CN117802180A - 一种生产黄嘌呤的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
一种生产黄嘌呤的基因工程菌及其构建方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117802180A CN117802180A CN202311854984.5A CN202311854984A CN117802180A CN 117802180 A CN117802180 A CN 117802180A CN 202311854984 A CN202311854984 A CN 202311854984A CN 117802180 A CN117802180 A CN 117802180A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- seq
- xanthine
- fermentation
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 88
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 45
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 title claims abstract description 42
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000010276 construction Methods 0.000 title abstract description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 46
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 46
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 40
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 101150002764 purA gene Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 101100342666 Aspergillus oryzae ladA gene Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 101100126053 Dictyostelium discoideum impdh gene Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 101150035744 guaB gene Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 101150100888 xdhA gene Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 101150047804 xdhB gene Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 101150110158 xdhC gene Proteins 0.000 claims abstract description 17
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 101150114741 guaA gene Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 101150093309 guaAA gene Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 101150085008 guaAB gene Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 108010093894 Xanthine oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 108010091383 Xanthine dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 108090000926 GMP synthase (glutamine-hydrolyzing) Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108010087227 IMP Dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims abstract description 8
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 19
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 17
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 13
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 13
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 claims description 10
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 claims description 9
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 claims description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 8
- 101150107208 ygaY gene Proteins 0.000 claims description 8
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 claims description 7
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 7
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 7
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 7
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 7
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 6
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 6
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 6
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 claims description 6
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 5
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 101100160181 Escherichia coli (strain K12) yjiV gene Proteins 0.000 claims description 4
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000004907 flux Effects 0.000 claims description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims description 3
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 claims description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 2
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 claims 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 claims 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 2
- GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N IMP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N 0.000 abstract 1
- -1 guanine-inosine phosphate Chemical compound 0.000 abstract 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 abstract 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 abstract 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 48
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 46
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 23
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 23
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 21
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 11
- 101150106935 purR gene Proteins 0.000 description 9
- 101150092531 purL gene Proteins 0.000 description 7
- 101150044736 purQ gene Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N nebularine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC=C2N=C1 MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N 0.000 description 4
- 239000002212 purine nucleoside Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 108010056443 Adenylosuccinate synthase Proteins 0.000 description 2
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010027570 Xanthine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N caffeine Chemical compound CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N=CN2C RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 2
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- YAPQBXQYLJRXSA-UHFFFAOYSA-N theobromine Chemical compound CN1C(=O)NC(=O)C2=C1N=CN2C YAPQBXQYLJRXSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N theophylline Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101100410642 Dictyostelium discoideum purC/E gene Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-L IMP(2-) Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP([O-])([O-])=O)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-L 0.000 description 1
- LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N Isocaffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N(C)C=N2 LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033220 Xanthine oxidase Human genes 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229940124630 bronchodilator Drugs 0.000 description 1
- 239000000168 bronchodilator agent Substances 0.000 description 1
- VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N caffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1C=CN2C VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001948 caffeine Drugs 0.000 description 1
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000019219 chocolate Nutrition 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 101150106093 gpt gene Proteins 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 101150028995 purC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150105087 purC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150084005 purD gene Proteins 0.000 description 1
- 101150076045 purF gene Proteins 0.000 description 1
- 101150103875 purH gene Proteins 0.000 description 1
- 101150035806 purK gene Proteins 0.000 description 1
- 101150056177 purM gene Proteins 0.000 description 1
- 101150112726 purN gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004144 purine metabolism Effects 0.000 description 1
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960004559 theobromine Drugs 0.000 description 1
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种生产黄嘌呤的基因工程菌及其构建方法与应用，以野生型E.coli.W3110为底盘微生物，异源表达枯草芽孢杆菌嘌呤操纵子基因pur(EKBCSQLFMNHD)、过表达IMP脱氢酶基因guaB。敲除转录阻遏蛋白基因purR；敲除GMP合成酶基因guaA、腺苷琥珀酸合成酶基因purA、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因hpt，鸟嘌呤‑次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因gpt；敲除黄嘌呤脱氢酶基因xdhA、xdhB、xdhC。采用分批补料发酵法，在5L发酵罐中48h可达到15±0.5g/L的产量，首次实现了大肠杆菌中黄嘌呤的高效稳定生产。
Description
技术领域
本发明涉及重组基因工程菌技术及发酵工程技术生产领域，尤其是一种生产黄嘌呤的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
黄嘌呤是由一个嘧啶环和一个咪唑环稠合而成的一种化合物，其作为一种嘌呤碱广泛分布于人体及其他生物体的器官及体液内，分子式为C5H4N4O2，分子量为152.111，为黄色片状结晶，难溶于水、醇，易溶于氨水及氢氧化钠溶液中。
黄嘌呤是嘌呤降解途径的产物，并会在黄嘌呤氧化酶的作用下转换为尿酸；通常被用作温和的兴奋剂和支气管扩张剂，特别用于治疗哮喘症状。黄嘌呤的衍生物包括茶碱、咖啡因、可可碱(主要在巧克力中发现)和马黛因。
目前合成黄嘌呤的方法主要是天然产物中提取、化学合成法及生物合成法，天然产物中提取和化学合成法原料易得，但成本高、产率较低、环境污染严重等，无法满足当前对该产品的需求和要求。
生物合成法中的微生物发酵法成本低、工艺简单且安全环保。目前细胞内嘌呤的生物合成路线早已探明，但由于其合成路线较长，并受到细胞内多方面严格调控，因此构建一株产酸效率高、遗传稳定性好的黄嘌呤生产菌种是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于生产黄嘌呤的基因工程菌，以实现利用生物法大量合成黄嘌呤。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述基因工程菌的构建方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述基因工程菌的应用方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种生产黄嘌呤的基因工程菌，所述基因工程菌为重组菌，在其基因组上引入嘌呤操纵子基因pur(EKBCSQLFMNHD)和IMP脱氢酶基因guaB；和/或，在其基因组上敲除如下基因中的至少一个：嘌呤核苷酸阻遏蛋白基因purR、GMP合成酶基因guaA、腺苷琥珀酸合成酶基因purA、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因hpt、鸟嘌呤-次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因gpt、黄嘌呤脱氢酶基因xdhA、xdhB、xdhC；
任选地，所述基因工程菌具有如下特征(1)-(4)的至少一个，或全部：
(1)增强嘌呤代谢途径的碳代谢流；
(2)强化黄嘌呤的生物合成途径；
(3)阻断黄嘌呤的回补途径；
(4)阻断黄嘌呤分解途径；
任选地，所述基因工程菌是以大肠杆菌为出发菌株，在其基因组上分别引入嘌呤操纵子基因pur(EKBCSQLFMNHD)和IMP脱氢酶基因guaB；且在其基因组上分别敲除嘌呤核苷酸阻遏蛋白基因purR、GMP合成酶基因guaA、腺苷琥珀酸合成酶基因purA、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因hpt、鸟嘌呤-次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因gpt和黄嘌呤脱氢酶基因xdhA、xdhB、xdhC。
其中，所述嘌呤操纵子基因pur(EKBCSQLFMNHD)源自异源枯草芽孢杆菌B.subtilis 168；所述大肠杆菌出发菌株为E.coli W3110。
所述E.coli W3110的生物保藏号为ATCC 273250。
具体地，本发明所述的用于生产黄嘌呤的基因工程菌(本发明中称为E.coli-XZ10)，是由下述基因改造策略获得的：
1)首先通过在E.coli W3110的基因组yjiV位点引入异源枯草芽孢杆菌B.subtilis 168的嘌呤操纵子基因pur(EKBCSQLFMNHD)，由Ptrc启动子启动，得到菌株XZ-1；然后在基因组ygaY位点引入IMP脱氢酶基因guaB，由Ptrc启动子启动，得到菌株XZ-2；
2)接着敲除嘌呤核苷酸阻遏蛋白基因(purR)，得到菌株XZ-3，之后通过敲除GMP合成酶基因guaA、腺苷琥珀酸合成酶基因purA，得到菌株XZ-4、XZ-5；再敲除次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因hpt和鸟嘌呤-次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因gpt阻断回补途径，分别得到菌株XZ-6、XZ-7；最后敲除黄嘌呤脱氢酶基因xdhA、xdhB、xdhC，阻断分解途径，分别得到菌株XZ-8、XZ-9、XZ-10；菌株XZ-10即为改造成功后的目的菌。
优选的，上述用于生产黄嘌呤的基因工程菌，所述嘌呤操纵子基因pur(EKBCSQLFMNHD)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(NCBI-GeneID分别为：purE：939481；purK：936039；purB：936048；purC：939389；purS：936041；purQ：938760；purL：939233；purF：936046；purM：936044；purN：936045；purH：936053；purD：938741)。所述次黄苷酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(guaB：NCBI-GeneID：946985)。
优选的，上述用于生产黄嘌呤的基因工程菌，所述嘌呤核苷酸阻遏蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示(purR；NCBI-GeneID：945226)；所述GMP合成酶基因guaA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示(guaA；NCBI-GeneID:：947334)；所述腺苷酸琥珀酸合酶基因purA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示(purA；NCBI-GeneID：937805)；
优选的，上述用于生产黄嘌呤的基因工程菌，所述次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示(hpt；NCBI-Gene ID:946624)。所述黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因gpt的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示(gpt；NCBI-Gene ID:944817)。
所述黄嘌呤脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10所示(xdhA；NCBI-GeneID：947116；xdhB；NCBI-GeneID：947205；xdhC；NCBI-GeneID：945148；)。
本发明提供上述用于生产黄嘌呤的基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：
(1)通过在E.coli W3110的基因组yjiV位点引入异源枯草芽孢杆菌B.subtilis168的嘌呤操纵子基因pur(EKBCSQLFMNHD)(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，由Ptrc启动子启动，增强嘌呤代谢途径的碳代谢流；
(2)通过在基因组ygaY位点引入IMP脱氢酶基因guaB(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，由Ptrc启动子启动；
(3)敲除嘌呤核苷酸阻遏蛋白基因(purR)(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，由Ptrc启动子启动；
(4)通过敲除GMP合成酶基因guaA,腺苷酸琥珀酸合酶基因purA，(核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示)，进一步强化黄嘌呤的生物合成途径；
(5)通过敲除次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因hpt、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因gpt(核苷酸序列如SEQ ID NO.6、7所示)，阻断黄嘌呤的回补途径；
(6)黄嘌呤脱氢酶基因xdhA、xdhB、xdhC(核苷酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10所示)，阻断黄嘌呤分解途径。
优选地，上述构建方法包括如下具体步骤S1-S8：
S1)嘌呤核苷操纵子基因pur(EKBCSQLFMNHD)的整合
通过分段整合的方法将嘌呤核苷操纵子基因pur(EKBCSQLFMNHD)依次整合在基因组yjiv位点，分别为purEKB、purCSQ、purL、purFMN、purHD，获得菌株XZ-01。
S2)基因guaB的整合
构建出pGRB-ygaY质粒。然后在合适引物条件下，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-ygaY-up，下游同源臂Q-ygaY-DN，目的基因guaB；然后再获得融合片段ygaY::guaB。最后将pGRB-ygaY质粒与重叠片段ygaY::guaB电转至XZ-01的电转感受态细胞中；再筛选阳性转化子，获得菌株XZ-02。
S3)基因purR的敲除
构建出pGRB-purR质粒。然后在适当引物条件下，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-purR-up，下游同源臂Q-purR-DN；然后再获得融合片段ΔpurR。最后将pGRB-purR质粒与重叠片段ΔpurR电转至XZ-02的电转感受态细胞中；再筛选阳性转化子，获得菌株XZ-03。
S4)基因guaA的敲除
构建pGRB-guaA质粒。然后在适当引物条件下，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-guaA-up，下游同源臂Q-guaA-DN；然后再获得融合片段ΔguaA。最后将pGRB-guaA质粒与重叠片段ΔguaA电转至XZ-03的电转感受态细胞中；再筛选阳性转化子，获得菌株XZ-04。
S5)基因purA的敲除
构建pGRB-purA质粒。然后在适当引物存在下，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-purA-up，下游同源臂Q-purA-DN；然后再获得融合片段ΔpurA。最后将pGRB-purA质粒与重叠片段ΔpurA电转至XZ-04的电转感受态细胞中；再筛选阳性转化子，获得菌株XZ-05。
S6)基因hpt的敲除
构建pGRB-hpt质粒。然后在引物存在下，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-hpt-up，下游同源臂Q-hpt-DN；然后再获得融合片段Δhpt。最后将pGRB-hpt质粒与重叠片段Δhpt电转至XZ-05的电转感受态细胞中；再筛选阳性转化子，获得菌株XZ-06。
S7)基因gpt的敲除
构建pGRB-gpt质粒。然后在引物存在下，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-gpt-up，下游同源臂Q-gpt-DN；然后再获得融合片段Δgpt。最后将pGRB-gpt质粒与重叠片段Δgpt电转至XZ-06的电转感受态细胞中；再鉴定筛选阳性转化子，获得菌株XZ-07。
S8)黄嘌呤脱氢酶基因(xdhA、xdhB、xdhC)的敲除
1)基因xdhA的敲除
构建pGRB-xdhA质粒。然后在引物存在下，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-xdhA-up，下游同源臂Q-xdhA-DN；然后再获得融合片段ΔxdhA。最后将pGRB-xdhA质粒与重叠片段ΔxdhA电转至XZ-07的电转感受态细胞中；再筛选阳性转化子，获得菌株XZ-08。
2)基因xdhB的敲除
构建出pGRB-xdhB质粒。然后在引物存在下，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-xdhB-up，下游同源臂Q-xdhB-DN；然后再获得融合片段ΔxdhB。最后将pGRB-xdhB质粒与重叠片段ΔxdhB电转至XZ-08的电转感受态细胞中；再筛选阳性转化子，获得菌株XZ-09。
3)基因xdhC的敲除
构建出pGRB-xdhC质粒。然后在引物存在下，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-xdhC-up，下游同源臂Q-xdhC-DN；然后再获得融合片段ΔxdhC。最后将pGRB-xdhC质粒与重叠片段ΔxdhC电转至XZ-09的电转感受态细胞中；再筛选阳性转化子，获得菌株XZ-10。
本发明还提供上述基因工程菌在发酵生产黄嘌呤方面的应用。
任选的，上述基因工程菌的应用，包括摇瓶发酵方案和发酵罐培养方案。具体地，包括活化重组菌，然后将活化后的重组菌接种到培养基中进行发酵培养。
优选的，上述基因工程菌的应用，所述摇瓶发酵方案为：按15％的接种量接种到装有发酵培养基的500ml三角瓶中(终体积30ml)，九层纱布封口，温度维持在37℃±0.2，220r/min振荡培养，发酵过程中按苯酚红指示剂指示，通过补加25％的氨水来维持pH在7.0-7.2；添加60％葡萄糖溶液补充菌体所需的碳源，发酵周期24h。
优选的，上述基因工程菌的应用，所述发酵罐培养方案为：
(1)菌种活化：将菌种从甘油管接至斜面培养基活化培养11-13h；将菌种从斜面培养基中接至茄形瓶培养基中继续活化扩大培养10-12h，培养温度：37℃；
(2)种子培养：培养过程pH维持在6.7±0.2，温度维持在37±0.2℃，溶氧维持在35％-50％，培养至OD为20±3时转接发酵罐中进行发酵培养。
(3)发酵培养：按20％的接种量将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵pH维持在6.7±0.2，温度维持在37±0.2℃，溶氧维持在30％-50％；培养过程中通过流加80％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵过程菌体所需的碳源，期间通过添加25％的氨水来调节pH。
优选的，上述基因工程菌的应用，采用的种子培养基为：葡萄糖30g/L，酵母浸粉4g/L，蛋白胨2g/L，柠檬酸1g/L，(NH4)2SO4 3g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，KH2PO4 1.5g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MnSO4 5mg/L，Vb1、Vb3、Vb5、Vb12.各2mg/L，腺嘌呤50mg/L，鸟嘌呤100mg/L。
采用的发酵培养基为：葡萄糖20g/L，酵母浸粉4g/L，蛋白胨2g/L，柠檬酸2g/L，(NH4)2SO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，KH2PO4 4g/L，FeSO4·7H2O 20mg/L，MnSO4 10mg/L，Vb1、Vb3、Vb5、Vb12.各2mg/L，腺嘌呤50mg/L，鸟嘌呤100mg/L。
本发明有益效果如下：
本发明所述用于生产黄嘌呤的基因工程菌，该菌株通过对E.coli和Bacillussubtilis的嘌呤代谢相关途径进行分析，并在底盘微生物E.coli W3110中异源引入嘌呤操纵子，敲除黄嘌呤代谢回补，分解途径等相关分子改造，至此成功构建出一株不含质粒、从头合成黄嘌呤的基因工程菌E.coli-XZ10，具有遗传背景清晰，可持续改造等优点，具有很好的工业应用前景。
附图说明
图1黄嘌呤工程菌株E.coli-XZ10的构建方法图解。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。
以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
实施例1
基因工程菌的构建方法
采用的基因编辑方法参照文献(Li Y，Lin Z，Huang C，et al.Metabolicengineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9 meditated genomeediting.Metabolic Engineering，2015，31：13-21.)。该方法涉及的工程质粒pGRB是以pUC18为骨架，包括启动子J23100、gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列以及氨节青霉素抗性(工作浓度：100mg/L)。下列实施例中涉及到的专业名词均可在该文章中解释。菌株构建过程中用到的引物见表1。
表1菌株构建过程中所涉及的引物
1.1嘌呤核苷操纵子基因pur(EKBCSQLFMNHD)的整合
由于嘌呤核苷操纵子基因全长13689bp，通过分段整合(具体方法参照CN114774341A)的方法将其依次整合在基因组yjiv位点，这五段分别为purEKB、purCSQ、purL、purFMN、purHD。
1.1.1基因purEKB的整合
以pGRB-yjiv-s(SEQ ID NO.11)、pGRB-yjiv-a(SEQ ID NO.12)为引物，构建出pGRB-yjiv质粒。以Q-yjiv-up-s(SEQ ID NO.13)、Q-yjiv-up-purEKB-a(SEQ ID NO.14)、purEKB-s(SEQ ID NO.15)、purEKB-a(SEQ ID NO.16)、Q-yjiv-DN-purEKB-s(SEQ IDNO.17)、Q-yjiv-DN-s(SEQ ID NO.18)为引物，再分别以B.Subtilis XGL和E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂yjiv-up，下游同源臂yjiv-DN，目的基因purEKB；然后再获得融合片段yjiv::purEKB。最后将pGRB-yjiv质粒与重叠片段yjiv::purEKB电转至出发菌株E.coli W3110的电转感受态细胞中；再以Q-yjiv-up-s、Q-yjiv-DN-s为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株XZ-01-purEKB。
1.1.2基因purCSQ的整合
以pGRB-1-s(SEQ ID NO.19)、pGRB-1-a(SEQ ID NO.20)为引物，构建出pGRB-1质粒。以Q-1-1-up-s(SEQ ID NO.21)、Q-1-1-up-a(SEQ ID NO.22)、purCSQ-s(SEQ IDNO.23)、purCSQ-a(SEQ ID NO.24)、Q-yjiv-DN-purCSQ-s(SEQ ID NO.25)、Q-yjiv-DN-s(SEQ ID NO.18)为引物，再分别以B.Subtilis 168和E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-1-1-up，下游同源臂Q-1-1-DN，目的基因purCSQ；然后再获得融合片段1::purEKB。最后将pGRB-1质粒与重叠片段1::purEKB电转至Hx-01-purEKB的电转感受态细胞中；再以Q-1-1-up-s、Q-yjiv-DN-s为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株XZ-01-purEKBCSQ。
1.1.3基因purL的整合
以pGRB-4-s(SEQ ID NO.26)、pGRB-4-a(SEQ ID NO.27)为引物，构建出pGRB-4质粒。以Q-4-1-up-s(SEQ ID NO.28)、Q-4-1-up-a(SEQ ID NO.28)、purL-s(SEQ ID NO.30)、purL-a(SEQ ID NO.31)、Q-yjiv-DN-purL-s(SEQ ID NO.32)、Q-yjiv-DN-s(SEQ ID NO.18)为引物，分别以B.Subtilis XGL和E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-4-1-up，下游同源臂Q-4-1-DN，目的基因purL；然后再获得融合片段4::purL。最后将pGRB-yjiv质粒与重叠片段4::purL电转至Hx-01-purEKBCSQ的电转感受态细胞中；再以Q-4-1-up-s、Q-yjiv-DN-s为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株XZ-01-purEKBCSQL。
1.1.4基因purFMN的整合
以pGRB-5-s(SEQ ID NO.33)、pGRB-5-a(SEQ ID NO.34)为引物，构建出pGRB-5质粒。以Q-5-1-up-s(SEQ ID NO.35)、Q-5-1-up-a(SEQ ID NO.36)、purFMN-s(SEQ IDNO.37)、purFMN-a(SEQ ID NO.38)、Q-yjiv-DN-purFMN-s(SEQ ID NO.39)、Q-yjiv-DN-s(SEQ ID NO.18)为引物，分别以B.Subtilis XGL和E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-5-1-up，下游同源臂Q-5-1-DN，目的基因purFMN；然后再获得融合片段5::purEKB。最后将pGRB-5质粒与重叠片段5::purFMN电转至Hx-1-purEKBCSQL的电转感受态细胞中；再以Q-5-1-up-s、Q-yjiv-DN-s为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株XZ-1-purEKBCSQLFMN。
1.1.5基因purHD的整合
以pGRB-4-s(SEQ ID NO.26)、pGRB-4-a(SEQ ID NO.27)为引物，构建出pGRB-4质粒。然后以Q-4-2-up-s(SEQ ID NO.40)、Q-4-2-up-a(SEQ ID NO.41)、purHD-s(SEQ IDNO.42)、purHD-a(SEQ ID NO.43)、Q-yjiv-DN-purHD-s(SEQ ID NO.44)、Q-yjiv-DN-s(SEQID NO.18)为引物，分别以B.Subtilis XGL和E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-4-2-up，下游同源臂Q-4-2-DN，目的基因purHD；然后再获得融合片段4::purHD。最后将pGRB-4质粒与重叠片段4::purHD电转至Hx-1-purEKBCSQLFMN的电转感受态细胞中；再以Q-4-2-up-s、Q-yjiv-DN-s为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株XZ-1-purEKBCSQLFMNHD(即为菌株XZ-01)。
1.2.基因guaB的整合
以pGRB-ygaY-s(SEQ ID NO.45)、pGRB-ygaY-a(SEQ ID NO.46)为引物，构建出pGRB-ygaY质粒。然后以Q-ygaY-up-s(SEQ ID NO.47)、Q-ygaY-up-a(SEQ ID NO.48)、guaB-s(SEQ ID NO.49)、guaB-a(SEQ ID NO.50)、Q-ygaY-DN-s(SEQ ID NO.51)、Q-ygaY-DN-a(SEQ ID NO.52)为引物，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-ygaY-up，下游同源臂Q-ygaY-DN，目的基因guaB；然后再获得融合片段ygaY::guaB。最后将pGRB-ygaY质粒与重叠片段ygaY::guaB电转至XZ-01的电转感受态细胞中；再以Q-ygaY-up-s、Q-ygaY-DN-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株XZ-02。
1.3基因purR的敲除
以pGRB-purR-s(SEQ ID NO.53)、pGRB-purR-a(SEQ ID NO.54)为引物，构建出pGRB-purR质粒。然后以Q-purR-up-s(SEQ ID NO.55)、Q-purR-up-a(SEQ ID NO.56)、Q-purR-DN-s(SEQ ID NO.57)、Q-purR-DN-a(SEQ ID NO.58)为引物，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-purR-up，下游同源臂Q-purR-DN；然后再获得融合片段ΔpurR。最后将pGRB-purR质粒与重叠片段ΔpurR电转至XZ-02的电转感受态细胞中；再以Q-purR-up-s、Q-purR-DN-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株XZ-03。
1.4基因guaA的敲除
以pGRB-guaA-s(SEQ ID NO.59)、pGRB-guaA-a(SEQ ID NO.60)为引物，构建出pGRB-guaA质粒。然后以Q-guaA-up-s(SEQ ID NO.61)、Q-guaA-up-a(SEQ ID NO.62)、Q-guaA-DN-s(SEQ ID NO.63)、Q-guaA-DN-a(SEQ ID NO.64)为引物，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-guaA-up，下游同源臂Q-guaA-DN；然后再获得融合片段ΔguaA。最后将pGRB-guaA质粒与重叠片段ΔguaA电转至XZ-03的电转感受态细胞中；再以Q-guaA-up-s、Q-guaA-DN-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株XZ-04。
1.5基因purA的敲除
以pGRB-purA-s(SEQ ID NO.65)、pGRB-purA-a(SEQ ID NO.66)为引物，构建出pGRB-purA质粒。然后以Q-purA-up-s(SEQ ID NO.67)、Q-purA-up-a(SEQ ID NO.68)、Q-purA-DN-s(SEQ ID NO.69)、Q-purA-DN-a(SEQ ID NO.70)为引物，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-purA-up，下游同源臂Q-purA-DN；然后再获得融合片段ΔpurA。最后将pGRB-purA质粒与重叠片段ΔpurA电转至XZ-04的电转感受态细胞中；再以Q-purA-up-s、Q-purA-DN-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株XZ-05。
1.6基因hpt的敲除
以pGRB-hpt-s(SEQ ID NO.71)、pGRB-hpt-a(SEQ ID NO.72)为引物，构建出pGRB-hpt质粒。然后以Q-hpt-up-s(SEQ ID NO.73)、Q-hpt-up-a(SEQ ID NO.74)、Q-hpt-DN-s(SEQ ID NO.75)、Q-hpt-DN-a(SEQ ID NO.76)为引物，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-hpt-up，下游同源臂Q-hpt-DN；然后再获得融合片段Δhpt。最后将pGRB-hpt质粒与重叠片段Δhpt电转至XZ-05的电转感受态细胞中；再以Q-hpt-up-s、Q-hpt-DN-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株XZ-06。
1.7基因gpt的敲除
以pGRB-gpt-s(SEQ ID NO.77)、pGRB-gpt-a(SEQ ID NO.78)为引物，构建出pGRB-gpt质粒。然后以Q-gpt-up-s(SEQ ID NO.79)、Q-gpt-up-a(SEQ ID NO.80)、Q-gpt-DN-s(SEQ ID NO.81)、Q-gpt-DN-a(SEQ ID NO.82)为引物，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-gpt-up，下游同源臂Q-gpt-DN；然后再获得融合片段Δgpt。最后将pGRB-gpt质粒与重叠片段Δgpt电转至XZ-06的电转感受态细胞中；再以Q-gpt-up-s、Q-gpt-DN-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株XZ-07。
1.8黄嘌呤脱氢酶基因(xdhA、xdhB、xdhC)的敲除
1.8.1基因xdhA的敲除
以pGRB-xdhA-s(SEQ ID NO.83)、pGRB-xdhA-a(SEQ ID NO.84)为引物，构建出pGRB-xdhA质粒。然后以Q-xdhA-up-s(SEQ ID NO.85)、Q-xdhA-up-a(SEQ ID NO.86)、Q-xdhA-DN-s(SEQ ID NO.87)、Q-xdhA-DN-a(SEQ ID NO.88)为引物，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-xdhA-up，下游同源臂Q-xdhA-DN；然后再获得融合片段ΔxdhA。最后将pGRB-xdhA质粒与重叠片段ΔxdhA电转至XZ-07的电转感受态细胞中；再以Q-xdhA-up-s、Q-xdhA-DN-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株XZ-08。
1.8.2基因xdhB的敲除
以pGRB-xdhB-s(SEQ ID NO.89)、pGRB-xdhB-a(SEQ ID NO.90)为引物，构建出pGRB-xdhB质粒。然后以Q-xdhB-up-s(SEQ ID NO.91)、Q-xdhB-up-a(SEQ ID NO.92)、Q-xdhB-DN-s(SEQ ID NO.93)、Q-xdhB-DN-a(SEQ ID NO.94)为引物，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-xdhB-up，下游同源臂Q-xdhB-DN；然后再获得融合片段ΔxdhB。最后将pGRB-xdhB质粒与重叠片段ΔxdhB电转至XZ-08的电转感受态细胞中；再以Q-xdhB-up-s、Q-xdhB-DN-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株XZ-09。
1.8.3基因xdhC的敲除
以pGRB-xdhC-s(SEQ ID NO.95)、pGRB-xdhC-a(SEQ ID NO.96)为引物，构建出pGRB-xdhC质粒。然后以Q-xdhC-up-s(SEQ ID NO.97)、Q-xdhC-up-a(SEQ ID NO.98)、Q-xdhC-DN-s(SEQ ID NO.99)、Q-xdhC-DN-a(SEQ ID NO.100)为引物，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-xdhC-up，下游同源臂Q-xdhC-DN；然后再获得融合片段ΔxdhC。最后将pGRB-xdhC质粒与重叠片段ΔxdhC电转至XZ-09的电转感受态细胞中；再以Q-xdhC-up-s、Q-xdhC-DN-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株XZ-10(即E.coli-XZ10)。
实施例2
采用实施例1中所述的基因工程菌E.coli-XZ10进行摇瓶发酵生产黄嘌呤。
1.培养基
1.1种子培养基
葡萄糖30g/L，酵母浸粉4g/L，蛋白胨2g/L，柠檬酸1g/L，(NH4)2SO4 3g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，KH2PO4 1.5g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MnSO4 5mg/L，Vb1、Vb3、Vb5、Vb12.各2mg/L，腺嘌呤50mg/L，鸟嘌呤100mg/L，其余为水。
1.2发酵培养基
葡萄糖20g/L，酵母浸粉4g/L，蛋白胨2g/L，柠檬酸2g/L，(NH4)2SO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，KH2PO4 4g/L，FeSO4·7H2O 20mg/L，MnSO4 10mg/L，Vb1、Vb3、Vb5、Vb12.各2mg/L，腺嘌呤50mg/L，鸟嘌呤100mg/L，其余为水。
1.3斜面及茄形瓶培养基
葡萄糖1g/L、蛋白胨8g/L、酵母粉4g/L、氯化钠2g/L、琼脂25g/L，其余为水。
2.摇瓶培养方案
2.1菌种活化
取-80℃保藏的实施例1所述用于产生黄嘌呤的基因工程菌E.coli-XZ10划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次。
2.2种子培养
用接种环刮取一环斜面种子接种于装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，九层纱布封口，36℃，200r/min培养12h。
2.3发酵培养
按10％-15％接种量接种菌种活化后制备的种子液到装有发酵培养基的三角瓶中，九层纱布封口，温度维持在37±0.2℃，220r/min振荡培养，发酵过程中按苯酚红指示剂指示，通过补加25％的氨水来维持pH在7.0-7.2左右；添加60％葡萄糖溶液补充菌体所需的碳源，发酵周期24h。
摇瓶发酵24h，黄嘌呤产量可达2.7g/L。
实施例3
采用实施例1中所述的基因工程菌E.coli-XZ10进行5L放大发酵生产黄嘌呤。发酵培养基具体见实施例2。
(1)菌种活化：将菌种从甘油管接至斜面培养基活化培养11-13h；将菌种从斜面培养基中接至茄形瓶培养基中继续活化扩大培养10-12h。培养温度：37℃。
(2)种子培养：培养过程pH维持在6.7±0.2，温度维持在37℃±0.2，溶氧维持在35％-50％之间，培养至OD600nm为25时转接发酵罐中进行发酵培养。
(3)发酵培养：按20％的接种量将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵pH维持在6.7±0.2，温度维持在37±0.2℃，溶氧维持在30％-50％之间。培养过程中通过流加80％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵过程菌体所需的碳源，期间通过添加25％的氨水来调节pH。
5L发酵罐发酵48h时，黄嘌呤的产量可达到15±0.5g/L，为现有报道中最高。
可见，实施例1所述基因工程菌E.coli-XZ10具有遗传性能稳定、遗传背景清晰、生产效率高等优点；具有较好的工业化前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种生产黄嘌呤的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌为重组菌，在其基因组上引入嘌呤操纵子基因pur(EKBCSQLFMNHD)和IMP脱氢酶基因guaB；和/或，在其基因组上敲除如下基因中的至少一个：嘌呤核苷酸阻遏蛋白基因purR、GMP合成酶基因guaA、腺苷琥珀酸合成酶基因purA、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因hpt、鸟嘌呤-次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因gpt、黄嘌呤脱氢酶基因xdhA、xdhB、xdhC；
任选地，所述基因工程菌具有如下特征(1)-(4)的至少一个，或全部：
(1)增强嘌呤代谢途径的碳代谢流；
(2)强化黄嘌呤的生物合成途径；
(3)阻断黄嘌呤的回补途径；
(4)阻断黄嘌呤分解途径；
任选地，所述基因工程菌是以大肠杆菌为出发菌株，在其基因组上分别引入嘌呤操纵子基因pur(EKBCSQLFMNHD)和IMP脱氢酶基因guaB；且在其基因组上分别敲除嘌呤核苷酸阻遏蛋白基因purR、GMP合成酶基因guaA、腺苷琥珀酸合成酶基因purA、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因hpt、鸟嘌呤-次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因gpt和黄嘌呤脱氢酶基因xdhA、xdhB、xdhC。
2.根据权利要求1所述的生产黄嘌呤的基因工程菌，其特征在于：所述嘌呤操纵子基因pur(EKBCSQLFMNHD)源自异源枯草芽孢杆菌B.subtilis 168；所述大肠杆菌出发菌株为E.coli W3110。
3.根据权利要求1所述的生产黄嘌呤的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌具体是由下述基因改造策略获得的：
(1)首先，通过在E.coli W3110的基因组yjiV位点引入异源枯草芽孢杆菌B.subtilis168的嘌呤操纵子基因pur(EKBCSQLFMNHD)，由Ptrc启动子启动，得到菌株XZ-1；然后在基因组ygaY位点引入IMP脱氢酶基因guaB，由Ptrc启动子启动，得到菌株XZ-2；
(2)接着敲除嘌呤核苷酸阻遏蛋白基因(purR)，得到菌株XZ-3；
(3)之后通过敲除GMP合成酶基因guaA、腺苷琥珀酸合成酶基因purA，得到菌株XZ-4、XZ-5；再敲除次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因hpt和鸟嘌呤-次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因gpt，分别得到菌株XZ-6、XZ-7；最后敲除黄嘌呤脱氢酶基因xdhA、xdhB、xdhC，分别得到菌株XZ-8、XZ-9、XZ-10；菌株XZ-10即为改造后的目的菌。
4.根据权利要求1-3任一项所述的基因工程菌，其特征在于：所述来源于枯草芽孢杆菌B.subtilis 168嘌呤操纵子基因pur(EKBCSQLFMNHD)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述IMP脱氢酶基因guaB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求1-3任一项所述的基因工程菌，其特征在于：所述嘌呤核苷酸阻遏蛋白基因purR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述GMP合成酶基因guaA的核苷酸序列如SEQID NO.4所示；所述腺苷琥珀酸合成酶基因purA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因hpt的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述鸟嘌呤-次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因gpt的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述黄嘌呤脱氢酶基因xdhA、xdhB、xdhC的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示。
6.一种权利要求1-3任一项所述基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)在E.coli W3110的基因组yjiV位点引入枯草芽孢杆菌B.subtilis 168的嘌呤操纵子基因pur(EKBCSQLFMNHD)，由Ptrc启动子启动；
(2)通过在基因组ygaY位点过表达IMP脱氢酶基因guaB，由Ptrc启动子启动；
(3)敲除嘌呤核苷酸阻遏蛋白基因purR；
(4)敲除GMP合成酶基因guaA和腺苷琥珀酸合成酶基因purA，阻断黄嘌呤的分支途径；
(4)敲除次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因hpt、鸟嘌呤-次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因gpt，阻断黄嘌呤的回补途径；
(5)敲除黄嘌呤脱氢酶基因xdhA、xdhB、xdhC，阻断黄嘌呤的分解途径。
7.权利要求1-3任一项所述基因工程菌在发酵生产黄嘌呤方面的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述应用包括活化基因工程菌，然后将活化后的基因工程菌接种到培养基中进行发酵培养，发酵培养包括摇瓶发酵培养和发酵罐培养；
其中，所述摇瓶发酵培养为：按10％-15％接种量接种菌种活化后制备的种子液到装有发酵培养基的三角瓶中，纱布封口，温度维持在37℃±0.2，220r/min振荡培养，发酵过程中通过补加25％的氨水来维持pH在6.7左右；添加60％葡萄糖溶液补充菌体所需的碳源，发酵周期24h。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述发酵罐培养为：
(1)菌种活化：将菌种从甘油管接至斜面培养基活化培养11-13h；将菌种从斜面培养基中接至茄形瓶培养基中继续活化扩大培养10-12h，培养温度37℃；
(2)种子培养：培养过程pH维持在6.7±0.2，温度维持在37℃±0.2，溶氧维持在35％-50％，培养至OD600nm为20±3时转接发酵罐中进行发酵培养；
(3)发酵培养：按20％的接种量将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵pH维持在6.7±0.2，温度维持在37℃±0.2，溶氧维持在30％-50％；培养过程中通过流加80％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵过程菌体所需的碳源，期间通过添加25％的氨水来调节pH。
10.根据权利要求7-9任一项所述的应用，其特征在于：
(1)种子培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母浸粉4g/L，蛋白胨2g/L，柠檬酸1g/L，(NH4)2SO43g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，KH2PO4 1.5g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MnSO4 5mg/L，Vb1、Vb3、Vb5、Vb12.各2mg/L，腺嘌呤50mg/L，鸟嘌呤100mg/L；
(2)发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，酵母浸粉4g/L，蛋白胨2g/L，柠檬酸2g/L，(NH4)SO43g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，KH2PO4 4g/L，FeSO4·7H2O 20mg/L，MnSO4 10mg/L，Vb1、Vb3、Vb5、Vb12各2mg/L，腺嘌呤50mg/L，鸟嘌呤100mg/L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311854984.5A CN117802180A (zh) | 2023-12-28 | 2023-12-28 | 一种生产黄嘌呤的基因工程菌及其构建方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311854984.5A CN117802180A (zh) | 2023-12-28 | 2023-12-28 | 一种生产黄嘌呤的基因工程菌及其构建方法与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117802180A true CN117802180A (zh) | 2024-04-02 |
Family
ID=90425081
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311854984.5A Pending CN117802180A (zh) | 2023-12-28 | 2023-12-28 | 一种生产黄嘌呤的基因工程菌及其构建方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117802180A (zh) |
-
2023
- 2023-12-28 CN CN202311854984.5A patent/CN117802180A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108753669B (zh) | 一种腺嘌呤生产菌株及其构建方法和应用 | |
| CN114774343B (zh) | 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用 | |
| CN114480240A (zh) | 一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法 | |
| CN110157654B (zh) | 一种纳豆芽孢杆菌重组菌及其构建方法与应用 | |
| CN117363553B (zh) | 一种生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| US20210371843A1 (en) | Genetically Engineered Bacteria, Its Construction Method And Its Application In Producing Nad+ Method | |
| CN116121161B (zh) | 一种生产麦角硫因的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN116694544A (zh) | 用于生产腺嘌呤的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN115960812A (zh) | 一种高产l-岩藻糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用 | |
| CN114317386B (zh) | 一种生产肌苷的基因工程菌株及其构建方法与应用 | |
| WO2024099089A1 (zh) | 一种生产假尿苷的基因工程菌株及其构建方法与应用 | |
| CN117821349A (zh) | 一种用于生产肌苷的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| EP4324927A1 (en) | Enzyme composition for preparing ?-nicotinamide mononucleotide, and application thereof | |
| CN110656073B (zh) | 一种生产黄嘌呤的重组菌及其构建方法和应用 | |
| CN113755411A (zh) | 高产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物及其生产β-烟酰胺单核苷酸的方法 | |
| CN114410561B (zh) | 一种生产胸苷的基因工程菌株及其构建方法与应用 | |
| CN117802180A (zh) | 一种生产黄嘌呤的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN112375725B (zh) | 一种生产维生素b6的代谢工程菌株及其构建方法与应用 | |
| CN110819605B (zh) | 甲硫氨酸合成酶突变体、突变基因及其在制备维生素b12中的应用 | |
| CN117229987A (zh) | 一种生产次黄嘌呤的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN110656074B (zh) | 一种合成次黄嘌呤的重组菌及其构建方法与应用 | |
| CN113736768B (zh) | 假尿苷合成酶突变体、突变基因及其在制备维生素b2中的应用 | |
| CN116875474A (zh) | 一种利用对香豆酸合成白藜芦醇工程菌、构建及应用 | |
| CN115895992A (zh) | 一种利用混菌劳动分工发酵生产氨基葡萄糖的方法 | |
| CN116769813A (zh) | 一种用于生产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌株及其构建方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |