CN110996967A

CN110996967A - 使用烟酰胺单核苷酸进行治疗的组合物和方法

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Publication number: CN110996967A
Application number: CN201880051788.5A
Authority: CN
Inventors: 今井真一郎; A·格罗齐奥
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 2017-08-10
Filing date: 2018-08-10
Publication date: 2020-04-10
Also published as: EP3664813A4; TW201919647A; US11564936B2; US20200215087A1; KR20200041330A; WO2019032973A1; US20230338407A1; JP2020530460A; CA3071423A1; EP3664813A1; JP2023139082A

Abstract

描述了用于治疗年龄相关的病症和其他医学病症(诸如肌肉疾病、2型糖尿病和/或肥胖症)的多种方法和组合物。进一步描述了增强NMN的细胞摄取和刺激NAD+产生的方法。描述了多种哺乳动物细胞和哺乳动物细胞系，其包括包含编码Slc12a8蛋白的cDNA的那些。还公开了包含编码Slc12a8的核酸的基因治疗载体以及在Slc12a8基因中包含失活性突变的非人动物。还描述了筛选候选化合物以鉴定促进NMN转运的化合物的方法。

Description

使用烟酰胺单核苷酸进行治疗的组合物和方法

政府支持声明

本发明是在美国国家卫生研究院给予的AG047902和AG037457的政府支持下进行的。政府享有本发明的某些权利。

序列表引用

序列表为本公开的一部分，其包括包含本发明的引物、核苷酸和/或氨基酸序列的文本文件。序列表的主题通过引用整体并入本文。以计算机可读形式记录的信息与书面序列表相同。

技术领域

本公开涉及用于治疗年龄相关的病症和其他医学病症(诸如肌肉疾病、2型糖尿病和/或肥胖症)的多种方法和组合物。进一步描述了增强NMN的细胞摄取和刺激NAD+产生的方法。描述了多种哺乳动物细胞和哺乳动物细胞系，其包括包含编码Slc12a8蛋白的cDNA的那些。还公开了包含编码Slc12a8的核酸的基因治疗载体以及在Slc12a8基因中包含失活性突变的非人动物。还描述了筛选候选化合物以鉴定促进NMN转运的化合物的方法。

背景技术

NAD⁺是一种参与多种细胞氧化还原反应的通用且必不可少的辅酶。NAD⁺对于NAD⁺消耗酶的活性也是必需的，NAD⁺消耗酶包括NAD⁺依赖性蛋白质脱乙酰基酶的sirtuin家族、聚ADP-核糖聚合酶(PARP)和CD38/157NAD+水解酶/环状ADP-核糖合酶(Canto,C.,等人，Cell Metab.22,304,31-53,2015；Imai,S.和Guarente,L.,Trends in Cell Biology,24,306 464-471,2014。为了产生NAD⁺，哺乳动物利用各种前体，诸如色氨酸、烟酰胺和烟酸(也称为维生素B₃的两种形式)，以及包括烟酰胺核糖核苷(NR)和烟酰胺单核苷酸(NMN)的中间体。从烟酰胺开始的补救途径为哺乳动物中主要的NAD⁺生物合成途径(Garten,A.等人，Nat.Rev.Endocrinol.,11,535-546,2015.；Imai,S.,Curr.Pharm.Des.,15,20-28,2009。在这一途径中，烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)由烟酰胺和5'-磷酸核糖焦磷酸盐产生NMN。然后NMN与ATP一起被NMN腺苷酰基转移酶NMNAT1-3转化为NAD⁺。NAMPT反应的产物为NMN，一种关键的NAD⁺中间体。NAMPT为哺乳动物中限速NAD+生物合成酶。不受任何特定理论的束缚，认为NMN可用于预防和/或治疗各种疾病状况以及减轻年龄相关的生理衰退。然而，NMN转运机制一直存在争议。

Slc12a8最初由Gagnon,K.B.和Delpire,E鉴定(Am.J.Physiol.Cell Physiol.,304,C693-714,2013)。然而，Gagnon等人并未鉴定Slc12a8的功能。Kubo,Y.等人Exp.EyeRes.,124,17-23,2014)鉴定了Slc12a8作为精胺转运蛋白，但未公开其参与NMN转运。

发明内容

提供了对有此需要的受试者的年龄相关的病症进行治疗的多种方法。通常，该方法包含向受试者施用治疗有效量的烟酰胺单核苷酸(NMN)和至少一种其他化合物，该其他化合物选自由以下组成的群组：烟酸、戊四烟酯、生育酚烟酸酯、β-吡啶甲醇、烟酸肌醇酯、其任意酯、其任意药学上可接受的盐及其任意组合，并且其中年龄相关的病症包含至少一种选自由以下组成的群组的病症：胰岛素敏感性的丧失、胰岛素分泌的丧失、胰岛素作用和分泌的丧失、记忆功能的损伤、眼功能下降、视网膜变性、机能衰退及其任意组合。

其他方法涉及对有此需要的受试者的医学病症进行治疗。该方法包含向受试者施用治疗有效量的烟酰胺单核苷酸(NMN)和至少一种化合物，该化合物选自由以下组成的群组：烟酸、戊四烟酯、生育酚烟酸酯、β-吡啶甲醇、烟酸肌醇酯、其任意酯、其任意药学上可接受的盐及其任意组合，其中医学病症包含选自由以下组成的群组中的至少一种：肌肉疾病、2型糖尿病、肥胖症及其任意组合。

还提供了一种在有此需要的受试者中增强NMN的细胞摄取的方法。这些方法包含向受试者施用治疗有效量的化合物，该化合物选自由以下组成的群组：烟酸、戊四烟酯、生育酚烟酸酯、β-吡啶甲醇、烟酸肌醇酯、其任意酯、其任意药学上可接受的盐及其任意组合。

提供了一种在有此需要的受试者中刺激NAD+产生和/或增加NMN摄取到细胞中的方法。该方法包含向受试者施用治疗有效量的编码Slc12a8的核酸。

提供了一种基因治疗载体。该基因治疗载体包含编码Slc12a8的核酸。

提供了一种非人动物。该非人动物在Slc12a8基因中包含失活性突变。

提供了一种哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系。该哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系包含编码Slc12a8蛋白的cDNA。该cDNA包含编码SEQ ID NO:12(小鼠Slc12a8蛋白)、SEQ IDNO:13(小鼠Scl12a8变体A蛋白)、SEQ ID NO:14(小鼠Scl12a8变体B蛋白)或SEQ ID NO:15(人Slc12a8蛋白)的cDNA。

提供了另一种哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系。该哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系包含编码Slc12a8蛋白的cDNA。该cDNA包含编码一种与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14或SEQ ID NO:15具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少99％同一性的蛋白的cDNA。

还提供了另一种哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系。该哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系包含编码Slc12a8蛋白的cDNA。该cDNA包含与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)或Slc12a8人全长cDNA(SEQ ID NO:11)具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少99％或100％序列同一性的cDNA序列。

提供了另一种哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系。该细胞或细胞系包含编码Slc12a8蛋白的cDNA。该细胞或细胞系不包含胎盘来源的细胞。

提供了筛选候选化合物以鉴定调节NMN转运的化合物的方法。该方法包含(a)使候选化合物与表达NMN转运蛋白的细胞或包含NMN转运蛋白的蛋白脂质体接触；和(b)检测细胞中NMN转运蛋白表达或活性的变化或蛋白脂质体中NMN转运蛋白活性的变化。与候选化合物接触后，细胞中NMN转运蛋白表达或活性的变化或蛋白脂质体中NMN转运蛋白活性的变化表明：该候选化合物调节NMN的转运。

提供了一种药物组合物。该药物组合物包含NMN和NMN转运蛋白的激动剂。

提供了另一种药物组合物。该药物组合物包含NMN和Slc12a8或其同源物的基因表达的诱导剂。

附图说明

图1为用FK866处理的原代肝细胞、胰岛和海马神经球中通常上调的基因的维恩图(Venn diagram)。

图2显示了3月龄B6雄性小鼠不同组织中的Slc12a8 mRNA表达。

图3显示了用0.1％DMSO、单独的FK866或FK866加NMN处理的原代小鼠肝细胞、NIH3T3成纤维细胞以及空肠和回肠的离体外植体中的Slc12a8 mRNA表达的变化。

图4显示了用DMSO、单独的FK866和FK866加NMN处理的原代小鼠肝细胞和NIH3T3成纤维细胞中的胞内NAD+含量。

图5显示了在用FK866以及FK866加NMN处理48小时的NIH3T3细胞中测量的表面和细胞内的Slc12a8蛋白表达水平的流式细胞术数据。

图6显示了用下文详述的NMN途径抑制剂处理的原代小鼠肝细胞中外源性NMN摄取的时间过程。

图7显示了在原代小鼠肝细胞中Slc12a8和Nrk1 mRNA沉默的敲低效率。

图8显示了通过HPLC测量的经历Slc12a8和Nrk1 mRNA沉默的细胞的细胞内NMN含量。

图9显示了Slc12a8蛋白表达，其通过对照和Slc12a8-OE NIH3T3细胞的质膜级分的SDS-PAGE揭示。

图10显示了标准化为对照和Slc12a8-OE NIH3T3细胞的窖蛋白-1(caveolin-1)蛋白水平的Slc12a8蛋白水平。

图11显示了在Slc12a8过表达和对照NIH3T3细胞中³H-NMN的细胞内摄取。

图12显示了通过绘制细胞外NMN对细胞内³H-NMN摄取的图计算米曼氏(Michaelis-Menten)动力学。

图13显示了来源于Slc12a8-OE细胞或对照细胞的蛋白脂质体的³H-NMN摄取。

图14显示了³H-NMN针对冷NAD⁺相关化合物的置换以测定Slc12a8的底物特异性。

图15显示了使用蛋白脂质体系统测定NMN和NR的IC₅₀。

图16显示了用Li⁺代替Na⁺对蛋白脂质体对³H-NMN摄取的影响。

图17显示了萤火虫荧光素酶(fLuc)shRNA和Slc12a8 shRNA感染的小鼠空肠和回肠组织样品的代表性蛋白质印迹。

图18显示了萤火虫萤光素酶(fLuc)shRNA和Slc12a8 shRNA感染的小鼠空肠和回肠组织样品的柱状图，其中表达水平已相对于GAPDH进行了标准化。

图19显示了在对照和Slc12a8敲低小鼠中口服管饲NMN后60分钟内通过HPLC测量的小鼠体内血浆NMN水平。

图20显示了在对照和Slc12a8敲低小鼠中口服管饲NMN后60分钟内通过HPLC测量的小鼠体内血浆烟酰胺水平。

图21显示了在对照和Slc12a8敲低小鼠中通过口服管饲法给药NMN后60分钟收集的空肠组织样品中NAD浓度。

图22显示了对照小鼠与Slc12a8敲除小鼠中不同组织中的Slc12a8 mRNA表达。

图23通过蛋白质印迹显示了Slc12a8敲除小鼠的十二指肠、空肠、回肠和胰腺中不存在Slc12a8蛋白。

图24通过蛋白质印迹显示了在Slc12a8敲除小鼠的下丘脑中不存在Slc12a8蛋白。

图25A-B显示了在一天的光亮和黑暗时间期间从Slc12a8敲除小鼠收集的各种组织样品中的NAD+水平。

图26显示了在SLc12a8敲除小鼠及其野生型同窝出生小鼠中通过管饲法给药后¹⁸O-D-NMN的摄取。

图27显示了与其野生型同窝出生小鼠相比，Slc12a8敲除小鼠的食物摄入量。

图28显示了与其野生型同窝出生小鼠相比，Slc12a8敲除小鼠的脂肪与瘦肉的质量百分比。

图29显示了与其野生型同窝出生小鼠相比，Slc12a8敲除小鼠的粪便脂质含量。

图30显示了与其野生型同窝出生小鼠相比，Slc12a8敲除小鼠的耗氧量。

图31显示了与其野生型同窝出生小鼠相比，Slc12a8敲除小鼠的能量消耗。

图32显示了与其野生型同窝出生小鼠相比，Slc12a8敲除小鼠的移动计数。

图33显示了与其野生型同窝出生小鼠相比，Slc12a8敲除小鼠的呼吸交换比更低。

图34显示了与其野生型同窝出生小鼠相比，Slc12a8敲除小鼠的葡萄糖水平。

图35显示了与其野生型同窝出生小鼠相比，Slc12a8敲除小鼠的胰岛素水平。

图36显示了与其野生型同窝出生小鼠相比，Slc12a8敲除小鼠的甘油三酯水平。

图37显示了与其野生型同窝出生小鼠相比，Slc12a8敲除小鼠在禁食和再喂养条件下的GLP-2血浆水平。

图38显示了与其野生型同窝出生小鼠相比，Slc12a8敲除小鼠的弓形核中Chop和Socs3的相对mRNA表达。

图39显示了与其野生型同窝出生小鼠相比，随意喂养的Slc12a8敲除小鼠肝脏中Pepck和G6pc的表达。

图40显示了与其野生型同窝出生小鼠相比，Slc12a8敲除小鼠中的PMCH mRNA表达。

图41显示了在具有或不具有Slc12a8过表达构建体的NIH3T3细胞中NAD⁺生物合成的抑制剂的作用。

图42显示了烟酸(NA)增强了³H-标记的NMN(³H-NMN)摄取到含Slc12a8的蛋白脂质体中。

图43显示了相对于2月龄小鼠，24月龄小鼠的空肠和回肠中NAD⁺水平降低。

图44显示了在2月龄和24月龄小鼠的空肠和回肠中的Slc12a8表达。

图45显示了2月龄和24月龄的肠Slc12a8敲低小鼠的4天食物摄入量。

图46显示了在肠道中有或无Slc12a8敲低的2月龄和24月龄的小鼠的空腹葡萄糖水平。

图47显示了24小时禁食后再喂养对Slc12a8和对照小鼠中GLP-1水平的影响。

图48显示了2月龄的肠Slc12a8敲低小鼠和对照小鼠的回肠裂解物中Slc12a8和GAPDH的蛋白质印迹。

图49显示了24月龄肠道Slc12a8基因敲低小鼠和对照小鼠的回肠裂解物中Slc12a8和GAPDH的蛋白质印迹。

图50显示了2月龄或24月龄的肠Slc12a8敲低小鼠和对照小鼠的回肠中NAD+水平。

图51显示了来自24月龄的肠Slc12a8敲低小鼠和对照小鼠的离体外植体的GLP-1水平上清液的ELISA。

图52显示了12月龄的Slc12a8敲除小鼠和对照小鼠的外植体中GLP-1水平(左)和样品中NAD+水平(右)。

图53显示了用SIRT家族抑制剂或对照处理的外植体中GLP-1水平。

具体实施方式

本文公开了增强NMN摄取到细胞中的方法。还公开了用于研究Slc12a8及其NMN转运的细胞系。本发明人还鉴定了一种增强NMN摄取到细胞中的转运蛋白，Slc12a8。

本文公开的方法可用于治疗、改善、减轻或逆转涉及NMN代谢的任何疾病或病症，例如，但不限于，II型糖尿病、肥胖症、年龄相关的肥胖症、年龄相关的血脂水平升高、年龄相关的胰岛素敏感性的降低、年龄相关的记忆功能的丧失或降低、年龄相关的眼功能的丧失或降低、年龄相关的生理衰退、葡萄糖刺激的胰岛素分泌的损伤、糖尿病，改善阿尔茨海默病中线粒体功能、神经死亡和/或认知功能，保护心脏免受缺血/再灌注损伤，维持神经干/祖细胞群，恢复损伤后骨骼肌线粒体功能和动脉功能以及年龄相关的功能下降。

本发明包括，但不限于：

1.一种哺乳动物Slc12a8 mRNA(诸如小鼠Slc12a8 mRNA或人Slc12a8 mRNA)的全长cDNA。

2.一种编码小鼠Slc12a8多肽或人Slc12a8多肽的cDNA。

3.一种哺乳动物表达载体，其包含Slc12a8 cDNA，诸如全长Slc12a8 cDNA。

4.一种携带Slc12a8 cDNA的细胞系(诸如NIH3T3细胞系)，包括过表达Slc12a8cDNA(诸如全长小鼠Slc12a8 cDNA(Slc12a8-OE细胞)或全长人Slc12a8 cDNA)的细胞系。

5.一种携带shRNA的慢病毒，其减少或沉默Slc12a8 mRNA的表达。

6.一种多克隆抗体，其包括兔多克隆抗体，其针对Slc12a8蛋白(诸如小鼠Slc12a8蛋白或人Slc12a8蛋白)的N端和内部结构域。

7.一种全身Slc12a8敲除小鼠。

本发明包括蛋白脂质体系统，其包含脂质体，所述脂质体具有嵌入在膜双层中的转运蛋白(诸如Slc12a8蛋白)。这种系统可用于分析Slc12a8蛋白的性质，并用于测试候选药物对Slc12a8的亲和力或作为Slc12a8活性的激动剂或拮抗剂的活性。

本发明包括促进细胞、组织和器官(诸如肠道)中NMN摄取的方法。这些方法可以包括向肠道施用Slc12a8的cDNA。这些方法可以包括向肠道施用包含编码Slc12a8的cDNA的慢病毒。

促进NMN摄取的方法可包括联合施用NMN和钠盐。例如，该施用可以为口服施用。

本发明包括向有此需要的受试者施用烟酸(NA)或NA衍生物化合物(即NA的结构类似物)以增强NMN摄取。本发明包括施用烟酸(NA)或NA衍生物化合物(即NA的结构类似物)以增强有此需要的受试者中Slc12a8 NMN转运蛋白的NMN摄取功能。烟酸(NA)或NA衍生化合物可以以，例如，但不限于，10至500mg/天或50至500mg/天(对于NA或NA衍生物化合物)的剂量范围施用于有此需要的受试者。该施用可以为口服施用、肠胃外施用或其任意组合。

本发明包括将NA或NA衍生物化合物与NMN组合施用以促进或利于有此需要的受试者中NMN的摄取，这可以通过增强Slc12a8 NMN转运蛋白的NMN摄取功能来实现。对于NMN和NA或NA衍生化合物中的每一种，这种组合可以以，例如，但不限于，10至500mg/天或50至500mg/天的剂量范围施用于有此需要的受试者。该施用可以为口服施用、肠胃外施用或其组合。

本发明包括施用NMN和一些盐(例如，Na+)的组合以促进有此需要的受试者中NMN的摄取。该组合可以为口服给药的组合。该组合可以为肠胃外给药的组合。NMN和NMN摄取促进盐(诸如钠盐)可以各自以，例如，但不限于，10至500mg/天或50至500mg/天的剂量范围施用。

本发明可以包括施用NMN、钠盐以及烟酸(NA)或NA衍生物化合物的组合以促进有此需要的受试者中NMN的摄取。NMN、钠盐以及烟酸(NA)或NA衍生物化合物中的一种或任意组合可以口服施用。该施用可以包含口服NMN、钠盐以及烟酸(NA)或NA衍生物化合物的任意或全部。NMN、钠盐以及烟酸(NA)或NA衍生物化合物可以各自以，例如，但不限于，10至500mg/天或50至500mg/天的剂量范围施用于有此需要的受试者。

本发明还包括施用烟酰胺核糖(NR)或NR衍生化合物以在有此需要的受试者中抑制Slc12a8 NMN转运蛋白的NMN摄取功能。该烟酰胺核苷(NR)或NR衍生物化合物可以口服施用。该NR或NR衍生化合物可以以，例如，但不限于，10至500mg/天或50至500mg/天的剂量范围施用于有此需要的受试者。

本发明还包括施用非钠盐(诸如锂盐)以在有此需要的受试者中抑制Slc12a8 NMN转运蛋白的NMN摄取功能。该非钠盐可以口服施用。该非钠盐可以以，例如，但不限于，10至500mg/天或50至500mg/天的剂量范围施用于有此需要的受试者。

本发明包括将烟酰胺核糖核糖(NR)或NR衍生化合物与非钠盐(诸如，例如锂盐)组合施用，以在有此需要的受试者中抑制Slc12a8 NMN转运蛋白的NMN摄取功能。该NR或NR衍生化合物和/或非钠盐可口服施用。该NR或NR衍生化合物和非钠盐可以各自以，例如，但不限于，10至500mg/天或50至500mg/天的剂量范围施用于有此需要的受试者。

本发明公开了在受试者中刺激NAD+产生的方法。该方法可以包含向有此需要的受试者施用包含基因组DNA或编码Slc12a8的cDNA的核酸。该核酸可以是或可以包含慢病毒，该慢病毒包含基因组DNA或编码Slc12a8的cDNA，例如，但不限于，具有NM_134251(SEQ IDNO:1)、Slc12a8小鼠变体A(SEQ ID NO:9)、Slc12a8小鼠变体B(SEQ ID NO:10)或Slc12a8人全长cDNA(SEQ ID NO:11)所示序列的cDNA。受试者可以为哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或人)。编码Slc12a8的cDNA可以为与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)具有至少70％序列同一性、与Slc12a8小鼠变体A(SEQ ID NO:9)具有至少70％序列同一性、与Slc12a8小鼠变体B(SEQ ID NO:10)具有至少70％序列同一性或与Slc12a8人全长cDNA(SEQID NO:11)具有至少70％序列同一性的序列。编码Slc12a8的cDNA可以为GenBank参比序列NM_134251的序列，或者可以与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

编码Slc12a8的cDNA可以为SEQ ID NO:9的序列，或可以与SEQ ID NO:9具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

编码Slc12a8的cDNA可以为SEQ ID NO:10所示的Slc12a8小鼠变体b的序列，或者可以与Slc12a8小鼠变体b(SEQ ID NO:10)具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

编码Slc12a8的cDNA可以为SEQ ID NO:11所示的Slc12a8人全长序列，或可以与Slc12a8人全长序列(SEQ ID NO:11)具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

本发明包括在受试者中促进或增加NMN摄取到细胞中的方法。该方法可以包括向有此需要的受试者施用一种核酸，该核酸包含编码Slc12a8的cDNA或与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)、Slc12a8小鼠变体A(SEQ ID NO:9)、Slc12a8小鼠变体B(SEQ IDNO:10)或Slc12a8人全长cDNA(SEQ ID NO:11)具有至少70％序列同一性的序列。与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)具有至少70％序列同一性的序列可以与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)具有至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。与Slc12a8小鼠变体a(SEQ ID NO:9)具有至少70％序列同一性的序列可以与Slc12a8小鼠变体a(SEQ ID NO:9)具有至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。与Slc12a8小鼠变体b(SEQ ID NO:10)具有至少70％序列同一性的序列可以与Slc12a8小鼠变体b(SEQ ID NO:10)具有至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。与Slc12a8全长人cDNA(SEQ ID NO:11)具有至少70％序列同一性的序列可以与Slc12a8全长人cDNA(SEQ ID NO:11)具有至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。该cDNA可以施用于肠道。该施用可以包括通过管饲法施用。这一施用可以包含设计成在小肠中溶解的口服药物。

本发明包括在Slc12a8基因中包含缺失的敲除小鼠。该缺失可以为Slc12a8基因的完全缺失或Slc12a8基因的部分缺失，诸如，例如，但不限于，Slc12a8基因外显子4的缺失或Slc12a8基因外显子4内的缺失。

本发明包括一种哺乳动物细胞系，其包含Slc12a8基因或cDNA的导入序列，如GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)、Slc12a8小鼠变体A(SEQ ID NO:9)、Slc12a8小鼠变体B(SEQ ID NO:10)或Slc12a8人全长cDNA(SEQ ID NO:11)所示的序列。引入的Slc12a8基因或cDNA可以是外源来源的，或者可以与宿主哺乳动物细胞系物种相同。该哺乳动物细胞系可以以比未引入Slc12a8基因或cDNA的亲代细胞系高的水平表达Slc12a8多肽。

本发明包括一种哺乳动物细胞系，其包含非天然存在的序列，即通过转化或转染引入细胞系的序列，并且与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)、Slc12a8小鼠变体A(SEQ ID NO:9)、Slc12a8小鼠变体B(SEQ ID NO:10)或Slc12a8人全长cDNA(SEQ ID NO:11)具有至少70％的序列同一性。与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)具有至少70％序列同一性的序列可以与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)具有至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。与Slc12a8小鼠变体a(SEQ ID NO:9)具有至少70％序列同一性的序列可以与Slc12a8小鼠变体a(SEQ ID NO:9)具有至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。与Slc12a8小鼠变体b(SEQ ID NO:10)具有至少70％序列同一性的序列可以与Slc12a8小鼠变体b(SEQ ID NO:10)具有至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。与Slc12a8全长人cDNA(SEQ ID NO:11)具有至少70％序列同一性的序列可以与Slc12a8全长人cDNA(SEQ ID NO:11)具有至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

本发明包括一种哺乳动物细胞系，其包含Slc12a8序列，诸如GenBank参比序列：NM_134251(SEQ ID NO:1)、Slc12a8小鼠变体A(SEQ ID NO:9)、Slc12a8小鼠变体B(SEQ IDNO:10)或Slc12a8人全长cDNA(SEQ ID NO:11)。本发明的细胞系的Slc12a8序列对于宿主细胞可以是异源来源的。

本发明的细胞系可以包含Slc12a8序列，其可以为与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)、Slc12a8小鼠变体A(SEQ ID NO:9)、Slc12a8小鼠变体B(SEQ ID NO:10)或Slc12a8人全长cDNA(SEQ ID NO:11)具有至少70％序列同一性的序列。该序列可以为编码Slc12a8的基因组或cDNA的序列。编码本发明的细胞系的Slc12a8的基因组或cDNA对于宿主细胞可以是异源来源的。该包含编码Slc12a8的序列的细胞系还可以包含与编码Slc12a8的序列可操作地连接的启动子。该细胞系可以为哺乳动物细胞系。该哺乳动物细胞系可以缺乏CD73活性，可以缺乏CD38活性或可以缺乏CD73活性和CD38活性。该哺乳动物细胞系可以为NIH3T3细胞系。该哺乳动物细胞系可以为稳定转化的细胞系，其包含与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)、Slc12a8小鼠变体A(SEQ ID NO:9)、Slc12a8小鼠变体B(SEQ IDNO:10)或Slc12a8人全长cDNA(SEQ ID NO:11)具有至少70％序列同一性的序列。与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)具有至少70％序列同一性的序列可以与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)具有至少71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。可以用与GenBank参比序列NM_134251(SEQ IDNO:1)具有至少70％序列同一性的序列瞬时转染该哺乳动物细胞系。与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)具有至少70％序列同一性的序列可以与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)具有至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。该哺乳动物细胞系可以为小鼠细胞系、大鼠细胞系或人细胞系。该哺乳动物细胞系可以选自由以下组成的群组：小鼠细胞系和大鼠细胞系。该哺乳动物细胞系可以为人细胞系。与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)、Slc12a8小鼠变体A(SEQ ID NO:9)、Slc12a8小鼠变体B(SEQ ID NO:10)或Slc12a8人全长cDNA(SEQID NO:11)具有至少70％序列同一性的序列可以为全长Slc12a8 cDNA。

本发明的方法可以包含一种在有此需要的受试者中增强NMN的细胞摄取的方法。这些方法可以包含向有此需要的受试者施用治疗有效量的烟酸或其酯或药学上可接受的盐。该烟酸的酯或其药学上可接受的盐可以为以下结构

或其药学上可接受的盐，其中R可以选自由以下组成的群组：H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基、正辛基、2-氯乙基、2-羟基乙基、3-羟基丙基、2-甲氧基乙基、2-丁氧基乙基、氨基甲酰基甲基、1-氨基甲酰基乙基、2-二甲基氨基乙基、3-氨基丙基、四氢糠基、苄基、苯氧基乙基、对氯苯基和对硝基苯基。R可以为H、2-二甲基氨基乙基、对氯苯基或对硝基苯基。R可以选自由以下组成的群组：H、2-二甲基氨基乙基、对氯苯基和对硝基苯基。R可以选自由以下组成的群组：2-二甲基氨基乙基、对氯苯基和对硝基苯基。R可以选自由以下组成的群组：H、C₁-C₆直链烷基、C₃-C₆支链烷基、C₃-C₆环烷基、C₁-C₆直链烷氧基、C₃-C₆支链烷氧基和C₃-C₆环烷氧基。R可以选自由以下组成的群组：H、C₁-C₆直链烷氧基、C₃-C₆支链烷氧基、C₃-C₆环烷氧基、C₁-C₆直链卤代烷氧基、C₃-C₆支链卤代烷氧基、C₃-C₆环卤代烷氧基、C₁-C₆直链羟基烷氧基、C₃-C₆支链羟基烷氧基、C₃-C₆环羟基烷氧基、烷氧基甲基、烷氧基乙基、烷氧基烷氧基甲基、烷氧基烷氧基乙基、苄基、烷氧基苄基、萘基和烷氧基萘基。

R可以选自由以下组成的群组：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基、正辛基、2-氯乙基、2-羟基乙基、3-羟基丙基、2-甲氧基乙基、2-丁氧基乙基、氨基甲酰基甲基、1-氨基甲酰基乙基、2-二甲基氨基乙基、3-氨基丙基、四氢糠基、苄基、苯氧基乙基、对氯苯基和对硝基苯基。R可以为2-二甲基氨基乙基、对氯苯基或对硝基苯基。R可以选自由以下组成的群组：2-二甲基氨基乙基、对氯苯基和对硝基苯基。R可以选自由以下组成的群组：2-二甲基氨基乙基、对氯苯基和对硝基苯基。R可以选自由以下组成的群组：C₁-C₆直链烷基、C₃-C₆支链烷基、C₃-C₆环烷基、C₁-C₆直链烷氧基、C₃-C₆支链烷氧基和C₃-C₆环烷氧基。R可以选自由以下组成的群组：C₁-C₆直链烷氧基、C₃-C₆支链烷氧基、C₃-C₆环烷氧基、C₁-C₆直链卤代烷氧基、C₃-C₆支链卤代烷氧基、C₃-C₆环卤代烷氧基、C₁-C₆直链羟基烷氧基、C₃-C₆支链羟基烷氧基、C₃-C₆环羟基烷氧基、烷氧基甲基、烷氧基乙基、烷氧基烷氧基甲基、烷氧基烷氧基乙基、苄基、烷氧基苄基、萘基和烷氧基萘基。

本发明包括在有此需要的受试者中增强NMN的细胞摄取的方法。这些方法可以包含向受试者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物可以为烟酸

戊四烟酯、生育酚烟酸酯、β-吡啶甲醇或烟酸肌醇酯。该化合物可以选自由以下组成的群组：烟酸、戊四烟酯、生育酚烟酸酯、β-吡啶甲醇或烟酸肌醇酯。该化合物或其药学上可接受的盐可以为烟酸或其药学上可接受的盐。施用可以包含每天施用50至500mg烟酸或其药学上可接受的盐。施用可以包含每天施用50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495或500mg烟酸或其药学上可接受的盐。施用可以包含每天施用50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、85-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-105、105-110、110-115、115-120、120-125、125-130、130-135、135-140、140-145、145-150、150-155、155-160、160-165、165-170、170-175、175-180、180-185、185-190、190-195、195-200、200-205、205-210、210-215、215-220、220-225、225-230、230-235、235-240、240-245、245-250、250-255、255-260、260-265、265-270、270-275、275-280、280-285、285-290、290-295、295-300、300-305、305-310、310-315、315-320、320-325、325-330、330-335、335-340、340-345、345-350、350-355、355-360、360-365、365-370、370-375、375-380、380-385、385-390、390-395、395-400、400-405、405-410、410-415、415-420、420-425、425-430、430-435、435-440、440-445、445-450、450-455、455-460、460-465、465-470、470-475、475-480、480-485、485-490、490-495或495-500mg烟酸或其药学上可接受的盐。施用可以包含每天施用50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、260-270、270-280、280-290、290-300、300-310、310-320、320-330、330-340、340-350、350-360、360-370、370-380、380-390、390-400、400-410、410-420、420-430、430-440、440-450、450-460、460-470、470-480、480-490、490-500mg烟酸或其药学上可接受的盐。施用化合物或其药学上可接受的盐可以包含施用化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的赋形剂。

本发明包括对有此需要的受试者的年龄相关的胰岛素敏感性和/或胰岛素分泌的丧失进行中治疗、改善、减少、预防或逆转的方法。该对有此需要的受试者的年龄相关的胰岛素敏感性的丧失进行治疗、改善、减少、预防或逆转的方法可以包含施用有效量的NMN或其药学上可接受的盐，以及有效量的烟酸或其药学上可接受的盐、戊四烟酯或其药学上可接受的盐、生育酚烟酸酯或其药学上可接受的盐中或β-吡啶甲醇、烟酸肌醇酯或其药学上可接受的盐中的至少一种。该对有此需要的受试者的年龄相关的胰岛素分泌的丧失进行治疗、改善、减少、预防或逆转的方法可以包含施用有效量的NMN或其药学上可接受的盐，以及有效量的烟酸或其药学上可接受的盐、戊四烟酯或其药学上可接受的盐、生育酚烟酸酯或其药学上可接受的盐或β-吡啶甲醇、烟酸肌醇酯或其药学上可接受的盐中的至少一种。

本发明包括对有此需要的受试者的年龄相关的记忆功能的损伤进行治疗、改善、减少、预防或逆转的方法。该对有此需要的受试者的年龄相关的记忆功能的损伤进行治疗、改善、减少、预防或逆转的方法可以包含施用有效量的NMN或其药学上可接受的盐，以及有效量的烟酸或其药学上可接受的盐、戊四烟酯或其药学上可接受的盐、生育酚烟酸酯或其药学上可接受的盐或β-吡啶甲醇、烟酸肌醇酯或其药学上可接受的盐中的至少一种。

本发明包括对有此需要的受试者的年龄相关的眼功能的下降进行治疗、改善、减少、预防或逆转的方法。该对有此需要的受试者的年龄相关的眼功能的下降进行治疗、改善、减少、预防或逆转的方法可以包含施用有效量的NMN或其药学上可接受的盐，以及有效量的烟酸或其药学上可接受的盐、戊四烟酯或其药学上可接受的盐、生育酚烟酸酯或其药学上可接受的盐、β-吡啶甲醇或其药学上可接受的盐或烟酸肌醇酯或其药学上可接受的盐中的至少一种。

提供了一种对有此需要的受试者的年龄相关的视网膜变性进行治疗的方法。该方法可以包含施用NMN或其药学上可接受的盐，以及烟酸或其药学上可接受的盐、戊四烟酯或其药学上可接受的盐、生育酚烟酸酯或其药学上可接受的盐、β-吡啶甲醇或其药学上可接受的盐或烟酸肌醇酯或其药学上可接受的盐中的至少一种。

提供了一种治疗年龄相关的视网膜变性、年龄相关的眼功能下降、年龄相关的记忆功能损伤或年龄相关的胰岛素敏感性丧失的方法。该方法可以包含施用NMN或其药学上可接受的盐，以及烟酸或其药学上可接受的盐、戊四烟酯或其药学上可接受的盐、生育酚烟酸酯或其药学上可接受的盐、β-吡啶甲醇或其药学上可接受的盐或烟酸肌醇酯或其药学上可接受的盐中的至少一种。

提供了一种治疗、改善、预防或逆转年龄相关的机能衰退的方法。该方法可以包含施用NMN或其药学上可接受的盐，以及烟酸或其药学上可接受的盐、戊四烟酯或其药学上可接受的盐、生育酚烟酸酯或其药学上可接受的盐、β-吡啶甲醇或其药学上可接受的盐或烟酸肌醇酯或其药学上可接受的盐中的至少一种。年龄相关的机能衰退可以包含食欲不振、葡萄糖水平低、肌无力、少肌症或其组合。

提供了一种治疗、改善、预防或逆转糖尿病的方法。该方法可以包含施用NMN或其药学上可接受的盐，以及烟酸或其药学上可接受的盐、戊四烟酯或其药学上可接受的盐、生育酚烟酸酯或其药学上可接受的盐、β-吡啶甲醇或其药学上可接受的盐或烟酸肌醇酯或其药学上可接受的盐中的至少一种。该糖尿病可以为I型糖尿病或II型糖尿病。

提供了一种治疗、改善、预防或逆转肥胖症的方法。该方法可以包含施用NMN或其药学上可接受的盐，以及烟酸或其药学上可接受的盐、戊四烟酯或其药学上可接受的盐、生育酚烟酸酯或其药学上可接受的盐、β-吡啶甲醇或其药学上可接受的盐或烟酸肌醇酯或其药学上可接受的盐中的至少一种。

提供了一种药物组合物。该药物组合物可以包含NMN或其药学上可接受的盐，以及NMN转运蛋白的激动剂。该NMN转运蛋白的激动剂可以为烟酸或其药学上可接受的盐、戊四烟酯或其药学上可接受的盐、生育酚烟酸酯或其药学上可接受的盐、β-吡啶甲醇或其药学上可接受的盐或烟酸肌醇酯或其药学上可接受的盐。该NMN转运蛋白的激动剂可以选自由以下组成的群组：烟酸、戊四烟酯、生育酚烟酸酯或其药学上可接受的盐、β-吡啶甲醇或其药学上可接受的盐或烟酸肌醇酯或其药学上可接受的盐。该NMN转运蛋白可以为Slc12a8多肽或其同源物。

提供了另一种药物组合物。该药物组合物可以包含NMN以及一种Slc12a8或其同源物的基因表达的诱导剂。Slc12a8可以具有标识为登录号NM_134251(SEQ ID NO:12)；Slc12a8小鼠变体a(SEQ ID NO:13)；Slc12a8小鼠变体b，(SEQ ID NO:14)或Slc12a8人(SEQID NO:15)的氨基酸序列。

本发明包括在受试者中刺激NAD+产生的方法以及在受试者增加NMN摄取到细胞中的方法。该受试者可以为需要治疗涉及NMN代谢的疾病(诸如，例如年龄相关的肥胖症)的受试者。这些方法包括给有此需要的受试者施用包含编码Slc12a8的cDNA的核酸。该编码Slc12a8的cDNA可以为来自哺乳动物(诸如人)或啮齿动物(诸如小鼠或大鼠)的Slc12a8mRNA转录物的Slc12a8 cDNA。该核酸可以包括一种包含编码Slc12a8的cDNA的慢病毒。该编码Slc12a8的cDNA可以包括GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)中所述的序列，或可以与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)中所述的序列具有70％或更高的序列同一性。本发明的慢病毒可以施用于需要治疗的受试者的小肠。

本发明还包括在Slc12a8基因中包含缺失的敲除小鼠。该缺失可以是，但不限于，在Slc12a8基因的外显子4中的缺失。

本发明还包括一种哺乳动物细胞系，其包含编码Slc12a8多肽的cDNA，或与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)具有至少70％序列同一性的cDNA序列。该细胞系可以用cDNA稳定转化，或用cDNA瞬时转化。该cDNA可以与控制序列(诸如，例如，但不限于，与cDNA可操作地连接的启动子或增强子)可操作地连接。

该哺乳动物细胞系可以缺乏CD73和/或CD38活性。

该哺乳动物细胞系可以为小鼠细胞系、大鼠细胞系或人细胞系。该哺乳动物细胞系可以为用与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)具有至少70％序列同一性的cDNA序列转化的NIH3T3细胞系。该转化可以为稳定转化或瞬时转化。

本发明还包括在有此需要的受试者中增强NMN的细胞摄取的方法。这些方法包括施用治疗有效量的烟酸或其酯或药学上可接受的盐。该烟酸的酯可以具有以下结构

其中R可以为，但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基、正辛基、2-氯乙基、2-羟基乙基、3-羟基丙基、2-甲氧基乙基、2-丁氧基乙基、氨基甲酰基甲基、1-氨基甲酰基乙基、2-二甲基氨基乙基、3-氨基丙基、四氢糠基、苄基、苯氧基乙基、对氯苯基或对硝基苯基。R可以为H、2-二甲基氨基乙基、对氯苯基或对硝基苯基。R可以为2-二甲基氨基乙基、对氯苯基或对硝基苯基。

本发明还包括在有此需要的受试者中增强NMN的细胞摄取的方法。这些方法可以包括施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物为烟酸、烟酸的酯、戊四烟酯、生育酚烟酸酯、β-吡啶甲醇或烟酸肌醇酯。该施用可以包含每天施用50至500mg烟酸、烟酸的酯、戊四烟酯、生育酚烟酸酯、β-吡啶甲醇或烟酸肌醇酯或任何这些化合物的药学上可接受的盐。该化合物或其药学上可接受的盐可以与药学上可接受的赋形剂一起施用。

本发明还包括对有此需要的受试者的年龄相关的胰岛素敏感性丧失进行治疗的方法、对有此需要的受试者的年龄相关的胰岛素分泌丧失进行治疗的方法、对有此需要的受试者的年龄相关的胰岛素作用丧失进行治疗的方法、对有此需要的受试者的年龄相关的胰岛素作用和分泌丧失进行治疗的方法、对有此需要的受试者的年龄相关的记忆功能损伤进行治疗的方法、对有此需要的受试者的年龄相关的眼功能下降进行治疗的方法以及对有此需要的受试者的年龄相关的视网膜变性进行治疗的方法。这些方法可以包含施用药学有效量的NMN以及化合物诸如烟酸、烟酸的酯、戊四烟酯、生育酚烟酸酯、β-吡啶甲醇或烟酸肌醇酯或其药学上可接受的盐。

本发明还包括对有此需要的受试者的肌肉疾病进行治疗的方法。可以根据本发明治疗的肌肉疾病包括但不限于肌肉衰弱、肌萎缩、肌肉萎缩、肌肉强度下降。可以根据本发明治疗的肌肉疾病包括但不限于少肌症、肌力减低症(dynapenia)、恶病质、肌营养不良、肌强直失调症、脊髓性肌萎缩和肌病。肌营养不良可以为，例如，杜兴氏肌营养不良(DuchenneMuscular Dystrophy)、贝克肌营养不良(Becker Muscular Dystrophy)、先天性肌营养不良、远端肌营养不良、埃-德二氏肌营养不良(Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy)、面肩肱肌营养不良、肢带肌营养不良或眼咽肌营养不良。肌强直失调症可以为肌强直性营养不良、先天性肌强直或先天性副肌强直。肌病可以为Bethlem肌病、先天性纤维型不均衡症、进行性肌肉骨化症、甲状腺功能亢进性肌病、甲状腺功能减退性肌病、微轴空肌病、多轴空肌病、肌管肌病、线状体肌病、周期性麻痹、低钾性肌病或高钾性肌病。肌肉疾病可以为酸性麦芽糖酶缺乏症、肉碱缺乏症、肉碱棕榈酰转移酶缺乏症、脱支酶缺乏症、乳酸脱氢酶缺乏症、线粒体肌病、肌腺苷酸脱氨酶缺乏症、磷酸化酶缺乏症、磷酸果糖激酶缺乏症或磷酸甘油酸激酶缺乏症。肌肉疾病可以为少肌症、肌力减低症或恶病质。肌肉疾病可以为少肌症。这些方法可以包含施用药学有效量的NMN以及化合物诸如烟酸、烟酸的酯、戊四烟酯、生育酚烟酸酯、β-吡啶甲醇或烟酸肌醇酯或其药学上可接受的盐。

本发明还包括包含NMN和NMN转运蛋白的激动剂的药物组合物。该NMN转运蛋白的激动剂可以为，但不限于，烟酸、烟酸的酯、戊四烟酯、生育酚烟酸酯、β-吡啶甲醇或烟酸肌醇酯。

该NMN转运蛋白可以为Slc12a8多肽或其同源物。

本发明还包括对有此需要的受试者的年龄相关的机能衰退进行预防的方法。在非限制性实例中，年龄相关的机能衰退可以由食欲不振、葡萄糖水平低、肌无力、营养不良或老年性厌食症引起或与之相关。这些方法可以包含施用药学有效量的NMN以及化合物诸如烟酸、烟酸的酯、戊四烟酯、生育酚烟酸酯、β-吡啶甲醇或烟酸肌醇酯或其药学上可接受的盐。

本发明还包括对有此需要的受试者的2型糖尿病进行治疗的方法。这些方法可以包含施用药学有效量的NMN以及化合物诸如烟酸、烟酸的酯、戊四烟酯、生育酚烟酸酯、β-吡啶甲醇或烟酸肌醇酯或其药学上可接受的盐。

本发明还包括对有此需要的受试者的肥胖症进行治疗的方法。这些方法可以包含施用药学有效量的NMN以及化合物诸如烟酸、烟酸的酯、戊四烟酯、生育酚烟酸酯、β-吡啶甲醇或烟酸肌醇酯或其药学上可接受的盐。

本文提供的研究证明，Slc12a8基因在哺乳动物中编码新的NMN转运蛋白。Slc12a8基因的mRNA表达响应NAD+下降而上调，这允许细胞响应NAD+生物合成的迫切需要，而不受理论限制。Slc12a8 NMN转运蛋白在生理条件下可以对NMN具有特异性。尽管在细胞培养物中和在小肠中敲低这一基因完全消除了NMN的快速摄取，但是其全长cDNA的过表达增加了NMN向细胞的转运，否则表现出最低的NMN转运。

在下面的部分中进一步详细地描述了本发明的各个方面。

治疗方法

年龄相关的病症可以包含胰岛素敏感性的丧失。

年龄相关的病症可以包含胰岛素分泌的丧失。

年龄相关的病症可以包含胰岛素作用和分泌的丧失。

年龄相关的病症可以包含记忆功能的损伤。

年龄相关的病症可以包含眼功能下降。

年龄相关的病症可以包含视网膜变性。

年龄相关的病症可以包含机能衰退(例如，食欲不振、葡萄糖水平低、肌无力、营养不良、老年性厌食症或其任意组合)。

年龄相关的病症可以包含本文所述的年龄相关的病症的任意组合。

其他方法涉及对有此需要的受试者的医学病症进行治疗。该方法包含向受试者施用治疗有效量的烟酰胺单核苷酸(NMN)和至少一种化合物，该化合物选自由以下组成的群组：烟酸、戊四烟酯、生育酚烟酸酯、β-吡啶甲醇、烟酸肌醇酯、其任意酯、其任意药学上可接受的盐及其任意组合，其中医学病症包含至少一种选自由以下组成的群组的病症：肌肉疾病、2型糖尿病、肥胖症及其任意组合。

医学病症可以包含肌肉疾病。当受试者为需要治疗肌肉疾病的受试者时，该肌肉疾病可以包含肌肉衰弱、肌萎缩、肌肉萎缩、肌肉强度下降或其任意组合。

肌肉疾病可以包含少肌症、肌力减低症、恶病质、肌营养不良(例如，Duchenne肌营养不良、Becker肌营养不良、先天性肌营养不良、远端肌营养不良、Emery-Dreifuss肌营养不良、面肩肱肌营养不良、肢带肌营养不良、眼咽肌营养不良或其任意组合)、肌强直失调症(例如，肌强直性营养不良、先天性肌强直、先天性副肌强直或其任意组合)、脊髓性肌肉萎缩、肌病(例如，Bethlem肌病、先天性纤维型不均衡症、进行性肌肉骨化症、甲状腺功能亢进性肌病、甲状腺功能减退性肌病、微轴空肌病、多轴空肌病、肌管肌病、线状体肌病、周期性麻痹、低血钾性肌病、高血钾性肌病或其任意组合)、或其任意组合。

肌肉疾病可以包含酸性麦芽糖酶缺乏症、肉碱缺乏症、肉碱棕榈酰转移酶缺乏症、脱支酶缺乏症、乳酸脱氢酶缺乏症、线粒体肌病、肌腺苷酸脱氨酶缺乏症、磷酸化酶缺乏症、磷酸果糖激酶缺乏症、磷酸甘油酸激酶缺乏症或其任意组合。

肌肉疾病可以选自由以下组成的群组：少肌症、肌力减低症、恶病质或其任意组合。

肌肉疾病可以包含少肌症。

医学病症可以包含2型糖尿病。

医学病症可以包含肥胖症。

医学病症可以包含本文所述医学病症的任意组合。

在本文所述的各种方法中，至少一种其他化合物可以包含烟酸、其任意酯或其任意药学上可接受的盐。

该烟酸的酯或药学上可接受的盐可以为结构(I)的化合物：

其中R选自由以下组成的群组：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基、正辛基、2-氯乙基、2-羟基乙基、3-羟基丙基、2-甲氧基乙基、2-丁氧基乙基、氨基甲酰基甲基、1-氨基甲酰基乙基、2-二甲基氨基乙基、3-氨基丙基、四氢糠基、苄基、苯氧基乙基、对氯苯基和对硝基苯基(例如，R可以选自由以下组成的群组：2-二甲基氨基乙基、对氯苯基和对硝基苯基)。

在本文所述的各种方法中，每天向受试者施用约50mg至约500mg的至少一种其他化合物。此外，每天可以向受试者施用约10至约500mg的NMN。

此外，可以向受试者施用包含NMN和至少一种其他化合物的药物组合物。

该化合物可以包含烟酸、其酯或其药学上可接受的盐。该烟酸的酯或药学上可接受的盐可以为结构(I)的化合物：

其中R选自由以下组成的群组：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基、正辛基、2-氯乙基、2-羟基乙基、3-羟基丙基、2-甲氧基乙基、2-丁氧基乙基、氨基甲酰基甲基、1-氨基甲酰基乙基、2-二甲基氨基乙基、3-氨基丙基、四氢糠基、苄基、苯氧基乙基、对氯苯基和对硝基苯基(例如，R选自由以下组成的群组：2-二甲基氨基乙基、对氯苯基和对硝基苯基)。

每天可以向受试者施用约50mg至约500mg的化合物。

该编码Slc12a8的核酸可以包含编码Slc12a8的cDNA。

在受试者中刺激NAD+产生和/或增加NMN摄取到细胞中的任何方法中，施用编码Slc12a8的核酸可以包含施用编码Slc12a8的基因治疗载体。

该基因治疗载体可以包含逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、甲病毒、疱疹病毒、痘苗病毒或其任意组合。

例如，该基因治疗载体可以包含逆转录病毒。

当基因治疗载体包含逆转录病毒时，该逆转录病毒适当地包含慢病毒。

在包含施用编码Slc12a8的cDNA的在受试者中刺激NAD+产生和/或增加NMN摄取到细胞中的任何方法中，编码Slc12a8的cDNA可以包含与GenBank参比序列NM_134251(SEQ IDNO:1)具有至少70％序列同一性的序列。

编码Slc12a8的cDNA可以包含与SEQ ID NO:1具有至少75％序列同一性的序列。

编码Slc12a8的cDNA可以包含与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的序列。

编码Slc12a8的cDNA可以包含与SEQ ID NO:1具有至少85％序列同一性的序列。

编码Slc12a8的cDNA可以包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的序列。

编码Slc12a8的cDNA可以包含与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的序列。

编码Slc12a8的cDNA可以包含与SEQ ID NO:1具有至少99％序列同一性的序列。

编码Slc12a8的cDNA可以包含与SEQ ID NO:1具有100％序列同一性的序列。

替代地或另外地，编码Slc12a8的cDNA可以包含本文公开的任何Slc12a8。

在包含向受试者施用治疗有效量的编码Slc12a8的核酸的在受试者中刺激NAD+产生和/或增加NMN摄取到细胞中的任何方法中，该方法可以包含向受试者的胃肠道施用编码Slc12a8的核酸。例如，该方法可以包含将编码Slc12a8的核酸施用于受试者的小肠。

在包含向受试者施用治疗有效量的编码Slc12a8的核酸的在受试者中刺激NAD+产生和/或增加NMN摄取到细胞中的任何方法中，该受试者可以为需要治疗肌肉疾病、2型糖尿病、肥胖症、年龄相关的病症或其任意组合的受试者。

年龄相关的病症可以选自由以下组成的群组：胰岛素敏感性的丧失、胰岛素分泌的丧失、胰岛素作用和分泌的丧失、记忆功能的损伤、眼功能下降、视网膜变性、机能衰退、肥胖症及其任意组合。

年龄相关的病症可以包含胰岛素敏感性的丧失。

年龄相关的病症可以包含胰岛素分泌的丧失。

年龄相关的病症可以包含胰岛素作用和分泌的丧失。

年龄相关的病症可以包含记忆功能的损伤。

年龄相关的病症可以包含眼功能下降。

年龄相关的病症可以包含视网膜变性。

年龄相关的病症可以包含年龄相关的肥胖症。

当受试者为需要治疗肌肉疾病的受试者时，该肌肉疾病可以包含肌肉衰弱、肌萎缩、肌肉萎缩、肌肉强度下降或其任意组合。

肌肉疾病可以包含少肌症。

在包含向受试者施用治疗有效量的编码Slc12a8的核酸的在受试者中刺激NAD+产生和/或增加NMN摄取到细胞中的任何方法中，受试者可以为需要治疗2型糖尿病的受试者。

在包含向受试者施用治疗有效量的编码Slc12a8的核酸的在受试者中刺激NAD+产生和/或增加NMN摄取到细胞中的任何方法中，受试者可以为需要治疗肥胖症的受试者。

在本文所述的任何方法中，受试者可以为哺乳动物。

例如，受试者可以为小鼠或大鼠。

受试者可以为人。当受试者为人时，该人的年龄可以为至少30岁，至少40岁，至少50岁，至少60岁或至少70岁。

基因治疗载体

提供了一种基因治疗载体。该载体包含编码Slc12a8的核酸。

该编码Slc12a8的核酸可以包含编码Slc12a8的cDNA。

载体可以包含逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、甲病毒、疱疹病毒、痘苗病毒或其任意组合。

例如，该基因治疗载体可以包含逆转录病毒。

该逆转录病毒可以包含慢病毒。

编码Slc12a8的cDNA可以包含与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)具有至少70％序列同一性的序列。

编码Slc12a8的cDNA可以包含与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的序列。编码Slc12a8的cDNA可以包含与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性的序列。

包含Slc12a8中的突变的非人动物

该非人动物适当地包含小鼠或大鼠。

Slc12a8基因中的失活性突变可以包含Slc12a8基因中的缺失、Slc12a8基因中的插入或其组合。

例如，Slc12a8基因中的失活性突变可以包含Slc12a8基因中的缺失。该缺失可以包含Slc12a8基因的部分缺失或Slc12a8基因的完全缺失。

该缺失可以包含Slc12a8基因外显子4的缺失。

该缺失可以包含Slc12a8基因外显子4的一部分缺失。

哺乳动物细胞和哺乳动物细胞系

还提供了哺乳动物细胞和哺乳动物细胞系。

提供了另一种哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系。该哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系包含编码Slc12a8蛋白的cDNA。该cDNA包含编码具有SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14或SEQ ID NO:15的至少70％的蛋白质的cDNA。

该cDNA可以包含编码具有SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:15的至少75％的蛋白质的cDNA。

该cDNA可以包含编码具有SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:15的至少80％的蛋白质的cDNA。

该cDNA可以包含编码具有SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:15的至少85％的蛋白质的cDNA。

该cDNA可以包含编码具有SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:15的至少90％的蛋白质的cDNA。

该cDNA可以包含编码具有SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:15的至少95％的蛋白质的cDNA。

该cDNA可以包含编码具有SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:15的至少99％的蛋白质的cDNA。

还提供了另一种哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系。该哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系包含编码Slc12a8蛋白的cDNA。该cDNA包含与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)或Slc12a8人全长cDNA(SEQ ID NO:11)具有至少70％序列同一性的cDNA序列。

该cDNA可以包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:11具有至少75％序列同一性的cDNA序列。

该cDNA可以包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性的cDNA序列。

该cDNA可以包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:11具有至少85％序列同一性的cDNA序列。

该cDNA可以包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性的cDNA序列。

该cDNA可以包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:11具有至少95％序列同一性的cDNA序列。

该cDNA可以包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:11具有至少99％序列同一性的cDNA序列。

该cDNA可以包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:11具有100％序列同一性的cDNA序列。

对于该哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系中的任何一种，该哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系优选不包含胎盘来源的细胞。

该cDNA可以编码小鼠Slc12a8蛋白或其变体。

该cDNA可以编码人Slc12a8蛋白或其变体。

在该哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系中的任何一种中，cDNA可以包含编码SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15的cDNA。

在该哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系中的任何一种中，该细胞或细胞系可以进一步包含与该cDNA可操作地连接的启动子。

与不包含该cDNA的相同哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系中Slc12a8蛋白的表达相比，在该哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系中的任何一种中，Slc12a8蛋白的表达优选增加。

在该哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系中的任何一种中，该哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系可以缺乏可检测的CD73活性，可以缺乏可检测的CD38活性，或者可以缺乏可检测的CD73活性和可检测的CD38活性。

在该哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系中的任何一种中，该哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系优选表现出增加的NMN摄取。

该哺乳动物细胞可以包含一个成纤维细胞、肠细胞、胰腺细胞、肝细胞、脂肪细胞、神经元或神经胶质细胞。

该哺乳动物细胞可以包含多个成纤维细胞、肠细胞、胰腺细胞、肝细胞、脂肪细胞、神经元或神经胶质细胞。

该哺乳动物细胞可以为NIH3T3细胞。

该哺乳动物细胞系可以为NIH3T3细胞系。

在该哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系中的任何一种中，可用cDNA序列稳定地转化该哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系。

在该哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系中的任何一种中，可用cDNA序列瞬时转染该哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系。

在该哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系中的任何一种中，cDNA序列可以与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)具有至少70％的序列同一性。

cDNA序列可以与SEQ ID NO:1具有至少75％的序列同一性。

cDNA序列可以与SEQ ID NO:1具有至少80％的序列同一性。

cDNA序列可以与SEQ ID NO:1具有至少85％的序列同一性。

cDNA序列可以与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性。

cDNA序列可以与SEQ ID NO:1具有至少95％的序列同一性。

cDNA序列可以与SEQ ID NO:1具有至少99％的序列同一性。

cDNA序列可以与SEQ ID NO:1具有100％的序列同一性。

该哺乳动物细胞中的任何一种可以为小鼠或大鼠细胞。

该哺乳动物细胞系中的任何一种可以为小鼠细胞系或大鼠细胞系。

该哺乳动物细胞中的任何一种可以为人细胞。

该哺乳动物细胞系中的任何一种可以为人细胞系。

药物筛选方法

提供了筛选候选化合物以鉴定调节(例如，促进)NMN转运的化合物的方法。这些方法可用于例如鉴定新的治疗化合物，该治疗化合物可用于预防或治疗通过促进NMN摄取到细胞中而改善的疾病或病症。

提供了一种筛选候选化合物以鉴定调节NMN转运的化合物的方法。该方法包含(a)使候选化合物与表达NMN转运蛋白的细胞或包含NMN转运蛋白的蛋白脂质体接触；和(b)检测该细胞中NMN转运蛋白表达或活性的变化或该蛋白脂质体中NMN转运蛋白活性的变化。与候选化合物接触后，细胞中NMN转运蛋白表达或活性的变化或蛋白脂质体中NMN转运蛋白活性的变化表明：该候选化合物调节NMN的转运。

NMN转运蛋白可以包含Slc12a8蛋白。

Slc12a8蛋白可以包含与SEQ ID NO:12(小鼠Slc12a8蛋白)、SEQ ID NO:13(小鼠Scl12a8变体A蛋白)、SEQ ID NO:14(小鼠Scl12a8变体B蛋白)或SEQ ID NO:15(人Slc12a8蛋白)具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

Slc12a8蛋白可以包含与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:15具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。

Slc12a8蛋白可以包含与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:15具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

Slc12a8蛋白可以包含与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:15具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

Slc12a8蛋白可以包含与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:15具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

Slc12a8蛋白可以包含与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:15具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

Slc12a8蛋白可以包含与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:15具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。

Slc12a8蛋白可以包含与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:15具有100％序列同一性的氨基酸序列。

该方法可以进一步包含将以下进行对比：(i)与候选化合物接触后，NMN转运蛋白在表达NMN转运蛋白的细胞中的表达或活性；和(ii)与候选化合物接触后，NMN转运蛋白在不表达NMN转运蛋白的细胞或其中NMN蛋白的表达或活性已被抑制的细胞中的表达或活性。

该不表达NMN转运蛋白的细胞可以包含来源于Slc12a8敲除动物的细胞。

该方法可以进一步包含将以下进行对比：(i)与候选化合物接触后，NMN转运蛋白在包含NMN转运蛋白的蛋白脂质体中的活性；和(ii)与候选化合物接触后，NMN转运蛋白在不包含NMN转运蛋白的蛋白脂质体或其中NMN转运蛋白的活性已被抑制的蛋白脂质体中的活性。

该不包含NMN转运蛋白的蛋白脂质体可以包含来源于Slc12a8敲除动物细胞的蛋白脂质体。

在该方法的任何一种中，该细胞可包含哺乳动物成纤维细胞、肠细胞、胰腺细胞、肝细胞、脂肪细胞、神经元或神经胶质细胞。

在该方法的任何一种中，该蛋白脂质体可以包含来源于哺乳动物成纤维细胞、肠细胞、胰腺细胞、肝细胞、脂肪细胞、神经元或神经胶质细胞的蛋白脂质体。

在该方法的任何一种中，该细胞可包含本文所述的哺乳动物细胞中的任何一种。

在该方法的任何一种中，该蛋白脂质体可以包含来源于本文所述的哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系中的任何一种的蛋白脂质体。

在该方法的任何一种中，该蛋白脂质体包含来源于哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系的蛋白脂质体，该哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系包含Slc12a8 cDNA。

药物组合物

NMN转运蛋白的激动剂可以包含化合物，该化合物选自由以下组成的群组：烟酸、戊四烟酯、生育酚烟酸酯、β-吡啶甲醇、烟酸肌醇酯、其酯、其药学上可接受的盐及其组合。NMN转运蛋白可以包含烟酸、其任意酯或其任意药学上可接受的盐。

该烟酸的酯或药学上可接受的盐可以为结构(I)的化合物：

此外，NMN转运蛋白可以包含Slc12a8多肽或其同源物。

已经详细描述了本发明，显而易见的是，在不脱离由所附权利要求限定的本发明的范围的情况下，可以进行修改和变化。

实施例

方法

本文描述的方法和组合物利用本领域技术人员熟知的实验室技术，并且可以在实验室手册中找到，例如，Sambrook,J.等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，NY，2001；Spector,D.L.等人，Cell:A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY，1998；Nagy,A.，Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual(第三版)，冷泉港，NY，2003以及Harlow,E.,Using Antibodies:ALaboratory Manual，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY，1999。药物的给药方法和剂量方案可以根据药学领域公知的标准原理，使用标准参考教科书(诸如Remington:the Science and Practice of Pharmacy(Alfonso R.Gennaro编辑，1995年19版)；Hardman,J.G.等人，Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basisof Therapeutics，第九版，McGraw-Hill，1996；以及Rowe,R.C.等人，Handbook ofPharmaceutical Excipients，第四版，制药出版社，2003)提供的方法来确定。如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一”、“一种”和“该”也旨在包括复数形式，除非上下文另有说明。

微阵列分析。从原代肝细胞、胰岛和海马神经球中分离总RNA，用0.1％DMSO(对照)或FK866(对于原代肝细胞为200nM，对于胰岛和海马神经球为10nM)处理。为了确定FK866处理诱导的转录变化，使用Illumina Mouse Ref 8全基因组微阵列(版本2)进行微阵列分析。对减去背景的原始微阵列数据进行Z评分变换，并如前所述计算Z比(Yoshino,J.等人，CellMetab.,14,528-536,2011)。通过R统计软件包分析所有数据。

细胞培养和离体小肠外植体培养。将NIH3T3细胞在补充有10％胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)中在37℃和5％CO₂下培养。对于Slc12a8 mRNA表达分析，将细胞(2.5×105个细胞/孔)与含有0.1％DMSO或100nMFK866或100nM FK866加100μM NMN的1％FBS的DMEM一起在6孔板中温育24小时。将3月龄B6雄性小鼠的小肠切成三段：十二指肠/空肠/回肠，长度比为1:3:2(Wang,H.H.等人，Hepatology 45,998-1006,2007)。纵向打开每一段的1厘米，用冷PBS洗涤一次，并在DMEM与Ham's F-12培养基(Sigma)的1:1混合物中在37℃下温育4小时，该混合物中含有0.1％DMSO或100nM FK866或100nM FK866加500μM NMN，5％FBS以及以下添加剂：5μg/ml胰岛素(Sigma)、20ng/ml表皮生长因子(Sigma)、1×B27补充剂(GIBCO)、1mM丙酮酸钠(Corning)、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mM GlutaMAX^TM(GIBCO)。通过定量RT-PCR分析细胞和组织RNA样品，如前所述(Stein,L.R.和Imai，EMBO J.,33,1321-1340,2014)。

HPLC法测定NAD+和NMN。从细胞和组织中提取NAD+和NMN并通过HPLC进行定量，如前所述(Yoshino,J.等人，Cell Metab,14,528-536,2011；Yoshino,J.和Imai,S.,MethodsMol.Biol.,1077,203-215,2013)。

流式细胞术分析。将2×106个NIH3T3细胞与含有1％FBS的DMEM(含0.1％DMSO或100nM FK866或100nM FK866加100μM NMN)在10cm培养皿中于37℃和5％CO₂下温育48小时。然后将细胞用冷PBS洗涤一次，用0.02％EDTA的PBS溶液处理，并使用市售多克隆兔抗小鼠Slc12a8抗体(ARP44039，Aviva，CA)(1:200)、与

488缀合的第二山羊抗兔IgG(H+L)(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，美国)(1:2000)(Invitrogen)以及存活标记ZOMBIE AQUA^TM染料(1:400)(Biolegend，San Diego，CA)在4℃下进行流式细胞术染色25分钟。然后洗涤细胞并通过GALLIOS^TM流式细胞仪(BeckmanCoulter，Indianapolis，IN)进行分析。对于细胞内染色，首先将细胞在室温下在2％PFA中固定10分钟，然后在室温下在含有皂苷的缓冲液中再透化10分钟。Slc12a8染色在透化缓冲液中于4℃下进行25分钟。通过GALLIOS^TM流式细胞仪(BeckmanCoulter，Indianapolis，IN)分析样品，并且使用KALUZA^TM1.3(BeckmanCoulter，Indianapolis，IN)分析数据。使用ZOMBIE AQUA^TMFixable ViabilityKit(Biolegend，San Diego，CA)排除死亡细胞。

肝细胞分离、5'-核苷酸酶活性测定、NMN摄取测定以及Slc12a8和Nrk1表达的沉默。从3月龄C57BL/6J(B6)雄性小鼠中分离原代肝细胞，如前所述(Grimm,A.A.等人，AgingCell,10,305-317,2011)。在进行任何实验之前，在37℃和5％CO₂下，在补充有10％胎牛血清(FBS)、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(pen/strep)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)中，将细胞在涂覆有聚L-赖氨酸的6孔板中培养过夜。通过将肝细胞与500nM FK866或500nM FK866加500μM NMN在含有1％FBS的DMEM中温育24小时来评估Slc12a8 mRNA表达和NAD+含量。为了测试腺苷-5′-[α,β-亚甲基]二磷酸酯(AOPCP)是否抑制5'-核苷酸酶活性，将细胞(1.5×105个细胞/孔)在含500nM FK866的12孔板中在含1％FBS的DMEM中生长24小时，然后在100μM单磷酸腺苷(AMP)或100μM AMP加500μM AOPCP存在下，在含Ca2+和Mg2+的1.4ml Hanks缓冲盐溶液(pH 7.5)(HBSS，GIBCO)中培养。在不同的时间点(0、1、5、15和30分钟)，收集每种培养物上清液200μl，并加入28μl 70％高氯酸进行提取。通过HPLC测定产生的腺苷的量。AMP和腺苷的洗脱时间分别为4.7和17.4分钟。为了检测细胞活力，使用

AQueous单溶液细胞增殖溶液(Promega，Madison，WI)，并且在温育4小时后在λ＝490测量吸光度。为了测量NMN摄取，将细胞(1.5×105个细胞/孔)在含500nM FK866的DMEM中(含1％FBS)的12孔板中生长24小时，然后在500μM AOPCP、20μM双嘧达莫和500nMFK866或这些抑制剂加100μM NMN的存在下，在1ml HBSS中温育。在不同的时间点(0、0.25、1、5、15和30分钟)，将细胞用冷HBSS洗涤一次，并在冷10％高氯酸中裂解。通过HPLC测量细胞内NMN水平，如前所述(Yoshino,J.等人，Cell Metab.,14,528-536,2011)。对于基因沉默实验，按照制造商的说明，使用

程序H-26(Lonza，Basel，瑞士)，将10μg对Slc12a8(J-042450-12-0020)或Nrk1(J051839-11-0010)具有特异性的ON-TARGETLUS^TM(Dharmacon公司，Lafeyette，CO)小鼠siRNA(Thermo Scientific)或阴性对照siRNA(非靶向siRNA#1，D-001810-01-20)电穿孔入一百万个细胞中(每种条件)，并与100μl

Mouse Hepatocyte

Solution(Lonza，Basel，瑞士)混合。将电穿孔的细胞在试管中温育15分钟，然后加入培养基。在电穿孔后，在含有10％FBS和青霉素-链霉素的DMEM中，将细胞(2.5×105个细胞/孔)在37℃和5％CO₂下接种于涂覆有聚L-赖氨酸的6孔板中48小时。将这些细胞与500nM FK866在含有1％FBS的DMEM中温育24小时。在HBSS中将细胞与500μM AOPCP、20μM双嘧达莫和500nM FK866或这些抑制剂加100μM NMN在室温下温育1分钟后，通过HPLC测量NMN摄取。通过定量RT-PCR评估沉默效率。

稳定过表达全长小鼠Slc12a8 cDNA的NIH3T3细胞的制备。

GenBank参比序列NM_134251用于该序列。GenBank参比序列NM_134251的序列如本文SEQ ID NO:1所示。

使用PFUULTRA^TMII Fusion HS DNA聚合酶(Agilent，Santa Clara，CA)，使用以下含有XhoI位点的正向和反向引物，通过PCR从小鼠肝脏中扩增全长小鼠Slc12a8 cDNA的编码区(GenBank参比序列：NM_134251)(表1)。

表1：

引物(SEQ ID NO.)序列

Slc12a8正向 5’-ATACTCGAGGAGAATGGCCCAGAGGTCTC-3’

(SEQ ID NO:2)

Slc12a8反向 5’-TCAACTACGGAGGGATGATCGAGCTCATT-3’

(SEQ ID NO:3)。

将得到的全长Slc12a8 cDNA的2118bp片段用XhoI消化，并克隆到pBluescript SK载体中。然后将Slc12a8 cDNA片段亚克隆至哺乳动物表达载体pCXN2(Revollo,J.R.等人，J.Biol.Chem.,279,50754-50763,2004)。通过测序证实最终载体中的Slc12a8 cDNA序列。使用

转染试剂(QIAGEN，Fredrick，MD)用5μg携带全长Slc12a8cDNA(Slc12a8-OE)的pCXN2或空pCXN2载体(对照)转染NIH3T3细胞，并在补充有10％FBS、抗生素和300μg/ml G418(Invitrogen)的DMEM中培养2周。收集抗性细胞，冷冻等分试样用于进一步的实验。为了确认Slc12a8-OE细胞中的Slc12a8蛋白表达水平，由对照和Slc12a8-OENIH3T3细胞制备质膜(PM)级分，如前所述(Bruzzone,S.等人，FASEB J.,26,1251-1260,2012)。简而言之，使用在5个10cm培养皿中培养的7.5×107个细胞。在用冰冷的HES缓冲液(20mM HEPES、1mM EDTA和255mM蔗糖，pH 7.4)洗涤2次后，通过在含有蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的HES缓冲液(3ml/皿)中刮擦收集细胞，并通过22号针头进行5次均质。所有后续步骤在4℃进行。均质在JA25.5转子(Beckman-Coulter)中以16000g离心(Avanti J-E)30分钟。将沉淀重悬于10ml HES缓冲液中，再次以16000g离心30分钟。将所得沉淀重悬于10mlHES缓冲液中，并铺在10ml蔗糖垫(38.5％蔗糖，20mM HEPES和1mM EDTA，pH 7)的顶部，并以53000g离心120分钟。除去含有PM级分的界面，重悬于10ml HES缓冲液中，并以40000×g离心30分钟，得到沉淀中的PM级分。用RIPA缓冲液(150mM氯化钠，1.0％NP-40，0.25％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，50mM Tris，pH 7.5，2mM EDTA，1mM PMSF，0.5mM DTT和蛋白酶抑制剂混合物)裂解对照或Slc12a8OE细胞的PM级分，并在1×Laemmli缓冲液中煮沸5分钟。用多克隆兔抗小鼠Slc12a8(1:500，ARP44039，Aviva，CA)和抗窖蛋白-1(1:2000，#3238，CellSignaling，MA)进行蛋白质印迹。使用

(Adobe Systems公司，SanJose，CA)在AMERSHAM HYPERFILM^TMECL(GE Healthcare，Marlborough，MA)上对条带强度进行定量。

用放射性标记的NMN进行NMN摄取分析。通过离心(400×g，5分钟)收获对照和Slc12a8-OE NIH3T3细胞，在HBSS中洗涤一次，并在HBSS[pH 7.5](5×106细胞/ml)(该HBSS含有100nM 3H-β-烟酰胺单核苷酸(9Ci/mmol；Moravek Biochemicals，CA)和未标记的NMN)中于37℃温育，使终浓度为25μM。在指定的时间点(1、3、5和10分钟)，收集细胞的等分试样(100μl)，并置于1.5ml微量离心管(该离心管中在2M氢氧化钾溶液的顶部含有硅酮矿物油(密度为1.015；Sigma-Aldrich))中，然后以16000×g离心30秒。将细胞与缓冲液分离并通过硅酮矿物油层沉淀。通过液体闪烁计数器测定这些细胞沉淀中的放射性。为了计算Km和Vmax，使用如上所述相同的条件，但是NMN的各种总浓度不同，范围为1μM至100μM。在4分钟的时间点，收集100μl的细胞悬浮液，并且以与上述相同的方式沉淀。通过液体闪烁计数器测定细胞沉淀中的放射性。减去对照NIH3T3细胞中测量的放射性，以计算Slc12a8-OENIH3T3细胞中的Slc12a8特异性NMN摄取。

蛋白脂质体实验。进行蛋白脂质体的制备，如前所述(Bruzzone,S.等人，FASEBJ.,15,10-12,2001)。简而言之，将2×107对照或Slc12a8-OE NIH3T3细胞重悬于1ml裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.3，150mM NaCl，0.3M蔗糖，蛋白酶抑制剂混合物)中，并用均质器破碎。将裂解物以3000×g离心10分钟，收集上清液并以100000×g离心15分钟。用缓冲液A(10mM Tris-HCl，pH 8.3，含有150mM NaCl和0.5％正辛基β-吡喃葡萄糖苷)溶解膜蛋白。分别从无血红蛋白的红细胞膜(ghosts)提取总脂质，如前所述(Franco,L.等人，FASEB J.,12,1507-1520,1998)。将来自人红细胞膜的总脂质(3mg)干燥，并用600μl溶解的膜蛋白(约0.7mg/ml蛋白浓度)重悬。将所得乳液在冰中超声处理1分钟，并用5升不含正辛基-β-吡喃葡萄糖苷的缓冲液A(透析缓冲液)在4℃透析24小时。回收蛋白脂质体，以100000×g离心15分钟，重悬于900μl透析缓冲液中，并通过30号针头5次。

为了检测Slc12a8的Na+依赖性，用150mM LiCl代替NaCl。所有步骤均在4℃下进行。将蛋白脂质体(每种条件一式三份，30μl)在105cpm/ml具有或不具有无标记核苷酸(NMN，NR，NAD，AMP；NAM或NaMn)的3H-β-NMN(比活性，9.1Ci/mmole)的存在下在25℃温育2、5或10分钟。温育结束时，将样品在玻璃纤维纸上过滤。用3ml透析缓冲液洗涤滤膜，干燥，并计数放射性。

体内Slc12a8敲低实验。为了制备表达shRNA的慢病毒构建体，为小鼠Slc12a8和萤火虫荧光素酶(fLuc)生成56bp的双链寡核苷酸，并将其克隆至华盛顿大学医学院(Washington University School of Medicine)的病毒载体核心(Viral Vectors Core)提供的U6-PGK-GFP载体中，每个寡核苷酸均包含正义靶序列、基于microRNA的环序列(CTTCCTGTCA；SEQ ID NO:4)、反义序列、四个胸苷的终止序列以及两端的合适限制性酶切位点。正义Slc12a8序列为‘5-GCCTAGAGTGAACAGAAGA-3'(SEQ ID NO:5)。慢病毒如前所述制备(Satoh,A.等人，Cell Metab.,18,416-430,2013)。使用原代肠培养物测试敲低效率(Sato,T.和Clevers,H.,Methods Mol.Biol.,945,319-328,2013)。大规模慢病毒生产由华盛顿大学(Washington University)神经疾病希望中心(Hope Center for NeurologicalDisorders)的病毒载体核心进行。3月龄C57BL/6J雄性小鼠(Jackson实验室)连续两天过夜禁食后，口服(通过管饲法)滴度为5×106转导单位的fLuc或Slc12a8shRNA慢病毒。6天后，接受fLuc或Slc12a8 shRNA慢病毒的小鼠禁食过夜，并给予NMN(500mg/kg)或PBS管饲。在管饲法施用后0、5和60分钟从尾静脉收集血液，然后通过离心分离血浆。然后在管饲法给药后60分钟收集组织样品。测量血浆NMN和组织NAD+水平，如前所述(Yoshino,J.等人，CellMetab.,14,528-536,2011；Grimm,A.A.等人，Aging Cell,10,305-317,2011)。

小鼠Slc12a8抗体的产生。针对小鼠Slc12a8(Covance，Denver，PA)的合成N端肽(AQRSPQELFHEAAQQGC；SEQ ID NO:6)产生了两种不同的多克隆兔抗血清。从这些抗血清之一中亲和纯化Slc12a8特异性抗体。针对Slc12a8 N端肽的抗血清或亲和纯化的抗体以1:500稀释用于蛋白质印迹。

全身Slc12a8敲除小鼠的产生。用CRISPR-CAS9技术通过华盛顿大学的转基因载体核心(Transgenic Vectors Core)产生全身Slc12a8敲除(Slc12a8KO)小鼠。将CRISPR gRNA设计为侧接Slc12a8基因的外显子4。gRNA序列如下：5'gRNA；5'-AGTGCATGTATAGGACGTATG-3'(SEQ ID NO:7)和3'gRNA；5'-CCTCACAAATATTTACAGGC-3'(SEQ ID NO:8)。获得gRNA作为gBlock(IDT)。通过使用XTREMEGENE^TM HP(Roche，Basel，瑞士)用gBlock和Cas9质粒(addgene#42230)转染N2A细胞来评估切割活性。使用标准方法通过T7E1测定来测定切割活性。使用T7MEGASHORTSCRIPT^TM试剂盒(Ambion，Waltham，MA，美国)体外转录gRNA。使用MMESSAGE

T7Ultra试剂盒(Ambion，Waltham，MA)体外转录Cas9RNA。使用

柱(Ambion，Waltham，MA)纯化所有RNA。在华盛顿大学小鼠遗传核心设施(Washington University Mouse Genetic Core Facility)中，以50ng/μl Cas9、25ng/μlgRNA和100ng/μl ssODN的浓度将RNA显微注射至C57BL/6J×CBA杂合子中。通过PCR在整个切割位点检测全身敲除等位基因，并通过测序确认。建立一个杂合首建鼠，并在分析前将小鼠与野生型C57BL/6J小鼠(Jackson实验室)回交5代。使Slc12a8缺陷型杂合小鼠杂交以产生纯合Slc12a8KO小鼠。野生型同窝出生小鼠用作对照。

18O-D-NMN的产生。18O烟酰胺由氰基吡啶在18O水中水解制备(Kolodziejska-Huben,M.等人，J.Label.Compd.Radiopharm.,45,1005-1010,2002)。1,2-2H,3,5-四乙酸酯由D-[2-2H]-核糖合成(购自Omicron Biochemicals；Chatterjee,A.等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl,49,8653-8656,2010)。由18O-烟酰胺和D-呋喃核糖1,2-2H,3,5-四乙酸酯合成18O-2H标记的烟酰胺核糖(Fouquerel,E.等人，Cell Rep.,8,1819-1831,2014)。由18O-2H烟酰胺核糖合成18O-2H烟酰胺单核苷酸(18O-D-NMN),如前所述(Mills,K.F.等人，Cell Metab.,24,795-806,2016)。

同位素示踪实验。禁食过夜后，对7-8月龄的Slc12a8KO小鼠及其野生型同窝出生小鼠口服施用500mg/kg 18O-D-NMN或PBS。在口服管饲后10分钟收集空肠和回肠。将试剂级甲醇和水的1:1混合物(4℃)添加至冷冻组织(60μL/mg组织)中。超声处理后，将提取物在4℃下以12000×g离心15分钟。以1:1(v/v)的比例向提取物中加入氯仿，充分振荡30秒，并在4℃下以12000×g离心10分钟。将上相(甲醇和水)与下(有机)相分离，并在室温下通过快速真空冷冻干燥，用5mM甲酸铵重构，并在12000×g下离心10分钟。将NMN和18O-D-NMN以128至1000nmol/L的浓度在5mM甲酸铵中的系列稀释液用于校准。液相色谱分析是通过HPLC(1290；Agilent)用

T3(LC2.1×150mm，3mm；Waters，Millford，MA)流速为0.15ml/分钟进行的，其中流动相A为5mM甲酸铵，流动相B为100％甲醇。代谢物用梯度洗脱：0-10分钟，0-70％B；10-15分钟，70％B；16-20分钟，0％B。代谢物使用三重四极质谱仪(6470；Agilent)在正ESI多重反应监测(MRM)下，使用NMN(335>123)和18O-D-NMN(338>125)的参数进行分析。NMN的碎裂、碰撞和后加速电压为135、8、7。使用MassHunter定量分析工具(Agilent)鉴定NMN和18O-D-NMN峰。

动物实验。将所有小鼠分组饲养在具有12小时光亮/12小时黑暗周期的屏障设施中。小鼠按标准饮食随意喂养(LabDiet5053；LabDiet，St.Louis，MO)。对食物摄入以及进食和空腹葡萄糖、甘油三酸酯、游离脂肪酸和胰岛素水平进行测量，如前所述(Yoshino,J.等人，Cell Metab.,14,528-536,2011；Mills,K.F.等人，Cell Metab.,24,795-806,2016；Yoon,M.J.等人，Cell Metab.,21,706-717,2015)。收集Slc12a8KO小鼠及其野生型同窝出生小鼠的上午9和10点的粪便，并在55℃干燥过夜，然后称重。用氯仿/甲醇混合物(2:1，vol/vol)(Sigma，St.Louis，MO)提取总粪便脂肪，如前所述(Folch,J.等人，J.Biol.Chem.,226,497-509,1957)。将1毫升有机相转移至预称重的管中，真空干燥，然后再称重以测定脂质质量。将脂质含量的百分比标准化为提取的粪便的起始质量(g)。在上午9点或下午9点收集8至10月龄Slc12a8KO小鼠及其野生型同窝出生小鼠的组织，并通过HPLC测定NAD+水平。使用全身NMR仪器(

Echo Medical Systems LLC，Waco，TX)测定身体组成。间接量热法和自发活动通过Phenomaster系统(TSE Systems，MO)进行。所有动物研究均由华盛顿大学动物研究委员会(Washington University Animal Studies Committee)批准，并且符合NIH指南。

血浆GLP-2测定。禁食24小时(从上午9点至上午9点)且再喂养6小时(从上午10点至下午4点)后，使用EDTA包被的微孔管从7至9月龄Slc12a8KO小鼠及其对照野生型同窝出生小鼠的尾静脉收集血液。立即将血液在冰上冷却，以5000×g和4℃离心，并将血浆样品储存在-80℃。按照制造商的说明，通过小鼠GLP-2ELISA试剂盒(Alpco，Salem，NH)测定血浆GLP-2水平。

在血浆和离体小肠外植体培养物上清液中测定GLP-1。禁食24小时(从上午9点至上午9点)后，再喂养6小时(从上午10点至下午4点)，然后使用EDTA包被的管从2月龄或24月龄雌性Slc12a8敲低小鼠及其对照小鼠的尾静脉收集血液。立即将血液在冰上冷却，在4℃下以5000×g离心，并将血浆样品储存在-80℃。将来自肠特异性Slc12a8敲低雌性小鼠或12月龄Slc12a8KO雌性小鼠的小肠切成三段：十二指肠、空肠和回肠，长度比为1:3:2(Wang,H.H.等人，Hepatology,2007,45,998-1006)。纵向打开1厘米的回肠或结肠，用冷PBS洗涤一次，并在37℃下在500μl不含烟酰胺和葡萄糖且含0.25％无脂肪酸的白蛋白牛血清(Sigma，St.Louis，MO)的DMEM(GIBCO，分泌培养基)中温育2小时。对于使用Sirt1和Sirt6抑制剂的实验，将来自24月龄雌性B6小鼠的回肠在37℃下在500μl含有0.2％DMSO(溶媒)、20μMEX527(Cayman Chemical，MI)或20μM STK665401的分泌培养基中预温育2小时(ChemDiv，cat#8018-9378；Sociali,G.等人，Eur.J.Med.Chem.,2015,102,530-539)。预温育后，更换培养基，离体回肠外植体用相同的化学物质在37℃下温育2小时。在加湿培养箱(95％O₂，5％v/v CO₂)中温育结束时，收集培养基，在4℃下以800g离心5分钟以除去任何漂浮的碎片，并在-80℃冷冻用于后续的GLP-1测量。按照制造商的说明，通过GLP-1总ELISA试剂盒(EMD Millipore，MO)测量血浆和培养基中的GLP-1水平。通过Bradford测定分析的总蛋白质含量将GLP-1值标准化。

激光显微切割。对每个下丘脑核进行显微解剖，并通过定量RT-PCR提取和分析总RNA，如前所述(Satoh,A.等人，Cell Metab.,18,416-430,2013)。

统计分析。除非另有说明，否则使用Student t检验评估两组之间的差异。使用单向ANOVA与实施例中所示的各种post hoc检验进行几组之间的对比。使用Wilcoxon配对符号秩检验对比耗氧量、能量消耗、呼吸交换比和总自发活动的差异。为了进行对比，将p值<0.05视为具有统计学意义。使用GraphPad Prism(版本7)进行统计分析。所有值均表示为平均值±SEM。，除非另有说明，否则*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

本发明包括在实施例中提供的描述，其不旨在限制任何权利要求或方面的范围。除非以过去式具体说明，否则实施例可以是预示的或实际的实施例。提供以下非限制性实施例以进一步说明本发明。根据本公开，本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方式进行多种改变，并且仍然获得类似或相似的结果。

实施例1

本实施例说明了NMN转运蛋白基因的鉴定。

当NAMPT介导的NAD+生物合成被FK866(一种有效的NAMPT抑制剂)抑制时，在各种类型的原代细胞中，与不存在FK866的NMN诱导的NAD+相比，共同施用NMN总是产生更高的NAD+增加(Revollo,J.R.等人，Cell Metab.,6,363-375,2007；Stein,L.R.和Imai,S.,EMBOJ.,33,1321-1340 2014；Yoshino,J.等人，Cell Metab.,14,528-536,2011)。本发明研究人员在经FK866处理的原代小鼠肝细胞、胰岛和海马神经球中进行基因表达谱分析，以寻找在这三种原代培养物中普遍上调的基因。搜索集中于编码转运蛋白或跨膜蛋白的基因，且仅发现一个符合这些标准且具有未知功能的基因。这一基因Slc12a8在原代肝细胞、胰岛和神经球中分别表现出2.06、1.69和4.91的Z比(图1)。Slc12a8在图1中的Venn图的箭头指示部分中标识。图1中示出了每种细胞类型中的Slc12a8的Z比和p值。Slc12a8基因属于电中性阳离子-氯化物-偶联共转运蛋白SLC12基因家族，其编码蛋白的功能尚不清楚(Hebert,S.C.等人，Pflugers Arch,447,580-593,2004)。

实施例2

本实施例说明了Slc12a8在B6小鼠中的差异表达。

图2说明Slc12a8在3月龄B6雄性小鼠(n＝3只小鼠)在小肠和胰腺中高表达，并在肝和白色脂肪组织中中度表达。在原代小鼠肝细胞中观察到另外的Slc12a8 mRNA表达变化，如图3所示；(n＝4只小鼠)，NIH3T3成纤维细胞(n＝4)，以及空肠和回肠的离体外植体(DMSO和FK866分别n＝4只小鼠；对于FK866加NMN，n＝3只小鼠)用0.1％DMSO、单独的FK866或FK866加NMN处理(对于细胞，24小时；对于外植体，4小时；使用Tukey检验通过ANOVA进行分析)。当用FK866处理时，在小鼠原代肝细胞、小鼠NIH3T3成纤维细胞以及空肠和回肠的离体外植体中显著诱导了Slc12a8表达，而加入NMN抑制了这种诱导(图3至5)。图4显示了用DMSO、单独的FK866以及FK866加NMN处理的原代小鼠肝细胞和NIH3T3成纤维细胞中的胞内NAD+含量。用这些化合物处理细胞24小时(对于用DMSO和FK866处理的肝细胞，n＝4只小鼠；对于用FK866和NMN处理的肝细胞，n＝3只小鼠；对于NIH3T3细胞，n＝6；使用Tukey检验通过ANOVA进行分析)。图5显示了在用FK866或FK866加NMN处理48小时的NIH3T3细胞中，通过流式细胞术分析测量表面和细胞内Slc12a8蛋白表达水平。计算阴性选择凋亡标记(Zombi-)的细胞中Slc12a8染色阳性NIH3T3细胞(Slc12a8+)的百分比(对于表面染色，n＝8；对于细胞内染色，n＝5；通过非配对t检验进行分析)。

实施例3

本实施例说明了Slc12a8对NMN摄取动力学的影响。

测定小鼠原代肝细胞中NMN摄取的动力学。AOPCP(腺苷-5′-[α,β-亚甲基]二磷酸酯)抑制CD73将NMN胞外降解为NR。双嘧达莫抑制NR通过核苷转运蛋白摄取到细胞中，而FK866抑制NAMPT的细胞内NMN合成。将完整的原代肝细胞与AMP或AMP加AOPCP一起温育。通过HPLC在不同时间点(0、1、5、15和30分钟)测量细胞外腺苷的产生。AOPCP抑制5'-核苷酸酶活性达97％。AOPCP、双嘧达莫和FK866的混合物在长达30分钟的时间内都未影响细胞活力(数据未示出)。

将原代小鼠肝细胞用500nM FK866预处理24小时，然后与20μM双嘧达莫、500μMAOPCP和500nM FK866的混合物(含或不含100μM NMN)温育。通过HPLC测量NMN(n＝4只小鼠，除了仅对抑制剂的15和30分钟时间点的3个数据集；使用Sidak检验通过ANOVA进行分析)。与小鼠原代肝细胞中的对照相比，这种处理导致细胞内NMN水平在1分钟时间点显著增加(图6)。

实施例4

本实施例说明了减少的Slc12a8和Nrk1 mRNA对NMN摄取的影响。

为了测量原代小鼠肝细胞中Slc12a8和Nrk1 mRNA的敲低效率，将细胞用Scramble和Slc12a8或Nrk1 siRNA处理72小时(对于Slc12a8沉默，n＝5只小鼠，对于Nrk1沉默，n＝3；通过非配对700t检验进行分析)。不受理论限制，这些条件敲低了Slc12a8和Nrk1(一种在细胞内将NR转化为NMN的主要NR激酶)的表达(Belenky,P.等人，Cell,129,473-484,2007)。在加入100μM NMN后1分钟，通过HPLC测定用Scramble、Slc12a8和Nrk1 siRNA处理的原代肝细胞。培养条件与实施例3描述的相同(对于Slc12a8沉默，n＝5只小鼠，对于Nrk1沉默，n＝3只小鼠；用Tukey检验通过ANOVA进行分析)。两个基因的敲低效率均约为80％(图7)。在Slc12a8敲低肝细胞中NMN的快速摄取被完全消除，而在Nrk1敲低肝细胞中未观察到NMN摄取的显著降低(图8)；这些数据表明Slc12a8对于原代肝细胞中NMN快速摄取是必需的，并且观察到的细胞内NMN的增加并非由于NR或烟酰胺转化成NMN所致。

实施例5

本实施例说明了在小鼠NIH3T3细胞中的全长小鼠Slc12a8 cDNA的过表达。

选择NIH3T3细胞系是因为其不具有CD73(将NMN转化为NR)和CD38(将NMN降解为烟酰胺和磷酸核糖)的任何可检测的细胞外活性，并且还具有非常弱的NMN摄取活性。如方法中所述，将全长小鼠Slc12a8 cDNA转染至细胞中，并测定Slc12a8蛋白的表达。图9显示了来自对照和Slc12a8-OE NIH3T3细胞的质膜级分中的Slc12a8蛋白表达。图10显示了每种细胞系的标准化为窖蛋白-1蛋白水平的Slc12a8蛋白水平(右图；n＝3，通过非配对t检验进行分析)。Slc12a8蛋白水平在过表达Slc12a8的NIH3T3(Slc12a8-OE)细胞中显著提高约2.2倍。

实施例6

本实施例说明了在Slc12a8-OE和对照细胞中使用3H标记的NMN的NMN摄取的动力学。

按照“放射标记的NMN的NMN吸收分析”所述的方法，在37℃下，使用25μM3H-NMN测量在含Mg2+和Ca2+的Hanks'缓冲液[ph7.5]中的对照和Slc12a8-OE NIH3T3细胞在10分钟内的NMN的摄取(n＝12；使用Sidak检验通过ANOVA进行分析)。与对照细胞相比，Slc12a8-OE细胞中3H-NMN的摄取在3和5分钟时间点显著增强(图11)。为了计算Slc12a8蛋白的Michaelis-Menten参数，在37℃下，将对照和Slc12a8-OE NIH3T3细胞与100nM的3H-NMN和增加浓度的冷NMN在含有Mg2+和Ca2+的Hanks'缓冲液[pH7.5]中温育4分钟。Km和Vmax值通过非线性回归分析减去对照细胞的背景来确定(对于1和10μM，n＝5，对于25和100μM，n＝4)。对于NMN，Km为34.1±8.3μM，Vmax为11.5±1.2pmol/min/mg(图12)。Km定性地与小鼠血浆和红细胞中NMN浓度的检测范围一致(Revollo,J.R.等人，Cell Metab.,6,363-375,2007；Ramsey,K.M.等人，Science,324,651-654,2009；Yamada,K.,等人，Anal.Biochem.,352,282-285,2006)。

实施例7

本实施例说明了Slc12a8蛋白的特异性。

通过在25℃下，在转运缓冲液中，通过使用22nM 3H-NMN将Slc12a8-OE或对照NIH3T3细胞的膜级分与来源于去蛋白的红细胞质膜的磷脂双层结合(如上所述)在Slc12a8-OE和对照NIH3T3细胞的质膜级分产生的蛋白脂质体中，来生产蛋白脂质体(n＝3；通过使用Sidak多重比较检验的单向ANOVA进行分析)。Slc12a8-OE衍生的蛋白脂质体在2分钟内掺入比对照衍生的蛋白脂质体显著更高水平的3H-NMN(图13)。

在一些实验中，发现烟酸(NA)能够增强放射性标记的3H-NMN摄取到表达Slc12a8的蛋白脂质体中(图42)。在几种不同的条件下再现NA对3H-NMN摄取的增强(图42)。

为了确定Slc12a8的底物特异性，将这些Slc12a8-OE蛋白脂质体用于用3H-NMN和各种冷NAD+相关化合物的置换实验。在转运缓冲液中存在150μM竞争性冷化合物(NMN、NR、NAD、AMP、NaMN和烟酰胺)的情况下，在Slc12a8-OE蛋白脂质体中2分钟时测量3H-NMN的摄取(150nM，25℃)(n＝3，用Dunnett检验通过ANOVA进行分析)。150μM的冷NMN显示出3H-NMN的完全置换，而NAD+、AMP、烟酸单核苷酸(NaMn)和烟酰胺在相同浓度下显示非常低或可忽略的置换(图14)。150μM NR表现出约70％的置换，因此使用蛋白脂质系统测定NMN和NR的IC50浓度。NMN的IC50为22.8±3.6μM，而NR的IC50为77.4±10.8μM(图15)。数据表示为3H-NMN摄取的百分比(n＝3；通过非线性回归分析计算IC50)。因为尚未显示NR水平在病理生理条件下(如在血液(Frederick,D.W.等人，Cell Metab.,24,269-282,2016)和腹水渗出物(Sociali,G.,et al.等人，Oncotarget,7,2968-2984,2016))可以达到如此高的浓度，并且不受理论限制，这一结果表明，Slc12a8蛋白在生理条件下主要对NMN具有特异性。

这些发现表明NA和一些NA衍生化合物可用于促进Slc12a8 NMN转运蛋白的功能。

实施例8

本实施例说明了Slc12a8对NMN转运的钠离子依赖性。

在这些实验中，使用蛋白脂质系统评估Slc12a8对NMN转运的钠离子依赖性。当在蛋白脂质制备和NMN流入测量期间，用等摩尔浓度的锂(Li+)代替钠(Na+)时，3H-NMN掺入显著降低约80％(图16；n＝3，通过非配对t检验进行分析)，表明通过Slc12a8的NMN转运是钠离子依赖性的。

这些结果表明，钠盐能增强Slc12a8介导的NMN转运，其他阳离子(如锂)能抑制Slc12a8介导的NMN转运。

实施例9

本实施例说明了Slc12a8过表达对NIH3T3细胞中NAD+生物合成的影响的测定。

在对照NIH3T3和Slc12a8-OE细胞用100nM FK866、2μM双嘧达莫和500μM AOPCP的混合物预处理1小时的情况下，对照和Slc12a8-OE细胞中的细胞内NAD+水平显著降低(图41)。然而，与100μM NMN再温育1小时仅能够在Slc12a8-OE细胞中而非对照NIH3T3细胞中将NAD+水平恢复到原始水平(图41；n＝9；用Tukey检验通过ANOVA进行分析)。

实施例10

本实施例说明了NMN转运蛋白的体内验证。

如上所述产生携带对照萤火虫荧光素酶(fLuc)shRNA和Slc12a8 shRNA的慢病毒。发明人直接对小鼠肠道进行了每种病毒的管饲。通过蛋白质印迹测定对照shfLuc慢病毒和shSlc12a8慢病毒感染的空肠和回肠样品中的Slc12a8蛋白表达水平(图17)。图18显示标准化为空肠和回肠中GAPDH蛋白水平的Slc12a8蛋白水平的柱状图(n＝6；3至4月龄的B6雄性，通过非配对t检验进行分析)。与接受表达fLuc shRNA的慢病毒的小鼠相比，接受表达Slc12a8 shRNA的慢病毒的小鼠的空肠中Slc12a8蛋白水平降低约60％，回肠中Slc12a8蛋白水平降低约30％(图17-18)。当通过口服管饲法向那些小鼠施用NMN(500mg/kg体重)时，对照小鼠在5分钟时血浆NMN水平显著增加，而在Slc12a8敲低小鼠中其根本不增加(图19；通过HPLC测量NMN；n＝6；3至4月龄的B6雄性，使用Sidak检验通过ANOVA进行分析)。相反，与对照小鼠相比，Slc12a8敲低小鼠的血浆烟酰胺水平倾向于更高(图20)，这可能是因为在Slc12a8敲低小鼠中更高水平的NMN被降解成烟酰胺。除血浆样品外，在对照shfLuc慢病毒和shSlc12a8慢病毒感染的小鼠中口服管饲磷酸盐缓冲液(PBS)或NMN(500mg/kg体重)后60分钟的时间点收集空肠组织样品(对于PBS，n＝5只小鼠，对于NMN，n＝8；3至4月龄的B6雄性)。然后通过HPLC测量这些样品中的NAD+水平(用Tukey检验通过ANOVA进行分析)。与对照小鼠相比，Slc12a8敲低小鼠的空肠中NAD+水平显著降低(图21)。这些结果强烈表明，小肠中的Slc12a8对于从肠吸收NMN至血液循环很重要，其影响小肠中NAD+水平和体内全身NMN供应。

实施例11

本实施例说明了Slc12a8敲除小鼠的表征。

使用如上所述的CRISPR-CAS9系统从小鼠中切除Slc12a8基因的外显子4，从而产生全身Slc12a8敲除(Slc12a8KO)小鼠。这些敲除小鼠的出生率低于预期的孟德尔比率，这意味着在胚胎阶段存在一些过早死亡。然而，出生的幼仔生长至成年期，并且没有表现出任何明显的异常。在光亮时间(上午9至10点)或黑暗时间(下午9至10点)收集来自Slc12a8KO小鼠和对照野生型同窝出生小鼠(WT)的十二指肠、空肠、回肠和胰腺的组织样品。通过HPLC测定这些样品中的NAD+水平(除了Slc12a8KO小鼠的空肠的3个数据点之外，对于光亮时间，n＝5只小鼠，对于黑暗时间，n＝4只小鼠；8至10月龄的雌性；通过非配对t检验进行分析)。在成年Slc12a8KO小鼠中，全长Slc12a8 mRNA的表达在组织中完全消除(n＝3，2至3月龄雄性；图22)。还通过蛋白质印迹显示Slc12a8KO小鼠的空肠和回肠(图23)、胰腺(图23)和下丘脑(图24)的整个组织裂解物中，Slc12a8蛋白表达被消除。使用针对Slc12a8的N端结构域的前17个氨基酸的抗血清。敲除小鼠的十二指肠不表达全长Slc12a8蛋白(图23)，即使它在野生型小鼠中表达高水平的Slc12a8 mRNA(图2)。与小肠中的蛋白质表达谱一致，Slc12a8KO小鼠显示空肠和回肠中NAD+水平显著降低，但在十二指肠中却没有，特别是在NAD+198水平通常升高的黑暗时间期间(图25A-B)。它们还显示出在光亮和黑暗时间期间胰腺中NAD+减少(图25A-B)。为了确认在Slc12a8KO小鼠的小肠中NMN转运是否受损，本发明人进行了双标记的，3-D，更重的同位素NMN(18O-D-NMN)的管饲法，并通过质谱测量18O-D-NMN直接摄取到向空肠和回肠中。在通过口服管饲法对Slc12a8KO小鼠和对照野生型(WT)同窝出生小鼠施用500mg/kg 758 18O-D-NMN后10分钟，在野生型空肠和回肠中清楚地检测到这一同位素NMN，而Slc12a8KO小鼠的空肠和回肠中18O-D-NMN的摄取分别降低46％和36％(图26；n＝6只小鼠，3只雄性和3只雌性，年龄7至8个月，除了2只雄性和2只雌性用于野生型回肠；通过非配对t检验进行分析)。通过减去PBS对照的背景值计算18O-D-NMN峰下的面积。数值相对于WT中检测到的18O-D-NMN水平表达。在本实施例中，所有数值表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01

实施例12

本实施例说明了Slc12a8KO小鼠表现出食欲过盛而对脂肪或瘦肉没有影响。

在6至7月龄时，Slc12a8KO小鼠，特别是雌性小鼠，在黑暗期间开始表现出显著的食欲过盛(图27)。在光亮时间(上午9点至下午6点)和黑暗时间(下午6点至上午9点)，测量Slc12a8KO小鼠和对照野生型(WT)同窝出生小鼠5天的食物摄入量(每种基因型n＝8只小鼠；6至7个月大的雌性；通过非配对t检验进行分析)。然而，与野生型对照相比，Slc12a8KO小鼠在脂肪和瘦肉方面未显示出任何差异(图28)。使用全身NMR仪器测量Slc12a8KO和对照野生型同窝出生小鼠的脂肪和瘦肉的质量(每个基因型n＝8只小鼠；8至10月龄雌性)。由于对照小鼠和Slc12a8KO小鼠之间粪便脂质含量没有差异，显示的食欲过盛不是肠道吸收不良所致(图29)。在上午9点至10点测量从Slc12a8KO小鼠和对照野生型同窝出生小鼠(每个基因型n＝8只小鼠，6至8个月雌性)收集的粪便的总脂质含量，表示为提取的起始粪便质量的百分比。

实施例13

本实施例说明了Slc12a8KO小鼠的呼吸和活动增加。

有趣的是，Slc12a8KO小鼠在黑暗时间期间表现出适度的耗氧量(VO2；图30)、能量消耗(图31)和总移动(图32)的增加，这解释了为什么它们的食欲过盛表型而无体重增加。这些小鼠还表现出显著更低的呼吸交换比(RER；图33)，暗示在光亮时间期间脂肪酸利用率更高，这另外解释了为什么脂肪量保持正常，即使在对照和Slc12a8KO小鼠(未示出)之间未检测到血浆脂肪酸水平的差异。

实施例14

本实施例说明了在Slc12a8敲除小鼠中葡萄糖代谢的增加。

禁食16小时后，雌性Slc12a8KO小鼠(每种基因型n＝8只小鼠；6至8月龄的雌性；通过非配对t检验进行分析)表现出更高的葡萄糖(图34)、胰岛素(图35)和甘油三酯水平(图36)。不受理论的限制，所有这些表型共同暗示了下丘脑功能障碍。

实施例15

本实施例说明了Slc12a8敲除小鼠中胰高血糖素样肽2受体(GLP-2R)损伤。

GLP-2R是由肠内分泌L细胞产生的33个氨基酸的胰高血糖素原衍生肽。禁食24小时(从上午9点至上午9点)后，再喂养6小时(从上午10点至下午4点)，然后通过ELISA测定Slc12a8KO小鼠和对照野生型同窝出生小鼠的血浆GLP-2水平(每种基因型n＝8只小鼠；7至8月龄雌性)。响应于禁食24小时后再喂养6小时，Slc12a8KO小鼠表现出显著较低的GLP-2血浆水平，而对照小鼠在再进食中表现出显著增加的血浆GLP-2水平(图37)。

实施例16

本实施例说明了Slc12a8敲除小鼠弓形核中的表达破坏。

响应内质网(ER)应激和由此产生的瘦素抗性，Chop(DNA损伤诱导转录物3)和Socs3(细胞因子信号传导抑制剂3)被上调。在黑暗时间(下午9至10点)期间测量Slc12a8KO小鼠和对照野生型同窝出生小鼠的下丘脑弓形核中的Chop和Socs3 mRNA表达水平(Chop，每种基因型n＝3只小鼠；Socs3，每种基因型n＝4只小鼠；8至10月龄的雌性；通过非配对t检验进行分析)。与缺乏适当的GLP-2刺激一致，Slc12a8KO小鼠的弓形核显示出mRNA表达水平增加(图38)。不受理论的限制，这些结果表明弓形神经元的功能障碍(Williams,K.W.等人，Cell Metab.,20,471-482,2014)。在随意喂养的Slc12a8KO小鼠和对照野生型同窝出生小鼠的肝脏中测量PepCK(磷酸烯醇丙酮酸羧激酶)和G6pc(葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基)mRNA表达水平(每种基因型n＝5只小鼠；8至10个月大的雌性通过非配对t检验进行分析)。发现这些糖异生基因在Slc12a8KO小鼠中被上调(图39)。不受理论的限制，这些数据为弓形神经元功能障碍进一步提供了证据，并解释了为什么禁食的Slc12a8KO小鼠中葡萄糖和胰岛素水平更高。

实施例17

本实施例说明了在Slc12a8敲除小鼠中PMCH的每日mRNA表达谱。

在Slc12a8KO小鼠和对照野生型同窝出生小鼠的外侧下丘脑(LH)中，在光亮时间(上午9至10点)和黑暗时间(下午9至10点)测定前黑色素浓集激素(PMCH)mRNA表达水平(每种基因型n＝3只小鼠；8至10月龄的雌性；通过非配对t检验进行分析)。在Slc12a8KO小鼠的外侧下丘脑中PMCH的每日mRNA表达谱异常(图40)，其显示在光亮时间和黑暗时间之间表达几乎没有变化，而野生型同窝出生小鼠中PMCH的表达在黑暗时间期间显著增加。不受理论的限制，NMN转运蛋白缺陷总体上影响下丘脑功能。在Slc12a8KO小鼠的其他下丘脑核中未检测到编码主要神经肽及其受体的基因的表达异常(未示出)。不受理论的限制，这些发现揭示了Slc12a8 NMN转运蛋白的新功能，其可能通过NMN本身和GLP-2调节肠和下丘脑之间的适当组织间通讯。

实施例18

本实施例说明了小肠中NAD+和Slc12a8的浓度。

已有充分的文献证明，多种组织中NAD+的含量会随着年龄的增长而降低(Yoshino,J.等人，Cell Metab.,2018,27:513-528,2018)。测量在黑暗时间(下午9至10点)收集的2月龄(2mo)和24月龄(24mo)雌性B6小鼠的空肠和回肠中的NAD+水平。空肠和回肠中NAD+含量随着年龄的增长而降低，尽管在空肠中差异并没有达到统计学显着性(图43；(对于每个年龄，n＝4只小鼠，通过非配对t检验进行分析))。测量2月龄(2mo)和24月龄(24mo)雌性B6小鼠的空肠和回肠中Slc12a8 mRNA表达，并在黑暗时间(下午9至10点)期间收集(对于每个年龄n＝4只小鼠，通过非配对t检验进行分析)。与观察到的NAD+减少一致，Slc12a8表达在老年回肠中显著上调(图44)。这些结果表明，Slc12a8上调与肠中NAD+减少相关。

实施例19

本实施例说明了Slc12a8肠敲低对小鼠葡萄糖代谢的影响。

本发明人将携带对照萤火虫荧光素酶(fLuc)shRNA和Slc12a8 shRNA的慢病毒口服管饲至2月龄和24月龄小鼠，并检查它们的摄食行为。在光亮时间(上午9点至下午6点)和黑暗时间(下午6点至上午9点)期间，测量2月龄或24月龄的肠Slc12a8敲低雌性B6小鼠(shSlc12a8)和对照小鼠(shfLuc)4天的食物摄入量。有趣的是，肠特异性Slc12a8敲低导致年老小鼠在黑暗期间的食物摄入显著减少，而它根本不影响年轻小鼠的食物摄入(图45；(对于2月龄肠道Slc12a8敲低和对照雌性B6小鼠，n＝6只小鼠，对于24月龄肠道Slc12a8敲低和对照雌性B6小鼠，n＝9只小鼠；用Tukey检验通过ANOVA进行分析)。禁食24小时后，测量2月龄(2mo)或24月龄(24mo)肠Slc12a8敲低雌性B6小鼠(shSlc12a8)和对照小鼠(shfLuc)的空腹葡萄糖水平(图46；对于2月龄肠道Slc12a8敲低和对照雌性B6小鼠，n＝6只小鼠，对于24月龄肠道Slc12a8敲低和对照雌性B6小鼠，n＝9只小鼠；通过非配对t检验进行分析)。因此，Slc12a8敲低也降低了年老小鼠的空腹葡萄糖水平，但不降低年轻小鼠的空腹葡萄糖水平(图46)。不受理论的限制，这些结果表明Slc12a8表达影响肠中NAD+的产生。

实施例20

本实施例说明了肠特异性Slc12a8敲低显著增加血液中胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的循环水平。

GLP-1是肠内分泌L细胞产生的前胰高血糖素衍生的厌食肽。禁食24小时(从上午10点至下午4点)后，再喂养6小时，然后通过ELISA测量2月龄或24月龄肠Slc12a8敲低雌性B6小鼠(shSlc12a8)和对照小鼠(shfLuc)的血浆GLP-1水平。响应于禁食24小时后再喂养6小时，Slc12a8敲低增加了年老小鼠中的GLP-1循环水平，而在年轻小鼠中则没有(图47；对于2月龄肠道Slc12a8敲低和对照雌性B6小鼠，n＝6只小鼠，对于24月龄肠道Slc12a8敲低和对照雌性B6小鼠，n＝9只小鼠；通过非配对t检验进行分析)。不受理论的限制，这些结果表明GLP-1分泌受Slc12a8活性的影响。

实施例21

本实施例说明了Slc12a8敲低对衰老的回肠的影响。

众所周知，产生GLP的L细胞在回肠中富集(Yoon,M.J.等人，Cell Metab.,2015,21,706-717)。因此检测了Slc12a8和GAPDH在回肠中的表达。对2月龄(图48)或24月龄(图49)肠Slc12a8敲低雌性B6小鼠(shSlc12a8)和对照小鼠(shfLuc)回肠裂解物中Slc12a8和GAPDH进行了蛋白质印迹。图48-49显示了代表性的蛋白质印迹(左图)，且相应的柱状图显示了标准化为回肠中GAPDH蛋白水平的Slc12a8蛋白水平(右图)。使用针对Slc12a8的N端结构域的前17个氨基酸的抗血清(对于2月龄肠Slc12a8敲低和对照小鼠，n＝6，对于24月龄肠Slc12a8敲低和对照小鼠，n＝4-5；通过非配对t检验进行分析)。尽管Slc12a8蛋白的水平在年轻和年老的Slc12a8敲低小鼠的回肠中显著降低(图48-49)，但只有年老的Slc12a8敲低回肠显示出NAD+水平显著降低(图50)，证实了Slc12a8上调对维持年老回肠中NAD+内稳态的生理学意义。图50显示了2月龄或24月龄肠Slc12a8敲低(ShSlc12a8)和对照雌性B6小鼠(ShfLuc)回肠中NAD+水平(对于2月龄肠Slc12a8敲低和对照雌性B6小鼠各自，n＝6只小鼠，对于24月龄肠Slc12a8敲低和对照雌性B6小鼠各自，n＝9只小鼠；通过非配对t检验进行分析)。不受理论的限制，这些结果表明Slc12a8上调是维持年老回肠中NAD+内稳态所必需的。

实施例22

本实施例说明了Slc12a8敲低对培养的回肠中GLP-1水平的影响。

本发明人还离体培养了来自年老fLuc对照和Slc12a8敲低小鼠的回肠。通过ELISA测定在37℃下培养2小时的24月龄肠Slc12a8敲低雌性B6小鼠(shSlc12a8)和对照小鼠(shfLuc)的离体回肠外植体的上清液中的GLP-1水平(n＝4只小鼠，使用非配对t检验进行分析)。图51显示，与来自年老fLuc对照回肠的GLP-1水平相比，年老Slc12a8敲低回肠分泌的GLP-1水平高3倍。来自年老fLuc对照和Slc12a8敲低小鼠的离体培养的结肠显示GLP-1分泌无差异。通过ELISA测定12月龄Slc12a8KO雌性小鼠(Slc12a8KO)和对照野生型同窝出生小鼠(WT)在37℃下培养2小时的离体回肠外植体上清液中的GLP-1水平(n＝4只小鼠；通过非配对t检验进行分析)。还测量了这些来自12月龄Slc12a8KO雌性小鼠(Slc12a8KO)和对照野生型同窝出生小鼠(WT)的回肠样品中的NAD+水平(对于WT，n＝3只小鼠，对于Slc12a8KO，n＝4只小鼠；通过非配对t检验进行分析)。所有数值表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。图52显示了12月龄对照和Slc12a8KO小鼠离体培养的回肠中GLP-1分泌增加和NAD+减少。不受理论的限制，这些实施例说明Slc12a8是年老小鼠肠中NAD+降低的原因。

实施例23

本实施例说明了SIRT1和SIRT6抑制剂对离体培养的回肠的影响。

检查到SIRT1(Yoon,M.J.等人，Cell Metab.,2015 21，706-717)和SIRT6(Jiang,H.等人，Nature,2013,496,110-113)与观察到的GLP-1分泌增加有关。用SIRT1和SIRT6抑制剂处理离体培养的野生型回肠。通过ELISA测量在用0.2％DMSO、20μM EX527或20μMSTK665401培养4小的24月龄雌性B6小鼠的离体回肠外植体的上清液中的GLP-1水平(n＝3只小鼠，使用Tukey检验通过ANOVA进行分析)。只有EX527(一种有效的SIRT1特异性抑制剂)能够增加回肠的GLP-1分泌，而STK665401(一种SIRT6特异性抑制剂)不能(图53)。不受理论的限制，这些结果表明，由于显著的NAD⁺降低，导致SIRT1活性降低可能与观察到的年老Slc12a8敲低回肠中GLP-1分泌的增加有关。

当介绍本发明的要素或其优选实施方式时，冠词“一”、“一种”“该”和“所述”旨在表示存在一个或多个要素。术语“包含”、“包括”和“具有”旨在是包括性的，并且意味着可以存在除了所列出的要素之外的其他要素。

鉴于上述内容，可以看出实现了本发明的几个目的并且获得了其他有利的结果。

由于在不脱离本发明的范围的情况下可以对上述产品和方法进行各种改变，因此，上述说明书中所包含的和附图中所示出的所有内容应当被解释为说明性的而非限制性的。

Claims

1.一种对有此需要的受试者的年龄相关的病症进行治疗的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的烟酰胺单核苷酸(NMN)和至少一种其他化合物，所述其他化合物选自由以下组成的群组：烟酸、戊四烟酯、生育酚烟酸酯、β-吡啶甲醇、烟酸肌醇酯、其任意酯、其任意药学上可接受的盐及其任意组合，且其中所述年龄相关的病症包含至少一种病症，所述至少一种病症选自以下组成的群组：胰岛素敏感性的丧失、胰岛素分泌的丧失、胰岛素作用和分泌的丧失、记忆功能的损伤、眼功能下降、视网膜变性、机能衰退及其任意组合。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述年龄相关的病症包含胰岛素敏感性的丧失。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述年龄相关的病症包含胰岛素分泌的丧失。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述年龄相关的病症包含胰岛素作用和分泌的丧失。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述年龄相关的病症包含记忆功能的损伤。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述年龄相关的病症包含眼功能下降。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述年龄相关的病症包含视网膜变性。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述年龄相关的病症包含机能衰退。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述机能衰退选自由以下组成的群组：食欲不振、葡萄糖水平低、肌无力、营养不良、老年性厌食症及其任意组合。

10.一种对有此需要的受试者的医学病症进行治疗的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的烟酰胺单核苷酸(NMN)和至少一种化合物，所述化合物选自由以下组成的群组：烟酸、戊四烟酯、生育酚烟酸酯、β-吡啶甲醇、烟酸肌醇酯、其任意酯、其任意药学上可接受的盐及其任意组合，其中所述医学病症包含选自由以下组成的群组中的至少一种：肌肉疾病、2型糖尿病、肥胖症和其任意组合。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述医学病症包含肌肉疾病。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述肌肉疾病选自由以下组成的群组：肌肉虚弱、肌肉萎缩、肌肉耗损、肌肉强度下降及其任意组合。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述肌肉疾病选自由以下组成的群组：少肌症、肌力减低症、恶病质、肌营养不良、肌强直失调症、脊髓性肌肉萎缩、肌病及其任意组合。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述肌营养不良选自由以下组成的群组：Duchenne肌营养不良、Becker肌营养不良、先天性肌营养不良、远端肌营养不良、Emery-Dreifuss肌营养不良、面肩肱肌营养不良、肢带肌营养不良、眼咽肌营养不良及其任意组合。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述肌强直失调症选自由以下组成的群组：肌强直性营养不良、先天性肌强直、先天性副肌强直及其任意组合。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述肌病选自由以下组成的群组：Bethlem肌病、先天性纤维型不均衡症、进行性肌肉骨化症、甲状腺功能亢进性肌病、甲状腺功能减退性肌病、微轴空肌病、多轴空肌病、肌管性肌病、线状体肌病、周期性麻痹、低血钾性肌病、高血钾性肌病及其任意组合。

17.根据权利要求10至16中任一项所述的方法，其中所述肌肉疾病选自由以下组成的群组：酸性麦芽糖酶缺乏症、肉碱缺乏症、肉碱棕榈酰转移酶缺乏症、脱支酶缺乏症、乳酸脱氢酶缺乏症、线粒体肌病、肌腺苷酸脱氨酶缺乏症、磷酸化酶缺乏症、磷酸果糖激酶缺乏症、磷酸甘油酸激酶缺乏症及其任意组合。

18.根据权利要求10至17中任一项所述的方法，其中所述肌肉疾病选自由以下组成的群组：少肌症、肌力减低症、恶病质及其任意组合组成的组。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述肌肉疾病为少肌症。

20.根据权利要求10至19中任一项所述的方法，其中所述医学病症包含2型糖尿病。

21.根据权利要求10至20中任一项所述的方法，其中所述医学病症包含肥胖症。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述至少一种其他化合物包含烟酸、其任意酯或其任意药学上可接受的盐。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述烟酸的酯或药学上可接受的盐为结构(I)的化合物

其中R选自由以下组成的群组：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基、正辛基、2-氯乙基、2-羟基乙基、3-羟基丙基、2-甲氧基乙基、2-丁氧基乙基、氨基甲酰基甲基、1-氨基甲酰基乙基、2-二甲基氨基乙基、3-氨基丙基、四氢糠基、苄基、苯氧基乙基、对氯苯基和对硝基苯基。

24.根据权利要求23所述的方法，其中R选自由以下组成的群组：2-二甲基氨基乙基、对氯苯基和对硝基苯基。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中每天向所述受试者施用约50mg至约500mg的所述至少一种其他化合物。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中每天向所述受试者施用约10至约500mg的NMN。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用一种药物组合物，所述药物组合物包含NMN和所述至少一种其他化合物。

28.一种在有此需要的受试者中增强NMN的细胞摄取的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的化合物，所述化合物选自由以下组成的群组：烟酸、戊四烟酯、生育酚烟酸酯、β-吡啶甲醇、烟酸肌醇酯、其任意酯、其任意药学上可接受的盐及其任意组合。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述化合物包含烟酸、其酯或其药学上可接受的盐。

30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述烟酸的酯或药学上可接受的盐为结构(I)的化合物

31.根据权利要求30所述的方法，其中R选自由以下组成的群组：2-二甲基氨基乙基、对氯苯基和对硝基苯基。

32.根据权利要求28至31中任一项所述的方法，其中每天向所述受试者施用约50mg至约500mg的所述化合物。

33.一种在有此需要的受试者中刺激NAD+产生和/或增加NMN摄取到细胞中的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的编码Slc12a8的核酸。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述编码Slc12a8的核酸包含编码Slc12a8的cDNA。

35.根据权利要求33或34所述的方法，其中施用所述编码Slc12a8的核酸包含施用编码Slc12a8的基因治疗载体。

36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述基因治疗载体包含逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、甲病毒、疱疹病毒、痘苗病毒或其任意组合。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述基因治疗载体包含逆转录病毒，且所述逆转录病毒包含慢病毒。

38.根据权利要求34至37中任一项所述的方法，其中所述编码Slc12a8的cDNA包含与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少99％或100％序列同一性的序列。

39.根据权利要求33至38中任一项所述的方法，其包含将所述编码Slc12a8的核酸施用于所述受试者的胃肠道。

40.根据权利要求39所述的方法，其包含将所述编码Slc12a8的核酸施用于所述受试者的小肠。

41.根据权利要求33至40中任一项所述的方法，其中所述受试者需要治疗肌肉疾病、2型糖尿病、肥胖症、年龄相关的病症或其任意组合。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述年龄相关的病症选自由以下组成的群组：胰岛素敏感性的丧失、胰岛素分泌的丧失、胰岛素作用和分泌的丧失、记忆功能的损伤、眼功能下降、视网膜变性、机能衰退、肥胖症及其任意组合。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述年龄相关的病症包含年龄相关的肥胖症。

44.根据权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物。

45.根据权利要求1至44中任一项所述的方法，其中所述受试者为小鼠或大鼠。

46.根据权利要求1至45中任一项所述的方法，其中所述受试者为人。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述人的年龄为至少30岁，至少40岁，至少50岁，至少60岁或至少70岁。

48.一种基因治疗载体，其包含编码Slc12a8的核酸。

49.根据权利要求48所述的基因治疗载体，其中所述编码Slc12a8的核酸包含编码Slc12a8的cDNA。

50.根据权利要求48或49所述的基因治疗载体，其中所述载体包含逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、甲病毒、疱疹病毒、痘苗病毒或其任意组合。

51.根据权利要求50所述的基因治疗载体，其中所述基因治疗载体包含逆转录病毒，且所述逆转录病毒包含慢病毒。

52.根据权利要求49至51中任一项所述的基因治疗载体，其中所述编码Slc12a8的cDNA包含与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少99％或100％序列同一性的序列。

53.一种非人动物，其在Slc12a8基因中包含失活性突变。

54.根据权利要求53所述的非人动物，其中所述非人动物包含小鼠或大鼠。

55.根据权利要求53或54所述的非人动物，其中所述Slc12a8基因中的失活性突变包含Slc12a8基因中的缺失、Slc12a8基因中的插入或其组合。

56.根据权利要求55所述的非人动物，其中所述Slc12a8基因中的失活性突变包含Slc12a8基因中的缺失。

57.根据权利要求56所述的非人动物，其中所述缺失包含所述Slc12a8基因的外显子4或其部分的缺失。

58.根据权利要求57所述的非人动物，其中所述缺失包含外显子4的缺失。

59.一种哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系，其包含编码Slc12a8蛋白的cDNA，其中所述cDNA包含：

(a)编码SEQ ID NO:12(小鼠Slc12a8蛋白)、SEQ ID NO:13(小鼠Scl12a8变体A蛋白)、SEQ ID NO:14(小鼠Scl12a8变体B蛋白)或SEQ ID NO:15(人Slc12a8蛋白)的cDNA；

(b)编码与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少99％同一性的蛋白质的cDNA；或

(c)与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)或Slc12a8人全长cDNA(SEQ ID NO:11)具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少99％或100％序列同一性的cDNA序列。

60.根据权利要求59所述的哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系，其中所述哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系不包含胎盘来源的细胞。

61.一种包含编码Slc12a8蛋白的cDNA的哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系，其中所述哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系不包含胎盘来源的细胞。

62.根据权利要求61所述的哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系，其中所述cDNA编码小鼠Slc12a8蛋白或其变体或人Slc12a8蛋白或其变体。

63.根据权利要求59至62中任一项所述的哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系，其中所述cDNA包含编码SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15的cDNA。

64.根据权利要求59至63中任一项所述的哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系，其还包含一种与所述cDNA可操作地连接的启动子。

65.根据权利要求59至64中任一项所述的哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系，其中与在不包含所述cDNA的相同哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系中的Slc12a8蛋白的表达相比，所述Slc12a8蛋白的表达增加。

66.根据权利要求59至65中任一项所述的哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系，其中所述哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系缺乏可检测的CD73活性，缺乏可检测的CD38活性，或缺乏可检测的CD73活性和可检测的CD38活性。

67.根据权利要求59至66中任一项所述的哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系，其中所述哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系表现出增加的NMN摄取。

68.根据权利要求59至67中任一项所述的哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系，其中所述哺乳动物细胞包含一个成纤维细胞、肠细胞、胰腺细胞、肝细胞、脂肪细胞、神经元或神经胶质细胞，或其中所述哺乳动物细胞系包含多个成纤维细胞、肠细胞、胰腺细胞、肝细胞、脂肪细胞、神经元或神经胶质细胞。

69.根据权利要求59至68中任一项所述的哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系，其中所述哺乳动物细胞为NIH3T3细胞，或其中所述哺乳动物细胞系为NIH3T3细胞系。

70.根据权利要求59至69中任一项所述的哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系，其中所述哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系用所述cDNA序列稳定转化。

71.根据权利要求59至70中任一项所述的哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系，其中所述哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系用所述cDNA序列瞬时转染。

72.根据权利要求59至71中任一项所述的哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系，其中所述cDNA序列与GenBank参比序列NM_134251(SEQ ID NO:1)具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少99％或100％的序列同一性。

73.根据权利要求59至72中任一项所述的哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系，其中所述哺乳动物细胞为小鼠或大鼠细胞，或其中所述哺乳动物细胞系为小鼠细胞系或大鼠细胞系。

74.根据权利要求59至72中任一项所述的哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系，其中所述哺乳动物细胞为人细胞，或其中所述哺乳动物细胞系为人细胞系。

75.一种筛选候选化合物以鉴定促进NMN转运的化合物的方法，所述方法包含：

(a)使所述候选化合物与表达NMN转运蛋白的细胞或包含NMN转运蛋白的蛋白脂质体接触；和

(b)检测所述细胞中NMN转运蛋白表达或活性的变化或所述蛋白脂质体中NMN转运蛋白活性的变化；

其中，与所述候选化合物接触后，所述细胞中NMN转运蛋白表达或活性的变化或所述蛋白脂质体中NMN转运蛋白活性的变化表明所述候选化合物调节所述NMN的转运。

76.根据权利要求75所述的方法，其中所述NMN转运蛋白包含Slc12a8蛋白。

77.根据权利要求76所述的方法，其中所述Slc12a8蛋白包含与SEQ ID NO:12(小鼠Slc12a8蛋白)、SEQ ID NO:13(小鼠Scl12a8变体A蛋白)、SEQ ID NO:14(小鼠Scl12a8变体B蛋白)或SEQ ID NO:15(人Slc12a8蛋白)具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

78.根据权利要求75至77中任一项所述的方法，其进一步包含将以下进行对比：

(i)与所述候选化合物接触后，所述NMN转运蛋白在所述表达NMN转运蛋白的细胞中的表达或活性；与

(ii)与所述候选化合物接触后，所述NMN转运蛋白在不表达NMN转运蛋白的细胞或其中NMN蛋白的表达或活性已被抑制的细胞中的表达或活性。

79.根据权利要求78所述的方法，其中所述不表达NMN转运蛋白的细胞包含来源于Slc12a8敲除动物的细胞。

80.根据权利要求75至77中任一项所述的方法，其进一步包含将以下进行对比：

(i)与所述候选化合物接触后，所述NMN转运蛋白在所述包含NMN转运蛋白的蛋白脂质体中的活性；与

(ii)与所述候选化合物接触后，所述NMN转运蛋白在不包含NMN转运蛋白的蛋白脂质体或其中NMN转运蛋白的活性已被抑制的蛋白脂质体中的活性。

81.根据权利要求80所述的方法，其中所述不包含NMN转运蛋白的蛋白脂质体包含来源于Slc12a8敲除动物细胞的蛋白脂质体。

82.根据权利要求75至81中任一项所述的方法，其中所述细胞包含哺乳动物成纤维细胞、肠细胞、胰腺细胞、肝细胞、脂肪细胞、神经元或神经胶质细胞，或其中所述蛋白脂质体包含来源于哺乳动物成纤维细胞、肠细胞、胰腺细胞、肝细胞、脂肪细胞、神经元或神经胶质细胞的蛋白脂质体。

83.根据权利要求75至82中任一项所述的方法，其中所述细胞包含根据权利要求59至74中任一项所述的哺乳动物细胞，或其中所述蛋白脂质体包含来源于根据权利要求59至74中任一项所述的哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系的蛋白脂质体。

84.根据权利要求75至83中任一项所述的方法，其中所述蛋白脂质体包含来源于哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系的蛋白脂质体，所述哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系包含Slc12a8 cDNA。

85.一种包含NMN和NMN转运蛋白的激动剂的药物组合物。

86.根据权利要求85所述的药物组合物，其中所述NMN转运蛋白的激动剂包含化合物，所述化合物选自由以下组成的群组：烟酸、戊四烟酯、生育酚烟酸酯、β-吡啶甲醇、烟酸肌醇酯、其酯、其药学上可接受的盐及其组合。

87.根据权利要求85或86所述的药物组合物，其中所述NMN转运蛋白包含烟酸、其任意酯或其任意药学上可接受的盐。

88.根据权利要求87所述的药物组合物，其中所述烟酸的酯或药学上可接受的盐为结构(I)的化合物

89.根据权利要求88所述的药物组合物，其中R选自由以下组成的群组：2-二甲基氨基乙基、对氯苯基和对硝基苯基。

90.根据权利要求85至89中任一项所述的药物组合物，其中所述NMN转运蛋白为Slc12a8多肽或其同源物。

91.一种药物组合物，其包含NMN和Slc12a8或其同源物的基因表达的诱导物。