CN1964627B - 治疗神经病变的方法和组合物 - Google Patents

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CN1964627B CN 200580018114 CN200580018114A CN1964627B CN 1964627 B CN1964627 B CN 1964627B CN 200580018114 CN200580018114 CN 200580018114 CN 200580018114 A CN200580018114 A CN 200580018114A CN 1964627 B CN1964627 B CN 1964627B
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J·米尔布兰特
佐佐木洋
荒木敏之
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Abstract

本发明公开了在哺乳动物中治疗或预防在神经病变性疾病中的轴突降解的方法。所述方法可包括给哺乳动物施用有效量的通过增加患病和/或受损的神经元中的sirtuin活性而发挥作用的药剂。所述方法还可包括给哺乳动物施用有效量的通过增加患病和/或受损的神经元中的NAD活性而发挥作用的药剂。本发明还公开了筛选用于治疗神经病变的药剂的方法以及用于治疗或预防神经病变的重组载体。

Description

治疗神经病变的方法和组合物

[0001] 政府利益

[0002] 该工作至少部分地得到了来自联邦政府的基金(U. S. P. H. S. 5R01NS40745)的支持。美国政府可以享有本发明中的某些权利。

[0003] 相关申请数据

[0004] 本申请根据35 U. S. C. § 119(e)要求保护2004年6月4日提交的美国临时申请系列号60/577,233和2005年1月4日提交的美国临时申请系列号60/641,330的权益。这些申请在此以其整体引用作为参考。

发明领域

[0005] 本发明总的来说涉及牵涉神经元的疾病和病状,更特别地涉及用于治疗或预防神经病变和其他牵涉神经变性的疾病和病状的方法和组合物。还包括鉴定用于治疗或预防神经病变的药剂(agent)的方法。

[0006] 发明背景

[0007] 轴突变性在多种神经变性疾病例如帕金森病和阿尔茨海默病中以及在神经元的创伤性、毒性或局部缺血性损伤时出现。这样的疾病和病状与包括轴突功能障碍在内的轴突病变(axonopathy)相关。轴突病变的一个实例是沃勒变性(Waller,Philos Trans R. soc. Lond. 140 :423-429,1850),其在轴突的远端部分被从细胞体上切断时发生。切断的轴突迅速地趋向变性。因此,轴突病变可以是神经病变性疾病和病状的关键特征,和轴突缺陷可能是患者残疾的重要成因。

[0008] 发明概述

[0009] 因此,本发明者成功地发现,轴突变性可以通过增加患病和/或受损的神经元中的NAD活性而得到减少或预防。据信,增加的NAD活性可以增加sirtuin活性,后者然后产生受损的神经元细胞的轴突变性的降低。因而,预防轴突变性的一个方法可以是通过在受损的哺乳动物轴突中活化sirtuin分子即SIRT1。SIRTl的活化可以通过对SIRTl分子的直接作用或通过增加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的供应,所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸是SIRTl的组蛋白/蛋白质脱乙酰酶活性的底物。SIRTl的活化导致轴突变性严重程度的减少或防止轴突变性。还据信,NAD活性的增加可能能够通过不牵涉sirtuin的其他机制起作用。因此,增加NAD活性可以减少或预防受损的哺乳动物轴突中的轴突变性,所述增加 NAD活性可能通过增加SIRTl活性或者通过一种或多种其他机制或者两者起作用。

[0010] 因此,在多种实施方案中,本发明旨在在有此需要的哺乳动物特别是人中治疗或预防神经病变的方法。该方法可包括施用有效量的药剂,其可增加患病和/或受损的神经元中的Sirtuin活性,特别是SIRTl活性。

[0011] 在多种实施方案中,所述药剂可通过增加NAD活性来增加SIRTl活性。据信,增加 NAD活性可以增加sirtuin活性,因为NAD可作为SIRTl的底物。这样的药剂可包括NAD或 NADH、NAD的前体、NAD补救途径中的中间体或者产生NAD的物质例如烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶(NMNAT)或编码烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的核酸。烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶可以为NMNATl蛋白。

[0012] 在多种实施方案中,所述药剂也可以直接增加SIRTl活性,同样地,所述药剂可以是sirtuin多肽或编码sirtuin多肽的核酸或诸如芪、查儿酮、黄酮、异黄烷酮、黄烷酮或儿茶素的物质。这样的化合物可包括选自白藜芦醇、piceatarmol、脱氧土大黄苷、反式芪和土大黄苷的芪;选自紫铆因、isoliquiritigen和3,4,2',4',6'-五羟基查儿酮的查儿酮; 选自黄颜木素、5,7,3',4',5'-五羟基黄酮、木犀草素、3,6,3',4'-四羟基黄酮、栎精、7,3',4',5'-四羟基黄酮、山奈黄素、6-羟基芹黄素、芹黄素、3,6,2',4'-四羟基黄酮、7,4' - 二羟基黄酮、7,8,3',4'-四羟基黄酮、3,6,2',3'-四羟基黄酮、4'-羟基黄酮、5,4' - 二羟基黄酮、5,7_ 二羟基黄酮、桑色素、黄酮和5-羟基黄酮的黄酮;选自大豆黄素和染料木黄酮的异黄酮;选自柚苷配基、3,5,7,3' ,4'-五羟基黄烷酮和黄烷酮的黄烷酮;或者选自(-)_表儿茶素、(-)_儿茶素、(-)_儿茶素、(-)_没食子儿茶素、(+)_儿茶素和(+)_表儿茶素的儿茶素。

[0013] 在多种实施方案中,本发明还涉及通过向哺乳动物特别是人施用有效量的药剂来治疗神经病变的方法,所述药剂通过增加患病和/或受损的神经元和/或支持细胞例如神经胶质细胞、肌肉细胞、成纤维细胞等中的核NAD活性而起作用。

[0014] 这样的药剂可以为NAD或NADH、烟酰胺单核苷酸、烟酸单核苷酸或烟酰胺核糖核苷或其衍生物;或者产生NAD的酶例如烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶,或编码产生NAD的酶的核酸例如编码烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的核酸;或者增加编码NAD产生途径中的酶的核酸表达的药剂,或增加NAD产生途径中的酶的活性和/或稳定性的药剂,或增加NAD活性的药剂。烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶可以为NMNATl蛋白。

[0015] 在多种实施方案中,本发明还涉及在有此需要的哺乳动物中治疗或预防视神经病变的方法。该方法可包括向哺乳动物施用有效量的药剂,其通过增加患病和/或受损的神经元中的NAD活性而起作用。向哺乳动物施用可以包括向眼施用,特别是通过用持续释放递送系统施用药剂,或通过施用包含给予眼的药剂的持续释放小丸。

[0016] 所述药剂可以为NAD或NADH、烟酰胺单核苷酸、烟酸单核苷酸或烟酰胺核糖核苷; 或者产生NAD的酶例如烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶;或者编码产生NAD的酶的核酸例如编码烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的核酸;或者增加NAD活性的药剂。烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶可以为NMNATl蛋白或NMNAT3蛋白。

[0017] 在本发明方法的多种实施方案中,与轴突降解相关的神经病变可以为许多神经病变中的一种,例如那些遗传的或先天的或与帕金森病、阿尔茨海默病、疱疹感染、糖尿病、肌萎缩性侧索硬化症、脱髓鞘病、局部缺血或中风、化学损伤、热损伤、AIDS等相关的神经病变。另外,上面未提及的神经变性疾病以及一亚类的上述疾病可以用本发明的方法治疗。这样的亚类的疾病可包括帕金森病或非帕金森病、阿尔茨海默病或非阿尔茨海默病等等。

[0018] 在多种实施方案中,本发明还旨在筛选用于在哺乳动物中治疗神经病变的药剂的方法。该方法可包括,在体外或体内给神经元细胞施用候选药剂,给所述神经元细胞造成轴突损伤,和检测受损的神经元细胞的轴突变性的减少。在多种实施方案中,该方法可包括检测在细胞中,特别是在神经元细胞中由候选药剂产生的NAD活性的增加。NAD活性的增加可以是核NAD活性的增加。

[0019] 还提供了用于筛选增加神经元中的sirtuin活性的药剂的方法,以及用于筛选增加神经元中的NAD生物合成活性的药剂的方法。该方法可包括,在体外或体内给哺乳动物神经元细胞施用候选药剂,给所述神经元细胞造成轴突损伤,和检测受损的神经元细胞的轴突变性的减少。在一些实施方案中,这样的方法可以是初步的筛选方法,其中第二次测定法进一步将活性描绘为与sirtuin活性或者与NAD和NAD生物合成或补救途径的酶或组分相关。

[0020] 在本发明的筛选方法的多种实施方案中,轴突损伤可以由大量的方法来产生,包括化学损伤神经元细胞、热损伤神经元细胞、使神经元细胞缺氧和物理损伤神经元细胞。

[0021] 在多种实施方案中还提供了重组载体。所述载体可以包含与编码哺乳动物NMNATl 蛋白或NMNAT3蛋白的序列有效连接的启动子。在这样的实施方案的多种方面,重组载体可以是慢病毒或腺伴随病毒。

[0022] 在多种实施方案中还提供了包含与编码SIRTl蛋白的序列有效连接的启动子的重组载体。在这样的实施方案的多种方面,重组载体可以是慢病毒或腺伴随病毒。

[0023] 附图简述

[0024] 图1图解说明了 Wlds融合蛋白的NMNATl活性产生了受损神经元的延迟的变性, 其显示:

[0025] A)表达Wlds蛋白或EGFP的被慢病毒感染的背根神经节(DRG)神经元外植体培养物中的体外沃勒变性,其中显示了在横断(transection)之前以及横断之后12、24、48和72 小时的微管蛋白β III-免疫反应性神经突(比例尺=1mm,和“*”标明了在去除之前细胞体的位置);和

[0026] B)被慢病毒感染的DRG神经元中的体外沃勒变性,所述DRG神经元仅表达EGFP、 Wlds蛋白、与EGFP融合的Wlds蛋白的Ufd2a部分(70个残基)(Ufd2a(1-70)-EGFP)、具有 C-末端核定位信号的Ufd2a(l-70)-EGFP、与EGFP融合的Wlds蛋白的NMNATl部分、显性失活的Ufd2a(Ufd2a(P1140A))、或Ufd2a siRNA构建体,其中显示了使用每个构建体在所示时间点上神经突的代表性图像和剩余的神经突数目的定量分析数据(相对于横断前的剩余神经突的百分数士S. D.)(底部左侧),和“*”表明用经EGFP感染的神经元具有显著差异 (P < 0. 0001);还显示了用于确认转基因表达的横断前的EGFP信号(底部右侧;比例尺= 50 μ m),和用于确认通过慢病毒基因转移而得到的蛋白质表达和Ufd2a蛋白的siRNA下调的免疫印迹分析(底部右图)。

[0027] 图2图解说明了增加的NAD供应保护轴突免于损伤后的变性,其显示:

[0028] A)使用烟酰胺单核苷酸作为底物就NAD产生检测了野生型和突变型Wlds和 NMNATl蛋白的酶活性,其中裂解物从表达所示蛋白质的HEK293细胞中制备,和将在1小时内产生的NAD的数量转化成NADH,通过荧光强度进行定量,并标准化至总蛋白质浓度,显示出两种突变体均基本上不具有酶活性;和

[0029] B)被慢病毒感染的DRG神经元中的体外沃勒变性,所述DRG神经元表达NMNATl或 Wlds蛋白、这些蛋白质的缺乏NAD-合成活性的突变体NMNATl (W170A)和Wlds(W258A)、或 EGFP,其中条形图显示了对于每个构建体在所示时间点上剩余的神经突数目的定量分析数据(相对于横断前的剩余神经突的百分数士 S. D.),和“*”表明用经EGFP感染的神经元具有显著差异(P < 0. 0001);

[0030] C)使用针对6XHis标签的抗体通过免疫印迹分析的在被慢病毒感染的细胞中的蛋白质表达;和

[0031] D)用0. 5 μ M长春花新碱培养的表达NMNATl或EGFP (对照)的DRG神经元外植体,其中显示了在所示的添加长春花新碱之后的时间点上神经突的代表性图像(相差;小条=1mm),和以由神经突所覆盖的面积相对于治疗前由神经突所覆盖的面积,将在所示时间点上的保护效果的定量进行作图。

[0032] 图3图解说明了轴突保护要求在损伤之前用NAD预处理神经元,其显示:

[0033] A)使用DRG外植体的体外沃勒变性,所述DRG外植体于在轴突横断之前M小时加入的各种浓度的NAD存在的情况下进行培养;和

[0034] B)在横断之前将DRG外植体与ImM NAD预温育4、8、12J4或48小时,其中条形图显示了在每个所示时间点上在每个实验中的剩余神经突数目(相对于横断前的剩余神经突的百分数士S. D.),和“*”表明与对照相比的显著的轴突保护(ρ < 0. 0001)。

[0035] 图4图解说明了 NAD依赖性轴突保护由SIRTl的活化而介导,其显示:

[0036] A)使用DRG外植体培养物的体外沃勒变性,所述DRG外植体培养物单独用NAD预温育(对照),或在100 μ M Sirtinol (Sir2抑制剂)或2OmM 3-氨基苯甲酰亚胺(3AB,PARP 抑制剂)存在的情况下用NAD预温育;

[0037] B)使用DRG外植体培养物的体外沃勒变性,所述DRG外植体培养物用白藜芦醇 (10,50或100 μ Μ)预温育;和

[0038] C) :使用DRG外植体培养物的体外沃勒变性,所述DRG外植体培养物被表达特异于SIRT家族(SIRT1-7)的每一个成员的siRNA的慢病毒所感染,其中条形图显示了在每种条件下在所示时间点上的剩余神经突数目的定量分析(相对于横断前的剩余神经突的百分数士S. D.),和“*”表明与对照显著不同的点(< 0.0001);

[0039] 中间的表:在被感染的ΝΙΗ3Τ3细胞中用qRT_PCR测得的每种SIRT siRNA的有效性(表示为野生型mRNA水平的% );和

[0040] 右侧:使用针对SIRTl的抗体的免疫印迹,显示出SIRTl的表达在存在有效地阻断 NAD依赖性轴突保护的SIRTl siRNA的情况下减少。

[0041] 图5图解说明了哺乳动物NAD生物合成途径,其中基于来自酵母和低级真核生物的酶表达分析和研究图解说明了预测的哺乳动物NAD生物合成(所用的缩写:QPRT,喹啉酸磷酸核糖转移酶;NaPRT,烟酸磷酸核糖转移酶;NmPRT,烟酰胺磷酸核糖转移酶;Nrk,烟酰胺核糖核苷激酶;NMNAT,烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶;QNS,NAD合成酶)。

[0042] 图6图解说明了在哺乳动物中的NAD生物合成相关酶的表达分析,其显示:(A)通过qRT-PCR测定了在大鼠DRG中在神经横断之后1、3、7和14天后的NAD生物合成相关酶的mRNA水平,其中将表达水平标准化至在每个样品中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶表达并标明是相对于未施行轴突切断术的DRG中的表达水平;(B)通过将DRG在1或0. 1 μ M鱼藤酮中温育所示的时间而引起的神经突变性,和如本文中所述通过qRT-PCR测定NAD合成相关酶的mRNA水平。

[0043] 图7图解说明了 NMNAT酶的亚细胞定位和其保护轴突的能力,其显示:(A)使用被慢病毒感染的DRG神经元外植体培养物的体外沃勒变性测定法,所述DRG神经元外植体培养物表达NMNAT1、cytNMNATl、NMNAT3或nucNMNAT3,其中显示了在横断之后12和 72 小时获取的代表性图像;(B)NMNATl、cytNMNATl、NMNAT3 或 nucNMNAT3 在 HEK 293T 细胞中的亚细胞定位,其采用了使用抗6xHis标签的抗体的免疫组织化学以检测每种蛋白质,和用核标记染料(双苯甲酰亚胺(bisbenzimide))对细胞进行染色以便通过比较来确定每种蛋白质的相对于细胞质定位的细胞核定位(比例尺=25 μ m) ; (C)野生型和突变型 NMNATl 和 NMNAT3 的酶活性,其中从表达 NMNAT1、cytNMNATl、NMNAT3、nucNMNAT3 的 HEK293T细胞的裂解物中纯化出具有6xHis标签的每种蛋白质,其中将在37度于1小时后产生的NAD的数量转化为NADH,进行定量并标准化至蛋白质浓度;(D)通过被每种病毒感染的HEK 293T细胞的免疫印迹分析来确认由慢病毒基因转移所引起的NMNATl、cytNMNATl、 NMNAT3和nucNMNAT3的蛋白质表达;和(E)使用被慢病毒感染的DRG神经元外植体培养物的体外沃勒变性测定法,所述DRG神经元外植体培养物表达NMNATl、cytNMNATl、NMNAT3或 nucNMNAT3,其中显示了在轴突切断术(axotomy)之后12、24、48和72小时的剩余神经突数目的定量分析数据。

[0044] 图8图解说明了 NAD生物合成底物的外源性施加和它们保护轴突的能力,其显示了 :㈧在外源性施加NAD、NmR之后使用DRG神经元外植体培养物的体外沃勒变性,在横断之后12、24、48和72小时获取代表性图像;(B)在外源性施加Na、Nam、NaMN、NMN、NaAD、NAD 和NmR之后使用DRG神经元外植体培养物的体外沃勒变性测定法,其中显示了在轴突切断术之后12、24、48和72小时的剩余神经突数目的定量分析数据;(C)用表达慢病毒的NaPRT 感染DRG神经元外植体,并在轴突切断术之前用或不用ImM Na温育M小时,体外沃勒变性测定法显示了在轴突切断术之后12、24、48和72小时的剩余神经突数目的定量分析数据。

[0045] 图9图解说明了在玻璃体内注射NAD生物合成底物之后的视神经横断,其中将 NAD、NMN, NmR或Nam注射入大鼠左眼的玻璃体内区室中并让其整合视网膜神经节细胞对小时,然后通过眼摘出术来横断左侧视神经,和在横断之后4天收集右侧和左侧视神经并通过Western印迹法进行分析,其中使用从在横断前未经任何处理的小鼠中横断的视神经作为负对照;在该图中显示了定量分析数据,即从经横断的视神经获得的剩余神经丝免疫反应性相对于未经横断的视神经的百分数士S. D.。

[0046] 发明详述

[0047] 本发明涉及用于治疗神经病变的方法和组合物。所述方法可以包括给哺乳动物施用有效量的增加患病和/或受损的神经元中的NAD活性的物质。据信,增加的NAD活性可以增加sirtuin活性,后者然后导致受损的神经元细胞的轴突变性相对于在未用所述药剂处理的受损的神经元细胞中出现的轴突变性有所降低。这样的轴突变性降低可以包括对于神经元的损伤的完全或部分改善。还据信,NAD活性的增加可能能够通过不牵涉sirtuin分子的其他机制起作用,从而产生轴突变性的降低或有助于产生轴突变性的降低。

[0048] 七种已知的称为SIRT,s的sirtuin分子组成了哺乳动物中的组蛋白/蛋白质脱乙酰酶的Sir2家族,所有这样的sirtuin分子包括在本发明的范围内。这七种人 sirtuin,SIRT1-SIRT7,是NAD依赖性组蛋白/蛋白质脱乙酰酶,其分别以NCBI LocusLink ID Nos. 23411、22933、23410、23409、23408、51548 和 51547 进行了更充分的描述(参见 http : //www. ncbi. nlm. hih. gov/LocusLink/)。特此引入所述 NCBILocusLink 参考站点作为参考。在多种实施方案中,本发明的方法和组合物可以增加任何一种或多种sirtuin的活性,特别地,本发明的多种方法增加SIRTl的活性。

[0049] 关于物质的活性,可参照特殊物质的浓度或该物质的功能有效性。物质的浓度可以通过许多因素来增加,包括例如增加合成、减少分解、增加物质的生物利用率或降低物质的结合或者另外增加游离物质的可利用数量。增加功能有效性可以是由于例如分子构象的改变、物质起作用的条件的改变、对物质的灵敏度的改变等等而造成的。关于sirtuin分子,增加活性是希望表示增加NAD的浓度或增强NAD的功能有效性或增加NAD的利用率,或者增加经过NAD的一个或多个生物合成途径的通量,或者其任何的组合。

[0050] 神经病变可以包括牵涉神经元和/或支持细胞例如神经胶质细胞、肌肉细胞、成纤维细胞等的任何疾病或病状,特别是那些牵涉轴突损害的疾病或病状。通过创伤性损伤或通过由于疾病或病状的非机械性损伤可以引起轴突损害,这样的损害的结果可以是轴突的变性或功能障碍和功能性神经元活性的丧失。产生这样的轴突损害或与这样的轴突损害相关的疾病和病状处于大量的神经病变性疾病和病状中。这样的神经病变可以包括外周神经病变、中枢神经病变和其组合。此外,外周神经病变的表现可以由主要集中在中枢神经系统中的疾病而产生,和中枢神经系统表现可以基本上由外周或全身的疾病而产生。

[0051] 外周神经病变涉及对于外周神经的损害,和可以是由于神经的疾病而引起的或者是全身性疾病的结果。一些这样的疾病可包括糖尿病,尿毒症,传染病如AIDs或麻风病, 营养缺乏,血管或胶原病症例如动脉粥样硬化,和自身免疫疾病例如全身性红斑狼疮、硬皮病、结节病、类风湿性关节炎和结节性多动脉炎。外周神经变性还可以是由于对于神经的创伤性即机械性损害以及对于神经的化学或热损害而造成的。损伤外周神经的这样的情形包括压迫或挤压损伤例如青光眼、腕管综合征、直接创伤、穿透损伤、挫伤、骨折或脱位的骨; 涉及浅神经(尺骨、桡骨或腓骨)的压力,其可以是由于延长了拐杖的使用时间或在一个位置保持了太长时间或者是由于肿瘤而造成的;神经内出血;局部缺血;暴露于冷或刺激或者某些药物或毒性物质例如除草剂(hertacides)或杀虫剂。特别地,神经损害可以是由于细胞毒性抗癌剂例如长春花生物碱如长春花新碱所造成的化学损伤而引起的。这样的外周神经病变的典型症状包括虚弱、麻木、感觉异常(不正常的感觉例如灼烧感、搔痒感、刺痛感或麻刺感)和在臂、手、腿和/或脚中的疼痛。神经病变还可以与线粒体功能障碍相关。 这样的神经病变可以展现出降低的能量水平,即降低的NAD和ATP水平。

[0052] 外周神经病变还可以是代谢性和内分泌性神经病变,其包括广泛的与代谢来源的全身性疾病相关的外周神经病症。其中的一些在前面已提及的这些疾病尤其包括糖尿病、 低血糖症、尿毒症、甲状腺功能减退症、肝衰竭、红细胞增多、淀粉样变性、肢端肥大症、P卜啉病、脂质/糖脂代谢的病症、营养/维生素缺乏和线粒体病症。这些疾病的共同特点是由于代谢途径失调而改变了髓鞘和轴突的结构或功能,由此牵涉到外周神经。

[0053] 神经病变还包括视神经病变例如青光眼;视网膜神经节变性例如与色素性视网膜炎和外视网膜神经病变相关的那些;视神经炎和/或变性,包括与多发性硬化相关的那些;对视神经的创伤性损伤,可包括例如切除肿瘤期间的损伤;遗传性视神经病变,例如 Kier's病和Leber’ s遗传性视神经病变;局部缺血性视神经病变,例如续发于巨细胞性动脉炎的那些;代谢性视神经病变,例如神经变性疾病,包括前面提及的Leber’ s神经病变, 营养缺乏例如缺乏维生素B12或叶酸,和毒性例如由于乙胺丁醇或氰化物引起的毒性;由于不良药物反应引起的神经病变;和由于维生素缺乏引起的神经病变。局部缺血性视神经病变还包括前动脉缺血性视神经病变。

[0054] 与中枢神经系统中的神经病变或轴突病变相关的神经变性疾病包括多种疾病。这样的疾病包括牵涉进行性痴呆的疾病,例如阿尔茨海默病、老年性痴呆、皮克病和亨廷顿舞蹈病;影响肌肉功能的中枢神经系统疾病,例如帕金森病、运动神经元疾病和进行性共济失调如肌萎缩性侧索硬化症;脱髓鞘病,例如多发性硬化;病毒性脑炎,例如由肠道病毒、虫媒病毒和单纯疱疹病毒引起的那些;和朊病毒疾病。对头部的机械性损伤例如青光眼或创伤性损伤还可以引起脑和脊髓中的神经损伤和变性。另外,局部缺血和中风以及诸如营养缺乏和化学毒性(例如用化疗剂时)的情形可以引起中枢神经系统神经病变。

[0055] 在此处使用时,术语“治疗”是希望包括在神经元损伤出现之前或之后的干涉。照此,治疗可以通过在对于神经元的首要侵害出现之前进行施用来预防神经元损伤,以及可以通过在对于神经元的首要侵害出现之后进行施用来改善神经元损伤。这样的对于神经元的首要侵害可以包括任何与神经病变相关的疾病或病状,或由于这些疾病或病状而产生。 “治疗”还包括防止神经元损伤的进展。在此处使用时,“治疗”可以包括施用药物和/或合成的物质,施用生物物质例如蛋白质、核酸、病毒载体等,以及施用诸如neutraceuticals、 食品添加剂或功能性食品的物质。

[0056] 本发明的方法和组合物可用于治疗哺乳动物。这样的哺乳动物包括人以及非人哺乳动物。非人哺乳动物包括,例如,伴侣动物例如狗和猫,农业动物例如牲畜(包括奶牛、马等),和外来动物例如动物园动物。

[0057] 能够在哺乳动物中增加sirtuin活性的物质可以包括多酚,其中的一些已在早些时候进行了描述(参见例如Howitz等人,Nature 425 : 191-196,2003,和该文章所带有的补充信息,在此引用所有这些文献作为参考)。这样的化合物可以包括芪,例如白藜芦醇、 piceatarmol、脱氧土大黄苷、反式芪和土大黄苷;查儿酮,例如紫铆因、isoliquiritigen 和3,4,2',4',6'-五羟基查儿酮和查儿酮;黄酮,例如黄颜木素、5,7,3',4',5'-五羟基黄酮、木犀草素、3,6,3',4'-四羟基黄酮、栎精、7,3',4',5'-四羟基黄酮、山奈黄素、6-羟基芹黄素、芹黄素、3,6,2',4'-四羟基黄酮、7,4' _ 二羟基黄酮、7,8,3 ‘, 4'-四羟基黄酮、3,6,2丨,3'-四羟基黄酮、4'-羟基黄酮、5,4' - 二羟基黄酮、5, 7-二羟基黄酮、桑色素、黄酮和5-羟基黄酮;异黄酮,例如大豆黄素和染料木黄酮;黄烷酮, 例如柚苷配基、3,5,7,3' ,4'-五羟基黄烷酮和黄烷酮;或儿茶素,例如(-)_表儿茶素、 (-)_儿茶素、(-)_儿茶素、(-)_没食子儿茶素、(+)_儿茶素和(+)_表儿茶素。

[0058] 另外的多酚或其他增加sirtuin脱乙酰酶活性的物质可以使用此处所述的测定系统以及在商购可得的测定系统例如发荧光性酶测定系统(Biomol International L. P., Plymouth Meeting,Pennsylvania)中进行鉴定。Sinclair 等人还公开了能够增加 sirtuin 活性的物质(Sinclair等人,W02005/02672,该文献在此以其整体进行引用作为参考)。

[0059] 在多种实施方案中,其他物质能够间接地通过增加NAD活性来增加sirtuin活性, 因为特殊的sirtuin起作用方式是通过NAD-依赖性组蛋白/蛋白质脱乙酰酶活性的。通过施用NAD或NADH以及通过合成NAD可以增加NAD活性。NAD可以通过三个主要途径来合成,即从新合成途径,其中从色氨酸合成NAD,NAD补救途径,其中通过降解的NAD产物例如烟酰胺的再环化来产生 NAD (Lin 等人,Curent Opin. Cell Biol. 15 :241-246,2003 ;Magni 等人,Cell Mol. LifeSci. 61 :19-34,2004),和烟酰胺核糖核苷激酶途径,其中通过烟酰胺核糖核苷激酶将烟酰胺核糖核苷转化成烟酰胺单核苷酸(Bieganowski等人,Cell 117 : 495-502,2004)。因此,向受损的神经元施用下列物质能够有效地增加NAD活性:在从新合成途径中的NAD的前体例如色氨酸或烟酸盐(nicotinate),和/或在NAD补救途径中的物质例如烟酰胺、烟酸、烟酸单核苷酸或脱氨基-NADjP /或在烟酰胺核糖核苷激酶途径中的物质例如烟酰胺核糖核苷或烟酰胺单核苷酸。如下所示,除了 NAD之外,烟酰胺单核苷酸、 烟酸单核苷酸或烟酰胺核糖核苷也具有和NAD类似程度的抗轴突变性的保护能力,但是, 烟酸和烟酰胺不能做到这样。然后,增加的NAD活性可以增加受损的神经元中sirtuin组蛋白/蛋白质脱乙酰酶活性,和减少或防止轴突变性。另外,据信,其他物质可以通过增加酶活性,或通过增加NAD、烟酰胺单核苷酸、烟酸单核苷酸、烟酰胺核糖核苷或sirtuin酶的水平,或通过减少NAD、烟酰胺单核苷酸、烟酸单核苷酸、烟酰胺核糖核苷或sirtuin酶的降解来发挥作用。

[0060] 在多种实施方案中,可以通过施用合成NAD的酶或包含合成NAD的酶的核酸来增加受损的神经元中的NAD。这样的酶可包括用于合成NAD的在从新合成途径中的酶、NAD 补救途径的酶或烟酰胺核糖核苷激酶途径的酶,或者编码用于合成NAD的在从新合成途径中的酶、NAD补救途径的酶或烟酰胺核糖核苷激酶途径的酶的核酸,特别是NAD补救途径的酶,例如烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶(NMNAT)如NMNATl。因此,在一个非限定性实例中, 施用NMNAT例如NMNATl或NMNAT3或者施用包含编码NMNAT例如NMNATl或NMNAT3的序列的核酸可以减少或防止受损的神经元中的轴突变性。

[0061] 根据下列对于人NMNAT1基因和/或蛋白的(ienBank登录号描绘了人NMNAT1酶 (E.C. 2. 7. 7. 18) :NP_073624 ;NM_022787 ;AAL76934 ;AF459819 ;和 NP_073624 ;AF314163。 该基因的一个变体是NMNAT-2 (KIAA0479),其的人类版本可以在GenBank登录号NP_0558M 和NM_015039下找到。

[0062] 在此处使用时,术语“以...的百分数同一的”或“同一性百分数”或“ %同一性” 是指两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的序列同一性。每个同一性可以通过比较可为了比较目的而比对的每个序列中的位置来确定。当在被比较的序列中的等价位置被相同碱基或氨基酸占据时,那么这些分子在该位置上就是同一的;当等价的位点被相同或类似的氨基酸残基(例如在空间和/或电子特性方面类似)占据时,那么这些分子可以被称为在该位置上是同源的(类似的)。作为同源性、类似性或同一性的百分数进行表示涉及在由被比较的序列所共享的位置处同一或类似的氨基酸数目的函数。可以使用多种比对算法和/或程序,包括FASTA、BLAST或ENTREZ。可作为GCG序列分析软件包(University of Wisconsin,Madison, Wis.)的一部分而获得FASTA和BLAST,和可以例如以默认设置进行使用。ENTREZ 可通过 National Center for Biotechnology Information, NationalLibrary of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Md. ·ί|。

中,两个序列的同一性百分数可以通过GCG程序以1的缺口权重来测定,例如给每个氨基酸缺口加权重,就好像其是两个序列之间的单个氨基酸或核苷酸错配。用于比对的其他技术描述于 Methods in Enzymology,第 266 卷:Computer Methods forMacromoIecuIar SeqHence Analysis(1996), ed. Doolittle, AcademicPress, Inc. , Harcourt Brace&Co.的分部,San Diego, California, USA。优选地,采用允许序列中的缺口的比对程序来比对序列。Smith-Waterman是一种类型的允许序列中的缺口的算法。参见Meth. Mol. Biol. 70 : 173-187(1997)。还有,可以采用使用Needleman和^msch比对方法的GAP程序来比对序列。一种可选择的搜索策略使用MPSRCH软件,其在MASPAR计算机上运行。MPSRCH使用Smith-Waterman算法以在极大并行的计算机(massively parallelcomputer)上对序列进行评分,该方法增强了选取远距离相关的匹配的能力,和特别能够耐受小的缺口和核苷酸序列错误。可以使用核酸编码的氨基酸序列来搜索蛋白质和DNA数据库。具有单独的序列的数据库描述于Methods in Enzymology, ed. Doolittle,同上。数据库包括Genbank、EMBL、 和日本的DNA数据库(DDBJ)。

[0063] 多肽的“变体”是指这样的多肽,即该多肽具有在一个或多个氨基酸残基处发生改变的多肽的氨基酸序列。变体可以具有“保守的”变化,其中被取代的氨基酸具有类似的结构或化学特性(例如用异亮氨酸替代亮氨酸)。变体可以具有“非保守的”变化(例如用色氨酸替代甘氨酸)。类似的次要变化还可以包括氨基酸缺失或插入或者两者。关于确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不会完全破坏生物学或免疫学活性的指导可以用本领域熟知的计算机程序来找到。例如LASERGENE软件(DNASTAR)。

[0064] 当在多核苷酸序列的情况下使用时,术语“变体”可以包括与特殊的基因或其编码序列的多核苷酸序列相关的多核苷酸序列。该定义可以包括例如“等位基因的”、“剪接”、 “物种”或“多态的”变体。剪接变体可以与参考分子具有显著的同一性,但通常由于在mRNA 加工期间的可选择的外显子剪接而具有或多或少数目的多肽。相应的多肽可拥有附加的功能结构域或不存在结构域。物种变体是在从一个物种到另一个物种时发生变化的多核苷酸序列。所获得的多肽通常会具有相互之间显著的氨基酸同一性。多态变化是在指定物种的个体之间在特殊基因的多核苷酸序列中的变化。多态变体还可以包括“单核苷酸多态性 (SNPs) ”,其中多核苷酸序列具有一个碱基的变化。SNPs的存在可能是某群体、疾病状态或疾病状态的倾向的指示。

[0065] 根据本发明的方法和组合物能够用于治疗或预防神经病变的药剂可以包括烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶(NMNAT)或编码NMNAT的多核苷酸。特别地,所述药剂可以是这样的酶,即其具有NMNAT活性,和具有与人NMNATl的至少50%同一性或与人NMNAT3的至少50%同一性,与人NMNATl的至少60%同一性或与人NMNAT3的至少60%同一性,与人 NMNATl的至少70%同一性或与人NMNAT3的至少70%同一性,与人NMNATl的至少80%同一性或与人NMNAT3的至少80%同一性,与人NMNATl的至少90%同一性或与人NMNAT3的至少90%同一性,与人NMNATl的至少95%同一性或与人NMNAT3的至少95%同一性。此外,所述药剂可以包括人NMNAT1、人NMNAT3或其经保守取代的变体。

[0066] 所述药剂还可以包括与编码人NMNATl的核酸具有至少50%同一性的多核苷酸或与编码人NMNAT3的核酸具有至少50%同一性的多核苷酸,与编码人NMNATl的核酸具有至少60%同一性的多核苷酸或与编码人NMNAT3的核酸具有至少60%同一性的多核苷酸,与编码人NMNATl的核酸具有至少70%同一性的多核苷酸或与编码人NMNAT3的核酸具有至少70%同一性的多核苷酸,与编码人NMNATl的核酸具有至少80%同一性的多核苷酸或与编码人NMNAT3的核酸具有至少80%同一性的多核苷酸,与编码人NMNATl的核酸具有至少 90%同一性的多核苷酸或与编码人NMNAT3的核酸具有至少90%同一性的多核苷酸,与编码人NMNATl的核酸具有至少95%同一性的多核苷酸或与编码人NMNAT3的核酸具有至少 95%同一性的多核苷酸。所述药剂还可以是编码人NMNAT1、人NMNAT3或其变体的多核苷酸。

[0067] 所述药剂还可以包括sirtuin多肽或编码sirtuin多肽的核酸。特别地,所述药剂可以包括这样的酶,即其具有SIRT活性,和具有与人SIRTl的至少50%同一性,与人 SIRTl的至少60%同一性,与人SIRTl的至少70%同一性,与人SIRTl的至少80%同一性, 与人SIRTl的至少90%同一性,或与人SIRTl的至少95%同一性。此外,所述药剂可以包括人SIRTl或其经保守取代的变体。所述药剂还可以包括与编码人SIRTl的核酸具有至少50%同一性的多核苷酸,与编码人SIRTl的核酸具有至少60%同一性的多核苷酸,与编码人SIRTl的核酸具有至少70%同一性的多核苷酸,与编码人SIRTl的核酸具有至少80% 同一性的多核苷酸,与编码人SIRTl的核酸具有至少90%同一性的多核苷酸,或与编码人 SIRTl的核酸具有至少95%同一性的多核苷酸。此外,所述药剂可以包括编码人SIRTl或其变体的多核苷酸。

[0068] 施用可以是通过任何合适的施用途径,包括颊、牙、子宫颈内、肌内、吸入、颅内、 淋巴管内、肌内、眼内、腹膜内、胸膜内、鞘内、气管内、子宫内、血管内、静脉内、膀胱内、鼻内、眼、口、耳、胆灌注、心灌注、小颚(priodontal)、直肠、脊髓、皮下、舌下、局部、阴道内、 transermal、输尿管或尿道。剂型可以是包括计量气雾剂的气雾剂、咀嚼棒、胶囊、含有经包衣的小丸的胶囊、含有延迟释放小丸的胶囊、含有延长释放小丸的胶囊、浓缩物、霜剂、增强的(augmented)霜剂、栓剂型霜剂、圆盘(disc)、敷料、酏剂、乳剂、灌肠剂、延长释放纤维、 延长释放薄膜、气体、凝胶、计量凝胶、颗粒剂、延迟释放颗粒剂、泡腾颗粒剂、咀嚼用树胶、 植入物、吸入物、可注射的、可注射的脂质复合物、可注射的脂质体、插入物、延长释放插入物、子宫内装置、胶冻剂、液体、延长释放液体、洗液、增强的洗液、香波洗液、油、软膏剂、增强的软膏剂、糊剂、软锭剂、小丸、粉剂、延长释放粉剂、计量粉剂、环、香波、皂液、溅湿用溶液剂(solution for slush)、溶液剂/滴剂、浓缩溶液剂、成凝胶溶液剂/滴剂、海绵、喷雾剂、计量喷雾剂、栓剂、混悬剂、混悬剂/滴剂、延长释放混悬剂、药签、糖浆剂、片剂、咀嚼片剂、含有经包衣的颗粒的片剂、延迟释放片剂、可分散的片剂、泡腾片剂、延长释放片剂、口中崩解片剂、棉塞、带(tape)或药片/糖锭剂。

[0069] 眼内施用可包括通过注射(包括玻璃体内注射)、通过滴眼剂和通过透巩膜递送的施用。

[0070] 施用还可以为夹杂在哺乳动物的饮食中,例如夹杂在人或伴侣动物的功能性食品中。

[0071] 还考虑到,某些含有增加sirtuin活性的组合物的制剂将要口服施用。这样的制剂优选地用合适的载体包封和配制成固体剂型。合适的载体、赋形剂和稀释剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、硅酸钙、 微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、明胶、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯和丙酯、滑石、硬脂酸镁、水、矿物油等等。所述制剂另外还可以包含润滑剂、湿润剂、乳化剂和悬浮剂、 防腐剂、增甜剂或矫味剂。通过使用本领域熟知的规程配制所述组合物,以便在施用给患者之后提供活性成分的快速、持续或延迟的释放。所述制剂还可以包含减少蛋白水解性降解和促进吸收的物质,例如表面活性剂。

[0072] 可以根据患者的大概体重或身体表面积或者将要占据的身体空间的体积来计算具体的剂量。该剂量还会依赖于所选择的特定施用途径。本领域普通技术人员可常规地进行对于确定合适的治疗剂量所必需的计算的进一步精确。按照在检定制剂中的活性,本领域技术人员可以进行这样的计算而不需过度的实验,对于某些化合物的所述在检定制剂中的活性例如已经在别处进行了描述(参见例如Howitz等人,Nature 425 : 191-196,2003和该文章所附的补充信息)。可以结合标准的剂量-响应研究来确定准确的剂量。将会理解, 实际施用的组合物的量将会由开业医生考虑相关情况来确定,所述相关情况包括待治疗的病状,待施用的组合物的选择,个体患者的年龄、体重和响应,患者症状的严重程度,和所选择的施用途径。

[0073] 在多种实施方案中,本发明还提供了筛选候选药剂的方法。在一个这样的测定方法中,就于减少或防止受损的神经元细胞的轴突变性方面的有效性对药剂进行测试。因此, 将候选药剂施用给经历了损伤的神经元细胞,并检测受损的神经元细胞的轴突变性的减少。通常,在产生损伤之前加入药剂,可是,在一些情况下,可以在添加候选化合物之前产生损伤。该方法可以在体外或体内进行。体外测试可以使用许多种哺乳动物神经元细胞中的任一种在多种引起损伤的实验条件下进行。可使用的哺乳动物神经元细胞类型的一个实例是原代背根神经节细胞,其通过横断并去除神经元细胞体或者通过生长在含有长春花新碱的培养基中而受到损伤,如下所述。体内测试可以在完整的动物中进行,例如外周神经再生的小鼠模型(Pan等人,J. Neurosci. 23 :11479-11488,2003)或进行性运动神经病变的小鼠模型(Schmalbruch 等人,J. Neuropathol. Exp. Neurol. 50 :192-204,1991 ;Ferri 等人, Current Biol. 13 :669-673,2003)。

[0074] 因为减少或防止神经元损伤的机制是由于sirtuin分子的NAD-依赖性组蛋白/ 蛋白质脱乙酰酶活性的增加,所以所述测定方法还可以用作对于直接或通过增加NAD活性来增加sirtuin活性的物质的初步筛选。因此,上述方法可以用于筛选增加NAD生物合成活性的药剂或者增加神经元中sirtuin活性的药剂。

[0075] 重组载体也在本发明的范围内,所述重组载体用作编码sirtuin分子或NAD生物合成的酶的核酸的承载物。这样的重组载体可以包含与编码哺乳动物NMNATl蛋白或哺乳动物sirtuin蛋白例如SIRTl蛋白的序列有效连接的启动子。这样的重组载体可以是任何合适的载体,例如慢病毒或腺伴随病毒。还可以使用任何合适的启动子,例如遍在蛋白启动子、CMV启动子或β-肌动蛋白启动子。

[0076] 本发明可以通过参考下列的实施例而得到进一步的理解。

[0077] 实施例1

[0078] 该实施例证明,从用表达Wlds蛋白的载体转染的神经元上横断的轴突与对照神经元相比显示出延迟的变性。

[0079] 在Wlds小鼠中,响应于轴突损伤的沃勒变性已显示出延迟(Gi 11 ingwater等人,J Physiol, 534 :627_639,2001)。基因分析显示,wlds突变包含85kb的串联三次重复,其导致嵌合的核分子(Wlds蛋白)的过表达。该蛋白质由下列部分组成:Ufd(遍在蛋白融合降解蛋白)加的N-末端70AAs、与烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1 (NMNATl)的全序列融合的遍在蛋白链装配因子、在细胞核内产生NAD的NAD补救途径中的酶。Wlds蛋白具有NMNAT活性,但缺乏遍在蛋白连接酶功能,这暗示了轴突保护源自增加的NMNATl活性或者Ufc^a功能的‘显性失活的’抑制。

[0080] 为了鉴定由Wlds蛋白介导的延迟的轴突变性的机制,我们使用了体外沃勒变性模型。将原代DRG外植体神经元用表达合适的蛋白质的慢病毒感染,并通过去除神经元细胞体(横断)或在长春花新碱中生长(毒性)来损伤轴突。[0081] 慢病毒表达构建体由D.Baltimore友情提供(Lois等人,Science295 =868-72, 2002)。我们修饰了 FUGW载体以产生普通表达穿梭FUIV(遍在蛋白启动子-目的基因-IRES-增强的YFP (Venus))载体,其使得能够增强在表达目的基因的细胞中的YFP 表达。下列蛋白质的每一个在C-末端具有六组氨酸标签,将它们克隆 FUIV载体中:Wlds嵌合突变蛋白;含有点突变(P1140A)的Ufd2a,其先前已显示作为“显性失活”(Uf(1¾ (P 1140))抑制野生型Ufc^a功能。将下列基因克隆入FUGW载体中:1) Ufc^a的第一个70AAs (包含在Wlds蛋白中的部分),其与EGFP的N-末端融合(Ufc^a (1-70) -EGFP) 或与在C-末端具有核定位信号的EGFP的N-末端融合(Ufc^a(1-70)-nucEGFP) ;2)Wlds蛋白的NMNATl部分,其与EGFP的C-末端融合(EGFP-NMNAT1)。

[0082] 对于 Ufd2a/Ube4b 的鼠 cDNA (mKIAA0684)由 Kazusa DNAResearch Institute ϋ 供。对于NMNATl的鼠cDNA(登录号:BC038133)从ATCC购买。使用PCR介导的诱变来在 Ufd2a、NMNATl和Wlds中产生点突变。

[0083] 我们在FSP-si载体中产生了 SiRNA构建体,所述FSP-si载体是通过用人TO启动子和Poll终止信号以及随后的SV40启动子-嘌呤霉素-N-乙酰转移酶基因替代遍在蛋白启动子和GFP cDNA而从FUGW骨架产生的。如前所述进行siRNA构建体的克隆,从而从U6 启动子转录出siRNA(Castanotto等人,RNA,8 =1454-60,2002)。用于蛋白质表达的siRNA 下调的序列为 SIRTl 的 1692 〜1710、SIRT2 的 1032 〜1050、SIRT3 的 538 〜556、SIRT4 的 1231 〜1249、SIRT5 的 37 〜55、SIRT6 的 1390 〜1408、和 SIRT7 的 450 〜468。每个慢病毒表达和siRNA构建体的完整性通过DNA测序来确认。

[0084] 将来自E12. 5胚胎的小鼠DRG外植体在存在InM神经生长因子的情况下进行培养。通过向培养基中加入5-氟尿嘧啶而从培养物中去除非神经元细胞。在10-20DIV进行神经突的横断,使用18号针头以去除神经元细胞体。使用在文中或在附图中所示的条件, 用β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Sigma)或Sirtinol (Calbiochem)进行温育。

[0085] 如上所述,使用HEK293T细胞产生慢病毒表达载体。为了确认源自慢病毒的蛋白表达,用慢病毒感染HEK293T细胞并在感染后3天裂解细胞。将这些裂解物通过使用抗-His 标签单克隆抗体Oiiagen)的免疫印迹法进行分析,以检测各自的具有六组氨酸标签的蛋白质的表达。在轴突横断之前刚开始的3-7天,通过将〜106-l(fpfu/ml的病毒与DRG外植体温育M小时来进行DRG神经元的慢病毒感染。在倒置荧光显微镜下检查被感染的神经元以确保在> 95%的神经元中可检测到慢病毒介导的转基因表达。

[0086] 如以前所述进行轴突变性的定量分析(aiai等人,Neuron 39 =217-25,2003)。简而言之,在所示的时间使用相差显微术检查培养物。将具有成碎片的、无折射的外观的轴突标示为“变性的”。在每个时间点上,从几张随机获取的每一培养物的图像中对至少200个可单独区分的轴突进行盲评分。在每个实验中,在一式三份的外植体中测试每一个条件。从每个条件的2-4个独立实验中获得结果。通过Mudent’ sT检验进行统计分析。为了计算神经突所覆盖的面积,使用analysis 3. 1软件(Soft Imaging System,Lakewood,CO)对从两个独立实验的一式四份样品中得到的数字捕获的图像进行分析。

[0087] 我们发现,从表达Wlds蛋白的神经元上横断下来的轴突以这样的方式变性,即其具有源自wlds小鼠的神经元的延迟动力学特征(Buckmaster等人,Eur J Neurosci 7 : 1596-602,1995),如图 IA 中所示。

16[0088] 接着,我们比较了在过表达Wlds蛋白的神经元中与在表达Ufc^a或NMNATl蛋白 (其构成了与EGFP相连的Wlds蛋白)的神经元中横断后的轴突变性。结果显示在图IB中。

[0089] 我们发现,与Wlds蛋白本身相比,EGFP-NMNAT1的表达延迟了轴突变性,而靶向细胞核或细胞质的Ufc^a的N-末端70AA(融合至EGFP)不影响轴突变性。通过在去除神经元细胞体之后的各个时间处计数剩余神经突的百分数来进行这些影响的定量。该分析显示, EGFP-NMNAT1像Wlds蛋白本身一样,在损伤后72小时导致完整的神经突有> 10倍的增加。 为了进一步排除UPS直接参与Wlds蛋白介导的轴突保护的可能,我们使用显性失活Ufc^a 突变体或Ufd2asiRNA构建体检查了 Ufc^a抑制的影响。但是,这些方法都没有导致延迟响应于轴突切断术的轴突降解。总之,这些实验证明,Wlds蛋白的NMNATl部分是在Wlds小鼠中观察到的延迟的轴突变性的原因。

[0090] 实施例2

[0091] 该实施例显示,在全长NMNATl中和在Wlds蛋白中的突变消除了这些蛋白质的轴突保护效应。

[0092] NMNATl是在核NAD补救途径中的酶,其分别催化烟酰胺单核苷酸(NMN)和烟酸盐单核苷酸(NaMN)转化成NAD和烟酸盐腺嘌呤单核苷酸(NaAD)。在过表达NMNATl的神经元中观察到的轴突保护可能是通过其合成NAD的能力(即其酶活性)介导的,或者也许是通过其他未知的该蛋白质的功能介导的。为了澄清该问题,我们使用NMNATl晶体结构来鉴定几个预测参与底物结合的残基。在这些残基中的一个处的突变(W170A)经工程改造而引入全长NMNATl和Wlds蛋白中。体外酶测定法确认,这两个突变型蛋白质都在其合成NAD的能力方面受到了严重的限制(图2A)。将这些突变体中的每一个和其各自的野生型配对物引入神经元中以评测它们保护轴突免于降解的能力。我们发现,表达这些无酶活性的突变体的神经元没有轴突保护作用(图2A),这表明NAD/NaAD-产生是NMNATl防止轴突降解的能力的原因。

[0093] 实施例3

[0094] 该实施例举例说明了,在用长春花新碱损伤的神经元中的增加的NMNAT活性也显示出延迟的轴突降解。

[0095] 除了机械横断之外,在Wlds小鼠中还观察到抗其他损害性因子例如局部缺血和毒素的轴突保护(Coleman 等人,Trends Neurosci25 :532-37,2002 ;GiIlingwater 等人,J Cereb Blood Flow Metab24 :62_66,2004)。我们寻求确定增加的NMNAT活性是否也会延迟响应于其他类型的轴突损伤的轴突降解,所述其他类型的轴突损伤例如为长春花新碱、 具有经充分表征的轴突毒性的癌症化疗试剂。让表达NMNATl或EGFP (对照)的神经元在 0. 5μΜ长春花新碱中生长直至9天。我们发现,表达NMNATl的神经元的轴突维持着它们原始的长度和反射性(refractility),而从表达EGFP的神经元发散出的轴突逐渐地缩回并在第9天前大部分发生变性(图2B)。这些结果表明,NMNAT活性自身能够保护轴突免受许多侵害的影响和介导在Wlds小鼠中观察到的保护作用。

[0096] 实施例4

[0097] 该实施例显示,外源性地施用的NAD能够保护受损的神经元免于轴突变性。

[0098] 以前的实验已显示,神经元细胞表达能够结合并转运细胞外NAD进入细胞的膜蛋白(Bruzzone等人,Faseb J 15 : 10-12,2001)。这鼓励我们探究外源性地施用的NAD是否能够防止轴突变性。我们在轴突横断之前向神经元培养物中加入各种浓度的NAD,并检查了轴突降解的程度。我们发现,在轴突切断术之前M小时加入的0. I-ImM的NAD显著地延迟了轴突变性,虽然外源性地施加的NAD在保护轴突的有效性方面比慢病毒介导的NMNATl表达要稍低一些(图3A)。这些结果提供了对于这样的想法的直接支持,即增加NAD供应可以防止轴突降解。

[0099] 实施例5

[0100] 该实施例举例说明了,在去除神经元细胞体之前需要NAD来保护受损的神经元免于轴突变性。

[0101] 为了获得对于NAD-依赖性轴突保护(NDAP)的机制的了解。我们检查了在去除神经元细胞体之前是否需要NAD,或者将切断的轴突直接暴露于高水平的NAD是否足以提供保护(图:3B)。制备了神经元培养物,并在轴突横断的时候或者在损伤之前的各个时间G 至48小时)处向培养基中加入ImM NAD。

[0102] 我们发现,在轴突横断的时候施用NAD或者在损伤之前施用NAD直至8小时对于轴突没有保护作用。但是,当在损伤之前将神经元与NAD温育更长的一段时间的时候,观察到了显著的轴突保留,最大的效用出现在至少M小时的NAD预处理之后。这些结果表明, NAD依赖性轴突保护不是由轴突本身中的快速的翻译后修饰介导的。

[0103] 对于延长完整的神经元暴露于NAD的时间以防止响应于损伤的轴突降解的要求暗示,保护过程要求从新的转录和/或翻译事件。有趣地,Wlds蛋白和NMNATl都位于细胞核内(数据未显示)。类似地,大多数构成酵母中的NAD补救途径的酶也区室化于细胞核中。 我们使用灵敏的微小规模酶测定法(Szabo等人,Proc Natl Acad Sci USA, 93 =1753-58, 1996)比较了在野生型和表达NMNATl的DRG神经元中的NAD水平,但是发现总的细胞NAD 水平没有变化(数据未显示)。这类似于在酵母中的观察结果,在酵母中这一细胞核途径的活化不改变总的 NAD 水平(Anderson 等人,J Biol Chem, 277 : 18881-90,2002 ;Huh 等人, Nature, 425 :686-91,2003)。此外,在野生型和wlds小鼠的脑中的组织NAD水平是类似的, 尽管在wlds小鼠中NMNAT活性水平增加(Mack等人,Nat Neurosci, 4 :1199_206,2001)。这些数据暗示了,与细胞质的NAD-依赖性过程相反,在细胞核中的NAD-依赖性酶活性可能介导了响应于增加的NMNAT活性而观察到的轴突保护。

[0104] 实施例6

[0105] 该实施例显示了,Sir2的抑制参与了 NAD-依赖性轴突保护。

[0106] 蛋白质脱乙酰酶和poly(ADP_核糖)聚合酶(PARP)的Sir2家族是主要的NAD-依赖性细胞核酶活性。Sir2是组蛋白和其他蛋白质的NAD-依赖性脱乙酰酶,它的活化对于在酵母和美丽线虫(C.elegans)中促进寿命的增加来说是重要的(Bitterman等人, Microbiol Mol BiolRev,67 :376_99,2003 ;Hekimi 等人,Science 299 : 1351-54,2003)。 PARP 通过 DNA 损伤而活化,并参与 DNA 修复(S. D. Skaper, Ann NY AcadSci,993 :217-¾ 和观7-88,200;3)。这些酶,特别是Sir2蛋白,在近些年已经产生了极大的关注,因为它们提供了热量限制和其对于衰老过程的影响之间的有力联系。这些NAD-依赖性酶在调节基因活性中的重要性提示我们去探究它们在轴突降解的自破坏过程中的作用。因此,我们测试了 Sir2的抑制剂(Sirtinol)和PARP的抑制剂(3-氨基苯甲酰胺(3AB))是否能够影响 NAD-依赖性轴突保护(NDAP)(图 4A)。在存在 ImM NAD 和 Sirtinol (100 μ M)或 3ΑΒ (20mM)的情况下培养神经元。通过去除神经元细胞体来进行轴突的横断,并在12至72小时后评测轴突降解的程度。我们发现,Sirtinol有效地阻断了 NDAP,表明Sir2蛋白可能是该过程的效应物。相反地,3AB对于NDAP没有影响,表明PARP在轴突保护中不起作用。为了进一步检查Sir2蛋白在NDAP中的作用,我们测试了白藜芦醇(10〜100 μ M)的效用,白藜芦醇是一种增强Sir2活性的多酚化合物(Howitz等人,Nature,425 : 191-96,2003)。我们发现, 在轴突切断术之前用白藜芦醇处理的神经元显示出轴突降解的减少,该减少与使用NAD而获得的相当(图4A),这为这样的想法提供了进一步的支持,即Sir2蛋白是由NMNAT活性增加介导的轴突保护的效应物。

[0107] 实施例7

[0108] 该实施例显示了,SIRTl参与了 NAD-依赖性轴突保护。

[0109] 在人和啮齿动物中,已经鉴定了共享Sir2保守结构域的七个分子 (Sirtuin(SIRT) 1至7),虽然这些蛋白质中的一些并不表现出具有组蛋白/蛋白质脱乙酰酶活性(Buck等人,J Leukoc Biol, S0741-5400,2004)。SIRTl位于细胞核中,并参与了染色质重塑和转录因子例如p53的调节(J. Smith, Trends Ceff Biol,12 :404_406,2002)。其他SIRT蛋白的细胞定位较不清楚,但是已经发现一些在细胞质中和在线粒体中。为了确定哪种或那些SIRT蛋白参与了 NAD-依赖性轴突保护,我们使用siRNA构建体进行了基因压制(knockdown)实验以特异地靶向SIRT家族的每一个成员。用表达特异的SIRT siRNA构建体的慢病毒感染神经元,所述SIRT siRNA构建体有效地抑制它们的所希望的靶标的表达 (图4B)。将经感染的神经元培养在ImM NAD中,并通过去除细胞体来进行轴突的横断。我们发现,SIRTl siRNA构建体在阻断NAD的轴突保护作用时就如同Sirtinol抑制剂一样有效。相反地,其他SIRT蛋白的抑制对于NDAP不具有显著的影响(图4B)。这些结果表明, SIRTl是NAD供应增加的主要效应物,所述的NAD供应增加有效地防止轴突的自破坏。虽然 SIRTl可以使直接参与轴突稳定性的蛋白质脱乙酰基,但是其主要在细胞核中的定位,以及为了获得有效保护而在损伤前〜M小时对于NAD的需要,一起暗示了 SIRTl调节了导致轴突保护的基因程序。

[0110] 轴突变性是一种主动的、自破坏性的现象,其不仅在损伤之后和在对化疗作出响应时被观察到,而且在与衰老、代谢疾病例如糖尿病性神经病变、和神经变性疾病相关时被观察到。我们的结果表明,在Wlds小鼠中的轴突保护的分子机制是由于NAD的供应增加和随之发生的组蛋白/蛋白质脱乙酰酶SIRTl的活化,所述的NAD的供应增加是由于NAD补救途径的活性增加而造成的。

[0111]实施例 8-11

[0112] 下面的材料和方法用于实施例8-11。

[0113] 表达质粒的构建和诱变。使用Herculase (Stratagene) PCR扩增出NAD生物合成相关酶的编码区,对于鼠NMNATl从EST克隆BC038133中扩增,和对于鼠烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶3 (NMNAB)从克隆BC005737中扩增。人NAD合成酶(QNQ的具有六组氨酸标签的 cDNA 由 Dr. N. Hara(Shimane University, Shimane, Japan)友情提供。六组氨酸标签加在每个cDNA的3'-末端。通过PCR介导的定点诱变产生NMNATl胞质突变体(cytNMNATl)。 通过在NMNAT3的C-末端加上核定位信号而产生NMNAT3的细胞核形式(nucNMNAB)。如前所述,将每一个PCR扩增出的NAD合成相关酶的片段克隆入FCIV慢病毒穿梭载体中。对

19所有构建体的完整性进行测序,使用iTaq DyeDeoxy Terminator循环测序试剂盒(Applied Biosystems)和 Applied Biosystems 373 DNA 测序仪。

[0114] NAD牛物合成底物。NAD生物合成相关酶的所有底物从Sigma购买(Na、Nam、 NMN、NaMN、烟酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)和NAD)。NmR从NMN合成。通过使用反相柱 LC-18T (Supelco)的HPLC(Waters)来确认NMN向NmR的转化。在Iml/分钟的缓冲液流速下,NmR在260士 10秒被洗脱和NMN在150士 10秒被洗脱,所述缓冲液含有50mM K2HPO4和 50mM Iffl2PO4 (ρΗ7· 0)。如前所述,使用由 Dr. Charles Brenner (Dartmouth Medical School, NewHampshire, USA)友情提供的酵母菌株来评测NmR的生物活性。

[0115] 实时定量反转录-PCR分析。根据对于实验室动物的照料和使用的National Institute of Health指导方针,在Washington University进行所有的手术程序。对于神经损伤之后的表达分析,横断C57BL/6小鼠的坐骨神经,和在所示时间点上收集L4至 L5.DR(iS并汇集在一起以提取RNA。根据所述的方法将来自E14. 5胚胎的大鼠DRG外植体培养14天,和用含有IOnM长春花新碱的培养基培养所示的一段时间,并提取RNA。从汇集的组织来源或DRG外植体培养物中制备总RNAs。使用标准方法,Wlyg的每种RNA中制备第一链cDNA模板。对于每个RNA样品进行两个独立的cDNA合成。通过在I~aqMan7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems)上实时监测 SYBR-GREEN染料的荧光增加来进行定量反转录(RT)-PCR。

[0116] 细朐,培养、体外轴突切断术和轴突变件的定量。将来自E12. 5胚胎的小鼠DRG外植体培养在含有10% FCS和InM神经生长因子的DMEM中。通过向培养基中加入5-氟尿嘧啶而从培养物中去除非神经元细胞。在14-21DIV进行神经突的横断,使用18号针头以去除神经元细胞体。产生慢病毒表达载体。在轴突横断之前3-7天进行慢病毒感染M小时。 进行神经突变性的定量分析。

[0117] 蛋白质表达和定位的确定。为了确认蛋白质表达,用表达每一种NAD生物合成相关酶的病毒感染HEK293T细胞。在感染后5天裂解细胞以便通过免疫印迹进行分析,从而通过抗-6xHis标签单克隆抗体(R&D Systems)来检测每种具有六组氨酸标签的蛋白质的表达。使用被对于每一种NAD生物合成相关酶的病毒穿梭载体瞬时转染的HEK293T细胞来分析每种蛋白质的亚细胞定位。将细胞于在含有0. 吐温-20的PBS(PBS-T)中的4%低聚甲醛中固定,并与含有5% BSA的PBS-T温育1小时,然后用在含有BSA的PBS-T中的 1 : 1000稀释的抗-6xHis标签抗体(R&D Systems)覆盖并在4°C保持16小时。用PBS-T 洗涤细胞,并用在TBS-T中的缀合有Alexa Fluor594的二抗(Molecular Probes)温育1 小时,和通过荧光显微术(Nikon)进行检查。

[0118] NMNAT蛋白过表达、亲和纯化和酶测定。通过使用磷酸钙沉淀法,用对于每种酶的表达质粒转染HEK293T细胞。三天后,用PBS洗涤细胞两次,然后悬浮在含有50mM磷酸钠 (pH8. 0)和300mMNaCl的缓冲液(缓冲液A)中。然后通过S0NIFIRE 450 (BRANSON)将细胞勻浆,并通过在10,OOOg离心10分钟来收集上清液。用缓冲液A洗涤His-选择镍亲和凝胶 (Sigma),和向Iml上清液中加入0. Iml的50%凝胶悬浮液,并在4°C温育10分钟,然后用缓冲液A充分地洗涤结合具有六组氨酸标签的蛋白质的小珠。通过加入100 μ 1含有50mM 磷酸钠(pH8.0)、300mM NaCl和250mM咪唑的溶液来洗脱蛋白质。通过使用如前所述经亲和纯化的蛋白质来测量相对的NMNAT酶活性,减去从用模拟品转染的细胞中获得的值,并通过由光密度测定法测定的重组蛋白质的量进行标准化。

[0119] NAD牛物合成底物的施用和视神经横断。将Nam、NMN、NmR或NAD以IOOmM或IM的浓度溶解在PBS中。在麻醉状态下,以每秒0. 5 μ 1 ml的速度将各自5 μ 1溶液注射入左侧玻璃体内component中。在玻璃体内注射后M小时横断左侧视神经,并在所示时间处回收视神经。将视神经组织在100 μ 1含有IOOmM tris-HCl (pH6. 8),1% SDS和ImM DTT的缓冲液中进行勻浆。对于每个样品取50 μ g蛋白质通过Western印迹法进行分析,使用抗-神经丝抗体2H3 (Developmental Studies Hybridoma Center)和缀合有过氧化物酶的二抗 (Jackson ImmunoResearch)。从横断的神经对对侧的神经的神经丝免疫反应性的比例计算变性率。

[0120] 实施例8

[0121 ] 该实施例举例说明了 NAD生物合成途径和哺乳动物NAD生物合成相关酶的表达分析。

[0122] 在原核生物和真核生物中,NAD均通过三个主要途径合成。在从新合成途径中,NAD 从色氨酸合成(图幻。在补救途径中,NAD从维生素(包括烟酸和烟酰胺)产生。最近已发现了从烟酰胺核糖核苷开始的第三条途径,称为不依赖于I^reiss-Handler的途径。从新合成途径的最后的酶促反应涉及通过QPRT (EC 2. 4. 2. 19)将喹啉酸盐(quinolinate)转化为NaMN。在这一点上,从新合成途径和补救途径会聚在一起。NaPRT(EC 2.4. 2. 11)将Na 转化为 NaMN,NaMN 然后被 NMNAT (EC 2. 7. 7. 1)转化为 NaAD。QNSl (EC 6. 3. 5. 1)将 NaAD 转化为 NAD。NmPRT (EC 2. 4. 2. 12 ;也称为 visfatin)将 Nam 转化为 NMN。NMN 还被 NMNAT 转化为NAD。在哺乳动物中还未鉴定出烟酰胺酶(PNC,EC 3.5. 1. 19),其在酵母和细菌补救途径中中将Nam转化为Na。在不依赖于Preiss-Handler的途径中,Nrk (EC2. 7. 1. 22)将NmR 转化为NMN,并与补救途径会聚。以前已经克隆和表征了这些哺乳动物酶中的大多数,包括 QPRT、NmPRT、QNS1、Nrk 1/2和NMNAT1/2/3。还将NaPRT的哺乳动物同源物鉴定为注释为细菌NaPRT的哺乳动物同源物的EST。

[0123] 为了探究在神经系统中哺乳动物NAD生物合成相关酶的表达,我们进行了定量 RT-PCR,其使用来自在E14、P0、P7、P14和P21期的小鼠脑、视网膜、脊髓和DRG的RNA。在整个发育阶段和在成年期,所有的酶普遍地在神经系统中表达,除了 Nrk2,它的表达在所有经检查的组织中非常低(数据未显示)。为了鉴定合成NAD的酶响应于神经元侵害的可诱导性,我们比较了在坐骨神经横断之后1、3、7和14天的DRG中相对于在未损伤的DRG中的每种酶的RNA表达。如图6A中所示,大多数的酶在损伤之后上调了 2至8倍。在这些之中, Nrk2表达在轴突切断术之后14天被异常高度地诱导(超过20倍)。我们还分析了在由位于培养的大鼠DRG神经元中的神经毒素所引起的轴突变性期间NAD合成相关酶的表达。用 0. 1 μ M和1 μ M鱼藤酮处理DRG神经元以引起轴突变性,并在添加鱼藤酮之后M小时收集 RNA。在鱼藤酮处理之后,Nrk2的表达增加超过6倍(图6B)。这些结果提示,尽管在NAD 合成途径中的所有酶活性是普遍存在的,但是Nrk2可能负责在神经元侵害之后提供NAD合成底物。

[0124] 实施例9

[0125] 该实施例举例说明了,细胞核和细胞质Nmat酶均拯救轴突免于变性。

[0126] 为了确定NMNATl的核定位对于提供轴突保护是否是必需的,我们在体外沃勒变性测定法中分析了 NMNAT酶的亚细胞分布的影响,并比较了细胞质和细胞核NMNAT的过表达之间的轴突保护的程度。NMNATl在NMNATl蛋白的211-217氨基酸中具有推定的核定位信号PGRKRKW。我们产生了标示为cytNMNATl的突变型NMNAT1,其中将该核定位信号改变为PGAAAAW,并检查了亚细胞分布。如图7B中所示,大部分的cytNMNATl位于胞质溶胶中, 和我们预期的一样。

[0127] 接着,我们确认了 cytNMNATl的酶活性,NMNATl和其突变体cytNMNATl通过使用亲和凝胶从表达任一种蛋白质的细胞裂解物中纯化出来。如上所述测量经亲和纯化的蛋白质的酶活性,我们发现,cytNMNATl的活性没有因其的突变而改变(图7C)。在DRG神经元中过表达cytNMNATl之后,我们观察到与细胞核野生型NMNATl —样的强神经突保护(图 7A、E)。我们通过使用缺乏核定位信号的NMNATl进一步确认了这一结果。在两种NMNAT同工酶中,以前报道NMNAT3位于细胞核和线粒体之外,并具有与NMNATl相当的酶活性。我们向NMNAT3的C-末端加入了人拓扑异构酶I的核定位信号KPKKIKTED,从而产生细胞核 NMNAT3。我们在HEK293T细胞中表达了具有六组氨酸标签的NMNAT3或nucNMNAT3,并分析了亚细胞定位及其酶活性。如以前报道的,NMNAT3分布在细胞核之外,包括明亮的点状染色 (punctuate staining),和nucNMNAT3主要位于细胞核中,在胞质溶胶中具有一些点状染色 (图7B)。测量了 NMNAT3和nucNMNAT3的酶活性,与NMNATl相比,这两种蛋白质均具有与之相当的酶活性(图7C)。然后,在过表达这两种NMNAT3酶之后进行了体外沃勒变性测定法,我们发现,NMNAT3和nucNMNAT3的过表达均显示出与NMNATl同样程度的神经突变性的延迟(图7A、E)。通过Western印迹法确认了慢病毒介导的每种酶的表达(图7D)。这些实验确证了,靶向细胞核或者胞质溶胶的NMNAT都保护神经突免于变性。

[0128] 实施例10

[0129] 该实施例举例说明了,外源性地施加NAD生物合成相关酶的底物可保护轴突免于变性。

[0130] 前面我们已经显示了,在培养基中外源性地施加的NAD显示出体外轴突拯救效用。在此。我们显示了,NmPRT的表达还显示出轴突保护作用,这暗示了 Nam用作神经元中 NAD合成的底物。为了确定图5中所显示的哪种底物用于神经元中的NAD合成,和为了鉴定任何一种NAD前体是否可以能够类似于NAD或比NAD更好地拯救轴突,我们在培养基中施加了 Na、Nam、NmR, NaMN, NMN或NaAD,并进行了体外沃勒变性测定法。在神经突横断之前施加ImMNMN M小时成功地拯救神经突免于变性。定量分析揭示出,NMN处理导致具有与通过外源性地施加NAD而获得的神经突保护程度类似的程度的神经突保护(图8B)。这些结果进一步暗示了这样的可能性,即增加其他NAD生物合成底物的供应能够拯救神经突免于变性。然后,我们向DRG神经元外源性地施加1 mM的NAD生物合成底物(包括Na、Nam、 NaMN,NaAD和NmR) 24小时,并进行神经突横断。如图8A和B中所示,NaMN或NmR处理也和 NAD 一样可拯救神经突。NaAD显示出轻微的保护,但Na不能拯救神经突,而Na和Nam没有作用。定量分析揭示出,在横断之后48小时外源性地施加ImM的NaMN、NMN, NmR或NAD引起相当的完整神经突的增加(图8B)。因为NaMN的保护作用等同于NMN,所以在增加NaAD 的供应的情况下,通过QNS从NaAD合成NAD的步骤足以发挥拯救神经突的作用。然而,与 NAD相比,外源性地施加NaAD在48小时显示出较少的完整神经突的增加(图8B)。这表明, 在我们的测定条件下,NaAD没有足量地掺入细胞中或者不稳定。这些实验暗示,存在几种

22不同的方式来拯救神经突,包括外源性地施加NMN、NaMN、和NmR。所有这些处理似乎引起了 NAD供应的增加,这与表明NAD施加或NMNATl过表达可拯救神经突免于变性的先前实验一致。

[0131] 实施例11

[0132] 该实施例证明,玻璃体内施加NAD生物合成底物可延迟视网膜神经节细胞的轴突变性。

[0133] 视神经的横断是能够用于研究导致如下情况的机制的体内模型:在人类疾病例如青光眼中观察到的沃勒变性和随后的视网膜神经节细胞(RGC)死亡。在C57BL/Wlds小鼠品系中,在轴突切断术之后的沃勒变性期间的视神经变性显著放慢。另外,玻璃体内注射用于筛选在体内保护RGC轴突免于变性的化合物,因此,我们可以通过眼内注射化合物(包括NAD、NMN, NmR和Nam)来评测每种NAD生物合成底物的体内轴突保护作用。从体外沃勒变性测定法中,培养基中ImM的NAD、NMN和NmR足以保护轴突免于变性。我们开始时向左侧玻璃体内区室中注射入5 μ 1的IOOmM或IM NAD溶液。M小时温育之后,横断左侧视神经,并在横断之后3、4和5天收集对照视神经(右侧)和经轴突切断术的视神经(左侧)。 测量来自经轴突切断术的视神经的神经丝免疫反应性,并将其对于从视神经的右侧获得的值进行标准化。我们发现,在注射了 IM和IOOmM NAD的大鼠中,在横断之后4天的免疫反应性分别是未经轴突切断术的视神经的77 士 27%和78 士 22%,而对照动物只显示7 士 16% (图 9)。

[0134] 然后,我们向左侧玻璃体内区室中注射入5μ 1的IOOmM NMN, NmR和Nam,并在左侧视神经横断之后4天收集视神经。从注射了 NMN和NmR的视神经中获得的免疫反应性是未经轴突切断术的神经的60士25和72士 19%。注射了 Nam的动物没有显示出任何与对照动物的差异。这些结果与显示了 NAD、NMN和NmR具有轴突拯救活性但Nam没有此活性的体外研究相一致。我们的体内研究揭示了,这些参与NAD生物合成途径的小分子是用于拯救轴突免于变性的有用工具。

[0135] 特此引入在本申请中所引用的所有参考文献作为参考。在此引用的参考文献的任何讨论只是想要概括其他作者所作的论断,而不是承认任何参考文献或其部分构成了相关的现有技术。申请人保留挑战所引用的参考文献的准确性和相关性的权利。

Claims (35)

1.增加患病和/或受损的神经元和支持细胞中的sirtuin活性的药剂的用途,用于制备在有此需要的哺乳动物中治疗或预防轴突病变的药物,其中所述药剂选自:NAD、用于合成NAD的从新合成途径的中间体、NAD补救途径的中间体、烟酰胺核糖核苷激酶途径的中间体、NAD的从新合成途径的酶、NAD补救途径的酶、烟酰胺核糖核苷激酶途径的酶、编码用于合成NAD的从新合成途径的酶的核酸、编码NAD补救途径的酶的核酸、编码烟酰胺核糖核苷激酶途径的酶的核酸、增加用于合成NAD的从新合成途径的酶、NAD补救途径的酶或烟酰胺核糖核苷激酶途径的酶表达的药剂、增加用于合成NAD的从新合成途径的酶、NAD补救途径的酶或烟酰胺核糖核苷激酶途径的酶的催化活性和/或稳定性的药剂、sirtuin多肽、编码 sirtuin多肽的核酸、芪、查儿酮、黄酮、异黄烷酮、黄烷酮、儿茶素和其组合。
2.根据权利要求1的药剂的用途,其中所述药剂通过增S^Tl的活性而起作用。
3.根据权利要求1的药剂的用途,其中所述药剂是NAD、用于合成NAD的从新合成途径的中间体、NAD补救途径的中间体、烟酰胺核糖核苷激酶途径的中间体或其组合。
4.根据权利要求1的药剂的用途,其中所述药剂是NAD、烟酰胺单核苷酸、烟酸单核苷酸或烟酰胺核糖核苷。
5.根据权利要求1的药剂的用途,其中所述药剂包括用于合成NAD的从新合成途径的酶、NAD补救途径的酶或烟酰胺核糖核苷激酶途径的酶;编码用于合成NAD的从新合成途径的酶、NAD补救途径的酶或烟酰胺核糖核苷激酶途径的酶的核酸;增加用于合成NAD的从新合成途径的酶、NAD补救途径的酶或烟酰胺核糖核苷激酶途径的酶表达的药剂;或增加用于合成NAD的从新合成途径的酶、NAD补救途径的酶或烟酰胺核糖核苷激酶途径的酶的催化活性和/或稳定性的药剂。
6.根据权利要求5的药剂的用途,其中所述药剂包括烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶 (NMNAT)或编码NMNAT的核酸。
7.根据权利要求6的药剂的用途,其中所述药剂选自人NMNATl和人NMNAT3。
8.根据权利要求6的药剂的用途,其中所述药剂包括编码人NMNATl或人NMNAT3的核酸。
9.根据权利要求1的药剂的用途,其中所述药剂包括sirtuin多肽或编码sirtuin多肽的核酸。
10.根据权利要求6的药剂的用途,其中所述药剂是人SIRT1。
11.根据权利要求6的药剂的用途,其中所述药剂包括编码人SIRTl的核酸。
12.根据权利要求1的药剂的用途,其中所述药剂是芪、查儿酮、黄酮、异黄烷酮、黄烷酮或儿茶素。
13.根据权利要求12的药剂的用途,其中所述药剂是选自白藜芦醇、piceatannol, 脱氧土大黄苷、反式芪和土大黄苷的芪;选自紫铆因、isoliquiritigen和3,4,2' ,4', 6'-五羟基查儿酮的查儿酮;选自黄颜木素、5,7,3',4',5'-五羟基黄酮、木犀草素、 3,6,3',4'-四羟基黄酮、栎精、7,3',4',5'-四羟基黄酮、山奈黄素、6-羟基芹黄素、 芹黄素、3,6,2',4'-四羟基黄酮、7,4' - 二羟基黄酮、7,8,3',4'-四羟基黄酮、3,6, 2',3'-四羟基黄酮、4'-羟基黄酮、5,4' -二羟基黄酮、5,7_ 二羟基黄酮、桑色素、黄酮和5-羟基黄酮的黄酮;选自大豆黄素和染料木黄酮的异黄酮;选自柚苷配基、3,5,7,3', 4'-五羟基黄烷酮和黄烷酮的黄烷酮;或者选自(-)_表儿茶素、(-)_儿茶素、(-)_没食子儿茶素、(+)_儿茶素和(+)_表儿茶素的儿茶素。
14.根据权利要求1的药剂的用途,其中所述轴突病变是遗传的或先天的,或者与神经变性疾病、运动神经元疾病、肿瘤形成、内分泌紊舌L、代谢疾病、营养缺乏、动脉粥样硬化、自身免疫疾病、机械损伤、化学的或药物诱导的损伤、热损伤、辐射损伤、神经压迫、视网膜或视神经病症、线粒体功能障碍、进行性痴呆、脱髓鞘病、局部缺血和/或中风、传染病或者炎性疾病有关。
15.根据权利要求14的药剂的用途,其中所述轴突病变是由细胞毒性抗癌剂诱导的。
16.根据权利要求14的药剂的用途,其中所述视神经病症是青光眼、视网膜神经节变性、视神经炎和/或变性、黄斑变性、局部缺血性视神经病变、对视神经的创伤性损伤、遗传性视神经病变、代谢性视神经病变、由于毒性剂引起的神经病变、或者由不良药物反应或维生素缺乏引起的神经病变。
17.根据权利要求14的药剂的用途,其中所述与线粒体功能障碍有关的神经病变是由于氧化损害、在线粒体基因组或核基因组中编码的线粒体蛋白质的突变、暴露于毒素或者衰老的过程而造成的。
18.根据权利要求1的药剂的用途,其中所述哺乳动物是人。
19.增加患病和/或受损的神经元和/或支持细胞中NAD活性的药剂的用途,用于制备在有此需要的哺乳动物中治疗或预防轴突病变的药物。
20.根据权利要求19的药剂的用途,其中所述药剂是NAD、用于合成NAD的从新合成途径的中间体、NAD补救途径的中间体、烟酰胺核糖核苷激酶途径的中间体或其组合。
21.根据权利要求20的药剂的用途,其中所述药剂是NAD、烟酰胺单核苷酸、烟酸单核苷酸或烟酰胺核糖核苷。
22.根据权利要求19的药剂的用途,其中所述药剂包括用于合成NAD的从新合成途径的酶、NAD补救途径的酶或烟酰胺核糖核苷激酶途径的酶;编码用于合成NAD的从新合成途径的酶、NAD补救途径的酶或烟酰胺核糖核苷激酶途径的酶的核酸;增加用于合成NAD的从新合成途径的酶、NAD补救途径的酶或烟酰胺核糖核苷激酶途径的酶表达的药剂;或增加用于合成NAD的从新合成途径的酶、NAD补救途径的酶或烟酰胺核糖核苷激酶途径的酶的催化活性和/或稳定性的药剂。
23.根据权利要求22的药剂的用途,其中所述药剂包括烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶 (NMNAT)或编码NMNAT的核酸。
24.根据权利要求23的药剂的用途,其中所述药剂选自人NMNATl和人NMNAT3。
25.根据权利要求23的药剂的用途,其中所述药剂包括编码人NMNATl或人NMNAT3的核酸。
26.根据权利要求19的药剂的用途,其中所述轴突病变是遗传的或先天的,或者与神经变性疾病、运动神经元疾病、肿瘤形成、内分泌紊乱、代谢疾病、营养缺乏、动脉粥样硬化、 自身免疫疾病、机械损伤、化学的或药物诱导的损伤、热损伤、辐射损伤、神经压迫、视网膜或视神经病症、线粒体功能障碍、进行性痴呆、脱髓鞘病、局部缺血和/或中风、传染病或者炎性疾病有关。
27.根据权利要求沈的药剂的用途,其中所述轴突病变是由细胞毒性抗癌剂诱导的。
28.根据权利要求14的药剂的用途,其中所述视神经病变是青光眼、视网膜神经节变性、视神经炎和/或变性、黄斑变性、局部缺血性视神经病变、对视神经的创伤性损伤、遗传性视神经病变、代谢性视神经病变、由于毒性剂引起的神经病变、或者由不良药物反应或维生素缺乏引起的神经病变。
29.根据权利要求沈的药剂的用途,其中所述与线粒体功能障碍有关的神经病变是由于氧化损害、在线粒体基因组或核基因组中编码的线粒体蛋白质的突变、暴露于毒素或者衰老的过程而造成的。
30.根据权利要求19的药剂的用途,其中所述哺乳动物是人。
31.筛选用于在哺乳动物中治疗神经病变的药剂的方法,所述方法包括在体外或体内向哺乳动物神经元细胞施用候选药剂;给所述神经元细胞造成轴突损伤;和检测在受损的神经元细胞中轴突变性的减少。
32.根据权利要求31的方法,其中给所述神经元细胞造成轴突损伤包括化学损伤神经元细胞、热损伤神经元细胞、使神经元细胞缺氧、物理损伤神经元细胞、抑制能量代谢或其组合。
33.筛选用于在哺乳动物中治疗神经病变的药剂的方法,所述方法包括检测细胞中由候选药剂引起的NAD活性的增加。
34.筛选增加神经元中的sirtuin活性的药剂的方法,所述方法包括在体外或体内向哺乳动物神经元细胞施用候选药剂;给所述神经元细胞造成轴突损伤;和检测在受损的神经元细胞中轴突变性的减少。
35.筛选增加神经元中的NAD活性的药剂的方法,所述方法包括在体外或体内向哺乳动物神经元细胞施用候选药剂;给所述神经元细胞造成轴突损伤;和检测在受损的神经元细胞中轴突变性的减少。
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SAMSAM et al..the wld mutantion delays robust loss of motor and sensoryaxons in a genetic model for myelin-related axonopathy.The Journal of Neuroscience23.2003,232833-2839.

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