KR20200041330A - 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드를 사용한 조성물 및 치료 방법 - Google Patents

니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드를 사용한 조성물 및 치료 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20200041330A
KR20200041330A KR1020207005922A KR20207005922A KR20200041330A KR 20200041330 A KR20200041330 A KR 20200041330A KR 1020207005922 A KR1020207005922 A KR 1020207005922A KR 20207005922 A KR20207005922 A KR 20207005922A KR 20200041330 A KR20200041330 A KR 20200041330A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
slc12a8
nmn
mammalian cell
seq
protein
Prior art date
Application number
KR1020207005922A
Other languages
English (en)
Inventor
신-이치로 이메이
알레시아 그로지오
Original Assignee
워싱턴 유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 워싱턴 유니버시티 filed Critical 워싱턴 유니버시티
Publication of KR20200041330A publication Critical patent/KR20200041330A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knockout animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4406—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof only substituted in position 3, e.g. zimeldine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/455—Nicotinic acids, e.g. niacin; Derivatives thereof, e.g. esters, amides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Abstract

노화 관련 병태 및 다른 의료 병태, 예컨대 근육 질환, 2형 당뇨병, 및/또는 비만을 치료하기 위한 다양한 방법 및 조성물이 기재된다. NMN의 세포 흡수를 향상시키고, NAD+ 생산을 자극하는 방법이 추가로 기재된다. Slc12a8 단백질을 인코딩하는 cDNA를 포함하는 것들이 포함된 다양한 포유동물 세포 및 포유동물 세포주가 기재된다. Slc12a8을 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 요법 벡터 및 Slc12a8 유전자에 불활성 돌연변이를 포함하는 비-인간 동물 또한 개시된다. 또한 NMN 수송을 촉진하는 화합물을 확인하기 위해 후보 화합물을 스크리닝하는 방법이 기재된다.

Description

니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드를 사용한 조성물 및 치료 방법
정부 지원 선언문
본 발명은 미국립 보건원에 의해 수여된 AG047902 및 AG037457 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 미 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
서열목록에 대한 언급
본 개시내용의 일부인 서열목록에는, 본 발명의 프라이머, 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열을 포함하는 텍스트 파일이 포함된다. 상기 서열목록의 요지가 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 컴퓨터 판독가능한 형태에 기록된 정보가 상기 쓰여진 서열목록과 동일하다.
본 개시내용은 노화 관련 병태 및 다른 의료 병태, 예컨대 근육 질환, 2형 당뇨병 및/또는 비만을 치료하기 위한 다양한 방법 및 조성물에 관한 것이다. NMN의 세포 흡수를 향상시키고 NAD+ 생산을 자극하는 방법이 추가로 기재된다. Slc12a8 단백질을 인코딩하는 cDNA를 포함하는 것들을 포함하는 다양한 포유동물 세포 및 포유동물 세포주가 기재된다. Slc12a8을 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 요법 벡터 및 Slc12a8 유전자에 불활성화 돌연변이를 포함하는 비-인간 동물 또한 개시된다. 또한 NMN 수송을 촉진하는 화합물을 식별하기 위해 후보 화합물을 스크리닝하는 방법이 기재된다.
NAD+는 많은 세포 산화환원 반응에 관여되는 보편적이고 필수적인 조효소이다. NAD+는 또한 NAD+-의존적 단백질 탈아세틸화효소의 시르투인 계열, 폴리-ADP-리보오스 중합효소(PARPs) 및 CD38/157 NAD+가수분해효소/환형 ADP-리보오스 합성효소를 포함하여 NAD+-소비 효소의 활성을 위해 필요하다(Canto, C., 등, Cell Metab. 22, 304, 31-53, 2015; Imai, S. and Guarente, L., Trends in Cell Biology, 24, 306 464-471, 2014). 포유동물은 NAD+를 생성하기 위해 다양한 전구체, 예컨대 트립토판, 니코틴아마이드 및 니코틴산(비타민 B3의 두 형태로도 알려져 있음), 및 니코틴아마이드 리보사이드(NR) 및 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(NMN)를 비롯한 중간체를 활용한다. 니코틴아마이드에서 출발하는 구조(salvage) 경로는 포유동물에서 우세한 NAD+ 생합성 경로이다(Garten, A., 등, Nat. Rev. Endocrinol., 11, 535-546, 2015.; Imai, S., Curr. Pharm. Des., 15, 20-28, 2009). 이와 같은 경로에서, 니코틴아마이드 포스포리보실전이효소(NAMPT)는 니코틴아마이드 및 5'-포스포리보오스 파이로포스페이트로부터 NMN을 생산한다. 이어서, NMN은 ATP와 함께 NMN 아데닐릴전이효소인 NMNAT1-3에 의해 NAD+로 전환된다. NAMPT 반응의 생성물은 주요 NAD+ 중간체인 NMN이다. NAMPT는 포유동물에서 속도-제한 NAD+ 생합성 효소이다. 임의의 특정 이론에 의한 구속됨 없이, NMN이 다양한 질환 상태의 예방 및/또는 치료, 및 노화 관련 생리적 쇠퇴의 완화와 관련하여 유용할 것으로 간주된다. 그러나, NMN 수송의 기전은 논란의 대상이 되어 왔다.
Slc12a8은 본래 Gagnon, K.B. & Delpire, E. .(Am. J. Physiol. Cell Physiol., 304, C693-714, 2013)에 의해 확인되었다. 그러나, Gagnon 등은 Slc12a8에 대한 기능은 식별하지 않았다. Kubo, Y. 등(Exp. Eye Res., 124, 17-23, 2014)이 확인된 스페르민 수송체로서 Slc12a8을 식별하였으나, 그것이 NMN 수송에 관여되었음을 개시하지 않았다.
노화 관련 병태를 치료하는 다양한 방법을 필요로 하는 대상체에서의 노화 관련 병태를 치료하는 다양한 방법이 제공된다. 전형적으로, 상기 방법은 상기 대상체에게 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(NMN)의 치료적 유효량 및, 니코틴산, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트, β-피리딜카비놀, 이노시톨 헥사니코티네이트, 이의 에스테르, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 추가 화합물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 노화 관련 병태는 인슐린 감수성의 상실, 인슐린 분비의 상실, 인슐린 작용 및 분비의 상실, 기억 기능의 손상, 눈 기능의 쇠퇴, 망막 퇴행, 기능성 쇠퇴 및 이들 중 어느 것들의 조합을 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 병태를 포함한다.
다른 방법은 의료 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 의료 병태의 치료에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 대상체에게 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(NMN)의 치료적 유효량 및, 니코틴산, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트, β-피리딜카비놀, 이노시톨 헥사니코티네이트, 이의 에스테르, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 화합물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 의료 병태는 근육 질환, 2형 당뇨병, 비만 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함한다.
NMN의 세포 흡수를 향상시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 NMN의 세포 흡수를 향상시키는 방법 또한 제공된다. 상기 방법은 상기 대상체에게 니코틴산, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트, β-피리딜카비놀, 이노시톨 헥사니코티네이트, 이의 에스테르, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 이의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
NAD+ 생산을 자극하고 및/또는 NMN의 세포로의 흡수를 증가시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 NAD+ 생산을 자극하고 및/또는 NMN의 세포로의 흡수를 증가시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 상기 대상체에게 Slc12a8을 인코딩하는 핵산의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
유전자 요법 벡터가 제공된다. 상기 유전자 요법 벡터는 Slc12a8을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
비-인간 동물이 제공된다. 상기 비-인간 동물은 Slc12a8 유전자에 불활성 돌연변이를 포함한다.
포유동물 세포 또는 포유동물 세포주가 제공된다. 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주는 Slc12a8 단백질을 인코딩하는 cDNA 를 포함한다. 상기 cDNA는 서열번호: 12(마우스 Slc12a8 단백질), 서열번호: 13(마우스 Scl12a8 변이체 단백질), 서열번호: 14(마우스 Scl12a8 변이체 B 단백질) 또는 서열번호: 15(인간 Slc12a8 단백질)를 인코딩하는 cDNA를 포함한다.
추가적 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주가 제공된다. 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주는 Slc12a8 단백질을 인코딩하는 cDNA를 포함한다. 상기 cDNA는 단백질을 인코딩하는 cDNA를 포함하되, 이것은 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 또는 서열번호: 15와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는다.
그 밖의 또 다른 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주가 제공된다. 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주는 Slc12a8 단백질을 인코딩하는 cDNA를 포함한다. 상기 cDNA는 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1) 또는 Slc12a8 인간 전장 cDNA(서열번호: 11)와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 cDNA 서열을 포함한다.
또 다른 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주가 제공된다. 상기 세포 또는 세포주는 Slc12a8 단백질을 인코딩하는 cDNA를 포함한다. 상기 세포 또는 세포주는 태반-유래 세포를 포함하지 않는다.
NMN 수송체를 조절(modulate)하는 화합물을 식별하기 위한 후보 화합물을 스크리닝하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) 상기 후보 화합물을 NMN 수송체 단백질을 발현하는 세포 또는 NMN 수송체 단백질을 포함하는 프로테오리포좀(단백질 함유 리포좀)과 접촉시키는 단계; 및(b) 상기 세포에서 상기 NMN 수송체 단백질의 발현 또는 활성의 변화, 또는 상기 프로테오리포좀에서 NMN 수송체 단백질의 활성의 변화를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 후보 화합물과의 접촉 후 상기 세포에서 NMN 수송체 단백질의 발현 또는 활성의 변화, 또는 상기 프로테오리포좀에서 상기 NMN 수송체 단백질의 활성의 변화는 상기 후보 화합물이 NMN의 수송을 조절함을 나타낸다.
약제학적 조성물이 제공된다. 상기 약제학적 조성물은 NMN 및 NMN 수송체의 효능제(agonist)를 포함한다.
추가적인 약제학적 조성물이 제공된다. 상기 약제학적 조성물은 NMN 및 Slc12a8의 유전자 발현의 유발제 또는 이의 동족체를 포함한다.
도 1은 FK866로 처리된 일차 간세포, 췌장 소도 및 해마 신경구에서 통상적으로 상향조절된 유전자의 벤 다이어그램이다.
도 2는 3 월령의 B6 수컷 마우스에서 유래된 상이한 조직에서 Slc12a8 mRNA 발현을 설명한다.
도 3은 0.1% DMSO, FK866 단독으로 또는 FK866/NMN 조합으로 처리된 일차 마우스 간세포, NIH3T3 섬유모세포, 및 공장 및 회장의 생체외 외식편에서 Slc12a8 mRNA 발현 변화를 설명한다.
도 4는 DMSO, FK866 단독, 및 FK866/NMN 조합으로 처리된 일차 마우스 간세포 및 NIH3T3 섬유모세포에서 세포내 NAD+ 함량을 설명한다.
도 5는 48시간 동안 FK866, 및 FK866/NMN 조합으로 처리된 NIH3T3 세포에서 측정된 표면의 유세포측정 데이터 및 세포내 Slc12a8 단백질 발현 수준을 설명한다.
도 6은 뒤에 묘사된 NMN 경로 억제제로 처리된 일차 마우스 간세포에서 외인성 NMN 흡수의 시간 경과를 설명한다.
도 7은 일차 마우스 간세포에서 Slc12a8 및 Nrk1 mRNA 침묵화의 녹다운 효율성을 설명한다.
도 8은 HPLC에 의해 측정된, Slc12a8 및 Nrk1 mRNA 침묵화를 거친 세포의 세포내 NMN 함량을 설명한다.
도 9는 대조군 및 Slc12a8-OE NIH3T3 세포에서 유래된 원형질막 분획의 SDS-PAGE에 의해 드러난 Slc12a8 단백질 발현을 설명한다.
도 10은 대조군 및 Slc12a8-OE NIH3T3 세포에서 유래된 카베올린-1 단백질 수준으로 정규화된 Slc12a8 단백질 수준을 설명한다.
도 11은 Slc12a8 과발현 및 대조군 NIH3T3 세포에서 3H-NMN의 세포내 흡수를 설명한다.
도 12는 세포내 3H-NMN 흡수 대비 세포외 NMN을 플롯팅함으로써 미하엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 동력학의 계산을 설명한다 .
도 13은 Slc12a8-OE 세포 또는 대조군 세포 중 하나에서 유래된 프로테오리포좀(단백질 함유 리포좀)의 3H-NMN 흡수를 설명한다.
도 14는 Slc12a8의 기질 특이성을 판단하기 위해 차가운 NAD+ 관련 화합물에 대비한 3H-NMN의 이동(displacement)을 설명한다.
도 15는 상기 프로테오리포좀 시스템을 사용한 NMN 및 NR의 IC50의 결정을 설명한다.
도 16은 프로테오리포좀에 의한 3H-NMN 흡수 시 Na+ 를 Li+로 대체한 효과를 설명한다.
도 17은 개똥벌레 루시퍼라제(fLuc) shRNA 및 Slc12a8 shRNA 감염된 마우스 공장 및 회장 조직 샘플의 대표적인 웨스턴 블랏을 설명한다.
도 18은 발현 수준이 GAPDH로 정규화된, 개똥벌레 루시퍼라제(fLuc) shRNA 및 Slc12a8 shRNA 감염된 마우스 공장 및 회장 조직 샘플의 막대 그래프를 설명한다.
도 19는 대조군 및 Slc12a8 녹다운 마우스에서 NMN의 경구 위관영양법 후 60분에 걸쳐 HPLC에 의해 측정된 마우스 생체내 혈장 NMN 수준을 설명한다.
도 20은 대조군 및 Slc12a8 녹다운 마우스에서 NMN의 경구 위관영양법 후 60분에 걸쳐 HPLC로 측정한 마우스 생체내 혈장 니코틴아마이드 수준을 설명한다.
도 21은 대조군 vs Slc12a8 녹다운 마우스에서 경구 위관영양법을 통한 NMN의 투여 후 60 분 동안 수집된 공장 조직 샘플의 NAD 농도를 설명한다.
도 22는 대조군 vs Slc12a8 녹아웃 마우스의 다양한 조직에서 발현을 설명한다.
도 23은 웨스턴 블랏을 통해 Slc12a8 녹아웃 마우스의 십이지장, 공장, 회장, 및 췌장에 Slc12a8 단백질의 부재를 설명한다.
도 24는 웨스턴 블랏을 통해 Slc12a8 녹아웃 마우스의 시상하부에 Slc12a8 단백질의 부재를 설명한다.
도 25a~b는 하루 중 낮 시간 및 밤 시간 동안 Slc12a8 녹아웃 마우스에서 수집된 다양한 조직 샘플에서의 NAD+ 수준을 설명한다.
도 26은 SLc12a8 녹아웃 마우스 및 이의 야생형 한배새끼에 위관영양법에 의한 투여 후, 18O-D-NMN의 흡수를 설명한다.
도 27은 Slc12a8 녹아웃 마우스의, 이의 야생형 한배새끼와 비교한, 음식 섭취를 설명한다.
도 28은 Slc12a8 녹아웃 마우스의, 이의 야생형 한배새끼와 비교한, 지방 대 제지방 체중백분율을 설명한다.
도 29는 Slc12a8 녹아웃 마우스의, 이의 야생형 한배새끼와 비교한, 배설물 지질 함량을 설명한다.
도 30은 Slc12a8 녹아웃 마우스의, 이의 야생형 한배새끼와 비교한, 산소 소비를 설명한다.
도 31은 Slc12a8 녹아웃 마우스의, 이의 야생형 한배새끼와 비교한, 에너지 소비를 설명한다.
도 32는 Slc12a8 녹아웃 마우스의, 이의 야생형 한배새끼와 비교한, 보행(ambulation) 수치를 설명한다.
도 33은 Slc12a8 녹아웃 마우스의, 이의 야생형 한배새끼와 비교한, 더 낮은 호흡교환비율을 설명한다.
도 34는 Slc12a8 녹아웃 마우스의, 이의 야생형 한배새끼와 비교한, 글루코오스 수준을 설명한다.
도 35는 Slc12a8 녹아웃 마우스의, 이의 야생형 한배새끼와 비교한, 인슐린 수준을 설명한다.
도 36은 Slc12a8 녹아웃 마우스의, 이의 야생형 한배새끼와 비교한, 트리글리세라이드 수준을 설명한다.
도 37은 공복 및 영양재개 조건 하에서 Slc12a8 녹아웃 마우스의, 이의 야생형 한배새끼와 비교한, GLP-2의 혈장 수준을 설명한다.
도 38은 Slc12a8 녹아웃 마우스의, 이의 야생형 한배새끼와 비교한, 궁상핵 중 Chop 및 Socs3의 상대적 mRNA 발현을 설명한다.
도 39은 자유식으로(ad libitum) 먹인 Slc12a8 녹아웃 마우스의, 이의 야생형 한배새끼와 비교한,간 에서의 Pepck 및 G6pc 발현을 설명한다.
도 40은 Slc12a8 녹아웃 마우스에서의, 이의 야생형 한배새끼와 비교한, PMCH mRNA 발현을 설명한다.
도 41은 Slc12a8 과발현 구성체가 있는 또는 이것이 없는 NIH3T3 세포에서 NAD+ 생합성의 억제제의 효과를 설명한다.
도 42는 니코틴산(NA)에 의한 3H-표지 NMN(3H-NMN)의 Slc12a8-함유 프로테오리포좀으로의 흡수의 향상을 설명한다.
도 43은 2-월령 마우스에 대비하여 24-월령 마우스의 공장 및 회장에서의 줄어든 NAD+ 수준을 설명한다.
도 44는 2- 및 24-월령 마우스의 공장 및 회장에서 Slc12a8 발현을 설명한다.
도 45는 2- 및 24-월령 창자 Slc12a8 녹다운 마우스에서 4일 동안의 음식 섭취를 설명한다.
도 46은 소화관에 Slc12a8 녹다운이 있거나 또는 이것이 없는 2-월령 및 24-월령 마우스의 공복 혈당 수준을 설명한다.
도 47은 Slc12a8 및 대조군 마우스에서 GLP-1 수준으로 24-시간 금식한 후, 영양재개의 효과를 설명한다.
도 48은 2-월령 창자 Slc12a8 녹다운 마우스 및 대조군 마우스의 회장 용해물 중 Slc12a8 및 GAPDH의 웨스턴 블랏팅을 설명한다.
도 49는 24-월령 창자 Slc12a8 녹다운 마우스 및 대조군 마우스의 회장 용해물 중 Slc12a8 및 GAPDH의 웨스턴 블랏팅을 설명한다.
도 50은 2- 또는 24-월령 창자 Slc12a8 녹다운 및 대조군 마우스의 회장에서 NAD+ 수준을 설명한다.
도 51은 24-월령 창자 Slc12a8 녹다운 및 대조군 마우스의 생체외 외식편에서 유래된 GLP-1 수준 상청액의 ELISA를 설명한다.
도 52는 12-월령 Slc12a8 녹아웃 및 대조군 마우스의 외식편(좌측) 중 GLP-1 수준 및 샘플(우측) 중 NAD+ 수준을 설명한다.
도 53은 SIRT 계열 억제제로 처리된 외식편 또는 대조군에서 GLP-1 수준을 설명한다.
세포로 NMN 흡수를 향상시키는 방법이 본원에 개시된다. 또한 Slc12a8 및 그것을 위한 NMN 수송체를 연구하는 데 유용한 세포주가 개시된다. 본 발명자들은 또한 세포로 NMN 흡수를 향상시키는 수송체, Slc12a8을 확인하였다.
본원에 개시된 방법은 NMN 대사와 관련된 모든 질환 또는 병태, 예컨대, 비제한적으로, 유형 II 당뇨병, 비만, 노화 관련 비만, 노화와 관련된 혈중 지질 수준 증가, 노화와 관련된 인슐린 감수성의 감소, 노화와 관련된 기억기능의 상실 또는 감소, 노화와 관련된 눈 기능의 상실 또는 감소, 노화와 관련된 생리적 쇠퇴, 글루코오스-자극 인슐린 분비의 손상, 당뇨병의 치료, 개선, 경감, 또는 역전(reverse), 알츠하이머병의 미토콘드리아 기능, 신경 사망, 및/또는 인지 기능의 개선, 허혈/재관류 손상에서 심장의 보호, 신경 줄기/선조 세포 모집단의 유지, 손상 후 골격근 미토콘드리아 기능 및 동맥 기능, 및 노화와 관련된 기능성 쇠퇴의 회복을 위해 사용될 수 있다.
본 교시에는 비제한적으로, 하기가 포함된다:
1. 포유동물 Slc12a8 mRNA, 예컨대 마우스 Slc12a8 mRNA 또는 인간 Slc12a8 mRNA의 전장 cDNA.
2. 마우스 Slc12a8 폴리펩타이드 또는 인간 Slc12a8 폴리펩타이드를 인코딩하는 cDNA.
3. Slc12a8 cDNA, 예컨대 전장 Slc12a8 cDNA를 포함하는 포유동물 발현 벡터.
4. 세포주, 예컨대 Slc12a8 cDNA를 품은 NIH3T3 세포주(Slc12a8 cDNA, 예컨대 전장 마우스 Slc12a8 cDNA(Slc12a8-OE 세포) 또는 전장 인간 Slc12a8 cDNA를 과발현하는 세포주 포함).
5. Slc12a8 mRNA의 발현을 감소 또는 침묵화하는 shRNA를 품은 렌티바이러스.
6. Slc12a8 단백질, 예컨대 마우스 Slc12a8 단백질 또는 인간 Slc12a8 단백질의 N-말단 및 내부 도메인에 대항하는 다클론성 항체(토끼 다클론성 항체 포함).
7. 전신 Slc12a8 녹아웃 마우스.
본 교시에는 수송 단백질, 예컨대 막 이중층에 포매된 Slc12a8 단백질을 갖는 리포좀을 포함하는 프로테오리포좀(단백질 함유 리포좀) 시스템이 포함된다. 그와 같은 시스템은 Slc12a8 단백질의 특성을 분석하고, Slc12a8에 대한 친화도, 또는 Slc12a8 활성의 효능제 또는 길항제로서의 활성에 대해 후보 약물을 시험하기 위해, 사용될 수 있다.
본 교시에는 세포, 조직, 및 기관, 예컨대 소화관에서 NMN의 흡수를 촉진하는 방법이 포함된다. 이들 방법은 상기 소화관에 Slc12a8의 cDNA를 투여하는 것을 포함한다. 이들 방법은 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA를 포함하는 렌티바이러스를 소화관에 투여하는 것을 포함할 수 있다.
NMN의 흡수를 촉진하는 방법은 나트륨 염과 조합하여 NMN을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 투여는 경구 투여일 수 있다.
본 교시에는 NMN 흡수를 향상시키기 위해 니코틴산(NA) 또는 NA 유도체 화합물(즉, NA의 구조 유사체)을 그것을 필요로 하는 대상체에 투여하는 것이 포함된다. 본 교시에는 Slc12a8 NMN 수송체의 NMN 흡수 기능을 향상시키기 위해 그것을 필요로 하는 대상체에 니코틴산(NA) 또는 NA 유도체 화합물(즉, NA의 구조유사체)을 투여하는 것이 포함된다. 니코틴산(NA) 또는 NA 유도체 화합물은, 예컨대, 비제한적으로, NA 또는 NA 유도체 화합물 10~500mg/일 또는 50~500mg/일의 투약 범위로 그것을 필요로 하는 대상체에 투여될 수 있다. 상기 투여는 경구 투여, 비경구 투여, 또는 이의 조합일 수 있다.
본 교시에는 NMN의 흡수를 조장 또는 촉진하기 위해(Slc12a8 NMN 수송체의 NMN 흡수 기능을 향상시킴으로써 이루어짐) 그것을 필요로 하는 대상체에 NA 또는 NA 유도체 화합물을 NMN과 조합하여 투여하는 단계가 포함된다. 이와 같은 조합물이 예컨대, 비제한적으로, 각각의 NMN 및 NA 또는 NA 유도체 화합물 10~500mg/일, 또는 50~500mg/일의 투약 범위로, 그것을 필요로 하는 대상체에 투여될 수 있다. 상기 투여는 경구 투여, 비경구 투여, 또는 이의 조합일 수 있다.
본 교시에는 NMN의 흡수를 촉진하기 위해, 그것을 필요로 하는 대상체에 NMN, 및 일부 염(,,예를 들어, Na+)의 조합물을 투여하는 것이 포함된다. 상기 조합물은 경구로 투여되는 조합물일 수 있다. 상기 조합물은 비경구로 투여되는 조합물일 수 있다. NMN 및 NMN 흡수-촉진 염, 예컨대 나트륨 염 각각은 예컨대, 비제한적으로, 10~500mg/일, 또는 50~500mg/일의 투약 범위로 투여될 수 있다.
본 교시에는 NMN의 흡수를 촉진하기 위해, 그것을 필요로 하는 대상체에 NMN, 나트륨 염, 및 니코틴산(NA) 또는 NA 유도체 화합물의 조합물을 투여하는 것이 포함될 수 있다. 나트륨 염, 및 니코틴산(NA) 또는 NA 유도체 화합물의 하나 또는 임의의 조합물이 경구로 투여될 수 있다. 상기 투여는 임의의 또는 모든 NMN, 나트륨 염 및 니코틴산(NA) 또는 NA 유도체 화합물에 대한 경구 투여를 포함할 수 있다. NMN, 나트륨 염 및 니코틴산(NA) 또는 NA 유도체 화합물 각각은 그것을 필요로 하는 대상체에 예컨대, 비제한적으로, 10~500mg/일, 또는 50~500mg/일의 투약 범위로 투여될 수 있다.
본 교시에는 또한 Slc12a8 NMN 수송체의 NMN 흡수 기능을 억제하기 위해, 그것을 필요로 하는 대상체에, 니코틴아마이드 리보사이드(NR) 또는 NR 유도체 화합물을 투여하는 것이 포함된다. 상기 니코틴아마이드 리보사이드(NR) 또는 NR 유도체 화합물은 경구로 투여될 수 있다. 상기 NR 또는 NR 유도체 화합물은 그것을 필요로 하는 대상체에 예컨대, 비제한적으로, 10~500mg/일, 또는 50~500mg/일의 투약 범위로 투여될 수 있다.
본 교시에는 또한 Slc12a8 NMN 수송체의 NMN 흡수 기능을 억제하기 위해, 그것을 필요로 하는 대상체에 비-나트륨 염 예컨대, 예를 들어, 리튬 염을 투여하는 것이 포함된다. 상기 비-나트륨 염은 경구로 투여될 수 있다. 상기 비-나트륨 염은 그것을 필요로 하는 대상체에 예컨대, 비제한적으로, 10~500mg/일, 또는 50~500mg/일의 투약 범위로 투여될 수 있다.
본 교시에는 Slc12a8 NMN 수송체의 NMN 흡수 기능을 억제하기 위해, 그것을 필요로 하는 대상체에, 니코틴아마이드 리보사이드(NR) 또는 NR 유도체 화합물을 비-나트륨 염, 예컨대, 예를 들어, 리튬 염과 조합하여 투여하는 것이 포함된다. 상기 NR 또는 NR 유도체 화합물, 및/또는 상기 비-나트륨 염은 경구로 투여될 수 있다. 상기 NR 또는 NR 유도체 화합물, 및 상기 비-나트륨 염은 각각 그것을 필요로 하는 대상체에 예컨대, 비제한적으로, 10~500mg/일, 또는 50~500mg/일의 투약 범위로 투여될 수 있다.
본 교시는 대상체에서 NAD+ 생산을 자극하는 방법을 개시한다. 상기 방법은 그것을 필요로 하는 대상체에 게놈 DNA 또는 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA를 포함하는 핵산을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 핵산은 게놈 DNA 또는 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA, 예컨대, 비제한적으로, NM_134251(서열번호: 1), Slc12a8 마우스 변이체 A(서열번호: 9), Slc12a8 마우스 변이체 B(서열번호: 10), 또는 Slc12a8 인간 전장 cDNA(서열번호: 11)으로 명시된 서열을 갖는 cDNA를 포함하는 렌티바이러스이거나 또는 이것을 포함할 수 있다. 상기 대상체는 포유동물(예를 들어, 마우스, 랫트, 또는 인간)일 수 있다. 상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1)과 서열 동일성이 적어도 70%, Slc12a8 마우스 변이체 A(서열번호: 9)와 서열 동일성이 적어도 70%, Slc12a8 마우스 변이체 B(서열번호: 10)와 서열 동일성이 적어도 70%, 또는 Slc12a8 인간 전장 cDNA(서열번호: 11)와 서열 동일성이 적어도 70%인 서열을 포함할 수 있다. 상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 유전자은행 참조 서열 NM_134251의 서열일 일부이거나, 또는 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1)과 서열 동일성이 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 서열번호: 9의 서열의 일부이거나, 또는 서열번호: 9와의 서열 동일성이 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 서열번호: 10으로 제시된 Slc12a8 마우스 변이체 b의 서열의 일부이거나, 또는 Slc12a8 마우스 변이체 b(서열번호: 10)와의 서열 동일성이 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 서열번호: 11로 제시된 Slc12a8 인간 전장 서열의 서열의 일부이거나, 또는 Slc12a8 인간 전장 서열(서열번호: 11)와 서열 동일성이 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다.
본 교시에는 대상체에서 세포로의 NMN 흡수를 촉진 또는 증진하는 방법이 포함된다. 상기 방법은 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA, 또는 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1), Slc12a8 마우스 변이체 A(서열번호: 9), Slc12a8 마우스 변이체 B(서열번호: 10), 또는 Slc12a8 인간 전장 cDNA(서열번호: 11)과 서열 동일성이 적어도 70%인 서열을 포함하는 핵산을, 이것을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1)과 서열 동일성이 적어도 70%인 서열은 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1)과 서열 동일성이 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다. Slc12a8 마우스 변이체 a(서열번호: 9)와 서열 동일성이 적어도 70%인 서열은 Slc12a8 마우스 변이체 a(서열번호: 9)와 서열 동일성이 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다. Slc12a8 마우스 변이체 b(서열번호: 10)와 서열 동일성이 적어도 70%인 서열은 Slc12a8 마우스 변이체 b(서열번호: 10)와 서열 동일성이 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다. Slc12a8 전장 인간 cDNA(서열번호: 11)과 서열 동일성이 적어도 70%인 서열은 Slc12a8 전장 인간 cDNA(서열번호: 11)과 서열 동일성이 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다. 상기 cDNA는 소화관에 투여될 수 있다. 이와 같은 투여는 위관영양법에 의한 투여를 포함할 수 있다. 이와 같은 투여는 소장에서 용해되도록 설계된 경구 약제를 포함할 수 있다.
본 교시에는 Slc12a8 유전자에 결손을 포함하는 녹아웃 마우스가 포함된다. 상기 결손은 Slc12a8 유전자의 완전한 결손이거나, 또는 Slc12a8 유전자의 부분적인 결손, 예컨대, 그러나 예를 들어 비제한적으로, 상기 Slc12a8 유전자의 엑손 4의 결손 또는 상기 Slc12a8 유전자의 엑손 4 내의 결손일 수 있다.
본 교시에는 Slc12a8 유전자의 도입된 서열, 또는 cDNA, 예컨대 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1), Slc12a8 마우스 변이체 A(서열번호: 9), Slc12a8 마우스 변이체 B(서열번호: 10), 또는 Slc12a8 인간 전장 cDNA(서열번호: 11)로서 제시된 서열을 포함하는 포유동물 세포주가 포함된다. 상기 도입된 Slc12a8 유전자 또는 cDNA는 외인성 기원의 일부이거나, 또는 상기 숙주 포유동물 세포주와 같은 동일한 종의 일부일 수 있다. 상기 포유동물 세포주는 Slc12a8 유전자 또는 cDNA가 도입된 바 없는 모체 세포주보다 더 높은 수준에서 Slc12a8 폴리펩타이드를 발현할 수 있다.
본 교시에는 비-자연 발생 서열, 즉, 형질변환 또는 형질감염에 의해 상기 세포주에 도입된 서열, 및 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1), Slc12a8 마우스 변이체 A(서열번호: 9), Slc12a8 마우스 변이체 B(서열번호: 10), 또는 Slc12a8 인간 전장 cDNA(서열번호: 11)과 서열 동일성이 적어도 70%인 서열을 포함하는 포유동물 세포주가 포함된다. 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1)과 서열 동일성이 적어도 70% 인 서열은 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1)과 서열 동일성이 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다. Slc12a8 마우스 변이체 a(서열번호: 9)와 서열 동일성이 적어도 70%인 서열은 Slc12a8 마우스 변이체 a(서열번호: 9)와 서열 동일성이 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다. Slc12a8 마우스 변이체 b(서열번호: 10)와 서열 동일성이 적어도 70%인 서열은 Slc12a8 마우스 변이체 b(서열번호: 10)와 서열 동일성이 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다. Slc12a8 전장 인간 cDNA(서열번호: 11)와 서열 동일성이 적어도 70%인 서열은 Slc12a8 전장 인간 cDNA(서열번호: 11)와 서열 동일성이 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다.
본 교시에는 Slc12a8 서열, 예컨대 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1), Slc12a8 마우스 변이체 A(서열번호: 9), Slc12a8 마우스 변이체 B(서열번호: 10), 또는 Slc12a8 인간 전장 cDNA(서열번호: 11)을 포함하는 포유동물 세포주가 포함된다. 본 교시의 세포주의 상기 Slc12a8 서열은 숙주세포와 비교하여 이종성 기원에서 유래한 것일 수 있다.
본 교시의 세포주는 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1), Slc12a8 마우스 변이체 A(서열번호: 9), Slc12a8 마우스 변이체 B(서열번호: 10), 또는 Slc12a8 인간 전체 -길이 cDNA(서열번호: 11)과 서열 동일성이 적어도 70%인 서열일 수 있는 Slc12a8 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열은 게놈 또는 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA의 일부일 수 있다. 본 교시의 세포주의 게놈 또는 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 상기 숙주세포와 비교하여 이종성 기원에서 유래된 것일 수 있다. Slc12a8을 인코딩하는 서열을 포함하는 세포주는 Slc12a8을 인코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 상기 세포주는 포유동물 세포주일 수 있다. 상기 포유동물 세포주에는 CD73 활성이 없거나, CD38 활성이 없을 수 있고, 또는 CD73 활성 및 CD38 활성 둘 다 없을 수 있다. 상기 포유동물 세포주은 NIH 3T3 세포주일 수 있다. 상기 포유동물 세포주는 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1), Slc12a8 마우스 변이체 A(서열번호: 9), Slc12a8 마우스 변이체 B(서열번호: 10), 또는 Slc12a8 인간 전장 cDNA(서열번호: 11)와 서열 동일성이 적어도 70%인 서열을 포함하는 안정적으로 형질변환된 세포주일 수 있다. 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1)과 서열 동일성이 적어도 70%인 서열은 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1)과 서열 동일성이 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다. 상기 포유동물 세포주은 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1)과 서열 동일성이 적어도 70%인 서열로 일시적으로 형질감염될 수 있다. 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1)와 서열 동일성이 적어도 70%인 서열은 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1)과 서열 동일성이 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다. 상기 포유동물 세포주는 마우스 세포주, 랫트 세포주, 또는 인간 세포주일 수 있다. 상기 포유동물 세포주는 마우스 세포주 및 랫트 세포주로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 포유동물 세포주는 인간 세포주일 수 있다. 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1), Slc12a8 마우스 변이체 A(서열번호: 9), Slc12a8 마우스 변이체 B(서열번호: 10), 또는 Slc12a8 인간 전장 cDNA(서열번호: 11)과 서열 동일성이 적어도 70%인 서열은 전장 Slc12a8 cDNA일 수 있다.
본 교시의 방법은 NMN의 세포 흡수를 향상시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 NMN의 세포 흡수를 향상시키는 방법을 포함할 수 있다. 이들 방법은 니코틴산 또는 에스테르의 치료적 유효량 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 그것을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 니코틴산의 에스테르 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 구조
Figure pct00001
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염일 수 있는데, 여기서 R는 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-헥실, n-옥틸, 2-클로로에틸, 2-하이드록시에틸, 3-하이드록시프로필, 2-메톡시에틸, 2-부톡시에틸, 카바모일메틸, l-카바모일에틸, 2-디메틸아미노에틸, 3-아미노프로필, 테트라하이드로푸르푸릴, 벤질, 페녹시에틸, p-클로로페닐 및 p-니트로페닐로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. R는 H, 2-디메틸아미노에틸, p-클로로페닐, 또는 p-니트로페닐일 수 있다. R는 H, 2-디메틸아미노에틸, p-클로로페닐, 및 p-니트로페닐로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. R는 2-디메틸아미노에틸, p-클로로페닐, 및 p-니트로페닐로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. R는 H, C1~C6 선형 알킬, C3~C6 분지쇄 알킬, C3~C6 사이클로알킬, C1~C6 선형 알콕시, C3~C6 분지쇄 알콕시 및 C3~C6 사이클로알콕시로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. R는 H, C1~C6 선형 알콕시, C3~C6 분지쇄 알콕시, C3~C6 사이클로알콕시, C1~C6 선형 할로알콕시, C3~C6 분지쇄 할로알콕시, C3~C6 사이클로할로알콕시, C1~C6 선형 하이드록시알콕시, C3~C6 분지쇄 하이드록시알콕시, C3~C6 사이클로하이드록시알콕시, 알콕시메틸, 알콕시에틸, 알콕시알콕시메틸, 알콕시알콕시에틸, 벤질, 알콕시벤질, 나프틸 및 알콕시나프틸로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
R는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-헥실, n-옥틸, 2-클로로에틸, 2-하이드록시에틸, 3-하이드록시프로필, 2-메톡시에틸, 2-부톡시에틸, 카바모일메틸, l-카바모일에틸, 2-디메틸아미노에틸, 3-아미노프로필, 테트라하이드로푸르푸릴, 벤질, 페녹시에틸, p-클로로페닐, 및 p-니트로페닐로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. R는 2-디메틸아미노에틸, p-클로로페닐, 또는 p-니트로페닐일 수 있다. R는 2-디메틸아미노에틸, p-클로로페닐, 및 p-니트로페닐로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. R는 2-디메틸아미노에틸, p-클로로페닐 및 p-니트로페닐로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. R는 C1~C6 선형 알킬, C3~C6 분지쇄 알킬, C3~C6 사이클로알킬, C1~C6 선형 알콕시, C3~C6 분지쇄 알콕시 및 C3~C6 사이클로알콕시로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. R는 C1~C6 선형 알콕시, C3~C6 분지쇄 알콕시, C3~C6 사이클로알콕시, C1~C6 선형 할로알콕시, C3~C6 분지쇄 할로알콕시, C3~C6 사이클로할로알콕시, C1~C6 선형 하이드록시알콕시, C3~C6 분지쇄 하이드록시알콕시, C3~C6 사이클로하이드록시알콕시, 알콕시메틸, 알콕시에틸, 알콕시알콕시메틸, 알콕시알콕시에틸, 벤질, 알콕시벤질, 나프틸 및 알콕시나프틸로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 교시에는 NMN의 세포 흡수를 향상시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 NMN의 세포 흡수를 향상시키는 방법이 포함된다. 이들 방법은 대상체에게 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 화합물은 니코틴산
Figure pct00002
, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트, β-피리딜카비놀 또는 이노시톨 헥사니코티네이트일 수 있다. 상기 화합물은 니코틴산, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트, β-피리딜카비놀 및 이노시톨 헥사니코티네이트로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 니코틴산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염일 수 있다. 상기 투여는 니코틴산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 하루 50~500mg 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 투여는 니코틴산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 하루 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 또는 500mg투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 투여는 니코틴산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 하루 50~55, 55~60, 60~65, 65~70, 70~75, 85~80, 80~85, 85~90, 90~95, 95~100, 100~105, 105~110, 110~115, 115~120, 120~125, 125~130, 130~135, 135~140, 140~145, 145~150, 150~155, 155~160, 160~165, 165~170, 170~175, 175~180, 180~185, 185~190, 190~195, 195~200, 200~205, 205~210, 210~215, 215~220, 220~225, 225~230, 230~235, 235~240, 240~245, 245~250, 250~255, 255~260, 260~265, 265~270, 270~275, 275~280, 280~285, 285~290, 290~295, 295~300, 300~305, 305~310, 310~315, 315~320, 320~325, 325~330, 330~335, 335~340, 340~345, 345~350, 350~355, 355~360, 360~365, 365~370, 370~375, 375~380, 380~385, 385~390, 390~395, 395~400, 400~405, 405~410, 410~415, 415~420, 420~425, 425~430, 430~435, 435~440, 440~445, 445~450, 450~455, 455~460, 460~465, 465~470, 470~475, 475~480, 480~485, 485~490, 490~495, 또는 495~500mg투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 투여는 니코틴산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 하루 50~60, 60~70, 70~80, 80~90, 90~100, 100~110, 110~120, 120~130, 130~140, 140~150, 150~160, 160~170, 170~180, 180~190, 190~200, 200~210, 210~220, 220~230, 230~240, 240~250, 250~260, 260~270, 270~280, 280~290, 290~300, 300~310, 310~320, 320~330, 330~340, 340~350, 350~360, 360~370, 370~380, 380~390, 390~400, 400~410, 410~420, 420~430, 430~440, 440~450, 450~460, 460~470, 470~480, 480~490, 490~500mg투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것은 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 약제학적으로 허용가능한 부형제와 함께 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 교시에는 인슐린 감수성 및/또는 인슐린 분비의 노화 관련 손실을 치료, 개선, 감소, 예방 또는 역전하는 것을 그것을 필요로 하는 대상체에서 수행하는 방법이 포함된다. 인슐린 감수성의 노화 관련 손실을 치료, 개선, 감소, 예방 또는 역전하는 것을 그것을 필요로 하는 대상체에서 수행하는 방법은 NMN 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 유효량, 및 니코틴산, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 니세리트롤 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 토코페롤 니코티네이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 β-피리딜카비놀 이노시톨 헥사니코티네이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 중 적어도 하나의 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 인슐린 분비의 노화 관련 손실의 치료, 개선, 감소, 예방 또는 역전하는 것을 그것을 필요로 하는 대상체에서 수행하는 방법은 NMN 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 유효량, 또는 니코틴산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 니세리트롤 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 토코페롤 니코티네이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 β-피리딜카비놀 이노시톨 헥사니코티네이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 중 적어도 하나의 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 교시에는 기억 기능의 노화 관련 손상을 치료, 개선, 감소, 예방 또는 역전하는 것을 그것을 필요로 하는 대상체에서 수행하는 방법이 포함된다. 기억 기능의 노화 관련 손상을 치료, 개선, 감소, 예방 또는 역전하는 것을 그것을 필요로 하는 대상체에서 수행하는 방법은 NMN 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 유효량, 및 니코틴산, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 니세리트롤 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 토코페롤 니코티네이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 β-피리딜카비놀 이노시톨 헥사니코티네이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 중 적어도 하나의 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 교시에는 눈 기능의 노화 관련 쇠퇴를 치료, 개선, 감소, 예방 또는 역전하는 것을 그것을 필요로 하는 대상체에서 수행하는 방법이 포함된다. 상기 눈 기능의 노화 관련 쇠퇴를 치료, 개선, 감소, 예방 또는 역전하는 것을 그것을 필요로 하는 대상체에서 수행하는 방법은 NMN 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 유효량, 및 니코틴산, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 니세리트롤 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 토코페롤 니코티네이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, β-피리딜카비놀 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 이노시톨 헥사니코티네이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 중 적어도 하나의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
노화 관련 망막 퇴행을 치료하는 것을 그것을 필요로 하는 대상체에서 수행하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 NMN 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 니코틴산, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 니세리트롤 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 토코페롤 니코티네이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, β-피리딜카비놀 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 이노시톨 헥사니코티네이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 중 적어도 하나를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
노화 관련 망막 퇴행, 눈 기능의 노화 관련 쇠퇴, 기억 기능의 노화 관련 손상, 또는 인슐린 감수성의 노화 관련 손실을 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 NMN 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 니코틴산, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 니세리트롤 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 토코페롤 니코티네이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, β-피리딜카비놀 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 이노시톨 헥사니코티네이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 중 적어도 하나를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
노화와 관련된 기능성 쇠퇴를 치료, 개선, 예방 또는 역전하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 NMN 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 니코틴산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 니세리트롤 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 토코페롤 니코티네이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, β-피리딜카비놀 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 이노시톨 헥사니코티네이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 중 적어도 하나를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 노화와 관련된 기능성 쇠퇴는 식욕 상실, 낮은 글루코오스 수준, 근육 약화, 근육감소증, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
당뇨병을 치료, 개선, 예방 또는 역전하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 NMN 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 니코틴산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 니세리트롤 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 토코페롤 니코티네이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, β-피리딜카비놀 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 이노시톨 헥사니코티네이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 중 적어도 하나를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 당뇨병은 유형 I 당뇨병 또는 유형 II 당뇨병일 수 있다.
비만을 치료, 개선, 예방 또는 역전하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 NMN 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 니코틴산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 니세리트롤 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 토코페롤 니코티네이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, β-피리딜카비놀 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 이노시톨 헥사니코티네이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 중 적어도 하나를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물이 제공된다. 상기 약제학적 조성물은 NMN 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염과, NMN 수송체의 효능제를 포함할 수 있다. 상기 NMN 수송체의 효능제는 니코틴산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 니세리트롤 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 토코페롤 니코티네이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, β-피리딜카비놀 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 이노시톨 헥사니코티네이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염일 수 있다. 상기 NMN 수송체의 효능제는 니코틴산, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, β-피리딜카비놀 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 이노시톨 헥사니코티네이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 NMN 수송체는 Slc12a8 폴리펩타이드 또는 이의 동족체일 수 있다.
추가 약제학적 조성물이 제공된다. 상기 약제학적 조성물은 NMN과, Slc12a8 또는 이의 동족체의 유전자 발현의 유발제를 포함할 수 있다. 상기 Slc12a8은 승인 번호 NM_134251(서열번호: 12); Slc12a8 마우스 변이체 a(서열번호: 13); Slc12a8 마우스 변이체 b,(서열번호: 14) 또는 Slc12a8 인간(서열번호: 15)로 확인된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 교시에는 대상체에서 NAD+ 생산을 자극하는 방법, 및 대상체에서 세포로의 NMN 흡수를 증가시키는 방법이 포함된다. 상기 대상체는 NMN 대사를 수반하는 질환, 예컨대, 예를 들어, 노화와 관련된 비만에 대한 치료를 필요로 하는 대상체일 수 있다. 이들 방법은 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA를 포함하는 핵산을 그것을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 포유동물, 예컨대 인간, 또는 설치류 예컨대 마우스 또는 랫트에서 유래된 Slc12a8 mRNA 전사체의 Slc12a8 cDNA일 수 있다. 상기 핵산에는 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA를 포함하는 렌티바이러스가 포함될 수 있다. 상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA에는 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1)에 기재된 서열이 포함되거나, 또는 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1)에 기재된 서열과 서열 동일성이 70% 이상일 수 있다. 본 교시의 렌티바이러스는 치료가 필요한 대상체의 소장에 투여될 수 있다.
본 교시에는 또한 Slc12a8 유전자에 결손을 포함하는 녹아웃 마우스가 포함된다. 상기 결손은, 비제한적으로, 상기 Slc12a8 유전자의 엑손 4에서의 결손일 수 있다.
본 교시에는 추가로, Slc12a8을 인코딩하는 cDNA 폴리펩타이드, 또는 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1)과 서열 동일성이 적어도 70%인 cDNA 서열을 포함하는 포유동물 세포주가 포함된다. 상기 세포주는 상기 cDNA로 안정적으로 형질변환되거나, 또는 상기 cDNA로 일시적으로 형질변환될 수 있다. 상기 cDNA는 조절 서열, 예컨대, 예를 들어 및 비제한적으로 상기 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터 또는 인핸서에 작동가능하게 연결될 수 있다.
상기 포유동물 세포주에는 CD73 및/또는 CD38 활성이 없을 수 있다.
상기 포유동물 세포주는 마우스 세포주, 랫트 세포주, 또는 인간 세포주일 수 있다. 상기 포유동물 세포주는 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1)과 서열 동일성이 적어도 70%인 cDNA 서열로 형질변환된 NIH 3T3 세포주일 수 있다. 상기 형질변환은 안정적 형질변환 또는 일시적 형질변환일 수 있다.
본 교시에는 또한 NMN의 세포 흡수를 향상시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 NMN의 세포 흡수를 향상시키는 방법이 포함된다. 이들 방법에는 니코틴산 또는 에스테르 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계가 포함된다. 상기 니코틴산의 에스테르는 하기 구조
Figure pct00003
를 가질 수 있되, R는 비제한적으로, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-헥실, n-옥틸, 2-클로로에틸, 2-하이드록시에틸, 3-하이드록시프로필, 2-메톡시에틸, 2-부톡시에틸, 카바모일메틸, l-카바모일에틸, 2-디메틸아미노에틸, 3-아미노프로필, 테트라하이드로푸르푸릴, 벤질, 페녹시에틸, p-클로로페닐, 또는 p-니트로페닐일 수 있다. R는 H, 2-디메틸아미노에틸, p-클로로페닐, 또는 p-니트로페닐일 수 있다. R는 2-디메틸아미노에틸, p-클로로페닐, 또는 p-니트로페닐일 수 있다.
본 교시에는 또한 NMN의 세포 흡수를 향상시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 NMN의 세포 흡수를 향상시키는 방법이 포함된다. 이들 방법에는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계가 포함될 수 있는데, 여기서 상기 화합물은 니코틴산, 니코틴산의 에스테르, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트, β-피리딜카비놀 또는 이노시톨 헥사니코티네이트이다. 상기 투여는 니코틴산, 니코틴산의 에스테르, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트, β-피리딜카비놀 또는 이노시톨 헥사니코티네이트, 또는 이들 화합물 중 임의의 것의 약제학적으로 허용가능한 염을 50~500mg/일 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 약제학적으로 허용가능한 부형제와 함께 투여될 수 있다.
본 교시에는 또한 인슐린 감수성의 노화 관련 손실을 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에서 인슐린 감수성의 노화 관련 손실을 치료하는 방법, 인슐린 분비의 노화 관련 손실을 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에서 인슐린 분비의 노화 관련 손실을 치료하는 방법, 인슐린 작용의 노화 관련 손실을 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에서 인슐린 작용의 노화 관련 손실을 치료하는 방법, 인슐린 작용 및 분비의 노화 관련 손실을 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에서 인슐린 작용 및 분비의 노화 관련 손실을 치료하는 방법, 기억 기능의 노화 관련 손상을 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에서 기억 기능의 노화 관련 손상을 치료하는 방법, 눈 기능의 노화 관련 쇠퇴를 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에서 눈 기능의 노화 관련 쇠퇴를 치료하는 방법, 및 노화 관련 망막 퇴행을 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에서 노화 관련 망막 퇴행을 치료하는 방법이 포함된다. 이들 방법은 NMN의 약제학적 유효량 뿐만 아니라, 화합물 예컨대 니코틴산, 니코틴산의 에스테르, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트, β-피리딜카비놀 또는 이노시톨 헥사니코티네이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 교시에는 또한 근육 질환을 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에서 근육 질환을 치료하는 방법이 포함된다. 본 교시에 따라 치료될 수 있는 근육 질환에는, 비제한적으로, 근육 허약, 근위축, 근육 소모, 근육 강도의 감소가 포함된다. 본 교시에 따라 치료될 수 있는 근육 질환에는, 비제한적으로, 근육감소증, 운동신경감소증, 악액질, 근이영양증, 근긴장성 장애, 척추 근육 위축증, 및 근병증이 포함된다. 상기 근이영양증은 예를 들어, 뒤센 근이영양증, 베커 근이영양증, 선천성 근이영양증, 원위근이영양증, 에머리-드라이푸스 근이영양증, 안면견갑상완형근이영양증, 사지 연결 근이영양증, 또는 안구인두 근이영양증일 수 있다. 상기 근긴장성 장애는 근긴장성 이영양증, 선천성근강직증, 또는 선천성 이상근긴장증일 수 있다. 상기 근병증은 베들렘 근병증, 선천성 섬유 유형 불균형, 진행성 골화성 섬유이형성증, 갑상선 기능항진근병증, 갑상선 기능저하 근병증, 소형코어(minicore) 근병증, 다중코어(multicore) 근병증, 근관성 근병증, 네말린 근병증, 주기성 근육마비, 저칼륨혈증 근병증 또는 고칼륨혈증 근병증일 수 있다. 상기 근육 질환은 산 말타아제 결핍, 카르니틴 결핍, 카르니틴 팔미틸 전이효소 결핍, 가지제거(debrancher) 효소 결핍, 락테이트 탈수소효소 결핍, 미토콘드리아 근병증, 근아데닐산탈아미노효소 결핍, 포스포릴라제 결핍, 포스포푸룩토키나제 결핍, 또는 포스포글리세레이트 키나제 결핍일 수 있다. 상기 근육 질환은 근육감소증, 운동신경감소증 또는 악액질일 수 있다. 상기 근육 질환은 근육감소증일 수 있다. 이들 방법은 NMN의 약제학적 유효량 뿐만 아니라, 화합물 예컨대 니코틴산, 니코틴산의 에스테르, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트, β-피리딜카비놀 또는 이노시톨 헥사니코티네이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 교시에는 또한 NMN 및, NMN 수송체의 효능제를 포함하는 약제학적 조성물이 포함된다. NMN 수송체의 효능제는, 비제한적으로, 니코틴산, 니코틴산의 에스테르, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트, β-피리딜카비놀 또는 이노시톨 헥사니코티네이트일 수 있다.
상기 NMN 수송체는 Slc12a8 폴리펩타이드 또는 이의 동족체일 수 있다.
본 교시에는 또한 노화와 관련된 기능성 쇠퇴를 예방하는 것을 필요로 하는 대상체에서 노화와 관련된 기능성 쇠퇴를 예방하는 방법이 포함된다. 상기 노화와 관련된 기능성 쇠퇴는 비-제한적인 예에서, 식욕 상실, 낮은 글루코오스 수준, 근육 약화, 영양실조, 또는 노화성 식욕부진에서 초래되거나 또는 그것들과 연관될 수 있다. 이들 방법은 NMN의 약제학적 유효량 뿐만 아니라, 화합물 예컨대 니코틴산, 니코틴산의 에스테르, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트, β-피리딜카비놀 또는 이노시톨 헥사니코티네이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 교시에는 또한 노화와 관련된 기능성 쇠퇴를 예방하는 것을 필요로 하는 대상체에서 노화와 관련된 기능성 쇠퇴를 예방하는 방법이 포함된다. 상기 노화와 관련된 기능성 쇠퇴는, 비-제한적인 예에서, 식욕 상실, 낮은 글루코오스 수준, 근육 약화, 영양실조, 또는 노화성 식욕부진에서 초래되거나 또는 그것들과 연관될 수 있다. 이들 방법은 NMN의 약제학적 유효량 뿐만 아니라, 화합물 예컨대 니코틴산, 니코틴산의 에스테르, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트, β-피리딜카비놀 또는 이노시톨 헥사니코티네이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 교시에는 또한 2형 당뇨병을 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에서 2형 당뇨병을 치료하는 방법이 포함된다. 이들 방법은 NMN의 약제학적 유효량 뿐만 아니라, 화합물 예컨대 니코틴산, 니코틴산의 에스테르, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트, β-피리딜카비놀 또는 이노시톨 헥사니코티네이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 교시에는 또한 비만을 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에서 비만을 치료하는 방법이 포함된다. 이들 방법은 NMN의 약제학적 유효량 뿐만 아니라, 화합물 예컨대 니코틴산, 니코틴산의 에스테르, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트, β-피리딜카비놀 또는 이노시톨 헥사니코티네이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 제시된 연구는 상기 Slc12a8 유전자가 포유동물에서 신규한 NMN 수송체를 인코딩함을 입증한다. 상기 Slc12a8 유전자의 mRNA 발현은 NAD+ 쇠퇴에 반응하여 상향조절되는데, 이로써, 이론에 의한 제한됨 없이, 세포가 NAD+ 생합성에 대한 긴급한 수요에 응답할 수 있다. Slc12a8 NMN 수송체는 생리적 조건 하에서 NMN에 특이적일 수 있다. 반면에 세포 배양 및 소장에서 이 유전자의 녹다운(knock down)이 NMN의 빠른 흡수를 완전히 무효화하는 반면, 이의 전장 cDNA의 과발현은 다른 상황에서는 최소 NMN 수송을 나타내는 세포로의 NMN 수송의 증가를 제공한다.
본 발명의 다양한 양태가 하기 섹션에 좀 더 상세하게 기재된다.
치료 방법
노화 관련 병태를 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에서 노화 관련 병태를 치료하는 다양한 방법이 제공된다. 전형적으로, 상기 방법은 상기 대상체에게 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(NMN)의 치료적 유효량 및, 니코틴산, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트, β-피리딜카비놀, 이노시톨 헥사니코티네이트, 이의 에스테르, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 이의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 추가의 화합물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 노화 관련 병태는 인슐린 감수성의 손실, 인슐린 분비의 손실, 인슐린 작용 및 분비의 손실, 기억 기능의 손상, 눈 기능의 쇠퇴, 망막 퇴행, 기능성 쇠퇴, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 병태를 포함한다.
상기 노화 관련 병태는 인슐린 감수성의 손실을 포함할 수 있다.
상기 노화 관련 병태는 인슐린 분비의 손실을 포함할 수 있다.
상기 노화 관련 병태는 인슐린 작용 및 분비의 손실을 포함할 수 있다.
상기 노화 관련 병태는 기억 기능의 손상을 포함할 수 있다.
상기 노화 관련 병태는 눈 기능의 쇠퇴를 포함할 수 있다.
상기 노화 관련 병태는 망막 퇴행을 포함할 수 있다.
상기 노화 관련 병태는 기능성 쇠퇴(예를 들어, 식욕 상실, 낮은 글루코오스 수준, 근육 약화, 영양실조, 노화성 식욕부진, 또는 이의 조합)를 포함할 수 있다.
상기 노화 관련 병태는 본원에 기재된 노화 관련 병태들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
다른 방법은 의료 병태를 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에서 의료 병태를 치료하는 것과 관련이 있다. 상기 방법은 상기 대상체에게 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(NMN)의 치료적 유효량 및, 니코틴산, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트, β-피리딜카비놀, 이노시톨 헥사니코티네이트, 이의 에스테르, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 이의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 화합물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 의료 병태는 근육 질환, 2형 당뇨병, 비만, 및 이의 조합에서 선택된 적어도 하나를 포함한다.
상기 의료 병태는 근육 질환을 포함할 수 있다. 상기 대상체가 근육 질환의 치료가 필요한 대상체인 경우, 상기 근육 질환은 근육 허약, 근위축, 근육 소모, 근육 강도의 감소, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
상기 근육 질환은 근육감소증, 운동신경감소증, 악액질, 근이영양증(예를 들어, 뒤센 근이영양증, 베커 근이영양증, 선천성 근이영양증, 원위근이영양증, 에머리-드라이푸스 근이영양증, 안면견갑상완형근이영양증, 사지 연결 근이영양증, 안구인두 근이영양증, 또는 이의 조합), 근긴장성 장애(예를 들어, 근긴장성 이영양증, 선천성근강직증, 선천성 이상근긴장증, 또는 이의 조합), 척추 근육 위축증, 근병증(예를 들어, 베들렘 근병증, 선천성 섬유 유형 불균형, 진행성 골화성 섬유이형성증, 갑상선 기능항진근병증, 갑상선 기능저하 근병증, 소형코어(minicore) 근병증, 다중코어(multicore) 근병증, 근관성 근병증, 네말린 근병증, 주기성 근육마비, 저칼륨혈증 근병증, 고칼륨혈증 근병증, 또는 이의 조합), 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
상기 근육 질환은 산 말타아제 결핍, 카르니틴 결핍, 카르니틴 팔미틸 전이효소 결핍, 가지제거(debrancher) 효소 결핍, 락테이트 탈수소효소 결핍, 미토콘드리아 근병증, 근아데닐산탈아미노효소 결핍, 가인산분해효소 결핍, 포스포푸룩토키나제 결핍, 포스포글리세레이트 키나제 결핍, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
상기 근육 질환은 근육감소증, 운동신경감소증, 악액질, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 근육 질환은 근육감소증을 포함할 수 있다.
상기 의료 병태는 2형 당뇨병을 포함할 수 있다.
상기 의료 병태는 비만을 포함할 수 있다.
상기 의료 병태는 본원에 기재된 의료 병태들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 기재된 다양한 방법에서, 상기 적어도 하나의 추가의 화합물은 니코틴산, 이의 에스테르, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다.
상기 니코틴산의 에스테르 또는 약제학적으로 허용가능한 염은 하기 구조식(I)의 화합물일 수 있다:
Figure pct00004
R는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-헥실, n-옥틸, 2-클로로에틸, 2-하이드록시에틸, 3-하이드록시프로필, 2-메톡시에틸, 2-부톡시에틸, 카바모일메틸, l-카바모일에틸, 2-디메틸아미노에틸, 3-아미노프로필, 테트라하이드로푸르푸릴, 벤질, 페녹시에틸, p-클로로페닐, 및 p-니트로페닐로 이루어진 군에서 선택될 수 있다(예를 들어, R는 2-디메틸아미노에틸, p-클로로페닐, 및 p-니트로페닐로 이루어진 군에서 선택될 수 있다).
본 명세서에서 기재된 다양한 방법에서, 상기 적어도 하나의 추가의 화합물이 상기 대상체에게 하루 약 50mg 내지 약 500mg투여될 수 있다. 또한, NMN이 상기 대상체에게 하루 약 10 내지 약 500mg투여될 수 있다.
또한, 상기 대상체에는 NMN 및 상기 적어도 하나의 추가의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물이 투여될 수 있다.
NMN의 세포 흡수를 향상시키는 것을 필요로 하는 대상체에 NMN의 세포 흡수를 향상시키는 방법이 또한 제공된다. 이들 방법은 니코틴산, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트, β-피리딜카비놀, 이노시톨 헥사니코티네이트, 이의 에스테르, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 이의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 화합물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
상기 화합물은 니코틴산, 그것이 에스테르, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 상기 니코틴산의 에스테르 또는 약제학적으로 허용가능한 염은 하기 구조식(I)의 화합물일 수 있다:
Figure pct00005
R는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-헥실, n-옥틸, 2-클로로에틸, 2-하이드록시에틸, 3-하이드록시프로필, 2-메톡시에틸, 2-부톡시에틸, 카바모일메틸, l-카바모일에틸, 2-디메틸아미노에틸, 3-아미노프로필, 테트라하이드로푸르푸릴, 벤질, 페녹시에틸, p-클로로페닐, 및 p-니트로페닐로 이루어진 군에서 선택된다(예를 들어, R는 2-디메틸아미노에틸, p-클로로페닐, 및 p-니트로페닐로 이루어진 군에서 선택된다).
상기 화합물은 상기 대상체에게 하루 약 50mg 내지 약 500mg 투여될 수 있다.
NAD+ 생산을 자극하고 및/또는 NMN의 세포 흡수를 증가시시키는 것을 필요로 하는 대상체에 NAD+ 생산을 자극하고 및/또는 NMN의 세포 흡수를 증가시시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 Slc12a8을 인코딩하는 핵산의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 핵산은 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA를 포함할 수 있다.
NAD+ 생산을 자극하고 및/또는 NMN의 세포 흡수를 증가시시키는 것을 필요로 하는 대상체에 NAD+ 생산을 자극하고 및/또는 NMN의 세포 흡수를 증가시시키는 임의의 방법에서, 상기 Slc12a8을 인코딩하는 핵산의 투여는 Slc12a8을 인코딩하는 유전자 요법 벡터의 투여를 포함할 수 있다.
상기 유전자 요법 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 알파바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아 바이러스, 또는 이의 조합물을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 유전자 요법 벡터는 레트로바이러스를 포함할 수 있다.
상기 유전자 요법 벡터가 레트로바이러스를 포함하는 반면, 상기 레트로바이러스는 렌티바이러스를 적합하게 포함한다.
Slc12a8을 인코딩하는 cDNA를 투여하는 단계를 포함하는, NAD+ 생산을 자극하고 및/또는 NMN의 세포 흡수를 증가시시키는 것을 필요로 하는 대상체에 NAD+ 생산을 자극하고 및/또는 NMN의 세포 흡수를 증가시시키는 임의의 방법에서, 상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1)과 서열 동일성이 적어도 70%인 서열을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 서열번호: 1과 서열 동일성이 적어도 75%인 서열을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 서열번호: 1과 서열 동일성이 적어도 80%인 서열을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 서열번호: 1과 서열 동일성이 적어도 85%인 서열을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 서열번호: 1과 서열 동일성이 적어도 90%인 서열을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 서열번호: 1과 서열 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는은 서열번호: 1과 서열 동일성이 적어도 99%인 서열을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 서열번호: 1과 서열 동일성이 적어도 100%인 서열을 포함할 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 본원에 개시된 임의의 Slc12a8을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 핵산의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 NAD+ 생산을 자극하고 및/또는 NMN의 세포 흡수를 증가시시키는 임의의 방법에서, 상기 방법은 상기 Slc12a8을 인코딩하는 핵산을 상기 대상체의 위장관에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 상기 Slc12a8을 인코딩하는 핵산을 상기 대상체의 소장에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
Slc12a8을 인코딩하는 핵산의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 NAD+ 생산을 자극하고 및/또는 NMN의 세포 흡수를 증가시시키는 임의의 방법에서, 상기 대상체는 근육 질환, 2형 당뇨병, 비만, 노화 관련 병태, 또는 이의 조합에 대한 치료가 필요한 대상체일 수 있다.
상기 노화 관련 병태는 인슐린 감수성의 손실, 인슐린 분비의 손실, 인슐린 작용 및 분비의 손실, 기억 기능의 손상, 눈 기능의 쇠퇴, 망막 퇴행, 기능성 쇠퇴, 비만, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 노화 관련 병태는 인슐린 감수성의 손실을 포함할 수 있다.
상기 노화 관련 병태는 인슐린 분비의 손실을 포함할 수 있다.
상기 노화 관련 병태는 인슐린 작용 및 분비의 손실을 포함할 수 있다.
상기 노화 관련 병태는 기억 기능의 손상을 포함할 수 있다.
상기 노화 관련 병태는 눈 기능의 쇠퇴를 포함할 수 있다.
상기 노화 관련 병태는 망막 퇴행을 포함할 수 있다.
상기 노화 관련 병태는 기능성 쇠퇴(예를 들어, 식욕 상실, 낮은 글루코오스 수준, 근육 약화, 영양실조, 노화성 식욕부진, 또는 이의 조합물)를 포함할 수 있다.
상기 노화 관련 병태는 노화와 관련된 비만을 포함할 수 있다.
상기 대상체가 근육 질환에 대한 치료가 필요한 대상체인 경우, 상기 근육 질환은 근육 허약, 근위축, 근육 소모, 근육 강도의 감소, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
상기 근육 질환은 근육감소증, 운동신경감소증, 악액질, 근이영양증(예를 들어, 뒤센 근이영양증, 베커 근이영양증, 선천성 근이영양증, 원위근이영양증, 에머리-드라이푸스 근이영양증, 안면견갑상완형근이영양증, 사지 연결 근이영양증, 안구인두 근이영양증, 또는 이의 조합물), 근긴장성 장애(예를 들어, 근긴장성 이영양증, 선천성근강직증, 선천성 이상근긴장증, 또는 이의 조합물), 척추 근육 위축증, 근병증(예를 들어, 베들렘 근병증, 선천성 섬유 유형 불균형, 진행성 골화성 섬유이형성증, 갑상선 기능항진근병증, 갑상선 기능저하 근병증, 소형코어(minicore) 근병증, 다중코어(multicore) 근병증, 근관성 근병증, 네말린 근병증, 주기성 근육마비, 저칼륨혈증 근병증, 고칼륨혈증 근병증, 또는 이의 조합물), 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
상기 근육 질환은 산 말타아제 결핍, 카르니틴 결핍, 카르니틴 팔미틸 전이효소 결핍, 가지제거(debrancher) 효소 결핍, 락테이트 탈수소효소 결핍, 미토콘드리아 근병증, 근아데닐산탈아미노효소 결핍, 가인산분해효소 결핍, 포스포푸룩토키나제 결핍, 포스포글리세레이트 키나제 결핍, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
상기 근육 질환은 근육감소증, 운동신경감소증, 악액질, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 근육 질환은 근육감소증을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 핵산의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 NAD+ 생산을 자극하고 및/또는 NMN의 세포 흡수를 증가시시키는 임의의 방법에서, 상기 대상체는 2형 당뇨병에 대한 치료가 필요한 대상체일 수 있다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 핵산의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 NAD+ 생산을 자극하고 및/또는 NMN의 세포 흡수를 증가시시키는 임의의 방법에서, 상기 대상체는 비만에 대한 치료가 필요한 대상체일 수 있다.
본 명세서에서 기재된 임의의 방법에서, 상기 대상체는 포유동물일 수 있다.
예를 들어, 상기 대상체는 마우스 또는 랫트일 수 있다.
상기 대상체는 인간일 수 있다. 상기 대상체가 인간인 경우, 상기 인간은 적어도 3적어도 30세, 적어도 40세, 적어도 50세, 적어도 60세, 또는 적어도 70세의 연령일 수 있다.
유전자 요법 벡터
유전자 요법 벡터가 제공된다. 상기 벡터는 Slc12a8을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 핵산은 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA를 포함할 수 있다.
상기 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 알파바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아 바이러스, 또는 이의 조합물을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 유전자 요법 벡터는 레트로바이러스를 포함할 수 있다.
상기 레트로바이러스는 렌티바이러스를 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1)과 서열 동일성이 적어도 70%인 서열을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 서열번호: 1과 서열 동일성이 적어도 75%인 서열을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 서열번호: 1 과 서열 동일성이 적어도 80%인 서열을 포함할 수 있다. 상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 서열번호: 1과 서열 동일성이 적어도 70%인 서열을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 서열번호: 1과 서열 동일성이 적어도 85%인 서열을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 서열번호: 1과 서열 동일성이 적어도 90%인 서열을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 서열번호: 1과 서열 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 서열번호: 1과 서열 동일성이 적어도 99%인 서열을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 서열번호: 1과 서열 동일성이 적어도 100%인 서열을 포함할 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 본원에 개시된 임의의 Slc12a8을 포함할 수 있다.
Slc12a8 중 돌연변이를 포함하는 비-인간 동물
비-인간 동물이 제공된다. 상기 비-인간 동물은 Slc12a8 유전자 중 불활성 돌연변이를 포함한다.
상기 비-인간 동물은 적합하게 마우스 또는 랫트를 포함한다.
상기 Slc12a8 유전자 중 불활성 돌연변이는 상기 Slc12a8 유전자 중 결손, 상기 Slc12a8 유전자 중 삽입, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 Slc12a8 유전자 중 불활성 돌연변이는 Slc12a8 유전자 중 결손을 포함할 수 있다. 상기 결손은 상기 Slc12a8 유전자의 부분적인 결손 또는 상기 Slc12a8 유전자의 완전한 결손을 포함할 수 있다.
상기 결손은 상기 Slc12a8 유전자의 엑손 4의 결손을 포함할 수 있다.
상기 결손은 상기 Slc12a8 유전자의 엑손 4의 부분의 결손을 포함할 수 있다.
포유동물 세포 및 포유동물 세포주
포유동물 세포 및 포유동물 세포주가 또한 제공된다.
포유동물 세포 또는 포유동물 세포주가 제공된다. 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주는 Slc12a8 단백질을 인코딩하는 cDNA를 포함한다. 상기 cDNA는 서열번호: 12(마우스 Slc12a8 단백질), 서열번호: 13(마우스 Scl12a8 변이체 단백질), 서열번호: 14(마우스 Scl12a8 변이체 B 단백질), 또는 서열번호: 15(인간 Slc12a8 단백질)를 인코딩하는 cDNA를 포함한다.
추가적인 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주가 제공된다. 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주는 Slc12a8 단백질을 인코딩하는 cDNA를 포함한다. 상기 cDNA는 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 또는 서열번호: 15의 적어도 70%를 갖는 단백질을 인코딩하는 cDNA를 포함한다.
상기 cDNA는 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 또는 서열번호: 15의 적어도 75%를 갖는 단백질을 인코딩하는 cDNA를 포함할 수 있다.
상기 cDNA는 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 또는 서열번호: 15의 적어도 80%를 갖는 단백질을 인코딩하는 cDNA를 포함할 수 있다.
상기 cDNA는 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 또는 서열번호: 15의 적어도 85%를 갖는 단백질을 인코딩하는 cDNA를 포함할 수 있다.
상기 cDNA는 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 또는 서열번호: 15 의 적어도 90%를 갖는 단백질을 인코딩하는 cDNA를 포함할 수 있다.
상기 cDNA는 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 또는 서열번호: 15의 적어도 95%를 갖는 단백질을 인코딩하는 cDNA를 포함할 수 있다.
상기 cDNA는 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 또는 서열번호: 15 의 적어도 99%를 갖는 단백질을 인코딩하는 cDNA를 포함할 수 있다.
그 밖의 또 다른 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주가 제공된다. 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주는 Slc12a8 단백질을 인코딩하는 cDNA를 포함한다. 상기 cDNA는 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1) 또는 Slc12a8 인간 전장 cDNA(서열번호: 11)과 서열 동일성이 적어도 70%인 cDNA 서열을 포함한다.
상기 cDNA는 서열번호: 1 또는 서열번호: 11 과 서열 동일성이 적어도 75%인 cDNA 서열을 포함할 수 있다.
상기 cDNA는 서열번호: 1 또는 서열번호: 11과 서열 동일성이 적어도 80%인 cDNA 서열을 포함할 수 있다.
상기 cDNA는 서열번호: 1 또는 서열번호: 11과 서열 동일성이 적어도 85%인 cDNA 서열을 포함할 수 있다.
상기 cDNA는 서열번호: 1 또는 서열번호: 11 과 서열 동일성이 적어도 90%인 cDNA 서열을 포함할 수 있다..
상기 cDNA는 서열번호: 1 또는 서열번호: 11 과 서열 동일성이 적어도 95%인 cDNA 서열을 포함할 수 있다.
상기 cDNA는 서열번호: 1 또는 서열번호: 11 과 서열 동일성이 적어도 99%인 cDNA 서열을 포함할 수 있다.
상기 cDNA는 서열번호: 1 또는 서열번호: 11 과 서열 동일성이 적어도 100%인 cDNA 서열을 포함할 수 있다.
임의의 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주의 경우, 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주는 바람직하게는 태반-유래 세포를 포함하지 않는다.
추가적인 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주가 제공된다. 상기 세포 또는 세포주는 Slc12a8 단백질을 인코딩하는 cDNA를 포함한다. 상기 세포 또는 세포주는 태반-유래 세포를 포함하지 않는다.
상기 cDNA는 마우스 Slc12a8 단백질 또는 이의 변이체를 인코딩할 수 있다.
상기 cDNA는 인간 Slc12a8 단백질 또는 이의 변이체를 인코딩할 수 있다.
임의의 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주에서, 상기 cDNA는 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 또는 서열번호 15를 인코딩하는 cDNA를 포함할 수 있다.
임의의 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주에서, 상기 세포 또는 세포주는는 상기 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주에서, 상기 Slc12a8 단백질의 발현은, 바람직하게는 상기 cDNA를 포함하지 않는 동일한 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주에서 상기 Slc12a8 단백질의 발현과 비교하여, 증가된다.
임의의 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주에서, 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주에는 검출가능한 CD73 활성이 없을 수 있고, 검출가능한 CD38 활성이 없을 수 있고, 또는 검출가능한 CD73 활성 및 검출가능한 CD38 활성 둘 다 없을 수 있다.
임의의 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주에서, 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주는 바람직하게는 증가된 NMN 흡수를 보인다.
상기 포유동물 세포는 섬유모세포, 창자 세포, 췌장 세포, 간세포, 지방세포, 뉴런, 또는 신경교 세포를 포함할 수 있다.
상기 포유동물 세포주는 섬유모세포, 창자 세포, 췌장 세포, 간세포, 지방세포, 뉴런, 또는 신경교 세포를 포함할 수 있다.
상기 포유동물 세포는 NIH 3T3 세포일 수 있다.
상기 포유동물 세포주는 NIH 3T3 세포주일 수 있다
임의의 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주에서, 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주는 상기 cDNA 서열로 안정적으로 형질변환될 수 있다.
임의의 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주에서, 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주는 상기 cDNA 서열로 일시적으로 형질감염될 수 있다.
임의의 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주에서, 상기 cDNA 서열은 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1)과 서열 동일성이 적어도 70%일 수 있다.
상기 cDNA 서열은 서열번호: 1과 서열 동일성이 적어도 75%일 수 있다.
상기 cDNA 서열은 서열번호: 1과 서열 동일성이 적어도 80%일 수 있다.
상기 cDNA 서열은 서열번호: 1과 서열 동일성이 적어도 85%일 수 있다.
상기 cDNA 서열은 서열번호: 1과 서열 동일성이 적어도 90%일 수 있다.
상기 cDNA 서열은 서열번호: 1과 서열 동일성이 적어도 95%일 수 있다.
상기 cDNA 서열은 서열번호: 1과 서열 동일성이 적어도 99%일 수 있다.
상기 cDNA 서열은 서열번호: 1과 서열 동일성이 적어도 100%일 수 있다.
임의의 상기 포유동물 세포는 마우스 또는 랫트 세포일 수 있다.
임의의 상기 포유동물 세포는주는 마우스 세포주 또는 랫트 세포주일 수 있다.
임의의 상기 포유동물 세포는 인간 세포일 수 있다.
임의의 상기 포유동물 세포주는 인간 세포주일 수 있다.
약물 스크리닝 방법
NMN 수송체를 조절(예를 들어, 촉진)하는 화합물을 확인하기 위해 후보 화합물을 스크리닝하는 방법들이 제공된다. 예를 들어, NMN의 세포로의 흡수를 촉진함으로써 개선되는 질환 또는 병태의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있는 신규한 치료적 화합물을 확인하기 위해 그와 같은 방법이 사용될 수 있다.
NMN 수송을 조절하는 화합물을 식별하기 위한 후보 화합물을 스크리닝하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) 상기 후보 화합물을 NMN 수송체 단백질 또는, NMN 수송체 단백질을 포함하는 프로테오리포좀을 발현하는 세포와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 세포에서 NMN 수송체 단백질의 발현 또는 활성의 변화, 상기 프로테오리포좀에서 NMN 수송체 단백질의 활성의 변화를 감지하는 단계를 포함한다. 상기 후보 화합물과의 접촉 후, 상기 세포에서 NMN 수송체 단백질의 발현 또는 활성의 변화, 또는 상기 프로테오리포좀에서 상기 NMN 수송체 단백질의 활성의 변화는 상기 후보 화합물이 NMN의 수송을 조절함을 나타낸다.
상기 NMN 수송체 단백질은 Slc12a8 단백질을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8 단백질은 서열번호: 12(마우스 Slc12a8 단백질), 서열번호: 13(마우스 Scl12a8 변이체 단백질), 서열번호: 14(마우스 Scl12a8 변이체 B 단백질), 또는 서열번호: 15(인간 Slc12a8 단백질)와 서열 동일성이 적어도 70%인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8 단백질은 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 또는 서열번호: 15 와 서열 동일성이 적어도 75%인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8 단백질은 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 또는 서열번호: 15 와 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8 단백질은 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 또는 서열번호: 15 와 서열 동일성이 적어도 85%인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8 단백질은 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 또는 서열번호: 15 와 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8 단백질은 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 또는 서열번호: 15 와 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8 단백질은 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 또는 서열번호: 15 와 서열 동일성이 적어도 99%인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 Slc12a8 단백질은 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 또는 서열번호: 15 와 서열 동일성이 적어도 100%인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 방법은 추가로 (i) 상기 후보 화합물과 접촉 후 상기 NMN 수송체 단백질을 발현하는 세포에서 상기 NMN 수송체 단백질의 발현 또는 활성을; (ii) 상기 NMN 수송체 단백질을 발현하지 않는 세포 또는 (상기 후보 화합물과 접촉 후, 상기 NMN 단백질의 발현 또는 활성이 억제된) 세포에서 상기 NMN 수송체 단백질의 발현 또는 활성과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 NMN 수송체 단백질을 발현하지 않는 세포는 Slc12a8 녹아웃 동물에서 유래된 세포를 포함할 수 있다.
상기 방법은 추가로 (i) 상기 후보 화합물과 접촉 후, 상기 NMN 수송체 단백질을 포함하는 상기 프로테오리포좀에서 상기 NMN 수송체 단백질의 활성을; (ii) 상기 NMN 수송체 단백질을 포함하지 않는 프로테오리포좀 또는, (상기 후보 화합물과 접촉 후, 상기 NMN 수송체의 활성이 억제된) 프로테오리포좀에서 NMN 수송체 단백질의 활성을 비교하는 단계를 포함한다.
상기 NMN 수송체 단백질을 포함하지 않는 프로테오리포좀은 Slc12a8 녹아웃 동물의 세포에서 유래된 프로테오리포좀을 포함할 수 있다.
상기의 방법들 중 임의의 방법에서, 상기 세포는 포유동물 섬유모세포, 창자 세포, 췌장 세포, 간 세포, 지방질 세포, 뉴런, 또는 신경교 세포를 포함할 수 있다.
상기의 방법들 중 임의의 방법에서, 상기 프로테오리포좀은 포유동물 섬유모세포, 창자 세포, 췌장 세포, 간 세포, 지방질 세포, 뉴런, 또는 신경교 세포에서 유래된 프로테오리포좀을 포함할 수 있다.
상기의 방법들 중 임의의 방법에서, 상기 세포는 본원에 기재된 임의의 포유동물 세포를 포함할 수 있다.
상기의 방법들 중 임의의 방법에서, 상기 프로테오리포좀은 본원에 기재된 임의의 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주에서 유래된 프로테오리포좀을 포함할 수 있다.
상기의 방법들 중 임의의 방법에서, 상기 프로테오리포좀은 Slc12a8 cDNA를 포함하는 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주에서 유래된 프로테오리포좀을 포함한다.
약제학적 조성물
약제학적 조성물이 제공된다. 상기 약제학적 조성물은 NMN 및, NMN 수송체의 효능제를 포함한다.
NMN 수송체의 효능제는 니코틴산, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트, β-피리딜카비놀, 이노시톨 헥사니코티네이트, 이의 에스테르, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 및 이의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 화합물을 포함할 수 있다. 상기 NMN 수송체는 니코틴산, 이의 에스테르, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다.
상기 니코틴산의 에스테르 또는 약제학적으로 허용가능한 염은 하기 구조식(I)의 화합물일 수 있다:
Figure pct00006
R는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-헥실, n-옥틸, 2-클로로에틸, 2-하이드록시에틸, 3-하이드록시프로필, 2-메톡시에틸, 2-부톡시에틸, 카바모일메틸, l-카바모일에틸, 2-디메틸아미노에틸, 3-아미노프로필, 테트라하이드로푸르푸릴, 벤질, 페녹시에틸, p-클로로페닐, 및 p-니트로페닐로 이루어진 군에서 선택된다(예를 들어, R는 2-디메틸아미노에틸, p-클로로페닐, 및 p-니트로페닐로 이루어진 군에서 선택될 수 있다).
또한, 상기 NMN 수송체는 Slc12a8 폴리펩타이드 또는 이의 동족체를 포함할 수 있다.
추가적인 약제학적 조성물이 제공된다. 상기 약제학적 조성물은 NMN 및, Slc12a8 또는 이의 동족체의 유전자 발현의 유발제를 포함한다.
본 발명을 상세히 기술하였기 때문에, 첨부된 청구항들에 정의된 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 수정 및 변형이 가능함이 명백할 것이다.
실시예
방법
본원에 기재된 방법 및 조성물은 숙련가에게 잘 알려진 실험실 기술을 활용하고, 하기의 실험실 매뉴얼에서 찾아볼 수 있다: 예컨대 Sambrook, J., 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Spector, D. L. 등, Cells: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1998; Nagy, A., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Third Edition), Cold Spring Harbor, NY, 2003 and Harlow, E., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1999. 의약품의 투여 방법 및 투약 요법은 하기의 표준 참조 문서에 의해 제공되는 방법을 사용하여 숙련가에게 잘 알려진 약리학의 표준 원칙에 따라 결정될 수 있다: 예컨대 Remington: the Science and Practice of Pharmacy (Alfonso R. Gennaro ed. 19th ed. 1995); Hardman, J.G., 등, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, McG미가공-Hill, 1996; and Rowe, R.C., 등, Handbook of Pharmaceutical Excipients, Fourth Edition, Pharmaceutical Press, 2003. 본 설명 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 달리 지시되지 않는 한, 복수 형태 또한 포함하는 것으로 의도된다.
마이크로어레이 분석. 0.1% DMSO(대조군) 또는 FK866(일차 간세포는 200nM 및 췌장 소도 및 해마 신경구는 10nM)로 처리된 일차 간세포, 췌장 소도, 및 해마 신경구에서 총 RNA를 단리하였다. FK866 처리에 의해 유도된 전사 변화를 판단하기 위해, Illumina 마우스 Ref 8 전체 게놈 마이크로어레이(버전 2)를 사용하여 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 상기 배경이 공제된 미가공 마이크로어레이 데이터에 Z 점수 변형을 시행하였고, 앞서 기재된 바와 같이(Yoshino, J., 등, Cell Metab., 14, 528-536, 2011) Z 비율을 계산하였다. 모든 데이터를 R 통계적인 소프트웨어 패키지로 분석하였다.
세포 배양액 및 생체외 소장 외식편 배양액. NIH3T3 세포를 10% 우태 혈청, 100 단위/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신을 보충한 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 37
Figure pct00007
및 5% CO2로 배양하였다. Slc12a8 mRNA 발현 분석을 위해, 2.5 x 105 세포/웰을 0.1% DMSO 또는 100nM FK866 또는 100nM FK866와 100μM NMN을 함유한 1% FBS를 갖는 DMEM이 구비된 6-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양하였다. 3-월령 B6 수컷 마우스의 소장을 십이지장/공장/회장 길이 비를 1:3:2로 하여 세 개의 분절로 잘랐다 (Wang, H. H., 등, Hepatology 45, 998-1006, 2007). 각각의 분절의 1센티미터를 종방향으로 개방하고, 차가운 PBS로 1회 세정한 후, 5% FBS 및 하기 첨가제: 5μg/ml 인슐린(Sigma), 20ng/ml 표피 성장 인자(Sigma), 1xB27 보충물(GIBCO), 1mM 나트륨 피루베이트(Corning), 100단위/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신, 및 2mM GlutaMAX?(GIBCO)가 함유된DMEM 및 Ham's F-12 배지(Sigma)의 1:1 혼합물 중에 0.1% DMSO 또는 100nM FK866 또는 100nM FK866/500μM NMN와 함께 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 세포 및 조직 RNA 샘플을 이전에 기재된 바와 같이(Stein, L. R. & Imai, S., EMBO J., 33, 1321-1340, 2014) 정량적 RT-PCR에 의해 분석하였다.
HPLC에 의한 NAD+ 및 NMN 측정. NAD+ 및 NMN을 이전에 기재된 바와 같이 (Yoshino, J., 등, Cell Metab., 14, 528-536, 2011; Yoshino, J. & Imai, S., Methods Mol. Biol., 1077, 203-215, 2013) 세포 및 조직에서 추출하고, HPLC에 이해 정량화하였다.
유세포측정 분석. 2 x 106 NIH3T3 세포를 0.1% DMSO 또는 100nM FK866 또는 100nM FK866/100μM NMN를 함유한 1% FBS가 구비된 DMEM으로 10cm 배양 접시에서 37
Figure pct00008
및 5% CO2에서 48시간 동안 배양하였다. 이어서 세포를 차가운 PBS로 1회 세정하고, PBS 중 0.02% EDTA로 처리하고, 1:200의 상업적으로 입수가능한 다클론성 토끼 항-마우스 Slc12a8 항체(ARP44039, Aviva, CA), 1:2000의 ALEXA FLUOR® 488(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)이 접합된 이차 염소 항-토끼 IgG(H+L)(Invitrogen) 및 1:400의 생존 마커 ZOMBIE AQUA™ 염료(Biolegend, San Diego, CA)를 사용하여, 유세포측정을 위해 25분 동안 4℃에서 염색하였다. 그러고 나서, 세포를 세정하고, GALLIOS™ 흐름 세포측정기(BeckmanCoulter, Indianapolis, IN)로 분석하였다. 세포내 염색을 위해, 우선 세포를 실온에서 10분 동안 2% PFA에 고정하고, 그 후 실온에서 또 다시 10분 동안 사포닌-함유 완충액에서 투과되게 하였다. Slc12a8 염색을 25분동안 4℃의 투과화 완충액에서 수행하였다. 샘플을 GALLIOS™ 흐름 세포측정기(BeckmanCoulter, Indianapolis, IN)로 분석하고, 데이터를 KALUZA™ 1.3(BeckmanCoulter, Indianapolis, IN)을 사용하여 분석하였다. ZOMBIE AQUA™ Fixable Viability Kit(Biolegend, San Diego, CA)를 사용하여 죽은 세포를 배제하였다.
간세포 단리, 5-뉴클레오티다제 활성 검정, NMN 흡수 측정, 및 Slc12a8 및 Nrk1 발현의 침묵화. 이전에 기재된 바와 같이(Grimm, A.A., 등, Aging Cell, 10, 305-317, 2011), 일차 간세포를 3 월령 C57BL/6J(B6) 수컷 마우스에서 단리하였다. 세포를 임의의 실험을 수행하기 전 10% 우태 혈청(FBS), 100 단위/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신(pen/strep)을 보충한 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 중 폴리-L-라이신을 도포한 6-웰 플레이트에서 37℃ 및 5% CO2로 밤새 배양하였다. 1% FBS가 구비된 DMEM에서 500nM FK866 또는 500nM FK866/500μM NMN와 함께 간세포를 24시간 동안 배양함으로써 Slc12a8 mRNA 발현 및 NAD+ 함량을 평가하였다. 아데노신-5'-[α,β-메틸렌]디포스페이트(AOPCP)가 5'-뉴클레오티다제 활성을 억제하는지 여부를 시험하기 위해, 1.5 Х 105 세포/웰을 1% FBS가 구비된 DMEM중 12-웰 플레이트에서 500nM FK866으로 24시간 동안 성장시킨 후, 100μM 아데노신 모노포스페이트(AMP) 또는 100μM AMP 플러스 500μM AOPCP의 존재 하에 pH 7.5(HBSS, GIBCO)로, Ca2+ 및mg2+을 갖는 Hanks' 완충 식염수 용액 1.4 mL에서 배양하였다. 상이한 시점에서(0, 1, 5, 15, 및 30분), 각각의 배양액 상청액을 200μl 수집하고, 70% 과염소산 28μl를 적가하여 추출하였다. 생산된 아데노신의 양을 HPLC에 의해 계산하였다. AMP 및 아데노신의 용출 시간은 각각 4.7 및 17.4분이었다. 세포 생존력을 살펴보기 위해, CELLTITER 96® 수성 1 용액 세포 증식 용액(Promega, Madison, WI)을 사용하였고, 4시간 배양 후 λ=490에서 흡광도를 측정하였다. NMN 흡수 측정을 위해, 1.5 Х 105 세포/웰을 1% FBS가 구비된 DMEM에서 500 nM FK866으로 12-웰 플레이트에서 24시간 동안 성장시킨 후, 500μM AOPCP, 20μM 디파이리다몰, 및 500nM FK866 또는 이들 억제제/100μM NMN의 존재 하에 HBSS 1mL에서 배양하였다. 상이한 시점에서(0, 0.25, 1, 5, 15, 및 30분), 세포를 차가운 HBSS로 1회 세정하고, 차가운 10% 과염소산에 용해시켰다. 이전에 기재된 바와 같이(Yoshino, J., 등, Cell Metab., 14, 528-536, 2011), 세포내 NMN 수준을 HPLC에 의해 측정하였다. 유전자 침묵화 실험을 위해, Slc12a8(J-042450-12-0020) 또는 Nrk1(J 051839-11-0010)에 특이적인 ON-TARGETPLUS™(Dharmacon, Inc, Lafeyette, CO) 마우스 siRNA(Thermo scientific) 또는 음성 대조군 siRNA(비-표적화하는 siRNA #1, D-001810-01-20) 10μg을 병태당 백만개의 세포에 전기천공하였고, 제조자의 지침에 따라 NUCLEOFECTOR® 프로그램 H-26(Lonza, Basel, Switzerland)을 사용하여 AMAXA® 마우스 간세포 NUCLEOFECTOR® 용액(Lonza, Basel, Switzerland) 100μl을 혼합하였다. 배지 첨가 전 15분 동안 큐벳에서 상기 전기천공된 세포를 배양하였다. 전기천공 후 48시간 동안, 37℃ 및 5% CO2로 10% FBS 및 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM에서 폴리-L-라이신이 도포된 6-웰 플레이트에 2.5x105 세포/웰을 씨딩하였다. 이들 세포를 1% FBS가 구비된 DMEM에서 24시간 동안 500nM FK866로 배양하였다. 500μM AOPCP, 20μM 디파이리다몰, 및 500nM FK866 또는 이들 억제제/100μM NMN이 구비된 HBSS에서 1분 동안 실온에서 세포를 배양한 후, NMN 흡수를 HPLC로 측정하였다. 정량적 RT-PCR에 의해 침묵화 효율성을 평가하였다.
상기 전장 마우스 Slc12a8 cDNA를 안정적으로 과발현하는 NIH3T3 세포의 생성.
서열의 경우, 유전자은행 참조 서열: NM_134251을 사용하였다. 유전자은행 참조 서열: NM_134251의 서열이 본원에 서열번호: 1로 제시되었다.
마우스 간에서 유래된 전장 마우스 Slc12a8 cDNA(유전자은행 참조 서열: NM_134251)의 코딩 영역을 PFUULTRA™ II 융합 HS DNA 중합효소(Agilent, Santa Clara, CA)와 하기 XhoI 부위를 함유하는 전방 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다 (표 1).
Figure pct00009
수득된 전장 Slc12a8 cDNA의 2118-bp 단편을 XhoI로 소화시키고, pBluescript SK-벡터로 복제하였다. 그러고 나서, Slc12a8 cDNA 단편을 포유동물 발현 벡터 pCXN2(Revollo, J. R., 등, J. Biol. Chem., 279, 50754-50763, 2004) 로 하위복제(subclone)하였다. 상기 최종 벡터 중 Slc12a8 cDNA 서열을 서열분석에 의해 확인하였다. NIH3T3 세포를 SUPERFECT® 형질감염 시약(QIAGEN, Fredrick, MD)을 사용하여 전장 Slc12a8 cDNA(Slc12a8-OE)를 보유한 pCXN2 또는 비어있는 pCXN2 벡터(대조군) 5μg으로 형질감염시키고, 10% FBS, 항생제 및 300μg/ml G418(Invitrogen)을 보충한 DMEM에서 2주 동안 배양하였다. 저항성 세포를 풀링하고, 추가 실험을 위해 분취액을 냉동해 두었다. Slc12a8-OE 세포에서 Slc12a8 단백질 발현 수준을 확인하기 위해, 이전에 기재된 바와 같이(Bruzzone, S. 등, FASEB J. 26, 1251-1260, 2012) 대조군 및 Slc12a8-OE NIH3T3 세포에서 원형질막(PM) 분획을 준비하였다. 간단히, 10cm접시 5개에서 배양된 7.5Х107 세포를 사용하였다, 빙랭 HES 완충액(20mM HEPES, 1mM EDTA 및 255mM 수크로스, pH 7.4)으로 2회 세정한 후, 프로테아제 억제제 칵테일(Roche)을 함유한 HES 완충액(3ml/접시)에서 스크랩핑하여 세포를 수집하고, 22-게이지 바늘을 5회 통과시켜 균질화하였다. 모든 후속적인 단계는 4℃에서 수행하였다. 상기 균질물을 JA 25.5 회전자(Beckman-Coulter)에서 30분 동안 16,000g으로 원심분리(Avanti J-E)하였다. 상기 펠릿을 10ml HES 완충액에 재현탁시킨 후, 다시 16,000g에서 30분 동안 원심분리하였다. 상기 수득된 펠릿을 10ml HES 완충액에 재현탁시키고, 10-ml 수크로스 쿠션(38.5% 수크로스, 20 mM HEPES, 및 1 mM EDTA, pH 7)의 최상부에 적층하고, 53,000g으로 120분 동안 원심분리하였다. 상기 PM 분획을 함유한 계면을 제거하여, 10ml HES 완충액에 재현탁시키고, 40,000Хg로 30분 동안 원심분리하여, 상기 펠릿에서 상기 PM 분획을 수득하였다. 대조군 또는 Slc12a8OE 세포에서 유래된 PM 분획을 RIPA 완충액(150 mM 염화나트륨, 1.0% NP-40, 0.25% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 50mM 트리스, pH 7.5, 2mM EDTA, 1mM PMSF, 0.5mM DTT 및 프로테아제 억제제 칵테일)으로 용해하고, 1x Laemmli 완충액에서 5 분 동안 끓였다. 다클론성 토끼 항-마우스 Slc12a8(1:500, ARP44039, Aviva, CA) 및 항-카베올린-1(1:2000, #3238, Cell Signaling, MA)으로 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. ADOBE® PHOTOSHOP®(Adobe Systems Inc., San Jose, CA)을 사용하여 AMERSHAM HYPERFILM™ ECL(GE Healthcare, Marlborough, MA) 상에서 밴드 강도를 정량화하였다.
방사선 표지된 NMN으로 NMN 흡수 분석. 대조군 및 Slc12a8-OE NIH3T3 세포를 원심분리(400xg, 5분)로 수확하고, HBSS에서 1회 세정한 후, 100nM 3H-β-니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(9 Ci/mmol; Moravek Biochemicals, CA) 및 비표지된 NMN을 함유한 HBSS [pH 7.5](5x106 세포/ml)에서 37℃로 인큐베이션하여, 최종 농도 25μM를 달성하였다. 상기 지정된 시점(1, 3, 5 및 10분)에, 상기 세포의 분취액(100μl)을 수집하고, 2M 수산화칼륨 용액의 최상부 상에 실리콘-광유(밀도, 1.015; Sigma-Aldrich)를 함유하는 1.5-ml 마이크로원심관에 배치한 후, 16,000Хg으로 30초 동안 원심분리하였다. 세포를 상기 완충액에서 분리하고, 상기 실리콘-광유 층을 통해 펠릿화하였다. 이들 세포 펠릿 중 방사능을 액체 섬광 계수기로 계산하였다. Km 및 Vmax를 계산하기 위해, 상기에 기재된 바와 같이 동일한 조건을 사용하였으나, NMN의 다양한 총 농도는 1μM 내지 100μM의 범위에 속한다. 4분 시점에, 세포 현탁액 100μl을 앞서 기재된 동일한 방식으로 수집 및 펠릿화하였다. 상기 세포 펠릿 중 방사능을 액체 섬광 계수기로 계산하였다. 대조군 NIH3T3 세포에서 측정된 방사능을 공제하여 Slc12a8-OE NIH3T3 세포에서 Slc12a8-특이적 NMN 흡수를 계산하였다.
프로테오리포좀 실험. 이전에 기재된 바와 같이(Bruzzone, S., 등, FASEB J., 15, 10-12, 2001), 프로테오리포좀 제조를 수행하였다. 간단히, 2Х107 대조군 또는 Slc12a8-OE NIH3T3 세포를 세포용해 버퍼(10mM 트리스-HCl, pH 8.3, 150mM NaCl, 0.3 M 수크로스, 프로테아제 억제제 칵테일) 1mL에 재현탁시키고, 균질기를 사용하여 붕괴시켰다. 상기 용해물을 10분 동안 3,000 x g으로 원심분리하였고, 상청액을 수집하여 15분 동안 100,000 Х g으로 원심분리하였다. 막 단백질을 완충액 A(10mM 트리스-HCl, pH 8.3, 150mM NaCl 및 0.5% n-옥틸 β-글루코피라노시드 함유)로 가용화하였다. 별도로, 이전에 기재된 바와 같이 (Franco, L., 등, FASEB J., 12, 1507-1520, 1998), 총 지질을 무-헤모글로빈 적혈구 막(유령(ghost))에서 추출하였다. 인간 적혈구 막(3mg)에서 유래된 총 지질을 건조하고, 가용화된 막 단백질(at 대략 0.7mg/ml 단백질 농도) 600μl로 재현탁하였다. 수득된 에멀션을 얼음에서 1분 동안 초음파처리하고, 24시간 동안 4℃에서 n-옥틸-β-글루코피라노시드(투석 완충 용액) 없는 5 리터의 완충액을 상대로 투석하였다. 프로테오리포좀을 회수하여 15분 동안 100,000 x g으로 원심분리하고, 900μl 투석 완충액에 재현탁시키고, 30-게이지 바늘에 5회 통과시켰다.
Slc12a8의 Na+ 의존성을 살펴보기 위해, NaCl을 150mM LiCl로 대체하였다. 모든 단계를 4℃에서 수행하였다. 프로테오리포좀(30μl, 각 조건에 대해 3회 반복)을 무표지 뉴클레오타이드(NMN, NR, NAD, AMP; NAM 또는 NaMN)가 있는, 또는 그것이 없는 105 cpm/ml 3H-β-NMN(특이 활성, 9.1 Ci/mmole)의 존재 하에 25℃에서 2, 5 또는 10분 동안 배양하였다. 배양 끝에, 샘플을 유리 섬유 종이 상에서 여과하였다. 필터를 투석 완충액 3mL로 세정하고, 건조한 후, 방사능 수치를 계산하였다.
생체내 Slc12a8 녹다운 실험. shRNA-발현 렌티바이러스 구성체를 생성하기 위해, 마우스 Slc12a8 및 개똥벌레 루시퍼라제(fLuc)에 대해 56-bp 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드(각각은 센스 표적 서열, microRNA-기반 루프 서열(CTTCCTGTCA; 서열번호: 4), 안티센스 서열, 4개 티미딘의 종결 서열 및 양쪽 단부의 적절한 제한 효소 부위를 함유함)를 생성하고, 워싱턴 의과대학(Washington University School of Medicine)에서 바이러스 벡터 코어에 의해 제공된 U6-PGK-GFP 벡터로 복제하였다. 상기 센스 Slc12a8 서열은 '5-GCCTAGAGTGAACAGAGAAGA-3'(서열번호: 5)이다. 이전에 기재된 바와 같이(Satoh, A. 등, Cell Metab., 18, 416-430, 2013), 렌티바이러스를 생산하였다. 일차 창자 배양액(Sato, T. & Clevers, H., Methods Mol. Biol. 945, 319-328, 2013)을 사용하여, 녹다운 효율을 시험하였다. 워싱턴대학 신경적 장애 홉 센터에서 바이러스 벡터 코어 대규모 렌티바이러스 생산을 이행하였다. 연 이틀 동안 밤새 금식 후, 3-월령 C57BL/6J 수컷 마우스(Jackson Laboratories)에 fLuc 또는 Slc12a8 shRNA 렌티바이러스를 5 Х 106 형질도입 단위의 역가로 경구 투여하였다.(위관영양법) 6 일 후, fLuc 또는 Slc12a8 shRNA 렌티바이러스를 투여한 마우스에 밤새 금식 후 위관영양법으로 NMN(500mg/kg) 또는 PBS를 투여하였다. 위관영양법 투여 후 0, 5 및 60분에 꼬리 정맥에서 혈액을 수집하고, 그 다음 원심분리로 혈장을 분리하였다. 이어서, 위관영양법 투여 60분 후, 조직 샘플을 수집하였다. 이전에 기재된 바와 같이(Yoshino, J., 등, Cell Metab., 14, 528-536, 2011; Grimm, A. A., 등, Aging Cell, 10, 305-317, 2011), 혈장 NMN 및 조직 NAD+ 수준을 측정하였다.
마우스 Slc12a8에 대항 항체 생성. 마우스 Slc12a8(Covance, Denver, PA)의 합성된 N-말단 펩타이드(AQRSPQELFHEAAQQGC; 서열번호: 6)에 대한 2개의 상이한 다클론성 토끼 항혈청을 생산하였다. 상기 Slc12a8-특이적 항체를 이들 항혈청 중 하나에서 친화도-정제하였다. 상기 Slc12a8 N-말단 펩타이드에 대한 항혈청 또는 친화도-정제된 항체를 1:500 희석하여 웨스턴 블랏팅에 사용하였다.
전신 Slc12a8 녹아웃 마우스의 생성. 워싱턴 대학의 형질변환 벡터 코어에 의해 CRISPR~CAS9 기술로 전신 Slc12a8 녹아웃(Slc12a8KO) 마우스를 생성하였다. CRISPR gRNAs를 상기 Slc12a8 유전자의 엑손 4의 측면에 위치하도록 설계하였다. gRNA 서열은 아래와 같았다: 5'gRNA; 5'-AGTGCATGTATAGACGTATG-3'(서열번호: 7) 및 3' gRNA; 5'- CCTCACAAATATTTACAGGC - 3'(서열번호: 8). gBlocks(IDT)로서 gRNAs를 수득하였다. XTREMEGENE? HP(Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 N2A 세포를 gBlock 및 Cas9 플라스미드(addgene # 42230)로 형질감염시킴으로써, 절단 활성(Cleavage activity)을 평가하였다. 표준 방법을 사용하여 T7E1 검정에 의해 절단 활성을 결정하였다. T7 MEGASHORTSCRIPT? Kit(Ambion, Waltham, MA, USA)를 사용하여, gRNA를 체외에서 전사하였다. MMESSAGE MMACHINE® T7 Ultra Kit (Ambion, Waltham, MA)를 사용하여, Cas9 RNA를 체외에서 전사하였다. MEGACLEAR® 칼럼(Ambion, Waltham, MA)를 사용하여, 모든 RNA를 정제하였다. 워싱턴 대학 마우스 유전적 코어 설비에서 50ng/μl Cas9, 25ng/μl gRNA, 및 100ng/μl ssODN의 농도로 RNA를 C57BL/6J Х CBA 하이브리드 접합체로 미세주입하였다. 절단 부위 전역에서 PCR에 의해 위해 전신 녹아웃 대립형질 유전자를 검출하고, 서열분석에 의해 식별하였다. 하나의 이종접합성 창시자를 성립시키고, 분석 전에 5세대 동안 상기 마우스를 야생형 C57BL/6J 마우스(Jackson Laboratories)로 역교배하였다. Slc12a8-결핍된 이종접합성 마우스를 이종교배하여 동종접합성 Slc12a8KO 마우스를 생성하였다. 야생형 한배새끼를 대조군으로 사용하였다.
18O-D-NMN의 생산. 18O 물에서 시아노피리딘의 가수분해를 통해 18O 니코틴아마이드를 제조하였다(Kolodziejska-Huben, M., 등, J. Label. Compd. Radiopharm. 45, 1005-1010, 2002). D-[2-2H]-리보오스(Omicron Biochemicals에서 구입; Chatterjee, A., 등, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 8653-8656, 2010)로 1,2-2H,3,5-테트라아세테이트를 합성하였다. 18O-2H 표지된 니코틴아마이드 리보사이드를 18O-니코틴아마이드 및 D-리보푸라노스 1,2-2H,3,5-테트라아세테이트에서 합성하였다(Fouquerel, E., 등, Cell Rep., 8, 1819-1831, 2014). 이전에 기재된 바와 같이(Mills, K. F. 등, Cell Metab., 24, 795-806, 2016), 18O-2H 니코틴아마이드 리보사이드에서 18O-2H 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(18O-D-NMN)를 합성하였다.
동위원소 추적 실험. 밤새 금식 후, 7 내지 8월령 Slc12a8KO 마우스 및 이의 야생형 한배새끼에 500mg/kg 18O-D-NMN 또는 PBS를 경구 투여하였다. 경구 위관영양법 후 10분에 공장 및 회장을 수집하였다. 시약-등급 메탄올 및 물(4℃)의 1:1 혼합물을 상기 냉동된 조직(60μL/mg 조직)에 첨가하였다. 초음파처리 후, 4℃에서 15분 동안 12,000 x g으로 추출물을 원심분리하였다. 클로로포름을 1:1(v/v)의 비로 상기 추출물에 첨가하고, 30초 동안 철저하게 진탕하고, 4℃에서 10분 동안 12,000 Х g으로 원심분리하였다. 상부 상(메탄올 및 물)을 하부상(유기)에서 분리하여 실온에서 고속 진공으로 동결건조하고, 5 mM 암모늄 포르메이트로 재구성한 후, 10분 동안 12,000 Х g으로 원심분리하였다. 보정을 위해, 5 mM 암모늄 포르메이트 중 128~1000 nmol/L의 범위의 농도에서 NMN 및 18O-D-NMN의 연속 희석을 사용하였다. 이동상 A의 경우 5mM 암모늄 포르메이트로, 이동상 B의 경우 100% 메탄올로, 0.15ml/분의 유속으로 ATLANTIS® T3(LC 2.1 x 150mm, 3 mm; Waters, Millford, MA)을 사용하여 HPLC(1290; Agilent)에 의해 액체 크로마토그래피를 수행하였다. 0~10분, 0~70% B; 10~15분, 70% B; 16~20분, 0% B의 구배로 대사물을 용출하였다. NMN(335>123) 및 18O-D-NMN(338>125)에 대한 매개변수를 사용하는 양성 ESI 다중 반응 모니터링(MRM) 하에 삼중 사중극자 질량 분광분석기(6470; Agilent)로 상기 대사물을 분석하였다. NMN의 경우, 단편화, 충돌, 및 후 가속 전압이 135, 8, 7이었다. MassHunter 정량 분석 툴(Agilent)을 사용하여 NMN 및 18O-D-NMN 피크를 확인하였다.
동물 실험과정. 모든 마우스를 12시간 낮/12시간 밤 주기로 장벽 설비에 그룹하우징(group-house)하였다. 자유롭게 표준 식사 식단(LabDiet 5053; LabDiet, St. Louis, MO)으로 마우스를 관리하였다. 이전에 기재된 바와 같이(Yoshino, J., 등, Cell Metab., 14, 528-536, 2011; Mills, K. F. 등, Cell Metab., 24, 795-806, 2016; Yoon, M.J., 등, Cell Metab., 21, 706-717, 2015), 음식 섭취 및 식후 및 공복 글루코오스, 트리글리세라이드, 유리 지방산, 및 인슐린 수준의 측정을 수행하였다. Slc12a8KO 마우스 및 이의 야생형 한배새끼에서 오전 9시와 10시 사이에 배설물을 수집하고, 칭량 전 밤새 55℃에서 건조되도록 하였다. 이전에 기재된 바와 같이(Folch, J., 등, J. Biol. Chem., 226, 497-509, 1957), 상기 총 배설물 지방을 클로로포름/메탄올 혼합물(2:1, vol/vol)(Sigma, St. Louis, MO)로 추출하였다. 상기 유기상 1 밀리리터를 칭량전 시험관에 옮기고, 진공 건조한 후, 칭량하여 지질 질량을 계산하였다. 지질 함량의 백분율을 추출된 배설물의 출발 질량(g)으로 정규화하였다. Slc12a8KO 마우스 및 이의 8-10 월령의 야생형 한배새끼에서 유래된 조직을 오전 9 또는 오후 9시에 수집하고, NAD+ 수준을 HPLC에 의해 판단하였다. 전신 NMR 기기(EchoMRI®, Echo Medical Systems LLC, Waco, TX)를 사용하여, 신체 조성을 결정하였다. PhenoMaster 시스템(TSE Systems, MO)으로 간접적인 열량측정 및 운동 활동을 수행하였다. 모든 동물 연구는 워싱턴대학 동물 연구 위원회의 승인을 받았고, NIH 지침을 따랐다.
혈장 GLP-2 측정치. EDTA-코팅된 마이크로베트(microvette) 튜브를 사용하여, 24시간 금식(오전9시부터 오전 9시) 후 및 6시간 영양재개(오전 10시부터 오후 4시) 후, 7-9 월령 Slc12a8KO 마우스 및 이의 대조군 야생형 한배새끼의 꼬리 정맥에서 혈액을 수집하였다. 혈액을 즉시 얼음 상에서 냉각하고, 5,000 Х g 및 4℃에서 원심분리한 후, 혈장 샘플을 -80℃로 저장하였다. 제조자의 지침에 따라 마우스 GLP-2 ELISA Kit(Alpco, Salem, NH)로 혈장 GLP-2 수준을 측정하였다.
혈장 및 생체외 소장 외식편 배양액의 상청액에서 GLP-1 측정. 24시간 금식(오전 9시부터 오전 9시)에 이어 6 시간 영양재개(오전 10시부터 오후 4시) 후, EDTA-코팅된 튜브를 사용하여 2- 또는 24-월령 암컷 Slc12a8 녹다운 마우스 및 이의 대조군의 꼬리정맥에서 혈액을 수집하였다. 혈액을 얼음 위에서 즉시 냉각시키고, 4℃에서 5,000 x g으로 원심분리하고, 혈장 샘플을 -80℃로 저장하였다. 소화관-특이적 Slc12a8 녹다운 암컷 마우스 또는 12-월령 Slc12a8KO 암컷 마우스의 소장을 1:3:2의 길이 비로 십이지장, 공장, 및 회장으로 3분절 하였다 (Wang, H. H., 등, Hepatology, 2007, 45, 998-1006). 회장 또는 결장의 1 센티미터를 종방향으로 개방하고, 차가운 PBS로 1회 세정한 후, 니코틴아마이드 및 글루코오스는 없고, 0.25% 지방산 없는 알부민 소과 혈청(Sigma, St. Louis, MO)이 함유된 DMEM(GIBCO, 분비 배지) 500μl에서 37℃로 2시간 동안 배양하였다. Sirt1 및 Sirt6 억제제를 사용한 실험에서, 24-월령 암컷 B6 마우스의 회장을 0.2% DMSO(비히클), 20μM EX527(Cayman chemical, MI) 또는 20μM STK665401(ChemDiv, cat #8018-9378; Sociali, G. 등, Eur. J. Med. Chem., 2015, 102, 530-539)을 함유한 분비 배지 500μl에서 2시간 동안 37℃에서 사전 배양하였다. 사전배양 후, 배지를 교체하고, 생체외 회장 외식편을 37℃에서 2시간 동안 동일한 화학물질을 사용하여 배양하였다. 가습된 인큐베이터(95% O2, 5% v/v CO2)에서 배양이 끝난 후, 배지를 수집하고, 4℃에서 5분 동안 800g로 원심분리하여 부유 잔해를 제거하고, 후속적인 GLP-1 측정을 위해 -80℃에서 냉동시켰다. 제조자의 지침에 따라 GLP-1 Total ELISA Kit(EMD Millipore, MO)로 혈장 및 배지에서의 GLP-1 수준을 측정하였다. GLP-1 값 브라드포드 검정에 의해 분석된 총 단백질 함량으로 정규화하였다.
레이저-현미절개. 이전에 기재된 바와 같이(Satoh, A. 등, Cell Metab., 18, 416-430, 2013), 각각의 시상하부 핵을 현미절개하고, 총 RNA를 정량적 RT-PCR에 의해 추출 및 분석하였다.
통계적인 분석. 달리 나타내지 않는 한, 스튜던트t 검정을 사용하여 두 그룹의 차이를 평가하였다. 하기 실시예에서 표시된 다양한 사후 검증으로 원-웨이 ANOVA를 사용하여 여러 그룹의 비교를 수행하였다. 윌콕슨 비모수 검정방법(Wilcoxon matched-pairs signed ranks test)을 사용하여 산소 소비, 에너지 소비, 호흡 교환비, 및 총 운동 활동에서의 차이를 비교하였다. 비교를 위해, p 값 <0.05을 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다. GraphPad Prism(버전 7)을 사용하여 통계적인 분석을 수행하였다. 모든 값은 평균 ± 표준오차로 제시하였다. 달리 명시되지 않는 한, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
본 교시에는 모든 청구항 또는 양태의 범위를 한정하고자 하는 의도가 없는 실시예에서 제공된 설명이 포함된다. 구체적으로 과거형으로 제시되지 않는 한, 실시예는 예언적인 또는 실제 예이다. 본 교시를 추가로 설명하기 위해 하기 비-제한적인 실시예들을 제공하였다. 본 개시내용에 비추어, 당해 분야의 숙련가는 개시된 특정 구현예에 많은 변형이 이루어질 수 있음을 인정할 것이다, 본 교시의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서, 비슷한 또는 유사한 결과를 여전히 획득할 것이다.
실시예 1
본 실시예는 NMN 수송체 유전자의 확인을 설명한다.
NAMPT-매개 NAD+ 생합성을 다양한 유형의 일차 세포에서 강력한 NAMPT 억제제인 FK866에 의해 억제한 경우, FK866의 부재 하에 NMN에 의해 유도된 것과 비교하여, NMN의 공-투여는 항상 더 높은 NAD+ 증가를 생산하였다(Revollo, J. R. 등, Cell Metab., 6, 363-375, 2007; Stein, L. R. & Imai, S., EMBO J., 33, 1321-1340 2014; Yoshino, J., 등, Cell Metab., 14, 528-536, 2011). 본 발명의 연구자는 FK866으로 처리된 일차 마우스 간세포, 췌장 소도, 및 해마 신경구에서 유전자 발현 프로파일링을 수행하여, 이들 세 가지 일차 배양액에서 통상적으로 상향조절된 유전자를 검색하였다. 이와 같은 검색은 수송체 또는 막관통 단백질을 인코딩하는 유전자에 집중 되었고, 이들 기준에 부합하지만 기능이 알려지지 않은 단 하나의 유전자를 찾아 내었다. 이와 같은 유전자, Slc12a8은 일차 간세포, 소도, 및 신경구 각각에서 2.06, 1.69, 및 4.91의 Z 비를 나타내었다(도1). 화살표로 표시된 도 1의 벤 다이어그램의 섹션에서 Slc12a8을 확인하였다. 각각의 세포 유형에서 Slc12a8에 대한 Z 비 및 p 값을 도 1에 도시하였다. 상기 Slc12a8 유전자는 전기중립적 양이온-클로라이드-커플링된 공-수송체의 SLC12 유전자 계열에 속하고, 이와 같은 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 기능은 여전히 알려지지 않았다(Hebert, S. C., 등, Pflugers Arch. 447, 580-593, 2004).
실시예 2
본 실시예는 B6 마우스에서 Slc12a8의 설명한다 차별적 발현을 설명한다.
도 2는 Slc12a8이 3 월령의 B6 수컷 마우스(n= 3 마우스)에서 소장 및 췌장에서 높이 발현되고, 간 및 백색 지방 조직에서 중간 정도로 발현됨을 보여준다. 일차 마우스 간세포에서 Slc12a8 mRNA 발현 추가 변화를 관측하여 이것을 도 3(n=4 마우스)에 도시하였다; NIH3T3 섬유모세포(n=4), 및 0.1% DMSO, FK866 단독으로 또는 FK866/NMN 조합(세포는 24시간 및 외식편은 4시간; Tukey's 검정으로 ANOVA를 사용하여 분석함)으로 처리한 공장 및 회장의 생체외 외식편(DMSO 및 FK866 단독의 경우 n=4 마우스; FK866/NMN조합의 경우 n=3 마우스). FK866으로 처리한 경우, 마우스 일차 간세포, 마우스 NIH3T3 섬유모세포, 및 공장 및 회장의 생체외 외식편에서, Slc12a8 발현이 유의미하게 유도된 반면, 이와 같은 유도는 NMN의 첨가에 의해 억제되었다(도 3~5). 도 4는 DMSO, FK866 단독, 및 FK866/NMN 조합으로 처리한 일차 마우스 간세포 및 NIH3T3 섬유모세포에서 세포내 NAD+ 함량을 설명한다. 세포를 이들 화합물로 24시간 동안 처리하였다(DMSO 및 FK866로 처리한 간세포의 경우는 n=4 마우스 및, FK866 및 NMN으로 처리한 간세포의 경우는 n=3; NIH3T3 세포의 경우는 n=6; Tukey's 검정을 가지고 ANOVA를 사용하여 분석함. 도 5는 FK866 또는 FK866/NMN 조합으로 48시간 동안 처리한 NIH3T3 세포에서 유세포측정 분석으로 표면 및 세포내 Slc12a8 단백질 발현 수준을 측정하였음을 설명한다. 세포자멸사(Zombi-)의 마커를 위해 부정적으로 선택된 세포들 사이에서 Slc12a8 염색(Slc12a8+)에 대한 양성 NIH3T3 세포의 백분율을 계산하였다(표면 염색의 경우 n=8 및 세포내 염색의 경우 n=5; 비결합(unpaired) t-검정으로 분석).
실시예 3
본 실시예는 Slc12a8이 NMN 흡수의 동력학에 미치는 효과를 설명한다.
마우스 일차 간세포에서 NMN 흡수의 동력학을 판단하였다. CD73에 의한 NMN의 NR로의 세포외 열화를 AOPCP(아데노신-5'-[α,β-메틸렌]디포스페이트)로 억제하였다. 뉴클레오사이드 수송체를 통해 세포로의 NR의 흡수는 디파이리다몰로 억제하였고, NAMPT에 의한 세포내 NMN 합성은 FK866로 억제하였다. 온전한 일차 간세포를 AMP 또는 AMP/AOPCP 조합과 함께 배양하였다. 상이한 시점에서(0, 1, 5, 15, 및 30분) 세포외 아데노신의 생성을 HPLC에 의해 측정하였다. AOPCP는 5'-뉴클레오티다제 활성을 97% 억제한다. AOPCP, 디파이리다몰, 및 FK866의 칵테일은 최대 30분까지 세포 생존력에 영향을 끼치지 않았다(데이터 도시되지 않음).
일차 마우스 간세포를 500nM FK866로 24시간 동안 전처리하고, 그 다음 100μM NMN의 존재 하에 또는 이의 부재 하에, 20μM 디파이리다몰, 500 μM AOPCP, 및 500 nM FK866의 칵테일로 배양하였다. HPLC로 NMN을 측정하였다(n=4 마우스,단 예외적으로 억제제 단독의 경우 15 및 30 분 시점 동안 3개 데이터 세트; Sidak's 검정으로 ANOVA를 사용하여 분석함). 마우스 일차 간세포에서, 대조군과 비교하여, 이와 같은 처리로 세포내 NMN 수준이 1분 시점에 유의미하게 증가하였다(도 6).
실시예 4
본 실시예는 감소된 Slc12a8 및 Nrk1 mRNA의 NMN 흡수에 대한 효과를 설명한다.
일차 마우스 간세포에서 Slc12a8 및 Nrk1 mRNA의 녹다운 효율성을 측정하기 위해, 세포를 스크램블(scramble) 및 Slc12a8 또는 Nrk1 siRNA로 72시간 동안 처리하였다(Slc12a8 침묵화의 경우는 n=5 마우스 및 Nrk1 침묵화의 경우 n=3; 비결합(unpaired) 700 t-검정으로 분석함). 이론에 의한 제한됨 없이, 이들 조건은 Slc12a8 및 Nrk1(세포내에서 NR를 NMN으로 전환하는 주요 NR 키나아제)의 발현을 녹다운하였다(Belenky, P., 등, Cell, 129, 473-484, 2007). 스크램블, Slc12a8, 및 Nrk1 siRNA로 처리한 일차 간세포를 100μM NMN 첨가 후 1분에 HPLC를 통해 분석하였다. 배양 조건은 실시예 3에 기재된 바와 동일하였다(Slc12a8 침묵화의 경우 n=5 마우스 및 Nrk1 침묵화의 경우 n=3; Tukey's 검정으로 ANOVA를 사용하여 분석함). 두 유전자 모두에 대한 녹다운 효율성은 대략 80%(도 7)였다. NMN의 빠른 흡수는 Slc12a8-녹다운 간세포에서 완전히 무효화된 반면, Nrk1-녹다운 간세포에서는 NMN 흡수의 상당한 감소가 관측되지 않았다(도 8); 이들 데이터는 Slc12a8이 일차 간세포에서 NMN 의 빠른 흡수를 위해 필요하고, 세포내 NMN의 상기 관측된 증가가 NR 또는 니코틴아마이드의 NMN으로의 전환 때문이 아님을 시사한다.
실시예 5
본 실시예는 마우스 NIH3T3 세포에서 전장 마우스 Slc12a8 cDNA의 과발현을 설명한다.
상기 NIH3T3 세포주가 CD73(NMN을 NR로 전환) 및 CD38(NMN을 니코틴아마이드 및 포스포리보오스로 분해)의 어떤 검출가능한 세포외 활성을 갖지 않고, 또한 아주 약한 NMN 흡수 활성을 갖기 때문에, 그것을 선택하였다. 방법에 기재된 바와 같이, 전장 마우스 Slc12a8 cDNA를 세포로 형질 감염시키고, Slc12a8 단백질의 발현을 분석하였다. 도 9는 대조군 및 Slc12a8-OE NIH3T3 세포의 원형질막 분획에서의 Slc12a8 단백질 발현을 설명한다. 도 10은 각각의 세포주에 대한 카베올린-1 단백질 수준으로 정규화된 Slc12a8 단백질 수준을 설명한다(우측 패널; n=3, 비결합(unpaired) t-검정으로 분석함). Slc12a8-과발현 NIH3T3(Slc12a8-OE) 세포에서 Slc12a8 단백질 수준이 ~2.2배 정도 유의미하게 증가하였다.
실시예 6
본 실시예는 Slc12a8-OE 및 대조군 세포에서 3H-표지된 NMN을 사용한 NMN 흡수의 동력학을 설명한다.
NMN의 흡수를, 대조군에서 37℃의 25μM 3H-NMN 및, Mg2+ 및 Ca2+를 갖는 Hanks' 완충액[ph7.5]에서 10 분에 걸쳐 Slc12a8-OE NIH3T3 세포를 사용하는 "방사선 표지된NMN으로 NMN 흡수 분석"하의 방법에 기재된 바와 같이, 측정하였다(n=12; Sidak's 검정으로 ANOVA에 의해 분석함). 3H-NMN의 흡수는 대조군 세포와 비교하여, Slc12a8-OE 세포에서 3분 및 5분 시점에 유의미하게 향상되었다 (도 11). 상기 Slc12a8 단백질에 대한 미하엘리스-멘텐 매개변수를 계산하기 위해, 대조군 및 Slc12a8-OE NIH3T3 세포를 Mg2+ 및 Ca2+를 갖는 Hanks'완충액[pH7.5]에서, 37℃로 4분 동안 3H-NMN 100nM 및 농도가 증가하는 차가운 NMN로 배양하였다. 대조군 세포의 배경을 공제함으로써 비-선형 회귀 분석에 의해 Km 및 Vmax 값을 결정하였다(1 및 10μM의 경우는 n=5, 및 25 및 100μM의 경우는 n=4). NMN의 경우, 상기 Km은 34.1 ± 8.3μM이고, 상기 Vmax는 11.5 ± 1.2 pmol/분/mg였다(도 12). 이와 같은 Km은 마우스 혈장 및 적혈구에서 검출된 NMN 농도의 범위(Revollo, J. R. 등, Cell Metab., 6, 363-375, 2007; Ramsey, K. M., 등, Science, 324, 651-654, 2009; Yamada, K., 등, Anal. Biochem., 352, 282-285, 2006)와 정성적으로 일치한다.
실시예 7
본 실시예는 상기 Slc12a8 단백질의 특이성을 설명한다.
프로테오리포좀은, 상기에 기재된 바와 같이, 수송 완충액 중 Slc12a8-OE 및 대조군 NIH3T3 세포의 원형질막 분획에서 생산된 프로테오리포좀에서 25℃의 22nM 3H-NMN을 사용하여, Slc12a8-OE 또는 대조군 NIH3T3 세포의 막 분획을 단백질-제거 적혈구 원형질막에서 유래된 인지질 이중층과 배합함으로써, 생산하였다(n=3; Sidak's 다중 비교 검정으로 원-웨이 ANOVA에 의해 분석함). Slc12a8-OE-유래 프로테오리포좀이 대조군-유래 프로테오리포좀의 것보다 유의미하게 더 높은 수준의 3H-NMN을 2분 내에 편입하였다(도 13).
일부 실험에서, 니코틴산(NA)이 방사선표지된 3H-NMN의 Slc12a8-과발현 프로테오리포좀으로의 흡수를 향상시킬 수 있음이 밝혀졌다(도 42). NA에 의한 3H-NMN 흡수의 향상을 다른 조건 하에서 재생하였다(도 42).
Slc12a8의 기질 특이성을 판단하기 위해, 3H-NMN 및 다양한 차가운 NAD+ 관련 화합물로 이동 실험을 위해 이들 Slc12a8-OE 프로테오리포좀을 사용하였다. 수송 완충액 중 150μM 경쟁하는 차가운 화합물(NMN, NR, NAD, AMP, NaMN, 및 니코틴아마이드)의 존재 하에 Slc12a8-OE 프로테오리포좀에서 2분에 3H-NMN(150nM, 25℃)의 흡수를 측정하였다(n=3, 던넷 검정으로 ANOVA에 의해 분석함). 150μM의 차가운 NMN은 3H-NMN의 완전한 이동을 보여준 반면, NAD+, AMP, 니코틴산 모노뉴클레오타이드(NaMN), 및 니코틴아마이드는 동일한 농도에서 아주 낮거나 또는 무시할만한 이동을 보여주었다(도 14). 150μM NR는 ~70% 이동을 보였고, 따라서 프로테오리포좀 시스템을 사용하여 NMN 및 NR에 대한 IC50 농도를 결정하였다. NMN의 IC50은 22.8 ± 3.6μM였던 반면, NR의 IC50은 77.4 ± 10.8μM였다(도 15). 데이터는 3H-NMN 흡수의 백분율로 나타내었다(n=3; 비-선형 회귀 분석에 의해 IC50을 계산하였다). NR 수준이 병리생리적 조건, 예컨대 혈액(Frederick, D. W., 등, Cell Metab., 24, 269-282, 2016) 및 복수 삼출물(Sociali, G., 등, Oncotarget, 7, 2968-2984, 2016)에서 그와 같은 고농도에 도달할 수 있음이 보여진 바 없기 때문에, 이론에 의한 제한됨 없이, 이와 같은 결과는 상기 Slc12a8 단백질이 생리적 조건 하에서 주로 NMN에 특이적임을 시사한다.
이와 같은 결과들은 NA 및 일부 NA 유도체 화합물을 사용하여 Slc12a8 NMN 수송체의 기능을 촉진할 수 있음을 시사한다.
실시예 8
본 실시예는 NMN 수송에 대한 Slc12a8의 나트륨 이온 의존성을 설명한다.
이들 실험에서, 상기 프로테오리포좀 시스템을 사용하여 NMN 수송에 대한 Slc12a8의 나트륨 이온 의존성을 평가하였다. 프로테오리포좀 제조 및 NMN-유입 측정 중에 나트륨(Na+)을 등몰 농도의 리튬(Li+)으로 대체한 경우, 상기 3H-NMN 편입은 극적으로 ~80% 감소하였고(도 16; n=3, 비결합(unpaired) t-검정에 의해 분석함), 이것은 Slc12a8에 의한 NMN 수송이 나트륨 이온-의존적임을 시사한다.
이들 결과는 나트륨 염이 Slc12a8-매개 NMN 수송을 향상시킬 수 있고, 다른 양이온 예컨대 리튬이 Slc12a8-매개 NMN 수송을 억제할 수 있음을 시사한다.
실시예 9
본 실시예는 NIH3T3 세포에서 NAD+ 생합성에 대한 Slc12a8 과발현의 효과의 결정을 설명한다.
대조군 NIH3T3 및 Slc12a8-OE 세포를 100nM FK866, 2μM 디파이리다몰, 및 500μM AOPCP의 칵테일로 1시간 동안 전처리 하는 경우, 세포내 NAD+ 수준이 대조군 및 Slc12a8-OE 세포 모두에서 유의미하게 감소하였다(도 41). 그러나, 100μM NMN으로의 추가적인 1시간 배양은, 대조군 NIH3T3 세포에서는 아니나, Slc12a8-OE 세포에서만은 NAD+ 수준을 최초 수준으로 회복시킬 수 있었다(도 41; n=9; Tukey's 검정으로 ANOVA에 의해 분석함).
실시예 10
본 실시예는 NMN 수송체의 생체내 검증을 설명한다.
상기에 기재된 바와 같이, 대조군 개똥벌레 루시퍼라제(fLuc) shRNA 및 Slc12a8 shRNA를 보유하는 렌티바이러스를 생성하였다. 상기의 발명자들은 마우스 소화관에 직접적으로 각 바이러스의 투여(위관영양법)를 수행하였다. 대조군 shfLuc 렌티바이러스- 및 shSlc12a8 렌티바이러스-감염된 공장 및 회장 샘플에서의 Slc12a8 단백질 발현 수준을 웨스턴 블랏을 통해 측정하였다(도 17). 도 18은 상기 공장 및 회장에서 GAPDH 단백질 수준으로 정규화된 Slc12a8 단백질 수준의 막대 그래프를 보여준다(n=6; 3~4월령 B6 수컷, 비결합(unpaired) t-검정에 의해 분석함). 소화관에 Slc12a8 shRNA-발현 렌티바이러스가 투여된 마우스에서는, 상기 fLuc shRNA-발현 렌티바이러스가 투여된 마우스와 비교하여, Slc12a8 단백질 수준이 공장에서 ~60% 감소하였고, 회장에서 ~30% 감소하였다(도 17-18). 경구 위관영양법으로 상기 마우스에 NMN(500mg/kg 체중)을 투여하자, 혈장 NMN 수준이 대조군 마우스에서 5분에 유의미하게 증가한 반면, 상기 Slc12a8-녹다운 마우스에서는 전혀 증가하지 않았다(도 19; HPLC에 의해 측정된 NMN; n=6; 3~4 월령 B6 수컷, Sidak's 검정으로 ANOVA에 의해 분석함). 대신에, 혈장 니코틴아마이드 수준이 대조군 마우스와 비교하여 Slc12a8-녹다운 마우스에서 더 높은 경향이 있었는데(도 20), 아마도 Slc12a8-녹다운 마우스에서 더 높은 수준의 NMN이 니코틴아마이드로의 분해를 거치기 때문일 것이다. 혈장 샘플뿐만 아니라, 대조군 shfLuc 렌티바이러스- 및 shSlc12a8 렌티바이러스-감염된 마우스에서, 인산염 버퍼 염수(PBS) 또는 NMN(500mg/kg 체중)의 경구 위관영양법 후 60분에 공장의 조직 샘플을 수집하였다(PBS는 n=5, 및 NMN은 n=8; 3~4 월령의 B6 수컷). 이어서, 이들 샘플에서 HPLC에 의해 NAD+ 수준을 측정하였다(Tukey's 검정으로 ANOVA에 의해 분석함). 대조군 마우스와 비교하여, Slc12a8-녹다운 마우스의 공장에서 NAD+ 수준이 유의미하게 감소하였다(도 21). 이들 결과는 소장에서의 Slc12a8이 소화관에서 혈액 순환으로 NMN을 흡수하는 데 중요하고, 이것이 소장 및 체내 전신 NMN 공급에서 NAD+ 수준에 영향을 미침을 강력히 시사한다.
실시예 11
본 실시예는 Slc12a8 녹아웃 마우스의 특성규명을 설명한다.
상기에 기재된 바와 같이, CRISPR~CAS9 시스템을 사용하여, 상기 Slc12a8 유전자의 엑손 4를 마우스에서 절단하였다(이것이 전신 Slc12a8 녹아웃(Slc12a8KO) 마우스를 생산하였다). 이들 녹아웃 마우스의 출생 비율은 기대된 멘델 비보다 낮았는데, 이는 배아 단계에서 일부 조기 사망이 있었음을 시사한다. 그러나, 태어난 새끼들은 성인기로 성장하였고, 어떤 엄청난 비정상을 보이지 않았다. 낮 시간(오전 9~10시) 또는 밤 시간(오후 9~10시) 동안, Slc12a8KO 마우스 및 대조군 야생형 한배새끼(WT)에서 유래된 십이지장, 공장, 회장, 및 췌장의 조직 샘플을 수집하였다. 이들 샘플에서 HPLC에 의해 NAD+ 수준을 측정하였다(낮 시간의 경우, n=5 마우스 및 밤 시간의 경우, n=4 마우스, 단 Slc12a8KO 마우스의 공장에 대한 3가지 데이터 포인트는 제외됨; 8~10 월령의 암컷; 비결합(unpaired) t-검정에 의해 분석함). 성체 Slc12a8KO 마우스에서, 전장 Slc12a8 mRNA의 발현을 조직에서 완전히 폐지하였다(n=3, 2~3 월령의 수컷; 도 22). 또한, Slc12a8 단백질 발현이 웨스턴 블랏팅에 의해 Slc12a8KO 마우스의 공장 및 회장(도 23), 췌장(도 23) 및 시상하부(도 24)의 전체의 조직 용해물에서 무효화되었음을 확인하였다. Slc12a8의 N-말단 도메인의 첫번째 17개 아미노산에 대한 항혈청을 사용하였다. 상기 녹아웃 마우스의 십이지장은, 비록 야생형 마우스(도 2)에서 높은 수준의 Slc12a8 mRNA를 발현하지만, 전장 Slc12a8 단백질을 발현하지 않는다(도 23). Slc12a8KO 마우스는, 특히 NAD+ 198 수준이 일반적으로 상승하는 밤 시간에, 소장에서의 단백질 발현 프로파일과 일치하면서, 공장 및 회장에서의 NAD+ 수준의 유의미한 감소를 나타냈으나, 십이지장에서는 그렇지 않았다(도 25a~b). 그들은 또한 낮 시간 및 밤 시간 모두 췌장에서 NAD+ 감소를 나타냈다(도 25a~b). 상기 Slc12a8KO 마우스의 소장에서 NMN 수송이 손상되었는지 여부를 확인하기 위해, 상기 발명자들은 이중으로 표지된 3-D, 더 무거운, 동위원소 NMN(18O-D-NMN)의 위관영양법을 수행하고, 질량 분광분석법으로 18O-D-NMN의 공장 및 회장으로의 직접적인 흡수를 측정하였다. Slc12a8KO 마우스 및 대조군 야생형(WT) 한배새끼에서 경구 위관영양법에 의해 500mg/kg의 758 18O-D-NMN을 투여한 후 10분에, 야생형 공장 및 회장에서 이와 같은 동위원소 NMN이 분명히 검출된 반면, 18O-D-NMN의 흡수는 Slc12a8KO 마우스의 공장 및 회장 각각에서 46% 및 36% 감소하였다(도 26; n=6 마우스, 7~8 월령의 수컷 3마리 및 암컷 3마리, 단 예외적으로 야생형 회장의 경우 수컷 2마리 및 암컷 2마리; 비결합(unpaired) t-검정으로 분석함). PBS 대조군의 배경 값을 공제함으로써 18O-D-NMN의 피크 아래 면적을 계산하였다. 값은 WT에서 검출된 18O-D-NMN 수준에 상대적으로 표현된다. 본 실시예에서, 모든 값은 평균 ± 표준오차로 제시된다. *p<0.05, **p<0.01
실시예 12
본 실시예는 Slc12a8KO 마우스가 지방 또는 제지방에 대한 효과 없이 과식증을 보임을 설명한다.
6~7월령의 Slc12a8KO 마우스, 특히 암컷이 밤 시간 동안 유의미한 과식증을 보이기 시작하였다(도 27). 5 일 동안 낮 시간(오전 9 시부터 오후6 시) 및 밤 시간(오후 6시부터 오전 9시) 동안 Slc12a8KO 마우스 및 대조군 야생형(WT) 한배새끼에서 음식 섭취를 측정하였다(각각의 유전자형의 경우 n=8 마우스; 6~7 월령의 암컷; 비결합(unpaired) t-검정에 의해 분석함). 그러나, 상기 Slc12a8KO 마우스는, 야생형 대조군과 비교하여, 지방 및 제지방에서 어떤 차이도 보이지 않았다(도 28). Slc12a8KO 및 대조군 야생형 한배새끼(각각의 유전자형에 대해 n=8 마우스; 8~10 월령의 암컷)에서 전신 NMR 기기를 사용하여 지방 및 제지방을 측정하였다. 상기 드러난 과식증은 배설물 지질 함량에 있어서 대조군 및 Slc12a8KO 마우스 사이에 차이가 없었기 때문에 소화관에서의 흡수불량 때문은 아니었다(도 29). Slc12a8KO 마우스 및 대조군 야생형 한배새끼(각각의 유전자형에 대해 n=8 마우스, 6~8월령의 암컷)에서 오전 9~10시에 수집한 배설물에서, 추출된 출발 배설물 질량의 백분율로 표현하는 총 지질 함량을 측정하였다.
실시예 13
본 실시예는 Slc12a8KO 마우스의 증가된 호흡 및 활성을 설명한다.
흥미롭게도, 상기 Slc12a8KO 마우스는 밤 시간 동안 산소 소비(VO2; 도 30), 에너지 소비(도 31), 및 총 보행(도 32)에서 중간 정도 증가를 보였는데, 이것은 체중 증가 없는 이의 과식증 표현형에 대한 설명을 제공한다. 이들 마우스는 또한 상당히 낮은 호흡 교환비(RER; 도 33)를 보여줬는데, 이는 낮 시간 동안 더 높은 지방산 이용을 시사하고, 대조군 및 Slc12a8KO 마우스 사이의 혈장 지방산 수준의 어떤 차이도 검출되지 않았으나, 정상적인 지방량의 유지에 대한 추가의 설명을 제공한다(도시되지 않음).
실시예 14
본 실시예는 Slc12a8 녹아웃 마우스에서 증가된 글루코오스 대사를 설명한다.
16 시간 동안 금식한 경우, 암컷 Slc12a8KO 마우스(각각의 유전자형에 대해 n=8 마우스; 6~8 월령의 암컷; 비결합(unpaired) t-검정에 의해 분석함)는 더 높은 글루코오스(도 34), 인슐린(도 35) 및 트리글리세라이드 수준(도 36)을 보여주었다. 이론에 의한 제한됨 없이, 모든 이들 표현형은 종합적으로 시상하부 기능이상을 시사한다.
실시예 15
본 실시예는 Slc12a8 녹아웃 마우스에서 글루카곤-유사 펩타이드 2 수용체(GLP-2R) 손상을 설명한다.
GLP-2R는 장내 분비 L 세포에 의해 생산되는 33-아미노산 프로글루카곤 유래 펩타이드이다. 24시간 금식(오전 9시부터 오전 9시까지) 후, 그런 다음 6시간 영양재개(오전 10시부터 오후 4시까지)(각각의 유전자형에 대해 n=8 마우스; 7~8 월령의 암컷) 후, Slc12a8KO 마우스 및 대조군 야생형 한배새끼에서 ELISA로 혈장 GLP-2 수준을 측정하였다. 상기 Slc12a8KO 마우스는, 24시간 금식 후 6시간 영양재개에 대한 반응으로, 상당히 더 낮은 혈장 수준의 GLP-2를 나타낸 반면, 대조군 마우스는 영양재개의 경우 혈장 GLP-2 수준에서 유의미한 증가를 나타냈다(도 37).
실시예 16
본 실시예는 Slc12a8 녹아웃 마우스의 궁상핵에서 발현 교란을 설명한다.
Chop(DNA 손상 유도성 전사체 3) 및 Socs3(사이토카인 신호전달 3의 억제제)는 내형질 망(ER) 스트레스 및 수득한 렙틴 저항에 반응하여 상향조절된다. 밤 시간(오후 9~10시) 중에 Slc12a8KO 마우스 및 대조군 야생형 한배새끼의 시상하부 궁상핵에서 Chop 및 Socs3 mRNA 발현 수준을 측정하였다 (Chop, 각각의 유전자형에 대해 n=3 마우스; Socs3, 각각의 유전자형에 대해 n=4 마우스; 8~10 월령의 암컷; 비결합(unpaired) t-검정에 의해 분석함). 상기 Slc12a8KO 마우스의 궁상핵은 적절한 GLP-2 자극의 이와 같은 결핍과 일치하며, mRNA 발현 수준의 증가를 보여주었다(도 38). 이론에 의한 제한됨 없이, 이들 결과는 궁상 뉴런의 기능이상을 시사한다(Williams, K.W., 등, Cell Metab., 20, 471-482,2014). 자유롭게 영양섭취한 Slc12a8KO 마우스 및 대조군 야생형 한배새끼에서 유래된 간에서 Pepck(포스포에놀피루베이트 카복시키나아제) 및 G6pc(글루코오스-6-포스파타제 촉매적 서브유닛) mRNA 발현 수준을 측정하였다 (각각의 유전자형에 대해 n=5 마우스; 8~10 월령의 암컷; 비결합(unpaired) t-검정으로 분석함). 이들 글로코네오제닉 유전자가 Slc12a8KO 마우스에서 상향조절됨을 발견하였다(도 39). 이론에 의한 제한됨 없이, 이들 데이터는 궁상 뉴런의 기능이상에 대한 증거를 추가로 제공하고, 금식한 Slc12a8KO 마우스에서 더 높은 글루코오스 및 인슐린 수준을 설명한다.
실시예 17
본 실시예은 Slc12a8 녹아웃 마우스에서 PMCH의 낮 동안의 mRNA 발현 프로파일을 설명한다.
낮 시간(오전 9~10시) 및 밤 시간(오후9~10시) 동안 Slc12a8KO 마우스 및 대조군 야생형 한배새끼의 측면 시상하부(LH)에서 PMCH(친-멜라닌 농축 호르몬) mRNA 발현 수준을 측정하였다(각각의 유전자형에 대해 n=3 마우스; 8~10 월령의 암컷; 비결합(unpaired) t-검정으로 분석함). 상기 PMCH의 낮 동안의 mRNA 발현 프로파일은 Slc12a8KO 마우스의 측면 시상하부에서 비정상이었던 반면(도 40)(낮 시간과 밤 시간 사이의 발현의 차이를 거의 보이지 않음), 밤 시간 동안 야생형 한배새끼에서의 PMCH의 발현은 유의미하게 증가하였다. 이론에 의한 제한됨 없이, NMN 수송체 결핍은 전반적으로 시상하부 기능에 영향을 미친다. Slc12a8KO 마우스의 다른 시상하부 핵에서 주요 뉴로펩타이드 및 이의 수용체를 인코딩하는 유전자의 발현에서 비정상이 검출되지 않았다(도시되지 않음). 이론에 의한 제한됨 없이, 이와 같은 발견은 상기 Slc12a8 NMN 수송체의 신규한 기능을 밝혀준다(NMN 자체 및 GLP-2를 통해, 소화관 및 시상하부 사이의 소화관 및 the 시상하부 조직간 소통을 소통하는 것으로 보임).
실시예 18
본 실시예는 소장에서 NAD+ 및 Slc12a8 농도를 설명한다.
나이를 먹으면서 다중 조직에서 NAD+ 함량이 감소한다는 것이 문서로 잘 기록된 바 있다(Yoshino, J., 등, Cell Metab., 2018, 27: 513-528, 2018). 밤 시간(오후 9~10시) 동안 수집된 2-월령(2 mo) 및 24-월령(24 mo) 암컷 B6 마우스의 공장 및 회장에서 NAD+ 수준을 측정하였다. 상기 공장 및 회장에서 나이를 먹으면서 NAD+ 함량이 감소한다(그러나, 공장에서 그와 같은 차이는 통계적 유의도를 갖지 못한다(도 43;(각각의 연령에 대해 n=4 마우스, 비결합(unpaired) t-검정으로 분석함)). 밤 시간(오후 9~10시) 동안 수집된 2-월령(2 mo) 및 24-월령(24 mo) 암컷 B6 마우스의 공장 및 회장에서 Slc12a8 mRNA 발현을 측정하였다(각각의 연령에 대해 n=4 마우스, 비결합(unpaired) t-검정으로 분석함). 노화된 회장에서 Slc12a8 발현은 관측된 NAD+ 감소와 일치하며 상당히 상향조절되었다(도 44). 이들 결과는 소화관에서 Slc12a8 상향조절이 감소한 NAD+와 상관관계가 있음을 설명한다.
실시예 19
본 실시예는 마우스에서 Slc12a8 소화관 녹다운의 글루코오스 대사에 대한 효과를 설명한다.
상기 발명자들은 경구 위관영양법을 통해 대조군 개똥벌레 루시퍼라제(fLuc) shRNA 및 Slc12a8 shRNA를 보유한 렌티바이러스를 2- 및 24-월령 마우스에 투여하고, 이의 섭식 행동을 조사하였다. 4 일 동안 낮 시간(오전 9시부터 오후 6시까지) 및 밤 시간(오후 6시부터 오전 9시까지) 동안 2- 또는 24-월령 창자 Slc12a8 녹다운 암컷 B6 마우스(shSlc12a8) 및 대조군 마우스(shfLuc)에서 음식 섭취를 측정하였다. 흥미롭게도, 노화된 마우스에서 밤 시간 동안 소화관-특이적 Slc12a8 녹다운이 음식 섭취의 상당한 감소를 야기한 반면, 어린 마우스에서는 음식 섭취에 어떤 영향도 미치지 않았다(도 45;(2-월령 창자 Slc12a8 녹다운 및 대조군 암컷 B6 마우스 각각에 대해 n=6 마우스 및 24-월령 창자 Slc12a8 녹다운 및 대조군 암컷 B6 마우스 각각에 대해 n=9 마우스; Tukey's 검정으로 ANOVA에 의해 분석함). 24시간 금식 후 2-월령(2 mo) 또는 24-월령(24 mo) 창자 Slc12a8 녹다운 암컷 B6 마우스(shSlc12a8) 및 대조군 마우스(shfLuc)에서 공복 혈당 수준을 측정하였다(도 46; 2-월령 창자 Slc12a8 녹다운 및 대조군 암컷 B6 마우스 각각에 대해 n=6 마우스 및 24-월령 창자 Slc12a8 녹다운 및 대조군 암컷 B6 마우스 각각에 대해 n=9 마우스; 비결합(unpaired) t-검정으로 분석함). 따라서, Slc12a8 녹다운은 또한 노화된 마우스에서 공복 혈당 수준을 감소시켰으나, 어린 마우스에서는 그렇지 않았다(도 46). 이론에 의한 제한됨 없이, 이들 결과는 소화관에서 Slc12a8 발현이 NAD+ 생산을 초래함을 설명한다.
실시예 20
본 실시예는 혈액에서 상기 소화관-특이적 Slc12a8 녹다운이 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1)의 순환 수준을 상당히 증가시켰음을 설명한다.
GLP-1은 장내 분비 L 세포에 의해 생산된 프로글루카곤-유래 식욕억제 펩타이드이다. 24시간 금식에 이어 6시간 영양재개(오전 10시부터 오후 4시까지) 후, 2- 또는 24-월령 창자 Slc12a8 녹다운 암컷 B6 마우스(shSlc12a8) 및 대조군 마우스(shfLuc)에서 ELISA로 혈장 GLP-1 수준을 측정하였다. 24시간 금식 후 6시간 영양재개에 반응하여, 노화된 마우스에서, Slc12a8 녹다운이 GLP-1 순환 수준을 증가시킨 반면, 어린 마우스에서는 그렇지 않았다(도 47; 2-월령 창자 Slc12a8 녹다운 및 대조군 암컷 B6 마우스 각각에 대해 n=6 마우스 및 24-월령 창자 Slc12a8 녹다운 및 대조군 암컷 B6 마우스 각각에 대해 n=9 마우스; 비결합(unpaired) t-검정으로 분석함). 이론에 의한 제한됨 없이, 이들 결과는 GLP-1 분비가 Slc12a8 활성의 영향을 받음을 설명한다.
실시예 21
본 실시예는 Slc12a8 녹다운이 노화된 회장에 미치는 효과를 설명한다.
회장에 GLP-생산 L 세포가 풍부함이 잘 알려져 있다(Yoon, M. J., 등, Cell Metab., 2015, 21, 706-717). 따라서, 회장에서 Slc12a8 및 GAPDH의 발현을 검사하였다. 2-월령(도 48) 또는 24-월령(도 49) 창자 Slc12a8 녹다운 암컷 B6 마우스(shSlc12a8) 및 대조군 마우스(shfLuc)의 회장 용해물에서 Slc12a8 및 GAPDH의 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. 도 48~49는 대표적인 웨스턴 블랏(좌측 패널)을 설명하고, 상응하는 막대 그래프는 회장에서 GAPDH 단백질 수준으로 정규화된 Slc12a8 단백질 수준(우측 패널)을 나타낸다. Slc12a8의 N-말단 도메인의 첫 번째 17 아미노산에 대한 항혈청을 사용하였다(2-월령 창자 Slc12a8 녹다운 및 대조군 마우스 각각에 대해 n=6 및 24-월령 창자 Slc12a8 녹다운 및 대조군 마우스 각각에 대해 n=4~5; 비결합(unpaired) t-검정으로 분석함). 상기 Slc12a8 단백질의 수준이 어린 및 노화된 Slc12a8-녹다운 마우스의 회장에서 상당히 감소하였으나(도 48~49), 상기 노화된 Slc12a8-녹다운 회장만이 NAD+ 수준의 상당한 감소를 나타냈는데(도 50), 이것은 노화된 회장에서 NAD+ 항상성을 유지하는 데 Slc12a8 상향조절의 생리적 유의성을 확인시켜 주었다. 도 50은 2- 또는 24-월령 창자 Slc12a8 녹다운(ShSlc12a8) 및 대조군 암컷 B6 마우스(ShfLuc)의 회장에서 NAD+ 수준을 설명한다(2-월령 창자 Slc12a8 녹다운 및 대조군 암컷 B6 마우스 각각에 대해 n=6 마우스 및 24-월령 창자 Slc12a8 녹다운 및 대조군 암컷 B6 마우스 각각에 대해 n=9 마우스; 비결합(unpaired) t-검정으로 분석함). 이론에 의한 제한됨 없이, 이들 결과는 노화된 회장에서 NAD+ 항상성을 유지하기 위해 Slc12a8 상향조절이 요구됨을 설명한다.
실시예 22
본 실시예는 배양된 회장에서 Slc12a8 녹다운이 GLP-1 수준에 미치는 효과를 설명한다.
상기 발명자들은 또한 노화된 fLuc- 대조군 및 Slc12a8-녹다운 마우스 생체외의 회장을 배양하였다. 37℃에서 2시간 배양된 24-월령 창자 Slc12a8 녹다운 암컷 B6 마우스(shSlc12a8) 및 대조군 마우스(shfLuc)의 생체외 회장 외식편에서 유래된 상청액에서 ELISA로 GLP-1 수준을 측정하였다(n=4 마우스, 비결합(unpaired) t-검정을 사용하여 분석함). 도 51은 상기 노화된 Slc12a8-녹다운 회장이, 상기 노화된 fLuc-대조군 회장과 비교하여, 3배 더 높은 수준의 GLP-1을 분비하였음을 설명한다. 상기 노화된 fLuc-대조군 및 Slc12a8-녹다운 마우스의 생체외-배양된 결장은 GLP-1 분비에서 어떤 차이도 나타내지 않았다. 37℃에서 2시간 동안 배양된 12-월령 Slc12a8KO 암컷 마우스(Slc12a8KO) 및 대조군 야생형 한배새끼(WT)의 생체외 회장 외식편의 상청액에서 ELISA로 GLP-1 수준을 측정하였다(n=4 마우스; 비결합(unpaired) t-검정으로 분석함). 또한 12-월령 Slc12a8KO 암컷 마우스(Slc12a8KO) 및 대조군 야생형 한배새끼(WT)의 회장 샘플에서 NAD+ 수준을 측정하였다(WT의 경우 n=3 마우스 및 Slc12a8KO의 경우 n=4; 비결합(unpaired) t-검정으로 분석함). 모든 값은 평균 ± 표준오차로 제시하였다. *p<0.05, **p<0.01. 도 52는 12-월령 대조군 및 Slc12a8KO 마우스의 생체외-배양된 회장에서 증가된 GLP-1 분비 및 감소된 NAD+를 설명한다. 이론에 의한 제한됨 없이, 이들 실시예는 Slc12a8이 노화된 마우스의 소화관에서 NAD+ 감소에 책임이 있음을 설명한다.
실시예 23
본 실시예는 SIRT1 및 SIRT6 억제제가 생체외-배양된 회장에 미치는 효과를 설명한다.
관측된 GLP-1 분비의 증가에 SIRT1 (Yoon, M. J., 등, Cell Metab., 2015 21, 706-717) 및 SIRT6(Jiang, H. 등, Nature, 2013, 496, 110-113)의 관여를 조사하였다. 생체외-배양된 야생형 회장을 SIRT1 및 SIRT6 억제제로 처리하였다. 0.2% DMSO, 20μM EX527 또는 20μM STK665401로 4시간 동안 배양한 24-월령 암컷 B6 마우스의 생체외 회장 외식편의 상청액에서 ELISA로 GLP-1 수준을 측정하였다(n=3 마우스, Tukey's 검정으로 ANOVA를 사용하여 분석함). 강력한 SIRT1-특이적 억제제인 EX527만이 (SIRT6-특이적 억제제인 STK665401은 아님) 상기 회장에서 GLP-1 분비를 증가시킬 수 있었다(도 53). 이론에 의한 제한됨 없이, 이들 결과는 상당한 NAD+ 감소로 인해 줄어든 SIRT1 활성이 노화된 Slc12a8-녹다운 회장에서 관측된 GLP-1 분비 증가에 관여될 가능성이 있음을 설명한다.
본 발명 또는 이의 바람직한 구현예(들)의 요소를 소개할 때, 관사 "a", "an", "the" 및 "상기"는 상기 요소가 하나 이상 존재함을 의미하는 것으로 의도된다. 용어들 "포함하는", "포함되는" 및 "구비한"은 포괄적인 의미로 의도되며, 열거된 요소 이외의 추가의 요소가 있을 수 있음을 의미한다.
상기의 관점에서, 본 발명의 몇 개의 목적이 달성되고, 다른 유리한 결과가 획득됨이 이해될 것이다.
본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 상기 생성물 및 방법에 다양한 변화가 이루어질 수 있기에, 의도적으로 상기 설명에 함유되고 수반된 도면에 도시된 모든 것들은 예시적인 것으로, 제한적인 의미가 없는 것으로 해석되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Washington University in St. Louis Imai, Shin-ichiro Grozio, Alessia <120> COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT USING NICOTINAMIDE MONONUCLEOTIDE <130> WSTL 17227.WO <150> 62/543,856 <151> 2017-08-10 <150> 62/653,348 <151> 2018-04-05 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3166 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 atggcccaga ggtctccgca agaactcttc cacgaggcag cccagcaggg catcctggcc 60 cagccccagc cctggtggaa gatccagctg ttcatgtggg agccggtgct gtttgggacc 120 tgggatggtg tgttcacatc ctgcatgatc aacatttttg gcgttgtcct tttcttgagg 180 accggctggc tggtgggaaa cacaggtgtg ctcctgggct tgctcctggt gtccttcgtc 240 gtcctcgtgg ccctcatcac cgtgctgtcg ggcattggtg tcgcagagca tggcgggatc 300 agcagtggcg gtgtctactc catgatctcc tcggtgcttg gtgggcagat gggaggcact 360 gtggggctgc tctatgtatt tggacagtgt gttgcaggtg ctatgtacat caccggcttt 420 gcggagtcca tctcagatct gctgggactt ggggacatct gggcagtgcg tggaatttca 480 gttgctgtgc ttctggcttt gctgggcatc aacctggcag gtgtcaagtg gattatccgc 540 ctccagctgc tgctgctgct cctgctggct gtctcgaccc tggactttgt ggtgggctct 600 ttcacccacc tggacccaga acatggcttt attggctact ccccagaact gctacagagc 660 aacattctgc cagagtacag ccccggggag tcattcttca ctgtgtttgg ggtgttcttc 720 cctgcagcta caggagtcat ggctggcttc aacatgggag gagacctgag agaccctgct 780 gacagtgtcc ccttaggctc cctagcagct gttggcgtct cgtggtttct ctacatcatc 840 tttgccttcc tgcttggtgc cgtctgtacc cgagaggccc tccgctctga cttcctgata 900 gctgaaaagg tgtctctggt tggtttcctc ttcctattgg gcctgtacat ctcatccctg 960 gcttcctgta tggggggact ctatggcgca ccccggatcc tgcagtgcat cgcccaggac 1020 aaagtcatcc ctgcactcgc ctttctggcg aatgggaaag ggccaaataa aacaccggta 1080 gcagccatct gcctgaccag cttggtgacc atggcctttg tcctggtggg tcaggtgaat 1140 gttctggcgc ccgttgtcac catcaatttc atgctgacct acatcatggt ggactactct 1200 tacttcgccc tctccatggc tcactgtggc ctcgccccat ctcctgagcc cgtccccaga 1260 caaggcccag atactctgca ctgctctgag cacctgctcc aggacagggc tcccagctac 1320 ggctctgatg tccctgccag aagcctctct gagggcaccc tgctggagtt caccaaggac 1380 atggatcagt tcctccagcc aatagaggaa ctggagagtc gtcagcttgg gtcaagagaa 1440 ggaaacaacc caaagaatca gaagcgcaag ggtaagaaag gcgccaagca aaccctacaa 1500 gatagcttcc tcttggaccc tgggtctcct ttgtcctttc ctacgaggac ttctgagagg 1560 ttgtctgttg ccttctgtgg ggagcaagag tcctatcaga agcagcagac ttctaggagt 1620 gaatcacatg accatcttgt tcctgatcta cgcaaccagc ctagagtgaa cagagaagat 1680 ttctttctga aatgcagact tcaggaacaa gagatccaga gaagaccaag tgttttctat 1740 gcttgcatgt gtaacccctg ggtctccctg ttaggggctc ttgcatccct gctcatcatg 1800 tttgtgatcc agtggctcta taccctagct agtatgggtg ttgctgccct tgtgtatttc 1860 tacattggcc aggcaagtcc aggcctttac ctcggatcag catcaaactt cagctttttc 1920 caatggatga agtccttctt ggtcccctcc tgcaggagcc tgaggtccgc ccaggagcaa 1980 atcatcttgg cgccatcacc agccaaggtt gacatggcaa tgactcagct tacccaggac 2040 aatgcagact tcgccacccg agatcgttac caccactcct ccttcctgag ccgggagcag 2100 ttgatgcctc cctactagga cctcgctgga ccccaccttt ctagaagccg ctgtggagat 2160 gggggaccca agcctcagaa cctttggaag ttgcttctac caataagaaa acccaagact 2220 ggtcttccca ccacagcctt ggacgctgga aatcacattc cggtctgaaa tggcatgtct 2280 agccagatac taggtatgac tatggcttcc acgtgtgccc aacctgaaga gtccacaggc 2340 accaggatga tcaggtgaca ccaagacaac caaatgtgga gaatcaaaac gagatttctt 2400 attctaaggg gccaaaataa acacttcttt ttaattttat tgttttattt tttattattt 2460 ttaaagaatt atatatatat acatatactg tagctatttt cagacagaaa atagcatcac 2520 cagaagaggg catcggatcc cattacagat ggttgtgagc caccatgtgg ttgctgggaa 2580 ttgaactcag gatctctgga agaacagtca gtgctcctaa ctgctgagcc atctctccag 2640 caccctcccc tgttttattt attttgtaat gtatactaac tacactcaca tggttcccaa 2700 gccacagagt atagaaaccc ccttctccct gtttctcatc tgtttggtgt ccgtccccca 2760 tcacaggggc aaccacttct catgcaaaca tcagccacct ctttacagac ccctcccatc 2820 tgcaaatgca gctctgttta caatgcacta catcccgctc ttctccctta atctgccata 2880 gaagcatttc catgaagatg cttacacagt ttcctcctta tgtctctatg tctgaatgtg 2940 ccttaattta tatactcagc ctcacgagga cggcatttag cttcattctg atattttgct 3000 attacagccg cttctgcaaa gagtcactgt gtttgtgtgc acagtcgtga aggatacctg 3060 aagataaatt ctcagaagga gaattacagg gtgactgggg atgtacattt gtaagctgtt 3120 actgtttgga gaaatgcttt ttaattaaaa agtcaatcaa atacca 3166 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 atactcgagg agaatggccc agaggtctc 29 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 3 tcaactacgg agggatgatc gagctcatt 29 <210> 4 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 4 cttcctgtca 10 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 5 gcctagagtg aacagagaag a 21 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 6 Ala Gln Arg Ser Pro Gln Glu Leu Phe His Glu Ala Ala Gln Gln Gly 1 5 10 15 Cys <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 7 agtgcatgta tagacgtatg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 8 cctcacaaat atttacaggc 20 <210> 9 <211> 2004 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 9 atggcccaga ggtctccgca agaactcttc cacgaggcag cccagcaggg catcctggcc 60 cagccccagc cctggtggaa gatccagctg ttcatgtggg agccggtgct gtttgggacc 120 tgggatggtg tgttcacatc ctgcatgatc aacatttttg gcgttgtcct tttcttgagg 180 accggctggc tggtgggaaa cacaggtgtg ctcctgggct tgctcctggt gtccttcgtc 240 gtcctcgtgg ccctcatcac cgtgctgtcg ggcattggtg tcgcagagca tggcgggatc 300 agcagtggcg gtgtctactc catgatctcc tcggtgcttg gtgggcagat gggaggcact 360 gtggggctgc tctatgtatt tggacagtgt gttgcaggtg ctatgtacat caccggcttt 420 gcggagtcca tctcagatct gctgggactt ggggacatct gggcagtgcg tggaatttca 480 gttgctgtgc ttctggcttt gctgggcatc aacctggcag gtgtcaagtg gattatccgc 540 ctccagctgc tgctgctgct cctgctggct gtctcgaccc tggactttgt ggtgggctct 600 ttcacccacc tggacccagg agtcatggct ggcttcaaca tgggaggaga cctgagagac 660 cctgctgaca gtgtcccctt aggctcccta gcagctgttg gcgtctcgtg gtttctctac 720 atcatctttg ccttcctgct tggtgccgtc tgtacccgag aggccctccg ctctgacttc 780 ctgatagctg aaaaggtgtc tctggttggt ttcctcttcc tattgggcct gtacatctca 840 tccctggctt cctgtatggg gggactctat ggcgcacccc ggatcctgca gtgcatcgcc 900 caggacaaag tcatccctgc actcgccttt ctggcgaatg ggaaagggcc aaataaaaca 960 ccggtagcag ccatctgcct gaccagcttg gtgaccatgg cctttgtcct ggtgggtcag 1020 gtgaatgttc tggcgcccgt tgtcaccatc aatttcatgc tgacctacat catggtggac 1080 tactcttact tcgccctctc catggctcac tgtggcctcg ccccatctcc tgagcccgtc 1140 cccagacaag gcccagatac tctgcactgc tctgagcacc tgctccagga cagggctccc 1200 agctacggct ctgatgtccc tgccagaagc ctctctgagg gcaccctgct ggagttcacc 1260 aaggacatgg atcagttcct ccagccaata gaggaactgg agagtcgtca gcttgggtca 1320 agagaaggaa acaacccaaa gaatcagaag cgcaagggta agaaaggcgc caagcaaacc 1380 ctacaagata gcttcctctt ggaccctggg tctcctttgt cctttcctac gaggacttct 1440 gagaggttgt ctgttgcctt ctgtggggag caagagtcct atcagaagca gcagacttct 1500 aggagtgaat cacatgacca tcttgttcct gatctacgca accagcctag agtgaacaga 1560 gaagatttct ttctgaaatg cagacttcag gaacaagaga tccagagaag accaagtgtt 1620 ttctatgctt gcatgtgtaa cccctgggtc tccctgttag gggctcttgc atccctgctc 1680 atcatgtttg tgatccagtg gctctatacc ctagctagta tgggtgttgc tgcccttgtg 1740 tatttctaca ttggccaggc aagtccaggc ctttacctcg gatcagcatc aaacttcagc 1800 tttttccaat ggatgaagtc cttcttggtc ccctcctgca ggagcctgag gtccgcccag 1860 gagcaaatca tcttggcgcc atcaccagcc aaggttgaca tggcaatgac tcagcttacc 1920 caggacaatg cagacttcgc cacccgagat cgttaccacc actcctcctt cctgagccgg 1980 gagcagttga tgcctcccta ctag 2004 <210> 10 <211> 1779 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 atggcccaga ggtctccgca agaactcttc cacgaggcag cccagcagtg tgttgcaggt 60 gctatgtaca tcaccggctt tgcggagtcc atctcagatc tgctgggact tggggacatc 120 tgggcagtgc gtggaatttc agttgctgtg cttctggctt tgctgggcat caacctggca 180 ggtgtcaagt ggattatccg cctccagctg ctgctgctgc tcctgctggc tgtctcgacc 240 ctggactttg tggtgggctc tttcacccac ctggacccag aacatggctt tattggctac 300 tccccagaac tgctacagag caacattctg ccagagtaca gccccgggga gtcattcttc 360 actgtgtttg gggtgttctt ccctgcagct acaggagtca tggctggctt caacatggga 420 ggagacctga gagaccctgc tgacagtgtc cccttaggct ccctagcagc tgttggcgtc 480 tcgtggtttc tctacatcat ctttgccttc ctgcttggtg ccgtctgtac ccgagaggcc 540 ctccgctctg acttcctgat agctgaaaag gtgtctctgg ttggtttcct cttcctattg 600 ggcctgtaca tctcatccct ggcttcctgt atggggggac tctatggcgc accccggatc 660 ctgcagtgca tcgcccagga caaagtcatc cctgcactcg cctttctggc gaatgggaaa 720 gggccaaata aaacaccggt agcagccatc tgcctgacca gcttggtgac catggccttt 780 gtcctggtgg gtcaggtgaa tgttctggcg cccgttgtca ccatcaattt catgctgacc 840 tacatcatgg tggactactc ttacttcgcc ctctccatgg ctcactgtgg cctcgcccca 900 tctcctgagc ccgtccccag acaaggccca gatactctgc actgctctga gcacctgctc 960 caggacaggg ctcccagcta cggctctgat gtccctgcca gaagcctctc tgagggcacc 1020 ctgctggagt tcaccaagga catggatcag ttcctccagc caatagagga actggagagt 1080 cgtcagcttg ggtcaagaga aggaaacaac ccaaagaatc agaagcgcaa gggtaagaaa 1140 ggcgccaagc aaaccctaca agatagcttc ctcttggacc ctgggtctcc tttgtccttt 1200 cctacgagga cttctgagag gttgtctgtt gccttctgtg gggagcaaga gtcctatcag 1260 aagcagcaga cttctaggag tgaatcacat gaccatcttg ttcctgatct acgcaaccag 1320 cctagagtga acagagaaga tttctttctg aaatgcagac ttcaggaaca agagatccag 1380 agaagaccaa gtgttttcta tgcttgcatg tgtaacccct gggtctccct gttaggggct 1440 cttgcatccc tgctcatcat gtttgtgatc cagtggctct ataccctagc tagtatgggt 1500 gttgctgccc ttgtgtattt ctacattggc caggcaagtc caggccttta cctcggatca 1560 gcatcaaact tcagcttttt ccaatggatg aagtccttct tggtcccctc ctgcaggagc 1620 ctgaggtccg cccaggagca aatcatcttg gcgccatcac cagccaaggt tgacatggca 1680 atgactcagc ttacccagga caatgcagac ttcgccaccc gagatcgtta ccaccactcc 1740 tccttcctga gccgggagca gttgatgcct ccctactag 1779 <210> 11 <211> 2145 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 atgacccaga tgtcccaggt gcaggagctc ttccatgagg cagcccagca ggatgccctg 60 gcccagcccc agccctggtg gaagacccag ctgttcatgt gggagcctgt gctgtttggg 120 acctgggatg gtgtgttcac atcctgcatg atcaacatct ttggggttgt gctcttcctg 180 aggactggct ggctggtggg aaacacagga gtgctcctgg gcatgttcct ggtgtccttc 240 gtcatcctgg tggccctcgt cacggtgctg tctggcattg gcgtcgggga gcgcagcagc 300 atcggcagcg gtggcgtcta ctccatgatc tcctcggtcc tgggtgggca gacgggaggc 360 accatcgggc tgctctatgt gtttggacag tgtgttgcag gtgccatgta tatcaccggc 420 tttgctgaat ccatctcgga tttgctgggc ctcgggaata tctgggctgt gcgaggaatt 480 tcagttgcgg tgcttctggc cttgctgggc attaacctcg caggtgtcaa atggataatc 540 cgcctccagc tgctgttgct gttcctgctg gccgtgtcca cactggactt tgtggtgggt 600 tctttcaccc acctggaccc agaacatggt ttcattggat attcacccga actgctacag 660 aacaacacgc tgcccgatta cagcccgggg gaatcttttt tcactgtctt tggggttttc 720 ttcccagcgg ctacaggagt catggccggc ttcaacatgg ggggcgacct cagggagcct 780 gccgccagca ttcccctggg ctccctggca gctgttggca tctcgtggtt tctgtacatc 840 atcttcgtct tcctcctggg cgccatctgc actcgagagg cccttcgcta tgacttcctg 900 atagcggaaa aggtatccct catgggcttc ctgttccttt tgggcttata catctcgtcc 960 ctggcttcct gcatgggagg actttatgga gctccccgca tcctgcagtg cattgcccag 1020 gagaaagtga tccctgcact tgcctgtctg ggacaaggga aggggccaaa caaaacaccc 1080 gtggctgcca tctgcctgac cagcttggtg accatggcct ttgtttttgt gggtcaagtg 1140 aacgttctgg cccccatcgt caccatcaac ttcatgctga catacgttgc agtggactac 1200 tcttacttct ccctgtccat gtgttcctgc agcctgaccc cggtgcctga gccggtgctc 1260 agggagggcg cagaaggcct ccactgctct gagcacctgc tcttagagaa agctcccagt 1320 tacggctctg agggacctgc ccaaagagtc ttggagggca cgctactgga attcaccaag 1380 gacatggatc agctcctcca gctaaccagg aagcttgaga gtagccagcc caggcaagga 1440 gagggtaaca ggaccccaga aagtcagaag aggaaaagca agaaggccac caagcagacc 1500 ctacaagata gcttcctctt ggacctcaaa tcccctcctt ctttccctgt cgagatctct 1560 gacaggttgc ccgctgcctc ctgggagggg caggagtcct gctggaacaa gcagacttcc 1620 aagagcgaag ggactcagcc tgagggaaca tatggagagc aacttgttcc tgagctgtgc 1680 aaccaatcag agtccagtgg agaagatttc ttcctgaagt ccaggctcca agaacaagat 1740 gtctggagaa gatccacttc tttctatacc cacatgtgca acccctgggt ctccctgttg 1800 ggggctgttg ggtcccttct catcatgttt gtgatacagt gggtgtatac cctggttaac 1860 atgggtgttg ctgccatcgt gtatttctac attggccggg ccagtccagg gcttcacctt 1920 ggatcagcct ccaacttcag ctttttccgg tggatgaggt ctctcttgct cccctcctgc 1980 aggagcttgc ggtcccctca ggagcagatc atcttggcgc cgtccctggc taaggttgac 2040 atggagatga ctcagctcac ccaggagaat gcagacttcg ccactcggga tcgctaccac 2100 cactcctccc tcgtgaaccg ggagcagctg atgcctcact actag 2145 <210> 12 <211> 705 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Met Ala Gln Arg Ser Pro Gln Glu Leu Phe His Glu Ala Ala Gln Gln 1 5 10 15 Gly Ile Leu Ala Gln Pro Gln Pro Trp Trp Lys Ile Gln Leu Phe Met 20 25 30 Trp Glu Pro Val Leu Phe Gly Thr Trp Asp Gly Val Phe Thr Ser Cys 35 40 45 Met Ile Asn Ile Phe Gly Val Val Leu Phe Leu Arg Thr Gly Trp Leu 50 55 60 Val Gly Asn Thr Gly Val Leu Leu Gly Leu Leu Leu Val Ser Phe Val 65 70 75 80 Val Leu Val Ala Leu Ile Thr Val Leu Ser Gly Ile Gly Val Ala Glu 85 90 95 His Gly Gly Ile Ser Ser Gly Gly Val Tyr Ser Met Ile Ser Ser Val 100 105 110 Leu Gly Gly Gln Met Gly Gly Thr Val Gly Leu Leu Tyr Val Phe Gly 115 120 125 Gln Cys Val Ala Gly Ala Met Tyr Ile Thr Gly Phe Ala Glu Ser Ile 130 135 140 Ser Asp Leu Leu Gly Leu Gly Asp Ile Trp Ala Val Arg Gly Ile Ser 145 150 155 160 Val Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ile Asn Leu Ala Gly Val Lys 165 170 175 Trp Ile Ile Arg Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Val Ser 180 185 190 Thr Leu Asp Phe Val Val Gly Ser Phe Thr His Leu Asp Pro Glu His 195 200 205 Gly Phe Ile Gly Tyr Ser Pro Glu Leu Leu Gln Ser Asn Ile Leu Pro 210 215 220 Glu Tyr Ser Pro Gly Glu Ser Phe Phe Thr Val Phe Gly Val Phe Phe 225 230 235 240 Pro Ala Ala Thr Gly Val Met Ala Gly Phe Asn Met Gly Gly Asp Leu 245 250 255 Arg Asp Pro Ala Asp Ser Val Pro Leu Gly Ser Leu Ala Ala Val Gly 260 265 270 Val Ser Trp Phe Leu Tyr Ile Ile Phe Ala Phe Leu Leu Gly Ala Val 275 280 285 Cys Thr Arg Glu Ala Leu Arg Ser Asp Phe Leu Ile Ala Glu Lys Val 290 295 300 Ser Leu Val Gly Phe Leu Phe Leu Leu Gly Leu Tyr Ile Ser Ser Leu 305 310 315 320 Ala Ser Cys Met Gly Gly Leu Tyr Gly Ala Pro Arg Ile Leu Gln Cys 325 330 335 Ile Ala Gln Asp Lys Val Ile Pro Ala Leu Ala Phe Leu Ala Asn Gly 340 345 350 Lys Gly Pro Asn Lys Thr Pro Val Ala Ala Ile Cys Leu Thr Ser Leu 355 360 365 Val Thr Met Ala Phe Val Leu Val Gly Gln Val Asn Val Leu Ala Pro 370 375 380 Val Val Thr Ile Asn Phe Met Leu Thr Tyr Ile Met Val Asp Tyr Ser 385 390 395 400 Tyr Phe Ala Leu Ser Met Ala His Cys Gly Leu Ala Pro Ser Pro Glu 405 410 415 Pro Val Pro Arg Gln Gly Pro Asp Thr Leu His Cys Ser Glu His Leu 420 425 430 Leu Gln Asp Arg Ala Pro Ser Tyr Gly Ser Asp Val Pro Ala Arg Ser 435 440 445 Leu Ser Glu Gly Thr Leu Leu Glu Phe Thr Lys Asp Met Asp Gln Phe 450 455 460 Leu Gln Pro Ile Glu Glu Leu Glu Ser Arg Gln Leu Gly Ser Arg Glu 465 470 475 480 Gly Asn Asn Pro Lys Asn Gln Lys Arg Lys Gly Lys Lys Gly Ala Lys 485 490 495 Gln Thr Leu Gln Asp Ser Phe Leu Leu Asp Pro Gly Ser Pro Leu Ser 500 505 510 Phe Pro Thr Arg Thr Ser Glu Arg Leu Ser Val Ala Phe Cys Gly Glu 515 520 525 Gln Glu Ser Tyr Gln Lys Gln Gln Thr Ser Arg Ser Glu Ser His Asp 530 535 540 His Leu Val Pro Asp Leu Arg Asn Gln Pro Arg Val Asn Arg Glu Asp 545 550 555 560 Phe Phe Leu Lys Cys Arg Leu Gln Glu Gln Glu Ile Gln Arg Arg Pro 565 570 575 Ser Val Phe Tyr Ala Cys Met Cys Asn Pro Trp Val Ser Leu Leu Gly 580 585 590 Ala Leu Ala Ser Leu Leu Ile Met Phe Val Ile Gln Trp Leu Tyr Thr 595 600 605 Leu Ala Ser Met Gly Val Ala Ala Leu Val Tyr Phe Tyr Ile Gly Gln 610 615 620 Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Leu Gly Ser Ala Ser Asn Phe Ser Phe Phe 625 630 635 640 Gln Trp Met Lys Ser Phe Leu Val Pro Ser Cys Arg Ser Leu Arg Ser 645 650 655 Ala Gln Glu Gln Ile Ile Leu Ala Pro Ser Pro Ala Lys Val Asp Met 660 665 670 Ala Met Thr Gln Leu Thr Gln Asp Asn Ala Asp Phe Ala Thr Arg Asp 675 680 685 Arg Tyr His His Ser Ser Phe Leu Ser Arg Glu Gln Leu Met Pro Pro 690 695 700 Tyr 705 <210> 13 <211> 667 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Met Ala Gln Arg Ser Pro Gln Glu Leu Phe His Glu Ala Ala Gln Gln 1 5 10 15 Gly Ile Leu Ala Gln Pro Gln Pro Trp Trp Lys Ile Gln Leu Phe Met 20 25 30 Trp Glu Pro Val Leu Phe Gly Thr Trp Asp Gly Val Phe Thr Ser Cys 35 40 45 Met Ile Asn Ile Phe Gly Val Val Leu Phe Leu Arg Thr Gly Trp Leu 50 55 60 Val Gly Asn Thr Gly Val Leu Leu Gly Leu Leu Leu Val Ser Phe Val 65 70 75 80 Val Leu Val Ala Leu Ile Thr Val Leu Ser Gly Ile Gly Val Ala Glu 85 90 95 His Gly Gly Ile Ser Ser Gly Gly Val Tyr Ser Met Ile Ser Ser Val 100 105 110 Leu Gly Gly Gln Met Gly Gly Thr Val Gly Leu Leu Tyr Val Phe Gly 115 120 125 Gln Cys Val Ala Gly Ala Met Tyr Ile Thr Gly Phe Ala Glu Ser Ile 130 135 140 Ser Asp Leu Leu Gly Leu Gly Asp Ile Trp Ala Val Arg Gly Ile Ser 145 150 155 160 Val Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ile Asn Leu Ala Gly Val Lys 165 170 175 Trp Ile Ile Arg Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Val Ser 180 185 190 Thr Leu Asp Phe Val Val Gly Ser Phe Thr His Leu Asp Pro Gly Val 195 200 205 Met Ala Gly Phe Asn Met Gly Gly Asp Leu Arg Asp Pro Ala Asp Ser 210 215 220 Val Pro Leu Gly Ser Leu Ala Ala Val Gly Val Ser Trp Phe Leu Tyr 225 230 235 240 Ile Ile Phe Ala Phe Leu Leu Gly Ala Val Cys Thr Arg Glu Ala Leu 245 250 255 Arg Ser Asp Phe Leu Ile Ala Glu Lys Val Ser Leu Val Gly Phe Leu 260 265 270 Phe Leu Leu Gly Leu Tyr Ile Ser Ser Leu Ala Ser Cys Met Gly Gly 275 280 285 Leu Tyr Gly Ala Pro Arg Ile Leu Gln Cys Ile Ala Gln Asp Lys Val 290 295 300 Ile Pro Ala Leu Ala Phe Leu Ala Asn Gly Lys Gly Pro Asn Lys Thr 305 310 315 320 Pro Val Ala Ala Ile Cys Leu Thr Ser Leu Val Thr Met Ala Phe Val 325 330 335 Leu Val Gly Gln Val Asn Val Leu Ala Pro Val Val Thr Ile Asn Phe 340 345 350 Met Leu Thr Tyr Ile Met Val Asp Tyr Ser Tyr Phe Ala Leu Ser Met 355 360 365 Ala His Cys Gly Leu Ala Pro Ser Pro Glu Pro Val Pro Arg Gln Gly 370 375 380 Pro Asp Thr Leu His Cys Ser Glu His Leu Leu Gln Asp Arg Ala Pro 385 390 395 400 Ser Tyr Gly Ser Asp Val Pro Ala Arg Ser Leu Ser Glu Gly Thr Leu 405 410 415 Leu Glu Phe Thr Lys Asp Met Asp Gln Phe Leu Gln Pro Ile Glu Glu 420 425 430 Leu Glu Ser Arg Gln Leu Gly Ser Arg Glu Gly Asn Asn Pro Lys Asn 435 440 445 Gln Lys Arg Lys Gly Lys Lys Gly Ala Lys Gln Thr Leu Gln Asp Ser 450 455 460 Phe Leu Leu Asp Pro Gly Ser Pro Leu Ser Phe Pro Thr Arg Thr Ser 465 470 475 480 Glu Arg Leu Ser Val Ala Phe Cys Gly Glu Gln Glu Ser Tyr Gln Lys 485 490 495 Gln Gln Thr Ser Arg Ser Glu Ser His Asp His Leu Val Pro Asp Leu 500 505 510 Arg Asn Gln Pro Arg Val Asn Arg Glu Asp Phe Phe Leu Lys Cys Arg 515 520 525 Leu Gln Glu Gln Glu Ile Gln Arg Arg Pro Ser Val Phe Tyr Ala Cys 530 535 540 Met Cys Asn Pro Trp Val Ser Leu Leu Gly Ala Leu Ala Ser Leu Leu 545 550 555 560 Ile Met Phe Val Ile Gln Trp Leu Tyr Thr Leu Ala Ser Met Gly Val 565 570 575 Ala Ala Leu Val Tyr Phe Tyr Ile Gly Gln Ala Ser Pro Gly Leu Tyr 580 585 590 Leu Gly Ser Ala Ser Asn Phe Ser Phe Phe Gln Trp Met Lys Ser Phe 595 600 605 Leu Val Pro Ser Cys Arg Ser Leu Arg Ser Ala Gln Glu Gln Ile Ile 610 615 620 Leu Ala Pro Ser Pro Ala Lys Val Asp Met Ala Met Thr Gln Leu Thr 625 630 635 640 Gln Asp Asn Ala Asp Phe Ala Thr Arg Asp Arg Tyr His His Ser Ser 645 650 655 Phe Leu Ser Arg Glu Gln Leu Met Pro Pro Tyr 660 665 <210> 14 <211> 592 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Met Ala Gln Arg Ser Pro Gln Glu Leu Phe His Glu Ala Ala Gln Gln 1 5 10 15 Cys Val Ala Gly Ala Met Tyr Ile Thr Gly Phe Ala Glu Ser Ile Ser 20 25 30 Asp Leu Leu Gly Leu Gly Asp Ile Trp Ala Val Arg Gly Ile Ser Val 35 40 45 Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ile Asn Leu Ala Gly Val Lys Trp 50 55 60 Ile Ile Arg Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Val Ser Thr 65 70 75 80 Leu Asp Phe Val Val Gly Ser Phe Thr His Leu Asp Pro Glu His Gly 85 90 95 Phe Ile Gly Tyr Ser Pro Glu Leu Leu Gln Ser Asn Ile Leu Pro Glu 100 105 110 Tyr Ser Pro Gly Glu Ser Phe Phe Thr Val Phe Gly Val Phe Phe Pro 115 120 125 Ala Ala Thr Gly Val Met Ala Gly Phe Asn Met Gly Gly Asp Leu Arg 130 135 140 Asp Pro Ala Asp Ser Val Pro Leu Gly Ser Leu Ala Ala Val Gly Val 145 150 155 160 Ser Trp Phe Leu Tyr Ile Ile Phe Ala Phe Leu Leu Gly Ala Val Cys 165 170 175 Thr Arg Glu Ala Leu Arg Ser Asp Phe Leu Ile Ala Glu Lys Val Ser 180 185 190 Leu Val Gly Phe Leu Phe Leu Leu Gly Leu Tyr Ile Ser Ser Leu Ala 195 200 205 Ser Cys Met Gly Gly Leu Tyr Gly Ala Pro Arg Ile Leu Gln Cys Ile 210 215 220 Ala Gln Asp Lys Val Ile Pro Ala Leu Ala Phe Leu Ala Asn Gly Lys 225 230 235 240 Gly Pro Asn Lys Thr Pro Val Ala Ala Ile Cys Leu Thr Ser Leu Val 245 250 255 Thr Met Ala Phe Val Leu Val Gly Gln Val Asn Val Leu Ala Pro Val 260 265 270 Val Thr Ile Asn Phe Met Leu Thr Tyr Ile Met Val Asp Tyr Ser Tyr 275 280 285 Phe Ala Leu Ser Met Ala His Cys Gly Leu Ala Pro Ser Pro Glu Pro 290 295 300 Val Pro Arg Gln Gly Pro Asp Thr Leu His Cys Ser Glu His Leu Leu 305 310 315 320 Gln Asp Arg Ala Pro Ser Tyr Gly Ser Asp Val Pro Ala Arg Ser Leu 325 330 335 Ser Glu Gly Thr Leu Leu Glu Phe Thr Lys Asp Met Asp Gln Phe Leu 340 345 350 Gln Pro Ile Glu Glu Leu Glu Ser Arg Gln Leu Gly Ser Arg Glu Gly 355 360 365 Asn Asn Pro Lys Asn Gln Lys Arg Lys Gly Lys Lys Gly Ala Lys Gln 370 375 380 Thr Leu Gln Asp Ser Phe Leu Leu Asp Pro Gly Ser Pro Leu Ser Phe 385 390 395 400 Pro Thr Arg Thr Ser Glu Arg Leu Ser Val Ala Phe Cys Gly Glu Gln 405 410 415 Glu Ser Tyr Gln Lys Gln Gln Thr Ser Arg Ser Glu Ser His Asp His 420 425 430 Leu Val Pro Asp Leu Arg Asn Gln Pro Arg Val Asn Arg Glu Asp Phe 435 440 445 Phe Leu Lys Cys Arg Leu Gln Glu Gln Glu Ile Gln Arg Arg Pro Ser 450 455 460 Val Phe Tyr Ala Cys Met Cys Asn Pro Trp Val Ser Leu Leu Gly Ala 465 470 475 480 Leu Ala Ser Leu Leu Ile Met Phe Val Ile Gln Trp Leu Tyr Thr Leu 485 490 495 Ala Ser Met Gly Val Ala Ala Leu Val Tyr Phe Tyr Ile Gly Gln Ala 500 505 510 Ser Pro Gly Leu Tyr Leu Gly Ser Ala Ser Asn Phe Ser Phe Phe Gln 515 520 525 Trp Met Lys Ser Phe Leu Val Pro Ser Cys Arg Ser Leu Arg Ser Ala 530 535 540 Gln Glu Gln Ile Ile Leu Ala Pro Ser Pro Ala Lys Val Asp Met Ala 545 550 555 560 Met Thr Gln Leu Thr Gln Asp Asn Ala Asp Phe Ala Thr Arg Asp Arg 565 570 575 Tyr His His Ser Ser Phe Leu Ser Arg Glu Gln Leu Met Pro Pro Tyr 580 585 590 <210> 15 <211> 714 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Thr Gln Met Ser Gln Val Gln Glu Leu Phe His Glu Ala Ala Gln 1 5 10 15 Gln Asp Ala Leu Ala Gln Pro Gln Pro Trp Trp Lys Thr Gln Leu Phe 20 25 30 Met Trp Glu Pro Val Leu Phe Gly Thr Trp Asp Gly Val Phe Thr Ser 35 40 45 Cys Met Ile Asn Ile Phe Gly Val Val Leu Phe Leu Arg Thr Gly Trp 50 55 60 Leu Val Gly Asn Thr Gly Val Leu Leu Gly Met Phe Leu Val Ser Phe 65 70 75 80 Val Ile Leu Val Ala Leu Val Thr Val Leu Ser Gly Ile Gly Val Gly 85 90 95 Glu Arg Ser Ser Ile Gly Ser Gly Gly Val Tyr Ser Met Ile Ser Ser 100 105 110 Val Leu Gly Gly Gln Thr Gly Gly Thr Ile Gly Leu Leu Tyr Val Phe 115 120 125 Gly Gln Cys Val Ala Gly Ala Met Tyr Ile Thr Gly Phe Ala Glu Ser 130 135 140 Ile Ser Asp Leu Leu Gly Leu Gly Asn Ile Trp Ala Val Arg Gly Ile 145 150 155 160 Ser Val Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ile Asn Leu Ala Gly Val 165 170 175 Lys Trp Ile Ile Arg Leu Gln Leu Leu Leu Leu Phe Leu Leu Ala Val 180 185 190 Ser Thr Leu Asp Phe Val Val Gly Ser Phe Thr His Leu Asp Pro Glu 195 200 205 His Gly Phe Ile Gly Tyr Ser Pro Glu Leu Leu Gln Asn Asn Thr Leu 210 215 220 Pro Asp Tyr Ser Pro Gly Glu Ser Phe Phe Thr Val Phe Gly Val Phe 225 230 235 240 Phe Pro Ala Ala Thr Gly Val Met Ala Gly Phe Asn Met Gly Gly Asp 245 250 255 Leu Arg Glu Pro Ala Ala Ser Ile Pro Leu Gly Ser Leu Ala Ala Val 260 265 270 Gly Ile Ser Trp Phe Leu Tyr Ile Ile Phe Val Phe Leu Leu Gly Ala 275 280 285 Ile Cys Thr Arg Glu Ala Leu Arg Tyr Asp Phe Leu Ile Ala Glu Lys 290 295 300 Val Ser Leu Met Gly Phe Leu Phe Leu Leu Gly Leu Tyr Ile Ser Ser 305 310 315 320 Leu Ala Ser Cys Met Gly Gly Leu Tyr Gly Ala Pro Arg Ile Leu Gln 325 330 335 Cys Ile Ala Gln Glu Lys Val Ile Pro Ala Leu Ala Cys Leu Gly Gln 340 345 350 Gly Lys Gly Pro Asn Lys Thr Pro Val Ala Ala Ile Cys Leu Thr Ser 355 360 365 Leu Val Thr Met Ala Phe Val Phe Val Gly Gln Val Asn Val Leu Ala 370 375 380 Pro Ile Val Thr Ile Asn Phe Met Leu Thr Tyr Val Ala Val Asp Tyr 385 390 395 400 Ser Tyr Phe Ser Leu Ser Met Cys Ser Cys Ser Leu Thr Pro Val Pro 405 410 415 Glu Pro Val Leu Arg Glu Gly Ala Glu Gly Leu His Cys Ser Glu His 420 425 430 Leu Leu Leu Glu Lys Ala Pro Ser Tyr Gly Ser Glu Gly Pro Ala Gln 435 440 445 Arg Val Leu Glu Gly Thr Leu Leu Glu Phe Thr Lys Asp Met Asp Gln 450 455 460 Leu Leu Gln Leu Thr Arg Lys Leu Glu Ser Ser Gln Pro Arg Gln Gly 465 470 475 480 Glu Gly Asn Arg Thr Pro Glu Ser Gln Lys Arg Lys Ser Lys Lys Ala 485 490 495 Thr Lys Gln Thr Leu Gln Asp Ser Phe Leu Leu Asp Leu Lys Ser Pro 500 505 510 Pro Ser Phe Pro Val Glu Ile Ser Asp Arg Leu Pro Ala Ala Ser Trp 515 520 525 Glu Gly Gln Glu Ser Cys Trp Asn Lys Gln Thr Ser Lys Ser Glu Gly 530 535 540 Thr Gln Pro Glu Gly Thr Tyr Gly Glu Gln Leu Val Pro Glu Leu Cys 545 550 555 560 Asn Gln Ser Glu Ser Ser Gly Glu Asp Phe Phe Leu Lys Ser Arg Leu 565 570 575 Gln Glu Gln Asp Val Trp Arg Arg Ser Thr Ser Phe Tyr Thr His Met 580 585 590 Cys Asn Pro Trp Val Ser Leu Leu Gly Ala Val Gly Ser Leu Leu Ile 595 600 605 Met Phe Val Ile Gln Trp Val Tyr Thr Leu Val Asn Met Gly Val Ala 610 615 620 Ala Ile Val Tyr Phe Tyr Ile Gly Arg Ala Ser Pro Gly Leu His Leu 625 630 635 640 Gly Ser Ala Ser Asn Phe Ser Phe Phe Arg Trp Met Arg Ser Leu Leu 645 650 655 Leu Pro Ser Cys Arg Ser Leu Arg Ser Pro Gln Glu Gln Ile Ile Leu 660 665 670 Ala Pro Ser Leu Ala Lys Val Asp Met Glu Met Thr Gln Leu Thr Gln 675 680 685 Glu Asn Ala Asp Phe Ala Thr Arg Asp Arg Tyr His His Ser Ser Leu 690 695 700 Val Asn Arg Glu Gln Leu Met Pro His Tyr 705 710

Claims (91)

  1. 노화 관련 병태를 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에서 노화 관련 병태를 치료하는 방법으로, 상기 방법은 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(NMN)의 치료적 유효량 및, 니코틴산, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트, β-피리딜카비놀, 이노시톨 헥사니코티네이트, 이의 에스테르, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 이의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 추가의 화합물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 노화 관련 병태가 인슐린 감수성의 손실, 인슐린 분비의 손실, 인슐린 작용 및 분비의 손상, 기억 기능의 손실, 눈 기능의 쇠퇴, 망막 퇴행, 기능성 쇠퇴, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 병태를 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 노화 관련 병태가 인슐린 감수성의 손실을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 노화 관련 병태가 인슐린 분비의 손실을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 노화 관련 병태가 인슐린 작용 및 분비의 손실을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 노화 관련 병태가 기억 기능의 손상을 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 노화 관련 병태가 눈 기능의 쇠퇴를 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 노화 관련 병태가 망막 퇴행을 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 노화 관련 병태가 기능성 쇠퇴를 포함하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 기능성 쇠퇴가 식욕 상실, 낮은 글루코오스 수준, 근육 약화, 영양실조, 노화성 식욕부진 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  10. 의료 병태를 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에서 의료 병태를 치료하는 방법으로, 상기 방법은 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(NMN)의 치료적 유효량과, 니코틴산, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트, β-피리딜카비놀, 이노시톨 헥사니코티네이트, 이의 에스테르, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 이의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 화합물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 의료 병태가 근육 질환, 2형 당뇨병, 비만 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 의료 병태가 근육 질환을 포함하는 것인 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 근육 질환이 근육 허약, 근위축, 근육 소모, 근육 강도 감소 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  13. 청구항 10 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근육 질환이 근육감소증(sarcopenia), 운동신경감소증(dynapenia), 악액질(cachexia), 근이영양증(muscular dystrophy), 근긴장성 장애(myotonic disorders), 척추 근육 위축증(spinal muscular atrophies), 근병증(myopathy), 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 근이영양증이 뒤센 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 베커 근이영양증(Becker muscular dystrophy), 선천성 근이영양증, 원위근이영양증(distal muscular dystroph), 에머리-드라이푸스 근이영양증(Emery-Dreifuss muscular dystrophy), 안면견갑상완형근이영양증(facioscapulohumeral muscular dystrophy), 지대근이영양증(limb-girdle muscular dystrophy), 안구인두근이영양증(oculopharyngeal muscular dystrophy), 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 근긴장성 장애가 근긴장성 이영양증, 선천성근강직증, 선천성 이상근긴장증, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근병증이 베들렘 근병증, 선천성 섬유 유형 불균형, 진행성 골화성 섬유이형성증, 갑상선 기능항진근병증, 갑상선 기능저하 근병증, 소형코어(minicore) 근병증, 다중코어(multicore) 근병증, 근관성 근병증, 네말린 근병증, 주기성 근육마비, 저칼륨혈증 근병증, 고칼륨혈증 근병증 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근육 질환이 산 말타아제 결핍, 카르니틴 결핍, 카르니틴 팔미틸 전이효소 결핍, 가지제거(debrancher) 효소 결핍, 락테이트 탈수소효소 결핍, 미토콘드리아 근병증, 근아데닐산탈아미노효소 결핍, 가인산분해효소 결핍, 포스포푸룩토키나제 결핍, 포스포글리세레이트 키나제 결핍 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  18. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근육 질환이 근육감소증, 운동신경감소증, 악액질 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 근육 질환이 근육감소증인 것인 방법.
  20. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 의료 병태가 2형 당뇨병을 포함하는 것인 방법.
  21. 제10항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 의료 병태가 비만을 포함하는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가의 화합물이 니코틴산, 이의 에스테르, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 니코틴산의 에스테르 또는 약제학적으로 허용가능한 염이 하기 구조식(I)의 화합물인 것인 방법:
    Figure pct00010

    여기서 R은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-헥실, n-옥틸, 2-클로로에틸, 2-하이드록시에틸, 3-하이드록시프로필, 2-메톡시에틸, 2-부톡시에틸, 카바모일메틸, l-카바모일에틸, 2-디메틸아미노에틸, 3-아미노프로필, 테트라하이드로푸르푸릴, 벤질, 페녹시에틸, p-클로로페닐 및 p-니트로페닐로 이루어진 군에서 선택된다.
  24. 제23항에 있어서, R은 2-디메틸아미노에틸, p-클로로페닐 및 p-니트로페닐로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 1일 당 상기 적어도 하나의 추가의 화합물 약 50mg 내지 약 500mg이 투여되는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 1일 당 NMN 10 내지 약 500mg이 투여되는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에 NMN 및 상기 적어도 하나의 추가의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물이 투여되는 것인 방법.
  28. NMN의 세포 흡수를 향상시킬 필요가 있는 대상체에서 NMN의 세포 흡수를 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 니코틴산, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트, β-피리딜카비놀, 이노시톨 헥사니코티네이트, 이의 에스테르, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 이의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 화합물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 화합물이 니코틴산, 이의 에스테르, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것인 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 니코틴산의 에스테르 또는 약제학적으로 허용가능한 염이 하기 구조식(I)의 화합물인 것인 방법:
    Figure pct00011

    여기서 R은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-헥실, n-옥틸, 2-클로로에틸, 2-하이드록시에틸, 3-하이드록시프로필, 2-메톡시에틸, 2-부톡시에틸, 카바모일메틸, l-카바모일에틸, 2-디메틸아미노에틸, 3-아미노프로필, 테트라하이드로푸르푸릴, 벤질, 페녹시에틸, p-클로로페닐, 및 p-니트로페닐로 이루어진 군에서 선택된다.
  31. 제30항에 있어서, R은 2-디메틸아미노에틸, p-클로로페닐 및 p-니트로페닐로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 1일 당 상기 화합물 약 50mg 내지 약 500mg이 투여되는 것인 방법.
  33. NAD+ 생산을 자극하고 및/또는 NMN의 세포로의 흡수를 증가시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 NAD+ 생산을 자극하고 및/또는 NMN의 세포로의 흡수를 증가시키는 방법으로, 치료적 유효량의 Slc12a8을 인코딩하는 핵산을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 Slc12a8을 인코딩하는 핵산은 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA를 포함하는 것인 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, Slc12a8을 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계는 Slc12a8을 인코딩하는 유전자 요법 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 요법 벡터가 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 알파바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아 바이러스, 또는 이의 조합물을 포함하는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 유전자 요법 벡터가 레트로바이러스를 포함하고, 상기 레트로바이러스가 렌티바이러스를 포함하는 것인 방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1)과 서열 동일성이 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100%인 서열을 포함하는 것인 방법.
  39. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Slc12a8을 인코딩하는 핵산을 상기 대상체의 위장관에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 Slc12a8을 인코딩하는 핵산을 상기 대상체의 소장에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  41. 제33항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 근육 질환, 2형 당뇨병, 비만, 노화 관련 병태, 또는 이의 조합에 대한 치료를 필요로 하는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 노화 관련 병태가 인슐린 감수성의 손실, 인슐린 분비의 손실, 인슐린 작용 및 분비의 손실, 기억 기능의 손상, 눈 기능의 쇠퇴, 망막 퇴행, 기능성 쇠퇴, 비만 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 노화 관련 병태가 노화와 관련된 비만을 포함하는 것인 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상기 대상체가 포유동물인 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 마우스 또는 랫트인 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 인간의 연령이 적어도 30세, 적어도 40세, 적어도 50세, 적어도 60세, 또는 적어도 70세인 것인 방법.
  48. Slc12a8을 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 요법 벡터.
  49. 제48항에 있어서, 상기 Slc12a8을 인코딩하는 핵산이 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA를 포함하는 것인 유전자 요법 벡터.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 상기 벡터가 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 알파바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아 바이러스, 또는 이의 조합물인 것인 유전자 요법 벡터.
  51. 제50항에 있어서, 상기 유전자 요법 벡터가 레트로바이러스를 포함하고, 상기 레트로바이러스가 렌티바이러스를 포함하는 것인 유전자 요법 벡터.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Slc12a8을 인코딩하는 cDNA는 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1)과 서열 동일성이 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100%인 서열을 포함하는 것인 유전자 요법 벡터.
  53. Slc12a8 유전자에 불활성 돌연변이를 포함하는 비-인간 동물.
  54. 제53항에 있어서, 상기 비-인간 동물이 마우스 또는 랫트인 비-인간 동물.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 Slc12a8 유전자 중 불활성 돌연변이가 상기 Slc12a8 유전자 중 결손, 상기 Slc12a8 유전자 중 삽입, 또는 이의 조합을 포함하는 것인 비-인간 동물.
  56. 제55항에 있어서, 상기 Slc12a8 유전자 중 상기 불활성 돌연변이가 Slc12a8 유전자 중 결손을 포함하는 것인 비-인간 동물.
  57. 제56항에 있어서, 상기 결손이 상기 Slc12a8 유전자 또는 이의 부분의 엑손 4의 결손을 포함하는 것인 비-인간 동물.
  58. 제57항에 있어서, 상기 결손이 엑손 4의 결손을 포함하는 것인 비-인간 동물.
  59. Slc12a8 단백질을 인코딩하는 cDNA를 포함하는 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주로서, 상기 cDNA가 하기를 포함하는 것인 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주:
    (a) 서열번호: 12(마우스 Slc12a8 단백질), 서열번호: 13(마우스 Scl12a8 변이체 단백질), 서열번호: 14(마우스 Scl12a8 변이체 B 단백질), 또는 서열번호: 15(인간 Slc12a8 단백질)를 인코딩하는 cDNA;
    (b) 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 또는 서열번호: 15와 동일성이 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 단백질을 인코딩하는 cDNA; 또는
    (c) 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1) 또는 Slc12a8 인간 전장 cDNA(서열번호: 11)와 서열 동일성이 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100%인 cDNA 서열.
  60. 제59항에 있어서, 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주가 태반-유래 세포를 포함하지 않는 것인 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주.
  61. Slc12a8 단백질을 인코딩하는 cDNA를 포함하는 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주로서, 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주가 태반-유래 세포를 포함하지 않는 것인 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주.
  62. 제61항에 있어서, 상기 cDNA가 마우스 Slc12a8 단백질 또는 이의 변이체, 또는 인간 Slc12a8 단백질 또는 이의 변이체를 인코딩하는 것인 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주.
  63. 제59항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 cDNA가 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 또는 서열번호 15를 인코딩하는 cDNA를 포함하는 것인 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주.
  64. 제59항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하는 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주.
  65. 제59항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Slc12a8 단백질이 발현이, 상기 cDNA를 포함하지 않는 동일한 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주에서의 Slc12a8 단백질의 발현과 비교할 때, 증가되는 것인 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주.
  66. 제59항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주는 검출가능한 CD73 활성이 없거나, 검출가능한 CD38 활성이 없거나, 또는 검출가능한 CD73 활성 및 검출가능한 CD38 활성 둘 다가 없는 것인 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주.
  67. 제59항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주가 증가된 NMN 흡수를 나타내는 것인 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주.
  68. 제59항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 섬유모세포, 창자 세포, 췌장 세포, 간세포, 지방세포, 뉴런, 또는 신경교 세포를 포함하거나, 또는 상기 포유동물 세포주가 섬유모세포, 창자 세포, 췌장 세포, 간세포, 지방세포, 뉴런, 또는 신경교세포를 포함하는 것인 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주.
  69. 제59항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 NIH 3T3 세포이거나 또는 상기 포유동물 세포주가 NIH 3T3 세포주인 것인 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주.
  70. 제59항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주가 상기 cDNA 서열로 안정적으로 형질변환(transformed)된 것인 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주.
  71. 제59항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주가 상기 cDNA 서열로 일시적으로 형질감염된 것인 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주.
  72. 제59항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 cDNA 서열이 유전자은행 참조 서열: NM_134251(서열번호: 1)과 서열 동일성이 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100%인 것인 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주.
  73. 청구항 59 내지 72 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 마우스 또는 랫트 세포이거나, 또는 상기 포유동물 세포주가 마우스 세포주 또는 랫트 세포주인 것인 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주.
  74. 청구항 59 내지 72 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포이 인간 세포이거나, 또는 상기 포유동물 세포주가 인간 세포주인 것인 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주.
  75. NMN 수송을 촉진하는 화합물을 식별하기 위해 후보 화합물을 스크리닝하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    (a) 상기 후보 화합물을 NMN 수송체 단백질을 또는, NMN 수송체 단백질을 포함하는 프로테오리포좀을 발현하는 세포와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 세포에서 NMN 수송체 단백질의 발현 또는 활성의 변화, 또는 상기 프로테오리포좀에서 NMN 수송체 단백질의 활성의 변화를 감지하는 단계;
    여기서 상기 후보 화합물과의 접촉 후, 상기 세포에서 NMN 수송체 단백질의 발현 또는 활성의 변화, 또는 상기 프로테오리포좀에서 NMN 수송체 단백질의 활성의 변화는 상기 후보 화합물이 NMN의 수송을 조절(modulate)함을 나타냄.
  76. 제75항에 있어서, 상기 NMN 수송체 단백질이 Slc12a8 단백질을 포함하는 것인 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 Slc12a8 단백질이 서열번호: 12(마우스 Slc12a8 단백질), 서열번호: 13(마우스 Scl12a8 변이체 단백질), 서열번호: 14(마우스 Scl12a8 변이체 B 단백질), 또는 서열번호: 15(인간 Slc12a8 단백질)와 서열 동일성이 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  78. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 상기 후보 화합물과의 접촉 후, 상기 NMN 수송체 단백질을 발현하는 상기 세포에서 상기 NMN 수송체 단백질의 발현 또는 활성;과
    (ii) ) 상기 후보 화합물과의 접촉 후 상기 NMN 수송체 단백질을 발현하지 않는 세포 또는 상기 NMN 단백질의 발현 또는 활성이 억제된 세포에서 NMN 수송체 단백질의 발현 또는 활성;세포에서 NMN 수송체 단백질의 발현 또는 활성을 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 NMN 수송체 단백질을 발현하지 않는 상기 세포가 Slc12a8 녹아웃 동물에서 유래된 세포를 포함하는 것인 방법.
  80. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 상기 후보 화합물과 접촉 후, 상기 NMN 수송체 단백질을 포함하는 프로테오리포좀에서 상기 NMN 수송체 단백질의 활성; 과
    (ii) 상기 후보 화합물과 접촉 후, NMN 수송체 단백질을 포함하지 않는 프로테오리포좀 또는 NMN 수송체의 활성이 억제된 프로테오리포좀에서 상기 NMN 수송체 단백질의 활성;을 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 NMN 수송체 단백질을 포함하지 않는 상기 프로테오리포좀이 Slc12a8 녹아웃 동물의 세포에서 유래된 프로테오리포좀을 포함하는 것인 방법.
  82. 제75항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 포유동물 섬유모세포, 창자 세포, 췌장 세포, 간 세포, 지방질 세포, 뉴런, 또는 신경교 세포를 포함하거나, 또는 상기 프로테오리포좀이 포유동물 섬유모세포, 창자 세포, 췌장 세포, 간 세포, 지방질 세포, 뉴런, 또는 신경교 세포에서 유래된 프로테오리포좀을 포함하는 것인 방법.
  83. 제75항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 청구항 제59항 내지 제74항 중 어느 한 항의 포유동물 세포를 포함하거나, 또는 상기 프로테오리포좀이 제59항 내지 제74항 중 어느 한 항의 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주에서 유래된 프로테오리포좀을 포함하는 것인 방법.
  84. 제75항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테오리포좀이 Slc12a8 cDNA를 포함하는 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주에서 유래된 프로테오리포좀을 포함하는 것인 방법.
  85. NMN과, NMN 수송체의 효능제를 포함하는 약제학적 조성물.
  86. 제85항에 있어서, NMN 수송체의 상기 효능제가 니코틴산, 니세리트롤, 토코페롤 니코티네이트, β-피리딜카비놀, 이노시톨 헥사니코티네이트, 이의 에스테르, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 이의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 화합물을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  87. 제85항 또는 제86항에 있어서, 상기 NMN 수송체가 니코틴산, 이의 에스테르, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  88. 제87항에 있어서, 상기 니코틴산의 에스테르 또는 약제학적으로 허용가능한 염이 구조식 (I)의 화합물인 것인 약제학적 조성물:
    Figure pct00012

    여기서 R은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-헥실, n-옥틸, 2-클로로에틸, 2-하이드록시에틸, 3-하이드록시프로필, 2-메톡시에틸, 2-부톡시에틸, 카바모일메틸, l-카바모일에틸, 2-디메틸아미노에틸, 3-아미노프로필, 테트라하이드로푸르푸릴, 벤질, 페녹시에틸, p-클로로페닐, 및 p-니트로페닐로 이루어진 군에서 선택되는 것인 약제학적 조성물.
  89. 제88항에 있어서, R이 2-디메틸아미노에틸, p-클로로페닐 및 p-니트로페닐로 이루어진 군에서 선택되는 것인 약제학적 조성물.
  90. 제85항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NMN 수송체가 Slc12a8 폴리펩타이드 또는 이의 동족체인 것인 약제학적 조성물.
  91. NMN 및 Slc12a8 또는 이의 동족체의 유전자 발현의 유발제를 포함하는 약제학적 조성물.
KR1020207005922A 2017-08-10 2018-08-10 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드를 사용한 조성물 및 치료 방법 KR20200041330A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762543856P 2017-08-10 2017-08-10
US62/543,856 2017-08-10
US201862653348P 2018-04-05 2018-04-05
US62/653,348 2018-04-05
PCT/US2018/046233 WO2019032973A1 (en) 2017-08-10 2018-08-10 COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT USING NICOTINAMIDE MONONUCLEOTIDE

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200041330A true KR20200041330A (ko) 2020-04-21

Family

ID=65272822

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207005922A KR20200041330A (ko) 2017-08-10 2018-08-10 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드를 사용한 조성물 및 치료 방법

Country Status (8)

Country Link
US (2) US11564936B2 (ko)
EP (1) EP3664813A4 (ko)
JP (2) JP2020530460A (ko)
KR (1) KR20200041330A (ko)
CN (1) CN110996967A (ko)
CA (1) CA3071423A1 (ko)
TW (1) TW201919647A (ko)
WO (1) WO2019032973A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112156105A (zh) * 2020-10-15 2021-01-01 天津科技大学 一种抑制剂联合小干扰rna抑制结肠癌细胞活性的新方法
CN113577091B (zh) * 2021-08-30 2023-10-13 厦门金达威集团股份有限公司 抗衰老药物组合及其用途
CN114480461B (zh) * 2022-02-21 2023-03-10 苏州华赛生物工程技术有限公司 生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物及构建方法和应用
CN114470213A (zh) * 2022-03-29 2022-05-13 重庆医科大学 Nampt抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗组织缺血再灌注损伤中的药物中的应用
CN116042724A (zh) * 2022-12-28 2023-05-02 天津科技大学 一种通过干扰Slc12a8导致NAD+/NADH水平降低建立衰老细胞模型

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2519241A1 (en) * 2003-04-01 2004-11-11 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2004094636A1 (en) 2003-04-24 2004-11-04 Galapagos Genomics N.V. Effective sirna knock-down constructs
JP2007516693A (ja) 2003-06-09 2007-06-28 ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミシガン 癌の治療および診断のための組成物および方法
CN1964627B (zh) 2004-06-04 2011-10-19 华盛顿大学 治疗神经病变的方法和组合物
AU2005299672A1 (en) 2004-10-22 2006-05-04 Benitec, Inc. Therapeutic RNAi agents for treating psoriasis
US20080318234A1 (en) 2007-04-16 2008-12-25 Xinhao Wang Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
JP6297769B2 (ja) 2009-02-02 2018-03-20 クロモセル コーポレーション 新規の細胞株および方法
WO2011014721A2 (en) * 2009-07-30 2011-02-03 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Genetically modified rat models for pharmacokinetics
WO2012119986A1 (en) * 2011-03-09 2012-09-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Modulators of slc22a7
AU2012262273B2 (en) 2011-06-01 2017-09-14 Celularity Inc. Treatment of pain using placental stem cells
WO2014059034A2 (en) * 2012-10-09 2014-04-17 President And Fellows Of Harvard College Nad biosynthesis and precursors for the treatment and prevention of cancer and proliferation
PL2968306T3 (pl) * 2013-03-15 2024-01-29 Washington University Podawanie mononukleotydu nikotynamidu do leczenia zespołu suchego oka
SG11201802933YA (en) 2015-10-07 2018-05-30 Joel Huizenga Resetting biological pathways for defending against and repairing deterioration from human aging
WO2017070647A1 (en) * 2015-10-23 2017-04-27 The Jackson Laboratory Nicotinamide for use in the treatment and prevention of ocular neurodegenerative disorder (e.g. glaucoma)

Also Published As

Publication number Publication date
EP3664813A4 (en) 2021-08-11
TW201919647A (zh) 2019-06-01
US11564936B2 (en) 2023-01-31
US20200215087A1 (en) 2020-07-09
WO2019032973A1 (en) 2019-02-14
US20230338407A1 (en) 2023-10-26
CN110996967A (zh) 2020-04-10
JP2020530460A (ja) 2020-10-22
CA3071423A1 (en) 2019-02-14
EP3664813A1 (en) 2020-06-17
JP2023139082A (ja) 2023-10-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20200041330A (ko) 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드를 사용한 조성물 및 치료 방법
Kummer et al. The epithelial cholinergic system of the airways
Stachowiak et al. Integrative nuclear FGFR1 signaling (INFS) as a part of a universal “feed‐forward‐and‐gate” signaling module that controls cell growth and differentiation
Han et al. Brain region specific actions of regulator of G protein signaling 4 oppose morphine reward and dependence but promote analgesia
Zhang et al. NRG1-Fc improves metabolic health via dual hepatic and central action
Fang et al. Methionine restriction promotes cGAS activation and chromatin untethering through demethylation to enhance antitumor immunity
AU2015370463B2 (en) Novel PI3K gamma inhibitor peptide for treatment of respiratory system diseases
US20100105625A1 (en) Product and Methods for Diagnosis and Therapy for Cardiac and Skeletal Muscle Disorders
Vazquez‐Martinez et al. Rab18 inhibits secretory activity in neuroendocrine cells by interacting with secretory granules
KR20220124196A (ko) 사이클릭 펩티드 수용체 란티오닌 신테타제 c-유사 단백질 (lancl) 및 이의 용도
EP2949664A1 (en) Mg53 mutant and mutation method and use thereof
Wu et al. Targeting a dominant negative rho kinase to neurons promotes axonal outgrowth and partial functional recovery after rat rubrospinal tract lesion
US9988626B2 (en) Neurocalcin delta inhibitors and therapeutic and non-therapeutic uses thereof
US9730985B2 (en) Method for reducing blood glucose
Tsuji et al. Hypomorphic mutation in mouse Nppc gene causes retarded bone growth due to impaired endochondral ossification
US20210275639A1 (en) Compositions for the treatment of sarcopenia or disuse atrophy
US20210267939A1 (en) Compositions and methods for treating nafld/nash and related disease phenotypes
Salek et al. Spinophilin‐dependent regulation of GluN2B‐containing NMDAR‐dependent calcium influx, GluN2B surface expression, and cleaved caspase expression
Mascarello et al. Structural study of skeletal muscle fibres in healthy and pseudomyotonia affected cattle
Bahraoui et al. PLOD2, a key factor for MRL MSC metabolism and chondroprotective properties
Campbell Protein Regulators of Lipid and Energy Metabolism
Kinney μ-Crystallin: A Novel Protein Regulator of Mammalian Metabolism
Yuan et al. α-ketoglutaric acid stimulates muscle hypertrophy and fat loss through OXGR1-dependent adrenal activation
Pan et al. The Kv2. 2 channel mediates the inhibition of Prostaglandin E2 on glucose-stimulated insulin secretion in pancreatic β/-cells
Buonarati Postsynaptic Ion Channel Regulation: Downstream Targets of β 2 AR Signaling

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application