CN115948307A - 一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成胞苷的基因工程菌、方法和应用 - Google Patents

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CN115948307A CN202210820162.4A CN202210820162A CN115948307A CN 115948307 A CN115948307 A CN 115948307A CN 202210820162 A CN202210820162 A CN 202210820162A CN 115948307 A CN115948307 A CN 115948307A
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安俊侠
刘欢
刘亚琦
宋雪静
徐庆阳
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Abstract

本发明公开一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成胞苷的基因工程菌，所述胞苷基因工程菌是在尿苷基因工程菌E.coliUR11的基础上，缺失了胞苷脱氨酶Cdd；缺失了嘧啶单磷酸核苷酶YgdH；缺失了胞苷酸激酶CmK；缺失了核苷三磷酸焦磷酸水解酶YhdE和MazG；过表达内源的核苷三磷酸焦磷酸水解酶NudG；过表达枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的尿苷酸激酶PyrH(D90A)；过表达枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的胞苷三磷酸合酶PyrG(E156K)；缺失了核苷三磷酸还原酶NrdD。本发明工程菌解除了UMP和CTP对胞苷合成途径关键酶的反馈调节，增加了胞苷合成的代谢通量。

Description

一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成胞苷的基因工程菌、方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其是一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成胞苷的基因工程菌、方法和应用。
背景技术
胞苷属于嘧啶核苷类化合物，是生物体合成RNA的组成成分，在生物体中起到重要的代谢、遗传等调控作用，并参与生物体内各种生理生化过程。胞苷用途十分广泛，涉及食品、医药、保健品等行业。在医药领域应用价值尤为显著，主要作为一些抗病毒和抗肿瘤药物的中间前体物质，也是生产阿糖胞苷、环胞苷、胞二磷胆碱等药物的原材料。胞苷具有十分重要的实用价值，随着胞苷市场需求量的不断扩大，迫切需要成本低且高效的胞苷生产工艺。
胞苷的生产方法有RNA水解法、化学合成法、微生物发酵法。应用较为广泛的是RNA水解法和化学合成法。RNA水解法需要大量优质的RNA原料，成本较高。水解后得到的是混合产品，分离提纯的过程繁琐，操作复杂，还会产生许多副产物，导致产销失衡。胞苷的化学合成法主要以胞嘧啶和核糖或尿苷为原料合成胞苷，需要添加甲苯磺酸和四氯化钛作为催化剂，化学合成法具有反应路线长、生产成本高、产品收率低、环保压力大等缺点，限制了其工业化大规模生产。微生物发酵法生产胞苷具有投入低、产出高、操作简单等优点，是实现胞苷工业化生产的理想方法。
上世纪70年代，国外许多学者开始对嘧啶核苷合成途径进行研究，选取的菌株主要有大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，这为胞苷生产菌的选育奠定了科学的理论基础。大肠杆菌中胞苷的合成需要经过一系列的代谢反应。第一步，谷氨酰胺、天冬氨酸和5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)等前体物质经过六步酶催化反应生成尿苷酸(UMP)。第二步，合成的UMP进行分流代谢，一部分UMP在核苷酸酶和尿苷磷酸化酶的催化下生成尿嘧啶或直接经过尿嘧啶磷酸核糖转移酶生成尿嘧啶；另一部分UMP在尿苷酸激酶、核苷二磷酸激酶、胞苷三磷酸合成酶的作用下生成胞苷三磷酸(CTP)，CTP脱磷酸后生成胞苷。胞嘧啶合成路径长，反馈调节机制复杂，受多条代谢路径的干扰。
上世纪90年代，国外已有关于微生物发酵法生产嘧啶核苷的报道，国内在本世纪初才逐渐进行相关研究。早期胞苷生产菌株的选育主要采用诱变结合结构类似物抗性筛选的方法。例如，1989年Asahi S等以枯草芽孢杆菌B.subilis为出发菌株，经过诱变育种，得到一株生产能力为2.0g/L胞苷生产菌株(Journal of the Agricultural ChemicalSociety of Japan,1989,53(1):97-102.)；2007年盛春雷等以B.subilis DOS7-2-1000-15为出发菌株，通过紫外诱变和结构类似物抗性筛选的方法提升CTP合酶活性，同时敲除胞苷脱氨酶基因，得到的菌株胞苷生产能力达到3.5g/L(生物技术,2007,17(5):57-59.)；2009年李登奎等通过NTG诱变和结构类似物抗性筛选的方法，部分解除了枯草芽孢杆菌B.subilis K-215中CTP合酶所受反馈抑制作用，胞苷积累量达到6.2g/L(中国药科大学学报,2009,40(5):455-459.)。2020年，李静等通过多轮次诱变筛选得到一株结构类似物抗性突变株，在50L发酵罐中胞苷产量达到90g/L，糖酸转化率达到30％，具有较好的工业应用前景(ZL202010188550.6)。但是，诱变选育的突变株存在遗传背景复杂，无效突变较多，生产活力不稳定，营养需求较高的问题，不利于连续生产过程。
利用代谢工程和基因编辑技术选育胞苷生产菌是近年来研究的热点。例如，2010年苏静等以B.subilis TS8为出发菌株，在保证遗传性能稳定的前提下通过Red同源重组的方法敲除了胞苷脱氨酶编码基因cdd，胞苷积累量达到1.72g/L，较原始菌株产量提高了44.19％(生物技术通讯,2010,21(1):39-42.)；2017年刘爱霞等对E.coli W3110的嘧啶核苷途径进行了基因工程改造，解除了合成途径的反馈抑制，敲除了胞苷的降解及利用基因，过表达合成途径的关键酶，重组菌株在5L发酵罐中胞苷产量可以达到20g/L以上(ZL201710003833.7)。与传统诱变育种相比，基因工程育种具有遗传背景清晰，突变位点少，连续生产稳定性强的特点。但是目前依靠基因工程技术选育的胞苷生产菌的产量和糖酸转化率均较低，无法真正用于工业化生产。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成胞苷的基因工程菌、方法和应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成胞苷的基因工程菌，所述胞苷基因工程菌是在尿苷基因工程菌E.coli UR11的基础上，缺失了胞苷脱氨酶Cdd；缺失了嘧啶单磷酸核苷酶YgdH；缺失了胞苷酸激酶CmK；缺失了核苷三磷酸焦磷酸水解酶YhdE和MazG；过表达内源的核苷三磷酸焦磷酸水解酶NudG；过表达枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的尿苷酸激酶PyrH(D90A)；过表达枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的胞苷三磷酸合酶PyrG(E156K)；缺失了核苷三磷酸还原酶NrdD。
其中，所述Cdd的基因序列为SEQ ID NO.1，YgdH的基因序列为SEQ ID NO.2，CmK的基因序列为SEQ ID NO.3，YhdE的基因序列为SEQ ID NO.4，MazG的基因序列为SEQ IDNO.5，NudG的基因序列为SEQ ID NO.6，PyrH(D90A)的基因序列为SEQ ID NO.7，PyrG(E156K)的基因序列为SEQ ID NO.9，NrdD的基因序列为SEQ ID NO.11。
进一步地，所述尿苷基因工程菌E.coli UR11(ZL201810020944.3)是在E.coliW3110(ATCC27325)的基因组上整合了来源于B.subtilis A260(CGMCC No.11775)的嘧啶核苷操纵子PyrBCAKDFE，由强启动子Ptrc控制；敲除尿苷激酶基因udk、尿苷磷酸化酶基因udp和核苷水解酶基因rihA、rihB和rihC；在基因组上对其自身PRPP合成酶基因prsA进行双拷贝，由强启动子Ptrc启动；敲除高丝氨酸脱氢酶基因thrA；敲除鸟氨酸氨甲酰转移酶基因argF。
如上所述的胞苷的基因工程菌的构建方法，所述方法是采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli UR11基因组进行定向改造。
进一步地，步骤如下：
(1)敲除胞苷脱氨酶基因cdd，cdd基因序列为SEQ ID NO.1；
(2)敲除嘧啶单磷酸核苷酶基因ygdH，ygdH基因序列为SEQ ID NO.2；
(3)敲除胞苷酸激酶基因cmK，cmK基因序列为SEQ ID NO.3；
(3)敲除核苷三磷酸焦磷酸酶基因yhdE，yhdE基因序列为SEQ ID NO.4；
(4)敲除核苷三磷酸焦磷酸酶基因mazG，mazG基因序列为SEQ ID NO.5；
(5)在假基因位点yeeP、mbhA、yjiT分别整合大肠杆菌内源的核苷三磷酸焦磷酸水解酶基因nudG，nudG基因序列为SEQ ID NO.6，由强启动子Ptrc控制；
(6)在胞苷脱氨酶基因位点cdd和假基因位点yghE分别整合枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的尿苷酸激酶基因pyrH(D90A)，cdd基因序列为SEQ ID NO.1，pyrH(D90A)基因序列为SEQ ID NO.7，由强启动子Ptrc控制，尿苷酸激酶氨基酸序列为SEQ ID NO.8；
(7)在胞苷酸激酶基因位点cmK、假基因位点ilvG分别整合枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的胞苷三磷酸合酶基因pyrG(E156K)，cmK基因序列为SEQ ID NO.3，pyrG(E156K)基因序列为SEQ ID NO.9，由强启动子Ptrc控制，胞苷三磷酸合酶氨基酸序列为SEQ ID NO.10；
(8)敲除核苷三磷酸还原酶基因nrdD，nrdD基因序列为SEQ ID NO.11。
进一步地，所述强启动子Ptrc的基因序列为SEQ ID NO.12：
TTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACC。
所述Ptrc终止子的基因序列为SEQ ID NO.13：
CAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAAT
如上所述的胞苷的基因工程菌在胞苷生产方面中的应用。
利用如上所述的胞苷的基因工程菌发酵生产胞苷的方法，所述方法通过反馈脉冲补料工艺来提高胞苷的产量。
进一步地，具体操作步骤如下：
取胞苷的基因工程菌的菌液，均匀涂布于活化斜面，并进行传代培养；将活化斜面上的菌株接种到种子培养基中，37℃培养8-10h，培养过程中通过补加氨水维持pH值在6.8-7.2；将种子液按照15-20％的接种量接入发酵培养基中，开始发酵培养；发酵起始pH值控制在6.8-7.2；发酵8-10h通过补加氨水维持pH值在6.4-6.7；发酵12h后开始采用反馈脉冲式补料策略补加葡萄糖，将溶解氧值控制在20％-35％；发酵24-26h采用联动反馈脉冲式补料策略同时补加葡萄糖和玉米浆，将溶解氧值控制在15％-30％；整个发酵过程中温度控制在37℃，发酵周期为40h，获得胞苷。
进一步地，所述活化斜面使用的斜面培养基为：葡萄糖1-2g/L，蛋白胨10-15g/L，牛肉膏10-15g/L，酵母粉5-8g/L，NaCl 2.5-5g/L，琼脂20g/L。
或者，所述种子培养基为：葡萄糖25-30g/L，KH2PO41.2-1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5-1.0g/L，酵母粉5-8g/L，FeSO4·7H2O 2.8-3.5mg/L，MnSO4·H2O 2.8-3.5mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1.3-2.5mg/L。
或者，所述发酵培养基为：葡萄糖20-25g/L，KH2PO42.5-5.0g/L，MgSO4·7H2O 1.2-2.0g/L，酵母粉4-8g/L，FeSO4·7H2O 80-90mg/L，MnSO4·H2O 80-90mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各2-4mg/L。
进一步地，所述方法的胞苷产量为74-78g/L，糖苷转化率为30-35％。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明通过合理的代谢改造策略，以ZL201810020944.3(CN 108130306 B)构建的尿苷生产菌为出发菌，利用基因组改造技术获得一株高产胞苷的基因工程菌，该菌株基因组上含有枯草芽孢杆菌来源的解除反馈抑制的嘧啶核苷操纵子PyrBCAKDFE，含有枯草芽孢杆菌来源的解除反馈抑制的尿苷酸激酶和胞苷三磷酸合酶PyrH(D90A)和PyrG(E156K)，进而解除了UMP和CTP对胞苷合成途径关键酶的反馈调节，增加了胞苷合成的代谢通量。
2、大肠杆菌中含有多个核苷三磷酸焦磷酸酶编码基因，如MazG、YhdE、NudG等，其中MazG和YhdE既可以催化UTP到UMP也可以催化CTP到CMP的转化，而NudG偏向于催化CTP到CMP的转化。本发明构建的胞苷工程菌缺失了MazG和YhdE，过表达了NudG，从而强化了UTP到CMP的代谢通量，促进了胞苷的积累。
3、大肠杆菌中很多支路代谢会影响胞苷的积累，例如核苷水解酶RihA/B/C催化胞苷到胞嘧啶的转化，尿苷/胞苷激酶Udk催化胞苷到CMP的转化，CMP激酶Cmk催化CMP到CDP的转化，胞苷脱氨酶Cdd催化胞苷到尿苷的转化，嘧啶单磷酸核苷酶Ygdh催化CMP到胞嘧啶的转化，核苷三磷酸还原酶NrdD催化UTP/CTP到dUTP/dCTP的转化。本发明构建的胞苷工程菌缺失了上述酶，从而阻断了各种分支代谢，提高了胞苷的产量和糖苷转化率。
4、大肠杆菌中UMP有尿苷和胞苷两个代谢流向，本发明在解除反馈抑制的基础上，通过合理优化UMP到胞苷合成关键酶PyrH、PyrG、NudG的表达量即启动子以及在基因组上的拷贝数，成功将UMP到尿苷的代谢转变为UMP到胞苷的代谢，实现了从尿苷生产到胞苷生产的转变。
5、本发明构建胞苷工程菌所涉及的基因操作均在基因组上进行，无质粒残留，无抗生素及诱导剂使用，与诱变菌株相比，最终获得的胞苷工程菌遗传性状清晰稳定，生产性能稳定，发酵过程简单。利用该胞苷工程菌株，在合适的发酵条件下发酵40h，胞苷产量可达到74-78g/L，糖酸转化率达到30-35％，与现有报道的重组菌株相比，产量及糖苷转化率较高，具有较好的工业应用价值。
附图说明
图1为本发明中胞苷基因工程菌的代谢改造策略图；其中，UMP为尿苷酸、UDP为二磷酸尿苷、UTP为三磷酸尿苷、CTP为三磷酸胞苷、CDP为二磷酸胞苷、CMP为单磷酸胞苷；
图2为本发明中ygdH基因敲除片段构建及验证电泳图；其中，M—1kb DNA Marker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—重叠片段；4—原菌PCR片段；5—阳性单菌落PCR鉴定片段；
图3为本发明中yhdE基因敲除片段构建及验证电泳图；其中，M—1kb DNA Marker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—重叠片段；4—原菌PCR片段；5—阳性单菌落PCR鉴定片段；
图4为本发明中mazG基因敲除片段构建及验证电泳图；其中，M—1kb DNA Marker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—重叠片段；4—原菌PCR片段；5—阳性单菌落PCR鉴定片段；
图5为本发明中yeeP::Ptrc-nudG整合片段构建及验证电泳图；其中，M—1kb DNAMarker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—目的基因；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—阳性单菌落PCR鉴定片段；
图6为本发明中mbhA::Ptrc-nudG整合片段构建及验证电泳图；其中，M—1kb DNAMarker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—目的基因；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—阳性单菌落PCR鉴定片段；
图7为本发明中yjiT::Ptrc-nudG整合片段构建及验证电泳图；其中，M—1kb DNAMarker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—目的基因；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—阳性单菌落PCR鉴定片段；
图8为本发明中cdd::Ptrc-pyrH(D90A)整合片段构建及验证电泳图；其中，M—1kbDNA Marker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—目的基因；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—阳性单菌落PCR鉴定片段；
图9为本发明中yghE::Ptrc-pyrH(D90A)整合片段构建及验证电泳图；其中，M—1kbDNA Marker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—目的基因；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—阳性单菌落PCR鉴定片段；
图10为本发明中ilvG::Ptrc-pyrG(E156K)整合片段构建及验证电泳图；其中，M—1kb DNA Marker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—目的基因；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—阳性单菌落PCR鉴定片段；
图11为本发明中cmK::Ptrc-pyrG(E156K)整合片段构建及验证电泳图；其中，M—1kbDNA Marker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—目的基因；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—阳性单菌落PCR鉴定片段；
图12为本发明中nrdD基因敲除片段构建及验证电泳图；其中，M—1kb DNAMarker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—重叠片段；4—原菌PCR片段；5—阳性单菌落PCR鉴定片段；
图13为本发明中实施例3中E.coli C11发酵过程曲线。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成胞苷的基因工程菌，所述胞苷基因工程菌是在尿苷基因工程菌E.coli UR11的基础上，缺失了胞苷脱氨酶Cdd；缺失了嘧啶单磷酸核苷酶YgdH；缺失了胞苷酸激酶CmK；缺失了核苷三磷酸焦磷酸水解酶YhdE和MazG；过表达内源的核苷三磷酸焦磷酸水解酶NudG；过表达枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的尿苷酸激酶PyrH(D90A)；过表达枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的胞苷三磷酸合酶PyrG(E156K)；缺失了核苷三磷酸还原酶NrdD。
其中，所述Cdd的基因序列为SEQ ID NO.1，YgdH的基因序列为SEQ ID NO.2，CmK的基因序列为SEQ ID NO.3，YhdE的基因序列为SEQ ID NO.4，MazG的基因序列为SEQ IDNO.5，NudG的基因序列为SEQ ID NO.6，PyrH(D90A)的基因序列为SEQ ID NO.7，PyrG(E156K)的基因序列为SEQ ID NO.9，NrdD的基因序列为SEQ ID NO.11。
较优地，所述尿苷基因工程菌E.coli UR11(ZL201810020944.3)是在E.coliW3110(ATCC27325)的基因组上整合了来源于B.subtilis A260(CGMCC No.11775)的嘧啶核苷操纵子PyrBCAKDFE，由强启动子Ptrc控制；敲除尿苷激酶基因udk、尿苷磷酸化酶基因udp和核苷水解酶基因rihA、rihB和rihC；在基因组上对其自身PRPP合成酶基因prsA进行双拷贝，由强启动子Ptrc启动；敲除高丝氨酸脱氢酶基因thrA；敲除鸟氨酸氨甲酰转移酶基因argF。
如上所述的胞苷的基因工程菌的构建方法，所述方法是采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli UR11基因组进行定向改造。
较优地，步骤如下：
(1)敲除胞苷脱氨酶基因cdd，cdd基因序列为SEQ ID NO.1；
(2)敲除嘧啶单磷酸核苷酶基因ygdH，ygdH基因序列为SEQ ID NO.2；
(3)敲除胞苷酸激酶基因cmK，cmK基因序列为SEQ ID NO.3；
(3)敲除核苷三磷酸焦磷酸酶基因yhdE，yhdE基因序列为SEQ ID NO.4；
(4)敲除核苷三磷酸焦磷酸酶基因mazG，mazG基因序列为SEQ ID NO.5；
(5)在假基因位点yeeP、mbhA、yjiT分别整合大肠杆菌内源的核苷三磷酸焦磷酸水解酶基因nudG，nudG基因序列为SEQ ID NO.6，由强启动子Ptrc控制；
(6)在胞苷脱氨酶基因位点cdd和假基因位点yghE分别整合枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的尿苷酸激酶基因pyrH(D90A)，cdd基因序列为SEQ ID NO.1，pyrH(D90A)基因序列为SEQ ID NO.7，由强启动子Ptrc控制，尿苷酸激酶氨基酸序列为SEQ ID NO.8；
(7)在胞苷酸激酶基因位点cmK、假基因位点ilvG分别整合枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的胞苷三磷酸合酶基因pyrG(E156K)，cmK基因序列为SEQ ID NO.3，pyrG(E156K)基因序列为SEQ ID NO.9，由强启动子Ptrc控制，胞苷三磷酸合酶氨基酸序列为SEQ ID NO.10；
(8)敲除核苷三磷酸还原酶基因nrdD，nrdD基因序列为SEQ ID NO.11。
较优地，所述强启动子Ptrc的基因序列为SEQ ID NO.12：
TTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACC。
所述Ptrc终止子的基因序列为SEQ ID NO.13：
CAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAAT
如上所述的胞苷的基因工程菌在胞苷生产方面中的应用。
利用如上所述的胞苷的基因工程菌发酵生产胞苷的方法，所述方法通过反馈脉冲补料工艺来提高胞苷的产量。
较优地，具体操作步骤如下：
取胞苷的基因工程菌的菌液，均匀涂布于活化斜面，并进行传代培养；将活化斜面上的菌株接种到种子培养基中，37℃培养8-10h，培养过程中通过补加氨水维持pH值在6.8-7.2；将种子液按照15-20％的接种量接入发酵培养基中，开始发酵培养；发酵起始pH值控制在6.8-7.2；发酵8-10h通过补加氨水维持pH值在6.4-6.7；发酵12h后开始采用反馈脉冲式补料策略补加葡萄糖，将溶解氧值控制在20％-35％；发酵24-26h采用联动反馈脉冲式补料策略同时补加葡萄糖和玉米浆，将溶解氧值控制在15％-30％；整个发酵过程中温度控制在37℃，发酵周期为40h，获得胞苷。
较优地，所述活化斜面使用的斜面培养基为：葡萄糖1-2g/L，蛋白胨10-15g/L，牛肉膏10-15g/L，酵母粉5-8g/L，NaCl 2.5-5g/L，琼脂20g/L。
或者，所述种子培养基为：葡萄糖25-30g/L，KH2PO41.2-1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5-1.0g/L，酵母粉5-8g/L，FeSO4·7H2O 2.8-3.5mg/L，MnSO4·H2O 2.8-3.5mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1.3-2.5mg/L。
或者，所述发酵培养基为：葡萄糖20-25g/L，KH2PO42.5-5.0g/L，MgSO4·7H2O 1.2-2.0g/L，酵母粉4-8g/L，FeSO4·7H2O 80-90mg/L，MnSO4·H2O 80-90mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各2-4mg/L。
较优地，所述方法的胞苷产量为74-78g/L，糖苷转化率为30-35％。
具体地，相关制备及检测实施例如下：
本发明以前期ZL201810020944.3(CN 108130306 B)构建的尿苷生产菌为出发菌，该菌详细构建过程可参考CN 108130306 B。
实施例1：胞苷基因工程菌株E.coli C11的构建(改造策略见图1)：
1、基因编辑方法
本发明中采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑方法，可参照文献(MetabolicEngineering,2015,31:13-21.)进行。CRISPR/Cas9是一种精确、高效的新型基因靶向修饰技术，该方法所用的两种质粒分别为pGRB与pREDCas9。pREDCas9质粒为温敏型质粒，携带gRNA质粒的消除系统，λ噬菌体的Red重组系统及Cas9蛋白表达系统，具有奇霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，适培温度32℃；pGRB质粒，以pUC18为骨架，包含启动子J23100，gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列，具有氨苄青霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，适培温度37℃。
2、菌株构建的具体过程
本发明菌株是以ZL201810020944.3(CN 108130306 B)构建的尿苷基因工程菌E.coli UR11为出发菌，该菌株是将B.subtilis A260中的嘧啶核苷操纵基因pyrBCAKDFE(pyrB、pyrC、pyrAA、pyrAB、pyrK、pyrD、pyrF、pyrE八个基因)按顺序依次整合在E.coliW3110基因组上，构建了尿苷的生物合成途径，敲除了udk、udp、rihA、rihB和rihC五个尿苷降解相关基因。在基因组上对其自身PRPP合成酶基因prsA进行双拷贝，敲除了高丝氨酸脱氢酶基因thrA和鸟氨酸氨甲酰转移酶基因argF。
2.1ygdH基因敲除
根据ygdH基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-ygdH-S(SEQ ID NO.14)、UP-ygdH-A(SEQ ID NO.15)和下游同源臂引物DN-ygdH-S(SEQ ID NO.16)、DN-ygdH-A(SEQ IDNO.17)，以尿苷生产菌E.coli UR11基因组为模板，利用PCR技术扩增上下游同源臂，通过重组PCR的方法获得基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。通过引物gRNA-ygdH-S(SEQID NO.18)和gRNA-ygdH-A(SEQ ID NO.19)的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-ygdH。将整合片段和pGRB-ygdH电转化至含有pREDCas9质粒的E.coli UR11感受态细胞中，复苏培养获得单菌落，通过PCR菌落验证得到阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-ygdH，即菌株E.coli C1。验证图如图2所示。
2.2yhdE基因敲除
根据yhdE基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-yhdE-S(SEQ ID NO.20)、UP-yhdE-A(SEQ ID NO.21)和下游同源臂引物DN-yhdE-S(SEQ ID NO.22)、DN-yhdE-A(SEQ IDNO.23)，以尿苷生产菌E.coli UR11基因组为模板，利用PCR技术扩增上下游同源臂，通过重组PCR的方法获得基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。通过引物gRNA-yhdE-S(SEQID NO.24)和gRNA-yhdE-A(SEQ ID NO.25)的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-yhdE。将整合片段和pGRB-yhdE电转化至含有pREDCas9质粒的E.coli C1感受态细胞中，复苏培养获得单菌落，通过PCR菌落验证得到阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yhdE，即菌株E.coli C2。验证图如图3所示。
2.3mazG基因敲除
根据mazG基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-mazG-S(SEQ ID NO.26)、UP-mazG-A(SEQ ID NO.27)和下游同源臂引物DN-mazG-S(SEQ ID NO.28)、DN-mazG-A(SEQ IDNO.29)，以尿苷生产菌E.coli UR11基因组为模板，利用PCR技术扩增上下游同源臂，通过重组PCR的方法获得基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。通过引物gRNA-mazG-S(SEQID NO.30)和gRNA-mazG-A(SEQ ID NO.31)的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-mazG。将整合片段和pGRB-mazG电转化至含有pREDCas9质粒的E.coli C2感受态细胞中，复苏培养获得单菌落，通过PCR菌落验证得到阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-mazG，即菌株E.coli C3。验证图如图4所示。
2.4Ptrc-nudG基因在yeeP、mbhA、yjiT假基因位点处的整合
根据假基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-yeeP-S(SEQ ID NO.32)和UP-yeeP-Ptrc-A(SEQ ID NO.33)；UP-mbhA-S(SEQ ID NO.34)和UP-mbhA-Ptrc-A(SEQ IDNO.35)；UP-yjiT-S(SEQ ID NO.36)和UP-yjiT-Ptrc-A(SEQ ID NO.37)，下游同源臂引物DN-Ptrc-yeeP-S(SEQ ID NO.38)和DN-yeeP-A(SEQ ID NO.39)；DN-Ptrc-mbhA-S(SEQ IDNO.40)和DN-mbhA-A(SEQ ID NO.41)；DN-Ptrc-yjiT-S(SEQ ID NO.42)和DN-yjiT-A(SEQID NO.43)。以尿苷生产菌E.coli UR11基因组为模板，利用PCR技术扩增假基因的上下游同源臂；根据nudG的基因序列设计引物Ptrc-nudG-S(SEQ ID NO.44)、nudG-Ptrc-A(SEQ IDNO.45)，扩增目的基因。Ptrc启动子设计在假基因上游同源臂的反义链引物和目的基因的正义链引物中；Ptrc终止子设计在目的基因反义链引物和假基因位点下游同源臂的正义链引物中。通过重组PCR的方法获得基因的整合片段(上游同源臂-目的基因-下游同源臂)。通过引物gRNA-yeeP-S(SEQ ID NO.46)和gRNA-yeeP-A(SEQ ID NO.47)；gRNA-mbhA-S(SEQ IDNO.48)和gRNA-mbhA-A(SEQ ID NO.49)；gRNA-yjiT-S(SEQ ID NO.50)和gRNA-yjiT-A(SEQID NO.51)退火制得含目的基因靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-yeeP、pGRB-mbhA、pGRB-yjiT。将整合片段和pGRB-yeeP电转化至含有pREDCas9质粒的E.coli C3感受态细胞中，复苏培养获得单菌落，通过PCR菌落验证得到阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yeeP，即菌株E.coli C4，验证图如图5所示；将整合片段和pGRB-mbhA电转化至含有pREDCas9质粒的E.coli C4感受态细胞中，复苏培养获得单菌落，通过PCR菌落验证得到阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-mbhA，即菌株E.coli C5，验证图如图6所示；整合片段和pGRB-yjiT电转化至含有pREDCas9质粒的E.coli C5感受态细胞中，复苏培养获得单菌落，通过PCR菌落验证得到阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yjiT，即菌株E.coli C6，验证图如图7所示。
2.5Ptrc-pyrH(D90A)基因在cdd、yghE基因位点处的整合
根据cdd和yghE基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-cdd-S(SEQ ID NO.52)和UP-cdd-Ptrc-A(SEQ ID NO.53)；UP-yghE-S(SEQ ID NO.54)和UP-yghE-Ptrc-A(SEQ IDNO.55)，下游同源臂引物DN-Ptrc-cdd-S(SEQ ID NO.56)和DN-cdd-A(SEQ ID NO.57)；DN-Ptrc-yghE-S(SEQ ID NO.58)和DN-yghE-A(SEQ ID NO.59)，以尿苷生产菌E.coli UR11基因组为模板，利用PCR技术扩增cdd和yghE基因的上下游同源臂；由天津安升达生物公司合成携带突变点的目的基因pyrH(D90A)，设计引物Ptrc-pyrH(D90A)-S(SEQ ID NO.60)、pyrH(D90A)-Ptrc-A(SEQ ID NO.61)，Ptrc启动子设计在cdd、yghE基因上游同源臂的反义链引物和目的基因的正义链引物中；Ptrc终止子设计在目的基因反义链引物和cdd、yghE基因位点下游同源臂的正义链引物中。通过重组PCR的方法获得基因的整合片段(上游同源臂-目的基因-下游同源臂)。通过引物gRNA-cdd-S(SEQ ID NO.62)和gRNA-cdd-A(SEQ ID NO.63)；gRNA-yghE-S(SEQ ID NO.64)和gRNA-yghE-A(SEQ ID NO.65)退火制得含目的基因靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-cdd和pGRB-yghE。将整合片段和pGRB-cdd电转化至含有pREDCas9质粒的E.coli C6感受态细胞中，复苏培养获得单菌落，通过PCR菌落验证得到阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-cdd，即菌株E.coli C7，验证图如图8所示；将整合片段和pGRB-yghE电转化至含有pREDCas9质粒的E.coli C7感受态细胞中，复苏培养获得单菌落，通过PCR菌落验证得到阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yghE，即菌株E.coli C8，验证图如图9所示。
2.6Ptrc-pyrG(E156K)基因在ilvG、cmK基因位点处的整合
根据ilvG和cmK基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-ilvG-S(SEQ IDNO.66)和UP-ilvG-Ptrc-A(SEQ ID NO.67)；UP-cmK-S(SEQ ID NO.68)和UP-cmK-Ptrc-A(SEQ ID NO.69)，下游同源臂引物DN-Ptrc-ilvG-S(SEQ ID NO.70)和DN-ilvG-A(SEQ IDNO.71)；DN-Ptrc-cmK-S(SEQ ID NO.72)和DN-cmK-A(SEQ ID NO.73)。以尿苷生产菌E.coliUR11基因组为模板，利用PCR技术扩增ilvG和cmK基因的上下游同源臂；由天津安升达生物公司合成携带突变点的目的基因pyrG(E156K)，设计引物Ptrc-pyrG(E156K)-S(SEQ ID NO.74)、pyrG(E156K)-Ptrc-A(SEQ ID NO.75)，Ptrc启动子设计在ilvG、cmK基因上游同源臂的反义链引物和目的基因的正义链引物中；Ptrc终止子设计在目的基因反义链引物和ilvG、cmK基因下游同源臂的正义链引物中。通过重组PCR的方法获得基因的整合片段(上游同源臂-目的基因-下游同源臂)。通过引物gRNA-ilvG-S(SEQ ID NO.76)和gRNA-ilvG-A(SEQ IDNO.77)；gRNA-cmK-S(SEQ ID NO.78)和gRNA-cmK-A(SEQ ID NO.79)退火制得含目的基因靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-ilvG和pGRB-cmK。将整合片段和pGRB-ilvG电转化至含有pREDCas9质粒的E.coli C8感受态细胞中，复苏培养获得单菌落，通过PCR菌落验证得到阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-ilvG，即菌株E.coliC9，验证图如图10所示；将整合片段和pGRB-cmK电转化至含有pREDCas9质粒的E.coli C9感受态细胞中，复苏培养获得单菌落，通过PCR菌落验证得到阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-cmK，即菌株E.coli C10，验证图如图11所示；
2.7nrdD基因敲除
根据nrdD基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-nrdD-S(SEQ ID NO.80)、UP-nrdD-A(SEQ ID NO.81)和下游同源臂引物DN-nrdD-S(SEQ ID NO.82)、DN-nrdD-A(SEQ IDNO.83)，以尿苷生产菌E.coli UR11基因组为模板，利用PCR技术扩增上下游同源臂，通过重组PCR的方法获得基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。通过引物gRNA-nrdD-S(SEQID NO.84)和gRNA-nrdD-A(SEQ ID NO.85)的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-nrdD。将整合片段和pGRB-nrdD电转化至含有pREDCas9质粒的E.coli C10感受态细胞中，复苏培养获得单菌落，通过PCR菌落验证得到阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-nrdD，即菌株E.coli C11。验证图如图12所示。
3.菌株构建过程中用到的引物
菌株构建过程中的所有引物见下表：
Figure BDA0003743935400000071
Figure BDA0003743935400000081
Figure BDA0003743935400000091
Figure BDA0003743935400000101
实施例2：基因工程菌E.coli C11 50 L发酵罐生产胞苷。
用接种环蘸取保菌管中的菌液，均匀涂布于活化斜面，并进行传代培养；将活化斜面上的菌株接种到种子培养基中，37℃培养8h，培养过程中通过补加氨水维持pH值7.2。将种子液按照15％的接种量接入发酵培养基中，开始发酵培养。发酵起始pH值控制在7.2。发酵10h通过补加氨水维持pH值在6.4。发酵12h后开始采用联动反馈脉冲式补糖策略将溶解氧值控制在20％-30％，即在1号补料泵上设定补料的脉冲速率为1/15s，当溶氧值高于30％时1号泵自动开启补加800g/L的葡萄糖溶液，当溶氧值低于20％时1号泵自动关闭。发酵24-26h采用联动反馈脉冲式补料策略将溶解氧值控制在15％-25％，即在1号补料泵上设定补料的脉冲速率为1/15s，2号补料泵上设定补料的脉冲速率为1/10s，当溶氧值高于25％时1、2号泵同时自动开启补加800g/L的葡萄糖溶液和10mL/L玉米浆，当溶氧值低于15％时1、2号泵同时自动关闭。整个发酵过程中温度控制在37℃，发酵周期为40h。发酵结束后发酵液中胞苷浓度可达74g/L，糖酸转化率可达30％。
所述斜面培养基配方为：葡萄糖1g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠2.5g/L，琼脂30g/L；
所述种子培养基配方为：葡萄糖25g/L，KH2PO41.2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，酵母粉5g/L，FeSO4·7H2O 2.8mg/L，MnSO4·H2O 2.8mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1.3mg/L。
所述发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L，KH2PO42.5g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，酵母粉4g/L，FeSO4·7H2O 80mg/L，MnSO4·H2O 80mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各2mg/L。
实施例3：基因工程菌E.coli C11 50 L发酵罐生产胞苷。
用接种环蘸取保菌管中的菌液，均匀涂布于活化斜面，并进行传代培养；将活化斜面上的菌株接种到种子培养基中，37℃培养10h，培养过程中通过补加氨水维持pH值在6.8。将种子液按照20％的接种量接入发酵培养基中，开始发酵培养。发酵起始pH值控制在6.8。发酵8h通过补加氨水维持pH值在6.7。发酵12h后开始采用反馈脉冲式补糖策略将溶解氧值控制在25％-35％，即在1号补料泵上设定补料的脉冲速率为1/18s，当溶氧值高于35％时1号泵自动开启补加800g/L的葡萄糖溶液，当溶氧值低于25％时1号泵自动关闭。发酵24-26h采用联动反馈脉冲式补料策略将溶解氧值控制在20％-30％，即在1号补料泵上设定补料的脉冲速率为1/18s，2号补料泵上设定补料的脉冲速率为1/12s，当溶氧值高于30％时1、2号泵同时自动开启补加800g/L的葡萄糖溶液和10mL/L玉米浆，当溶氧值低于20％时1、2号泵同时自动关闭。整个发酵过程中温度控制在37℃，发酵周期为40h。发酵结束后发酵液中胞苷可达78g/L，糖酸转化率可达35％。发酵进程图见附图13。
所述斜面培养基配方为：葡萄糖2g/L，蛋白胨15g/L，牛肉膏15g/L，酵母粉8g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L。
所述种子培养基配方为：葡萄糖30g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，酵母粉8g/L，FeSO4·7H2O 3.5mg/L，MnSO4·H2O 3.5mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各2.5mg/L。
所述发酵培养基配方为：葡萄糖25g/L，KH2PO45.0g/L，MgSO4·7H2O 2.0g/L，酵母粉8g/L，FeSO4·7H2O 90mg/L，MnSO4·H2O 90mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各4mg/L。
目前现有技术中胞苷的产量最高的是通过诱变菌获得的，在50L发酵罐中胞苷产量达到90g/L，糖酸转化率达到30％(ZL202010188550.6)。通过基因编辑的最高报道是在5L发酵罐中胞苷产量可以达到20g/L以上(ZL201710003833.7)。本发明胞苷的基因工程菌及其发酵方法的胞苷产量高达74-78g/L，糖苷转化率为30-35％，均高于现有技术中的胞苷的产量和转化率。
本发明中的基因序列：
SEQ ID NO.1：胞苷脱氨酶基因cdd
ATGCATCCACGTTTTCAAACCGCTTTTGCCCAACTTGCGGATAACTTGCAATCTGCACTGGAACCTATTCTGGCAGACAAGTACTTCCCCGCTTTGTTGACCGGGGAGCAAGTCTCATCGCTGAAGAGCGCAACGGGGCTGGACGAAGACGCGCTGGCATTCGCACTACTTCCGCTGGCGGCGGCCTGTGCGCGTACGCCATTGTCGAATTTTAATGTTGGCGCAATTGCGCGCGGTGTGAGCGGAACCTGGTATTTCGGTGCCAATATGGAATTTATTGGTGCGACAATGCAGCAAACCGTTCATGCCGAACAAAGCGCGATCAGCCACGCCTGGTTGAGTGGTGAAAAAGCGCTTGCAGCCATCACCGTTAACTACACGCCTTGTGGTCACTGCCGTCAGTTTATGAATGAACTGAACAGCGGTCTGGATCTGCGTATTCATCTGCCGGGCCGCGAGGCACACGCGCTGCGTGACTATCTGCCAGATGCCTTTGGGCCGAAAGATCTGGAGATTAAAACGCTGCTGATGGACGAACAGGATCACGGCTATGCGCTGACGGGTGATGCGCTTTCTCAGGCAGCGATTGCGGCGGCAAACCGTTCGCACATGCCTTACAGTAAGTCGCCAAGCGGTGTCGCGCTGGAATGTAAAGACGGTCGTATTTTCAGTGGCAGCTACGCTGAAAACGCCGCATTCAACCCGACTCTGCCACCGTTGCAGGGAGCGTTAATTCTGTTGAATCTCAAGGGTTATGATTACCCGGATATCCAGCGCGCGGTTCTGGCAGAAAAAGCCGATGCGCCGTTGATTCAGTGGGATGCCACCTCCGCAACGCTGAAAGCTCTCGGCTGTCACAGTATCGACCGAGTGCTTCTCGCTTAA
SEQ ID NO.2：嘧啶单磷酸核苷酶基因ygdH
TTGATTACACATATTAGCCCGCTTGGCTCCATGGATATGTTGTCGCAGCTGGAAGTGGATATGCTTAAACGCACCGCCAGCAGCGACCTCTATCAACTGTTTCGCAACTGTTCACTTGCCGTACTGAACTCCGGTAGTTTGACCGATAACAGCAAAGAATTGCTGTCTCGTTTTGAAAATTTCGATATTAACGTCTTGCGCCGTGAACGCGGCGTAAAGCTGGAACTGATTAATCCCCCGGAAGAGGCTTTTGTCGATGGGCGAATTATTCGCGCTTTGCAGGCCAACTTGTTCGCGGTCCTGCGTGACATTCTCTTCGTTTACGGGCAAATCCATAACACCGTTCGTTTTCCCAACCTGAATCTCGACAACTCCGTCCACATCACTAACCTGGTCTTTTCCATCTTGCGTAACGCTCGCGCGCTGCATGTGGGTGAAGCGCCAAATATGGTGGTCTGCTGGGGCGGTCACTCAATTAACGAAAACGAGTATTTGTATGCCCGTCGCGTCGGAAACCAGCTGGGCCTGCGTGAGCTGAATATCTGCACCGGCTGTGGTCCGGGAGCGATGGAAGCGCCGATGAAAGGTGCTGCGGTCGGACACGCGCAGCAGCGTTACAAAGACAGTCGTTTTATTGGTATGACAGAGCCGTCGATTATCGCCGCTGAACCGCCTAACCCGCTGGTCAACGAATTGATCATCATGCCAGATATCGAAAAACGTCTGGAAGCGTTTGTCCGTATCGCTCACGGTATCATTATCTTCCCTGGCGGTGTGGGTACGGCAGAAGAGTTGCTCTATTTGCTGGGAATTTTAATGAACCCGGCCAACAAAGATCAGGTTTTACCATTGATCCTCACCGGCCCGAAAGAGAGCGCCGACTACTTCCGCGTACTGGACGAGTTTGTCGTGCATACGCTGGGTGAAAACGCGCGCCGCCATTACCGCATCATCATTGATGACGCCGCTGAAGTCGCTCGTCAGATGAAAAAATCGATGCCGCTGGTGAAAGAAAATCGCCGTGATACAGGCGATGCCTACAGCTTTAACTGGTCAATGCGCATTGCGCCAGATTTGCAAATGCCGTTTGAGCCGTCTCACGAGAATATGGCTAATCTGAAGCTTTACCCGGATCAACCTGTTGAAGTGCTGGCTGCCGACCTGCGCCGTGCGTTCTCCGGTATTGTGGCGGGTAACGTAAAAGAAGTCGGTATTCGCGCCATTGAAGAGTTTGGTCCTTACAAAATCAACGGCGATAAAGAGATTATGCGTCGTATGGACGACCTGCTACAGGGTTTTGTTGCCCAGCATCGTATGAAGTTGCCAGGCTCAGCCTACATCCCTTGCTACGAAATCTGCACGTAA
SEQ ID NO.3：胞苷酸激酶基因cmK
ATGACGGCAATTGCCCCGGTTATTACCATTGATGGCCCAAGCGGTGCAGGGAAAGGCACCTTGTGTAAGGCTATGGCGGAAGCGTTGCAATGGCATCTGCTGGACTCGGGTGCAATTTATCGCGTACTGGCATTGGCGGCATTACATCACCATGTTGATGTTGCGTCGGAAGATGCGCTGGTACCGCTGGCATCCCATCTGGATGTACGTTTTGTGTCGACCAATGGCAATCTGGAAGTGATCCTCGAAGGGGAAGATGTCAGCGGCGAAATTCGTACTCAGGAAGTGGCGAATGCAGCTTCACAAGTCGCGGCATTCCCACGCGTTCGTGAAGCATTATTGCGTCGCCAACGCGCGTTTCGCGAATTACCAGGTCTGATTGCCGATGGCCGCGACATGGGAACGGTGGTATTCCCTGATGCACCAGTGAAAATTTTCCTTGACGCCTCCTCGGAAGAACGTGCGCATCGCCGCATGCTACAGTTGCAGGAGAAGGGCTTTAGTGTTAACTTTGAGCGCCTTTTGGCCGAGATCAAAGAACGCGACGACCGCGATCGTAACCGAGCGGTAGCGCCACTGGTTCCGGCAGCCGATGCTTTAGTGTTGGATTCCACCACCTTAAGCATTGAGCAAGTGATTGAAAAAGCGCTACAATACGCGCGCCAGAAATTGGCTCTCGCATAA
SEQ ID NO.4：核苷三磷酸焦磷酸酶基因yhdE
ATGACTTCTCTGTATTTAGCTTCCGGTTCTCCGCGTCGTCAGGAGTTACTTGCGCAACTTGGCGTGACCTTTGAACGTATTGTTACGGGCATTGAGGAGCAGCGTCAGCCGCAGGAGAGCGCGCAGCAGTATGTTGTGCGTCTGGCGCGCGAGAAAGCACGGGCAGGTGTCGCGCAAACGGCGAAGGATCTCCCGGTGCTGGGTGCGGATACTATCGTTATCCTGAACGGAGAAGTGCTGGAGAAACCGCGCGACGCAGAGCATGCGGCGCAGATGTTGCGCAAATTATCGGGTCAGACCCATCAGGTGATGACAGCAGTGGCGTTGGCCGACAGCCAGCACATTCTCGATTGCCTGGTGGTCACCGATGTGACTTTCAGAACGTTAACAGACGAAGACATCGCGGGCTATGTCGCCAGCGATGAACCGTTAGATAAAGCAGGTGCATACGGTATTCAGGGGCTGGGTGGCTGTTTTGTCAGGAAGATAAATGGCAGCTATCACGCCGTAGTCGGCTTACCGCTGGTTGAAACGTATGAATTATTAAGTAATTTTAACGCACTGCGTGAGAAAAGGGATAAACATGACGGCTGA
SEQ ID NO.5：核苷三磷酸焦磷酸酶基因mazG
ATGAATCAAATCGACCGTTTGCTCACTATTATGCAGCGCCTGCGCGATCCGGAAAACGGCTGCCCGTGGGATAAAGAGCAGACATTTGCCACCATTGCGCCTTACACCCTTGAAGAAACCTACGAAGTGCTGGACGCCATCGCCCGTGAAGATTTTGACGATCTTCGCGGTGAACTGGGCGATCTGCTATTCCAGGTGGTGTTTTACGCGCAAATGGCTCAGGAAGAAGGGCGCTTTGACTTTAATGATATTTGCGCTGCTATTAGCGATAAATTAGAGCGTCGCCATCCGCATGTTTTTGCTGATAGTTCTGCCGAAAACAGTAGTGAAGTGCTTGCCCGTTGGGAGCAAATCAAAACCGAAGAGCGCGCGCAGAAAGCGCAGCATTCGGCGCTGGACGATATTCCTCGTAGTTTACCGGCTTTAATGCGTGCGCAAAAAATCCAGAAACGTTGCGCCAACGTTGGCTTCGATTGGACGACGCTTGGTCCGGTAGTCGATAAAGTCTACGAAGAGATCGACGAGGTGATGTACGAAGCGCGGCAGGCTGTTGTCGACCAGGCTAAACTGGAGGAGGAAATGGGGGACCTGCTGTTTGCCACGGTTAATCTGGCTCGCCATTTAGGGACGAAAGCAGAAATCGCATTGCAAAAAGCGAACGAAAAATTCGAGCGTCGTTTTCGCGAAGTGGAGCGTATTGTTGCCGCGCGTGGACTGGAAATGACAGGTGTTGACCTCGAAACAATGGAAGAAGTCTGGCAACAGGTAAAACGGCAGGAAATTGATCTCTAA
SEQ ID NO.6：核苷三磷酸焦磷酸水解酶基因nudG
ATGAAAATGATTGAAGTTGTTGCCGCCATCATTGAACGTGATGGCAAAATTTTACTCGCGCAACGCCCCGCCCAGAGCGATCAGGCGGGATTATGGGAGTTTGCCGGTGGTAAAGTCGAGCCGGATGAAAGTCAGCGGCAGGCGCTGGTGCGTGAGTTACGCGAAGAACTGGGCATCGAAGCAACTGTGGGTGAATATGTTGCCAGCCATCAGCGAGAAGTTTCGGGGCGGATTATCCATCTTCATGCCTGGCACGTACCCGACTTCCACGGGACGTTACAGGCACATGAACATCAGGCGCTGGTCTGGTGCTCACCTGAAGAGGCGCTGCAATATCCGCTGGCCCCTGCTGACATTCCATTATTAGAGGCGTTTATGGCTTTACGCGCCGCCAGACCAGCGGATTAG
SEQ ID NO.7：尿苷酸激酶基因pyrH(D90A)(基因突变位点用下划线标出)
ATGGAAAAACCAAAATACAAACGTATCGTATTAAAGCTTAGCGGGGAAGCATTGGCAGGAGAACAGGGAAATGGAATTAACCCGACTGTCATTCAATCCATTGCAAAGCAAGTGAAGGAAATCGCTGAGCTTGAAGTCGAAGTGGCTGTTGTTGTAGGCGGCGGCAACTTATGGCGCGGAAAAACAGGAAGTGACCTGGGCATGGACCGCGCGACTGCTGACTATATGGGAATGCTGGCGACAGTAATGAATTCGCTTGCTCTTCAAGCCAGCTTGGAAACACTCGGAATCCAGTCCAGAGTGCAAACATCCATTGAAATGAGACAAGTTGCTGAACCGTACATAAGAAGAAAAGCGATACGCCACTTAGAGAAAAAACGTGTCGTTATTTTCGCTGCGGGCACAGGAAACCCATATTTCTCAACTGATACGACAGCTGCACTGCGGGCTGCTGAAATTGAGGCAGACGTTATTTTAATGGCTAAAAATAACGTTGACGGTGTGTATAATGCTGATCCTAGAAAAGATGAATCAGCTGTTAAGTATGAATCACTTTCTTATCTTGACGTTCTTAAAGACGGCCTGGAAGTCATGGATTCAACAGCTTCCTCTTTATGCATGGACAATGACATTCCGCTTATCGTCTTTTCTATTATGGAAGAAGGAAATATCAAACGTGCCGTTATCGGTGAATCAATCGGAACGATCGTGAGGGGGAAATAA
SEQ ID NO.8：尿苷酸激酶的氨基酸序列(氨基酸突变位点用下划线标出)
MEKPKYKRIVLKLSGEALAGEQGNGINPTVIQSIAKQVKEIAELEVEVAVVVGGGNLWRGKTGSDLGMDRATADYMGMLATVMNSLALQASLETLGIQSRVQTSIEMRQVAEPYIRRKAIRHLEKKRVVIFAAGTGNPYFSTDTTAALRAAEIEADVILMAKNNVDGVYNADPRKDESAVKYESLSYLDVLKDGLEVMDSTASSLCMDNDIPLIVFSIMEEGNIKRAVIGESIGTIVRGK
SEQ ID NO.9：胞苷三磷酸合酶基因pyrG(E156K)(基因突变位点用下划线标出)
ATGACGAAATATATTTTTGTAACCGGGGGAGTTGTATCCTCACTTGGAAAGGGTATTGTAGCAGCTTCATTAGGGCGTTTGCTGAAAAACCGCGGACTGAACGTGACGATTCAAAAATTCGATCCATACATCAACGTTGACCCGGGAACAATGAGCCCGTACCAGCACGGTGAAGTATTCGTAACGGATGACGGCGCTGAAACAGACTTGGACCTTGGTCACTATGAGCGTTTTATCGACATTAACCTGAATAAATTCAGCAACGTGACAACAGGTAAAATCTATTCAACAGTTCTTAAAAAAGAACGCCGCGGAGATTACCTTGGAGGAACCGTACAGGTCATTCCGCACATCACAAACGAATTGAAAGACCGTGTTTACCGCGCAGGGAAAGAGACAAACGCAGATGTTGTCATTACAGAAATCGGCGGTACTGTCGGAGACATCGAATCACTGCCATTCCTTAAAGCGATCCGCCAAATGAAGAGCGACATCGGCCGTGAAAACGTAATGTACATCCACTGTACGCTCGTGCCTTACATTAAAGCTGCTGGCGAATTAAAAACAAAACCGACACAGCACAGCGTAAAAGAATTGCGCAGCTTGGGCATTCAGCCAAACATCATCGTCGTTCGTACAGAAATGCCGATTTCTCAAGATATGAAAGATAAAATCGCGCTTTTCTGCGACATCGATACAAAAGCGGTTATTGAATGTGAAGATGCGGACAACCTTTACTCCATTCCGCTGGAGCTTCAAAAACAAGGGCTTGATAAGCTTGTTTGCGAGCACATGAAATTGGCATGCAAAGAAGCGGAAATGTCCGAGTGGAAAGAGCTTGTTAACAAAGTCAGCAACCTGTCTCAAACGATTACAATCGGCCTTGTCGGCAAATACGTTGAGCTTCCTGACGCATACATTTCTGTTGTCGAGTCTCTCCGCCATGCGGGCTATGCGTTTGACACAGATGTAAAAGTGAAGTGGATCAACGCGGAAGAAGTGACAGAAAACAATATCGCAGAACTCACAAGCGGAACAGACGGCATCATTGTGCCGGGCGGATTCGGAGACCGCGGTGTTGAAGGGAAAATCGTCGCGACAAAATACGCGCGCGAAAACAACATTCCGTTCTTGGGCATTTGCTTGGGCATGCAGGTGGCGTCTATTGAATACGCACGAAACGTATTGGGCTTAAAAGGCGCTCACTCAGCGGAAATTGATCCGTCAACTCAATACCCGATCATTGATCTTCTTCCTGAACAAAAGGATGTTGAGGATCTTGGGGGAACGCTTCGTCTCGGCCTTTACCCTTGTAAGCTTGAAGAAGGCACGAAAGCCTTTGAAGTGTATCAGGATGAAGTGGTGTACGAGCGCCACCGCCACCGCTATGAGTTTAACAATGAATTCAGACAGCAAATGGAAGAGCAAGGCTTCGTATTCTCAGGCACAAGCCCTGATGGACGCCTTGTTGAAATCATCGAGCTGAAAGACCACCCTTGGTTCGTGGCTTCTCAGTTCCACCCAGAGTTCAAGTCAAGACCGACAAGACCTCAGCCTCTATTCAAAGGCTTTATCGGAGCGTCTGTCGAAGCTGCAAATCAGAAGTAA
SEQ ID NO.10：胞苷三磷酸合酶的氨基酸序列(氨基酸突变位点用下划线标出)
MTKYIFVTGGVVSSLGKGIVAASLGRLLKNRGLNVTIQKFDPYINVDPGTMSPYQHGEVFVTDDGAETDLDLGHYERFIDINLNKFSNVTTGKIYSTVLKKERRGDYLGGTVQVIPHITNELKDRVYRAGKETNADVVITEIGGTVGDIESLPFLKAIRQMKSDIGRENVMYIHCTLVPYIKAAGELKTKPTQHSVKELRSLGIQPNIIVVRTEMPISQDMKDKIALFCDIDTKAVIECEDADNLYSIPLELQKQGLDKLVCEHMKLACKEAEMSEWKELVNKVSNLSQTITIGLVGKYVELPDAYISVVESLRHAGYAFDTDVKVKWINAEEVTENNIAELTSGTDGIIVPGGFGDRGVEGKIVATKYARENNIPFLGICLGMQVASIEYARNVLGLKGAHSAEIDPSTQYPIIDLLPEQKDVEDLGGTLRLGLYPCKLEEGTKAFEVYQDEVVYERHRHRYEFNNEFRQQMEEQGFVFSGTSPDGRLVEIIELKDHPWFVASQFHPEFKSRPTRPQPLFKGFIGASVEAANQK
SEQ ID NO.11：核苷三磷酸还原酶基因nrdD
ATGACACCGCATGTGATGAAACGAGACGGCTGCAAAGTGCCGTTTAAATCAGAGCGCATCAAAGAAGCGATTCTGCGTGCAGCTAAAGCAGCGGAAGTCGATGATGCCGATTATTGCGCCACTGTTGCCGCGGTTGTCAGCGAGCAGATGCAGGGCCGCAACCAGGTGGATATCAATGAGATCCAGACCGCAGTTGAAAATCAGCTGATGTCAGGTCCATACAAACAACTGGCTCGTGCTTACATCGAGTACCGTCACGATCGCGACATTGAACGTGAAAAACGCGGTCGCCTGAACCAGGAGATCCGTGGTCTGGTCGAGCAGACCAACGCCTCGTTACTCAACGAAAACGCCAACAAAGACAGCAAGGTGATTCCAACCCAGCGCGACCTGCTGGCCGGGATCGTGGCTAAACACTATGCACGTCAGCACCTGCTGCCGCGTGACGTGGTGCAGGCACATGAGCGTGGCGATATTCACTATCACGATCTCGATTACTCACCGTTCTTCCCGATGTTCAACTGCATGTTGATCGACCTGAAAGGCATGCTGACCCAGGGCTTTAAAATGGGGAACGCCGAGATTGAACCGCCGAAGTCGATCTCTACGGCAACCGCGGTAACTGCGCAGATTATTGCTCAGGTTGCCAGCCATATTTATGGCGGCACCACCATTAACCGTATCGATGAAGTGCTGGCACCGTTTGTCACTGCCAGCTACAACAAACATCGCAAGACCGCAGAAGAGTGGAACATCCCGGACGCCGAAGGCTACGCTAACTCTCGAACCATCAAAGAGTGCTACGATGCCTTCCAGTCACTGGAGTACGAAGTAAACACCCTGCACACCGCCAACGGTCAGACGCCGTTTGTAACCTTTGGTTTTGGCCTGGGCACCAGCTGGGAATCGCGCCTGATTCAGGAATCGATCCTGCGTAACCGTATCGCAGGCCTCGGTAAAAACCGTAAAACTGCGGTGTTCCCGAAACTGGTGTTTGCGATTCGCGATGGCCTGAACCATAAAAAAGGCGATCCGAACTACGACATCAAACAGCTGGCGCTGGAGTGCGCAAGCAAGCGCATGTATCCGGATATCCTGAACTACGATCAGGTAGTGAAAGTCACCGGTTCGTTTAAAACTCCGATGGGCTGCCGCAGCTTCCTCGGCGTGTGGGAAAATGAAAACGGCGAGCAGATCCACGATGGTCGTAACAACCTCGGCGTGATCAGCCTGAACCTGCCGCGTATTGCTCTGGAAGCAAAAGGCGATGAAGCCACCTTCTGGAAGCTGCTGGATGAACGTCTGGTGCTGGCACGTAAGGCGCTGATGACCCGTATCGCTCGTCTCGAAGGCGTGAAAGCGCGCGTGGCCCCGATCCTCTATATGGAAGGTGCTTGTGGCGTGCGTCTCAATGCTGACGATGATGTTTCTGAAATCTTCAAAAACGGTCGTGCGTCTATTTCGCTGGGTTACATCGGCATCCACGAAACCATTAACGCGCTGTTCGGCGGCGAGCATGTTTACGACAACGAGCAGCTTCGCGCGAAAGGTATCGCCATTGTTGAACGTCTGCGTCAGGCAGTGGATCAGTGGAAAGAAGAAACGGGTTATGGTTTCAGTCTCTACAGCACGCCGAGTGAAAACCTGTGCGATCGCTTCTGCCGTCTCGATACTGCTGAGTTTGGCGTGGTGCCGGGCGTGACCGATAAAGGTTACTACACCAACAGTTTCCACCTCGATGTGGAGAAGAAGGTGAACCCGTACGACAAGATCGACTTTGAAGCGCCTTACCCGCCGCTGGCGAACGGTGGTTTCATTTGCTACGGCGAGTATCCAAACATTCAGCACAACCTGAAGGCGCTGGAAGATGTCTGGGATTACAGCTATCAGCATGTACCGTATTACGGCACCAATACACCGATTGATGAGTGCTACGAGTGTGGCTTTACCGGTGAGTTCGAGTGCACCAGCAAAGGCTTCACTTGCCCGAAATGTGGTAACCATGACGCCTCCCGTGTGTCGGTAACTCGCCGCGTGTGCGGATATTTAGGTAGCCCGGATGCACGTCCGTTTAACGCTGGTAAGCAGGAAGAAGTTAAGCGCCGCGTTAAACATTTGGGGAATGGGCAGATAGGTTAA
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (10)

1.一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成胞苷的基因工程菌，其特征在于：所述胞苷基因工程菌是在尿苷基因工程菌E.coli UR11的基础上，缺失了胞苷脱氨酶Cdd；缺失了嘧啶单磷酸核苷酶YgdH；缺失了胞苷酸激酶CmK；缺失了核苷三磷酸焦磷酸水解酶YhdE和MazG；过表达内源的核苷三磷酸焦磷酸水解酶NudG；过表达枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的尿苷酸激酶PyrH(D90A)；过表达枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的胞苷三磷酸合酶PyrG(E156K)；缺失了核苷三磷酸还原酶NrdD。
其中，所述Cdd的基因序列为SEQ ID NO.1，YgdH的基因序列为SEQ ID NO.2，CmK的基因序列为SEQ ID NO.3，YhdE的基因序列为SEQ ID NO.4，MazG的基因序列为SEQ ID NO.5，NudG的基因序列为SEQ ID NO.6，PyrH(D90A)的基因序列为SEQ ID NO.7，PyrG(E156K)的基因序列为SEQ ID NO.9，NrdD的基因序列为SEQ ID NO.11。
2.根据权利要求1所述的胞苷的基因工程菌，其特征在于：所述尿苷基因工程菌E.coliUR11是在E.coli W3110的基因组上整合了来源于B.subtilis A260的嘧啶核苷操纵子PyrBCAKDFE，由强启动子Ptrc控制；敲除尿苷激酶基因udk、尿苷磷酸化酶基因udp和核苷水解酶基因rihA、rihB和rihC；在基因组上对其自身PRPP合成酶基因prsA进行双拷贝，由强启动子Ptrc启动；敲除高丝氨酸脱氢酶基因thrA；敲除鸟氨酸氨甲酰转移酶基因argF。
3.如权利要求1或2所述的胞苷的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述方法是采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli UR11基因组进行定向改造。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：步骤如下：
(1)敲除胞苷脱氨酶基因cdd，cdd基因序列为SEQ ID NO.1；
(2)敲除嘧啶单磷酸核苷酶基因ygdH，ygdH基因序列为SEQ ID NO.2；
(3)敲除胞苷酸激酶基因cmK，cmK基因序列为SEQ ID NO.3；
(3)敲除核苷三磷酸焦磷酸酶基因yhdE，yhdE基因序列为SEQ ID NO.4；
(4)敲除核苷三磷酸焦磷酸酶基因mazG，mazG基因序列为SEQ ID NO.5；
(5)在假基因位点yeeP、mbhA、yjiT分别整合大肠杆菌内源的核苷三磷酸焦磷酸水解酶基因nudG，nudG基因序列为SEQ ID NO.6，由强启动子Ptrc控制；
(6)在胞苷脱氨酶基因位点cdd和假基因位点yghE分别整合枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的尿苷酸激酶基因pyrH(D90A)，cdd基因序列为SEQ ID NO.1，pyrH(D90A)基因序列为SEQID NO.7，由强启动子Ptrc控制，尿苷酸激酶氨基酸序列为SEQ ID NO.8；
(7)在胞苷酸激酶基因位点cmK、假基因位点ilvG分别整合枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的胞苷三磷酸合酶基因pyrG(E156K)，cmK基因序列为SEQ ID NO.3，pyrG(E156K)基因序列为SEQ ID NO.9，由强启动子Ptrc控制，胞苷三磷酸合酶氨基酸序列为SEQ ID NO.10；
(8)敲除核苷三磷酸还原酶基因nrdD，nrdD基因序列为SEQ ID NO.11。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述强启动子Ptrc的基因序列为SEQID NO.12；
所述Ptrc终止子的基因序列为SEQ ID NO.13。
6.如权利要求1或2所述的胞苷的基因工程菌在胞苷生产方面中的应用。
7.利用如权利要求1或2所述的胞苷的基因工程菌发酵生产胞苷的方法，其特征在于：所述方法通过反馈脉冲补料工艺来提高胞苷的产量。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：具体操作步骤如下：
取胞苷的基因工程菌的菌液，均匀涂布于活化斜面，并进行传代培养；将活化斜面上的菌株接种到种子培养基中，37℃培养8-10h，培养过程中通过补加氨水维持pH值在6.8-7.2；将种子液按照15-20％的接种量接入发酵培养基中，开始发酵培养；发酵起始pH值控制在6.8-7.2；发酵8-10h通过补加氨水维持pH值在6.4-6.7；发酵12h后开始采用反馈脉冲式补料策略补加葡萄糖，将溶解氧值控制在20％-35％；发酵24-26h采用联动反馈脉冲式补料策略同时补加葡萄糖和玉米浆，将溶解氧值控制在15％-30％；整个发酵过程中温度控制在37℃，发酵周期为40h，获得胞苷。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述活化斜面使用的斜面培养基为：葡萄糖1-2g/L，蛋白胨10-15g/L，牛肉膏10-15g/L，酵母粉5-8g/L，NaCl 2.5-5g/L，琼脂20g/L；
或者，所述种子培养基为：葡萄糖25-30g/L，KH2PO4 1.2-1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5-1.0g/L，酵母粉5-8g/L，FeSO4·7H2O 2.8-3.5mg/L，MnSO4·H2O 2.8-3.5mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1.3-2.5mg/L；
或者，所述发酵培养基为：葡萄糖20-25g/L，KH2PO4 2.5-5.0g/L，MgSO4·7H2O 1.2-2.0g/L，酵母粉4-8g/L，FeSO4·7H2O 80-90mg/L，MnSO4·H2O 80-90mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各2-4mg/L。
10.根据权利要求7至9任一项所述的方法，其特征在于：所述方法的胞苷产量为74-78g/L，糖苷转化率为30-35％。
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