CN116694544A - 用于生产腺嘌呤的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

用于生产腺嘌呤的基因工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于生产腺嘌呤的基因工程菌及其构建方法与应用，所述菌株通过对E.coli和Bacillus subtilis的嘌呤代谢相关途径进行分析，并在底盘微生物E.coli w3110中异源引入腺嘌呤的生物合成途径，敲除腺嘌呤分解及关键分支途径，解除关键反馈抑制，敲除腺嘌呤代谢回补途径等相关分子改造，至此成功构建出一株不含质粒、从头合成腺嘌呤的基因工程菌E.coli‑Sade，具有遗传背景清晰、可持续改造等优点，与现有的腺嘌呤生产工艺相比，该菌株发酵生产腺嘌呤具有操作简单、能以廉价碳源直接合成腺嘌呤等优点，具有很好的工业应用前景。

Description

用于生产腺嘌呤的基因工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及化合物生物技术及发酵工程技术生产领域，尤其是一种用于生产腺嘌呤的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
腺嘌呤是由嘧啶和咪唑组成的杂环芳香族有机化合物，是生物遗传信息载体的基本组成原件之一。可用于粒细胞缺乏症和中性粒细胞减少症的治疗，是维生素、阿德福韦醋等药物合成的中间体。由于腺嘌呤对生物体的代谢活动至关重要，用途较为广泛，近年来在世界范围内应用不断增加。
目前腺嘌呤的生产方法有：天然产物提取法、化学合成法、酶法和发酵法。其中酶法是指以腺苷作为前体物，通过腺苷水解酶的作用将腺苷进行酶解产生腺嘌呤，由于其具有反应条件温和、操作简单、危险系数低等优势，已成为现在国内外腺嘌呤主要的工业化生产方法。但由于其底物腺苷的成本较高，且腺苷水解酶的制备成本较高，导致腺嘌呤的生产成本也大幅增高。
微生物发酵法已经被作为大多数天然小分子产物的大规模生产的主流方式，但由于嘌呤合成途径反馈抑制较为强烈以及腺嘌呤特有的反馈阻遏机理，因此目前能够发酵法生产腺嘌呤的菌株较少。因此在清晰其反馈抑制机理的情况下构建一株遗传背景清晰、产量较为可观的腺嘌呤生产菌株是目前降低腺嘌呤生产成本亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于生产腺嘌呤的基因工程菌及其构建方法与应用。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述基因工程菌的构建方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述基因工程菌的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种用于生产腺嘌呤的基因工程菌，为E.coli-Sade，是由下述基因改造策略获得的：首先通过在E.coli W3110-1的基因组yjiV位点引入异源的嘌呤操纵子pur(EKBCSQLFMNHD)基因，由Ptrc启动子启动，增强嘌呤代谢途径的碳代谢流；其次通过在基因组yghX、ygaY位点引入异源的腺苷酸琥珀酸合酶(purA)和腺苷酸琥珀酸裂解酶(purB)，分别由PT7、Ptrc强启动子启动，加强IMP→AMP的生物合成途径；然后通过在基因组yghE、yjiP位点双拷贝内源的AMP核苷酶(amn)和嘧啶/嘌呤-5’-核苷酸核苷酶(ygdH)，均由Ptrc启动子启动；之后通过敲除腺嘌呤的分解途径腺嘌呤脱氢酶(ade)、嘌呤-核苷磷酸化酶(deoD)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(apt)，阻断腺嘌呤的分解途径；然后通过敲除IMP脱氢酶(guaB)和腺苷脱氨酶(add)，进一步强化腺嘌呤的生物合成途径；最后敲除嘌呤核苷酸阻遏蛋白(purR)，在基因组yjgX和rpH位点分别引入PRPP转酰胺酶的抗反馈变体purFbaz K316Q和PRPP合成酶的抗反馈变体prseco D128A，均由Ptrc启动子启动，解除终产物及关键中间产物的反馈抑制作用。
优选的，上述生产腺嘌呤的基因工程菌，所述E.coli W3110-1是通过整合过噬菌体T7RNA聚合酶的大肠杆菌E.coli W3110(ATCC 27325)获得的。(该菌株可由天津科技大学生物工程学院代谢工程研究室购买获得。)
优选的，上述用于生产腺嘌呤的基因工程菌，所述整合的异源的嘌呤操纵子基因、腺苷酸琥珀酸合酶(purA)和腺苷酸琥珀酸裂解酶(purB)均来自于腺苷工程菌株B.subtilis 168(ATCC 23857)。
优选的，上述用于生产腺嘌呤的基因工程菌，所述嘌呤操纵子pur的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(NCBI-GeneID分别为：purE：939481；purK：936039；purB：936048；purC：939389；purS：936041；purQ：938760；purL：939233；purF：936046；purM：936044；purN：936045；purH：936053；purD：938741)。
优选的，上述用于生产腺嘌呤的基因工程菌，所述腺苷酸琥珀酸合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(purA；NCBI-GeneID：937805)；所述腺苷酸琥珀酸裂解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示(purB；NCBI-GeneID：936048)。
优选的，上述用于生产腺嘌呤的基因工程菌，所述AMP核苷酶的核苷酸序列如SEQID NO.4所示(amn；NCBI-GeneID：946508)；所述嘧啶/嘌呤-5’-核苷酸核苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示(ygdH；NCBI-GeneID：947266)。
优选的，上述用于生产腺嘌呤的基因工程菌，所述腺嘌呤脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示(ade；NCBI-GeneID：948210)；所述嘌呤-核苷磷酸化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示(deoD；NCBI-GeneID：945654)；所述腺嘌呤磷酸核糖转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示(apt；NCBI-GeneID：945113)。
优选的，上述用于生产腺嘌呤的基因工程菌，所述IMP脱氢酶的核苷酸序列如SEQID NO.9所示(guaB：NCBI-GeneID：946985)；所述腺苷脱氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示(add；NCBI-GeneID：945851)。
优选的，上述用于生产腺嘌呤的基因工程菌，所述嘌呤核苷酸阻遏蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示(purR；NCBI-GeneID：945226)；所述PRPP转酰胺酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示(purF；NCBI-GeneID：75094383)；所述抗反馈变体purFbaz K316Q的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述PRPP合成酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示(prs；NCBI-GeneID：945772)；所述抗反馈变体prseco D128A的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
上述用于生产腺嘌呤的基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：
(1)通过在E.coli W3110-1的基因组yjiV位点引入异源的嘌呤操纵子pur(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)基因，由Ptrc启动子启动，增强嘌呤代谢途径的碳代谢流；
(2)通过在基因组yghX、ygaY位点引入异源的腺苷酸琥珀酸合酶(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)和腺苷酸琥珀酸裂解酶(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，分别由PT7、Ptrc强启动子启动，加强IMP→AMP的生物合成途径；
(3)通过在基因组yghE、yjiP位点双拷贝内源的AMP核苷酶(核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示)和嘧啶/嘌呤-5’-核苷酸核苷酶(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)，均由Ptrc启动子启动；
(4)通过敲除腺嘌呤的分解途径腺嘌呤脱氢酶(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)、嘌呤-核苷磷酸化酶(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)，阻断腺嘌呤的分解途径；
(5)通过敲除IMP脱氢酶(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)和腺苷脱氨酶(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)，进一步强化腺嘌呤的生物合成途径；
(6)敲除嘌呤核苷酸阻遏蛋白(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)，在基因组yjgX和rpH位点分别引入解淀粉芽孢杆菌的PRPP转酰胺酶(核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)的抗反馈变体purFbaz K316Q(核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示)和PRPP合成酶(核苷酸序列如SEQID NO.14所示)的抗反馈变体prseco D128A(核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)，均由Ptrc启动子启动，解除终产物及关键中间产物的反馈抑制作用。
上述基因工程菌在发酵生产腺嘌呤方面的应用。
优选的，上述基因工程菌的应用，包括摇瓶发酵方案和发酵罐培养方案。
优选的，上述基因工程菌的应用，所述摇瓶发酵方案为：按10％-15％接种量接种菌种活化后制备的种子液到装有发酵培养基的三角瓶中，九层纱布封口，温度维持在36.8-37.2℃，220r/mi n振荡培养，发酵过程中通过补加25％的氨水来维持pH在7.0-7.2；添加60％葡萄糖溶液补充菌体所需的碳源，发酵周期30h。
优选的，上述基因工程菌的应用，所述发酵罐培养方案为：
(1)菌种活化：将菌种从甘油管接至斜面培养基活化培养11-13h；将菌种从斜面培养基中接至茄形瓶培养基中继续活化扩大培养10-12h，培养温度：37℃；
(2)种子培养：将无菌水于超净台火焰附近倒入上述茄形瓶中，使用接种环将菌落刮至无菌水中并打散制备菌悬液，在发酵罐火圈旁将菌悬液接种入发酵种子培养罐中，进行菌种扩大培养；培养过程pH维持在6.7-7.0，温度维持在37℃，溶氧维持在35％-50％，培养至OD为20时转接发酵罐中进行发酵培养；
(3)发酵培养：按20％的接种量将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵pH维持在6.4-6.7，温度维持在37℃，溶氧维持在30％-50％；培养过程中通过流加80％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵过程菌体所需的碳源，期间通过添加25％的氨水来调节pH。
优选的，上述基因工程菌的应用，采用的种子培养基为：葡萄糖30g/L，酵母浸粉6g/L，蛋白胨4g/L，柠檬酸1g/L，(NH4)2SO4 3g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，KH2PO4 2g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，Vb(1.3.5.12)各0.5mg/L，黄嘌呤100mg/L，鸟嘌呤100mg/L，VH 1mg/L；采用的发酵培养基为：葡萄糖30g/L，酵母浸粉6g/L，蛋白胨2g/L，柠檬酸2g/L，(NH4)2SO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 3g/L，FeSO4·7H2O 20mg/L，Vb(1.3.5.12)各2mg/L，VH 1mg/L，微量元素混合液1mL/L，黄嘌呤100mg/L，鸟嘌呤200mg/L，所述微量元素混合液组分含量为：钼酸铵0.28mg/L，硼酸5mg/L，CoCl2·6H2O 1.4mg/L，MnSO4·H2O 0.5mg/L，CuSO4·7H2O 0.5mg/L，ZnSO4·7H2O 0.6mg/L，上述成分称量固体后溶解于1L水中，在4℃保存。
上述培养基均可采用标准方法制备获得。
有益效果：
上述用于生产腺嘌呤的基因工程菌，该菌株通过对E.coli和Bacillus subtilis的嘌呤代谢相关途径进行分析，并在底盘微生物E.coli w3110中异源引入腺嘌呤的生物合成途径，敲除腺嘌呤分解及关键分支途径，解除关键反馈抑制，敲除腺嘌呤代谢回补途径等相关分子改造，至此成功构建出一株不含质粒、从头合成腺嘌呤的基因工程菌E.coli-Sade，具有遗传背景清晰、可持续改造等优点，与现有的腺嘌呤生产工艺相比，该菌株发酵生产腺嘌呤具有操作简单、能以廉价碳源直接合成腺嘌呤等优点，具有很好的工业应用前景。
附图说明
图1：腺嘌呤工程菌株E.coli-Sade的构建方法图解。
图2：嘌呤核苷操纵子基因pur(EKBCSQLFMNHD)整合构建及验证电泳图。由于嘌呤核苷操纵子基因全长12804bp，通过分段整合的方法将其依次整合在基因组yjiV位点，这五段分别为purEKB、purCSQ、purL、purFMN、purHD。其中各泳道分别为：M：DNA marker；1：上游同源臂；2：插入基因；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：阳性转化子；6：阴性对照。
图3：基因purA整合验证电泳图。其中各泳道分别为：M：DNA marker；1：上游同源臂；2：插入基因；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：阳性转化子；6：阴性对照。
图4：基因purB整合验证电泳图。其中各泳道分别为：M：DNA marker；1：上游同源臂；2：插入基因；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：阳性转化子；6：阴性对照。
图5：基因amn整合验证电泳图。其中各泳道分别为：M：DNA marker；1：上游同源臂；2：插入基因；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：阳性转化子；6：阴性对照。
图6：基因ygdH整合验证电泳图。其中各泳道分别为：M：DNA marker；1：上游同源臂；2：插入基因；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：阳性转化子；6：阴性对照。
图7：基因ade敲除验证电泳图。其中各泳道分别为：M：DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：阳性转化子；5：阴性对照。
图8：基因deoD敲除验证电泳图。其中各泳道分别为：M：DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：阳性转化子；5：阴性对照。
图9：基因apt敲除验证电泳图。其中各泳道分别为：M：DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：阳性转化子；5：阴性对照。
图10：基因guaB敲除验证电泳图。其中各泳道分别为：M：DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：阳性转化子；5：阴性对照。
图11：基因add敲除验证电泳图。其中各泳道分别为：M：DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：阳性转化子；5：阴性对照。
图12：基因purR敲除验证电泳图。其中各泳道分别为：M：DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：阳性转化子；5：阴性对照。
图13：基因purFbazK316Q整合验证电泳图。其中各泳道分别为：M：DNA marker；1：上游同源臂；2：插入基因；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：阳性转化子；6：阴性对照。
图14：基因prseco D128A整合验证电泳图。其中各泳道分别为：M：DNA marker；1：上游同源臂；2：插入基因；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：阳性转化子；6：阴性对照。
图15：菌株E.coli-Sade 5L发酵曲线数据图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。
下述实施例中采用的底盘微生物大肠杆菌E.coli W3110-1为整合过噬菌体T7RNA聚合酶的大肠杆菌，该菌株购自天津科技大学生物工程学院代谢工程研究室。
实施例1
菌株E.coli-Sade的具体构建方法如图1所示，采用的基因编辑方法参照文献(LiY,Lin Z,Huang C,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9 meditated genome editing.Metabolic Engineering,2015,31：13-21.)，具体的基因操作方法参照文献(徐庆阳，李长庚，孙鹏杰.一种生产乳清酸的基因工程菌及其构建方法与应用：CN114774341A)，菌株构建过程中所涉及的引物如下表1。
表1
菌株构建的具体过程如下：
1.1嘌呤核苷操纵子的整合
由于嘌呤核苷操纵子基因全长12804bp，通过分段整合(具体方法参照CN114774341A)的方法将其依次整合在基因组yjiV位点，这五段分别为purEKB、purCSQ、purL、purFMN、purHD。
1.1.1基因purEKB的整合
以pGRB-yjiV-s、pGRB-yjiV-a为引物，构建出pGRB-yjiV质粒。以Q-yjiV-up-s、Q-yjiV-up-purEKB-a、purEKB-s、purEKB-a、Q-yjiV-DN-purEKB-s、Q-yjiV-DN-s为引物，再分别以B.Subtilis XGL和E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂yjiV-up，下游同源臂yjiV-DN，目的基因purEKB；然后再获得融合片段yjiV::purEKB。最后将pGRB-yjiV质粒与重叠片段yjiV::purEKB电转至SA-0的电转感受态细胞中；再以Q-yjiV-up-s、Q-yjiV-DN-s为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株SA-1-purEKB。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图2，各片段大小均与理论值大小一致。
1.1.2基因purCSQ的整合
以pGRB-1-s、pGRB-1-a为引物，构建出pGRB-1质粒。以Q-1-1-up-s、Q-1-1-up-a、purCSQ-s、purCSQ-s、Q-yjiV-DN-purCSQ-s、Q-yjiV-DN-s为引物，再分别以B.Subtilis XGL和E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-1-1-up，下游同源臂Q-1-1-DN，目的基因purCSQ；然后再获得融合片段1::purEKB。最后将pGRB-1质粒与重叠片段1::purEKB电转至SA-1-purEKB的电转感受态细胞中；再以Q-1-1-up-s、Q-yjiV-DN-s为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株SA-1-purEKBCSQ。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图2，各片段大小均与理论值大小一致。
1.1.3基因purL的整合
以pGRB-4-s、pGRB-4-a为引物，构建出pGRB-4质粒。以Q-4-1-up-s、Q-4-1-up-a、purL-s、purL-a、Q-yjiV-DN-purL-s、Q-yjiV-DN-s为引物，分别以B.Subtilis XGL和E.coliW3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-4-1-up，下游同源臂Q-4-1-DN，目的基因purL；然后再获得融合片段4::purL。最后将pGRB-yjiV质粒与重叠片段4::purL电转至SA-1-purEKBCSQ的电转感受态细胞中；再以Q-4-1-up-s、Q-yjiV-DN-s为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株SA-1-purEKBCSQL。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图2，各片段大小均与理论值大小一致。
1.1.4基因purFMN的整合
以pGRB-5-s、pGRB-5-a为引物，构建出pGRB-5质粒。以Q-5-1-up-s、Q-5-1-up-a、purFMN-s、purFMN-a、Q-yjiV-DN-purFMN-s、Q-yjiV-DN-s为引物，分别以B.Subtilis XGL和E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-5-1-up，下游同源臂Q-5-1-DN，目的基因purFMN；然后再获得融合片段5::purEKB。最后将pGRB-5质粒与重叠片段5::purFMN电转至SA-1-purEKBCSQL的电转感受态细胞中；再以Q-5-1-up-s、Q-yjiV-DN-s为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株SA-1-purEKBCSQLFMN。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图2，各片段大小均与理论值大小一致。
1.1.5基因purHD的整合
以pGRB-4-s、pGRB-4-a为引物，构建出pGRB-4质粒。然后以Q-4-2-up-s、Q-4-2-up-a、purHD-s、purHD-a、Q-yjiV-DN-purL-s、Q-yjiV-DN-s为引物，分别以B.Subtilis XGL和E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-4-2-up，下游同源臂Q-4-2-DN，目的基因purHD；然后再获得融合片段4::purHD。最后将pGRB-4质粒与重叠片段4::purHD电转至SA-1-purEKBCSQLFMN的电转感受态细胞中；再以Q-4-2-up-s、Q-yjiV-DN-s为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株SA-1-purEKBCSQLFMNHD(即为菌株SA-1)。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图2，各片段大小均与理论值大小一致。
1.2基因purA的整合
以pGRB-yghX-s、pGRB-yghX-a为引物，构建出pGRB-yghX质粒。然后以Q-yghx-up-s、Q-yghx-up-a、purA-s、purA-a、Q-yghX-DN-s、Q-yghX-DN-a为引物，分别以B.SubtilisXGL和E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-yghX-up，下游同源臂Q-yghX-DN，目的基因purA；然后再获得融合片段yghX::purA。最后将pGRB-yghX质粒与重叠片段yghX::purA电转至SA-1的电转感受态细胞中；再以Q-yghx-up-s、Q-yghX-DN-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株SA-2。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图3，各片段大小均与理论值大小一致。
1.3基因purB的整合
以pGRB-ygaY-s、pGRB-ygaY-a为引物，构建出pGRB-ygaY质粒。然后以Q-ygaY-up-s、Q-ygaY-up-a、purB-s、purB-a、Q-ygaY-DN-s、Q-ygaY-DN-a为引物，分别以B.SubtilisXGL和E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-ygaY-up，下游同源臂Q-ygaY-DN，目的基因purB；然后再获得融合片段ygaY::purB。最后将pGRB-ygaY质粒与重叠片段ygaY::purB电转至SA-2的电转感受态细胞中；再以Q-ygaY-up-s、Q-ygaY-DN-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株SA-3。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图4，各片段大小均与理论值大小一致。
1.4基因amn的整合
以pGRB-yghE-s、pGRB-yghE-a为引物，构建出pGRB-yghE质粒。然后以Q-yghE-up-s、Q-yghE-up-a、amn-s、amn-a、Q-yghE-DN-s、Q-yghE-DN-a为引物，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-yghE-up，下游同源臂Q-yghE-DN，目的基因amn；然后再获得融合片段yghE::amn。最后将pGRB-yghE质粒与重叠片段yghE::amn电转至SA-3的电转感受态细胞中；再以Q-yghE-up-s、Q-yghE-DN-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株SA-4。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图5，各片段大小均与理论值大小一致。
1.5基因ygdH的整合
以pGRB-yjiP-s、pGRB-yjiP-a为引物，构建出pGRB-yjiP质粒。然后以Q-yjiP-up-s、Q-yjiP-up-a、ygdH-s、ygdH-a、Q-yjiP-DN-s、Q-yjiP-DN-a为引物，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-yjiP-up，下游同源臂Q-yjiP-DN，目的基因ygdH；然后再获得融合片段yjiP::ygdH。最后将pGRB-yjiP质粒与重叠片段yjiP::ygdH电转至SA-4的电转感受态细胞中；再以Q-yjiP-up-s、Q-yjiP-DN-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株SA-5。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图6，各片段大小均与理论值大小一致。
1.6基因ade的敲除
以pGRB-ade-s、pGRB-ade-a为引物，构建出pGRB-ade质粒。然后以Q-ade-up-s、Q-ade-up-a、Q-ade-DN-s、Q-ade-DN-a为引物，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-ade-up，下游同源臂Q-ade-DN；然后再获得融合片段Δade。最后将pGRB-ade质粒与重叠片段Δade电转至SA-5的电转感受态细胞中；再以Q-ade-up-s、Q-ade-DN-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株SA-6。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图7，各片段大小均与理论值大小一致。
1.7基因deoD的敲除
以pGRB-deoD-s、pGRB-deoD-a为引物，构建出pGRB-deoD质粒。然后以Q-deoD-up-s、Q-deoD-up-a、Q-deoD-DN-s、Q-deoD-DN-a为引物，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-deoD-up，下游同源臂Q-deoD-DN；然后再获得融合片段ΔdeoD。最后将pGRB-deoD质粒与重叠片段ΔdeoD电转至SA-6的电转感受态细胞中；再以Q-deoD-up-s、Q-deoD-DN-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株SA-7。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图8，各片段大小均与理论值大小一致。
1.8基因apt的敲除
以pGRB-apt-s、pGRB-apt-a为引物，构建出pGRB-apt质粒。然后以Q-apt-up-s、Q-apt-up-a、Q-apt-DN-s、Q-apt-DN-a为引物，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-apt-up，下游同源臂Q-apt-DN；然后再获得融合片段Δapt。最后将pGRB-apt质粒与重叠片段Δapt电转至SA-7的电转感受态细胞中；再以Q-apt-up-s、Q-apt-DN-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株SA-8。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图9，各片段大小均与理论值大小一致。
1.9基因guaB的敲除
以pGRB-guaB-s、pGRB-guaB-a为引物，构建出pGRB-guaB质粒。然后以Q-guaB-up-s、Q-guaB-up-a、Q-guaB-DN-s、Q-guaB-DN-a为引物，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-guaB-up，下游同源臂Q-guaB-DN；然后再获得融合片段ΔguaB。最后将pGRB-guaB质粒与重叠片段ΔguaB电转至SA-8的电转感受态细胞中；再以Q-guaB-up-s、Q-guaB-DN-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株SA-9。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图10，各片段大小均与理论值大小一致。
1.10基因add的敲除
以pGRB-add-s、pGRB-add-a为引物，构建出pGRB-add质粒。然后以Q-add-up-s、Q-add-up-a、Q-add-DN-s、Q-add-DN-a为引物，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-add-up，下游同源臂Q-add-DN；然后再获得融合片段Δadd。最后将pGRB-add质粒与重叠片段Δadd电转至SA-9的电转感受态细胞中；再以Q-add-up-s、Q-add-DN-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株SA-10。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图11，各片段大小均与理论值大小一致。
1.11基因purR的敲除
以pGRB-purR-s、pGRB-purR-a为引物，构建出pGRB-purR质粒。然后以Q-purR-up-s、Q-purR-up-a、Q-purR-DN-s、Q-purR-DN-a为引物，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂Q-purR-up，下游同源臂Q-purR-DN；然后再获得融合片段ΔpurR。最后将pGRB-purR质粒与重叠片段ΔpurR电转至SA-10的电转感受态细胞中；再以Q-purR-up-s、Q-purR-DN-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株SA-11。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图12，各片段大小均与理论值大小一致。
1.12基因purFbaz K316Q的整合
以pGRB-rph-s、pGRB-rph-a为引物，构建出pGRB-rph质粒。然后以Q-rph-up-s、Q-rph-up-a、PurF K316Q-s、PurF K316Q-a、Q-rph-DN-s、Q-rph-DN-a为引物，以E.coli W3110的基因组和基因合成的PurFbaz K316Q片段为模板，获得上游同源臂Q-rph-up、下游同源臂Q-rph-DN和目的基因片段PurFbaz K316Q；然后再获得融合片段Δrph::PurFbaz K316Q。最后将pGRB-rph质粒与重叠片段Δrph::PurFbaz K316Q电转至SA-11的电转感受态细胞中；再以Q-rph-up-s、Q-rph-DN-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株SA-12。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图13，各片段大小均与理论值大小一致。
1.13基因prseco D128A的整合
以pGRB-yjgX-s、pGRB-yjgX-a为引物，构建出pGRB-yjgX质粒。然后以Q-yjgX-up-s、Q-yjgX-up-a、prsD128A-s、prsD128A-a、Q-yjgX-DN-s、Q-yjgX-DN-a为引物，以E.coliW3110的基因组和基因合成的prseco D128A片段为模板，获得上游同源臂Q-yjgX-up、下游同源臂Q-yjgX-DN和目的基因片段prseco D128A；然后再获得融合片段ΔyjgX::prseco D128A。最后将pGRB-yjgX质粒与重叠片段ΔyjgX::prseco D128A电转至SA-12的电转感受态细胞中；再以Q-yjgX-up-s、Q-yjgX-DN-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株SA-13。菌株SA-13即为E.coli-Sade。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图14，各片段大小均与理论值大小一致。
实施例2
采用实施例1中所述的基因工程菌E.coli-Sade进行摇瓶发酵生产腺嘌呤。
1.培养基
1.1种子培养基
葡萄糖30g/L，酵母浸粉6g/L，蛋白胨4g/L，柠檬酸1g/L，(NH4)2SO43g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 2g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，Vb(1.3.5.12)各0.5m g/L，黄嘌呤100mg/L，鸟嘌呤100mg/L，VH 1mg/L。
1.2发酵培养基
葡萄糖30g/L，酵母浸粉6g/L，蛋白胨2g/L，柠檬酸2g/L，(NH4)2SO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 3g/L，FeSO4·7H2O 20mg/L，Vb(1.3.5.12)各2mg/L，VH 1mg/L，微量元素混合液1mL/L，黄嘌呤100mg/L，鸟嘌呤200mg/L。所述微量元素混合液组分含量为：钼酸铵0.28mg/L，硼酸5mg/L，CoCl2·6H2O
1.4mg/L，MnSO4·H2O 0.5mg/L，CuSO4·7H2O 0.5mg/L，ZnSO4·7H2O 0.6mg/L，上述成分称量固体后溶解于1L水中，在4℃保存。
2.摇瓶培养方案
2.1菌种活化
取-80℃保藏的实施例1所述用于产生腺嘌呤的基因工程菌E.coli-Sade划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次。
2.2种子培养
用接种环刮取一环斜面种子接种于装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，九层纱布封口，36℃，200r/min培养10h。
2.3发酵培养
按10％-15％接种量接种菌种活化后制备的种子液到装有发酵培养基的三角瓶中，九层纱布封口，温度维持在36.8-37.2℃，220r/min振荡培养，发酵过程中通过补加25％的氨水来维持pH在7.0-7.2；添加60％葡萄糖溶液补充菌体所需的碳源，发酵周期30h。
摇瓶发酵30h，腺嘌呤产量可达1.49g/L。
实施例3
采用实施例1中所述的基因工程菌E.coli-Sade进行5L放大发酵生产腺嘌呤。发酵培养基具体见实施例2。
(1)菌种活化：将菌种从甘油管接至斜面培养基活化培养11-13h；将菌种从斜面培养基中接至茄形瓶培养基中继续活化扩大培养10-12h。培养温度：37℃。
(2)种子培养：将200mL左右无菌水于超净台火焰附近倒入上述茄形瓶中，使用接种环将菌落刮至无菌水中并打散制备菌悬液，在发酵罐火圈旁将菌悬液接种入发酵种子培养罐中，进行菌种扩大培养。培养过程pH维持在6.7-7.0，温度维持在37℃，溶氧维持在35％-50％之间，培养至OD为20时转接发酵罐中进行发酵培养。
(3)发酵培养：按20％的接种量将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵pH维持在6.4-6.7，温度维持在37℃左右，溶氧维持在30％-50％之间。培养过程中通过流加80％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵过程菌体所需的碳源，期间通过添加25％的氨水来调节pH。
5L发酵罐发酵20h后腺嘌呤的产量就可达到2.43g/L。发酵数据曲线见图15。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于生产腺嘌呤的基因工程菌，其特征在于：为E.coli-Sade，是由下述基因改造策略获得的：首先通过在E.coli W3110-1的基因组yjiV位点引入异源的嘌呤操纵子pur基因，由Ptrc启动子启动；其次通过在基因组yghX、ygaY位点引入异源的腺苷酸琥珀酸合酶和腺苷酸琥珀酸裂解酶，分别由PT7、Ptrc强启动子启动；然后通过在基因组yghE、yjiP位点双拷贝内源的AMP核苷酶和嘧啶/嘌呤-5’-核苷酸核苷酶，均由Ptrc启动子启动；之后通过敲除腺嘌呤的分解途径腺嘌呤脱氢酶、嘌呤-核苷磷酸化酶和腺嘌呤磷酸核糖转移酶；然后通过敲除IMP脱氢酶和腺苷脱氨酶；最后敲除嘌呤核苷酸阻遏蛋白，在基因组yjgX和rpH位点分别引入PRPP转酰胺酶的抗反馈变体purFbaz K316Q和PRPP合成酶的抗反馈变体prseco D128A，均由Ptrc启动子启动。
2.根据权利要求1所述的生产腺嘌呤的基因工程菌，其特征在于：所述E.coliW3110-1是通过整合过噬菌体T7RNA聚合酶的大肠杆菌E.coliW3110获得的，该大肠杆菌E.coliW3110保藏号为ATCC 27325。
3.根据权利要求1所述的生产腺嘌呤的基因工程菌，其特征在于：所述嘌呤操纵子pur的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述腺苷酸琥珀酸合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述腺苷酸琥珀酸裂解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述AMP核苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述嘧啶/嘌呤-5’-核苷酸核苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述腺嘌呤脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述嘌呤-核苷磷酸化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述腺嘌呤磷酸核糖转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
4.根据权利要求1所述的生产腺嘌呤的基因工程菌，其特征在于：所述IMP脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述腺苷脱氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述嘌呤核苷酸阻遏蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述PRPP转酰胺酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述抗反馈变体purFbaz K316Q的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述PRPP合成酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；所述抗反馈变体prseco D128A的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
5.权利要求1所述用于生产腺嘌呤的基因工程菌的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)通过在E.coli W3110-1的基因组yjiV位点引入异源的嘌呤操纵子pur基因，由Ptrc启动子启动，增强嘌呤代谢途径的碳代谢流；
(2)通过在基因组yghX、ygaY位点引入异源的腺苷酸琥珀酸合酶和腺苷酸琥珀酸裂解酶，分别由PT7、Ptrc强启动子启动，加强IMP→AMP的生物合成途径；
(3)通过在基因组yghE、yjiP位点双拷贝内源的AMP核苷酶和嘧啶/嘌呤-5’-核苷酸核苷酶，均由Ptrc启动子启动；
(4)通过敲除腺嘌呤的分解途径腺嘌呤脱氢酶、嘌呤-核苷磷酸化酶和腺嘌呤磷酸核糖转移酶，阻断腺嘌呤的分解途径；
(5)通过敲除IMP脱氢酶和腺苷脱氨酶，进一步强化腺嘌呤的生物合成途径；
(6)敲除嘌呤核苷酸阻遏蛋白，在基因组yjgX和rpH位点分别引入解淀粉芽孢杆菌的PRPP转酰胺酶的抗反馈变体purFbaz K316Q和PRPP合成酶的抗反馈变体prseco D128A，均由Ptrc启动子启动，解除终产物及关键中间产物的反馈抑制作用。
6.权利要求1所述基因工程菌在发酵生产腺嘌呤方面的应用。
7.根据权利要求6所述的基因工程菌的应用，其特征在于：包括摇瓶发酵方案和发酵罐培养方案。
8.根据权利要求7所述的基因工程菌的应用，其特征在于：所述摇瓶发酵方案为：按10％-15％接种量接种菌种活化后制备的种子液到装有发酵培养基的三角瓶中，纱布封口，温度维持在36.8-37.2℃，220r/min振荡培养，发酵过程中通过补加25％的氨水来维持pH在7.0-7.2；添加60％葡萄糖溶液补充菌体所需的碳源，发酵周期30h。
9.根据权利要求7所述的基因工程菌的应用，其特征在于：所述发酵罐培养方案为：
(1)菌种活化：将菌种从甘油管接至斜面培养基活化培养11-13h；将菌种从斜面培养基中接至茄形瓶培养基中继续活化扩大培养10-12h，培养温度37℃；
(2)种子培养：将无菌水于超净台火焰附近倒入上述茄形瓶中，使用接种环将菌落刮至无菌水中并打散制备菌悬液，在发酵罐火圈旁将菌悬液接种入发酵种子培养罐中，进行菌种扩大培养；培养过程pH维持在6.7-7.0，温度维持在37℃，溶氧维持在35％-50％，培养至OD为20时转接发酵罐中进行发酵培养；
(3)发酵培养：按20％的接种量将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵pH维持在6.4-6.7，温度维持在37℃，溶氧维持在30％-50％；培养过程中通过流加80％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵过程菌体所需的碳源，期间通过添加25％的氨水来调节pH。
10.根据权利要求7-9之一所述的基因工程菌的应用，其特征在于：采用的种子培养基为：葡萄糖30g/L，酵母浸粉6g/L，蛋白胨4g/L，柠檬酸1g/L，(NH4)2SO4 3g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，KH2PO4 2g/L，FeSO4·7H2O10mg/L，Vb(1.3.5.12)各0.5mg/L，黄嘌呤100mg/L，鸟嘌呤100mg/L，VH 1mg/L；采用的发酵培养基为：葡萄糖30g/L，酵母浸粉6g/L，蛋白胨2g/L，柠檬酸2g/L，(NH4)2SO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 3g/L，FeSO4·7H2O20mg/L，Vb(1.3.5.12)各2mg/L，VH 1mg/L，微量元素混合液1mL/L，黄嘌呤100mg/L，鸟嘌呤200mg/L，所述微量元素混合液组分含量为：钼酸铵0.28mg/L，硼酸5mg/L，CoCl2·6H2O 1.4mg/L，MnSO4·H2O 0.5mg/L，CuSO4·7H2O0.5mg/L，ZnSO4·7H2O 0.6mg/L，上述成分称量固体后溶解于1L水中，在4℃保存。
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