待乙醇完全挥发之后用去离子水重悬，得到透明质酸溶液。稀释适当倍数后，加入到700μL的乙酸缓冲液(0.2mol/L醋酸钠、0.15mol/L氯化钠，用乙酸调节pH至6.0)和2mL CTAB溶液(0.5mol/L，使用NaOH溶液溶解)，反应5min后测定OD₄₀₀。

测定结果显示，实施例9-13所构建的基因工程菌的透明质酸摇瓶产量均达到13g/L以上，最高产量为出发菌株的2.8倍，达到17.4g/L。所构建的基因工程菌株透明质酸产量高，具有良好的工业应用前景。

以上的各个实施例仅仅是用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解；其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中的部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不能使得相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 清华大学

<120> 一种高产透明质酸的基因工程菌株及其应用

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 623

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 1

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<210> 2

<211> 446

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 2

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Ser Val Val Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ala Leu Glu Glu Gly

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<211> 2144

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 3

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1625 1630 1635

Lys Thr Arg Gly Phe Met Ile His Lys Arg Arg His Glu Thr His

1640 1645 1650

Arg Asp Pro Arg Thr Arg Val Asn Asp Trp Lys Glu Phe Thr Asn

1655 1660 1665

Pro Ile Thr Lys Lys Asp Ala Lys Tyr Gln Thr Ala Arg Cys Met

1670 1675 1680

Asp Cys Gly Thr Pro Phe Cys Leu Ser Asp Thr Gly Cys Pro Leu

1685 1690 1695

Ser Asn Ile Ile Pro Lys Phe Asn Glu Leu Leu Phe Lys Asn Gln

1700 1705 1710

Trp Lys Leu Ala Leu Asp Lys Leu Leu Glu Thr Asn Asn Phe Pro

1715 1720 1725

Glu Phe Thr Gly Arg Val Cys Pro Ala Pro Cys Glu Gly Ala Cys

1730 1735 1740

Thr Leu Gly Ile Ile Glu Asp Pro Leu Gly Ile Lys Ser Val Glu

1745 1750 1755

Arg Ile Ile Ile Asp Asn Ala Phe Lys Glu Gly Trp Ile Lys Pro

1760 1765 1770

Cys Pro Pro Ser Thr Arg Thr Gly Phe Thr Val Gly Val Ile Gly

1775 1780 1785

Ser Gly Pro Ala Gly Leu Ala Cys Ala Asp Met Leu Asn Arg Ala

1790 1795 1800

Gly His Thr Val Thr Val Tyr Glu Arg Ser Asp Arg Cys Gly Gly

1805 1810 1815

Leu Leu Met Tyr Gly Ile Pro Asn Met Lys Leu Asp Lys Ala Ile

1820 1825 1830

Val Gln Arg Arg Ile Asp Leu Leu Ser Ala Glu Gly Ile Asp Phe

1835 1840 1845

Val Thr Asn Thr Glu Ile Gly Lys Thr Ile Ser Met Asp Glu Leu

1850 1855 1860

Lys Asn Lys His Asn Ala Val Val Tyr Ala Ile Gly Ser Thr Ile

1865 1870 1875

Pro Arg Asp Leu Pro Ile Lys Gly Arg Glu Leu Lys Asn Ile Asp

1880 1885 1890

Phe Ala Met Gln Leu Leu Glu Ser Asn Thr Lys Ala Leu Leu Asn

1895 1900 1905

Lys Asp Leu Glu Ile Ile Arg Glu Lys Ile Gln Gly Lys Lys Val

1910 1915 1920

Ile Val Val Gly Gly Gly Asp Thr Gly Asn Asp Cys Leu Gly Thr

1925 1930 1935

Ser Val Arg His Gly Ala Ala Ser Val Leu Asn Phe Glu Leu Leu

1940 1945 1950

Pro Glu Pro Pro Val Glu Arg Ala Lys Asp Asn Pro Trp Pro Gln

1955 1960 1965

Trp Pro Arg Val Met Arg Val Asp Tyr Gly His Ala Glu Val Lys

1970 1975 1980

Glu His Tyr Gly Arg Asp Pro Arg Glu Tyr Cys Ile Leu Ser Lys

1985 1990 1995

Glu Phe Ile Gly Asn Asp Glu Gly Glu Val Thr Ala Ile Arg Thr

2000 2005 2010

Val Arg Val Glu Trp Lys Lys Ser Gln Ser Gly Val Trp Gln Met

2015 2020 2025

Val Glu Ile Pro Asn Ser Glu Glu Ile Phe Glu Ala Asp Ile Ile

2030 2035 2040

Leu Leu Ser Met Gly Phe Val Gly Pro Glu Leu Ile Asn Gly Asn

2045 2050 2055

Asp Asn Glu Val Lys Lys Thr Arg Arg Gly Thr Ile Ala Thr Leu

2060 2065 2070

Asp Asp Ser Ser Tyr Ser Ile Asp Gly Gly Lys Thr Phe Ala Cys

2075 2080 2085

Gly Asp Cys Arg Arg Gly Gln Ser Leu Ile Val Trp Ala Ile Gln

2090 2095 2100

Glu Gly Arg Lys Cys Ala Ala Ser Val Asp Lys Phe Leu Met Asp

2105 2110 2115

Gly Thr Thr Tyr Leu Pro Ser Asn Gly Gly Ile Val Gln Arg Asp

2120 2125 2130

Tyr Lys Leu Leu Lys Glu Leu Ala Ser Gln Val

2135 2140

<210> 4

<211> 1872

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 4

atgtgtggaa ttgttggata tattggccaa gcgggcgact cccgtgatta ctttgctcta 60

gatgtagttg ttgaaggact acgtcgcctg gaataccgcg gatatgactc cgcaggtatt 120

gctattcacg ccaatggtga gattagctac cgaaagaagg ccggaaaggt tgctgcacta 180

gatgcagaaa tcgctaaagc acctcttcca gattctattt tgggaattgg acacacccgt 240

tgggcaactc atggtggccc aaccgatgtc aacgctcacc cccacgttgt ttccaatggc 300

aagcttgccg tagtacacaa cggcatcatc gaaaactttg cggaactgcg ctctgagctt 360

tccgctaagg gctacaactt tgtatccgat accgataccg aagttgctgc ttctttgctt 420

gctgaaattt acaatactca ggcaaacggt gacctcaccc ttgctatgca gctgaccggt 480

cagcgccttg agggtgcttt caccctgcta gctattcatg ctgatcacga tgaccgcatc 540

gttgcagctc gtcgtaactc tcctttggtt atcggcgtcg gcgagggcga gaacttcctc 600

ggatctgacg tttctggctt tattgattac acccgcaagg ctgtagagct ggctaatgac 660

caggttgtta ccatcaccgc tgatgattac gccatcacca actttgatgg atcagaagca 720

gttggcaagc ctttcgacgt ggagtgggac gctgcagctg ctgaaaaggg tggcttcggt 780

tccttcatgg agaaggaaat ccacgatcag ccagcagctg ttcgcgatac cctgatgggc 840

cgtcttgatg aagatggcaa gctcgttctt gatgagctgc gcatcgatga agctattctg 900

cgtagtgtcg acaagatcgt cattgttgct tgtggtactg cagcttatgc aggccaggtt 960

gctcgttacg ccattgagca ctggtgccgc atcccaaccg aggtggagct ggctcacgag 1020

ttccgttacc gcgacccaat cctcaacgag aagacccttg ttgtggcatt gtcccagtcc 1080

ggcgagacca tggataccct catggctgtt cgccacgcac gtgagcaggg tgccaaggtt 1140

gttgctattt gtaacactgt tggatccact cttccacgtg aagcagatgc gtccctgtac 1200

acctacgctg gccctgagat cgctgtggcg tccaccaagg cgttcttggc tcagatcact 1260

gcttcttact tgcttggcct gtacttggct cagctgcgcg gcaacaagtt cgctgatgag 1320

gtttcttcca ttctggacag cctgcgtgag atgcctgaga agattcagca ggtcatcgat 1380

gcagaagagc agatcaagaa gcttggccaa gatatggcag atgctaagtc tgtgctgttc 1440

ctgggccgcc acgttggttt cccagttgcg cttgagggtg cgttgaagct caaggagatc 1500

gcatacctgc acgctgaagg tttcgctgca ggcgagctca agcacggccc aattgctttg 1560

gttgaggaag gccagccgat cttcgttatc gtgccttcac ctcgtggtcg cgattccctg 1620

cactccaagg ttgtctccaa cattcaggag atccgtgcac gtggcgctgt caccatcgtg 1680

attgcagagg aaggcgatga ggctgtcaac gattacgcca acttcatcat ccgcattcct 1740

caggccccaa ccctgatgca gcctctgctg tccaccgtgc ctctgcagat ctttgcgtgc 1800

gctgtggcaa ccgcaaaggg ctacaacgtg gatcagcctc gtaacctggc aaagtctgtc 1860

accgtcgaat aa 1872

<210> 5

<211> 1341

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 5

atgaacagcg aacaggaatt tgtactcagc gccattgaag aacgcgacat taagtttgtg 60

cgtctatggt tcactgacat tcttggccac ttgaagtcag tggttgtggc tcctgcagaa 120

ctagagtctg cgttggaaga aggcatcgga ttcgatggct cagccattga gggctacgcg 180

cgtatctcgg aagcggacac cattgcccgc ccagatccat cgacattcca ggtcctccca 240

ctagaagcgg gcatctcaaa actgcaggca gcacgcctgt tttgcgatgt cacgatgcca 300

gacggacagc catctttttc tgacccgcgc caagtgctgc gcaggcaggt ccaactagct 360

gcagatgaag gcttgacctg catgatctca ccagagattg agttctattt ggtgcaaagc 420

cttcgcacca acggactgcc acctgtgccc actgacaacg gcggatattt cgaccaagcc 480

acattcaatg aggcgccgaa tttccgtcga aacgcgatgg tagcgctgga ggaactcggc 540

atccctgtcg agttctccca ccatgaaact gcacctggcc agcaagaaat cgatttacgc 600

catgcggatg cgctcaccat ggccgacaac atcatgacct tccgctacat catgaaacag 660

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ggctccgcca tgcacacgca catgtcctta tttgagggcg ataccaacgc gttccacgat 780

ccagacgatt cttacatgct gtccaaaacc gcaaaacagt tcatcgctgg aatcttgcat 840

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cgtgttccta cctaccgttt gaataaggag gagtcgcgcc gggtggaggt gcgtcttcct 1020

gataccgctt gtaacccata tttggcgttt tcagtgatgc tcggcgctgg tttgaaaggc 1080

attaaagaag gttatgagct cgacgagcca gctgaggacg atatctccaa cttgagcttc 1140

cgggaacgtc gcgccatggg ctacaacgat ctgccaagca gccttgatca ggcactgcgc 1200

caaatggaaa agtcagagct tgttgctgac atcctcggtg agcacgtttt tgagtttttc 1260

ttgcgcaata agtggcgtga atggcgtgac taccaagagc agatcactcc gtgggagctc 1320

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<210> 6

<211> 6435

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 6

atgccagtgt tgaaatcaga caatttcgat ccattggaag aagcttacga aggtgggaca 60

attcaaaact ataacgatga acaccatctt cataaatctt gggcaaatgt gattccggac 120

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gctcaacctt tacgttggct agctcataat ggtgaaatta acaccttaag aggtaacaag 900

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gctatattgg atagaaatgg tttaagacct tgtcgttatt acatcactag tgatgacaga 1260

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ggttcgatgg gtaacgatgc gccactggct tgtttaaatg aaaatcctgt cttactttat 1680

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gcaaatgtta tgtcgttaga atgttatgtc ggacctcaag gcaacctttt ggaaatgcat 1800

tcatctcaat gtgatcgttt attattgaaa tctcctattt tgcattggaa tgagttccaa 1860

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agaaacaagc agcgttccca agttgctttg attttggaaa caggtgaagc cagagaaatt 2160

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aaggttatgt ctaaaatggg tatctccact ctagcatcct acaaaggtgc tcaaattttt 2400

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tatccatcca gacaaaccat tagtaaatct gttaacttac cagaaagtgg tgaataccac 2580

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attagagact gtacactaag aggactgtta gaattagatt ttgaaaattc tgtcagtatc 2760

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tcttatggtt ctatttctat ggaagctcac tctacattgg ctattgccat gaatcgttta 2880

ggggccaaat ccaattgtgg tgaaggtggt gaagacgcag aacgttctgc tgttcaagaa 2940

aacggtgata ctatgagatc tgctatcaaa caagttgctt ccgctagatt cggtgtaact 3000

tcatactact tgtcagatgc tgatgaaatc caaattaaga ttgctcaggg tgctaagccg 3060

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aagttggttt ccgaagttgg tgttggtatt gttgcctctg gtgtagctaa ggctaaagcc 3300

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aaatatgcgg gtttgccatg ggaattaggt ctagctgaaa ctcaccagac tttagtcttg 3420

aatgatttaa gacgtaatgt tgttgtccaa accgatggtc aattgagaac tgggtttgat 3480

attgctgttg cagttttatt aggggcagaa tcttttacct tggcaacagt tccattaatt 3540

gctatgggtt gtgttatgtt aagaagatgt cacttgaact cttgtgctgt tggtattgcc 3600

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gacgaaatgg tgggtcattc tgaaaaatta aagaaaaggg acgacgtaaa tgccaaagcc 3780

ataaatatcg atttatctcc tattttgacc ccagcacatg ttattcgtcc aggtgttcca 3840

accaagttca ctaagaaaca agaccacaaa ctccacaccc gtctagataa taagttaatc 3900

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aatactgatc gtgcactcgg ttctacttta tcttacagag tctcgaagaa atttggtgaa 4020

gatggtttgc caaaggacac cgttgtcgtt aacatagaag gttcagcggg tcaatctttt 4080

ggtgctttcc tagcttctgg tatcactttt atcttgaatg gtgatgctaa tgattatgtt 4140

ggtaaaggtt tatccggtgg tattattgtc attaaaccac caaaggattc taaattcaag 4200

agtgatgaaa atgtaattgt tggtaacact tgtttctatg gtgctacttc tggtactgca 4260

ttcatttcag gtagtgccgg tgagcgtttc ggtgtcagaa actctggtgc caccatcgtt 4320

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tcattatgtg acccggtcga gattgcgttt gttaagaatt tgatccagga gcattggaac 4560

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gttgatgacg aagtcaatac tctattgatt gctaatcaaa aagctaaaga gcaagaaaaa 4800

aagaagagta ttactatttc aaataaggcc actttgaagg agcctaaggt tgttgattta 4860

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aatgactgga aagaatttac taaccctatt accaagaagg atgccaaata tcaaactgcg 5040

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ggctttacag tgggtgtcat tggttctggt ccagcaggtt tagcgtgtgc tgatatgttg 5400

aaccgtgccg gacatacggt cactgtttat gaaagatccg accgttgtgg tgggttattg 5460

atgtatggta ttccaaacat gaagttggat aaggctatag tgcaacgtcg tattgatcta 5520

ttgagtgccg aaggtattga ctttgttacc aacaccgaaa ttggtaaaac cataagcatg 5580

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gacttaccta ttaagggtcg tgaattgaag aatattgatt ttgccatgca gttgttggaa 5700

tctaacacaa aagctttatt gaacaaagat ctggaaatca ttcgtgaaaa gatccaaggt 5760

aagaaagtaa ttgttgtcgg tggtggtgac acaggtaacg attgtttagg tacatctgta 5820

agacacggtg cagcatcagt tttgaatttc gaattgttgc ctgagccacc agtggaacgt 5880

gccaaagaca atccatggcc tcaatggccg cgtgtcatga gagtggacta cggtcatgct 5940

gaagtgaaag agcattatgg tagagaccct cgtgaatact gcatcttgtc caaggaattt 6000

atcggtaacg atgagggtga agtcactgcc atcagaactg tgcgcgtaga atggaagaag 6060

tcacaaagtg gcgtatggca aatggtagaa attcccaaca gtgaagagat ctttgaagcc 6120

gatatcattt tgttgtctat gggtttcgtg ggtcctgaat tgatcaatgg caacgataac 6180

gaagttaaga agacaagacg tggtacgatt gccacactcg acgactcctc atactctatt 6240

gatggaggaa agacttttgc atgtggtgac tgtagaagag ggcaatcttt gattgtctgg 6300

gccatccaag aaggtagaaa atgtgctgcc tctgtcgata agttcctaat ggacggcact 6360

acgtatctac caagtaatgg tggtatcgtt caacgtgatt acaaactatt gaaagaatta 6420

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<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 8

gccaagcttg catgcctgca ggtcgaccta gtaatcaaga ttg 43

<210> 9

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<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 9

agaccatgga attcgagctc ggtaccaaag gaggacacat atgccagtgt tgaaatcag 59

<210> 10

<211> 47

<212> DNA

<213> artificial sequence

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ccaagcttgc atgcctgcag gtcgacttag acttgactag ctaattc 47

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<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 11

agaccatgga attcgagctc ggtaccaaag gaggacacat atgtgtggaa ttgttgg 57

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 12

ccaagcttgc atgcctgcag gtcgacttat tcgacggtga cag 43

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 13

gccgaccaga tcatgacctt ccgc 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 14

atgatctggt cggccatggt gagc 24

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<211> 29

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 15

atgcgctcca aggaaggtgt gatgaattc 29

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<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 16

accttccttg gagcgcatcc aattc 25

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 17

tttgcttggt gaaatttaca atac 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 18

aaatttcacc aagcaaagaa gcag 24

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<211> 52

<212> DNA

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<400> 19

atggaattcg agctcggtac caaaggagga cacatatgtg tggaattgtt gg 52

<210> 20

<211> 34

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 20

attcctcctt tgtcgactta ttcgacggtg acag 34

<210> 21

<211> 34

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 21

taagtcgaca aaggaggaat gaacagcgaa cagg 34

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<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 22

aaacagccaa gcttgcatgc ctgcagctag taatcaagat tgtttc 46

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<211> 38

<212> DNA

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tggcattcct cctttgtcga cttattcgac ggtgacag 38

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<211> 32

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<400> 24

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Claims

1.一种高产透明质酸的基因工程菌株在生产透明质酸中的应用，其特征在于，所述基因工程菌株同时过表达谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶和谷氨酸合成酶，或者所述基因工程菌株同时过表达谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶和谷氨酰胺合成酶；所述谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶氨基酸序列为SEQ ID NO.1、谷氨酸合成酶氨基酸序列为SEQ ID NO.3、谷氨酰胺合成酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2；所述基因工程菌株制备时所用的出发菌株为申请号CN201910495504.8的中国专利申请中的C.glu-Δldh/AB、C.glu-Δldh/A-PdapB-B、

C.glu-Δldh/A-PdapB-B-aF或者C.glu-Δldh-aEG/A-PdapB-B-aF-aE。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶受强启动子控制。

3.根据权利要求1所述的应用，其中所述应用步骤包括：

将基因工程菌接入培养基中，进行扩大培养，得到基因工程菌菌液；按照1-20％体积百分比将上述步骤获得的工程菌菌液接入发酵培养基中，进行发酵培养，得到含有透明质酸的发酵液。

4.根据权利要求3所述的应用，其中所述的扩大培养的方法为：在20-40℃、摇床转速为100-250rpm的条件下培养10-20h；所述的发酵培养的方法为：在20-40℃、摇床转速为100-250rpm的条件下培养1.5-4h时加入0.5-1.5mM IPTG诱导剂后继续培养40-72h。

5.高产透明质酸的基因工程菌株的制备方法，所述基因工程菌株同时过表达谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶和谷氨酸合成酶，或者所述基因工程菌株同时过表达谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶和谷氨酰胺合成酶；所述谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶氨基酸序列为SEQID NO.1、谷氨酸合成酶氨基酸序列为SEQ ID NO.3、谷氨酰胺合成酶氨基酸序列为SEQ IDNO.2；所述基因工程菌株制备时所用的出发菌株为申请号CN201910495504.8的中国专利申请中的C.glu-Δldh/AB、C.glu-Δldh/A-PdapB-B、C.glu-Δldh/A-PdapB-B-aF或者C.glu-Δldh-aEG/A-PdapB-B-aF-aE，其特征在于，所述方法包括如下步骤：扩增得到谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶基因，以及谷氨酰胺合成酶或者谷氨酸合成酶基因；将谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶基因、谷氨酰胺合成酶基因插入穿梭质粒，构建表达质粒；或者将谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶基因、谷氨酸合成酶基因插入穿梭质粒，构建表达质粒；将表达质粒转入到出发菌株，构建基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的制备方法，所述制备方法为：

(1)利用上下游引物，以谷氨酸棒杆菌基因组为模板进行聚合酶链式反应，扩增得到谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶基因，其核酸序列如SEQ ID NO.4所示；利用上下游引物，以谷氨酸棒杆菌基因组为模板进行聚合酶链式反应，扩增得到谷氨酰胺合成酶基因，其核酸序列如SEQ ID NO.5所示，或者以酿酒酵母基因组为模板进行聚合酶链式反应，扩增得到谷氨酸合成酶基因，其核酸序列如SEQ ID NO.6所示；

(2)将穿梭质粒进行双酶切，使用Gibson连接试剂盒将需要插入的片段连接入穿梭质粒中，得到连接产物；

(3)将连接产物转化至大肠杆菌E.coli TOP10感受态细胞，涂布于抗性平板培养基，筛选阳性克隆，得到如下表达质粒：pEC-XK99E-gmlS-cgl2229或pEC-XK99E-glmS-glt1；

(4)将步骤(3)中所构建的表达质粒pEC-XK99E-gmlS-cgl2229或pEC-XK99E-glmS-glt1转入出发菌株中，获得同时过表达谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶和谷氨酸合成酶或者同时过表达谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶和谷氨酰胺合成酶的基因工程重组菌。