CN115806926A - 一种生产假尿苷的基因工程菌株及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产假尿苷的基因工程菌株,所述基因工程菌异源过表达嘧啶核苷操纵子,过表达假尿苷酸合成酶,过表达核糖激酶,过表达核糖核苷水解酶,过表达尿嘧啶渗透酶,不表达假尿苷转运蛋白和假尿苷激酶。本发明从大肠杆菌基因组水平出发,主要通过代谢工程技术手段,对尿苷酸合成途径、假尿苷合成途径、转运系统及假尿苷分支代谢途径各模块进行系统全面的组合优化,提高菌株的假尿苷发酵性能。本基因工程菌株的假尿苷产量高、生产性能稳定、能用于假尿苷生产。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,涉及工业微生物的育种,尤其是一种生产假尿苷的基因工程菌株及其构建方法与应用。
背景技术
假尿苷又称5-B-D-核呋喃基尿嘧啶,分子式为C9H12N2O6,分子量为244.201。假尿苷是一种嘧啶核苷,是尿苷的5位核糖异构体,核糖不与尿嘧啶N1相连,而与嘧啶环的C5连接。假尿苷是RNA上最丰富的修饰核苷,又被称为RNA的“第五种核苷”,在mRNA新冠疫苗中具有重要的应用价值。将假尿苷及其类似物替换尿苷加入mRNA,可以解决mRNA药物容易被免疫系统识别而被清除、产生免疫副反应的问题。同时,假尿苷作为一种RNA的代谢产物,具有仅从肾脏排泄的特点,在临床医学上可用于监测肿瘤的发生、发展及肾病的诊治等。假尿苷具有十分重要的应用价值,随着假尿苷市场需求量的不断扩大,迫切需要开发廉价的可大规模应用的假尿苷生产工艺。
假尿苷的生产方法有化学合成法、化学酶法、微生物发酵法。而目前,关于假尿苷的制备方面的报道颇少。李静简等人以2,3,5-三苄氧基-D-核糖酸-1,4-内酯为原料与2,4-二烷氧基-5-溴嘧啶进行加成反应,而后依次与三乙基硅烷、三氟化硼乙醚进行还原反应,最后用三氯化硼进行脱保护反应得到假尿苷(ZL202210798651.4);金峰等人以D-核糖和尿嘧啶为起始反应物,在有机溶剂中加入乙酰溴与D-核糖反应以及在有机溶剂中使用强路易斯碱后加入(Boc)2O与尿嘧啶反应,两者发生缩合反应后使用三氟乙酸脱去保护基,而后加入乙酸酐进行手性拆分,最后脱去保护基得到假尿苷(ZL202210473532.1)。虽说假尿苷的生产方法主要依赖于化学方法合成,但是化学合成过程中存在合成步骤长、生产成本高、收率低等问题,并且使用易燃易爆等危险试剂。肖聪等人发明了一种化学酶法来合成假尿苷,使用5’-假尿苷单磷酸糖苷酶突变体催化5-磷酸核糖与尿嘧啶合成5’-假尿苷单磷酸,再经化学去磷酸化、分离后得到假尿苷(ZL202111581013.9)。但是该方法也存在原料成本高、生产工艺复杂、转化率低等缺点。与上述方法相比,微生物发酵法具有环境友好、成本低廉、工艺简单、生产可持续等优势。陈伟等人筛选得到了一种链霉菌,可以通过有氧发酵产生1.36g/L的假尿苷(ZA202011421953.7)。进一步,将来自于链霉菌Streptomycessp.ID38640中的假尿苷合成基因pumH、pumJ和pumD基因克隆至大肠杆菌体内,转化得到可产7.2g/L假尿苷的工程菌(ZL202011637153.9)。但是该工程菌携带质粒、生长负担重、产量较低且发酵周期长。
利用代谢工程和合成生物技术选育核苷类产品生产菌株是近年来研究的热点。本发明从大肠杆菌基因组水平出发,主要通过代谢工程技术手段,对尿苷酸合成途径、假尿苷合成途径、转运系统及假尿苷分支代谢途径各模块进行系统全面的组合优化,提高菌株的假尿苷发酵性能。
通过检索,尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术上存在的问题,提供一种生产假尿苷的基因工程菌株及其构建方法与应用。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是:
一种生产假尿苷的基因工程菌株,所述基因工程菌异源过表达嘧啶核苷操纵子,过表达假尿苷酸合成酶,过表达核糖激酶,过表达核糖核苷水解酶,过表达尿嘧啶渗透酶,不表达假尿苷转运蛋白和假尿苷激酶。
进一步地,所述嘧啶核苷操纵子为枯草芽孢杆菌pyrBCAKDFE基因编码的操纵子,核苷酸序列为SEQ ID NO.1;
所述假尿苷酸合成酶为大肠杆菌yeiN基因(NCBI-GeneID:946699)编码的蛋白或海栖热袍菌TM1464基因(NCBI-GeneID:896983)编码的蛋白或根癌农杆菌AWN88_14600基因(NCBI-GeneID:29364903)编码的蛋白;
所述核糖激酶为大肠杆菌rbsK基因(NCBI-GeneID:948260)编码的蛋白或枯草芽孢杆菌rbsK基因(NCBI-GeneID:936844)编码的蛋白;
所述核糖核苷水解酶为大肠杆菌rihA基因(NCBI-GeneID:945503)或大肠杆菌rihB基因(NCBI-GeneID:946646)或大肠杆菌rihC基因(NCBI-GeneID:944796)编码的蛋白;
所述尿嘧啶渗透酶为大肠杆菌uraA基因(NCBI-GeneID:946978)编码的蛋白;
所述假尿苷转运蛋白为大肠杆菌psuT基因(NCBI-GeneID:946671)编码的蛋白;
所述假尿苷激酶为大肠杆菌yeiI基因(NCBI-GeneID:946640)和大肠杆菌yeiC基因(NCBI-GeneID:946664)编码的蛋白。
进一步地,所述嘧啶核苷操纵子的基因连接有启动子Ptrc;和/或
所述假尿苷酸合成酶的基因连接有启动子Ptrc;和/或
所述核糖激酶的基因连接有启动子Ptrc;和/或
所述核糖核苷水解酶的基因连接有启动子Ptrc;和/或
所述尿嘧啶渗透酶的基因连接有启动子Ptrc;
其中,所述启动子Ptrc的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地,所述基因工程菌株在构建时使用的出发菌株为大肠杆菌。
进一步地,所述大肠杆菌为E.coli MG1655。
如上所述的基因工程菌株的构建方法,所述方法包括如下步骤:
在出发菌株中过表达枯草芽孢杆菌来源的嘧啶核苷操纵子基因pyrBCAKDFE,过表达大肠杆菌内源的假尿苷酸合成酶基因yeiN或海栖热袍菌的假尿苷酸合成酶基因TM1464或根癌农杆菌的假尿苷酸合成酶基因AWN88_14600,过表达大肠杆菌内源的核糖激酶基因rbsK或枯草芽孢杆菌的核糖激酶基因rbsK,过表达大肠杆菌内源的核糖核苷水解酶基因rihA或rihB或rihC,过表达大肠杆菌内源的尿嘧啶渗透酶基因uraA,敲除或失活假尿苷转运蛋白基因psuT,敲除或失活假尿苷激酶基因yeiI和yeiC。所述基因工程菌过表达嘧啶核苷操纵子,过表达假尿苷酸合成酶,过表达核糖激酶,过表达核糖核苷水解酶,过表达尿嘧啶渗透酶,不表达假尿苷转运蛋白和假尿苷激酶。
进一步地,所述方法包括如下步骤:
在出发菌株中过表达枯草芽孢杆菌来源的嘧啶核苷操纵子基因pyrBCAKDFE,过表达大肠杆菌内源的假尿苷酸合成酶基因yeiN,过表达大肠杆菌内源的核糖激酶基因rbsK,过表达大肠杆菌内源的核糖核苷水解酶基因rihB,过表达大肠杆菌内源的尿嘧啶渗透酶基因uraA,敲除或失活假尿苷转运蛋白基因psuT,敲除或失活假尿苷激酶基因yeiI和yeiC。
进一步地,所述方法包括如下步骤:
(1)从大肠杆菌E.coli MG1655基因组出发,将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的嘧啶核苷操纵子pyrBCAKDFE与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-pyrBCAKDFE整合在yghX假基因位点;
(2)将大肠杆菌内源的假尿苷酸合成酶基因yeiN与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-yeiN整合在ygay假基因位点;
(3)将大肠杆菌内源的核糖激酶基因rbsK与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-rbsK整合在mbhA假基因位点;
(4)将大肠杆菌内源的核糖核苷水解酶基因rihB与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-rihB整合在yjiT假基因位点;
(5)将大肠杆菌内源的尿嘧啶渗透酶基因uraA与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-uraA整合在ycgh假基因位点;
(6)将假尿苷转运蛋白基因psuT敲除或失活;
(7)将假尿苷激酶基因yeiI和yeiC敲除或失活。
如上述的基因工程菌株在发酵生产假尿苷中的应用。
利用如上所述的基因工程菌株在发酵生产假尿苷的方法,所述方法包括如下步骤:
在适宜条件培养所述基因工程菌株,并从其培养物中收集假尿苷,得到假尿苷;
其中,所述适宜条件是指培养温度37℃,维持pH在7.0±0.5,溶氧在25%-35%之间,并且培养基组成为:
葡萄糖20-25g/L,酵母粉4-8g/L,蛋白胨5-10g/L,柠檬酸钠1-5g/L,KH2PO42-4g/L,MgSO4·7H2O 1.2-2.0g/L,FeSO4·7H2O 20-30mg/L,MnSO4·7H2O 10-20mg/L,VB1、VB3、VB5、VB12、VH各2-4mg/L,其余为水,pH 7.0-7.2。
本发明取得的有益效果是:
1、本发明基因工程菌株过表达嘧啶核苷操纵子,过表达假尿苷酸合成酶,过表达核糖激酶,过表达核糖核苷水解酶,过表达尿嘧啶渗透酶,不表达假尿苷转运蛋白和假尿苷激酶。本发明从大肠杆菌基因组水平出发,主要通过代谢工程技术手段,对尿苷酸合成途径、假尿苷合成途径、转运系统及假尿苷分支代谢途径各模块进行系统全面的组合优化,提高菌株的假尿苷发酵性能。本基因工程菌株的假尿苷产量高、生产性能稳定、能用于假尿苷生产。
2、本发明利用理性代谢工程改造的方法获得了具有清晰遗传背景、不含质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物并且从头高效合成假尿苷的工程菌株。目前现有技术中假尿苷的产量最高的是通过一株携带质粒的工程菌获得的,产量为7.2g/L,发酵周期为72-96h(ZL202011637153.9)。从生产表型来看,本发明所述菌株在5L罐上发酵48h后假尿苷产量达到了20g/L,发酵产量是现有报道的最高水平,且发酵周期与现有报道相比明显缩短。
3、从构建策略来看,本发明通过代谢工程技术手段,分模块对尿苷酸合成途径、假尿苷合成途径、转运系统及假尿苷分支代谢途径各模块进行了系统全面的组合优化,整体的代谢改造策略(见图1)未见相关报道。由于所有操作均在基因组上完成,最终所得工程菌株可更加稳定高效生产假尿苷,具有良好的工业化应用前景。
附图说明
图1为本发明中假尿苷工程菌株的代谢改造策略图;
图2为本发明中嘧啶核苷操纵子pyrBCAKDFE分段整合片段构建及验证电泳图;包括:
图2A为本发明中pyr1整合片段构建及验证电泳图;其中:M:1kb DNAMarker;1:上游同源臂;2:pyr1片段;3:下游同源臂;4:重叠片段;5:原菌PCR片段;6:阳性单菌落PCR鉴定片段;
图2B为本发明中pyr2整合片段构建及验证电泳图;其中:M:1kb DNA Marker;1:pyr2上游片段-pyr2片段;2:下游同源臂;3:重叠片段;4:原菌PCR片段;5:阳性单菌落PCR鉴定片段;
图2C为本发明中pyr3整合片段构建及验证电泳图;其中:M:1kb DNA Marker;1:pyr3上游片段-pyr3片段;2:下游同源臂;3:重叠片段;4:原菌PCR片段;5:阳性单菌落PCR鉴定片段;
图3为本发明中yeiN整合片段构建及验证电泳图;其中:M:1kb DNAMarker;1:上游同源臂;2:目的基因;3:下游同源臂;4:重叠片段;5:原菌PCR片段;6:阳性单菌落PCR鉴定片段;
图4为本发明中rbsK整合片段构建及验证电泳图;其中:M:1kb DNAMarker;1:上游同源臂;2:目的基因;3:下游同源臂;4:重叠片段;5:原菌PCR片段;6:阳性单菌落PCR鉴定片段;
图5为本发明中rihB整合片段构建及验证电泳图;其中:M:1kb DNAMarker;1:上游同源臂;2:目的基因;3:下游同源臂;4:重叠片段;5:原菌PCR片段;6:阳性单菌落PCR鉴定片段;
图6为本发明中uraA整合片段构建及验证电泳图;其中:M:1kb DNAMarker;1:上游同源臂;2:目的基因;3:下游同源臂;4:重叠片段;5:原菌PCR片段;6:阳性单菌落PCR鉴定片段;
图7为本发明中psuT基因敲除片段构建及验证电泳图;其中:M:1kb DNAMarker;1:上游同源臂;2:下游同源臂;3:重叠片段;4:原菌PCR片段;5:阳性单菌落PCR鉴定片段;
图8为本发明中yeiI基因敲除片段构建及验证电泳图;其中:M:1kb DNAMarker;1:上游同源臂;2:下游同源臂;3:重叠片段;4:原菌PCR片段;5:阳性单菌落PCR鉴定片段;
图9为本发明中yeiC基因敲除片段构建及验证电泳图;其中:M:1kb DNAMarker;1:上游同源臂;2:下游同源臂;3:重叠片段;4:原菌PCR片段;5:阳性单菌落PCR鉴定片段;
图10为本发明中实施例2的摇瓶发酵结果图;
图11为本发明中实施例3的5L发酵罐发酵过程曲线图;
图12为本发明中假尿苷标品的高效液相色谱图,其中4.3min中是假尿苷的峰;
图13为本发明中发酵液的高效液相色谱图,其中4.3min中是假尿苷的峰。
具体实施方式
为更好理解本发明,下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明,但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。
本发明中所使用的的原料,如无特殊说明,均为常规市售产品,本发明中所使用的方法,如无特殊说明,均为本领域常规方法,本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。
一种生产假尿苷的基因工程菌株,所述基因工程菌异源过表达嘧啶核苷操纵子,过表达假尿苷酸合成酶,过表达核糖激酶,过表达核糖核苷水解酶,过表达尿嘧啶渗透酶,不表达假尿苷转运蛋白和假尿苷激酶。
较优地,所述嘧啶核苷操纵子为枯草芽孢杆菌pyrBCAKDFE基因编码的操纵子,核苷酸序列为SEQ ID NO.1;
所述假尿苷酸合成酶为大肠杆菌yeiN基因(NCBI-GeneID:946699)编码的蛋白或海栖热袍菌TM1464基因(NCBI-GeneID:896983)编码的蛋白或根癌农杆菌AWN88_14600基因(NCBI-GeneID:29364903)编码的蛋白;
所述核糖激酶为大肠杆菌rbsK基因(NCBI-GeneID:948260)编码的蛋白或枯草芽孢杆菌rbsK基因(NCBI-GeneID:936844)编码的蛋白;
所述核糖核苷水解酶为大肠杆菌rihA基因(NCBI-GeneID:945503)或大肠杆菌rihB基因(NCBI-GeneID:946646)或大肠杆菌rihC基因(NCBI-GeneID:944796)编码的蛋白;
所述尿嘧啶渗透酶为大肠杆菌uraA基因(NCBI-GeneID:946978)编码的蛋白;
所述假尿苷转运蛋白为大肠杆菌psuT基因(NCBI-GeneID:946671)编码的蛋白;
所述假尿苷激酶为大肠杆菌yeiI基因(NCBI-GeneID:946640)和大肠杆菌yeiC基因(NCBI-GeneID:946664)编码的蛋白。
较优地,所述嘧啶核苷操纵子的基因连接有启动子Ptrc;和/或
所述假尿苷酸合成酶的基因连接有启动子Ptrc;和/或
所述核糖激酶的基因连接有启动子Ptrc;和/或
所述核糖核苷水解酶的基因连接有启动子Ptrc;和/或
所述尿嘧啶渗透酶的基因连接有启动子Ptrc;
其中,所述启动子Ptrc的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
较优地,所述基因工程菌株在构建时使用的出发菌株为大肠杆菌。
较优地,所述大肠杆菌为E.coli MG1655。
如上所述的基因工程菌株的构建方法,所述方法包括如下步骤:
在出发菌株中过表达枯草芽孢杆菌来源的嘧啶核苷操纵子基因pyrBCAKDFE,过表达大肠杆菌内源的假尿苷酸合成酶基因yeiN或海栖热袍菌的假尿苷酸合成酶基因TM1464或根癌农杆菌的假尿苷酸合成酶基因AWN88_14600,过表达大肠杆菌内源的核糖激酶基因rbsK或枯草芽孢杆菌的核糖激酶基因rbsK,过表达大肠杆菌内源的核糖核苷水解酶基因rihA或rihB或rihC,过表达大肠杆菌内源的尿嘧啶渗透酶基因uraA,敲除或失活假尿苷转运蛋白基因psuT,敲除或失活假尿苷激酶基因yeiI和yeiC。所述基因工程菌过表达嘧啶核苷操纵子,过表达假尿苷酸合成酶,过表达核糖激酶,过表达核糖核苷水解酶,过表达尿嘧啶渗透酶,不表达假尿苷转运蛋白和假尿苷激酶。
较优地,所述方法包括如下步骤:
在出发菌株中过表达枯草芽孢杆菌来源的嘧啶核苷操纵子基因pyrBCAKDFE,过表达大肠杆菌内源的假尿苷酸合成酶基因yeiN,过表达大肠杆菌内源的核糖激酶基因rbsK,过表达大肠杆菌内源的核糖核苷水解酶基因rihB,过表达大肠杆菌内源的尿嘧啶渗透酶基因uraA,敲除或失活假尿苷转运蛋白基因psuT,敲除或失活假尿苷激酶基因yeiI和yeiC。
较优地,所述方法包括如下步骤:
(1)从大肠杆菌E.coli MG1655基因组出发,将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的嘧啶核苷操纵子pyrBCAKDFE与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-pyrBCAKDFE整合在yghX假基因位点;
(2)将大肠杆菌内源的假尿苷酸合成酶基因yeiN与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-yeiN整合在ygay假基因位点;
(3)将大肠杆菌内源的核糖激酶基因rbsK与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-rbsK整合在mbhA假基因位点;
(4)将大肠杆菌内源的核糖核苷水解酶基因rihB与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-rihB整合在yjiT假基因位点;
(5)将大肠杆菌内源的尿嘧啶渗透酶基因uraA与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-uraA整合在ycgh假基因位点;
(6)将假尿苷转运蛋白基因psuT敲除或失活;
(7)将假尿苷激酶基因yeiI和yeiC敲除或失活。
如上述的基因工程菌株在发酵生产假尿苷中的应用。
利用如上所述的基因工程菌株在发酵生产假尿苷的方法,所述方法包括如下步骤:
在适宜条件培养所述基因工程菌株,并从其培养物中收集假尿苷,得到假尿苷;
其中,所述适宜条件是指培养温度37℃,维持pH在7.0±0.5,溶氧在25%-35%之间,并且培养基组成为:
葡萄糖20-25g/L,酵母粉4-8g/L,蛋白胨5-10g/L,柠檬酸钠1-5g/L,KH2PO42-4g/L,MgSO4·7H2O 1.2-2.0g/L,FeSO4·7H2O 20-30mg/L,MnSO4·7H2O 10-20mg/L,VB1、VB3、VB5、VB12、VH各2-4mg/L,其余为水,pH 7.0-7.2。
具体地,相关的制备及检测如下:
一种大肠杆菌基因工程菌株,该基因工程菌异源过表达嘧啶核苷操纵子,过表达假尿苷酸合成酶,过表达核糖激酶,过表达核糖核苷水解酶,过表达尿嘧啶渗透酶,不表达假尿苷转运蛋白和假尿苷激酶。
优选的,所述嘧啶核苷操纵子基因pyrBCAKDFE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的,所述假尿苷酸合成酶基因yeiN的NCBI-GeneID:946699。
优选的,所述核糖激酶基因rbsK的NCBI-GeneID:948260。
优选的,所述核糖核苷水解酶基因rihB的NCBI-GeneID:946646。
优选的,所述尿嘧啶渗透酶基因uraA的NCBI-GeneID:946978。
优选的,所述假尿苷转运蛋白基因psuT的NCBI-GeneID:946671。
优选的,所述假尿苷激酶基因yeiI的NCBI-GeneID:946640。
优选的,所述假尿苷激酶基因yeiC的NCBI-GeneID:946664。
根据本发明,不表达上述基因的方式可以采用本领域常规手段,例如,通过本领域常规手段使该基因失活或者将该基因敲除。
根据本发明,所述不表达是指该基因表达产物的量显著低于原有水平,例如,显著降低了50%、60%、70%、80%、90%、100%。
根据本发明,过表达上述基因的方式可以采取本领域常规手段,例如,增加基因的拷贝数或者使该基因连接强启动子。
根据本发明,所述过表达是指该基因表达产物的量显著高于原有水平。
根据本发明一种优选的实施方式,所述嘧啶核苷操纵子基因pyrBCAKDFE连接有启动子Ptrc;和/或所述假尿苷酸合成酶基因yeiN连接有启动子Ptrc;和/或所述核糖激酶基因rbsK连接有启动子Ptrc;和/或核糖核苷水解酶基因rihB连接有启动子Ptrc;和/或尿嘧啶渗透酶基因uraA连接有启动子Ptrc;优选的,所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
根据本发明,用于构建所述大肠杆菌基因工程菌株的出发菌株可以是任意的大肠杆菌,根据本发明一种优选的实施方式,所述出发菌株是E.coli MG1655。
如上所述的大肠杆菌基因工程菌株的构建方法,包括:在出发菌株大肠杆菌中过表达枯草芽孢杆菌来源的嘧啶核苷操纵子基因pyrBCAKDFE,过表达大肠杆菌内源的假尿苷酸合成酶基因yeiN,过表达大肠杆菌内源的核糖激酶基因rbsK,过表达大肠杆菌内源的核糖核苷水解酶基因rihB,过表达大肠杆菌内源的尿嘧啶渗透酶基因uraA,敲除或失活假尿苷转运蛋白基因psuT,敲除或失活假尿苷激酶基因yeiI和yeiC。
上面已经详细介绍了上述各基因的选择、启动子的选择、出发菌株的选择等,此处不再赘述。
一种具体的实施方式,该方法包括:
(1)增强尿苷酸合成途径
从菌株E.coli MG1655基因组出发,将B.subtilis A260的嘧啶核苷操纵子pyrBCAKDFE与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-pyrBCAKDFE整合在yghX假基因位点;该步骤强化了嘧啶核苷从头合成通量,解除了尿苷酸对氨甲酰磷酸合成酶的反馈抑制;
(2)增强假尿苷合成途径
将大肠杆菌内源的假尿苷酸合成酶基因yeiN与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-yeiN整合在ygay假基因位点,强化5-磷酸核糖与尿嘧啶向5’-假尿苷单磷酸的转化;将大肠杆菌内源的核糖激酶基因rbsK与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-rbsK整合在mbhA假基因位点,强化核糖到5-磷酸核糖的转化;将大肠杆菌内源的核糖核苷水解酶基因rihB与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-rihB整合在yjiT假基因位点,强化尿苷到尿嘧啶的转化;5’-假尿苷单磷酸通过胞内的核苷酸酶的作用生成假尿苷,该步骤促进了假尿苷的合成和分泌;
(3)修饰转运系统
将大肠杆菌内源的尿嘧啶渗透酶基因uraA与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-uraA整合在ycgh假基因位点,强化尿嘧啶向胞内的转运;敲除假尿苷转运蛋白基因psuT,减弱了假尿苷向胞内的转运。
(4)减弱假尿苷分支代谢途径
敲除假尿苷激酶基因yeiI和yeiC,减弱了假尿苷向5’-假尿苷单磷酸的转化。
本发明上述构建过程的原理可参考图1所示。
如上所述的大肠杆菌基因工程菌株在高产假尿苷中的应用,包括:在适宜条件培养所述基因工程菌株,并从其培养物中收集假尿苷。
一种优选的实施方式,所述适宜条件是指培养温度37℃,维持pH在7.0左右,溶氧在25%-35%之间,并且培养基组成为:葡萄糖20-25g/L,酵母粉4-8g/L,蛋白胨5-10g/L,柠檬酸钠1-5g/L,KH2PO42-4 g/L,MgSO4·7H2O 1.2-2.0g/L,FeSO4·7H2O 20-30mg/L,MnSO4·7H2O 10-20mg/L,VB1、VB3、VB5、VB12、VH各2-4mg/L,其余为水,pH7.0-7.2。
以下将通过具体的实施例对本发明进行更详细描述。以下实施例中:
如无特别说明,本发明实施例中所涉及的基因编辑方法参照文献(Li Y,Lin Z,Huang C,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9meditated genome editing.Metabolic engineering,2015,31:13-21.)进行,其他所涉及的分子生物学、基因工程等具体操作手段根据本领域人员容易获得的技术手册、教科书或文献报道均可以实现。
实施例1:假尿苷工程菌株E.coli psu8的构建
1基因编辑方法
本发明中采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑方法,可参照文献(MetabolicEngineering,2015,31:13-21.)进行。CRISPR/Cas9是一种精确、高效的新型基因靶向修饰技术,该方法所用的两种质粒分别为pGRB与pREDCas9。pREDCas9质粒为温敏型质粒,携带gRNA质粒的消除系统,λ噬菌体的Red重组系统及Cas9蛋白表达系统,具有奇霉素抗性(工作浓度:100mg/L),适培温度32℃;pGRB质粒,以pUC18为骨架,包含启动子J23100,gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列,具有氨苄青霉素抗性(工作浓度:100mg/L),适培温度37℃。
2增强尿苷酸合成途径
将枯草芽孢杆菌(B.subtilisA260)的嘧啶核苷操纵子pyrBCAKDFE(包含pyrB、pyrC、pyrAA、pyrAB、pyrK、pyrD、pyrF、pyrE八个基因)共9492bp,在本实施例中分pyr1、pyr2、pyr3三段依次整合至大肠杆菌yghX基因位点,并由启动子Ptrc启动该外源操纵子的转录表达,构建了菌株E.colipsu1-3。具体包括:
2.1Ptrc-pyr1的整合
以E.coli MG1655基因组为模板,根据其yghX基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-yghX-S、UP-yghX-A)和下游同源臂引物(DN-yghX-S1、DN-yghX-A),PCR扩增其上下游同源臂片段;以B.subtilisA260基因组为模板,根据pyr1(SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第1-3260位)设计引物(pyr1-S、pyr1-A),PCR扩增pyr1基因片段,启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和pyr1基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得pyr1基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-pyr1-下游同源臂),通过引物gRNA-yghX-S和gRNA-yghX-A的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段,与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-yghX。将该重组片段和质粒pGRB-yghX电转至含有pREDCas9质粒的MG1655的感受态细胞,筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株E.coli psu1-1。Ptrc-pyr1整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图2A。其中,上游同源臂的长度为658bp,pyr1基因片段长度为3363bp,下游同源臂的长度为604bp,整合片段的总长为4560bp。PCR验证时,阳性菌PCR扩增片段长度应为4560bp,原菌PCR扩增片段长度应为1765bp。
2.2Ptrc-pyr2的整合
以B.subtilis A260基因组为模板,根据pyr2及其上游序列(SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第2448-6469位)设计引物(pyr2-S、pyr2-A),PCR扩增pyr2片段;以E.coliMG1655基因组为模板,根据其yghX基因的下游同源臂引物(DN-yghX-S2、DN-yghX-A),PCR扩增其下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得pyr2基因的整合片段(pyr2-下游同源臂),通过引物gRNA-S1和gRNA-A1的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段,与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-pyr2。将该重组片段和质粒pGRB-pyr2电转至含有pREDCas9质粒的E.coli psu1-1的感受态细胞,筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株E.coli psu1-2。pyr2整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图2B。其中pyr2基因片段及其上游同源臂的长度为4065bp,下游同源臂的长度为604bp,整合片段的总长为4646bp。PCR验证时,阳性菌PCR扩增片段长度应为4646bp,原菌PCR扩增片段长度应为1437bp。
2.3Ptrc-pyr3的整合
以B.subtilis A260基因组为模板,根据pyr3及其上游序列(SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第(5671-9492位)设计引物(pyr3-S、pyr3-A),PCR扩增pyr3片段;以E.coliMG1655基因组为模板,根据其yghX基因的下游同源臂引物(DN-yghX-S3、DN-yghX-A),PCR扩增其下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得pyr3基因的整合片段(pyr3-下游同源臂),通过引物gRNA-S2和gRNA-A2的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段,与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-pyr3。将该重组片段和质粒pGRB-pyr3电转至含有pREDCas9质粒的E.coli psu1-2的感受态细胞,筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株E.coli psu1-3。pyr3整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图2C。其中pyr3基因片段及其上游同源臂的长度为3885bp,下游同源臂的长度为622bp,整合片段的总长为4468bp。PCR验证时,阳性菌PCR扩增片段长度应为4468bp,原菌PCR扩增片段长度应为1426bp。
3增强假尿苷合成途径
3.1yeiN基因的整合
以E.coli MG1655基因组为模板,根据其ygaY基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-ygaY-S、UP-ygaY-A)和下游同源臂引物(DN-ygaY-S、DN-ygaY-A),PCR扩增其上下游同源臂片段;根据其yeiN基因(NCBI-GeneID:946699)设计引物(yeiN-S、yeiN-A),扩增yeiN基因片段,启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和yeiN基因的上游引物中,终止子Ttrc则设计在下游同源臂的上游引物和yeiN基因的下游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得yeiN基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-yeiN-Ttrc-下游同源臂),通过引物gRNA-ygaY-S和gRNA-ygaY-A的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段,与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-ygaY。将该重组片段和质粒pGRB-ygaY电转至含有pREDCas9质粒的E.coli psu1-3的感受态细胞,筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株E.coli psu2。yeiN整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图3。其中,上游同源臂的长度为629bp,yeiN基因片段长度为1063bp,下游同源臂的长度为549bp,整合片段的总长为2152bp。PCR验证时,阳性菌PCR扩增片段长度应为1642bp,原菌PCR扩增片段长度应为2083bp。
3.2rbsK基因的整合
以E.coli MG1655基因组为模板,根据其mbhA基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-mbhA-S、UP-mbhA-A)和下游同源臂引物(DN-mbhA-S、DN-mbhA-A),PCR扩增其上下游同源臂片段;根据其rbsK基因(NCBI-GeneID:948260)设计引物(rbsK-S、rbsK-A),扩增rbsK基因片段,启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和rbsK基因的上游引物中,终止子Ttrc则设计在下游同源臂的上游引物和rbsK基因的下游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得rbsK基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-rbsK-Ttrc-下游同源臂),通过引物gRNA-mbhA-S和gRNA-mbhA-A的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段,与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-mbhA。将该重组片段和质粒pGRB-mbhA电转至含有pREDCas9质粒的E.coli psu2的感受态细胞,筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株E.coli psu3。rbsK整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图4。其中,上游同源臂的长度为692bp,rbsK基因片段长度为1053bp,下游同源臂的长度为749bp,整合片段的总长为2413bp。PCR验证时,阳性菌PCR扩增片段长度应为2413bp,原菌PCR扩增片段长度应为1837bp。
3.3rihB基因的整合
以E.coli MG1655基因组为模板,根据其yjit基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-yjit-S、UP-yjit-A)和下游同源臂引物(DN-yjit-S、DN-yjit-A),PCR扩增其上下游同源臂片段;根据其rihB基因(NCBI-GeneID:946646)设计引物(rihB-S、rihB-A),扩增rihB基因片段,启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和rihB基因的上游引物中,终止子Ttrc则设计在下游同源臂的上游引物和rihB基因的下游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得rihB基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-rihB-Ttrc-下游同源臂),通过引物gRNA-yjit-S和gRNA-yjit-A的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段,与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-yjit。将该重组片段和质粒pGRB-yjit电转至含有pREDCas9质粒的E.coli psu3的感受态细胞,筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株E.colipsu4。rihB整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图5。其中,上游同源臂的长度为380bp,rihB基因片段长度为1065bp,下游同源臂的长度为532bp,整合片段的总长为1889bp。PCR验证时,阳性菌PCR扩增片段长度应为1396bp,原菌PCR扩增片段长度应为1873bp。
4修饰转运系统
4.1uraA基因的整合
以E.coli MG1655基因组为模板,根据其ycgh基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-ycgh-S、UP-ycgh-A)和下游同源臂引物(DN-ycgh-S、DN-ycgh-A),PCR扩增其上下游同源臂片段;根据其uraA基因(NCBI-GeneID:946978)设计引物(uraA-S、uraA-A),扩增uraA基因片段,启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和uraA基因的上游引物中,终止子Ttrc则设计在下游同源臂的上游引物和uraA基因的下游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得uraA基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-uraA-Ttrc-下游同源臂),通过引物gRNA-ycgh-S和gRNA-ycgh-A的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段,与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-ycgh。将该重组片段和质粒pGRB-ycgh电转至含有pREDCas9质粒的E.coli psu4的感受态细胞,筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株E.coli psu5。uraA整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图6。其中,上游同源臂的长度为580bp,uraA基因片段长度为1413bp,下游同源臂的长度为630bp,整合片段的总长为2535bp。PCR验证时,阳性菌PCR扩增片段长度应为2535bp,原菌PCR扩增片段长度应为1409bp。
4.2psuT基因的敲除
以E.coli MG1655基因组为模板,根据其psuT基因(NCBI-GeneID:946671)的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-psuT-S、UP-psuT-A)和下游同源臂引物(DN-psuT-S、DN-psuT-A),PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得psuT基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。通过引物gRNA-psuT-S和gRNA-psuT-A的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段,与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-psuT。将该重组片段和质粒pGRB-psuT电转至含有pREDCas9质粒的E.coli psu5的感受态细胞,筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株E.coli psu6。psuT敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图7。其中,上游同源臂的长度为303bp,下游同源臂的长度为513bp,重叠片段的总长为775bp。PCR验证时,阳性菌PCR扩增片段长度应为775bp,原菌PCR扩增片段长度应为1970bp。
5减弱假尿苷分支代谢途径
5.1yeiI基因的敲除
以E.coli MG1655基因组为模板,根据其yeiI基因(NCBI-GeneID:946640)的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-yeiI-S、UP-yeiI-A)和下游同源臂引物(DN-yeiI-S、DN-yeiI-A),PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得yeiI基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。通过引物gRNA-yeiI-S和gRNA-yeiI-A的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段,与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-yeiI。将该重组片段和质粒pGRB-yeiI电转至含有pREDCas9质粒的E.coli psu6的感受态细胞,筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株E.coli psu7。yeiI敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图8。其中,上游同源臂的长度为617bp,下游同源臂的长度为314bp,重叠片段的总长为885bp。PCR验证时,阳性菌PCR扩增片段长度应为885bp,原菌PCR扩增片段长度应为2372bp。
5.2yeiC基因的敲除
以E.coli MG1655基因组为模板,根据其yeiC基因(NCBI-GeneID:946664)的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-yeiC-S、UP-yeiC-A)和下游同源臂引物(DN-yeiC-S、DN-yeiC-A),PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得yeiC基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。通过引物gRNA-yeiC-S和gRNA-yeiC-A的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段,与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-yeiC。将该重组片段和质粒pGRB-yeiC电转至含有pREDCas9质粒的E.coli psu7的感受态细胞,筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株E.coli psu8。psuT敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图9。其中,上游同源臂的长度为734bp,下游同源臂的长度为860bp,重叠片段的总长为1547bp。PCR验证时,阳性菌PCR扩增片段长度应为1547bp,原菌PCR扩增片段长度应为2408bp。
6菌株构建过程中用到的引物
上述构建过程所涉及的引物见下表:
实施例2:假尿苷工程菌株摇瓶发酵实验
摇瓶培养方法如下:
斜面活化培养:取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面,37℃培养12h,再传代一次;
种子培养:用接种环刮取一环斜面种子接种于装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中,九层纱布封口,37℃,200rmp培养7-10h;
发酵培养:按种子培养液体积10-15%的接种量接种到装有发酵培养基的500mL三角瓶中(终体积为30ml),九层纱布封口,37℃,200r/min振荡培养,发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2;补加60%(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行;发酵周期36h。
斜面培养基:葡萄糖1-5g/L,蛋白胨5-10g/L,牛肉膏5-10g/L,酵母粉1-5g/L,氯化钠1-2.5g/L,琼脂25-30g/L,其余为水,pH 7.0-7.2。
种子培养基:葡萄糖20-25g/L,酵母粉4-8g/L,KH2PO41-2 g/L,MgSO4·7H2O 0.1-0.5g/L,FeSO4·7H2O 2-5mg/L,MnSO4·7H2O 2-5mg/L,VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1-2mg/L,其余为水,pH 7.0-7.2。
发酵培养基:葡萄糖20-25g/L,酵母粉4-8g/L,KH2PO42-4 g/L,MgSO4·7H2O 0.1-0.5g/L,FeSO4·7H2O 20-30mg/L,MnSO4·7H2O 10-20mg/L,VB1、VB3、VB5、VB12、VH各2-4mg/L,其余为水,pH 7.0-7.2。
摇瓶发酵结果:如图10所示,对菌株psu4、psu5、psu6、psu7、psu8进行摇瓶发酵,结果显示五个菌株的OD600值均无明显变化,但假尿苷产率均得到不同程度的提升。菌株psu8的假尿苷产率最高,达到4g/L。
实施例3:假尿苷工程菌株5L罐发酵实验
发酵罐培养方法如下:
斜面活化培养:取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面,37℃培养12h,转接茄形瓶继续培养12-16h;
种子培养:取适量无菌水于茄形瓶中,将菌悬液接入种子培养基中,pH稳定在7.0左右,温度恒定在37℃,溶氧在25-35%之间,培养至细胞干重达到5-6g/L;
发酵培养:按照15-20%接种量接入新鲜的发酵培养基,开始发酵,发酵过程中控制pH稳定在7.0左右,温度维持在37℃,溶氧在25-35%之间;当培养基中的葡萄糖消耗完之后,流加80%(m/v)的葡萄糖溶液,维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-2g/L。
斜面培养基:葡萄糖1-5g/L,蛋白胨5-10g/L,牛肉膏5-10g/L,酵母粉1-5g/L,氯化钠1-2.5g/L,琼脂25-30g/L,其余为水,pH 7.0-7.2。
种子培养基:葡萄糖20-25g/L,酵母粉4-8g/L,蛋白胨1-5g/L,KH2PO41-4 g/L,MgSO4·7H2O 1.2-2.0g/L,FeSO4·7H2O 20-30mg/L,MnSO4·7H2O 10-20mg/L,VB1、VB3、VB5、VB12、VH各2-4mg/L,其余为水,pH 7.0-7.2。
发酵培养基:葡萄糖20-25g/L,酵母粉4-8g/L,蛋白胨5-10g/L,柠檬酸钠1-5g/L,KH2PO42-4 g/L,MgSO4·7H2O 1.2-2.0g/L,FeSO4·7H2O 20-30mg/L,MnSO4·7H2O10-20mg/L,VB1、VB3、VB5、VB12、VH各2-4mg/L,其余为水,pH 7.0-7.2。
5L发酵罐分批补料发酵结果:如图11所示,发酵初期菌株生长迅速,OD600值达到最高后逐渐降低,48h的假尿苷产量达到20g/L。假尿苷标品的液相检测结果如图12所示,发酵液的液相检测结果如图13所示。
目前现有技术中假尿苷的产量最高的是通过一株携带质粒的工程菌获得的,产量为7.2g/L,发酵周期为72-96h(ZL202011637153.9)。本发明假尿苷的基因工程菌及其发酵方法的假尿苷产量高达20g/L,发酵周期为48h,均优于现有技术中的假尿苷的产量和发酵周期。
相关序列如下:
尽管为说明目的公开了本发明的实施例,但是本领域的技术人员可以理解:在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内,各种替换、变化和修改都是可能的,因此,本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
Claims (10)
1.一种生产假尿苷的基因工程菌株,其特征在于:所述基因工程菌异源过表达嘧啶核苷操纵子,过表达假尿苷酸合成酶,过表达核糖激酶,过表达核糖核苷水解酶,过表达尿嘧啶渗透酶,不表达假尿苷转运蛋白和假尿苷激酶。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于:所述嘧啶核苷操纵子为枯草芽孢杆菌pyrBCAKDFE基因编码的操纵子,核苷酸序列为SEQ ID NO.1;
所述假尿苷酸合成酶为大肠杆菌yeiN基因(NCBI-GeneID:946699)编码的蛋白或海栖热袍菌TM1464基因(NCBI-GeneID:896983)编码的蛋白或根癌农杆菌AWN88_14600基因(NCBI-GeneID:29364903)编码的蛋白;
所述核糖激酶为大肠杆菌rbsK基因(NCBI-GeneID:948260)编码的蛋白或枯草芽孢杆菌rbsK基因(NCBI-GeneID:936844)编码的蛋白;
所述核糖核苷水解酶为大肠杆菌rihA基因(NCBI-GeneID:945503)或大肠杆菌rihB基因(NCBI-GeneID:946646)或大肠杆菌rihC基因(NCBI-GeneID:944796)编码的蛋白;
所述尿嘧啶渗透酶为大肠杆菌uraA基因(NCBI-GeneID:946978)编码的蛋白;
所述假尿苷转运蛋白为大肠杆菌psuT基因(NCBI-GeneID:946671)编码的蛋白;
所述假尿苷激酶为大肠杆菌yeiI基因(NCBI-GeneID:946640)和大肠杆菌yeiC基因(NCBI-GeneID:946664)编码的蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌株,其特征在于:所述嘧啶核苷操纵子的基因连接有启动子Ptrc;和/或
所述假尿苷酸合成酶的基因连接有启动子Ptrc;和/或
所述核糖激酶的基因连接有启动子Ptrc;和/或
所述核糖核苷水解酶的基因连接有启动子Ptrc;和/或
所述尿嘧啶渗透酶的基因连接有启动子Ptrc;
其中,所述启动子Ptrc的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1或2所述的基因工程菌株,其特征在于:所述基因工程菌株在构建时使用的出发菌株为大肠杆菌。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌株,其特征在于:所述大肠杆菌为E.coli MG1655。
6.如权利要求1至5任一所述的基因工程菌株的构建方法,其特征在于:所述方法包括如下步骤:
在出发菌株中过表达枯草芽孢杆菌来源的嘧啶核苷操纵子基因pyrBCAKDFE,过表达大肠杆菌内源的假尿苷酸合成酶基因yeiN或海栖热袍菌的假尿苷酸合成酶基因TM1464或根癌农杆菌的假尿苷酸合成酶基因AWN88_14600,过表达大肠杆菌内源的核糖激酶基因rbsK或枯草芽孢杆菌的核糖激酶基因rbsK,过表达大肠杆菌内源的核糖核苷水解酶基因rihA或rihB或rihC,过表达大肠杆菌内源的尿嘧啶渗透酶基因uraA,敲除或失活假尿苷转运蛋白基因psuT,敲除或失活假尿苷激酶基因yeiI和yeiC。所述基因工程菌过表达嘧啶核苷操纵子,过表达假尿苷酸合成酶,过表达核糖激酶,过表达核糖核苷水解酶,过表达尿嘧啶渗透酶,不表达假尿苷转运蛋白和假尿苷激酶。
7.根据权利要求6所述的构建方法,其特征在于:所述方法包括如下步骤:
在出发菌株中过表达枯草芽孢杆菌来源的嘧啶核苷操纵子基因pyrBCAKDFE,过表达大肠杆菌内源的假尿苷酸合成酶基因yeiN,过表达大肠杆菌内源的核糖激酶基因rbsK,过表达大肠杆菌内源的核糖核苷水解酶基因rihB,过表达大肠杆菌内源的尿嘧啶渗透酶基因uraA,敲除或失活假尿苷转运蛋白基因psuT,敲除或失活假尿苷激酶基因yeiI和yeiC。
8.根据权利要求7所述的构建方法,其特征在于:所述方法包括如下步骤:
(1)从大肠杆菌E.coli MG1655基因组出发,将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的嘧啶核苷操纵子pyrBCAKDFE与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-pyrBCAKDFE整合在yghX假基因位点;
(2)将大肠杆菌内源的假尿苷酸合成酶基因yeiN与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-yeiN整合在ygay假基因位点;
(3)将大肠杆菌内源的核糖激酶基因rbsK与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-rbsK整合在mbhA假基因位点;
(4)将大肠杆菌内源的核糖核苷水解酶基因rihB与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-rihB整合在yjiT假基因位点;
(5)将大肠杆菌内源的尿嘧啶渗透酶基因uraA与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-uraA整合在ycgh假基因位点;
(6)将假尿苷转运蛋白基因psuT敲除或失活;
(7)将假尿苷激酶基因yeiI和yeiC敲除或失活。
9.如权利要求1至5任一所述的基因工程菌株在发酵生产假尿苷中的应用。
10.利用如权利要求1至5任一所述的基因工程菌株在发酵生产假尿苷的方法,其特征在于:所述方法包括如下步骤:
在适宜条件培养所述基因工程菌株,并从其培养物中收集假尿苷,得到假尿苷;
其中,所述适宜条件是指培养温度37℃,维持pH在7.0±0.5,溶氧在25%-35%之间,并且培养基组成为:
葡萄糖20-25g/L,酵母粉4-8g/L,蛋白胨5-10g/L,柠檬酸钠1-5g/L,KH2PO42-4 g/L,MgSO4·7H2O 1.2-2.0g/L,FeSO4·7H2O 20-30mg/L,MnSO4·7H2O 10-20mg/L,VB1、VB3、VB5、VB12、VH各2-4mg/L,其余为水,pH 7.0-7.2。
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AAZAZ ABDERRAHMANE,王戈林,沈萍: "一种具高活性的酪氨酸酶基因启动子片段的分离", 武汉大学学报(自然科学版), no. 02, 10 April 1999 (1999-04-10) * |
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