CN112342230A

CN112342230A - 产n-乙酰氨基葡萄糖工程菌株的构建与应用

Info

Publication number: CN112342230A
Application number: CN201910763311.6A
Authority: CN
Inventors: 林白雪; 王鹏超; 张译元; 陶勇
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2019-08-06
Filing date: 2019-08-19
Publication date: 2021-02-09

Abstract

本发明公开了产N‑乙酰氨基葡萄糖工程菌株的构建与应用。本发明提供了产N‑乙酰氨基葡萄糖工程菌的构建方法，本发明通过敲除大肠杆菌中N‑乙酰氨基葡萄糖的转运降解途径提高大肠杆菌积累N‑乙酰氨基葡萄糖能力；弱化糖酵解途径对N‑乙酰氨基葡萄糖合成前体果糖‑6‑磷酸的利用，从而提高N‑乙酰氨基葡萄糖合成前提物质供应；进一步通过对大肠杆菌无机氨摄取系统的改造并过表达谷氨酰胺合酶提高N‑乙酰氨基葡萄糖合成途径辅因子的供应进一步提高的大肠杆菌产物合成水平。通过对高密度发酵和全细胞转化工艺的优化，使N‑乙酰氨基葡萄糖合成达到112/L，高于目前国内文献报道水平。

Description

产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌株的构建与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌株的构建与应用。

背景技术

N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine，GlcNAc)以及其脱乙酰衍生物氨基葡萄糖(Glucosamine，GlcN)存在于所有的生命体中，包括细菌、酵母、丝状真菌、植物和动物均可合成。在人类中，N-乙酰氨基葡萄糖是透明质酸、硫酸软骨素等物质的前体，是保持和修复软骨和关节健康的必备物质。临床研究表明，服用N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖对于治疗关节炎具有良好的作用。因此N-乙酰氨基葡萄糖作为药物和营养膳食广泛的应用于关节损伤的治疗和修复。目前，N-乙酰氨基葡萄糖主要是通过水解虾壳蟹壳中的几丁质获得的，生产过程中会产生严重的污染，另一方面，通过此方法制备的N-乙酰氨基葡萄糖易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏人群服用。

发明内容

为了制备N-乙酰氨基葡萄糖，本发明提供了如下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌的构建方法。

本发明提供的构建方法，包括如下步骤：使突变型大肠杆菌或大肠杆菌表达6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰基转移酶，得到产N-乙酰氨基葡萄糖的工程菌；

所述突变型大肠杆菌为将所述大肠杆菌按照如下A1和/或A2改造：

A1、弱化所述大肠杆菌糖酵解途径得到的突变型大肠杆菌；

A2、解除所述大肠杆菌中对谷氨酰胺合成酶的负反馈抑制；

上述方法中，所述使突变型大肠杆菌表达6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰基转移酶为将6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰基转移酶(氨基酸序列为序列2，编码基因的核苷酸序列为序列1)导入所述突变型大肠杆菌；

所述弱化所述大肠杆菌糖酵解途径得到的突变型大肠杆菌为抑制或降低所述大肠杆菌中丙酮酸激酶编码基因的表达或活性；

或，所述解除所述大肠杆菌中对谷氨酰胺合成酶的负反馈抑制为抑制或降低所述大肠杆菌中氮同化调节蛋白编码基因glnE和/或glnB的表达或活性。

上述方法中，所述抑制或降低大肠杆菌中丙酮酸激酶编码基因的表达或活性为敲除所述大肠杆菌中的丙酮酸激酶编码基因；

或，所述抑制或降低大肠杆菌中氮同化调节蛋白编码基因glnE的表达或活性为敲除所述大肠杆菌中的丙酮酸激酶编码基因，或，将所述大肠杆菌中的丙酮酸激酶编码基因替换为带有启动子的谷氨酰胺合成酶基因CgGS；

或，所述抑制或降低所述大肠杆菌中氮同化调节蛋白编码基因glnB的表达或活性为敲除所述大肠杆菌中氮同化调节蛋白编码基因glnB。

上述方法中，所述带有启动子的谷氨酰胺合成酶基因CgGS的启动子为CPA1；

或，所述带有启动子的谷氨酰胺合成酶基因CgGS的核苷酸序列为序列5。

上述方法中，所述突变型大肠杆菌为将所述大肠杆菌按照所述A1和/或A2改造，且按照如下B1和/或B2的方式改造：

B1、抑制或降低所述大肠杆菌中N-乙酰氨基葡萄糖转运降解途径的基因簇nagEBACD的表达或活性；

B2、抑制或降低所述大肠杆菌中与GlcANc向胞内转运相关的基因簇manXYZ的表达或活性。

上述方法中，所述抑制或降低所述大肠杆菌中N-乙酰氨基葡萄糖转运降解途径的基因簇nagEBACD的表达或活性为敲除所述大肠杆菌中N-乙酰氨基葡萄糖转运降解途径的基因簇nagEBACD；

或，所述抑制或降低所述大肠杆菌中与GlcANc向胞内转运相关的基因簇manXYZ的表达或活性为敲除所述大肠杆菌中与GlcANc向胞内转运相关的基因簇manXYZ；

或，所述抑制或降低所述大肠杆菌中与GlcANc向胞内转运相关的基因簇manXYZ的表达或活性为将所述大肠杆菌中与GlcANc向胞内转运相关的基因簇manXYZ替换为带有启动子的6-磷酸-氨基葡萄糖合成酶编码基因glmS。

上述方法中，所述6-磷酸-氨基葡萄糖合成酶编码基因glm的启动子为119启动子；

所述带有启动子的6-磷酸-氨基葡萄糖合成酶编码基因glmS的核苷酸序列为序列3。

由上述的方法制备的产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌也是本发明保护的范围。

上述产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌在制备N-乙酰氨基葡萄糖或其及其衍生产物中的应用也是本发明保护的范围。

本发明另一个目的是提供一种制备N-乙酰氨基葡萄糖的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述的产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌，得到N-乙酰氨基葡萄糖。

本发明包含了合成N-乙酰氨基葡萄糖的重组大肠杆菌菌株，该重组大肠杆菌中共表达了有N-乙酰氨基葡萄糖合成途径上的各个基因，以及参与辅因子循环的谷氨酰胺合成酶编码基因(CgGS)；所述的大肠杆菌为大肠杆菌BW25113，及以其为背景的代谢旁路敲除菌株。

丙酮酸激酶pykF编码基因如NCBI-Gene ID：946179(更新日期为2018.10.11)，氮同化调节蛋白glnE编码基因如NCBI-Gene ID：947552(更新日期为2019.5.30)，氮同化调节蛋白glnB编码基因如NCBI-Gene ID：947016，更新日期2019.7.7)。

谷氨酰胺合成酶来源于谷氨酸棒杆菌。

上述发酵采用的发酵培养基为高密度发酵培养基，发酵条件为：温度30-37℃，通气量1-3vvm，搅拌桨转速300rpm，20％溶氧偶联转速，pH＝6.5-7.5，初糖耗完，开始补葡萄糖，补糖速度调至1-10g/L*h左右，发酵72h。

上述高密度发酵培养基按照如下方法制备：将柠檬酸0.1-1g/L、磷酸二氢钾2-10g/L、磷酸氢二铵1-5g/L、消泡剂1-2ml，将各组分混匀后定容1L，121℃灭菌20min。灭菌后加入：100X微量元素10ml/L(500mg/L EDTA，150mg/L CuCl₂·2H₂O，200mg/L H₃BO₃)、0.5g/LVB1 1ml/L、葡萄糖10g/L、MgSO₄0.3g/L，得到高密度发酵培养基。

本发明通过敲除大肠杆菌中N-乙酰氨基葡萄糖的转运降解途径提高大肠杆菌积累N-乙酰氨基葡萄糖能力；弱化糖酵解途径对N-乙酰氨基葡萄糖合成前体果糖-6-磷酸的利用，从而提高N-乙酰氨基葡萄糖合成前提物质供应；进一步通过对大肠杆菌无机氨摄取系统的改造并过表达谷氨酰胺合酶提高N-乙酰氨基葡萄糖合成途径辅因子的供应进一步提高的大肠杆菌产物合成水平。通过对高密度发酵和全细胞转化工艺的优化，使N-乙酰氨基葡萄糖合成达到112/L，高于目前国内合成N-乙酰氨基葡萄糖的产量。

附图说明

图1为工程菌产GlcNAc的结果。

图2为工程菌GNA1/GN304发酵产GlcNAc。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、构建产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌

一、构建6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰基转移酶GNA1表达质粒pYB1a-GNA1

表达质粒pYB1a-GNA1为将gna1基因(序列1)替换pYB1a-GFP质粒中的GFP基因所得质粒，命名为pYB1a-GNA1；具体构建方法如下：

根据酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰基转移酶(GNA1)的氨基酸序列(GenBank:NP_116637.1)，依据大肠杆菌的密码子偏好性进行优化，全基因合成优化后的序列，6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰基转移酶编码基因的核苷酸序列如序列表中的序列1所示。以序列1所示的6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰基转移酶编码基因为模板，引物(P1和P2)进行扩增，得到6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰基转移酶(gna1)编码基因扩增产物，片段大小约500bp，与目的片段相符。

P1:TTTGGTAGGCCGTCTGAGTAGAGCTCCGACGGCGCGCCGTGGTCCG

P2:TTTACGTCTAAGCATTTATTTCTAGACCATGATCACCACTTAAGCC

pYB1a是由pBADhisB载体(购自invitrogen公司)改造而来，复制起始位点(1984-2657bp)换成RSF复制起始位点片段(序列如序列5所示)。

将载体pYB1a使用XhoI和BglII双酶切，电泳回收3500bp片段，使用Gibson连接方法，将酶切回收后的pYB1a和上述gna1扩增产物以一定比例加入Gibson反应体系中。50℃反应1小时。取5μL连接产物转化DH5α(购自Takara，产品目录号为D9057A)，使用氨苄青霉素抗性平板筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆的质粒，进行酶切验证，XhoI和BglII双酶切，得到500bp目的片段为阳性质粒，命名为pYB1a-GNA1。

二、敲除大肠杆菌N-乙酰氨基葡萄糖转运降解途径的基因簇nagEBACD构建大肠杆菌突变体ΔnagEBACD

大肠杆菌突变体ΔnagEBACD为敲除大肠杆菌BW25113基因组中N-乙酰氨基葡萄糖GlcANc转运降解途径相关基因簇nagEBACD(nagE geneID：945292、nagB geneID：945290nagA geneID：945289nagC geneID：945285nagD geneID：945283；更新日期20190601)，其他基因不变，得到的重组菌。

具体方法如下：

大肠杆菌BW25113(公众可从中国科学院微生物研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Tomoya Baba,Takeshi Ara,Miki Hasegawa,Yuki Takai,Yoshiko Okumura,Miki Baba,Kirill A Datsenko,Masaru Tomita,Barry L Wanner,and HirotadaMori1.Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockoutmutants:the Keio collection.Molecular Systems Biology(2006):1-11.)为出发菌株，采用crisp的方法(Yu Jiang et al,AEM,81:2506–2514)，敲除中GlcANc转运降解途径基因簇nagEBACD：

以BW25113的基因组DNA为模板，nagEBACD-up-F、nagEBACD-down-R为引物PCR，获得1682bp打靶片段nagEBACD-knockout。

nagEBACD-up-F:CGCCGTCCTGGCTCCACAAA

nagEBACD-down-R:CGCACGCAGGCAGGCTTTAC

以pTarget(Yu Jiang et al,AEM,81:2506–2514)为模板，以pTarget-nagEBACD-F、pTarget-nagEBACD-R为引物，进行PCR，得到2124bp的PCR产物；DpnI酶切,取酶切后的产物转化全式金Trans T1感受态细胞。获得阳性克隆经进一步的细胞培养和测序证明其获得了能够引导Cas9蛋白切割nagEBACD基因的gRNA，将其命名为pTarget-nagEBACD。

pTarget-nagEBACD-F:ACTAGTTTAGGTTTTTTCCAGCGACTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

pTarget-nagEBACD-R:AAAACAGTCGCTGGAAAAAACCTAAACTAGTATTATACCTAGGAC

将pCas9(Yu Jiang et al,AEM,81:2506–2514)转入大肠杆菌BW25113中，获得pCas9/BW25113；制备pCas9/BW25113电转感受态,将pTarget-nagEBACD和nagEBACD-knockout电转pCas9/BW25113电转感受态，获得阳性克隆后，测序验证正确。再42℃培养12小时使其丢失pCas9和pTarget-nagEBACD，得到重组菌ΔnagEBACD(经过测序，验证基因组缺失agEBACD)。测序验证正确。

三、敲除大肠杆菌突变体ΔnagEBACD中与GlcANc向胞内转运相关的基因簇manXYZ构建大肠杆菌突变体GN102(ΔnagEBACD,ΔmanXYZ::119-glmS)

在大肠杆菌突变体ΔnagEBACD的基础上，采用crisp的方法(Yu Jiang et al,AEM,81:2506–2514)，敲除与GlcANc向胞内转运相关的基因簇manXYZ(manX geneID：946334，manY geneID：946332，manZ geneID：946342；更新日期20190707)替换为119-glmS(带有119启动子的6-磷酸-氨基葡萄糖合成酶编码基因；DNA序列如序列3所示)，获得大肠杆菌突变体GN102(ΔnagEBACD,ΔmanXYZ::119-glmS)：

如实施例1(二)所述方法构建GN102：

设计如下引物：

manXYZ-up-F:AACATAACCGCCATCGCAATCA

manXYZ-up-R:ATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAATTGCTACCTCCTTTATTATC

glmS-F:AGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCAAGGAGATATAATGTGTGGAATTGTTGGCGC

glmS-R:TACAACAGTCTTACTCAACCGTAACCGATT

manXYZ-down-F:GGTTGAGTAAGACTGTTGTACACTACCGGG

manXYZ-down-R:CGGAATCTGGAAATCGGCTACTC

以BW25113基因组为模板，分别用上述引物扩增，得到manXYZ-up片段、glmS片段和manXYZ-down-F片段，再两两组合扩增，得到3592bp打靶片段manXYZ::119-glmS。

获得引导Cas9蛋白切割manXYZ基因的gRNA：以pTarget为模板，以pTarget-manXYZ-F、pTarget-manXYZ-R为引物，进行PCR，所获得2124bp PCR产物经DpnI酶切，转化全式金Trans T1感受态细胞。获得阳性克隆经进一步的细胞培养和测序证明其获得了能够引导Cas9蛋白切割manXYZ基因的gRNA，将其命名为pTarget-manXYZ。

pTarget-manXYZ-F:ACTAGTTGTGCCTATAACAATAGCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

pTarget-manXYZ-R:AAAACTTGCTATTGTTATAGGCACAACTAGTATTATACCTAGGACT

将pCas9转入上述二构建的大肠杆菌突变体ΔnagEBACD中，获得pCas9/ΔnagEBACD；将pTarget-manXYZ和manXYZ::119-glmS共同电转pCas9/ΔnagEBACD电转感受态。获得阳性克隆后，再42℃培养12小时使其丢失pCas9和pTarget-manXYZ，得到重组菌GN102(ΔnagEBACD,ΔmanXYZ::119-glmS)，测序验证正确。

四、构建大肠杆菌突变体GN101(ΔnagEBACD,ΔpykF)和GN201(ΔnagEBACD,ΔmanXYZ::119-glmS,ΔpykF)

在大肠杆菌突变体ΔnagEBACD的基础上，采用crisp的方法(Yu Jiang et al,AEM,81:2506–2514)，敲除糖酵解途径相关丙酮酸激酶编码基因pykF(NCBI-Gene ID：946179，更新日期为2018.10.11)，获得大肠杆菌突变体GN101(ΔnagEBACD,ΔpykF)。

在大肠杆菌突变体GN102(ΔnagEBACD,ΔmanXYZ::119-glmS)的基础上，采用crisp的方法(Yu Jiang et al,AEM,81:2506–2514)，敲除糖酵解途径相关丙酮酸激酶编码基因pykF，获得大肠杆菌突变体GN201(ΔnagEBACD,ΔmanXYZ::119-glmS,ΔpykF)。

具体方法如下：

1、通过overlapPCR方法获得打靶片段pykF-knockout

以BW25113基因组为模板，分别以pykF-up-F、pykF-up-R和pykF-down-F、pykF-down-R为引物进行PCR，获得836bp pykF-up和860bp pykF-down。再以pykF-up和pykF-down为模板，pykF-up-F、pykF-down-R为引物PCR，获得1676bp打靶片段pykF-knockout。

pykF-up-F:AACTGGACCGCAACTGAAGCAA

pykF-up-R:AAAAGCAATAGACAGTCTTAGTCTTTAAGT

pykF-down-F:TAAGACTGTCTATTGCTTTTGTGAATTAAT

pykF-down-R:TCGGCAGAAGAACAGCAGAACG

以pTarget为模板，以pTarget-pykF-F、pTarget-pykF-R为引物，进行PCR，所获得2124bp PCR产物，转化全式金Trans T1感受态细胞。获得阳性克隆，测序正确。测序证明其获得了能够引导Cas9蛋白切割pykF基因的gRNA，将其命名为pTarget-pykF。

pTarget-pykF-F:ACTAGTACCAAAATTGTTTGCACCATGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

pTarget-pykF-R:TAAAACATGGTGCAAACAATTTTGGTACTAGTATTATACCTAGGAC

将pCas9分别转入上述二得到的大肠杆菌ΔnagEBACD和上述三得到的GN102中，获得pCas9/ΔnagEBACD和pCas9/GN102；将pTarget-pykF和pykF-knockout共同电转pCas9/ΔnagEBACD电转感受态。获得阳性克隆后，测序验证正确，再42℃培养12时间使其丢失pCas9和pTarget-pykF，得到GN101(ΔnagEBACD,ΔpykF)(经过测序，验证基因组缺失agEBACD和pykF)。

将pTarget-pykF和pykF-knockout共同电转pCas9/GN102电转感受态。获得阳性克隆后，测序验证正确，再42℃培养12小时，得到GN201(ΔnagEBACD,ΔmanXYZ::119-glmS,ΔpykF)(经过测序，验证基因组缺失nagEBACD和pykF，且manXYZ替换为119-glmS)。

五、构建大肠杆菌突变体GN401(ΔnagEBACD,ΔmanXYZ::119-glmS,ΔpykF,ΔglnB,ΔglnE)

构建大肠杆菌突变体GN301(ΔnagEBACD,ΔmanXYZ::119-glmS,ΔpykF,ΔglnB)在大肠杆菌突变体GN201(ΔnagEBACD,ΔmanXYZ::119-glmS,ΔpykF)的基础上，采用crisp的方法(Yu Jiang et al,AEM,81:2506–2514)，敲除氮同化调节蛋白编码基因glnB(NCBI-Gene ID：947016，更新日期为2019.7.7),获得大肠杆菌突变体GN301(ΔnagEBACD,ΔmanXYZ::119-glmS,ΔpykF,ΔglnB)。

1、通过overlapPCR方法获得打靶片段

以BW25113基因组为模板，分别以glnB-up-F、glnB-up-R和glnB-down-F、glnB-down-R为引物进行PCR，获得807bp glnB-up和946bp glnB-down。再以glnB-up和glnB-down为模板，glnB-up-F、glnB-down-R为引物PCR，获得1733bp打靶片段glnB-knockout。

glnB-up-F:TGCTGGAGTCGGAGCTGTTTGG

glnB-up-R:TTGACGCGGTGCTATTCCTTGAAAAGGTCG

glnB-down-F:AAGGAATAGCACCGCGTCAAGGGTTGCCGG

glnB-down-R:ACACCTGTTGGCAACGCTGGAC

以pTarget为模板，以pTarget-glnB-F、pTarget-glnB-R为引物，进行PCR，所获得2124bp PCR产物转化全式金Trans T1感受态细胞。获得阳性克隆经进一步的细胞培养和测序证明其获得了能够引导Cas9蛋白切割glnB基因的gRNA，将其命名为pTarget-glnB。

pTarget-glnB-F:ACTAGTGATTATAAAACCCTTCAAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

pTarget-glnB-R:AAAACGCTTGAAGGGTTTTATAATCACTAGTATTATACCTAGGACT

3、电转敲除glnB

将pCas9转入上述四得到大肠杆菌突变体GN201中，获得pCas9/GN201。将pTarget-glnB和glnB-knockout共同电转pCas9/GN201电转感受态。获得阳性克隆后，测序验证正确，再42℃培养12小时使其丢失pCas9和pTarget-glnB，得到GN301(ΔnagEBACD,ΔmanXYZ::119-glmS,ΔpykF,ΔglnB)(经过测序，验证基因组缺失nagEBACD、pykF和glnB，且manXYZ替换为119-glmS)。

2、构建大肠杆菌突变体GN401(ΔnagEBACD,ΔmanXYZ::119-glmS,ΔpykF,ΔglnB,,ΔglnE)

在大肠杆菌突变体GN301(ΔnagEBACD,ΔmanXYZ::119-glmS,ΔpykF)的基础上，采用crisp的方法(Yu Jiang et al,AEM,81:2506–2514)，敲除glnE(NCBI-Gene ID：947552，更新日期为2019.5.30),获得大肠杆菌突变体GN401(ΔnagEBACD,ΔmanXYZ::119-glmS,ΔpykF,ΔglnB,ΔglnE)。

以BW25113基因组为模板，分别以glnE-up-F、glnE-up-R和glnE-down-F、glnE-down-R为引物进行PCR，获得596bp glnE-up和589bp glnE-down。再以glnE-up和glnE-down为模板，glnE-up-F、glnE-down-R为引物PCR，获得1165bp打靶片段glnE-knockout。

glnE-up-F:AACGATGCGGCGAAAGAACAGG

glnE-up-R:ATACCATACTAAGCGATTTTATCCTTGCCT

glnE-down-F:AAAATCGCTTAGTATGGTATTATCGCGCGC

glnE-down-R:GATCAATCAGCACCGGAACACCC

2、通过点突变PCR方法获得引导Cas9蛋白切割glnE基因的gRNA

以pTarget为模板，以pTarget-glnE-F、pTarget-glnE-R为引物，进行PCR，所获得2124bp PCR产物转化全式金Trans T1感受态细胞。获得阳性克隆经进一步的细胞培养和测序证明其获得了能够引导Cas9蛋白切割glnE基因的gRNA，将其命名为pTarget-glnE。

pTarget-glnE-F:ACTAGTCTTCACCGTTACAGCAGTACGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

pTarget-glnE-R:AAAACGTACTGCTGTAACGGTGAAGACTAGTATTATACCTAGGACT

将pCas9转入上述构建的大肠杆菌突变体GN301中，获得pCas9/GN301，制备pCas9/GN301电转感受态。将pTarget-glnE和glnE-knockout共同电转pCas9/GN301电转感受态。获得阳性克隆后，测序验证正确，再42℃培养12小时使其丢失pCas9和pTarget-glnB，得到GN401(ΔnagEBACD,ΔmanXYZ::119-glmS,ΔpykF,ΔglnB,,ΔglnE)(经过测序，验证基因组缺失nagEBACD、pykF、glnB和glnE，且manXYZ替换为119-glmS)。

在大肠杆菌突变体GN201(ΔnagEBACD,ΔmanXYZ::119-glmS,ΔpykF)的基础上，采用crisp的方法(Yu Jiang et al,AEM,81:2506–2514)，将GN201的glnE替换为CPA1-CgGS(序列如序列4所示),获得大肠杆菌突变体大肠杆菌突变体GN304(ΔnagEBACD,ΔmanXYZ::119-glmS,ΔpykF,ΔglnE::CPA1-CgGS).

GN201基础上敲除glnE同时引入一个谷氨酸棒杆菌来源的谷氨酰胺合成酶基因CgGS构建大肠杆菌突变体GN304(ΔnagEBACD,ΔmanXYZ::119-glmS,ΔpykF,ΔglnE::CPA1-CgGS)。

以BW25113基因组为模板，分别以glnE-up-F、glnE-up-overlap-R和glnE-down-overlap-F、glnE-down-R为引物进行PCR，获得606bp的glnE-up-overlap和599bp的glnE-down-overlap。

再以pSCPA1-CgGS为模板，CPA1-CgGS-F、CPA1-CgGS-R为引物进行PCR，获得2021bpCAP1-CgGS(序列4)。以glnE-up-overlap和CAP1-CgGS为模板，glnE-up-F、CPA1-CgGS-R为进行引物PCR，获得2596bp glnE-up-CAP1-CgGS；再以glnE-up-CAP1-CgGS和glnE-down-overlap为模板，glnE-up-F、glnE-down-R为引物PCR，获得3165bp打靶片段glnE::CPA1-CgGS。

glnE-up-overlap-R:GTCAATACTCTTTTTGATAAAAGCGATTTTATCCTTGCCT

glnE-down-overlap-F:CAAATAAAACGAAAGGCTCAAGTATGGTATTATCGCGCGC

CPA1-CgGS-F:TAAAATCGCTTTTATCAAAAAGAGTATTGA

CPA1-CgGS-R:ATACCATACTTGAGCCTTTCGTTTTATTTG

将pCas9转入大肠杆菌GN201中，获得pCas9/GN201。将pTarget-glnE和glnE::CPA1-CgGS共同电转pCas9/GN201电转感受态。获得阳性克隆后，测序验证正确，阳性克隆42℃培养12小时使其丢失pCas9和pTarget-glnE，得到GN304(ΔnagEBACD,ΔmanXYZ::119-glmS,ΔpykF,ΔglnE::CPA1-CgGS)(经过测序，验证基因组缺失nagEBACD和pykF，且manXYZ替换为119-glmS、glnE替换为CPA1-CgGS)。

六、工程菌株的转化

上述大肠杆菌突变体具体见表1所示：

表1为大肠杆菌突变体

将上述一制备的重组质粒pYB1a-GNA1用氯化钙法分别转化表1所示的GN101、GN201、GN401、GN304中，在氨苄青霉素平板上筛选阳性克隆子。根据蛋白电泳N-乙酰氨基葡萄糖合成相关的各蛋白正确表达。将菌株分别命名为GNA1/+相应菌株名。如GNA1/GN304即为pYB1a-GNA1重组质粒转入BW25113,ΔnagEBACD,ΔmanXYZ::119-glmS,ΔpykF,ΔglnE::CPA1-CgGS中构成的重组菌株。

共得到如下产N-乙酰氨基葡萄糖基因重组菌：GNA1/GN101、GNA1/GN201、GNA1/GN401、GNA1/GN304。

实施例2、利用产N-乙酰氨基葡萄糖基因工程菌制备N-乙酰氨基葡萄糖

一、产N-乙酰氨基葡萄糖基因工程菌的蛋白诱导表达方法

自诱导培养：将实施例1制备的产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌GNA1/GN101、GNA1/GN201、GNA1/GN401、GNA1/GN304分别划线到含有质量百分比浓度为1.5％的琼脂和含50μg/mL的氨苄青霉素LB平板上，37℃培养12h。挑取平板上所长的单克隆，接种到含有50μg/mL的氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃过夜震荡培养，转速为220rpm；将过夜培养的物以体积百分比为1％的接种量接种至自诱导培养基ZYM中，20℃震荡培养，转速220rpm，培养时间为24h。

自诱导培养基ZYM配方如下：100mL A+2mL B+2mL C+200μL D+100μL E(以下均为质量百分比浓度)；

A.ZY：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉；

B.50×M：1.25M Na₂HPO₄，1.25M KH₂PO₄，2.5M NH₄Cl和0.25M Na₂SO₄；

C.50×5052：25％甘油，2.5％葡萄糖，10％L-阿拉伯糖；

D.500×MgSO₄；1MMgSO₄

E.1000×微量元素：50mMFeCl₃，20mMCaCl₂，10mMMnCl₂，10mMZnSO₄，CoCl₂、NiCl₂、Na₂MoO₄、Na₂SeO₃和H₃BO₃各2mM。

二、生物转化合成N-乙酰氨基葡萄糖的方法

诱导后细胞，根据菌液的生长情况，取一定量菌体，于4℃4200rpm离心10min，使用200μL转化液洗涤一次，弃上清后，再次重悬于200μL转化液中，使其最终OD值为30。

转化液：0.1M Glucose,50mM MOPS,50mMNH₄Cl,10mM Glutamate。30℃、220rpm震荡转化进行12h后终止，获得最终转化液，用于N-乙酰氨基葡萄糖的定量分析。

将得到的转化液12000rpm离心10min，取上清，使用0.22μm滤膜过滤后，用HPLC检测N-乙酰氨基葡萄糖产量。HPLC采用Agilent 1200高效也行色谱仪(配四元泵、DAD检测器和工作站)。

N-乙酰氨基葡萄糖定量方法使用：AminexHPX–87H Column(300×7.8mm)；流动相：5mMH₂SO₄，流速：0.5mL*min^-1，柱温55℃；进样量5μL，检测波长214nm。N-乙酰氨基葡萄糖标准品购自sigma公司。

将GNA1/GN101、GNA1/GN201、GNA1/GN401、GNA1/GN304菌株经蛋白诱导表达取等量菌体进行全细胞转化，转化条件和转化液如上述。分别在转化3h、6h、12h取样检测N-乙酰氨基葡萄糖合成量。通过转运降解途径敲除、糖酵解途径削弱并进一步增强谷氨酰胺合成，单位细胞的N-乙酰氨基葡萄糖合成能力有了大幅度提高，结果图附图1所示，可以看出，GNA1/GN304产量最高，达到32mM(7.07g/L转化液)，与GN101相比，提高了3倍。

三、发酵合成N-乙酰氨基葡萄糖的方法

将基因工程菌GNA1/GN304接种于5mLLB过夜培养。后转接于100mLLB培养3h左右，至其OD≈2，得到种子液。100mL种子液接种于2L高密度发酵培养基中。高密度发酵培养基为无机盐发酵培养基，按照如下方法制备：将柠檬酸0.1-1g/L、磷酸二氢钾2-10g/L、磷酸氢二铵1-5g/L、消泡剂0.5ml，将各组分混匀后定容1L，121℃灭菌20min。灭菌后加入：100X微量元素10ml/L(500mg/L EDTA，150mg/L CuCl₂·2H₂O，200mg/L H₃BO₃)、0.5g/L VB1 1ml/L、葡萄糖10g/L、MgSO₄0.3g/L，得到高密度发酵培养基。

发酵过程，控制发酵罐温度30-37℃，通气量1-3vvm，搅拌桨转速300rpm，20％溶氧偶联转速，pH＝6.5-7.5，初糖耗完，开始补葡萄糖600g/L，补糖速度调至1-10g/L*h左右，发酵72h后下罐，每隔2h取样监测N-乙酰氨基葡萄糖合成量，合成结果如图2所示：

通过一系列菌株改造和发酵优化，N-乙酰氨基葡萄糖浓度达到112g/L(对应图中507mM)，葡萄糖转化率38.3％，生产强度1.6g/(L*h)。

产生N-乙酰氨基葡萄糖浓度为目前文献报道的最高水平，具有良好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院微生物研究所

<120>产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌株的构建与应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 480

<212> DNA

<213>Artificial sequence

<400> 1

atgagtctgc cggatggttt ttatattcgc cgcatggaag aaggcgatct ggaacaggtg 60

accgaaaccc tgaaagtgct gaccaccgtt ggcaccatta ccccggaaag ttttagcaaa 120

ctgattaaat attggaatga agcaaccgtt tggaatgata atgaagataa aaaaattatg 180

cagtataatc cgatggttat tgttgataaa cgtaccgaaa ccgttgctgc taccggcaat 240

attattattg aacgtaaaat tattcatgaa ctgggtctgt gcggccatat tgaagatatt 300

gccgtgaata gcaaatatca gggccagggt ctgggtaaac tgctgattga tcagctggtt 360

accattggtt ttgattatgg ttgttataaa attattctgg attgtgatga aaaaaatgtg 420

aaattttatg aaaaatgtgg tttttcaaat gcaggcgtgg aaatgcagat tcgtaaataa 480

<210> 2

<211> 159

<212> PRT

<213>Artificial sequence

<400> 2

Met Ser Leu Pro Asp Gly Phe Tyr Ile Arg Arg Met Glu Glu Gly Asp

1 5 10 15

Leu Glu Gln Val Thr Glu Thr Leu Lys Val Leu Thr Thr Val Gly Thr

20 25 30

Ile Thr Pro Glu Ser Phe Ser Lys Leu Ile Lys Tyr Trp Asn Glu Ala

35 40 45

Thr Val Trp Asn Asp Asn Glu Asp Lys Lys Ile Met Gln Tyr Asn Pro

50 55 60

Met Val Ile Val Asp Lys Arg Thr Glu Thr Val Ala Ala Thr Gly Asn

65 70 75 80

Ile Ile Ile Glu Arg Lys Ile Ile His Glu Leu Gly Leu Cys Gly His

85 90 95

Ile Glu Asp Ile Ala Val Asn Ser Lys Tyr Gln Gly Gln Gly Leu Gly

100 105 110

Lys Leu Leu Ile Asp Gln Leu Val Thr Ile Gly Phe Asp Tyr Gly Cys

115 120 125

Tyr Lys Ile Ile Leu Asp Cys Asp Glu Lys Asn Val Lys Phe Tyr Glu

130 135 140

Lys Cys Gly Phe Ser Asn Ala Gly Val Glu Met Gln Ile Arg Lys

145 150 155

<210> 3

<211> 1876

<212> DNA

<213>Artificial sequence

<400> 3

ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagcaagga gatataatgt gtggaattgt 60

tggcgcgatc gcgcaacgtg atgtagcaga aatccttctt gaaggtttac gtcgtctgga 120

ataccgcgga tatgactctg ccggtctggc cgttgttgat acagaaggtc atatgacccg 180

cctgcgtcgc ctcggtaaag tccagatgct ggcacaggca gcggaagaac atcctctgca 240

tggcggcact ggtattgctc acactcgctg ggcgacccac ggtgaacctt cagaagtgaa 300

tgcgcatccg catgtttctg aacacattgt ggtggtgcat aacggcatca tcgaaaacca 360

tgaaccgctg cgtgaagagc taaaagcgcg tggctatacc ttcgtttctg aaaccgacac 420

cgaagtgatt gcccatctgg tgaactggga gctgaaacaa ggcgggactc tgcgtgaggc 480

cgttctgcgt gctatcccgc agctgcgtgg tgcgtacggt acagtgatca tggactcccg 540

tcacccggat accctgctgg cggcacgttc tggtagtccg ctggtgattg gcctggggat 600

gggcgaaaac tttatcgctt ctgaccagct ggcgctgttg ccggtgaccc gtcgctttat 660

cttccttgaa gagggcgata ttgcggaaat cactcgccgt tcggtaaaca tcttcgataa 720

aactggcgcg gaagtaaaac gtcaggatat cgaatccaat ctgcaatatg acgcgggcga 780

taaaggcatt tactgtcact acatgcagaa agagatctac gaacagccga acgcgatcaa 840

aaacaccctt accggacgca tcagccacgg tcaggttgat ttaagcgagc tgggaccgaa 900

cgccgacgaa ctgctgtcga aggttgagca tattcagatc ctcgcctgtg gtacttctta 960

taactccggt atggtttccc gctactggtt tgaatcgcta gcaggtattc cgtgcgacgt 1020

cgaaatcgcc tctgaattcc gctatcgcaa atctgccgtg cgtcgtaaca gcctgatgat 1080

caccttgtca cagtctggcg aaaccgcgga taccctggct ggcctgcgtc tgtcgaaaga 1140

gctgggttac cttggttcac tggcaatctg taacgttccg ggttcttctc tggtgcgcga 1200

atccgatctg gcgctaatga ccaacgcggg tacagaaatc ggcgtggcat ccactaaagc 1260

attcaccact cagttaactg tgctgttgat gctggtggcg aagctgtctc gcctgaaagg 1320

tctggatgcc tccattgaac atgacatcgt gcatggtctg caggcgctgc cgagccgtat 1380

tgagcagatg ctgtctcagg acaaacgcat tgaagcgctg gcagaagatt tctctgacaa 1440

acatcacgcg ctgttcctga gccgtggcga tcagtaccca atcgcgctgg aaggcgcatt 1500

gaagttgaaa gagatctctt acattcacgc tgaagcctac gctgctggcg aactgaaaca 1560

cggtccgctg gcgctaattg atgccgatat gccggttatt gttgttgcac cgaacaacga 1620

attgctggaa aaactgaaat ccaacattga agaagttcgc gcgcgtggcg gtcagttgta 1680

tgtcttcgcc gatcaggatg cgggttttgt aagtagcgat aacatgcaca tcatcgagat 1740

gccgcatgtg gaagaggtga ttgcaccgat cttctacacc gttccgctgc agctgctggc 1800

ttaccatgtc gcgctgatca aaggcaccga cgttgaccag ccgcgtaacc tggcaaaatc 1860

ggttacggtt gagtaa 1876

<210> 4

<211> 2000

<212> DNA

<213>Artificial sequence

<400> 4

ttatcaaaaa gagtattgac ataaagtcta acctatagat aattacagcc atcgagaggg 60

acacggcgat ttgctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120

cagcctctac aaataatttt gtttaagaat tcaaaagatc ttttaagaag gagatatacc 180

atgggtacct ctcatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagcctc 240

gagatggcgt tcgagacccc ggaggaaatc gtgaagttta ttaaagacga gaacgttgag 300

ttcgtggacg ttcgttttac cgatctgccg ggcaccgaac agcacttcag catcccggcg 360

gcgagctttg acgcggatac cgttgaggaa ggcctggcgt tcgacggtag cagcatccgt 420

ggctttacca ccattgacga gagcgatatg aacctgctgc cggacctggg caccgcgacc 480

ctggatccgt tccgtaaggc gaaaaccctg aacgtgaagt tctttgttca cgacccgttc 540

acccgtgagg cgtttagccg tgatccgcgt aacgtggcgc gtaaagcgga acagtacctg 600

gcgagcaccg gtattgcgga cacctgcaac tttggtgcgg aggcggagtt ctacctgttt 660

gatagcgttc gttatagcac cgagatgaac agcggttttt atgaagtgga caccgaggaa 720

ggttggtgga accgtggcaa ggagaccaac ctggatggca ccccgaacct gggcgcgaag 780

aaccgtgtga aaggtggcta cttcccggtt gcgccgtatg accaaaccgt ggatgttcgt 840

gacgatatgg ttcgtaacct ggcggcgagc ggttttgcgc tggagcgttt tcaccacgaa 900

gtgggtggcg gtcagcaaga aatcaactac cgtttcaaca ccatgctgca cgcggcggac 960

gatatccaga ccttcaagta catcatcaag aacaccgcgc gtctgcacgg taaagcggcg 1020

accttcatgc cgaaaccgct ggcgggtgac aacggtagcg gtatgcacgc gcaccaaagc 1080

ctgtggaagg acggtaaacc gctgtttcac gatgaaagcg gctacgcggg tctgagcgat 1140

atcgcgcgtt actatatcgg cggtattctg caccacgcgg gtgcggttct ggcgttcacc 1200

aacgcgaccc tgaacagcta tcatcgtctg gtgccgggtt ttgaggcgcc gatcaacctg 1260

gtttatagcc aacgtaaccg tagcgcggcg gtgcgtatcc cgattaccgg tagcaacccg 1320

aaggcgaaac gtattgagtt ccgtgcgccg gacccgagcg gtaacccgta cctgggcttt 1380

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gtggacaagg acctgtttga actgccgccg gaggaagcgg cgagcatccc gcaggcgccg 1500

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gacgttttta ccgaggatct gatcgaagcg tacatccagt acaagtacga caacgaaatt 1620

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tctggtacta gtggtgaatt cggtgagctc ggtctgcagc tggtgccgcg cggcagccac 1740

caccaccacc accactaagg atcctaagcg gccgcaagtc ctgcaggaag tggcgcgcca 1800

agtcgccggc gataatacag attaaatcag aacgcagaag cggtctgata aaacagaatt 1860

tgcctggcgg cagtagcgcg gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac 1920

gccgtagcgc cgatggtagt gtggggtctc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat 1980

caaataaaac gaaaggctca 2000

<210> 5

<211> 750

<212> DNA

<213>Artificial sequence

<400> 5

cttccgcttc ctcgctcact gactcgctac gctcggtcgt tcgactgcgg cgagcggtgt 60

cagctcactc aaaagcggta atacggttat ccacagaatc aggggataaa gccggaaaga 120

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tctcatagct cacgctgttg gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 420

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gagaaaacca ccgttggtag cggtggtttt tctttattta tgagatgatg aatcaatcgg 720

tctatcaagt caacgaacag ctattccgtt 750

Claims

1.产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌的构建方法，包括如下步骤：使突变型大肠杆菌或大肠杆菌表达6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰基转移酶，得到产N-乙酰氨基葡萄糖的工程菌；

A1、弱化所述大肠杆菌糖酵解途径得到的突变型大肠杆菌；

A2、解除所述大肠杆菌中对谷氨酰胺合成酶的负反馈抑制。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述使突变型大肠杆菌表达6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰基转移酶为将6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰基转移酶导入所述突变型大肠杆菌；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述抑制或降低大肠杆菌中丙酮酸激酶编码基因的表达或活性为敲除所述大肠杆菌中的丙酮酸激酶编码基因；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

所述带有启动子的谷氨酰胺合成酶基因CgGS的启动子为CPA1。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：

所述突变型大肠杆菌为将所述大肠杆菌按照所述A1和/或A2改造，且按照如下B1和/或B2的方式改造：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述抑制或降低所述大肠杆菌中N-乙酰氨基葡萄糖转运降解途径的基因簇nagEBACD的表达或活性为敲除所述大肠杆菌中N-乙酰氨基葡萄糖转运降解途径的基因簇nagEBACD；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述6-磷酸-氨基葡萄糖合成酶编码基因glm的启动子为119启动子。

8.由权利要求1-7任一所述的方法制备的产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌。

9.权利要求8所述的产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌在制备N-乙酰氨基葡萄糖或其及其衍生产物中的应用。

10.一种制备N-乙酰氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：发酵权利要求8所述的产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌，得到N-乙酰氨基葡萄糖。