CN117965587A - 一种含hok/sok基因的菌株及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域,尤其是涉及一种含hok/sok基因的菌株及其制备与应用。本发明通过将hok/sok基因片段插入重组蛋白表达载体中,并优化基因插入位点,筛选到在重组大肠杆菌高密度发酵过程中质粒稳定性有显著提高的高产菌株。高密度发酵结束后,在有抗生素添加情况下质粒保有率为100%;在不添加抗生素情况下,质粒保有率为65%,重组蛋白表达量提高了40%。与现有技术相比,本发明的质粒稳定系统应用于大肠杆菌高密度发酵过程中显著提高了生产效率,具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,尤其是涉及一种含hok/sok基因的菌株及其制备与应用。
背景技术
质粒是细胞染色体外能够自主复制的环状DNA分子。其分子量小,拷贝数高,遗传操作简单,是介导外源基因表达最常用的载体。在发酵生产过程中,为了得到高产菌株,常利用质粒使外源基因在菌株中表达。因此在发酵过程中,质粒丢失是蛋白表达的制约因素,直接影响菌株蛋白表达水平。质粒丢失现象是质粒及其表达蛋白对菌株正常生存造成影响后菌株的自我保护机制,是在菌株应激反应下多次传代的结果。而质粒拷贝数的减少或质粒丢失必然导致减产,因此,能够在逆境条件下稳定复制和传代的质粒在发酵生产中具有很重要的意义。
针对质粒的丢失,通常增加质粒稳定性的方法有:1)选择合适的宿主、合适的载体、分阶段控制培养和控制培养条件虽然可以增加质粒的稳定性,但是需要重新改造宿主或者寻找新的载体;2)通过添加抗生素等筛选标记来增加质粒稳定性,但是这会增加下游产品分离的难度。也不适用于利用发酵工程生产产品的食品和医药等行业。3)改变培养基组分增加质粒稳定性,但是适合质粒稳定性的培养基往往不能保证宿主达到目的产物的最大值。因此,目前增加质粒稳定性的方法都有其局限性。
hok/sok系统已经被确定为毒素和抗毒素系统,其作用机制为hok基因转录毒性蛋白,sok基因转录反义RNA抑制毒性蛋白表达。一旦质粒丢失,hok基因mRNA的半衰期较长将表达毒性蛋白,直接杀死菌株。因此能够有效的提升质粒稳定性,从而提升菌株的表达水平。该方法能够摆脱上述局限性,可以在多种宿主与载体中进行使用。迄今为止,hok/sok基因的研究多集中在探究其机制及其在合成生物学中的应用,但关于运用于提升蛋白水平的质粒稳定性系统鲜有报道,且hok/sok基因的插入位点的选择也会影响质粒的稳定性,且利用hok/sok基因提升质粒的稳定性仍是需要本领域技术人员进行探索的。
发明内容
为了解决上述问题,本发明的目的是提供一种含hok/sok基因的菌株及其制备与应用。hok/sok基因的应用范围更加广泛,不受限于发酵宿主与发酵条件。与现有技术相比,本发明的质粒稳定系统应用于大肠杆菌高密度发酵过程中显著提高了生产效率,具有很好的应用(大肠杆菌重组蛋白表达领域以及生物基化学品的发酵生产)前景。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
本发明的第一个目的是提供一种含hok/sok基因的菌株的制备方法,包括以下步骤:
(S1)将hok/sok基因插入含表达外源蛋白基因的重组表达质粒,得到含表达外源蛋白基因-hok/sok基因的重组表达质粒;
所述含表达外源蛋白基因的重组表达质粒中含抗性基因;
(S2)将步骤(S1)制备得到的含表达外源蛋白基因-hok/sok基因的重组表达质粒导入大肠杆菌中,培养筛选得到含hok/sok基因的菌株;
其中,所述hok/sok基因的插入位点位于抗性基因下游。
在本发明的一个实施方式中,步骤(S1)中,所述含表达外源蛋白基因的重组表达质粒为将表达外源蛋白的基因插入质粒载体得到的质粒。
在本发明的一个实施方式中,所述外源蛋白选自生物催化用酶以及抗体等蛋白药物中的一种;
优选地,所述外源蛋白选自绿色荧光蛋白、转氨酶、甘油激酶、酮还原酶、醇脱氢酶或重组人干扰素α2b中的一种。
在本发明的一个实施方式中,所述质粒载体选自pET-28a、pET-22b、pQE-30或pRSFDuet-1中的一种。
在本发明的一个实施方式中,所述质粒载体选自pET系列载体、pQE系列载体和pRSF系列载体中的一种;
优选地,所述质粒载体选自pET-28a、pET-22b、pQE-30或pRSFDuet-1中的一种;
更优选地,所述质粒载体为pET-28a。
在本发明的一个实施方式中,所述hok/sok基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一个实施方式中,利用上游引物2和下游引物2扩增hok/sok基因;
利用上游引物3和下游引物3扩增含表达外源蛋白基因-hok/sok基因的重组表达质粒;
其中,上游引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;下游引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;上游引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,下游引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在本发明的一个实施方式中,步骤(S2)中,所述大肠杆菌选自E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α、E.coli W3110、E.coli MG1655、E.coli Top 10或E.coli JM109中的一种;
优选地,所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。
本发明的第二个目的是提供一种通过上述方法制备得到的含hok/sok基因的菌株。
本发明的第三个目的是提供一种含hok/sok基因的菌株在发酵中的应用,包括以下步骤:
(A1)将含hok/sok基因的菌株活化后进行种子培养,得到种子液;
(A2)将步骤(A1)得到的种子液进行发酵处理以表达外源蛋白。
在本发明的一个实施方式中,步骤(A1)中,种子培养过程中,时间为8h~12h;
步骤(A2)中,发酵过程中,保持溶氧处于15%~25%。
hok/sok基因作为一种逃逸后致死系统,将其插入重组蛋白表达载体,当质粒丢失时,其编码的毒性蛋白将会杀死无质粒细胞,从而提高质粒稳定性。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明发现hok/sok的插入位点不同,对基因表达以及质粒稳定性不同,只有将抗性基因设置于重组表达质粒中抗性基因下游时,才能够最大程度提升基因的表达和质粒的稳定性;为hok/sok基因提升治理稳定性的研究拓宽了新思路;
(2)本发明中,将hok/sok的插入位点设置于抗性基因下游时,制备得到的含hok/sok基因的菌株发酵结束后,在有抗生素添加情况下质粒保有率为100%;在不添加抗生素情况下,质粒保有率为65%,重组蛋白表达量提高40%。
附图说明
图1为pET-28a/GFP-hok/sok重组质粒的质粒图谱(一);
图2为pET-28a/GFP-hok/sok重组质粒的质粒图谱(二);
图3为pET-28a/GFP-hok/sok重组质粒的质粒图谱(三);
图4为三株不同插入位点的含有hok/sok基因的菌株的生物量和蛋白质表达水平对比图谱;
图5为荧光强度分析pET-28a/GFP-hok/sok重组质粒发酵的蛋白差异图;
图6为SDS-PAGE分析pET-28a/GFP-hok/sok重组质粒发酵蛋白差异图;
图7为pET-28a/GFP-hok/sok重组质粒发酵罐发酵的质粒稳定性实验图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
下述实施例中,若无特殊说明,所用试剂均为市售试剂,所用检测手段及方法均为本领域常规检测手段及方法。
下述实施例中,所使用的大肠杆菌DH5α、pET-28a等材料都是商业化产品,可直接购买。
实施例1
本实施例提供pET-28a/GFP重组质粒的构建。
(S1)以全长的绿色荧光蛋白GFP基因(上海桑尼生物科技有限公司合成)为模板,通过常规PCR扩增复制绿色荧光蛋白GFP的核苷酸编码序列,其中GFP核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
其中,所用上游引物1带有BamHⅠ酶切位点和保护碱基,序列为:SEQ ID NO.2;
SEQ ID NO.2:CGCGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTT。
下游引物1带有EcoRI酶切位点和保护碱基,序列为:SEQ ID NO.3;
SEQ ID NO.3:CCGGAATTCTTATTTGTATAGTTCATCCATGCC。
反应条件为:94℃预变性5min,94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸1min,循环30次,最后72℃延伸10min。将扩增得到的GFP基因序列经1%琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒(Omiga)回收目的片段。
(S2)将表达载体pET-28a用Thermo Scientific公司的BamHⅠ和EcoRI酶切,酶切反应体系为:10×buffer 1μL,EcoRI 1μL,BamHⅠ1μL,pET-28a载体7μL。酶切体系于37℃条件下反应1小时。将酶切位点和对应保护碱基序列分别添加到GFP基因特异性上下游引物序列的5'端。连接反应体系为:使用Thermo Scientific公司的T4 DNA Ligase 2μL,T4 DNALigase buffer 4μL,GFP基因片段10μL,酶切载体2μL进行连接。连接于37℃下反应30min得到连接产物。将重组产物转化至大肠杆菌DH5α中。PCR筛选阳性菌株pET-28a/GFP并进行DNA测序,验证重组质粒构建正确。将阳性菌株接种至含有终浓度50mg/L卡那霉素的5mL LB液体培养基,LB液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L,于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12h后按照质粒提试剂盒(Omiga)操作说明提取重组质粒pET-28a/GFP。
其中,SEQ ID NO.1:ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTC CCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCAGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGCTCAGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAATAA
实施例2pET-28a/GFP-hok/sok重组质粒的构建
以全长的hok/sok基因(上海桑尼生物科技有限公司合成)为模板,以序列如SEQID NO.5所示的上游引物2和序列如SEQ ID NO.6所示的下游引物2为反应引物,常规PCR反应扩增hok/sok基因的核苷酸编码序列,其核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示。
其中,所用上游引物2带有同源臂,序列为:SEQ ID NO.5;
SEQ ID No.5:GTGGATGGTGCCGAACAAAC。
下游引物2带有同源臂,序列为:SEQ ID No.6;
SEQ ID No.6:CCTGGCAGTCTGGTTGTTCA。
以全长的pET-28a/GFP基因为模板。1)以序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物3和序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物3为反应引物,常规PCR反应获得线性载体片段A;2)以序列如SEQ ID NO.9所示的上游引物4和序列如SEQ ID NO.10所示的下游引物4为反应引物,常规PCR反应获得线性载体片段B;3)以序列如SEQ ID NO.11所示的上游引物5和序列如SEQ ID NO.12所示的下游引物5为反应引物,常规PCR反应获得线性载体片段C;
其中,所用上游引物带有同源臂,序列具体如下:
SEQ ID NO.7
TGAACAACCAGACTGCCAGGAACACCCCTTGTATTACTGTTTATG
SEQ ID NO.9
TGAACAACCAGACTGCCAGGAACACCCCTTGTATTACTGTTTATG
SEQ ID NO.11
TGAACAACCAGACTGCCAGGTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAA
下游引物带有同源臂,序列具体如下:
SEQ ID No.8
GTTTGTTCGGCACCATCCACATGAGCCATATTCAACGGGAAACGT
SEQ ID No.10
GTTTGTTCGGCACCATCCACATGAGCCATATTCAACGGGAAACGT
SEQ ID NO.12
GTTTGTTCGGCACCATCCACGAATTAATTCATGAGCGGATACATA。
反应条件为:94℃预变性5min,94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸1min,循环30次,最后72℃延伸10min。将扩增得到的hok/sok基因序列和pET-28a/GFP线性载体片段(线性载体片段A、线性载体片段B和线性载体片段C)经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。同源重组反应体系为:ABclonal公司的2X Seamless Assembly Mix 10μL,H2O 6μL,GFP基因片段2μL,线性载体片段(线性载体片段A、线性载体片段B和线性载体片段C)2μL进行同源重组。连接于50℃下反应30min得到重组产物:pET-28a/GFP-hok/sok(分别为BES01:线性载体片段A+hok/sok基因、BES011:线性载体片段B+hok/sok基因和BES012:线性载体片段C+hok/sok基因)。将重组产物分别转化至大肠杆菌Trans1-T1中。PCR分别筛选阳性菌株pET-28a/GFP-hok/sok并进行DNA测序,验证重组质粒构建正确。将阳性菌株接种至含有终浓度50mg/L卡那霉素的5mL LB液体培养基,LB液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L,于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12h后按照质粒提试剂盒(Omiga)操作说明提取重组质粒pET-28a/GFP-hok/sok(分别命名为质粒BES01、质粒BES011和质粒BES012),如图1~3所示。
其中,SEQ ID NO.4:GTGGATGGTGCCGAACAAACTCCGGGAGGCAGCGT GATGCGGCAACAATCACACAGATTACCCGTAAACAGCCTGAATGAGCGGGTTATTTTCAGGAAAAGTGAGTGTGGTCAGCGTGCAGGGATATGGGCTATGATGTGCCCGGCGCTTGAGGCTTTCTGCCTCATGACGTGAAGGTGGTTTGTTGCCGTGTTGTGTGGCAGAAGGACAAAAGCCCCGTAGTTAATTTTTCATTAACCCACGAGGCCCCTGCATGCTTAGACAACATCAGGATAGCCTCTTACTGCGCTTTGCGCAAGGAGAAGAAGGCCATGAAACTACCACGCAGCTCTCTTGTCTGGTGTGTGTTGATCGTGTGTCTCACACTGTTGATATTCACTTATCTGACACGAAAATCGCTGTGCGAGATTCGTTACAGAGACGGATACAGGGAGGTGGCGGCTTTCATGGCTTACGAATCCGGTAAGTAGCAACCTGGAGGCGGGCGCAGGCCCGCCTTTTCAGGGCTGATGCTGGTCTGACTGCACTGAAGCGCCTTTATAAAGGGGCTGCTGGTTCGCCGGTGGCCCCTTTCTCCTTGCTGGCATTGTACGGGCATGAACAACCAGACTGCCAGG
实施例3构建BL21(DE3)-pET-28a/GFP-hok/sok和BL21(DE3)-pET-28a/GFP菌株
将实施例1构建的重组质粒pET-28a/GFP和实施例2构建的三种不同hok/sok插入位点重组质粒pET-28a/GFP-hok/sok(BES01、BES011和BES012)分别转至大肠杆菌BL21(DE3)中。转化体系为:重组质粒2μL,BL21(DE3)感受态100μL。混合均匀后置于冰上冰浴30min,再在42℃水浴锅中热激90s,再次置于冰上2min,加入1mL LB,于37℃、200rpm条件下振荡培养45min~1h后,4000rpm浓缩至200μL,再涂布于含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB固体培养基中,放在37℃培养箱内过夜培养,挑选阳性克隆进行菌落PCR验证,最终得到生产菌株:BL21(DE3)-pET-28a/GFP-hok/sok(分别命名为BES01菌株、BES011菌株和BES012菌株)和BL21(DE3)-pET-28a/GFP。
实施例4不同三株位点hok/sok菌株的生物量和蛋白质表达水平对比
由于hok/sok基因在质粒中的位置可能会影响基因的表达和质粒的稳定性,因此选择了三个不同的位置插入hok/sok基因,分别命名为BES01、BES011和BES012。与BES01相比,当hok/sok插入位置靠近抗生素基因的上游或下游时,BES011和BES012的蛋白质表达水平分别下降了13.80%和18.20%,生物量分别下降了9.56%和5.12%(结果如图4),推测卡那霉素抗性基因的转录影响了质粒稳定系统的转录,从而降低了外源蛋白的表达水平。因此hok/sok基因位置远离卡那霉素抗性基因的为BES01菌株为质粒稳定性性系统表达最优组。
实施例5重组菌株BL21(DE3)-pET-28a/GFP-hok/sok高密度发酵验证
将实施例4挑选得到的BES01菌株以及BL21(DE3)-pET-28a/GFP菌株分别在含2%的琼脂抗性平板上活化,挑取单菌落在5mL LB培养基中培养10~16h,将其转移到50mL LB培养基中培养10h;
将培养好的菌株以再以2%的接种量(v/v)转接发酵罐培养基进行上罐发酵,再以10%的接种量(v/v)转接发酵罐培养基(发酵罐培养基配方:葡萄糖30g/L,硫酸铵14g/L,酵母粉20g/L,七水合硫酸镁2g/L,磷酸二氢钾4g/L,七水合硫酸亚铁0.3g/L,pH 7)。发酵罐参数设定为:转速300~800rpm,与溶氧偶联,溶氧控制40%,温度设定为37℃保持菌株的快速生长,在发酵过程中补加氨水控制pH维持7,发酵第6h后以45mL/h的速度流加600g/L的葡萄糖溶液。在培养8~12h后进行IPTG的诱导,进行重组蛋白的表达,同时进行荧光强度的检测(结果如图5,control group为BL21(DE3)-pET-28a/GFP菌株组,experience group为BES01菌株组),结果显示,GFP荧光表达水平随着诱导时间的增加也逐渐提高,最终比对照组提高40%。在诱导后8~16h进行菌株的收集破碎,进行SDS蛋白电泳验证其蛋白表达情况(结果如图6所示,对照菌株为BL21(DE3)-pET-28a/GFP菌株,实验菌株为BES01菌株),结果显示随着hok/sok基因的引入,绿色荧光蛋白仍保持上清表达,且表达量相较对照组有显著提升。综合荧光强度分析蛋白差异图和SDS-PAGE蛋白差异图结果,都表明hok/sok基因的引入能显著提高GFP荧光蛋白的表达量。
实施例6质粒稳定性测试
将取样发酵菌株按照每OD稀释105比例进行稀释,将其涂布到没有抗性的LB固定培养基上,将其放置在37℃培养箱中培养。待菌落肉眼可见时,在超净台中将菌落分别挑取在没有抗性和含卡那抗性(卡那霉素使用浓度为50μg/mL)的LB固体培养基上,并将其放置在37℃培养基中,待菌落肉眼可见时进行质粒稳定性比例鉴定(结果如图7)。在有抗生素添加情况下质粒保有率为100%(图7右图);在不添加抗生素情况下,质粒保有率为65%(图7左图)。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于上述实施例,本领域技术人员根据本发明的解释,不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种含hok/sok基因的菌株的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(S1)将hok/sok基因插入含表达外源蛋白基因的重组表达质粒,得到含表达外源蛋白基因-hok/sok基因的重组表达质粒;
所述含表达外源蛋白基因的重组表达质粒中含抗性基因;
(S2)将步骤(S1)制备得到的含表达外源蛋白基因-hok/sok基因的重组表达质粒导入大肠杆菌中,培养筛选得到含hok/sok基因的菌株;
其中,所述hok/sok基因的插入位点位于抗性基因下游。
2.根据权利要求1所述的一种含hok/sok基因的菌株的制备方法,其特征在于,步骤(S1)中,所述含表达外源蛋白基因的重组表达质粒为将表达外源蛋白的基因插入质粒载体得到的质粒。
3.根据权利要求2所述的一种含hok/sok基因的菌株的制备方法,其特征在于,所述外源蛋白选自绿色荧光蛋白、转氨酶、甘油激酶、酮还原酶、醇脱氢酶或重组人干扰素α2b中的一种。
4.根据权利要求2所述的一种含hok/sok基因的菌株的制备方法,其特征在于,所述质粒载体选自pET-28a、pET-22b、pQE-30或pRSFDuet-1中的一种。
5.根据权利要求4所述的一种含hok/sok基因的菌株的制备方法,其特征在于,所述hok/sok基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求5所述的一种含hok/sok基因的菌株的制备方法,其特征在于,利用上游引物2和下游引物2扩增hok/sok基因;
利用上游引物3和下游引物3扩增含表达外源蛋白基因-hok/sok基因的重组表达质粒;
其中,上游引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;下游引物2的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示;上游引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,下游引物3的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。
7.根据权利要求1所述的一种含hok/sok基因的菌株的制备方法,其特征在于,步骤(S2)中,所述大肠杆菌选自E.coliBL21(DE3)、E.coliDH5α、E.coliW3110、E.coli MG1655、E.coli Top 10或E.coli JM109中的一种。
8.一种通过权利要求1~7任一所述方法制备得到的含hok/sok基因的菌株。
9.一种如权利要求8所述的含hok/sok基因的菌株在发酵中的应用,其特征在于,包括以下步骤:
(A1)将含hok/sok基因的菌株活化后进行种子培养,得到种子液;
(A2)将步骤(A1)得到的种子液进行发酵处理以表达外源蛋白。
10.根据权利要求9所述的一种含hok/sok基因的菌株在发酵中的应用,其特征在于,步骤(A1)中,种子培养过程中,时间为8h~12h;
步骤(A2)中,发酵过程中,保持溶氧处于15%~25%。
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