CN114480461A - 生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物及构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生产β‑烟酰胺单核苷酸的重组微生物及其构建方法和应用,属于生物技术领域。本发明首次发现转运蛋白YihN、MdtH、MdtL、SetC或EmrD可作为转运β‑烟酰胺单核苷酸的关键酶,同时可用于提高β‑烟酰胺单核苷酸的产量。本发明利用包含上述转运蛋白的重组微生物生产β‑烟酰胺单核苷酸,产量更高,发酵周期短,生产强度高,可用于β‑烟酰胺单核苷酸的大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物及其构建方法和应用。
背景技术
烟酰胺单核苷酸(NMN,CAS:1094-61-7)是一种自然存在的生物活性核苷酸,是人体内固有的物质,也富含在一些水果和蔬菜中。NMN有α和β2种不规则存在形式,而β-异构体是NMN的活性形式,其分子式为C11H15N2O8P,分子量为334.22。在哺乳动物体内,β-烟酰胺单核苷酸由烟酰胺(Nicotinamide,Nam)在Nampt(烟酰胺磷酸核糖转移酶)的催化下生成,随后烟酰胺单核苷酸在烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的催化下生成NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)。烟酰胺单核苷酸是补充NAD+的关键前提物质之一。哺乳动物体内的NAD+经由细胞内的酶生成NMN和Nam,在NAD+供应不足时,细胞会重新利用NMN和Nam来合成NAD+。NMN在人体内通过转化为NAD+来发挥其生理功能,如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。此外,研究发现NMN对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用;且NMN还可参与或调节机体的内分泌,具有保护和修复胰岛的功能,从而增加胰岛素的分泌,防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病。因此,NMN在医药治疗以及功能食品方面有着广泛的应用前景。
NMN的体外制备方法包括化学合成,半酶法合成和全酶法合成,其中以化学合成为主。化学合成方法存在成本高、收率低而且化学试剂污染大等问题。例如,2002年,Tanimori等人用乙酰基保护的核糖与烟酰胺在TMSOTf的催化下发生缩合反应;2004年Palmarisa等人使用硅烷化试剂对烟酰胺进行硅烷化,然后与乙酰核糖在TMSOTf的催化下进行反应。半酶法合成是利用化学合成制备烟酰胺核糖,再利用烟酰胺核糖激酶和外源的ATP合成NMN。全酶法则是利用烟酰胺磷酸核糖转移酶以烟酰胺,磷酸核糖焦磷酸和ATP直接合成NMN。采用Nampt催化Nam生成NMN,不仅需要酶法合成磷酸核糖焦磷酸,整个合成中需要大量昂贵的ATP,而且由于现有的烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的酶活性较低,使得酶法反应存在耗时长、成本高、收率低等问题,难以实现工厂化大规模生产,因此限制了NMN的大规模应用。
生物发酵法生产NMN,主要是利用微生物菌株自身的生物合成途径来生产NMN,克服酶法生产中的限制因素,其优势在于以糖质为原料生产核苷酸类物质,符合食用习惯,生产成本低、效益高,特别是目前基因工程育种技术及高产优化控制技术的采用,使发酵法生产成本大大降低。例如,专利CN202110815270.8公开了一种利用发酵培养法制备NMN的方法,所述方法为通过培养酿酒酵母KH09制备烟酰胺单核苷酸。专利CN202010498732.3公开了一种生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物,并利用该重组微生物生产β-烟酰胺单核苷酸,重组微生物菌种含有一个或几个下列特征或全部特征,这些特征为:(1)在发酵培养基中添加烟酰胺经由重组微生物转化生成NMN;(2)过表达烟酰胺磷酸核糖转移酶;(3)重组微生物基因组上编码5’-脱氧核苷酸酶的基因缺失或者失活或者酶活降低。
尽管如此,由于发酵法是通过微生物自身合成途径获得高浓度的NMN,通过对发酵过程中的大量数据分析,发现当微生物细胞体内积累一定量的NMN后,对其自身的生长会受到不同程度的影响,造成菌代谢受限,产量无法近一步提高。因此,亟需找到一种能够解除细胞生长限制且易于操作,可应用于工业化生产NMN的方法。
发明内容
针对以上问题,本发明提供了一种生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物及其构建方法和应用。本发明通过表达转运蛋白从而获得高产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物,该重组微生物可用于NMN的高效工业化生产,达到绿色环保低成本的NMN生产。
术语:
1、NMN:如无特殊说明,本发明中的英文简称“NMN”指β-烟酰胺单核苷酸,其分子式为C11H15N2O8P,分子量334.22,结构式如下式(1)所示。
2、重组微生物:如无特殊说明,本发明中的中文名称“重组微生物”指经过人为处理后的微生物;所述的人为处理包括但不限于:基因敲除、基因抑制、基因沉默、基因插入、基因突变、外源表达或过表达基因等本领域所有可以实现基因操作的技术手段。
3、宿主菌:如无特殊说明,本发明中的中文名称“宿主菌”指待进行人为处理的微生物。
4、种子液:如无特殊说明,本发明中的中文名称“种子液”指经微生物经试管斜面活化、扁平或摇瓶培养或种子罐逐级扩大培养后,获得的含有一定微生物数量,活力、质量较优的微生物培养液。
5、高产:如无特殊说明,本发明中的“高产”指β-烟酰胺核糖产量高于亲本微生物。
6、低产:如无特殊说明,本发明中的“低产”指β-烟酰胺核糖产量低于亲本微生物。
7、外源表达或过表达:在相对于本发明使用时应被广义地认为包括在相同条件下与亲本微生物的一种或多种蛋白质(包括编码一种或多种蛋白质的一种或多种核酸)表达水平相比所述蛋白质表达(包括核酸表达)的任何增加。不应被认为意指所述蛋白质(或核酸)以任何具体水平表达。
8、亲本微生物:是本发明的微生物所来源于的微生物。本发明的微生物可以通过任何方法例如人工或天然选择、突变或基因重组而产生。亲本微生物可以是天然存在的微生物(即野生型微生物)或先前曾被修饰过但是不生产或不过度生产β-烟酰胺单核苷酸的微生物。
9、载体:应被广义地认为包括适合用作媒介将遗传物质转移到细胞中的任何核酸(包括DNA和RNA),包括质粒、病毒(包括噬菌体)、粘粒和人工染色体。载体可以包括一种或多种调节元件、复制起点、多克隆位点和/或可选择标记物。
10、关于蛋白和基因名称的约定:本发明中涉及的英文蛋白名称均为大写正体;本发明中涉及的英文基因名称均为小写斜体。
为了实现上述发明目的,本发明的技术方案如下:
一方面,本发明提供了一种转运蛋白或其编码基因在调节β-烟酰胺单核苷酸产量中的应用,所述的转运蛋白为YihN、MdtH、MdtL、SetC或EmrD中的一种或多种。
具体地,所述的转运蛋白为YihN或EmrD中的一种或多种。
具体地,所述转运蛋白的含量或活性降低,和/或,编码所述转运蛋白的基因缺失、失活或活力降低,以降低调节β-烟酰胺单核苷酸的产量;
或:所述转运蛋白的含量或活性提高,和/或,编码所述转运蛋白的基因增加、拷贝数或活力提高,以提高调节β-烟酰胺单核苷酸的产量。
另一方面,本发明提供了转运蛋白或其编码基因在制备高产或低产β-烟酰胺单核苷酸的微生物中的应用,所述的转运蛋白为YihN、MdtH、MdtL、SetC或EmrD中的一种或多种。
具体地,所述的转运蛋白为YihN或EmrD中的一种或多种。
又一方面,本发明提供了一种生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物,所述的重组微生物包括以下特征:
转运蛋白的含量或活性提高,和/或,编码所述转运蛋白的基因增加、拷贝数或活力提高。
具体地,所述的转运蛋白编码基因为yihN、mdtH、mdtL、setC或emrD中的一种或多种。
进一步具体地,所述的转运蛋白编码基因为yihN或emrD中的一种或多种。
具体地,所述的微生物包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、沙门氏菌(salmonella)和酵母菌(Yeast)。
又一方面,本发明还提供了上述重组微生物在生产β-烟酰胺单核苷酸中的应用。
又一方面,本发明提供了一种重组微生物大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SHD04K/pHD539,所述的重组微生物SHD04K/pHD539由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为:CGMCC No.23990。
具体地,本发明所述的重组微生物大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SHD04K/pHD539于2021年11月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏号为CGMCC No.23990。
又一方面,本发明提供了上述重组微生物大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SHD04K/pHD539在生产β-烟酰胺单核苷酸中的应用。
又一方面,本发明提供了一种生产β-烟酰胺单核苷酸的方法,所述的方法包括利用上述重组微生物发酵生产β-烟酰胺单核苷酸或利用上述重组微生物全细胞产物催化底物生产β-烟酰胺单核苷酸;所述的全细胞产物包括但不限于:培养液、细胞裂解液、细胞裂解液的上清部分、细胞裂解液的沉淀部分等。需要说明的是,在未来的技术发展中对于全细胞产物的操作方法及其具体产物类型的新增技术由于未脱离本发明的发明点,也应当在本发明的上述要求保护的范围之内。
具体地,所述的方法包括:
将上述重组微生物活化后制备种子液;
采用摇瓶发酵:按照1-5%接种量接种到发酵培养基中,37℃摇床250rpm培养3-4h,添加终浓度为1mM的IPTG,同时添加终浓度为300mg/L的底物烟酰胺(NAM),调节摇床温度至34℃,发酵周期为18-22h。
或采用发酵罐发酵:按照8-12%接种量接种到发酵培养基中,37℃培养,维持pH为6.9,溶氧为30-45%,当溶氧高于40%时,开始偶联补料,培养7-9h,OD600至10-30时,温度维持在37℃,加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG进行诱导,以0.3-0.5g/L·h-1的速率流加底物烟酰胺(NAM),发酵周期为40-48h。
进一步具体地,摇瓶发酵中,
所述的接种量为1%。
所述的发酵培养基成分为:每升培养基中葡萄糖20-40g,5N-5倍的盐溶液180-220mL,TM2溶液0.5-1.5mL,柠檬酸铁8-12mg,七水硫酸镁240-250mg,氯化钙105-115mg,硫胺素0.5-1.5μg,以无菌去离子水定容至1L;其中5N-5倍的盐溶液为十二水合磷酸氢二钠75.6g,磷酸二氢钾15g,氯化钠2.5g,氯化铵25g,以离子水定容至1L;TM3溶液为四水氯化锌2.0g,六水氯化钙2.0g,两水钼酸钠2.0g,五水硫酸铜1.9g,硼酸0.5g,盐酸100mL,去离子水定容至1L。
所述的发酵周期为20h。
进一步具体地,所述的发酵培养基成分为:每升培养基中葡萄糖30g,5N-5倍的盐溶液200mL,TM2溶液1mL,柠檬酸铁10mg,七水硫酸镁246mg,氯化钙111mg,硫胺素1μg,以无菌去离子水定容至1L。
进一步具体地,发酵罐发酵中,
所述的接种量为10%。
所述的发酵培养基为半合成培养基,每升培养基中含硫酸铵4-6g,氯化钠1-3g,磷酸二氢钾3-5g,七水硫酸镁1-3g,葡萄糖10-20g,氯化钙0.05-0.15g,氯化锌0.005-0.015g,TM3 0.5-1.5mL,柠檬酸铁90-100mg,玉米浆2-8g,VB12-3mg,NA 35-45mg,泡敌0.5-1.5g,以去离子水定容;补料培养基为每升含葡萄糖450-550g,调节pH至6.9;TM3溶液为每升含四水氯化锌2.0g,六水氯化钙2.0g,两水钼酸钠2.0g,五水硫酸铜1.9g,硼酸0.5g,盐酸100mL,去离子水定容至1L。
所述的发酵周期为43h。
进一步具体地,所述的发酵培养基为半合成培养基,每升培养基中含硫酸铵5g,氯化钠2g,磷酸二氢钾4g,七水硫酸镁2g,葡萄糖15g,氯化钙0.105g,氯化锌0.01g,TM3 1mL,柠檬酸铁94mg,玉米浆5g,VB1 2.5mg,NA 40mg,泡敌1g,以去离子水定容;补料培养基为每升含葡萄糖500g,调节pH至6.9。
与现有技术相比,本发明的积极和有益效果在于:
(1)本发明首次发现转运蛋白YihN、MdtH、MdtL、SetC或EmrD可作为转运β-烟酰胺单核苷酸的关键酶,同时可用于提高β-烟酰胺单核苷酸的产量。
(2)采用本发明所述的重组微生物生产β-烟酰胺单核苷酸,产量更高,发酵周期短,生产强度高,可用于β-烟酰胺单核苷酸的大规模工业化生产。
(3)本发明所提供的重组微生物的构建方法是一种定向的理性的菌种构建方法,相比传统诱变方法更为高效便捷,可操作性强。
保藏说明
分类命名:大肠埃希氏菌
拉丁名:Escherichia coli
参椐的生物材料:SHD04K/pHD539
保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称:CGMCC
保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期:2021年11月29日
保藏中心登记入册编号:CGMCC NO.23990。
附图说明
图1为大肠杆菌NMN的代谢路径示意图。
图2为NMN及各副产物检测的HPLC图谱。
图3为转运蛋白复筛结果图。
图4为5L发酵罐筛选转运蛋白NMN产量检测结果图。
图5为5L发酵罐筛选转运蛋白43h OD检测结果图。
图6为验证SHD04K/pHD539生长OD检测结果图。
图7为在不同宿主中验证yihN的检测结果图。
图8为在不同宿主中验证emrD的检测结果图。
其中:NA:烟酸;NR:β-烟酰胺核糖;NMN:β-烟酰胺单核苷酸;NAM:烟酰胺;Asp:天冬氨酸;QA:喹啉酸;NaMN:烟酸单核苷酸;NaAD:烟酸腺嘌呤二核苷酸;NAD:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸;PRPP:磷酸核糖焦磷酸;NadC:喹啉酸磷酸核糖基转移酶;NadA、NadB:核苷二磷酸还原酶;NadD:烟酸单核苷酸腺苷酸转移酶;NadR:烟酰胺核苷酸腺苷酸基转移酶;PncA:烟酰胺酶;PncB:烟酸磷酸核糖基转移酶;PncC:NMN脱酰胺酶;DeoD:嘌呤核苷磷酸化酶I;XapA:嘌呤核苷磷酸化酶II;Cdh:CDP-二酰基甘油二磷酸酶;AphA:磷酸转移酶;PhoA:碱性磷酸酶;YjjG:嘧啶核苷酸酶;YfdR:dCMP磷酸水解酶。
具体实施方式
下面结合具体实施例,对本发明作进一步详细的阐述,下述实施例不用于限制本发明,仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,下述实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
原理说明:NMN代谢路径
在微生物中,NAD+有三种合成途径:补救途径、从头合成途径和P-H途径(又叫烟酸补救途径)。
如图1所示,以大肠杆菌为例,其从头合成途径涉及三个主要的酶:喹啉酸磷酸核糖基转移酶(NadC,EC 2.4.2.19)、烟酸单核苷酸腺嘌呤基转移酶(NadD,EC 2.7.7.18)、NAD+合成酶(NadE,EC 6.3.1.5),NadC将来自磷酸核糖基焦磷酸的磷酸核糖基部分转移到喹啉酸氮并催化随后的中间体脱羧以产生烟酸单核苷酸(NaMN),NadD利用三磷酸腺苷(ATP)腺苷酸化NaMN,从而产生烟酸二核苷酸(NaAD),NadD还能够腺苷酸化NMN,但与使用NaMN作为底物时相比,具有较低的活力,NAD+生物合成的最后一步由NadE催化,NadE利用氨或谷氨酰胺作为氨基供体将NaAD酰胺化为NAD+。
除了从头合成途径外,NAD+还有多种补救途径,如NMN、烟酰胺核糖(NR)、烟酰胺(NAM)或烟酸(NA)补救途径:NMN是由烟酰胺(Nam)与磷酸核糖焦磷酸(PRPP)反应的产物,是NAD+补救合成途径的关键前体,在大肠杆菌中,NMN的流向主要有如下三种:第一种通过烟酰胺核苷酸酰胺酶(PncC ECK2695)的作用被降解为NaMN,进而进入NAD+的合成中;第二种利用方式为胞外NMN通过周质酸性磷酸酶(UshA ECK0474)被去磷酸化为烟酰胺核糖(NR),胞外NR通过NR转运体(PnuC ECK0740)被导入细胞,胞内NMN经由CDP-二酰基甘油二磷酸酶(Cdh ECK3910)、磷酸转移酶(Apha ECK4047)的作用去除NMN的侧链磷酸基团产生NR,进而通过烟酰胺核糖苷激酶(NadR,EC 2.7.1.22)被磷酸化成NMN或在可逆反应中通过嘌呤核苷磷酸化酶(DeoD ECK4376)被降解为底物Nam;第三种降解NMN的途径也是由nadR基因编码的烟酰胺核糖苷激酶起作用,将NMN进一步磷酸化到NAD+。
本发明还首次通过实验验证了转运蛋白YihN、MdtH、MdtL、SetC或EmrD可作为转运β-烟酰胺单核苷酸的关键酶,用于提高β-烟酰胺单核苷酸的产量。
实验方法1:基因敲除方法
本发明采用Datsenko的方法进行微生物基因敲除,大致步骤为基于Red重组系统,用具有36-nt同源延伸的引物通过PCR生成的可选择的抗生素耐药基因替换基因序列,从而达到基因敲除的目的。本发明所采用的具体基因敲除的方法记载于文献:K.A.Datsenko,B.L.Wanner.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proceedings of the National Academy Sciences of the USA,2000,97(12):6640-6645。相应的基因敲除引物见Baba2006.Mol Syst Biol,2(1)0008。本专利中用到的具体引物序列见表1。
表1基因敲除引物序列
实验方法2:摇瓶发酵验证重组菌株生产NMN的能力
1、试剂
(1)发酵培养基:每升培养基中葡萄糖30g,5N-5倍的盐溶液200mL,TM2溶液1mL,柠檬酸铁10mg,七水硫酸镁246mg,氯化钙111mg,硫胺素1μg,以无菌去离子水定容至1L。
其中5N-5倍的盐溶液为十二水合磷酸氢二钠每升75.6g,磷酸二氢钾每升15g,氯化钠每升2.5g,氯化铵25g,以离子水定容至1L;TM3溶液为四水氯化锌2.0g,六水氯化钙2.0g,两水钼酸钠2.0g,五水硫酸铜1.9g,硼酸0.5g,盐酸100mL,去离子水定容至1L。
上述溶液进行高压蒸汽灭菌,灭菌温度121℃,时间20-30min。
(2)LB培养基:每升培养基中含酵母粉5g,氯化钠10g,蛋白胨10g,去离子水定容至1L(著[美]J.莎姆布鲁克.黄培堂译,分子克隆指南2002,1595)。
上述溶液进行高压蒸汽灭菌,灭菌温度121℃,时间20-30min。
2、仪器:恒温摇床培养箱。
3、方法:
摇瓶发酵过程如下:(1)接种重组菌株至含有抗生素的4mL的LB培养基中,置37℃摇床250rpm培养;(2)取培养16h后的种子200μL转移至2mL含有抗生素的LB液体培养基,于37℃摇床250rpm培养4h;(3)将2mL二级种子全部转入装有18mL发酵培养基的摇瓶中,置37℃摇床中,250rpm培养3-4h;(4)添加IPTG至终浓度1mM后,同时添加底物烟酰胺(NAM)300mg/L,调节摇床温度至34℃,继续培养20h左右,取样进行HPLC检测,检测方法详见实验方法4。
实验方法3:发酵罐中重组菌株发酵生产NMN
1、试剂
(1)发酵培养基:为半合成培养基,每升培养基中含硫酸铵5g,氯化钠2g,磷酸二氢钾4g,七水硫酸镁2g,葡萄糖15g,氯化钙0.105g,氯化锌0.01g,TM31mL,柠檬酸铁94mg,玉米浆5g,VB1 2.5mg,NA 40mg,泡敌1g,以去离子水定容。
TM3溶液为四水氯化锌2.0g,六水氯化钙2.0g,两水钼酸钠2.0g,五水硫酸铜1.9g,硼酸0.5g,盐酸100mL,去离子水定容至1L。
(2)补料培养基:每升含葡萄糖500g,以氨水调节pH至6.9。
2、仪器
恒温摇床培养箱,发酵罐。
3、方法
发酵过程如下:(1)活化种子,从种子甘油管按接种量0.25%接入装有30mL LB的250mL摇瓶,37℃培养16h至OD600为3-4;(2)以接种量1%接种至装有100mL LB培养基的500mL种子摇瓶,37℃培养4h至OD600为1-2;(3)以接种量10%接种到装有2L半合成培养基的5L发酵罐中,37℃培养,用氨水调节pH为6.9,溶氧转速偶联,维持溶氧在30%,当溶氧高于40%时,开始偶联补料,使溶氧维持在30-45%。发酵8h至OD600为10-30时,温度维持在37℃,加入IPTG,使其终浓度为0.4mmol/L进行诱导,以0.3-0.5g/L·h-1的速率流加底物烟酰胺(NAM),发酵15h后开始取样进行HPLC检测,检测方法详见实验方法4。
实验方法4:HPLC测定发酵液中的NMN和相关副产物
精密吸取800μL发酵液(或者200μL反应液)加800μL乙腈,旋涡震荡5min,12000rpm离心2min,取上清液过0.22μm有机滤膜,HPLC检测。HPLC的参数如下:采用Agilent SB Aq4.6*150mm 5μm,流动相为甲醇和10mM乙酸铵(pH5.0),流动相比例0.01-4.4分钟甲醇比例维持在1%,流速0.8mL/min,4.4-5.4分钟甲醇比例由1%上升到7%,流速0.8mL/min,5.4-6.5分钟甲醇比例由7%上升到18%,流速1.2mL/min,6.5-6.6分钟甲醇比例由18%下降到2%,6.6-12分钟甲醇比例维持2%,流速1.2mL/min,利用紫外检测器检测波长260nm;发酵液的上样量2μL,柱温30℃。NMN出峰时间为2.348分钟,乳清酸出峰时间为2.471分钟,NR出峰时间为3.074分钟,NA出峰时间为3.915分钟,NAD出峰时间为8.347分钟,NAM出峰时间为10.505分钟。HPLC图谱如图2所示。
实施例1:验证NMN对细胞的毒性
本实验室在已构建的生产NMN的菌株SHD04K(以保藏号CGMCC No.19573的菌JN11K为基础,敲除了专利CN202010498732.3中所述的yjjG和yfdR基因,详细信息见表2)中转入表达质粒pHD03(质粒pEZ07-nadV-prs128,其中pEZ07同中国专利CN201510093004.3,在pEZ07载体上依次连接Acinetobacter baylyi sp.ADP1来源的nadV基因以及大肠自身来源的具有D128A点突变的prs基因),在5L发酵罐发酵43h后NMN产量约11g/L。
为进一步提高NMN的产量,在SHD04K基础上进行以下尝试:(1)在发酵培养基中分别添加50mg/L的肌苷、腺苷,以期通过提高ATP的供给进一步增加NMN产量,摇瓶发酵24h检测NMN产量仅150mg/L,为对照产量的一半(对照约300mg/L);(2)通过过表达核糖磷酸焦磷酸激酶基因prs128提高PRPP的供应,摇瓶产量200mg/L左右(对照约300mg/L);(3)敲除基因组上的可能会降解NMN至NR的核苷酸5'-单磷酸核苷酶编码基因ppnN,发酵产量与对照持平,并没有优势(对照约300mg/L)。通过进一步研究,从菌的自身特点考虑,发现NMN生产菌株在发酵罐上的表现与常规大肠杆菌发酵不同,它在整个发酵过程中,菌的生长OD一直偏低,发酵40h时OD仅为40-50,而一般大肠杆菌会达到100以上,由此怀疑产物NMN会对细胞造成损伤,导致菌的生长受限。
设计实验,在SHD04K/pHD03菌株生长过程中添加不同浓度NMN,监测生长OD。具体地,接种菌株SHD04K/pHD03于4mL LB(含100mg/L Spe抗性)中过夜培养,次日转接1%菌液于30mL含有不同浓度NMN的250mL摇瓶中,37℃培养,不同时间取样检测OD。结果见表3,在添加了30g/L NMN的摇瓶中菌的生长受到影响,70g/L NMN条件下,菌的生长OD值仅为2左右,与不添加NMN的对照比较下降了87%,表明在细胞的生长环境中若存在过多的NMN会对细胞产生毒性,导致菌的生长抑制,因此想要提高NMN的产量,解除NMN对细胞的毒害尤为重要。
表2质粒、菌株信息
表3 NMN对细胞生长的影响
NMN(g/L) | 22h OD | 46h OD | 71h OD | 143h OD |
30 | 10.4 | 9.5 | 10.9 | 11.1 |
50 | 7.3 | 6.9 | 4.8 | 4.1 |
70 | 2.1 | 2.1 | 2.2 | 2.7 |
0 | 15.5 | 15.2 | 15.2 | 14.5 |
实施例2:过表达膜蛋白转运基因解除细胞内NMN合成压力
由实施例1可知,细胞生长环境中过多的NMN会对细胞生长产生一定的副作用,推测是由于NMN在胞内和胞外的浓度偏差过大,导致合成代谢受到抑制,因此为了减缓生长合成压力,通过构建膜蛋白转运基因的表达质粒用以平衡细胞内外的NMN浓度,促进细胞生长从而提高NMN产量。
以大肠杆菌W3110基因组为模板,扩增110个转运蛋白基因,并将这些基因构建至现有生产NMN的表达质粒pHD03(pEZ07-nadV-prs128)上,最终将构建的表达质粒转化宿主SHD04K中,按照实验方法2中的方法进行摇瓶发酵,筛选能够提高NMN产量的转运蛋白。检测结果如下表4(初筛结果)所示。最终得到5个转运蛋白YihN、mdtH、mdtL、SetC、EmrD能明显提高NMN产量(图3为复筛结果,质粒信息见表2)。
表4
另外,质粒构建具体过程如下:以pHD539(pHD03-yihN)为例,以大肠杆菌W3110(ATCC27325)为模板,分别以引物yihN-F/yihN-R扩增yihN片段(引物序列见表5),得到的PCR产物大小为1300bp,且电泳检测无杂带,直接进行过柱回收纯化(捷瑞胶回收纯化试剂盒),得到的纯化片段与KpnI酶切回收的pHD03载体以纳摩尔比3:1进行无缝克隆构建(苏州神洲基因GBclonart无缝克隆试剂盒),重组克隆反应液于45℃水浴锅温浴30min,然后转移到冰上放置5min,转入TG1化转感受态细胞,42℃热击2min,冰浴2min后加入800μL复苏培养基LB,复苏培养1h后离心涂布含50mg/L壮观霉素抗性的LB平板,次日挑取克隆培养过夜,提取质粒进行酶切验证,最终构建得到质粒pHD539。
表5引物序列
实施例3:5L发酵罐产量验证
将摇瓶筛选到的YihN、mdtH、mdtL、SetC、EmrD转运蛋白表达质粒进行5L发酵罐验证,观察罐上的菌生长是否正常,NMN产量是否有提高。具体地,按照实验方法3中的方法进行5L发酵罐发酵,按照实验方法4的方法进行HPLC检测,发酵从15h开始取样检测,直至67h,期间NMN产量明显高于SHD04K/pHD03的菌株为SHD04K/pHD539(yihN),发酵43h时产量最高,达到26g/L,比对照产量提高了2.2倍;另外菌株SHD04K/pHD543(emrD)发酵43h产量也有6%的提高;表达mdtH、mdtL、setC的菌株虽然在摇瓶中有优势,但是放大到5L发酵罐后,产量和OD都不如对照(图4)。从检测结果看,发酵产量在43h时可以达到最高值,时间延长产量并没有提高,因此之后发酵罐发酵43h下罐。
另外,从菌的生长OD来看,表达了yihN和emrD的菌株,生长情况也优于对照(图5),表明这两个基因的表达确实能够协调胞内外NMN的相互转运从而降低渗透压,缓解NMN对细胞的毒性解除生长压力。
实施例4:验证YihN转运NMN的能力
为了验证转运蛋白YihN在发酵过程中是否能够完全解除NMN对细胞生长的抑制,将重组菌株SHD04K/pHD539按照实施例1中的方法,在250mL摇瓶中加入不同浓度的NMN,转接1%过夜生长的SHD04K/pHD539菌液于摇瓶中,以SHD04K/pHD03作为对照,检测24h OD。结果显示,表达了转运蛋白编码基因yihN后,生长OD有所提高,可部分解除NMN对细胞的抑制。但从图6可知,表达转运蛋白编码基因yihN后并没有完全达到不加NMN时的OD,说明yihN起到了一定的平衡胞内外渗透压的效果,但无法完全解除NMN对细胞的毒性。仍需要不断探索NMN生产菌株生长OD偏低的原因。
重组菌株SHD04K(W3110△ushA△cdh△pncC△nadR△pncA△aphA△phoA△nadC△yjjG△yfdR::KanFRT)带有pHD539(pEZ07-nadV-prs128-yihN)简写为菌株SHD04K/pHD539,其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli.),该菌株已于2021年11月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编:100101,保藏编号为CGMCC NO.23990。
实施例5:验证YihN、EmrD在不同宿主菌中的效果
为了进一步验证YihN、EmrD转运NMN的能力,将表达质粒pHD539(pEZ07-nadV-prs128-yihN)和pHD543(pEZ07-nadV-prs128-emrD)分别转化至不同的宿主菌中,验证转运蛋白基因yihN、emrD在NMN生产能力偏弱的菌株中是否也具有增加NMN产量的效果。
具体地,选择大肠杆菌BL21、W3110以及实验室构建的敲除了NAM、NMN降解基因的基础菌株JU01K(W3110△pncC::KanFRT)、JU02C(JU01△pncA::CmFRT))、JB01K(BL21△pncC::KanFRT)、JB02C(JB01△pncA::CmFRT),按照实验方法2进行摇瓶发酵,检测结果见图7、图8。
检测数据表明,无论在未做改造的野生菌株W3110、BL21中,还是在去除了NMN、NAM降解基因的宿主菌JU01K(W3110△pncC::KanFRT)、JU02C(JU01△pncA::CmFRT)、JB01K(BL21△pncC::KanFRT)、JB02C(JB01△pncA::CmFRT)中,表达了yihN、emrD后NMN产量都有一定程度的提高,且yihN过表达的效果优于emrD,表明即便在NMN生产能力偏弱的菌株中,转运蛋白YihN、EmrD也能够通过转运胞内外NMN提高产量。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
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Claims (10)
1.转运蛋白或其编码基因在调节β-烟酰胺单核苷酸产量中的应用,其特征在于:所述的转运蛋白为YihN、MdtH、MdtL、SetC或EmrD中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述的转运蛋白为YihN或EmrD中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:
所述转运蛋白的含量或活性降低,和/或,编码所述转运蛋白的基因缺失、失活或活力降低,以降低调节β-烟酰胺单核苷酸的产量;
或:所述转运蛋白的含量或活性提高,和/或,编码所述转运蛋白的基因增加、拷贝数或活力提高,以提高调节β-烟酰胺单核苷酸的产量。
4.转运蛋白或其编码基因在制备高产或低产β-烟酰胺单核苷酸的微生物中的应用,其特征在于:所述的转运蛋白为YihN、MdtH、MdtL、SetC或EmrD中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于:所述的转运蛋白为YihN或EmrD中的一种或多种。
6.一种生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物,其特征在于:所述的重组微生物包括以下特征:
转运蛋白的含量或活性提高,和/或,编码所述转运蛋白的基因增加、拷贝数或活力提高。
7.根据权利要求6所述的重组微生物,其特征在于:
所述的转运蛋白编码基因为yihN、mdtH、mdtL、setC或emrD中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的重组微生物,其特征在于:所述的转运蛋白编码基因为yihN或emrD中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的重组微生物,其特征在于:所述的微生物为大肠杆菌、芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、沙门氏菌或酵母菌。
10.一种生产β-烟酰胺单核苷酸的方法,其特征在于:所述的方法包括利用权利要求6-9任一项所述的重组微生物发酵生产β-烟酰胺单核苷酸或利用权利要求6-9任一项所述的重组微生物全细胞产物催化底物生产β-烟酰胺单核苷酸。
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