JP2020530460A - ニコチンアミドモノヌクレオチドを使用する治療の組成物および方法 - Google Patents

ニコチンアミドモノヌクレオチドを使用する治療の組成物および方法 Download PDF

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Abstract

筋疾患、２型糖尿病、および／または肥満などの加齢関連症状および他の医学症状を治療するための種々の方法と組成物が提供される。さらに、ＮＭＮの細胞内取込みを亢進し、ＮＡＤ＋の産生を刺激する方法が記載される。Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む、種々の哺乳動物細胞および哺乳動物細胞株が記載される。Ｓｌｃ１２ａ８をコードする核酸を含む遺伝子治療ベクター、およびＳｌｃ１２ａ８遺伝子に不活性化変異を含む非ヒト動物も開示される。また、ＮＭＮ輸送を亢進する化合物を同定するための候補化合物をスクリーニングするための方法も記載される。

Description

政府の補助の宣言
本発明は米国国立衛生研究所から授与されたＡＧ０４７９０２およびＡＧ０３７４５７の下で政府の支援により遂行された。政府は本発明に特定の権利を保有する。
［配列リストへの参照］
本開示の一部である配列リストは、本発明のプライマー、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を含むテキストファイルを含んでいる。配列リストの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。コンピュータ読み出し可能な形式で記録された情報は、記述された配列リストと同一である。
本開示は、筋疾患、２型糖尿病、および／または肥満などの加齢関連症状および他の医学症状の治療のための種々の方法と組成物に関する。ＮＭＮの細胞内取込みを亢進させる方法およびＮＡＤ＋の産生を刺激する方法も記載される。Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質をコードするｃＤＮＡを含むものを含み、種々の哺乳動物細胞および哺乳動物細胞株が記載される。Ｓｌｃ１２ａ８をコードする核酸を含む遺伝子治療ベクターおよびＳｌｃ１２ａ８遺伝子に不活性化変異を含む非ヒト動物も開示される。さらに、ＮＭＮの輸送を亢進する化合物を同定するための候補化合物をスクリーニングするための方法も記載される。
ＮＡＤ＋は多くの細胞の酸化還元反応に関与する普遍的で必須の補酵素である。ＮＡＤ＋は、サーチュインファミリーのＮＡＤ＋依存性タンパク質デアセチラーゼ、ポリ−ＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰｓ）、およびＣＤ３８／１５７ＮＡＤ＋ヒドロラーゼ／サイクリックＡＤＰ−リボースシンターゼを含む、ＮＡＤ＋消費酵素の活性のためにも必要とされる（Canto, C., et al., Cell Metab., 22, 304, 31-53, 2015; Imai, S. and Guarente, L., Trends in Cell Biology, 24, 306, 464-471, 2014）。ＮＡＤ＋を産生するために、哺乳動物はトリプトファン、ニコチンアミドおよびニコチン酸（ビタミンＢ３の２つの形式としても知られる）、およびニコチンアミドリボシド（ＮＲ）およびニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）を含む中間体などの種々の前駆体を利用する。ニコチンアミドから始まるサルベージ経路は、哺乳動物における主要なＮＡＤ＋生合成経路である（Garten, A., et al., Nat. Rev. Endocrinol., 11, 535-546, 2015; Imai, S., Curr. Pharm. Des., 15, 20-28, 2009）。この経路では、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）がニコチンアミドと５’−ホスホリボースピロホスフェートからＮＭＮを産生する。その後、ＮＭＮはＡＴＰとともにＮＭＮアデニリルトランスフェラーゼ、ＮＭＮＡＴ１−３、によりＮＡＤ＋に変換される。ＮＡＭＰＴ反応の生成物はＮＭＮであり、キーとなるＮＡＤ＋中間体である。哺乳動物において、ＮＡＭＰＴは律速となるＮＡＤ＋生合成酵素である。いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、ＮＭＮは、種々の病気の症状の予防および／または治療、および加齢関連の生理的機能低下の緩和に関連して有用であると考えられる。しかしながら、ＮＭＮ輸送のメカニズムについては議論の余地がある。
Ｓｌｃ１２ａ８はＧａｇｎｏｎ，Ｋ．Ｂ．とＤｅｌｐｉｒｅ，Ｅ．により最初に同定された（Am. J. Physiol. Cell Physiol., 304, C693-714, 2013）。しかしながら、GagnonらはＳｌｃ１２ａ８の機能を同定しなかった。Ｋｕｂｏ，Ｙ．らは、Ｓｌｃ１２ａ８をスペルミントランスポーターとして同定したが（Exp. Eye Res., 124, 17-23, 2014）、それがＮＭＮ輸送に関与することは開示しなかった。
それを必要とする対象の加齢関連症状を治療する種々の方法が提供される。典型的には、その方法は、治療有効量のニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）ならびにニコチン酸、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロール、β−ピリジルカルビノール、ヘキサニコチン酸イノシトール、そのいずれかのエステル、そのいずれかの薬学的に許容可能な塩、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つの追加の化合物を対象に投与することを含み、ここで加齢関連症状には、インスリン感受性の損失、インスリン分泌の損失、インスリンの作用および分泌の損失、記憶機能の障害、眼機能の低下、網膜の変性、機能低下、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つの症状が含まれる。
他の方法は、それを必要とする対象の医学的症状の治療に関する。その方法は、治療有効量のニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）ならびにニコチン酸、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロール、β−ピリジルカルビノール、ヘキサニコチン酸イノシトール、そのいずれかのエステル、そのいずれかの薬学的に許容可能な塩、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つの化合物を対象に投与することを含み、ここで医学的症状には、筋疾患、２型糖尿病、肥満、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つが含まれる。
それを必要とする対象のＮＭＮの細胞内取込みを亢進させる方法も提供される。これらの方法は、ニコチン酸、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロール、β−ピリジルカルビノール、ヘキサニコチン酸イノシトール、そのいずれかのエステル、そのいずれかの薬学的に許容可能な塩、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される治療有効量の化合物を対象に投与することを含む。
それを必要とする対象のＮＡＤ＋の産生を刺激し、および／または細胞内へのＮＭＮ取込みを亢進させる方法が提供される。方法は、治療有効量のＳｌｃ１２ａ８をコードする核酸を対象に投与することを含む。
遺伝子治療ベクターが提供される。遺伝子治療ベクターはＳｌｃ１２ａ８をコードする核酸を含む。
非ヒト動物が提供される。非ヒト動物はＳｌｃ１２ａ８遺伝子に不活性化変異を含む。
哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株が提供される。哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株は、Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。ｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２（マウスＳｌｃ１２ａ８タンパク質）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３（マウスＳｌｃ１２ａ８変異体Ａタンパク質）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（マウスＳｌｃ１２ａ８変異体Ｂタンパク質）、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５（ヒトＳｌｃ１２ａ８タンパク質）を含む。
さらなる哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株が提供される。哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株は、Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。ｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の相同性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。
さらに別の哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株が提供される。哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株は、Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。ｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）またはＳｌｃ１２ａ８ ヒト全長ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の配列相同性を有するｃＤＮＡ配列を含む。
別の哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株が提供される。細胞または細胞株は、Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。細胞または細胞株は胎盤由来細胞を含まない。
ＮＭＮの輸送を調節する化合物を同定するための候補化合物をスクリーニングする方法が提供される。方法は、（ａ）候補化合物を、ＮＭＮトランスポータータンパク質を発現している細胞またはＮＭＮトランスポータータンパク質を含むプロテオリポソームと接触させること、および（ｂ）細胞中でのＮＭＮトランスポータータンパク質の発現または活性の変化、またはプロテオリポソーム中でのＮＭＮトランスポータータンパク質の活性の変化を検出することを含む。候補化合物との接触に引き続く、細胞内でのＮＭＮトランスポータータンパク質の発現または活性の変化、またはプロテオリポソーム中でのＮＭＮトランスポータータンパク質の活性の変化は、候補化合物がＮＭＮの輸送を調節することを示唆する。
医薬組成物が提供される。医薬組成物はＮＭＮおよびＮＭＮトランスポーターのアゴニストを含む。
さらなる医薬組成物が提供される。医薬組成物はＮＭＮおよびＳｌｃ１２ａ８またはその同族体の遺伝子発現誘発物質を含む。
図１は、ＦＫ８６６で処理した初代肝細胞、膵島および海馬球状細胞塊において一般に上方制御されている遺伝子のベン図である。
図２は、３月齢Ｂ６雄性マウス由来の異なる組織におけるＳｌｃ１２ａ８ ｍＲＮＡの発現を示す。
図３は、０．１％ＤＭＳＯ、ＦＫ８６６単独またはＦＫ８６６プラスＮＭＮで処理した初代マウス肝細胞、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞、および空腸および回腸のエクスビボ外植片におけるＳｌｃ１２ａ８ ｍＲＮＡの発現変化を示す。
図４は、ＤＭＳＯ、ＦＫ８６６単独およびＦＫ８６６プラスＮＭＮで処理した初代マウス肝細胞およびＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞における細胞内ＮＡＤ＋含量を示す。
図５は、ＦＫ８６６およびＦＫ８６６プラスＮＭＮで４８時間処理したＮＩＨ３Ｔ３細胞において測定した、表面および細胞内Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質発現レベルのフローサイトメトリーのデータを示す。
図６は、後述するＮＭＮ経路阻害剤で処理した初代マウス肝細胞における外因性ＮＭＮ取込みの経時変化を示す。
図７は、初代マウス肝細胞におけるＳｌｃ１２ａ８およびＮｒｋ１ ｍＲＮＡサイレンシングに対するノックダウン効率を示す。
図８は、Ｓｌｃ１２ａ８およびＮｒｋ１ ｍＲＮＡサイレンシングに付した細胞のＨＰＬＣで測定した細胞内ＮＭＮ含量を示す。
図９は、対照およびＳｌｃ１２ａ８−ＯＥ ＮＩＨ３Ｔ３細胞の原形質膜画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより明らかになったＳｌｃ１２ａ８タンパク質発現を示す。
図１０は、対照およびＳｌｃ１２ａ８−ＯＥ ＮＩＨ３Ｔ３細胞のカベオリン−１タンパク質レベルに正規化したＳｌｃ１２ａ８タンパク質レベルを示す。
図１１は、Ｓｌｃ１２ａ８過剰発現および対照ＮＩＨ３Ｔ３細胞における３Ｈ−ＮＭＮの細胞内取込みを示す。
図１２は、３Ｈ−ＮＭＮの細胞内取込みに対する細胞内ＮＭＮをプロットすることによるミカエリス・メンテン動力学の計算を示す。
図１３は、Ｓｌｃ１２ａ８−ＯＥ細胞または対照細胞に由来するプロテオリポソームの３Ｈ−ＮＭＮの取込みを示す。
図１４は、Ｓｌｃ１２ａ８の基質特異性を決定するための非標識ＮＡＤ＋関連化合物に対する３Ｈ−ＮＭＮの置換を示す。
図１５は、プロテオリポソームシステムを使用したＮＭＮおよびＮＲのＩＣ５０の決定を示す。
図１６は、プロテオリポソームによる３Ｈ−ＮＭＮの取込みに対してＮａ＋をＬｉ＋で置換した効果を示す。
図１７は、ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）ｓｈＲＮＡおよびＳｌｃ１２ａ８ ｓｈＲＮＡを感染させたマウスの空腸および回腸組織試料の代表的ウエスタンブロットを示す。
図１８は、ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）ｓｈＲＮＡおよびＳｌｃ１２ａ８ ｓｈＲＮＡを感染させたマウスの空腸および回腸組織試料の発現レベルをＧＡＰＤＨに対して正規化した棒グラフを示す。
図１９は、対照およびＳｌｃ１２ａ８ノックダウンマウスのＮＭＮの経口強制投与後６０分間にわたってＨＰＬＣにより測定したマウスのインビボ血漿ＮＭＮレベルを示す。
図２０は、対照およびＳｌｃ１２ａ８ノックダウンマウスにおいてＮＭＮの経口強制投与後６０分間にわたってＨＰＬＣにより測定したマウスのインビボ血漿ニコチンアミドレベルを示す。
図２１は、対照およびＳｌｃ１２ａ８ノックダウンマウスにおいてＮＭＮの経口強制投与後６０分間にわたって採取した空腸組織試料中のＮＡＤ濃度を示す。
図２２は、対照およびＳｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスの種々の組織におけるＳｌｃ１２ａ８ ｍＲＮＡの発現を示す。
図２３は、ウエスタンブロットによるＳｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスの十二指腸、空腸、回腸、および膵臓におけるＳｌｃ１２ａ８タンパク質の欠如を示す。
図２４は、ウエスタンブロットによるＳｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスの視床下部におけるＳｌｃ１２ａ８タンパク質の欠如を示す
図２５Ａ−Ｂは、Ｓｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスから採取した種々の組織試料中の明期および暗期のＮＡＤ＋レベルを示す。
図２６は、Ｓｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスおよびその野生型同腹仔に対する強制投与後の１８Ｏ−Ｄ−ＮＭＮの取込みを示す。
図２７は、野生型同腹仔と比較したＳｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスの食餌摂取を示す。
図２８は、野生型同腹仔と比較したＳｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスの体脂肪率と除脂肪量率を示す。
図２９は、野生型同腹仔と比較したＳｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスの糞便中脂質含量を示す。
図３０は、野生型同腹仔と比較したＳｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスの酸素消費量を示す。
図３１は、野生型同腹仔と比較したＳｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスのエネルギー消費量を示す。
図３２は、野生型同腹仔と比較したＳｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスの歩行数を示す。
図３３は、野生型同腹仔と比較したＳｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスの下気道呼吸交換比を示す。
図３４は、野生型同腹仔と比較したＳｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスのグルコースレベルを示す。
図３５は、野生型同腹仔と比較したＳｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスのインスリンレベルを示す。
図３６は、野生型同腹仔と比較したＳｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスのトリグリセリドレベルを示す。
図３７は、野生型同腹仔と比較したＳｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスの空腹時および再給餌時の血漿ＧＬＰ−２レベルを示す。
図３８は、野生型同腹仔と比較したＳｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスの弓状核におけるＣｈｏｐおよびＳｏｃｓ３の相対的ｍＲＮＡ発現を示す。
図３９は、野生型同腹仔と比較した不断給餌Ｓｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスの肝臓におけるＰｅｐｃｋおよびＧ６ｐｃの発現を示す。
図４０は、野生型同腹仔と比較したＳｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスにおけるＰＭＣＨ ｍＲＮＡの発現を示す。
図４１は、Ｓｌｃ１２ａ８過剰発現構成体を有するか、または有しないＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＮＡＤ＋生合成阻害剤の効果を示す。
図４２は、Ｓｌｃ１２ａ８を含有するプロテオリポソームへの３Ｈ−標識ＮＭＮ（３Ｈ−ＮＭＮ）取込みのニコチン酸（ＮＡ）による亢進を示す。
図４３は、２月齢マウスに対して２４月齢マウスの空腸および回腸において低下したＮＡＤ＋レベルを示す。
図４４は、２月齢および２４月齢マウスの空腸および回腸におけるＳｌｃ１２ａ８の発現を示す。
図４５は、２月齢および２４月齢の腸Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンマウスの４日間の食餌摂取量を示す。
図４６は、消化管におけるＳｌｃ１２ａ８ノックダウンを有するか、または有しない２月齢および２４月齢マウスの空腹時グルコースレベルを示す。
図４７は、Ｓｌｃ１２ａ８および対照マウスのＧＬＰ−１レベルに対する２４時間絶食後の再給餌の効果を示す。
図４８は、２月齢の腸Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンマウスおよび対照マウスの回腸溶解物中のＳｌｃ１２ａ８およびＧＡＰＤＨのウエスタンブロットを示す。
図４９は、２４月齢の腸Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンマウスおよび対照マウスの回腸溶解物中のＳｌｃ１２ａ８およびＧＡＰＤＨのウエスタンブロットを示す。
図５０は、２月齢および２４月齢の腸Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンマウスおよび対照マウスの回腸中のＮＡＤ＋レベルを示す。
図５１は、２４月齢の腸Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンマウスおよび対照マウスのエクスビボ外植片由来の上清のＧＬＰ−１レベルのＥＬＩＳＡを示す。
図５２は、１２月齢のＳｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスおよび対照マウスの外植片中のＧＬＰ−１レベル（左）および試料中のＮＡＤ＋レベル（右）を示す。
図５３は、ＳＩＲＴファミリー阻害剤で処理した外植片中または対照のＧＬＰ−１レベルを示す。
本明細書において開示するのは細胞へのＮＭＮの取込みを亢進させる方法である。また、そのためにＳｌｃ１２ａ８およびＮＭＮの輸送の研究に有用な細胞株も開示する。また本発明者は細胞内へのＮＭＮの取込みを亢進させるトランスポーターＳｌｃ１２ａ８も同定した。
本明細書において開示する方法は、限定はされないが、２型糖尿病、肥満、加齢関連肥満、加齢関連血中脂質レベルの上昇、加齢関連インスリン感受性の低下、加齢関連記憶機能の損失または低下、加齢関連眼機能の損失または低下、加齢関連生理機能の低下、グルコース刺激インスリン分泌の障害、糖尿病、ミトコンドリア機能の改善、神経死、および／またはアルツハイマー病における認知機能、虚血／再灌流傷害からの心臓の保護、神経幹／前駆細胞集団の保持、傷害後の骨格筋ミトコンドリア機能および動脈機能の回復、および加齢関連機能低下などのＮＭＮの代謝が関与するいずれの病気または症状をも治療、改善、緩和、または回復するために使用することができる。
本教示は、限定はされないが、
１．マウスＳｌｃ１２ａ８ ｍＲＮＡまたはヒトＳｌｃ１２ａ８ ｍＲＮＡなどの哺乳動物Ｓｌｃ１２ａ８ ｍＲＮＡの全長ｃＤＮＡ、
２．マウスＳｌｃ１２ａ８ポリペプチドまたはヒトＳｌｃ１２ａ８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、
３．全長Ｓｌｃ１２ａ８ ｃＤＮＡなどのＳｌｃ１２ａ８ ｃＤＮＡを含む哺乳動物発現ベクター、
４．全長マウスＳｌｃ１２ａ８ ｃＤＮＡ（Ｓｌｃ１２ａ８−ＯＥ細胞）または全長ヒトＳｌｃ１２ａ８ ｃＤＮＡなどのＳｌｃ１２ａ８ ｃＤＮＡを過剰発現する細胞株を含み、Ｓｌｃ１２ａ８ ｃＤＮＡを内部に含むＮＩＨ３Ｔ３細胞株などの細胞株、
５．Ｓｌｃ１２ａ８ ｍＲＮＡの発現を低下またはサイレンス化させるｓｈＲＮＡを内部に含むレンチウイルス、
６．マウスＳｌｃ１２ａ８タンパク質またはヒトＳｌｃ１２ａ８タンパク質などのＳｌｃ１２ａ８タンパク質のＮ末端および内部ドメインに対する、ウサギポリクローナル抗体を含むポリクローナル抗体、
７．全臓器的なＳｌｃ１２ａ８ノックアウトマウス
を含む。
本教示は膜二重層に内包されたＳｌｃ１２ａ８タンパク質などの輸送タンパク質を有するリポソームを含むプロテオリポソームシステムを含む。そのようなシステムはＳｌｃ１２ａ８タンパク質の解析、および候補薬物のＳｌｃ１２ａ８に対する親和性試験に使用、またはＳｌｃ１２ａ８の活性に対するアゴニストまたはアンタゴニストとしての活性試験に使用することができる。
本教示は細胞、組織、および消化管などの器官におけるＮＭＮ取込みを促進する方法を含む。これらの方法はＳｌｃ１２ａ８のｃＤＮＡを消化管に投与することを含むことができる。これらの方法はＳｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡを含むレンチウイルスを消化管に投与することを含むことができる。
ＮＭＮ取込みを促進する方法はナトリウム塩と併用でＮＭＮを投与することを含むことができる。例えば、投与は経口投与とすることができる。
本教示はＮＭＮの取込みを亢進させるためにニコチン酸（ＮＡ）またはＮＡ誘導体化合物（すなわち、ＮＡの構造同族体）を、それを必要とする対象に投与することを含む。本教示は、それを必要とする対象におけるＳｌｃ１２ａ８ ＮＭＮトランスポーターの取込み機能を亢進させるためのニコチン酸（ＮＡ）またはＮＡ誘導体化合物の投与を含む。ニコチン酸（ＮＡ）またはＮＡ誘導体化合物（すなわち、ＮＡの構造同族体）は、限定はされないが、ＮＡまたはＮＡ誘導体化合物として１０−５００ｍｇ／日または５０−５００ｍｇ／日などの用量範囲で、それを必要とする対象に投与することができる。投与は、経口投与、非経口投与、またはそのいずれかの組み合わせとすることができる。
本教示はそれを必要とする対象におけるＮＭＮの取込みを促進または加速させるために、ＮＭＮと併用でＮＡまたはＮＡ誘導体化合物を投与することを含み、それはＳｌｃ１２ａ８ ＮＭＮトランスポーターのＮＭＮ取込み機能を亢進させることによる。そのような併用は、限定はされないが、ＮＭＮおよびＮＡまたはＮＡ誘導体化合物として１０〜５００ｍｇ／日または５０〜５００ｍｇ／日などの用量範囲で、それを必要とする対象に投与することができる。投与は、経口投与、非経口投与、またはそのいずれかの組み合わせとすることができる。
本教示はそれを必要とする対象におけるＮＭＮの取込みを促進させるために、ＮＭＮと塩（例えば、Ｎａ＋）の併用投与を含む。併用は経口投与で併用とすることができる。併用は非経口投与で併用とすることができる。ＮＭＮとナトリウム塩などのＮＭＮ取込み促進塩は、限定はされないが、各々１０〜５００ｍｇ／日または５０〜５００ｍｇ／日などの用量範囲で投与することができる。
本教示はそれを必要とする対象におけるＮＭＮの取込みを促進させるために、ＮＭＮ、ナトリウム塩、およびニコチン酸（ＮＡ）もしくはＮＡ誘導体化合物の併用投与を含むことができる。ＮＭＮ、ナトリウム塩、およびニコチン酸（ＮＡ）もしくはＮＡ誘導体化合物の内の１つまたはいずれの併用も経口投与することができる。投与は、ＮＭＮ、ナトリウム塩、およびニコチン酸（ＮＡ）もしくはＮＡ誘導体化合物の内のいずれかまたは全ての経口投与を含むことができる。ＮＭＮ、ナトリウム塩、およびニコチン酸（ＮＡ）もしくはＮＡ誘導体化合物は、それを必要とする対象に、限定はされないが、各々１０〜５００ｍｇ／日または５０〜５００ｍｇ／日などの用量範囲で投与することができる。
本教示は、それを必要とする対象においてＳｌｃ１２ａ８ ＮＭＮトランスポーターのＮＭＮ取込み機能を抑制するために、ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）またはＮＲ誘導体化合物の投与も含む。ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）またはＮＲ誘導体化合物は経口で投与することができる。ＮＲまたはＮＲ誘導体化合物は、それを必要とする対象に、限定はされないが、１０〜５００ｍｇ／日または５０〜５００ｍｇ／日などの用量範囲で投与することができる。
本教示は、それを必要とする対象においてＳｌｃ１２ａ８ ＮＭＮトランスポーターのＮＭＮ取込み機能を抑制するために、例えばリチウム塩などの非ナトリウム塩の投与も含む。非ナトリウム塩は経口で投与することができる。非ナトリウム塩は、それを必要とする対象に、限定はされないが、１０〜５００ｍｇ／日または５０〜５００ｍｇ／日などの用量範囲で投与することができる。
本教示は、それを必要とする対象においてＳｌｃ１２ａ８ ＮＭＮトランスポーターのＮＭＮ取込み機能を抑制するために、例えばリチウム塩などの非ナトリウム塩などを併用した、ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）またはＮＲ誘導体化合物の投与を含む。ＮＲもしくはＮＲ誘導体化合物、および／または非ナトリウム塩は経口で投与することができる。ＮＲもしくはＮＲ誘導体化合物および非ナトリウム塩は、それを必要とする対象に、限定はされないが、１０〜５００ｍｇ／日または５０〜５００ｍｇ／日などの用量範囲で投与することができる。
本教示は対象におけるＮＡＤ＋産生を刺激する方法を開示する。本方法は、それを必要とする対象に、Ｓｌｃ１２ａ８をコードする遺伝子ＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む核酸を投与することを含むことができる。核酸は、限定はされないが、ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、またはＳｌｃ１２ａ８ヒト全長ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）などと表記された配列を有するｃＤＮＡなどのＳｌｃ１２ａ８をコードする遺伝子ＤＮＡまたはｃＤＮＡを含むレンチウイルスであり得るか、またはそれを含むことができる。対象には哺乳動物（例えば、マウス、ラット、またはヒト）があげられる。Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％の配列相同性、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）と少なくとも７０％の配列相同性、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）と少なくとも７０％の配列相同性、またはＳｌｃ１２ａ８ヒト全長ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と少なくとも７０％の配列相同性を有する配列であり得る。Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１の配列であり得る、またはＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有することができる。
Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の配列であり得る、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有することができる。
Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０と表記されたＳｌｃ１２ａ８マウス変異体Ｂの配列であり得る、またはＳｌｃ１２ａ８マウス変異体Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有することができる。
Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１と表記されたＳｌｃ１２ａ８ヒト全長配列の配列であり得る、またはＳｌｃ１２ａ８ヒト全長配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有することができる。
本教示は対象における細胞へのＮＭＮ取込みを促進または亢進させる方法を含む。本方法は、それを必要とする対象に、Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡ、またはＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、またはＳｌｃ１２ａ８ヒト全長ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と少なくとも７０％の配列相同性を有する配列を含む核酸を投与することを含むことができる。ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％の配列相同性を有する配列は、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有することができる。Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）と少なくとも７０％の配列相同性を有する配列は、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）と少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有することができる。Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）と少なくとも７０％の配列相同性を有する配列は、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）と少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有することができる。Ｓｌｃ１２ａ８ヒト全長ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と少なくとも７０％の配列相同性を有する配列は、Ｓｌｃ１２ａ８ヒト全長ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有することができる。ｃＤＮＡは消化管に投与することができる。この投与は強制投与による投与を含むことができる。この投与は、小腸において溶解するように設計された経口製剤を含むことができる。
本教示はＳｌｃ１２ａ８遺伝子における欠損を含むノックアウトマウスを含む。この欠損はＳｌｃ１２ａ８遺伝子の完全な欠損、または例えば、限定はされないが、Ｓｌｃ１２ａ８遺伝子のエクソン４の欠損、もしくはＳｌｃ１２ａ８遺伝子のエクソン４内の欠損などのＳｌｃ１２ａ８遺伝子の部分的欠損でもあり得る。
本教示は、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、またはＳｌｃ１２ａ８ヒト全長ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と表記された配列などの、Ｓｌｃ１２ａ８遺伝子またはｃＤＮＡの導入された配列を含む哺乳動物細胞株を含む。導入されたＳｌｃ１２ａ８遺伝子またはｃＤＮＡは、外因性起源またはホスト哺乳動物細胞株と同種であり得る。哺乳動物細胞株は、Ｓｌｃ１２ａ８遺伝子またはｃＤＮＡが導入されなかった親細胞株よりも高レベルでＳｌｃ１２ａ８ポリペプチドを発現することができる。
本教示は非天然、即ち形質転換または形質移入により細胞に導入され、そして、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、またはＳｌｃ１２ａ８ヒト全長ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）の配列と少なくとも７０％の配列相同性を有する、配列を含む哺乳動物細胞株を含む。ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％の配列相同性を有する配列は、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有することができる。Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）と少なくとも７０％の配列相同性を有する配列は、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）と少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有することができる。Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）と少なくとも７０％の配列相同性を有する配列は、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）と少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有することができる。Ｓｌｃ１２ａ８ヒト全長ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と少なくとも７０％の配列相同性を有する配列は、Ｓｌｃ１２ａ８ヒト全長ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有することができる。
本教示は、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、またはＳｌｃ１２ａ８ヒト全長ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）などのＳｌｃ１２ａ８配列を含む哺乳動物細胞株を含む。本教示の細胞株のＳｌｃ１２ａ８配列はホスト細胞と異種起源でもあり得る。
本教示の細胞株は、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、またはＳｌｃ１２ａ８ヒト全長ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と少なくとも７０％の配列相同性を有する配列であり得るＳｌｃ１２ａ８配列を含むことができる。配列はＳｌｃ１２ａ８をコードする遺伝子またはｃＤＮＡの配列であり得る。本教示の細胞株のＳｌｃ１２ａ８をコードする遺伝子またはｃＤＮＡはホスト細胞と異種起源であり得る。Ｓｌｃ１２ａ８をコードする配列を含む細胞株は、さらにＳｌｃ１２ａ８をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。細胞株は哺乳動物細胞株であり得る。哺乳動物細胞株はＣＤ７３活性を損失、ＣＤ３８活性を損失、またはＣＤ７３活性とＣＤ３８活性の両方を損失することもできる。哺乳動物細胞株はＮＩＨ３Ｔ３細胞株であり得る。哺乳動物細胞株は、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、またはＳｌｃ１２ａ８ヒト全長ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と少なくとも７０％の配列相同性を有する配列を含む安定的に形質転換された細胞株であり得る。ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％の配列相同性を有する配列は、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有することができる。哺乳動物細胞株は、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％の配列相同性を有する配列を用いて一過的に形質移入することができる。ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％の配列相同性を有する配列は、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有することができる。哺乳動物細胞株は、マウス細胞株、ラット細胞株、またはヒト細胞株であり得る。哺乳動物細胞株は、マウス細胞株およびラット細胞株から成る群から選択することができる。哺乳動物細胞株はヒト細胞株であり得る。ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、またはＳｌｃ１２ａ８ヒト全長ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と少なくとも７０％の配列相同性を有する配列は、全長Ｓｌｃ１２ａ８ｃＤＮＡであり得る。
本教示の方法は、それを必要とする対象におけるＮＭＮの細胞内取込みを亢進させる方法を含むことができる。これらの方法は、それを必要とする対象に、治療有効量のニコチン酸またはそのエステルまたは薬学的に許容可能なその塩を投与することを含むことができる。ニコチン酸のエステルまたは薬学的に許容可能なその塩は、
Figure 2020530460
 の構造または薬学的に許容可能なその塩であり得、ここでＲはＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−オクチル、２−クロロエチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、２−メトキシエチル、２−ブトキシエチル、カルバモイルメチル、１−カルバモイルエチル、２−ジメチルアミノエチル、３−アミノプロピル、テトラヒドロフルフリル、ベンジル、フェノキシエチル、ｐ−クロロフェニル、およびｐ−ニトロフェニルから成る群から選択することができる。ＲはＨ、２−ジメチルアミノエチル、ｐ−クロロフェニル、またはｐ−ニトロフェニルであり得る。ＲはＨ、２−ジメチルアミノエチル、ｐ−クロロフェニル、およびｐ−ニトロフェニルから成る群から選択することができる。Ｒは２−ジメチルアミノエチル、ｐ−クロロフェニル、およびｐ−ニトロフェニルから成る群から選択することができる。ＲはＨ、Ｃ１〜Ｃ６直鎖アルキル、Ｃ３〜Ｃ６分岐鎖アルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６直鎖アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６分岐鎖アルコキシおよびＣ３〜Ｃ６シクロアルコキシから成る群から選択することができる。ＲはＨ、Ｃ１〜Ｃ６直鎖アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６分岐鎖アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６直鎖ハロアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６分岐鎖ハロアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６シクロハロアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６直鎖ヒドロキシアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６分岐鎖ヒドロキシアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６シクロヒドロキシアルコキシ、アルコキシメチル、アルコキシエチル、アルコキシアルコキシメチル、アルコキシアルコキシエチル、ベンジル、アルコキシベンジル、ナフチルおよびアルコキシナフチルから成る群から選択することができる。
Ｒは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−オクチル、２−クロロエチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、２−メトキシエチル、２−ブトキシエチル、カルバモイルメチル、１−カルバモイルエチル、２−ジメチルアミノエチル、３−アミノプロピル、テトラヒドロフルフリル、ベンジル、フェノキシエチル、ｐ−クロロフェニル、およびｐ−ニトロフェニルから成る群から選択することができる。Ｒは２−ジメチルアミノエチル、ｐ−クロロフェニル、またはｐ−ニトロフェニルであり得る。Ｒは２−ジメチルアミノエチル、ｐ−クロロフェニル、およびｐ−ニトロフェニルから成る群から選択することができる。Ｒは２−ジメチルアミノエチル、ｐ−クロロフェニル、およびｐ−ニトロフェニルから成る群から選択することができる。Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６直鎖アルキル、Ｃ３〜Ｃ６分岐鎖アルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６直鎖アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６分岐鎖アルコキシおよびＣ３〜Ｃ６シクロアルコキシから成る群から選択することができる。Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６直鎖アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６分岐鎖アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６直鎖ハロアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６分岐鎖ハロアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６シクロハロアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６直鎖ヒドロキシアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６分岐鎖ヒドロキシアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６シクロヒドロキシアルコキシ、アルコキシメチル、アルコキシエチル、アルコキシアルコキシメチル、アルコキシアルコキシエチル、ベンジル、アルコキシベンジル、ナフチルおよびアルコキシナフチルから成る群から選択することができる。
本教示はそれを必要とする対象におけるＮＭＮの細胞内取込みを亢進させる方法を含む。これらの方法は、対象に化合物または薬学的に許容可能なその塩を投与することを含むことができ、化合物はニコチン酸
Figure 2020530460
 ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロール、β−ピリジルカルビノールまたはヘキサニコチン酸イノシトールであり得る。化合物は、ニコチン酸、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロール、β−ピリジルカルビノールおよびヘキサニコチン酸イノシトールから成る群から選択することができる。化合物または薬学的に許容可能なその塩は、ニコチン酸または薬学的に許容可能なその塩であり得る。投与は、１日当たり５０−５００ｍｇのニコチン酸または薬学的に許容可能なその塩を投与することを含むことができる。投与は、１日当たり５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、または５００ｍｇのニコチン酸または薬学的に許容可能なその塩を投与することを含むことができる。投与は、１日当たり５０−５５、５５−６０、６０−６５、６５−７０、７０−７５、７５−８０、８０−８５、８５−９０、９０−９５、９５−１００、１００−１０５、１０５−１１０、１１０−１１５、１１５−１２０、１２０−１２５、１２５−１３０、１３０−１３５、１３５−１４０、１４０−１４５、１４５−１５０、１５０−１５５、１５５−１６０、１６０−１６５、１６５−１７０、１７０−１７５、１７５−１８０、１８０−１８５、１８５−１９０、１９０−１９５、１９５−２００、２００−２０５、２０５−２１０、２１０−２１５、２１５−２２０、２２０−２２５、２２５−２３０、２３０−２３５、２３５−２４０、２４０−２４５、２４５−２５０、２５０−２５５、２５５−２６０、２６０−２６５、２６５−２７０、２７０−２７５、２７５−２８０、２８０−２８５、２８５−２９０、２９０−２９５、２９５−３００、３００−３０５、３０５−３１０、３１０−３１５、３１５−３２０、３２０−３２５、３２５−３３０、３３０−３３５、３３５−３４０、３４０−３４５、３４５−３５０、３５０−３５５、３５５−３６０、３６０−３６５、３６５−３７０、３７０−３７５、３７５−３８０、３８０−３８５、３８５−３９０、３９０−３９５、３９５−４００、４００−４０５、４０５−４１０、４１０−４１５、４１５−４２０、４２０−４２５、４２５−４３０、４３０−４３５、４３５−４４０、４４０−４４５、４４５−４５０、４５０−４５５、４５５−４６０、４６０−４６５、４６５−４７０、４７０−４７５、４７５−４８０、４８０−４８５、４８５−４９０、４９０−４９５、または４９５−５００ｍｇのニコチン酸または薬学的に許容可能なその塩を投与することを含むことができる。投与は、１日当たり５０−６０、６０−７０、７０−８０、８０−９０、９０−１００、１００−１１０、１１０−１２０、１２０−１３０、１３０−１４０、１４０−１５０、１５０−１６０、１６０−１７０、１７０−１８０、１８０−１９０、１９０−２００、２００−２１０、２１０−２２０、２２０−２３０、２３０−２４０、２４０−２５０、２５０−２６０、２６０−２７０、２７０−２８０、２８０−２９０、２９０−３００、３００−３１０、３１０−３２０、３２０−３３０、３３０−３４０、３４０−３５０、３５０−３６０、３６０−３７０、３７０−３８０、３８０−３９０、３９０−４００、４００−４１０、４１０−４２０、４２０−４３０、４３０−４４０、４４０−４５０、４５０−４６０、４６０−４７０、４７０−４８０、４８０−４９０、４９０−５００ｍｇのニコチン酸または薬学的に許容可能なその塩を投与することを含むことができる。化合物または薬学的に許容可能なその塩の投与は、化合物または薬学的に許容可能なその塩を薬学的に許容可能な賦形剤とともに投与することを含むことができる。
本教示はそれを必要とする対象の加齢関連のインスリン感受性および／またはインスリン分泌の損失を治療、改善、軽減、予防または回復させる方法を含む。対象の加齢関連のインスリン感受性の損失を治療、改善、軽減、予防または回復させる方法は、有効量のＮＭＮもしくは薬学的に許容可能なその塩、ならびにニコチン酸もしくは薬学的に許容可能なその塩、ニセリトロールもしくは薬学的に許容可能なその塩、ニコチン酸トコフェロールもしくは薬学的に許容可能なその塩、β−ピリジルカルビノールもしくは薬学的に許容可能なその塩、またはヘキサニコチン酸イノシトールもしくは薬学的に許容可能なその塩の少なくとも１つの有効量を投与することを含むことができる。それを必要とする対象の加齢関連のインスリン分泌の損失を治療、改善、軽減、予防または回復させる方法は、有効量のＮＭＮもしくは薬学的に許容可能なその塩、ならびにニコチン酸もしくは薬学的に許容可能なその塩、ニセリトロールもしくは薬学的に許容可能なその塩、ニコチン酸トコフェロールもしくは薬学的に許容可能なその塩、β−ピリジルカルビノールもしくは薬学的に許容可能なその塩、またはヘキサニコチン酸イノシトールもしくは薬学的に許容可能なその塩の少なくとも１つの有効量を投与することを含むことができる。
本教示はそれを必要とする対象の加齢関連の記憶機能の障害を治療、改善、軽減、予防または回復させる方法を含む。それを必要とする対象の加齢関連の記憶機能の障害を治療、改善、軽減、予防または回復させる方法は、有効量のＮＭＮもしくは薬学的に許容可能なその塩、ならびにニコチン酸もしくは薬学的に許容可能なその塩、ニセリトロールもしくは薬学的に許容可能なその塩、ニコチン酸トコフェロールもしくは薬学的に許容可能なその塩、β−ピリジルカルビノールもしくは薬学的に許容可能なその塩、またはヘキサニコチン酸イノシトールもしくは薬学的に許容可能なその塩の少なくとも１つの有効量を投与することを含むことができる。
本教示はそれを必要とする対象の加齢関連の眼機能の低下を治療、改善、軽減、予防または回復させる方法を含む。それを必要とする対象の加齢関連の眼機能の低下を治療、改善、軽減、予防または回復させる方法は、有効量のＮＭＮもしくは薬学的に許容可能なその塩、ならびにニコチン酸もしくは薬学的に許容可能なその塩、ニセリトロールもしくは薬学的に許容可能なその塩、ニコチン酸トコフェロールもしくは薬学的に許容可能なその塩、β−ピリジルカルビノールもしくは薬学的に許容可能なその塩、またはヘキサニコチン酸イノシトールもしくは薬学的に許容可能なその塩の少なくとも１つの有効量を投与することを含むことができる。
それを必要とする対象の加齢関連の網膜の変性を治療する方法が提供される。本方法は、ＮＭＮもしくは薬学的に許容可能なその塩、ならびにニコチン酸もしくは薬学的に許容可能なその塩、ニセリトロールもしくは薬学的に許容可能なその塩、ニコチン酸トコフェロールもしくは薬学的に許容可能なその塩、β−ピリジルカルビノールもしくは薬学的に許容可能なその塩、またはヘキサニコチン酸イノシトールもしくは薬学的に許容可能なその塩の少なくとも１つを投与することを含むことができる。
加齢関連の網膜の変性、加齢関連の眼機能の低下、加齢関連の記憶機能の障害、または加齢関連のインスリン感受性の損失を治療する方法が提供される。本方法は、ＮＭＮもしくは薬学的に許容可能なその塩、ならびにニコチン酸もしくは薬学的に許容可能なその塩、ニセリトロールもしくは薬学的に許容可能なその塩、ニコチン酸トコフェロールもしくは薬学的に許容可能なその塩、β−ピリジルカルビノールもしくは薬学的に許容可能なその塩、またはヘキサニコチン酸イノシトールもしくは薬学的に許容可能なその塩の少なくとも１つを投与することを含むことができる。
加齢関連の機能の低下を治療、改善、予防または回復させる方法が提供される。本方法は、ＮＭＮもしくは薬学的に許容可能なその塩、ならびにニコチン酸もしくは薬学的に許容可能なその塩、ニセリトロールもしくは薬学的に許容可能なその塩、ニコチン酸トコフェロールもしくは薬学的に許容可能なその塩、β−ピリジルカルビノールもしくは薬学的に許容可能なその塩、またはヘキサニコチン酸イノシトールもしくは薬学的に許容可能なその塩の少なくとも１つを投与することを含むことができる。加齢関連の機能の低下は、食欲不振、低グルコースレベル、筋力低化、サルコペニア、またはその組み合わせを含むことができる。
糖尿病を治療、改善、予防または回復させる方法が提供される。本方法は、ＮＭＮもしくは薬学的に許容可能なその塩、ならびにニコチン酸もしくは薬学的に許容可能なその塩、ニセリトロールもしくは薬学的に許容可能なその塩、ニコチン酸トコフェロールもしくは薬学的に許容可能なその塩、β−ピリジルカルビノールもしくは薬学的に許容可能なその塩、またはヘキサニコチン酸イノシトールもしくは薬学的に許容可能なその塩の少なくとも１つを投与することを含むことができる。糖尿病には１型糖尿病または２型糖尿病があり得る。
肥満を治療、改善、予防または回復させる方法が提供される。本方法は、ＮＭＮもしくは薬学的に許容可能なその塩、ならびにニコチン酸もしくは薬学的に許容可能なその塩、ニセリトロールもしくは薬学的に許容可能なその塩、ニコチン酸トコフェロールもしくは薬学的に許容可能なその塩、β−ピリジルカルビノールもしくは薬学的に許容可能なその塩、またはヘキサニコチン酸イノシトールもしくは薬学的に許容可能なその塩の少なくとも１つを投与することを含むことができる。
医薬組成物が提供される。本医薬組成物はＮＭＮもしくは薬学的に許容可能なその塩、およびＮＭＮトランスポーターのアゴニストを含むことができる。ＮＭＮトランスポーターのアゴニストは、ニコチン酸もしくは薬学的に許容可能なその塩、ニセリトロールもしくは薬学的に許容可能なその塩、ニコチン酸トコフェロールもしくは薬学的に許容可能なその塩、β−ピリジルカルビノールもしくは薬学的に許容可能なその塩、またはヘキサニコチン酸イノシトールもしくは薬学的に許容可能なその塩であり得る。ＮＭＮトランスポーターのアゴニストは、ニコチン酸、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロールもしくは薬学的に許容可能なその塩、β−ピリジルカルビノールもしくは薬学的に許容可能なその塩、またはヘキサニコチン酸イノシトールもしくは薬学的に許容可能なその塩から成る群から選択することができる。ＮＭＮトランスポーターはＳｌｃ１２ａ８ポリペプチドまたはその同族体であり得る。
さらなる医薬組成物が提供される。本医薬組成物は、ＮＭＮおよびＳｌｃ１２ａ８またはその同族体の遺伝子発現誘導物質を含むことができる。Ｓｌｃ１２ａ８はアクセッション番号ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、Ｓｌｃ１２ａ８マウス変異体Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）またはＳｌｃ１２ａ８ヒト（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）として同定されたアミノ酸配列を有することができる。
本教示は、対象においてＮＡＤ＋産生を刺激する方法および対象において細胞へのＮＭＮ取込みを亢進させる方法を含む。対象は、例えば加齢関連肥満などのＮＭＮ代謝が関与する病気の治療を必要とする対象であり得る。これらの方法は、それを必要とする対象にＳｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡを含む核酸を投与することを含む。Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡは、ヒトまたはマウスまたはラットなどのげっ歯類などの哺乳動物に由来するＳｌｃ１２ａ８ ｍＲＮＡ転写物のＳｌｃ１２ａ８ ｃＤＮＡであり得る。核酸はＳｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡを含むレンチウイルスを含むことができる。Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に記載された配列を含むことができ、またはＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に記載された配列と７０％以上の配列相同性を有することができる。本教示のレンチウイルスは、治療を必要とする対象の小腸に投与することができる。
本教示は、Ｓｌｃ１２ａ８遺伝子に欠損を含むノックアウトマウスを含むこともできる。欠損は、限定はされないが、Ｓｌｃ１２ａ８遺伝子のエクソン４における欠損であり得る。
本教示はさらに、Ｓｌｃ１２ａ８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、またはＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％以上の配列相同性を有するｃＤＮＡ配列を含む哺乳動物細胞株を含む。細胞株は、ｃＤＮＡで安定的に形質転換され得るか、またはｃＤＮＡで一過的に形質転換され得る。ｃＤＮＡは、限定はされないが、例えばｃＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターまたはエンハンサーなどの制御配列に作動可能に連結され得る。
哺乳動物細胞株はＣＤ７３および／またはＣＤ３８活性を損失することができる。
哺乳動物細胞株はマウス細胞株、ラット細胞株、またはヒト細胞株であり得る。哺乳動物細胞株はＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％以上の配列相同性を有するｃＤＮＡ配列で形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞株であり得る。形質転換は安定的な形質転換または一過的な形質転換であり得る。
本教示はそれを必要とする対象においてＮＭＮの細胞内取込みを亢進させる方法も含む。これらの方法は治療有効量のニコチン酸またはそのエステルまたは薬学的に許容可能なその塩を投与することを含む。ニコチン酸のエステルは、
Figure 2020530460
 の構造を有することができ、ここでＲは、限定はされないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−オクチル、２−クロロエチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、２−メトキシエチル、２−ブトキシエチル、カルバモイルメチル、１−カルバモイルエチル、２−ジメチルアミノエチル、３−アミノプロピル、テトラヒドロフルフリル、ベンジル、フェノキシエチル、ｐ−クロロフェニル、またはｐ−ニトロフェニルであり得る。ＲはＨ、２−ジメチルアミノエチル、ｐ−クロロフェニル、またはｐ−ニトロフェニルであり得る。Ｒは２−ジメチルアミノエチル、ｐ−クロロフェニル、またはｐ−ニトロフェニルであり得る。
本教示はそれを必要とする対象においてＮＭＮの細胞内取込みを亢進させる方法も含む。これらの方法は化合物または薬学的に許容可能なその塩を投与することを含むことができ、ここで化合物はニコチン酸、ニコチン酸のエステル、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロール、β−ピリジルカルビノールまたはヘキサニコチン酸イノシトールである。投与は１日当たり５０〜５００ｍｇのニコチン酸、ニコチン酸のエステル、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロール、β−ピリジルカルビノールまたはヘキサニコチン酸イノシトール、またはこれらいずれかの化合物の薬学的に許容可能な塩を投与することを含むことができる。化合物または薬学的に許容可能なその塩は薬学的に許容可能な賦形剤とともに投与することができる。
本教示は、それを必要とする対象の加齢関連インスリン感受性の損失を治療する方法、それを必要とする対象の加齢関連インスリン分泌の損失を治療する方法、それを必要とする対象の加齢関連インスリン作用の損失を治療する方法、それを必要とする対象の加齢関連インスリン作用および分泌の損失を治療する方法、それを必要とする対象の加齢関連記憶機能の障害を治療する方法、それを必要とする対象の加齢関連眼機能の低下を治療する方法、およびそれを必要とする対象の加齢関連網膜の変性を治療する方法も含む。これらの方法は、薬学的有効量の、ＮＭＮ、ならびにニコチン酸、ニコチン酸のエステル、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロール、β−ピリジルカルビノール、もしくはヘキサニコチン酸イノシトール、または薬学的に許容可能なその塩を投与することを含むことができる。
本教示はそれを必要とする対象の筋疾患を治療する方法も含む。本教示に従って治療し得る筋疾患は、限定はされないが、筋脆弱、筋萎縮症、筋消耗、筋力低下を含む。本教示に従って治療し得る筋疾患は、限定はされないが、サルコペニア、ダイナペニア、悪液質、筋ジストロフィー、筋緊張障害、脊髄性筋委縮症、およびミオパシーを含む。筋ジストロフィーは、例えば、デユシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、エメリードレイフス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または眼咽頭筋ジストロフィーであり得る。筋緊張障害は筋強直性ジストロフィー、先天性ミオトニー、または先天性パラミオトニアであり得る。ミオパシーは、ベスレムミオパシー、先天性線維型不均衡、進行性骨化性線維異形成、甲状腺機能亢進性ミオパシー、甲状腺機能低下性ミオパシー、ミニコアミオパシー、マルチコアミオパシー、筋管ミオパシー、ネマリンミオパシー、周期性麻痺、低カリウムミオパシー、または高カリウムミオパシーであり得る。筋疾患は、酸性マルターゼ欠損症、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症、デブランチャー酵素欠損症、乳酸脱水素酵素欠損症、ミトコンドリア筋症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症、ホスホリラーゼ欠損症、ホスホフルクトキナーゼ欠損症、またはホスホグリセリン酸キナーゼ異常症であり得る。筋疾患はサルコペニア、ダイナペニア、または悪液質であり得る。筋疾患はサルコペニアであり得る。これらの方法は、薬学的有効量の、ＮＭＮ、ならびにニコチン酸、ニコチン酸のエステル、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロール、β−ピリジルカルビノールもしくはヘキサニコチン酸イノシトールなどの化合物、または薬学的に許容可能なその塩を投与することを含むことができる。
本教示はＮＭＮおよびＮＭＮトランスポーターのアゴニストを含む医薬組成物も含む。ＮＭＮトランスポーターのアゴニストは、限定はされないが、ニコチン酸、ニコチン酸のエステル、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロール、β−ピリジルカルビノールまたはヘキサニコチン酸イノシトールであり得る。
ＮＭＮトランスポーターはＳｌｃ１２ａ８ポリペプチドまたはその同族体であり得る。
本教示はそれを必要とする対象の加齢関連の機能低下を予防する方法も含む。加齢関連の機能低下は、限定されない例であるが、食欲不振、低グルコースレベル、筋力低下、栄養失調、または加齢による無食欲に起因し得る、または関連することができる。これらの方法は、薬学的有効量の、ＮＭＮ、ならびにニコチン酸、ニコチン酸のエステル、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロール、β−ピリジルカルビノールもしくはヘキサニコチン酸イノシトールなどの化合物、または薬学的に許容可能なその塩を投与することを含むことができる。
本教示はそれを必要とする対象の加齢関連の機能低下を予防する方法も含む。加齢関連の機能低下は、限定されない例であるが、食欲不振、低グルコースレベル、筋力低下、栄養失調、または加齢による無食欲に起因し得る、または関連することができる。これらの方法は、薬学的有効量の、ＮＭＮ、ならびにニコチン酸、ニコチン酸のエステル、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロール、β−ピリジルカルビノールもしくはヘキサニコチン酸イノシトールなどの化合物、または薬学的に許容可能なその塩を投与することを含むことができる。
本教示はそれを必要とする対象の２型糖尿病を治療する方法も含む。これらの方法は、薬学的有効量の、ＮＭＮ、ならびにニコチン酸、ニコチン酸のエステル、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロール、β−ピリジルカルビノールもしくはヘキサニコチン酸イノシトールなどの化合物、または薬学的に許容可能なその塩を投与することを含むことができる。
本教示はそれを必要とする対象の肥満を治療する方法も含む。これらの方法は、薬学的有効量の、ＮＭＮ、ならびにニコチン酸、ニコチン酸のエステル、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロール、β−ピリジルカルビノールもしくはヘキサニコチン酸イノシトールなどの化合物、または薬学的に許容可能なその塩を投与することを含むことができる。
本明細書に提示された研究は、哺乳動物においてＳｌｃ１２ａ８遺伝子が新規ＮＭＮトランスポーターをコードすることを実証する。Ｓｌｃ１２ａ８遺伝子のｍＲＮＡ発現はＮＡＤ＋の低下に応答して上方制御され、理論によって限定されるわけではないが、それにより細胞がＮＡＤ＋生合成に対する緊急の要求に応答することが可能になる。Ｓｌｃ１２ａ８ＮＭＮトランスポーターは生理的条件下でＮＭＮに特異的であり得る。細胞培養物および小腸においてこの遺伝子をノックダウンするとＮＭＮの早い取込みが完全に無効にされるが、その全長ｃＤＮＡの過剰発現により、そうでなければ最小のＮＭＮ輸送を示す細胞へのＮＭＮ輸送が亢進する。
本発明の種々の態様が以下のセクションに追加的に詳細に記載される。

治療の方法
それを必要とする対象の加齢関連の症状を治療する種々の方法が提供される。典型的には、方法は対象に治療有効量の、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）、ならびにニコチン酸、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロール、β−ピリジルカルビノール、ヘキサニコチン酸イノシトール、そのいずれかのエステル、薬学的に許容可能なそのいずれかの塩、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つの化合物を投与することを含み、そして加齢関連の症状はインスリン感受性の損失、インスリン分泌の損失、インスリン作用および分泌の損失、記憶機能の障害、眼機能の低下、網膜の変性、機能低下、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つの症状を含む。
加齢関連の症状はインスリン感受性の損失を含むことができる。
加齢関連の症状はインスリン分泌の損失を含むことができる。
加齢関連の症状はインスリンの作用および分泌の損失を含むことができる。
加齢関連の症状は記憶機能の障害を含むことができる。
加齢関連の症状は眼機能の低下を含むことができる。
加齢関連の症状は網膜の変性を含むことができる。
加齢関連の症状は機能の低下（例えば、食欲不振、低グルコースレベル、筋力低下、栄養失調、加齢による無食欲、またはそのいずれかの組み合わせ）を含むことができる。
加齢関連の症状は、本明細書に記載された加齢関連症状のいずれかの組み合わせを含むことができる。
他の方法はそれを必要とする対象の医学症状の治療に関する。方法は、対象に治療有効量の、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）、ならびにニコチン酸、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロール、β−ピリジルカルビノール、ヘキサニコチン酸イノシトール、そのいずれかのエステル、薬学的に許容可能なそのいずれかの塩、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つの化合物を投与することを含み、医学症状は筋疾患、２型糖尿病、肥満、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つを含む。
医学症状は筋疾患を含むことができる。対象が筋疾患の治療を必要とする対象の場合は、筋疾患は筋脆弱、筋萎縮症、筋消耗、筋力低下、およびそのいずれかの組み合わせを含むことができる。
筋疾患は、サルコペニア、ダイナペニア、悪液質、筋ジストロフィー（例えば、デユシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、エメリードレイフス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、眼咽頭筋ジストロフィー、またはそのいずれかの組み合わせ）、筋緊張障害（例えば、筋強直性ジストロフィー、先天性ミオトニー、先天性パラミオトニア、またはそのいずれかの組み合わせ）、脊髄性筋委縮症、およびミオパシー（例えば、ベスレムミオパシー、先天性線維型不均衡、進行性骨化性線維異形成、甲状腺機能亢進性ミオパシー、甲状腺機能低下性ミオパシー、ミニコアミオパシー、マルチコアミオパシー、筋管ミオパシー、ネマリンミオパシー、周期性麻痺、低カリウムミオパシー、または高カリウムミオパシー、またはそのいずれかの組み合わせ）、またはそのいずれかの組み合わせを含むことができる。
筋疾患は、酸性マルターゼ欠損症、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症、デブランチャー酵素欠損症、乳酸脱水素酵素欠損症、ミトコンドリア筋症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症、ホスホリラーゼ欠損症、ホスホフルクトキナーゼ欠損症、ホスホグリセリン酸キナーゼ異常症、またはそのいずれかの組み合わせを含むことができる。
筋疾患は、サルコペニア、ダイナペニア、悪液質、およびそのいずれかの組み合わせから選択することができる。
筋疾患はサルコペニアを含むことができる。
医学症状は２型糖尿病を含むことができる。
医学症状は肥満を含むことができる。
筋疾患は本明細書に記載された医学症状のいずれかの組み合わせを含むことができる。
本明細書に記載された種々の方法において、少なくとも１つの追加の化合物はニコチン酸、そのいずれかのエステル、または薬学的に許容可能なそのいずれかの塩を含むことができる。
ニコチン酸のエステルまたは薬学的に許容可能な塩は、構造式（Ｉ）
Figure 2020530460
 ［式中、Ｒはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−オクチル、２−クロロエチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、２−メトキシエチル、２−ブトキシエチル、カルバモイルメチル、１−カルバモイルエチル、２−ジメチルアミノエチル、３−アミノプロピル、テトラヒドロフルフリル、ベンジル、フェノキシエチル、ｐ−クロロフェニル、およびｐ−ニトロフェニルから成る群から選択される（例えば、Ｒは２−ジメチルアミノエチル、ｐ−クロロフェニル、およびｐ−ニトロフェニルから成る群から選択することができる）。］で表される化合物であり得る。
本明細書に記載された種々の方法において、１日当たり約５０ｍｇから約５００ｍｇの少なくとも１つの追加の化合物が対象に投与される。また、１日当たり約１０から約５００ｍｇのＮＭＮが対象に投与され得る。
さらに、ＮＭＮと少なくとも１つの追加の化合物を含む医薬組成物を対象に投与することができる。
それを必要とする対象においてＮＭＮの細胞内取込みを亢進させる方法も提供される。これらの方法は、治療有効量のニコチン酸、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロール、β−ピリジルカルビノール、ヘキサニコチン酸イノシトール、そのいずれかのエステル、薬学的に許容可能なそのいずれかの塩、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される化合物を対象に投与することを含む。
化合物は、ニコチン酸、そのエステル、または薬学的に許容可能なその塩を含むことができる。ニコチン酸のエステルまたは薬学的に許容可能な塩は、構造式（Ｉ）
Figure 2020530460
 ［式中、Ｒはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−オクチル、２−クロロエチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、２−メトキシエチル、２−ブトキシエチル、カルバモイルメチル、１−カルバモイルエチル、２−ジメチルアミノエチル、３−アミノプロピル、テトラヒドロフルフリル、ベンジル、フェノキシエチル、ｐ−クロロフェニル、およびｐ−ニトロフェニルから成る群から選択される（例えば、Ｒは２−ジメチルアミノエチル、ｐ−クロロフェニル、およびｐ−ニトロフェニルから成る群から選択される）。］で表される化合物であり得る。
１日当たり約５０ｍｇから約５００ｍｇの化合物を対象に投与することができる。
それを必要とする対象においてＮＡＤ＋産生を刺激する、および／または細胞へのＮＭＮの取込みを亢進させる方法が提供される。方法は、治療有効量の、Ｓｌｃ１２ａ８をコードする核酸を対象に投与することを含む。
Ｓｌｃ１２ａ８をコードする核酸はＳｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡを含むことができる。
対象においてＮＡＤ＋産生を刺激し、および／または細胞へのＮＭＮの取込みを亢進させるいずれかの方法において、Ｓｌｃ１２ａ８をコードする核酸の投与はＳｌｃ１２ａ８をコードする遺伝子治療ベクターを投与することを含むことができる。
遺伝子治療ベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、またはそのいずれかの組み合わせを含むことができる。
例えば、遺伝子治療ベクターはレトロウイルスを含むことができる。
遺伝子治療ベクターがレトロウイルスを含む場合には、レトロウイルスは好適にはレンチウイルスを含む。
対象においてＮＡＤ＋産生を刺激する、および／または細胞へのＮＭＮの取込みを亢進させるための、Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡの投与を含むいずれかの方法において、Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡはＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％の配列相同性を有する配列を含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも７５％の配列相同性を有する配列を含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも８５％の配列相同性を有する配列を含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９５％の配列相同性を有する配列を含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９９％の配列相同性を有する配列を含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と１００％の配列相同性を有する配列を含むことができる。
或いはまたは更に、Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡは、本明細書で開示されたいずれかのＳｌｃ１２ａ８を含むことができる。
対象においてＮＡＤ＋産生を刺激する、および／または細胞へのＮＭＮの取込みを亢進させるための、対象への治療有効量のＳｌｃ１２ａ８をコードする核酸の投与を含むいずれかの方法において、方法は対象の消化管へＳｌｃ１２ａ８をコードする核酸を投与することを含むことができる。例えば、方法は対象の小腸へＳｌｃ１２ａ８をコードする核酸を投与することを含むことができる。
対象においてＮＡＤ＋産生を刺激する、および／または細胞へのＮＭＮの取込みを亢進させるための、対象への治療有効量のＳｌｃ１２ａ８をコードする核酸の投与を含むいずれかの方法において、対象は筋疾患、２型糖尿病、肥満、加齢関連症状、またはそのいずれかの組み合わせの治療を必要とする対象であり得る。
加齢関連症状は、インスリン感受性の損失、インスリン分泌の損失、インスリンの作用と分泌の損失、記憶機能の障害、眼機能の低下、網膜の変性、機能の低下、肥満、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択することができる。
加齢関連症状はインスリン感受性の損失を含むことができる。
加齢関連症状はインスリン分泌の損失を含むことができる。
加齢関連症状はインスリンの作用と分泌の損失を含むことができる。
加齢関連症状は記憶機能の障害を含むことができる。
加齢関連症状は眼機能の低下を含むことができる。
加齢関連症状は網膜の変性含むことができる。
加齢関連症状は機能の低下を含むことができる（例えば、食欲不振、低グルコースレベル、筋力低下、栄養失調、加齢による無食欲、またはそのいずれかの組み合わせ）。
加齢関連症状は加齢関連の肥満を含むことができる。
対象が筋疾患の治療を必要とする対象である場合は、筋疾患は筋脆弱、筋萎縮症、筋消耗、筋力低下、およびそのいずれかの組み合わせを含むことができる。
筋疾患は、サルコペニア、ダイナペニア、悪液質、筋ジストロフィー（例えば、デユシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、エメリードレイフス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、眼咽頭筋ジストロフィー、またはそのいずれかの組み合わせ）、筋緊張障害（例えば、筋強直性ジストロフィー、先天性ミオトニー、先天性パラミオトニア、またはそのいずれかの組み合わせ）、脊髄性筋委縮症、およびミオパシー（例えば、ベスレムミオパシー、先天性線維型不均衡、進行性骨化性線維異形成、甲状腺機能亢進性ミオパシー、甲状腺機能低下性ミオパシー、ミニコアミオパシー、マルチコアミオパシー、筋管ミオパシー、ネマリンミオパシー、周期性麻痺、低カリウムミオパシー、または高カリウムミオパシー、またはそのいずれかの組み合わせ）、またはそのいずれかの組み合わせを含むことができる。
筋疾患は、酸性マルターゼ欠乏症、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症、デブランチャー酵素欠損症、乳酸脱水素酵素欠損症、ミトコンドリア筋症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症、ホスホリラーゼ欠損症、ホスホフルクトキナーゼ欠損症、ホスホグリセリン酸キナーゼ異常症、またはそのいずれかの組み合わせを含むことができる。
筋疾患は、サルコペニア、ダイナペニア、悪液質、およびそのいずれかの組み合わせから選択することができる。
筋疾患はサルコペニアを含むことができる。
対象においてＮＡＤ＋産生を刺激する、および／または細胞へのＮＭＮの取込みを亢進させるための、対象への治療有効量のＳｌｃ１２ａ８をコードする核酸の投与を含むいずれかの方法において、対象は２型糖尿病の治療を必要とする対象であり得る。
対象においてＮＡＤ＋産生を刺激する、および／または細胞へのＮＭＮの取込みを亢進させるための、対象への治療有効量のＳｌｃ１２ａ８をコードする核酸の投与を含むいずれかの方法において、対象は肥満の治療を必要とする対象であり得る。
本明細書に記載されたいずれかの方法において、対象は哺乳動物であり得る。
例えば、対象はマウスまたはラットであり得る。
対象はヒトであり得る。対象がヒトである場合、ヒトは少なくとも３０歳、少なくとも４０歳、少なくとも５０歳、少なくとも６０歳、または少なくとも７０歳の年齢を有し得る。

遺伝子治療ベクター
遺伝子治療ベクターが提供される。ベクターはＳｌｃ１２ａ８をコードする核酸を含む。
Ｓｌｃ１２ａ８をコードする核酸はＳｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡを含むことができる。
ベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、またはそれらのいずれかの組み合わせを含むことができる。
例えば、遺伝子治療ベクターはレトロウイルスを含むことができる。
レトロウイルスはレンチウイルスを含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％の配列相同性を有する配列を含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも７５％の配列相同性を有する配列を含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含むことができる。Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも７０％の配列相同性を有する配列を含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも８５％の配列相同性を有する配列を含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９５％の配列相同性を有する配列を含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９９％以上の配列相同性を有する配列を含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と１００％の配列相同性を有する配列を含むことができる。
或いはまたは更に、Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡは本明細書に開示されたいずれかのＳｌｃ１２ａ８を含むことができる。

Ｓｌｃ１２ａ８における変異を含む非ヒト動物
非ヒト動物が提供される。非ヒト動物はＳｌｃ１２ａ８遺伝子における不活性化変異を含む。
非ヒト動物は、好適にはマウスまたはラットを含む。
Ｓｌｃ１２ａ８遺伝子における不活性化変異は、Ｓｌｃ１２ａ８遺伝子における欠損、Ｓｌｃ１２ａ８遺伝子における挿入、またはその組み合わせを含むことができる。
例えば、Ｓｌｃ１２ａ８遺伝子における不活性化変異はＳｌｃ１２ａ８遺伝子における欠損を含むことができる。欠損はＳｌｃ１２ａ８遺伝子の部分的欠損、またはｌｃ１２ａ８遺伝子の完全な欠損を含むことができる。
欠損はＳｌｃ１２ａ８遺伝子のエクソン４の欠損を含むことができる。
欠損はＳｌｃ１２ａ８遺伝子のエクソン４の一部の欠損を含むことができる。

哺乳動物細胞および哺乳動物細胞株
哺乳動物細胞および哺乳動物細胞株も提供される。
哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株が提供される。哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株はＳｌｃ１２ａ８タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。ｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２（マウスＳｌｃ１２ａ８タンパク質）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３（マウスＳｌｃ１２ａ８変異体Ａタンパク質）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（マウスＳｌｃ１２ａ８変異体Ｂタンパク質）、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５（ヒトＳｌｃ１２ａ８タンパク質）をコードするｃＤＮＡを含む。
さらなる哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株が提供される。哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株はＳｌｃ１２ａ８タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。ｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と少なくとも７０％の配列相同性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。
ｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と少なくとも７５％の配列相同性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを含むことができる。
ｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と少なくとも８０％の配列相同性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを含むことができる。
ｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と少なくとも８５％の配列相同性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを含むことができる。
ｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と少なくとも９０％の配列相同性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを含むことができる。
ｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と少なくとも９５％の配列相同性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを含むことができる。
ｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と少なくとも９９％の配列相同性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを含むことができる。
さらに別の哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株が提供される。哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株はＳｌｃ１２ａ８タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。ｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）またはＳｌｃ１２ａ８ヒト全長ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と少なくとも７０％の配列相同性を有するｃＤＮＡ配列を含む。
ｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１と少なくとも７５％の配列相同性を有するｃＤＮＡ配列を含むことができる。
ｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１と少なくとも８０％の配列相同性を有するｃＤＮＡ配列を含むことができる。
ｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１と少なくとも８５％の配列相同性を有するｃＤＮＡ配列を含むことができる。
ｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１と少なくとも９０％の配列相同性を有するｃＤＮＡ配列を含むことができる。
ｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１と少なくとも９５％の配列相同性を有するｃＤＮＡ配列を含むことができる。
ｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１と少なくとも９９％の配列相同性を有するｃＤＮＡ配列を含むことができる。
ｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１と１００％の配列相同性を有するｃＤＮＡ配列を含むことができる。
いずれの哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株についても、哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株は好ましくは胎盤由来の細胞を含まない。
さらなる哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株が提供される。細胞または細胞株はＳｌｃ１２ａ８タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。細胞または細胞株は胎盤由来の細胞を含まない。
ｃＤＮＡはマウスＳｌｃ１２ａ８タンパク質またはその変異体をコードすることができる。
ｃＤＮＡはヒトＳｌｃ１２ａ８タンパク質またはその変異体をコードすることができる。
いずれの哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株においても、ｃＤＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５をコードするｃＤＮＡを含むことができる。
いずれの哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株においても、細胞または細胞株はｃＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含むことができる。
いずれの哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株においても、同じ哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株のｃＤＮＡを含まないものにおけるＳｌｃ１２ａ８タンパク質の発現と比較して、Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質の発現が好ましくは亢進する。
いずれの哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株においても、哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株は検出可能なＣＤ７３活性を欠くことができ、検出可能なＣＤ３８活性を欠くことができ、または検出可能なＣＤ７３活性と検出可能なＣＤ３８活性の両方を欠くことができる。
いずれの哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株においても、哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株は好ましくはＮＭＮ取込みの亢進を示す。
哺乳動物細胞は、線維芽細胞、腸管細胞、膵細胞、肝細胞、脂肪細胞、ニューロン、またはグリア細胞を含むことができる。
哺乳動物細胞株は、線維芽細胞、腸管細胞、膵細胞、肝細胞、脂肪細胞、ニューロン、またはグリア細胞を含むことができる。
哺乳動物細胞はＮＩＨ３Ｔ３細胞であり得る。
哺乳動物細胞株はＮＩＨ３Ｔ３細胞株であり得る。
いずれの哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株においても、哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株はｃＤＮＡ配列により安定的に形質転換され得る。
いずれの哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株においても、哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株はｃＤＮＡ配列により一過的に形質移入され得る。
いずれの哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株においても、ｃＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％の配列相同性を有することができる。
ｃＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも７５％の配列相同性を有することができる。
ｃＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも８０％の配列相同性を有することができる。
ｃＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも８５％の配列相同性を有することができる。
ｃＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９０％の配列相同性を有することができる。
ｃＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９５％の配列相同性を有することができる。
ｃＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９９％の配列相同性を有することができる。
ｃＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と１００％の配列相同性を有することができる。
いずれの哺乳動物細胞もマウスまたはラット細胞であり得る。
いずれの哺乳動物細胞株もマウス細胞株またはラット細胞株であり得る。
いずれの哺乳動物細胞もヒト細胞であり得る。
いずれの哺乳動物細胞株もヒト細胞株であり得る。

薬物スクリーニング法
ＮＭＮ輸送を調節する（例えば、促進する）化合物を同定するための候補化合物をスクリーニングする方法が提供される。そのような方法は、例えば、細胞へのＮＭＮの取込みを促進することにより改善される病気または症状の予防または治療のために使用することができる新規治療化合物を同定するために使用することができる。
ＮＭＮ輸送を調節する化合物を同定するための候補化合物をスクリーニングする方法が提供される。方法は、（ａ）ＮＭＮトランスポータータンパク質を発現する細胞またはＮＭＮトランスポータータンパク質を含むプロテオリポソームに候補化合物を接触させること、および（ｂ）細胞中のＮＭＮトランスポータータンパク質の発現または活性の変化、またはプロテオリポソーム中のＮＭＮトランスポータータンパク質の活性の変化を検出することを含む。候補化合物と接触した後の細胞中のＮＭＮトランスポータータンパク質の発現または活性の変化、またはプロテオリポソーム中のＮＭＮトランスポータータンパク質の活性の変化は、候補化合物がＮＭＮの輸送を調節することを示す。
ＮＭＮトランスポータータンパク質はＳｌｃ１２ａ８タンパク質を含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２（マウスＳｌｃ１２ａ８タンパク質）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３（マウスＳｌｃ１２ａ８変異体Ａタンパク質）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（マウスＳｌｃ１２ａ８変異体Ｂタンパク質）、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５（ヒトＳｌｃ１２ａ８タンパク質）と少なくとも７０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と少なくとも７５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
方法はさらに、（ｉ）候補化合物と接触した後の、ＮＭＮトランスポータータンパク質を発現する細胞中のＮＭＮトランスポータータンパク質の発現または活性を、（ｉｉ）候補化合物と接触した後の、ＮＭＮトランスポータータンパク質を発現しない細胞またはＮＭＮタンパク質の発現または活性が阻害されている細胞中のＮＭＮトランスポータータンパク質の発現または活性と比較することを含むことができる。
ＮＭＮトランスポータータンパク質を発現しない細胞は、Ｓｌｃ１２ａ８ノックアウト動物由来の細胞を含むことができる。
方法はさらに、（ｉ）候補化合物と接触した後の、ＮＭＮトランスポータータンパク質を含むプロテオリポソーム中のＮＭＮトランスポータータンパク質の活性を、（ｉｉ）候補化合物と接触した後の、ＮＭＮトランスポータータンパク質を含まないプロテオリポソームまたはＮＭＮタンパク質の活性が阻害されているプロテオリポソーム中のＮＭＮトランスポータータンパク質の活性と比較することを含むことができる。
ＮＭＮトランスポータータンパク質を含まないプロテオリポソームは、Ｓｌｃ１２ａ８ノックアウト動物の細胞由来のプロテオリポソームを含むことができる。
いずれの方法においても、細胞は哺乳動物の線維芽細胞、腸管細胞、膵細胞、肝細胞、脂肪細胞、ニューロン、またはグリア細胞を含むことができる。
いずれの方法においても、プロテオリポソームは哺乳動物の線維芽細胞、腸管細胞、膵細胞、肝細胞、脂肪細胞、ニューロン、またはグリア細胞由来のプロテオリポソームを含むことができる。
いずれの方法においても、細胞は本明細書に記載されたいずれかの哺乳動物細胞を含むことができる。
いずれの方法においても、プロテオリポソームは本明細書に記載されたいずれかの哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株由来のプロテオリポソームを含むことができる。
いずれの方法においても、プロテオリポソームはＳｌｃ１２ａ８ ｃＤＮＡを含む哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株由来のプロテオリポソームを含むことができる。

医薬組成物
医薬組成物が提供される。医薬組成物はＮＭＮおよびＮＭＮトランスポーターのアゴニストを含む。
ＮＭＮトランスポーターのアゴニストは、ニコチン酸、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロール、β−ピリジルカルビノール、ヘキサニコチン酸イノシトール、そのいずれかのエステル、薬学的に許容可能なそのいずれかの塩、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される化合物を含むことができる。ＮＭＮトランスポーターは、ニコチン酸、そのエステル、薬学的に許容可能なその塩を含むことができる。
ニコチン酸のエステルまたは薬学的に許容可能な塩は、構造式（Ｉ）
Figure 2020530460
 ［式中、Ｒはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−オクチル、２−クロロエチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、２−メトキシエチル、２−ブトキシエチル、カルバモイルメチル、１−カルバモイルエチル、２−ジメチルアミノエチル、３−アミノプロピル、テトラヒドロフルフリル、ベンジル、フェノキシエチル、ｐ−クロロフェニル、およびｐ−ニトロフェニルから成る群から選択される（例えば、Ｒは２−ジメチルアミノエチル、ｐ−クロロフェニル、およびｐ−ニトロフェニルから成る群から選択することができる）。］で表される化合物であり得る。
さらに、ＮＭＮトランスポーターはＳｌｃ１２ａ８ポリペプチドまたはその同族体を含むことができる。
さらなる医薬組成物が提供される。医薬組成物はＮＭＮ、およびＳｌｃ１２ａ８ポリペプチドもしくはその同族体の遺伝子発現の誘発物質を含む。
本発明を詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲に定義した本発明の範囲を逸脱することなく、修正および変更が可能であることが明らかであろう。
［方法］
本明細書に記載された方法および組成物は、当業者によく知られた実験室技術を使用し、それはSambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Spector, D. L., et al., Cells: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1998; Nagy, A., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Third Edition), Cold Spring Harbor, NY, 2003; およびHarlow, E., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1999などの実験室マニュアルに見出すことができる。医薬の投与方法および投与計画は、Remington: the Science and Practice of Pharmacy (Alfonso R. Gennaro ed. 19th ed. 1995); Hardman, J.G., et al., Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, McGraw-Hill, 1996; および Rowe, R.C., et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, Fourth Edition, Pharmaceutical Press, 2003などの標準的な参照テキストによって提供される方法を使用して、当業者によく知られた薬理学の標準的原理に従って決定することができる。本記載および添付の特許請求の範囲において使用するとき、単数形「ａ」と「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈で特に指示されない限り、複数形をも含むことを意図している。
マイクロアレイ解析。全ＲＮＡを、０．１％ＤＭＳＯ（対照）またはＦＫ８６６で処理した初代肝細胞、膵島、および海馬球状細胞塊から単離した（初代肝細胞には２００ｎＭ、膵島および海馬球状細胞塊には１０ｎＭ）。ＦＫ８６６処理により誘発された転写変化を評価するために、イルミナ社のマウスＲｅｆ８ 全ゲノムマイクロアレイ（２版）を使用してマイクロアレイ解析を実施した。バックグラウンドを差し引いた生のマイクロアレイデータをＺスコア変換に付して、既に報告されたようにしてＺ比を計算した（Yoshino, J., et al., Cell Metab., 14, 528-536, 2011）。データは全て、Ｒ統計ソフトウェアパッケージで解析した。
細胞培養およびエクスビボ小腸外植培養。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１０％ウシ胎児血清、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃および５％ＣＯ２にて培養した。Ｓｌｃ１２ａ８ ｍＲＮＡの発現解析については、ウェル当たり２．５×１０５細胞を、０．１％ＤＭＳＯまたは１００ｎＭ ＦＫ８６６または１００ｎＭ ＦＫ８６６プラス１００μＭ ＮＭＮを含有する１％ＦＢＳを有するＤＭＥＭと６穴プレート中で２４時間培養した。３月齢Ｂ６雄性マウス由来の小腸を、十二指腸／空腸／回腸の長さ比が１：３：２の３つのセグメントに切断した（Wang, H. H., et al., Hepatology, 45, 998-1006, 2007）。１センチメートルの各セグメントを縦方向に開いて冷ＰＢＳで１回洗浄し、以下の５μｇ／ｍＬインスリン（Ｓｉｇｍａ）、２０ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子（Ｓｉｇｍａ）、１×Ｂ２７サプリメント（ＧＩＢＣＯ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ（ＧＩＢＣＯ）の添加剤を含有する、５％ＦＢＳを含んだＤＭＥＭとＨａｍのＦ−１２培地の１：１の混合物（Ｓｉｇｍａ）中で、０．１％ＤＭＳＯまたは１００ｎＭ ＦＫ８６６または１００ｎＭ ＦＫ８６６プラス５００μＭ ＮＭＮと３７℃にて４時間培養した。細胞および組織のＲＮＡ試料は、既に報告されたようにして定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した（Stein, L. R. & Imai, S., EMBO J., 33, 1321-1340, 2014）。
ＨＰＬＣによるＮＡＤ＋およびＮＭＮの測定。ＮＡＤ＋およびＮＭＮを細胞および組織から抽出して、既に報告されたようにしてＨＰＬＣにより定量した（Yoshino, J., et al., Cell Metab., 14, 528-536, 2011; Yoshino, J. & Imai, S., Methods Mol. Biol., 1077, 203-215, 2013）。
フローサイトメトリー解析。２×１０６のＮＩＨ３Ｔ３細胞を、０．１％ＤＭＳＯまたは１００ｎＭ ＦＫ８６６または１００ｎＭ ＦＫ８６６プラス１００μＭ ＮＭＮを含有する１％ＦＢＳを有するＤＭＥＭと、１０ｃｍ培養皿中で３７℃にて５％ＣＯ２で４８時間培養した。その後、細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄してＰＢＳ中の０．０２％ＥＤＴＡで処理し、市販の１：２００のポリクローナルウサギ抗マウスＳｌｃ１２ａ８抗体（ＡＲＰ４４０３９，Ａｖｉｖａ，ＣＡ）、１：２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（Ｒ）４８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）と結合したヤギ２次抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体、および１：４００の生存マーカーＺＯＭＢＩＥ ＡＱＵＡＴＭ Ｄｙｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、フローサイトメトリーのために４℃にて２５分間染色した。その後、細胞を洗浄して、ＧＡＬＬＯＩＯＳＴＭフローサイトメーター（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で解析した。細胞内染色のために、細胞をまず２％ＰＦＡに室温で１０分間固定化し、その後サポニン含有バッファー中において室温でさらに１０分間、透過化した。Ｓｌｃ１２ａ８染色は、透過性化バッファー中で４℃にて２５分間実施した。試料をＧＡＬＬＯＩＯＳＴＭフローサイトメーター（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で解析し、データをＫＡＬＵＺＡＴＭ１．３（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で解析した。死細胞は、ＺＯＭＢＩＥ ＡＱＵＡＴＭの修正Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して排除した。
肝細胞の分離、５’−ヌクレオチダーゼ活性のアッセイ、ＮＭＮ取込み測定、ならびにＳｌｃ１２ａ８およびＮｒｋ１の発現のサイレンシング。初代肝細胞は、３月齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）雄性マウスから、既に報告されたようにして分離した（Grimm, A. A., et al., Aging Cell, 10, 305-317, 2011）。細胞は、いかなる実験を実施する前にも１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）を添加したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃および５％ＣＯ２で、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングした６穴プレートで一晩培養した。Ｓｌｃ１２ａ８ ｍＲＮＡの発現とＮＡＤ＋含量は、１％ＦＢＳを含んだＤＭＥＭ中で５００ｎＭのＦＫ８６６または５００ｎＭのＦＫ８６６プラス５００μＭのＮＭＮとともに肝細胞を２４時間培養することにより評価した。アデノシン−５’−［α，β−メチレン］ジホスフェート（ＡＯＰＣＰ）が５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害するか否か試験するために、１％ＦＢＳを含んだＤＭＥＭ中で１穴当たり１．５×１０５細胞を５００ｎＭのＦＫ８６６とともに１２穴プレートで２４時間生育させ、その後１００μＭアデノシンモノホスフェート（ＡＭＰ）または１００μＭ ＡＭＰプラス５００μＭ ＡＯＰＣＰの存在下に、Ｃａ２＋とＭｇ２＋を含んだ１．４ｍＬのハンクの緩衝化生理食塩水中（ＨＢＳＳ、ＧＩＢＣＯ）においてｐＨ７．５で培養した。異なる時点で（０、１、５、１５、および３０分）、各培養上清を２００μＬ採取して、２８μＬの７０％過塩素酸を加えることにより抽出した。生成されたアデノシンの量をＨＰＬＣで測定した。ＡＭＰおよびアデノシンの溶出時間は、各々４．７分および１７．４分であった。細胞生存率を調べるために、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ９６（Ｒ） ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用し、４時間培養後にλ＝４９０で吸光度を測定した。ＮＭＮ取込み測定には、１穴当たり１．５×１０５細胞を１％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で５００ｎＭのＦＫ８６６とともに１２穴プレートで２４時間生育させ、その後５００μＭ ＡＯＰＣＰ、２０μＭジピリダモール、および５００ｎＭ ＦＫ８６６またはこれらの阻害剤プラス１００μＭ ＮＭＮの存在下で、１ｍＬのＨＢＳＳ中で培養した。異なる時点で（０、０．２５、１、５、１５、および３０分）、細胞を冷ＨＢＳＳで１回洗浄し、冷１０％過塩素酸中で溶解した。細胞内ＮＭＮレベルは、ＨＰＬＣにより既に報告されたように測定した（Yoshino, J., et al., Cell Metab., 14, 528-536, 2011）。遺伝子サイレンシング実験には、Ｓｌｃ１２ａ８（Ｊ−０４２４５０−１２−００２０）またはＮｒｋ１（Ｊ０５１８３９−１１−００１０）に特異的な１０μｇのＯＮ−ＴＡＲＧＥＴＰＬＵＳＴＭ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ，Ｌａｆｅｙｅｔｔｅ，ＣＯ）マウスｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）または陰性対照ｓｉＲＮＡ（ＮＯＮ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ＃１、Ｄ−００１８１０−０１−２０）を条件当たり１００万個の細胞に電気穿孔し、製造者の説明書に従ってＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（Ｒ）プログラムＨ−２６（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、１００μＬのＡＭＡＸＡ（Ｒ）マウス肝細胞ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（Ｒ）溶液（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と混合した。電気穿孔された細胞を、培地を加える前にキュベット中で１５分間培養した。電気穿孔後に、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングした６穴プレートに１穴当たり２．５×１０５細胞を、１０％ＦＢＳおよびペニシリン−ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ中に、３７℃および５％ＣＯ２で４８時間かけて播種した。１％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中でこの細胞を５００ｎＭのＦＫ８６６と２４時間培養した。細胞を５００μＭ ＡＯＰＣＰ、２０μＭジピリダモールおよび５００ｎＭ ＦＫ８６６、またはこれらの阻害剤プラス１００μＭ ＮＭＮとＨＢＳＳ中で室温にて１分間培養した後に、ＨＰＬＣでＮＭＮ取込み量を測定した。サイレンシング効率は定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価した。
全長マウスＳｌｃ１２ａ８ ｃＤＮＡを安定的に過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の作製。
ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１を配列として使用した。ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１の配列は、本明細書ではＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として提示される。
全長マウスＳｌｃ１２ａ８ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１）のコード領域は、以下のＸｈｏＩサイトを含有するフォワードおよびレバースプライマーを用いて、ＰＦＵＵＬＴＲＡＴＭＩＩ融合ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用したＰＣＲにより、マウス肝臓より増幅された（表１）。
Figure 2020530460
作製した２１１８−ｂｐの全長Ｓｌｃ１２ａ８ ＤＮＡをＸｈｏＩで消化してｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＳＫベクターにクローン化した。その後、Ｓｌｃ１２ａ８ ｃＤＮＡフラグメントを哺乳動物発現ベクターｐＣＸＮ２にサブクローン化した（Revollo, J.R., et al., J. Biol. Chem., 279, 50754-50763, 2004）。最終ベクター中のＳｌｃ１２ａ８ ｃＤＮＡの配列を配列解析により確認した。ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｒ）形質移入試薬（ＱＩＡＧＥＮ，Ｆｒｅｄｒｉｃｋ，ＭＤ）を使用して、５μｇの、全長Ｓｌｃ１２ａ８ ｃＤＮＡを担持したｐＣＸＮ２（Ｓｌｃ１２ａ８−ＯＥ）または空のｐＣＸＮ２ベクター（対照）をＮＩＨ３Ｔ３細胞に形質移入し、１０％ＦＢＳ、抗生物質、および３００μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＤＭＥＭ中で２週間培養した。耐性細胞はプールして、分割して後の実験のために凍結した。Ｓｌｃ１２ａ８−ＯＥ細胞におけるＳｌｃ１２ａ８タンパク質の発現を確認するために、対照およびＳｌｃ１２ａ８−ＯＥ ＮＩＨ３Ｔ３細胞から、既に報告されたようにして原形質膜（ＰＭ）画分を調製した（Bruzzone, S., et al., FASEB J., 26, 1251-1260, 2012）。手短に説明すると、５個の１０ｃｍ皿中で培養された７．５×１０７細胞を使用した。氷冷ＨＥＳバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２５５ｍＭスクロース、ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含むＨＥＳバッファー（３ｍＬ／皿）で細胞を掻き取り、２２ゲージの針に５回通して均質化した。その後の全てのステップは４℃で実行した。ホモジネートはＪＡ２５．５ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）にて１６，０００ｇで３０分間遠心した（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−Ｅ）。ペレットを１０ｍＬ ＨＥＳバッファーに再懸濁し、１６，０００ｇで３０分間再度遠心した。得られたペレットを１０ｍＬ ＨＥＳバッファーに再懸濁し、１０ｍＬのスクロースクッション（３８．５％スクロース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７）の上に層状にして、５３，０００ｇで１２０分間遠心した。ＰＭ画分を含む界面を除去して１０ｍＬ ＨＥＳバッファーに再懸濁し、４０，０００×ｇで３０分間遠心して、ペレット中にＰＭ画分を生成した。対照またはＳｌｃ１２ａ８ＯＥ細胞のＰＭ画分をＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１．０％ＮＰ−４０、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ トリス、ｐＨ７．５、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）で溶解し、１×Ｌａｅｍｍｌｉバッファー中で５分間煮沸した。ポリクローナルウサギ抗マウスＳｌｃ１２ａ８（１：５００、ＡＲＰ４４０３９，Ａｖｉｖａ，ＣＡ）および抗カベオリン−１（１：２０００，＃３２３８，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ＭＡ）を用いてウエスタンブロットを実施した。ＡＤＯＢＥ（Ｒ） ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ（Ｒ）（Ａｄｏｂｅ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ，Ｓａｎ Ｊｏｎｅｓ，ＣＡ）を使用して、ＡＭＥＲＳＨＡＭ ＨＹＰＥＲＦＩＬＭＴＭ ＥＣＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）でバンド強度を定量化した。
放射性標識ＮＭＮを用いるＮＭＮ取込み分析。対照およびＳｌｃ１２ａ８−ＯＥ ＮＩＨ３Ｔ３細胞を遠心（４００×ｇ、５分）により回収してＨＢＳＳで１回洗浄し、１００ｎＭ ３Ｈ−β−ニコチンアミドモノヌクレオチド（９Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ｍｏｒａｖｅｋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＣＡ）と非標識ＮＭＮを含むＨＢＳＳ［ｐＨ７．５］（５×１０６細胞／ｍＬ）中において３７℃で培養して、最終濃度を２５μＭにした。指定した時点（１、３、５、および１０分）で、細胞の一部分（１００μＬ）を回収し、２Ｍ水酸化カリウム溶液の上にシリコーン−ミネラルオイル（密度、１．０１５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブ中に入れて、１６，０００×ｇで３０秒間遠心した。細胞を緩衝液から分離し、シリコーン−ミネラルオイル層を通してペレット化した。これらの細胞ペレットの放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。ＫｍおよびＶｍａｘを計算するために上記と同じ条件を使用したが、ＮＭＮの合計濃度は１μＭから１００μＭの種々の範囲とした。４分の時点で１００μＬの細胞懸濁液を回収し、上記と同じ方法でペレット化した。細胞ペレットの放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。対照ＮＩＨ３Ｔ３細胞で測定された放射活性を差し引いて、Ｓｌｃ１２ａ８−ＯＥ ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＳｌｃ１２ａ８特異的なＮＭＮ取込み量を計算した。
プロテオリポソーム実験。プロテオリポソームの調製は、既に報告されたようにして行った（Bruzzone, S., et al., FASEB J., 15, 10-12, 2001）。手短に説明すると、２×１０７の対照またはＳｌｃ１２ａ８−ＯＥ ＮＩＨ３Ｔ３細胞を１ｍＬの溶解バッファー（１０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ８．３、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．３Ｍスクロース、プロテアーゼ阻害剤カクテル）に再懸濁し、ホモジナイザーを用いて破壊した。溶解物を３，０００×ｇで１０分間遠心し、上清を回収して１００，０００×ｇで１５分間遠心した。膜タンパク質は、バッファーＡ（１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．５％ｎ−オクチルβ−グルコピラノシドを含む１０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ８．３）で可溶化した。別途に、既に報告されたようにして、ヘモグロビンを含まない赤血球膜（ゴースト）から全脂質を抽出した（Franco, L., et al., FASEB J., 12, 1507-1520, 1998）。ヒト赤血球膜の全脂質（３ｍｇ）を乾燥させ、６００μＬの可溶化膜タンパク質とともに再懸濁した（タンパク質濃度、約０．７ｍｇ／ｍＬ）。生成したエマルジョンを氷中で１分間超音波処理し、４℃にて２４時間、ｎ−オクチル−β−グルコピラノシドを含有しない５リットルのバッファーＡ（透析バッファー）で透析した。プロテオリポソームを回収し、１００，０００×ｇで１５分間遠心して９００μＬ透析バッファーに再懸濁し、３０ゲージの針に５回通した。
Ｓｌｃ１２ａ８のＮａ＋依存性を調べるために、ＮａＣｌを１５０ｍＭ ＬｉＣｌに置換した。全てのステップを４℃で実施した。プロテオリポソーム（各条件で３回３０μＬ）を、非標識ヌクレオチド（ＮＭＮ、ＮＲ、ＮＡＤ、ＡＭＰ、ＮＡＭまたはＮａＭＮ）の存在下または非存在下に、１０５ｃｐｍ／ｍＬの３Ｈ−β−ＮＭＮ（特異活性、９．１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で２５℃にて２、５、または１０分間培養した。培養の最後に、ガラス繊維紙でサンプルを濾過した。フィルターを３ｍＬの透析バッファーで洗浄して乾燥させ、放射活性をカウントした。
インビボＳｌｃ１２ａ８ノックダウン実験。ｓｈＲＮＡ発現レンチウイルス構成体を作製するために、センス標的配列、マイクロＲＮＡに基づくループ配列（ＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、アンチセンス配列、４つのチミジンの末端配列、および両端に適切な制限酵素を各々含有する５６−ｂｐの二重鎖オリゴヌクレオチドを、マウスＳｌｃ１２ａ８およびホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）用に作製し、ワシントン大学医学部ウイルスベクターコアにより提供されたＵ６−ＰＧＫ−ＧＦＰベクターへクローン化した。センスＳｌｃ１２ａ８配列は、５’−ＧＣＣＴＡＧＡＧＴＧＡＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）である。既に報告されたようにしてレンチウイルスを作製した（Satoh, A. et al., Cell Metab., 18, 416-430, 2013）。初代腸培養を使用してノックダウン効率を試験した（Satoh, T. & Clevers, H., Methods Mol. Biol., 945, 319-328, 2013）。ワシントン大学神経疾患ホープセンターのウイルスベクターコアでレンチウイルスの大規模生産を実施した。２日連続で一晩絶食した後に、３週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にタイター量５×１０６の形質転換ユニットを有するｆＬｕｃまたはＳｌｃ１２ａ８ｓｈＲＮＡレンチウイルスを（強制投与）で経口投与した。６日後に、ｆＬｕｃまたはＳｌｃ１２ａ８ｓｈＲＮＡレンチウイルスを投与されたマウスを一晩絶食させ、ＮＭＮ（５００ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを強制投与した。強制投与に続く０、５および６０分後に、尾静脈から採血して、遠心により血漿を分離した。その後、強制投与に続く６０分後に組織試料を採取した。既に報告されたようにして血漿のＮＭＮレベルおよび組織のＮＡＤ＋レベルを測定した（Yoshino, J., et al., Cell Metab., 14, 528-536, 2011; Grimm, A. A., et al., Aging Cell, 10, 305-317, 2011）。
マウスＳｌｃ１２ａ８に対する抗体の作製。マウスＳｌｃ１２ａ８の合成Ｎ末端ペプチド（ＡＱＲＳＰＱＥＬＦＨＥＡＡＱＱＧＣ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）（Ｃｏｎｖａｎｃｅ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＰＡ）に対する２種の異なるポリクローナルウサギ抗血清を作製した。これらの抗血清の１つから、Ｓｌｃ１２ａ８特異抗体をアフィニティ精製した。Ｓｌｃ１２ａ８のＮ末端ペプチドに対する抗血清またはアフィニティ精製抗体を、１：５００希釈でウエスタンブロッティングに使用した。
全身Ｓｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスの作製。全身Ｓｌｃ１２ａ８ノックアウト（Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯ）マウスは、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９技術を用いて、ワシントン大学のトランスジェニックベクターコアによりを作製された。ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡはＳｌｃ１２ａ８遺伝子のエクソン４に隣接するように設計された。ｇＲＮＡの配列は、５’ｇＲＮＡは５’−ＡＧＴＧＣＡＴＧＴＡＴＡＧＡＣＧＴＡＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）および３’ｇＲＮＡは５’−ＣＣＴＣＡＣＡＡＡＴＡＴＴＴＡＣＡＧＧＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）であった。ｇＲＮＡはｇＢｌｏｃｋｓ（ＩＤＴ）として得た。切断活性は、ＸＴＲＥＭＥＧＥＮＥＴＭＨＰ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、ｇＢｌｏｃｋおよびＣａｓ９プラスミド（ａｄｄｇｅｎｅ ＃４２２３０）を用いてＮ２Ａ細胞に形質移入することにより評価した。切断活性は、標準法を使用して、Ｔ７Ｅ１アッセイにより決定した。ｇＲＮＡはＴ７ ＭＥＧＡＳＨＯＲＴＳＣＲＩＰＴＴＭキット（Ａｍｂｉｃｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、インビトロで転写した。Ｃａｓ９ＲＮＡは、ＭＭＥＳＳＡＧＥ ＭＭＡＣＨＩＮＥ（Ｒ）Ｔ７ウルトラキット（Ａｍｂｉｃｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用してインビトロで転写した。ＲＮＡは全てＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（Ｒ）カラム（Ａｍｂｉｃｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して精製した。ＲＮＡは、ワシントン大学マウス遺伝子コア施設において、５０ｎｇ／μＬ Ｃａｓ９、２５ｎｇ／μＬ ｇＲＮＡ、および１００ｎｇ／μＬ ｓｓＯＤＮの濃度でＣ５７ＢＬ／６Ｊ×ＣＢＡハイブリッド接合子にマイクロインジェクトされた。全身ノックアウト対立遺伝子は切断部位のＰＣＲにより検出し、配列解析により確認した。ヘテロ接合ファウンダーを１つ確立し、分析の前に5代にわたってそのマウスを野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に戻し交配させた。Ｓｌｃ１２ａ８欠損ヘテロ接合マウスを交配して、ホモ接合Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスを作製した。野生型同腹仔を対照として使用した。
１８Ｏ−Ｄ−ＮＭＮの作製。シアノピリジンを１８Ｏ水の中で加水分解して１８Ｏニコチンアミドを調製した（Kolodziejska-Huben, M., et al., J. Label. Compd. Radiopharm., 45, 1005-1010, 2002）。１，２−２Ｈ，３，５−テトラアセテートはＤ−［２−２Ｈ］−リボース（Ｏｍｉｃｒｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入）から合成した（Chatterjee, A., et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 49, 8653-8656, 2010）。１８Ｏ−２Ｈ標識ニコチンアミドリボシドは、１８ＯニコチンアミドとＤ−リボフラノース１，２−２Ｈ，３，５−テトラアセテートから合成した（Fouquerel, E., et al., Cell Rep., 8, 1819-1831, 2014）。１８Ｏ−２Ｈニコチンアミドモノヌクレオチド（１８Ｏ−Ｄ−ＮＭＮ）は、既に報告されたようにして１８Ｏ−２Ｈニコチンアミドリボシドから合成した（Mills, K. F., et al., Cell Metab., 24, 795-806, 2016）。
同位体追跡実験。７〜８月齢のＳｌｃ１２ａ８ＫＯマウスおよびその野生型同腹仔に、一晩絶食後に５００ｍｇ／ｋｇの１８Ｏ−Ｄ−ＮＭＮまたはＰＢＳを経口投与した。強制経口投与の１０分後に、空腸と回腸を採取した。凍結組織に試薬級メタノールと水の１：１混合物（４℃）を加えた（６０μＬ／ｍｇ組織）。超音波処理後、抽出物を４℃にて１２，０００×ｇで１５分間遠心した。抽出物に１：１（ｖ／ｖ）の比率でクロロホルムを加え、３０秒間よく振り交ぜて、１２，０００×ｇで４℃にて１０分間遠心した。上層（メタノールと水）を下層（有機層）から分離し、スピード真空により室温で凍結乾燥し、５ｍＭギ酸アンモニウムで再構成して１２，０００×ｇで１０分間遠心した。５ｍＭギ酸アンモニウム中で１２８〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度に連続希釈したＮＭＮおよび１８Ｏ−Ｄ−ＮＭＮをキャリブレーションに使用した。ＡＴＬＡＮＴＩＳ（Ｒ）Ｔ３（ＬＣ２．１×１５０ｍｍ、３ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を備えたＨＰＬＣ（１２９０、Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、流速０．１５ｍＬ／ｍｉｎで移動相Ａに５ｍＭギ酸アンモニウム、移動相Ｂに１００％メタノールを用いて液体クロマトグラフィーを実施した。代謝物を、０〜１０分は０〜７０％Ｂ、１０〜１５分は７０％Ｂ、１６〜２０分は０％Ｂのグラジェントで溶出した。ＮＭＮ（３３５＞１２３）および１８Ｏ−Ｄ−ＮＭＮ（３３８＞１２５）のパラメーターを使用して、ポジティブＥＳＩ多重反応モニタリング（ＭＲＭ）下でトリプル四重極質量分析計（６４７０，Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて代謝物を分析した。フラグメンテーション、衝突、および加速後電圧はＮＭＮに対して１３５、８、および７とした。ＮＭＮおよび１８Ｏ−Ｄ−ＮＭＮのピークはＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ定量分析ツール（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して同定した。
動物実験。マウスは全て隔離施設で１２時間明／１２時間暗サイクルで集団飼育した。マウスは標準食餌の不断給餌で維持した（ＬａｂＤｉｅｔ５０５３，ＬａｂＤｉｅｔ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。食物摂取、食餌摂取時および空腹時グルコース、トリグリセリド、遊離脂肪酸、およびインスリンレベルの測定を、既に報告されたようにして実施した（Yoshino, J., et al., Cell Metab., 14, 528-536, 2011; Mills, K. F., et al., Cell Metab, 24, 795-806, 2016; Yoon, M. J., et al., Cell Metab., 21, 706-717, 2015）。Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスおよびその野生型同腹仔から午前９時から１０時の間に便を採取して、秤量する前に５５℃で一晩乾燥させた。クロロホルム／メタノール混合物（２：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で、既に報告されたようにして全便脂肪を抽出した（Folch, J., et al., J. Biol. Chem., 226, 497-509, 1957）。１ミリリットルの有機層を予め秤量したチューブに移して真空乾燥し、再度秤量して脂肪の質量を測定した。脂肪含量パーセンテージを、抽出した便の最初の質量（ｇ）に対して正規化した。８〜１０月齢のＳｌｃ１２ａ８ＫＯマウスおよびその野生型同腹仔から午前９時または午後９時に組織を採取して、ＨＰＬＣでＮＡＤ＋レベルを測定した。全身ＮＭＲ設備（ＥｃｈｏＭＲＩ（Ｒ），Ｅｃｈｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＬＬＣ，Ｗａｃｏ，ＴＸ）を使用して身体組成を測定した。ＰｈｅｎｏＭａｓｔｅｒシステム（ＴＳＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＯ）により、間接熱量測定および自発運動量測定を実施した。全ての動物実験はワシントン大学動物試験委員会の承認を得ており、ＮＩＨガイドラインに準拠している。
血漿ＧＬＰ−２測定。ＥＤＴＡコーティングマイクロベットチューブを使用して、７〜９月齢Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスおよびその対照野生型同腹仔の尾静脈から、２４時間絶食後（午前９時から午後９時）および６時間再給餌後（午前１０時から午後４時）に、血液を採取した。血液は直ちに氷冷し、５，０００×ｇで４℃にて遠心して、血漿試料を−８０℃にて保存した。製造者の説明書に従ってＭｏｕｓｅ ＧＬＰ−２ ＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｃｏ，Ｓａｌｅｍ，ＮＨ）を用いて、血漿中のＧＬＰ２−レベルを測定した。
血漿およびエクスビボ小腸外植培養物上清中のＧＬＰ−１の測定。ＥＤＴＡコーティングチューブを使用して、２月齢または２４月齢雌性Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンマウスおよびその対照の尾静脈から、２４時間絶食（午前９時から午前９時）に引き続く６時間再給餌（午前１０時から午後４時）後に血液を採取した。血液は直ちに氷冷し、４℃にて５，０００×ｇで遠心して、血漿試料を−８０℃にて保存した。消化管特異的雌性Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンマウスまたは１２月齢雌性Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスの小腸を、長さの比が１：３：２の十二指腸、空腸、および回腸の３セグメントに切断した（Wang, H. H., et al., Hepatology, 2007, 45, 998-1006）。１センチメートルの回腸または大腸を縦方向に開いて、冷ＰＢＳで一回洗浄し、ニコチンアミドとグルコースを含まない５００μＬのＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ，分泌培地）中で、脂肪酸フリーの０．２５％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とともに、３７℃にて２時間培養した。Ｓｉｒｔ１およびＳｉｒｔ６阻害剤を用いた実験では、２４月齢雌性Ｂ６マウスの回腸を０．２％ＤＭＳＯ（溶媒）、２０μＭ ＥＸ５２７（Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ，ＭＩ）または２０μＭ ＳＴＫ６６５４０１（ＣｈｅｍＤｉｖ，ｃａｔ＃８０１８−９３７８）を含有する５００μＬの分泌培地中で３７℃にて２時間予備培養した（Sociali, G., et al., Eur. J. Med. Chem., 2015, 102, 530-539）。予備培養後、培地を交換して、エクスビボ回腸外植片を同様の化合物と３７℃にて２時間予備培養した。加湿インキュベーター（９５％Ｏ２、５％ｖ／ｖＣＯ２）中における培養の最後に、培地を集めて４℃にて８００ｇで５分間遠心し、いかなる浮遊デブリをも除去して、後続のＧＬＰ−１測定のために−８０℃にて凍結させた。血漿および培地中のＧＬＰ−１レベルを、製造者の説明書に従って、ＧＬＰ−１ Ｔｏｔａｌ ＥＬＩＳＡキット（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＯ）により測定した。ＧＬＰ−１値はブラッドフォードアッセイにより分析した総タンパク質量により正規化した。
レーザーマイクロダイセクション。各視床下部核をマイクロダイセクションして全ＲＮＡを抽出し、既に報告されたようにして定量ＲＴ−ＰＣＲにより分析した（Satoh, A., et al., Cell Metab., 18, 416-430, 2013）。
統計解析。特に指示しない限り、２群間の差はスチューデントｔ検定を使用して評価した。いくつかの群の間の比較は、実施例において示された種々の事後試験を用いた一元ＡＮＯＶＡを使用して実施した。Ｗｉｌｃｏｘｏｎの符号順位検定を使用して、酸素消費量、エネルギー消費量、呼吸交換比、および総自発運動量の差異を比較した。比較において、ｐ値＜０．０５を統計的に有意と判断した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（７版）を使用して統計解析を実行した。値は全て、平均±ＳＥＭとして示される。特に指定されない限り、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１とする。
本教示は、実施例において提供される、請求項または態様の範囲を限定することを意図しない記述を含む。明確に過去形で提示されない限り、実施例は予想または実際の例であり得る。本教示をさらに例示するために、以下の非限定的な実施例が提供される。当業者は、本開示に照らして、開示された特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、本教示の精神および範囲から逸脱することなく、同様のまたは類似の結果を得ることができることを理解する。
［実施例１］
本実施例は、ＮＭＮトランスポーター遺伝子の同定を示す。
種々のタイプの初代細胞において、強力なＮＡＭＰＴ阻害剤であるＦＫ８６６によって、ＮＡＭＰＴにより媒介されるＮＡＤ＋の生合成が阻害されるとき、ＮＭＮを併用投与すると、ＦＫ８６６の非存在下にＮＭＮにより誘導されるよりもより高いＮＡＤ＋の増大が常にもたらされた（Revollo, J. R., et al., Cell Metab., 6, 363-375, 2007; Stein, L. R. & Imai, S., EMBO J., 33, 1321-1340, 2014; Yoshino, J., et al., Cell Metab., 14, 528-536, 2011）。本研究者らは、ＦＫ８６６で処理したマウス初代肝細胞、膵島、および海馬神経幹細胞塊における遺伝子発現プロファイリングを実施して、これら３種の初代培養物において共通に上方制御されている遺伝子を探索した。トランスポーターまたは膜貫通タンパク質をコードする遺伝子に焦点を当てて探索し、これらの基準に合致して未知機能を有する唯一の遺伝子を発見した。この遺伝子Ｓｌｃ１２ａ８は、初代肝細胞、膵島、および海馬神経幹細胞塊において、各々２．０６、１．６９、および４．９１のＺ比を示した（図１）。Ｓｌｃ１２ａ８は、図１のベン図中の矢印で指示されたセクションに同定された。各細胞タイプにおけるＳｌｃ１２ａ８のＺ比とｐ値は図１に示されている。Ｓｌｃ１２ａ８遺伝子は、電気的中性のカチオン−クロリド結合コトランスポーターのＳＬＣ１２遺伝子ファミリーに属し、この遺伝子によりコードされるタンパク質の機能は未だ知られていない（Hebert, S. C., et al., Pflugers Arch., 447, 580-593, 2004）。
［実施例２］
本実施例は、Ｂ６マウスにおけるＳｌｃ１２ａ８の差次的発現を示す。
図２は、Ｓｌｃ１２ａ８が３月齢のＢ６雄性マウス（ｎ＝３マウス）の小腸および膵臓で高度に発現し、肝臓および白色脂肪組織で中程度に発現することを示す。さらなるＳｌｃ１２ａ８ ｍＲＮＡ発現の変化が初代マウス肝細胞で観察され、図３に示される（ｎ＝４マウス）。０．１％ＤＭＳＯ、ＦＫ８６６単独またはＦＫ８６６プラスＮＭＮで処理されたＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞（ｎ＝４）および空腸および回腸のエクスビボ外植片（ＤＭＳＯおよびＦＫ８６６のみの場合はｎ＝４マウス、ＦＫ８６６プラスＮＭＮの場合はｎ＝３マウス）（細胞の場合は２４時間、外植片の場合は４時間、Ｔｕｋｅｙの検定でＡＮＯＶＡを使用して解析した）。Ｓｌｃ１２ａ８の発現は、ＦＫ８６６で処理した場合、マウス初代肝細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞、および空腸および回腸のエクスビボ外植片で有意に誘発されたが、この誘発はＮＭＮの添加により抑制された（図３〜５）。図４は、ＤＭＳＯ、ＦＫ８６６単独、およびＦＫ８６６プラスＮＭＮで処理された初代マウス肝細胞およびＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞の細胞内ＮＡＤ＋含有量を示している。細胞をこれらの化合物で２４時間処理した（ＤＭＳＯおよびＦＫ８６６で処理した肝細胞ではｎ＝４マウス、ＦＫ８６６およびＮＭＮで処理した肝細胞ではｎ＝３、ＮＩＨ３Ｔ３細胞ではｎ＝６、Ｔｕｋｅｙの検定でＡＮＯＶＡを使用して解析した）。図５は、ＦＫ８６６またはＦＫ８６６プラスＮＭＮで４８時間処理されたＮＩＨ３Ｔ３細胞において、フローサイトメトリー解析により測定された、表面および細胞内Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質の発現レベルを示す。Ｓｌｃ１２ａ８染色（Ｓｌｃ１２ａ８＋）の陽性ＮＩＨ３Ｔ３細胞の割合が、アポトーシスのマーカー（Ｚｏｍｂｉ−）に対して負に選択された細胞間で計算された（表面染色ではｎ＝８、細胞内染色ではｎ＝５、独立ｔ検定で解析された）。
［実施例３］
本実施例は、ＮＭＮ取込みの動態に対するＳｌｃ１２ａ８の効果を示す。
マウス初代肝細胞におけるＮＭＮ取込みの動態を決定した。ＣＤ７３によるＮＭＮからＮＲへの細胞外分解は、ＡＯＰＣＰ（アデノシン−５’−［α，β−メチレン］ジホスフェート）で阻害された。ヌクレオシドトランスポーターを介した細胞内へのＮＲの取込みはジピリダモールで阻害され、ＮＡＭＰＴによる細胞内ＮＭＮ合成はＦＫ８６６で阻害された。未処理初代肝細胞をＡＭＰまたはＡＭＰプラスＡＯＰＣＰで培養した。細胞外アデノシンの生成を、種々の時点（０、１、５、１５、および３０分）にＨＰＬＣで測定した。ＡＯＰＣＰは５’−ヌクレオチダーゼ活性を９７％抑制する。ＡＯＰＣＰ、ジピリダモールおよびＦＫ８６６のカクテルは、３０分まで細胞生存率に影響を与えなかった（データ表示せず）。
初代マウス肝細胞を５００ｎＭ ＦＫ８６６で２４時間前処理し、２０μＭジピリダモール、５００μＭ ＡＯＰＣＰ、および５００ｎＭ ＦＫ８６６のカクテルで、１００μＭ ＮＭＮの存在下および非存在下にて培養した。ＮＭＮをＨＰＬＣで測定した（ｎ＝４マウス、阻害剤のみの１５分および３０分時点の３つのデータセットを除く。Ｓｉｄａｋの検定でＡＮＯＶＡを使用して解析した）。この処理により、対照と比較して、マウス初代肝細胞の１分時点での細胞内ＮＭＮレベルが有意に増加した（図６）。
［実施例４］
本実施例は、ＮＭＮ取込みに対するＳｌｃ１２ａ８およびＮｒｋ１ ｍＲＮＡの減少の効果を示す。
初代マウス肝細胞におけるＳｌｃ１２ａ８およびＮｒｋ１ ｍＲＮＡのノックダウン効率を測定するために、細胞をスクランブルおよびＳｌｃ１２ａ８またはＮｒｋ１ ｓｉＲＮＡで７２時間処理した（Ｓｌｃ１２ａ８サイレンシングではｎ＝５マウス、Ｎｒｋ１サイレンシングではｎ＝３、独立７００ｔ検定で解析した）。理論に制限されることなく、これらの条件は、細胞内でＮＲをＮＭＮに変換する主要なＮＲキナーゼであるＳｌｃ１２ａ８およびＮｒｋ１の発現をノックダウンした（Belenky, P., et al., Cell, 129, 473-484, 2007）。スクランブル、Ｓｌｃ１２ａ８、およびＮｒｋ１ ｓｉＲＮＡで処理した初代肝細胞を、１００μＭ ＮＭＮを添加して１分後にＨＰＬＣでアッセイした。培養条件は実施例３に記載されたものと同じとした（Ｓｌｃ１２ａ８サイレンシングではｎ＝５マウス、Ｎｒｋ１サイレンシングではｎ＝３、Ｔｕｋｅｙの検定によりＡＮＯＶＡで解析した）。両方の遺伝子のノックダウン効率は約８０％である（図７）。Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウン肝細胞ではＮＭＮの高速取込みは完全に消失したが、Ｎｒｋ１ノックダウン肝細胞ではＮＭＮ取込みの有意な減少は観察されなかった（図８）。これらのデータは、初代肝細胞におけるＮＭＮの高速取込みにＳｌｃ１２ａ８が必要であり、観察された細胞内ＮＭＮの増加はＮＲまたはニコチンアミドのＮＭＮへの変換によるものではないことを示す。
［実施例５］
本実施例は、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞における全長マウスＳｌｃ１２ａ８ ｃＤＮＡの過剰発現を示す。
ＣＤ７３（ＮＭＮをＮＲに変換する）およびＣＤ３８（ＮＭＮをニコチンアミドとホスフォリボースに分解する）のいかなる検出可能な細胞外活性も有さず、そしてＮＭＮ取込み活性も非常に弱いので、ＮＩＨ３Ｔ３細胞株を選択した。方法で説明したようにして、全長マウスＳｌｃ１２ａ８ ｃＤＮＡを細胞に形質移入し、Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質の発現をアッセイした。図９は、対照およびＳｌｃ１２ａ８−ＯＥ ＮＩＨ３Ｔ３細胞からの原形質膜画分におけるＳｌｃ１２ａ８タンパク質の発現を示す。図１０は、各細胞株についてカベオリン−１タンパク質レベルに正規化したＳｌｃ１２ａ８タンパク質レベルを示す（右パネル、ｎ＝３、独立ｔ検定により解析した）。Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質レベルは、Ｓｌｃ１２ａ８過剰発現ＮＩＨ３Ｔ３（Ｓｌｃ１２ａ８−ＯＥ）細胞において約２．２倍と顕著に増加した。
［実施例６］
本実施例は、Ｓｌｃ１２ａ８−ＯＥおよび対照細胞における、３Ｈ−標識ＮＭＮを使用したＮＭＮ取込みの動態を示す。
「放射性標識ＮＭＮを用いるＮＭＮ取込み分析」の方法で説明したように、対照およびＳｌｃ１２ａ８−ＯＥ ＮＩＨ３Ｔ３細胞において、Ｍｇ２＋とＣａ２＋を含むハンクスバッファー［ｐＨ７．５］中で２５μＭの３Ｈ−ＮＭＮを使用して、ＮＭＮの取込みを３７℃にて１０分より長く測定した（ｎ＝１２、Ｓｉｄａｋの検定によりＡＮＯＶＡで解析した）。３Ｈ−ＮＭＮの取込みは、対照細胞と比較して、Ｓｌｃ１２ａ８−ＯＥ細胞の３分および５分の時点で有意に亢進した（図１１）。Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質のミカエリス・メンテン定数を計算するために、対照およびＳｌｃ１２ａ８−ＯＥ ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、Ｍｇ２＋とＣａ２＋を含むハンクスバッファー［ｐＨ７．５］中で３７℃にて４分間、１００ｎＭの３Ｈ−ＮＭＮおよび漸増濃度の非放射性ＮＭＮと培養した。対照セルのバックグラウンドを差し引くことにより、ＫｍおよびＶｍａｘ値を非線形回帰分析により決定した（１および１０μＭでｎ＝５、２５および１００μＭでｎ＝４）。ＮＭＮの場合、Ｋｍは３４．１±８．３μＭで、Ｖｍａｘは１１．５±１．２ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであった（図１２）。このＫｍは、マウスの血漿および赤血球において検出されたＮＭＮ濃度範囲と定性的に一致する（Revollo, J. R., et al., Cell Metab., 6, 363-375, 2007; Ramsey, K. M., et al., Science, 324, 651-654, 2009; Yamada, K., et al., Anal. Biochem., 352, 282-285, 2006）。
［実施例７］
本実施例は、Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質の特異性を示す。
プロテオリポソームは、輸送バッファー中でＳｌｃ１２ａ８−ＯＥおよび対照ＮＩＨ３Ｔ３細胞の原形質膜画分から作製されたプロテオリポソームに、上記のように、２２ｎＭの３Ｈ−ＮＭＮを使用して、２５℃にてＳｌｃ１２ａ８−ＯＥまたは対照ＮＩＨ３Ｔ３細胞の膜画分を除タンパク赤血球原形質膜由来のリン脂質二重層と組み合わせることにより作製した（ｎ＝３、Ｓｉｄａｋの多重比較検定を使用して一元ＡＮＯＶＡで解析した）。Ｓｌｃ１２ａ８−ＯＥ由来のプロテオリポソームは、２分以内に、対照由来のプロテオリポソームよりも有意に高いレベルの３Ｈ−ＮＭＮを取り込んだ（図１３）。
いくつかの実験では、ニコチン酸（ＮＡ）が、Ｓｌｃ１２ａ８を過剰発現するプロテオリポソームへの放射性標識３Ｈ−ＮＭＮの取込みを亢進することができることが見出された（図４２）。ＮＡによる３Ｈ−ＮＭＮ取込みの亢進は、いくつかの異なる条件下で再現された（図４２）。
Ｓｌｃ１２ａ８の基質特異性を決定するために、これらのＳｌｃ１２ａ８−ＯＥプロテオリポソームを３Ｈ−ＮＭＮおよび種々の非放射性ＮＡＤ＋関連化合物を用いた置換実験に使用した。３Ｈ−ＮＭＮ（１５０ｎＭ、２５℃）の取込みを、１５０μＭの競合する非放射性化合物（ＮＭＮ、ＮＲ、ＮＡＤ、ＡＭＰ、ＮａＭＮ、およびニコチンアミド）の存在下に輸送バッファー中において、Ｓｌｃ１２ａ８−ＯＥプロテオリポソームで２分の時点に測定した（ｎ＝３、Ｄｕｎｎｅｔｔの検定を使用してＡＮＯＶＡにより解析した）。１５０μＭの非放射性ＮＭＮは３Ｈ−ＮＭＮと完全な置換を示したが、ＮＡＤ＋、ＡＭＰ、ニコチン酸モノヌクレオチド（ＮａＭＮ）、およびニコチンアミドは同じ濃度で非常に低いか、または無視できる程度の置換を示した（図１４）。１５０μＭ ＮＲは約７０％の置換を示したので、プロテオリポソームシステムを使用してＮＭＮおよびＮＲのＩＣ５０濃度を決定した。ＮＭＮのＩＣ５０は２２．８±３．６μＭで、ＮＲのＩＣ５０は７７．４±１０．８μＭであった（図１５）。データは３Ｈ−ＮＭＮの取込みをパーセンテージとして示す（ｎ＝３、ＩＣ５０は非線形回帰分析により計算した）。血液（Frederick, D. W., et al., Cell Metab., 24, 269-282, 2016）や腹水滲出液（Sociali, G., et al., Oncotarget, 7, 2968-2984, 2016）などにおいて、ＮＲレベルが病態生理学条件でそのような高濃度に達することは示されていないので、理論に制限されることなく、この結果は、Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質が生理的条件下で主にＮＭＮに特異的であることを示唆する。
これらの発見は、ＮＡおよびいくつかのＮＡ誘導体化合物が、Ｓｌｃ１２ａ８ＮＭＮトランスポーターの機能を促進するために使用できることを示唆する。
［実施例８］
本実施例は、ＮＭＮ輸送に対するＳｌｃ１２ａ８のナトリウムイオン依存性を示す。
これらの実験では、プロテオリポソームシステムを使用して、ＮＭＮ輸送に対するＳｌｃ１２ａ８のナトリウムイオン依存性を評価した。プロテオリポソームの調製中およびＮＭＮ流入の測定中にナトリウム（Ｎａ＋）を等モル濃度のリチウム（Ｌｉ＋）に置換した場合、３Ｈ−ＮＭＮの取込みは約８０％と劇的に減少し（図１６、ｎ＝３、独立ｔ検定で解析した）、Ｓｌｃ１２ａ８によるＮＭＮ輸送がナトリウムイオン依存性であることが示された。
これらの結果は、ナトリウム塩がＳｌｃ１２ａ８により媒介されるＮＭＮ輸送を亢進できること、およびリチウムなどの他のカチオンがＳｌｃ１２ａ８により媒介されるＮＭＮ輸送を阻害できることを示す。
［実施例９］
本実施例は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＮＡＤ＋生合成に対するＳｌｃ１２ａ８の過剰発現の効果の測定を示す。
対照ＮＩＨ３Ｔ３およびＳｌｃ１２ａ８−ＯＥ細胞を１００ｎＭ ＦＫ８６６、２μＭジピリダモールおよび５００μＭ ＡＯＰＣＰのカクテルで１時間前処理すると、対照とＳｌｃ１２ａ８−ＯＥ細胞の両方において細胞内ＮＡＤ＋レベルが有意に低下した（図４１）。しかしながら、１００μＭ ＮＭＮを用いた追加の１時間の培養により、対照ＮＩＨ３Ｔ３細胞ではなく、Ｓｌｃ１２ａ８−ＯＥ細胞でのみＮＡＤ＋レベルを元のレベルに回復させることができた（図４１、ｎ＝９、Ｔｕｋｅｙの検定を使用してＡＮＯＶＡで解析した）。
［実施例１０］
本実施例は、ＮＭＮ輸送のインビボ検証を示す。
上記のように、対照ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）ｓｈＲＮＡおよびＳｌｃ１２ａ８ ｓｈＲＮＡを担持するレンチウイルスを作製した。本発明者らは、各ウイルスを直接マウスの腸に強制投与した。対照ｓｈｆＬｕｃレンチウイルスおよびｓｈＳｌｃ１２ａ８レンチウイルスを感染させた空腸および回腸の試料におけるＳｌｃ１２ａ８タンパク質の発現レベルを、ウエスタンブロットにより測定した（図１７）。図１８は、ＧＡＰＤＨタンパク質レベルに対して正規化された空腸および回腸のＳｌｃ１２ａ８タンパク質レベルの棒グラフを示す（ｎ＝６、３〜４月齢のＢ６雄性、独立ｔ検定により解析した）。ｆＬｕｃ ｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスを投与されたマウスと比較して、Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質レベルは、腸にＳｌｃ１２ａ８ ｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスを投与されたマウスの空腸で約６０％、および回腸で約３０％減少した（図１７〜１８）。ＮＭＮ（５００ｍｇ／ｋｇ体重）をこれらのマウスに経口強制投与で投与した場合、対照マウスでは血漿ＮＭＮレベルが５分で有意に増加したが、Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンマウスでは全く増加しなかった（図１９、ＮＭＮをＨＰＬＣで測定した、ｎ＝６、３〜４月齢のＢ６雄性、Ｓｉｄａｋの検定を使用してＡＮＯＶＡで解析した）。代わりに、対照マウスと比較して、血漿ニコチンアミドレベルがＳｌｃ１２ａ８−ノックダウンマウスでより高い傾向があったが（図２０）、これはおそらくＳｌｃ１２ａ８−ノックダウンマウスではより高レベルのＮＭＮがニコチンアミドへの分解を受けたためである。血漿試料に加えて、対照ｓｈｆＬｕｃレンチウイルスおよびｓｈＳｌｃ１２ａ８レンチウイルス感染マウスにおいて、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはＮＭＮ（５００ｍｇ／ｋｇ体重）の強制経口投与後６０分の時点で、空腸から組織試料を採取した（ＰＢＳの場合はｎ＝５マウス、ＮＭＮの場合はｎ＝８、３〜４月齢のＢ６雄性）。次に、これらの試料のＮＡＤ＋レベルをＨＰＬＣで測定した（Ｔｕｋｅｙの検定によりＡＮＯＶＡで解析した）。ＮＡＤ＋レベルは、対照マウスと比較して、Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンマウスの空腸で有意に減少した（図２１）。これらの結果は、消化管から血液循環へのＮＭＮの吸収に小腸のＳｌｃ１２ａ８が重要であり、小腸のＮＡＤ＋レベルとインビボにおけるＮＭＮの全身供給に影響することを強く示唆する。
［実施例１１］
実施例は、Ｓｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスの特性評価を示す。
Ｓｌｃ１２ａ８遺伝子のエクソン４を、上記のＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９システムを使用してマウスから切除し、全身Ｓｌｃ１２ａ８ノックアウト（Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯ）マウスを作製した。これらのノックアウトマウスの出生率は、予想されるメンデルの比率よりも低く、胚期の間にいくらかの早死があったことを意味する。しかしながら、生まれたマウスは成体になり、肉眼的な異常は観察されなかった。Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスおよび対照野生型同腹仔（ＷＴ）からの十二指腸、空腸、回腸、および膵臓の組織試料を、明期（午前９時から１０時）または暗期（午後９時から１０時）に採取した。これらの試料のＮＡＤ＋レベルをＨＰＬＣで測定した（Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスの空腸の３つのデータポイントを除き、明期でｎ＝５マウス、暗期でｎ＝４マウス、８〜１０月齢の雌性、独立ｔ検定で解析した）。成体Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスでは、全長Ｓｌｃ１２ａ８ ｍＲＮＡの発現は組織で完全に消失した（ｎ＝３、２〜３月齢の雄性、図２２）。ウエスタンブロッティングにより、Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質発現が、Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスの空腸および回腸の全組織溶解物（図２３）、膵臓（図２３）および視床下部（図２４）でも消失することが示された。Ｓｌｃ１２ａ８のＮ末端ドメインの最初の１７アミノ酸に対する抗血清を使用した。野生型マウスで高レベルのＳｌｃ１２ａ８ ｍＲＮＡを発現しているにもかかわらず（図２）、ノックアウトマウスの十二指腸は全長Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質を発現しない（図２３）。小腸でのタンパク質発現プロファイルと一致して、Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスは空腸および回腸でＮＡＤ＋レベルの有意な減少を示したが、特に通常はＮＡＤ＋１９８レベルが上昇する暗期に十二指腸では減少しなかった（図２５Ａ−Ｂ）。また、明期と暗期の両方において、膵臓のＮＡＤ＋が減少を示した（図２５Ａ−Ｂ）。ＮＭＮ輸送がＳｌｃ１２ａ８ＫＯマウスの小腸で損なわれているか否かを確認するために、発明者らは二重標識３−Ｄのより重い同位体ＮＭＮ（１８Ｏ−Ｄ−ＮＭＮ）の強制投与を行い、質量分析法により空腸および回腸への１８Ｏ−Ｄ−ＮＭＮの直接取込み量を測定した。Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスと野生型（ＷＴ）同腹仔に７５８ １８Ｏ−Ｄ−ＮＭＮ ５００ｍｇ／ｋｇを経口強制投与により投与してから１０分後に、この同位体ＮＭＮが野生型空腸および回腸で明確に検出されたが、Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスの空腸および回腸では、１８Ｏ−Ｄ−ＮＭＮの取込みは、各々４６％および３６％減少した（図２６、ｎ＝６マウス、７〜８月齢の雄性３および雌性３、野生型回腸の雄性２と雌性２を除く、独立ｔ検定により解析した）。ＰＢＳ対照のバックグラウンド値を差し引いて、１８Ｏ−Ｄ−ＮＭＮのピーク下面積を計算した。値は、ＷＴで検出された１８Ｏ−Ｄ−ＮＭＮレベルに対して表される。この例では、全ての値は平均±ＳＥＭで表示される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
［実施例１２］
本実施例は、Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスが脂肪量および除脂肪量には影響がなく過食症を呈することを示す。
６〜７月齢で、特に雌性のＳｌｃ１２ａ８ＫＯマウスは、暗期中に著しい過食を示し始めた（図２７）。明期（午前９時〜午後６時）および暗期（午後６時〜午前９時）にＳｌｃ１２ａ８ＫＯマウスおよび対照野生型（ＷＴ）同腹仔の食物摂取量を５日間測定した（各遺伝子型ごとにｎ＝８マウス、６〜７月齢の雌性、独立ｔ検定で解析した）。しかしながら、Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスは、野生型対照と比較して、体脂肪および除脂肪量にいかなる差も示さなかった（図２８）。Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯおよび対照野生型同腹仔に全身ＮＭＲ装置を使用して、体脂肪および除脂肪量を測定した（各遺伝子型でｎ＝８マウス、８〜１０月齢の雌性）。対照マウスとＳｌｃ１２ａ８ＫＯマウスの間に糞便中脂質含有量に差がなかったので、示された過食は腸の吸収不良によるものではなかった（図２９）。抽出された開始便量のパーセンテージとして表された総脂質含有量は、Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスおよび対照野生型同腹仔から午前９〜１０時に採取した糞便で測定した（各遺伝子型でｎ＝８マウス、６〜８月齢の雌性）。
［実施例１３］
本実施例は、Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスの増大した呼吸量および活動量を示す。
興味深いことに、Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスは、暗期中に酸素消費量（ＶＯ２、図３０）、エネルギー消費量（図３１）および総自発運動量（図３２）の中程度の増加を示し、体重増加のない過食性表現型に対する説明を提供した。また、これらのマウスは有意に低い呼吸交換率を示し（ＲＥＲ、図３３）、明期中のより高い脂肪酸利用が示唆され、対照とＳｌｃ１２ａ８ＫＯマウスの間に血漿脂肪酸レベルの差は検出されなかったが（表示せず）、正常な脂肪量の維持に関する追加の説明を提供した。
［実施例１４］
本実施例は、Ｓｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスにおける亢進したグルコース代謝を示す。
１６時間絶食すると、雌性Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウス（各遺伝子型でｎ＝８マウス、６〜８月齢の雌性、独立ｔ検定で解析した）は、より高いグルコースレベル（図３４）、インスリンレベル（図３５）、およびトリグリセリドレベル（図３６）を示した。理論に制限されることなく、これら全ての表現型はともに、視床下部の機能障害を示唆する。
［実施例１５］
本実施例は、Ｓｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスにおけるグルカゴン様ペプチド２受容体（ＧＬＰ−２Ｒ）の障害を示す。
ＧＬＰ−２Ｒは、腸管内分泌Ｌ細胞により生成されるプログルカゴン由来の３３アミノ酸ペプチドである。Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスおよび対照野生型同腹仔を２４時間絶食後（午前９時から午前９時まで）およびその後６時間の再給餌後（午前１０時から午後４時まで）に、血漿ＧＬＰ２−レベルをＥＬＩＳＡで測定した（各遺伝子型についてｎ＝８マウス、７〜８月齢雌性）。Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスは、２４時間絶食後の６時間の再給餌に応答して有意に低いＧＬＰ−２の血漿レベルを示したが、対照マウスは再給餌により血漿ＧＬＰ−２レベルの有意な上昇を示した（図３７）。
［実施例１６］
本実施例は、Ｓｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスの弓状核の発現破壊を示す。
Ｃｈｏｐ（ＤＮＡ損傷誘導性転写物３）およびＳｏｃｓ３（サイトカインシグナリング３のサプレッサー）は、小胞体（ＥＲ）ストレスおよびその結果生成するレプチン耐性に応答して上方制御される。ＣｈｏｐおよびＳｏｃｓ３ ｍＲＮＡ発現レベルを、Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスおよび対照野生型同腹仔の視床下部弓状核で暗期（午後９時から１０時）に測定した（Ｃｈｏｐ、各遺伝子型でｎ＝３マウス、Ｓｏｃｓ３、各遺伝子型でｎ＝４マウス、８〜１０月齢雌性、独立ｔ検定により解析した）。この妥当なＧＬＰ−２刺激の欠如と一致して、Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスの弓状核はｍＲＮＡ発現レベルの亢進を示した（図３８）。理論に制限されることなく、これらの結果は弓状ニューロンの機能不全を示唆する（Williams, K. W., et al., Cell Metab., 20, 471-482, 2014）。Ｐｅｐｃｋ（ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ）およびＧ６ｐｃ（グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット）のｍＲＮＡ発現レベルを、不断給餌したＳｌｃ１２ａ８ＫＯマウスおよび対照野生型同腹仔の肝臓で測定した（各遺伝子型でｎ＝５マウス、８〜１０月齢の雌性、独立ｔ検定で解析した）。これらの糖新生遺伝子は、Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスで上方制御されることが発見された（図３９）。理論に制限されることなく、これらのデータは球状ニューロンの機能不全の証拠を提供し、絶食Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスのより高いグルコースおよびインスリンレベルを説明する。
［実施例１７］
本実施例は、Ｓｌｃ１２ａ８ノックアウトマウスにおけるＰＭＣＨの日内ｍＲＮＡ発現プロファイルを示す。
ＰＭＣＨ（プロメラニン濃縮ホルモン）ｍＲＮＡ発現レベルを、Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスおよび対照野生型同腹仔の外側視床下部（ＬＨ）で明期（午前９時から１０時）および暗期（午後９時から１０時）に測定した（各遺伝子型に対してｎ＝３マウス、８〜１０月齢の雌性、独立ｔ検定により解析した）。ＰＭＣＨの日内ｍＲＮＡ発現プロファイルは、Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスの外側視床下部で異常であり（図４０）、明期と暗期の間で発現の変化がほとんどないことが示されたが、野生型同腹仔におけるＰＭＣＨの発現は暗期に有意に増加した。理論に制限されることなく、ＮＭＮトランスポーターの損失は視床下部機能に全体的に影響する。Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯマウスの他の視床下部核の主要な神経ペプチドとその受容体をコードする遺伝子の発現に異常は検出されなかった（表示せず）。理論に制限されることなく、これらの発見は、Ｓｌｃ１２ａ８ ＮＭＮトランスポーターの新規機能を明示しており、おそらくＮＭＮ自体とＧＬＰ−２を介して、消化管と視床下部の間の適切な組織間コミュニケーションを調節している。
［実施例１８］
本実施例は、小腸におけるＮＡＤ＋およびＳｌｃ１２ａ８濃度を示す。
多くの組織でＮＡＤ＋含有量が年齢とともに減少することが十分に立証されている（Yoshino, J., et al., Cell Metab., 2018, 27: 513-528, 2018）。２月齢および２４月齢の雌性Ｂ６マウスから暗期（午後９時から１０時）に採取した空腸および回腸で、ＮＡＤ＋レベルを測定した。空腸および回腸でＮＡＤ＋含有量が月齢とともに減少するが、その差は空腸では統計的有意性に達しなかった（図４３、各月齢でｎ＝４マウス、独立ｔ検定で解析した）。２月齢および２４月齢の雌性Ｂ６マウスから暗期（午後９時から１０時）に採取した空腸および回腸で、Ｓｌｃ１２ａ８ ｍＲＮＡ発現を測定した（各月齢でｎ＝４マウス、独立ｔ検定で解析した）。観察されたＮＡＤ＋の減少と一致して、Ｓｌｃ１２ａ８の発現は、高齢の回腸で有意に上方制御された（図４４）。これらの結果は、Ｓｌｃ１２ａ８の上方制御が消化管内のＮＡＤ＋の減少と相関していることを示す。
［実施例１９］
本実施例は、マウスにおけるグルコース代謝に対するＳｌｃ１２ａ８消化管ノックダウンの効果を示す。
本発明者らは、対照ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）ｓｈＲＮＡおよびＳｌｃ１２ａ８ ｓｈＲＮＡを担持したレンチウイルスを２月齢および２４月齢マウスに経口強制投与し、それらの摂取行動を調べた。２月齢および２４月齢の腸Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウン雌性Ｂ６マウス（ｓｈＳｌｃ１２ａ８）および対照マウス（ｓｈｆＬｕｃ）において、明期（午前９時から午後６時まで）および暗期（午後６時から午前９時まで）に、食物摂取量を４日間測定した。興味深いことに、消化管特異的Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンは、高齢マウスの暗期の食物摂取量の有意な減少を引き起こしたが、若年マウスではまったく食物摂取量に影響を与えなかった（図４５、２月齢の腸Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンおよび対照雌性Ｂ６マウスでは各々ｎ＝６マウス、および２４月齢の腸Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンおよび対照雌性Ｂ６マウスでは各々ｎ＝９マウス、Ｔｕｋｅｙの検定によりＡＮＯＶＡで解析した）。２月齢または２４月齢の腸Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウン雌性Ｂ６マウス（ｓｈＳｌｃ１２ａ８）および対照マウス（ｓｈｆＬｕｃ）において、２４時間絶食後に、空腹時グルコースレベルを測定した（図４６、２月齢の腸Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンおよび対照雌性Ｂ６マウスでは各々ｎ＝６マウス、および２４月齢の腸Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンおよび対照雌性Ｂ６マウスでは各々ｎ＝９マウス、独立ｔ検定により解析した）。従って、Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンは、高齢マウスにおいて空腹時グルコースレベルを低下させたが、しかしながら、若年マウスでは低下させなかった（図４６）。理論に制限されることなく、これらの結果はＳｌｃ１２ａ８の発現が、消化管におけるＮＡＤ＋の産生に影響することを示す。
［実施例２０］
本実施例は、消化管特異的Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンがグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）の血中循環濃度を有意に上昇させることを示す。
ＧＬＰ−１は、腸内分泌Ｌ細胞によって産生されるプログルカゴン由来の食欲抑制ペプチドである。２月齢または２４月齢の腸Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウン雌性Ｂ６マウス（ｓｈＳｌｃ１２ａ８）および対照マウス（ｓｈｆＬｕｃ）に２４時間絶食に続く６時間の再給餌（午前１０時から午後４時まで）後の血漿ＧＬＰ−１レベルをＥＬＩＳＡで測定した。Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンは、高齢マウスでは２４時間絶食後の６時間の再給餌に応答してＧＬＰ−１の循環レベルを上昇させたが、若年マウスでは上昇させなかった（図４７、２月齢の腸Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンおよび対照雌性Ｂ６マウスに+ついて各々ｎ＝６マウス、および２４月齢の腸Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンおよび対照雌性Ｂ６マウスについ各々ｎ＝９マウス、独立ｔ検定により解析した）。理論に制限されることなく、これらの結果は、ＧＬＰ−１の分泌がＳｌｃ１２ａ８活性によって影響されることを示す。
［実施例２１］
本実施例は、高齢回腸に対するＳｌｃ１２ａ８ノックダウンの効果を示す。
ＧＬＰを産生するＬ細胞が回腸で濃縮されることはよく知られている（Yoon, M. J., et al., Cell Metab., 2015, 21, 706-717）。従って、回腸におけるＳｌｃ１２ａ８およびＧＡＰＤＨの発現を調べた。２月齢（図４８）または２４月齢（図４９）の腸Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウン雌性Ｂ６マウス（ｓｈＳｌｃ１２ａ８）および対照マウス（ｓｈｆＬｕｃ）の回腸溶解物において、Ｓｌｃ１２ａ８およびＧＡＰＤＨのウエスタンブロットを行った。図４８〜４９は代表的なウエスタンブロットを示し（左パネル）、対応する棒グラフは回腸のＧＡＰＤＨタンパク質レベルに正規化されたＳｌｃ１２ａ８タンパク質レベルを示す（右パネル）。Ｓｌｃ１２ａ８のＮ末端ドメインの最初の１７アミノ酸に対する抗血清を使用した（２月齢の腸Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンおよび対照マウスでは各々ｎ＝６、および２４月齢の腸Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンおよび対照マウスでは各々ｎ＝４〜５、独立ｔ検定により解析した）。若年および高齢のＳｌｃ１２ａ８ノックダウンマウスの回腸でＳｌｃ１２ａ８タンパク質のレベルが有意に減少したが（図４８〜４９）、高齢のＳｌｃ１２ａ８ノックダウン回腸のみがＮＡＤ＋レベルの有意な減少を示し（図５０）、高齢の回腸におけるＮＡＤ＋恒常性の維持におけるＳｌｃ１２ａ８の上方制御の生理学的重要性が確認された。図５０は、２月齢または２４月齢の腸Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウン（ｓｈＳｌｃ１２ａ８）および対照雌性Ｂ６マウス（ｓｈｆＬｕｃ）の回腸におけるＮＡＤ＋レベルを示す（２月齢の腸Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンおよび対照雌性Ｂ６マウスについてｎ＝６マウス、および２４月齢の腸Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウンおよび対照雌性Ｂ６マウスについて各々ｎ＝９マウス、独立ｔ検定により解析した）。理論に制限されることなく、これらの結果は、高齢の回腸におけるＮＡＤ＋恒常性を維持するためにＳｌｃ１２ａ８の上方制御が必要であることを示す。
［実施例２２］
本実施例は、培養回腸におけるＧＬＰ−１レベルに対するＳｌｃ１２ａ８ノックダウンの効果を示す。
本発明者らは、エクスビボで高齢ｆＬｕｃ対照およびＳｌｃ１２ａ８ノックダウンマウスの回腸の培養も実施した。３７℃にて２時間培養した２４月齢の腸Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウン雌性Ｂ６マウス（ｓｈＳｌｃ１２ａ８）および対照マウス（ｓｈｆＬｕｃ）のエクスビボ回腸外植片の上清のＥＬＩＳＡにより、ＧＬＰ−１レベルを測定した（ｎ＝４マウス、独立ｔ検定を使用して解析した）。図５１は、高齢のＳｌｃ１２ａ８−ノックダウン回腸が、高齢のｆＬｕｃ対照回腸からのものと比較して３倍のレベルのＧＬＰ−１を分泌したことを示す。高齢ｆＬｕｃ対照とＳｌｃ１２ａ８ノックダウンマウスからエクスビボで培養した結腸は、ＧＬＰ−１分泌に違いを示さなかった。３７℃にて２時間培養した１２月齢Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯ雌性マウス（Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯ）および対照野生型同腹仔（ＷＴ）のエクスビボ回腸外植片の上清のＥＬＩＳＡにより、ＧＬＰ−１レベルを測定した（ｎ＝４マウス、独立ｔ検定により解析した）。１２月齢Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯ雌性マウス（Ｓｌｃ１２ａ８ＫＯ）および対照野生型同腹仔（ＷＴ）のこれらの回腸試料で、ＮＡＤ＋レベルも測定した（ＷＴでｎ＝３マウス、およびＳｌｃ１２ａ８ＫＯでｎ＝４、独立ｔ検定により解析した）。全ての値は平均値±ＳＥＭとして示される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図５２は、１２月齢対照およびＳｌｃ１２ａ８ＫＯマウスのエクスビボ培養された回腸におけるＧＬＰ−１分泌の増加とＮＡＤ＋の減少を示す。理論に制限されることなく、これらの例は、Ｓｌｃ１２ａ８が高齢マウスの消化管におけるＮＡＤ＋の減少の原因であることを示している。
［実施例２３］
本実施例は、エクスビボ培養された回腸に対するＳＩＲＴ１およびＳＩＲＴ６阻害剤の効果を示す。
観察されたＧＬＰ−１分泌の増加への、ＳＩＲＴ１の関与（Yoon, M. J., et al., Cell Metab., 2015, 21, 706-717）およびＳＩＲＴ６の関与（Jiang, H., et al., Nature, 2013, 496, 110-113）を検討した。エクスビボで培養された野生型の回腸を、ＳＩＲＴ１およびＳＩＲＴ６阻害剤で処理した。０．２％ＤＭＳＯ、２０μＭ ＥＸ５２７または２０μＭ ＳＴＫ６６５４０１で４時間培養した２４月齢雌性Ｂ６マウスのエクスビボ回腸外植片の上清において、ＥＬＩＳＡによりＧＬＰ−１レベルを測定した（ｎ＝３マウス、Ｔｕｋｅｙの検定を使用してＡＮＯＶＡで解析した）。ＳＩＲＴ６特異的阻害剤であるＳＴＫ６６５４０１ではなく、強力なＳＩＲＴ１特異的阻害剤であるＥＸ５２７のみが、回腸からのＧＬＰ−１の分泌を亢進させることができた（図５３）。理論に制限されることなく、これらの結果は、高齢Ｓｌｃ１２ａ８ノックダウン回腸において観察されたＧＬＰ−１分泌の亢進に、ＮＡＤ＋の有意な減少によるＳＩＲＴ１活性の低下が関与している可能性が高いことを示す。
本発明またはその好ましい実施形態の要素を紹介するとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「ｓａｉｄ」は、１つ以上の要素があることを意味することを意図している。「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」および「ｈａｖｉｎｇ」という用語は、包括的であることを意図しており、リストされた要素以外の追加の要素が存在する可能性があることを意味する。
上記を考慮して、本発明のいくつかの目的が達成され、別の有利な結果が得られることが分かるであろう。
本発明の範囲から逸脱することなく、上記の生成物および方法に種々の変更を加えることができるように、上記の説明に含まれ、および添付の図面に示される全ての事項は、限定的な意味ではなく例示として解釈されるものとする。

Claims (91)

  1. それを必要とする対象の加齢関連症状を治療する方法であって、該対象に治療有効量のニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）ならびにニコチン酸、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロール、β−ピリジルカルビノール、ヘキサニコチン酸イノシトール、そのいずれかのエステル、そのいずれかの薬学的に許容可能な塩、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つの追加の化合物を投与することを含み、該加齢関連症状がインスリン感受性の損失、インスリン分泌の損失、インスリンの作用と分泌の損失、記憶機能の障害、眼機能の低下、網膜の変性、機能低下、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つの症状を含む方法。
  2. 前記加齢関連症状がインスリン感受性の損失を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記加齢関連症状がインスリン分泌の損失を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記加齢関連症状がインスリンの作用と分泌の損失を含む、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
  5. 前記加齢関連症状が記憶機能の障害を含む、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
  6. 前記加齢関連症状が眼機能の低下を含む、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
  7. 前記加齢関連症状が網膜の変性を含む、請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
  8. 前記加齢関連症状が機能の低下を含む、請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
  9. 前記機能の低下が食欲不振、低グルコースレベル、筋力低下、栄養失調、加齢による無食欲、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される、請求項８に記載の方法。
  10. それを必要とする対象の医学症状を治療する方法であって、該対象に治療有効量のニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）ならびにニコチン酸、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロール、β−ピリジルカルビノール、ヘキサニコチン酸イノシトール、そのいずれかのエステル、そのいずれかの薬学的に許容可能な塩、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つの化合物を投与することを含み、該医学症状が筋疾患、２型糖尿病、肥満、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つを含む方法。
  11. 前記医学症状が筋疾患を含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記筋疾患が筋脆弱、筋萎縮症、筋消耗、筋力低下、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 前記筋疾患がサルコペニア、ダイナペニア、悪液質、筋ジストロフィー、筋緊張障害、脊髄性筋萎縮症、ミオパシー、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される、請求項１０〜１２のいずれか１つに記載の方法。
  14. 前記筋ジストロフィーがデユシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、エメリードレイフス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、眼咽頭筋ジストロフィー、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記筋緊張障害が筋強直性ジストロフィー、先天性ミオトニー、先天性パラミオトニア、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. 前記ミオパシーがベツレムミオパシー、先天性線維型不均衡、進行性線維性異形成、甲状腺機能亢進性ミオパシー、甲状腺機能低下性ミオパシー、ミニコアミオパシー、マルチコアミオパシー、筋管ミオパシー、ネマリンミオパシー、周期性麻痺、低カリウムミオパシー、高カリウムミオパシー、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される、請求項１３〜１５のいずれか１つに記載の方法。
  17. 前記筋疾患が酸性マルターゼ欠乏症、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症、デブランチャー酵素欠損症、ラクテートデヒドロゲナーゼ欠損症、ミトコンドリア筋症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症、ホスホリラーゼ欠損症、ホスホフルクトキナーゼ欠損症、ホスホグリセリン酸キナーゼ異常症、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される、請求項１０〜１６のいずれか１つに記載の方法。
  18. 前記筋疾患がサルコペニア、ダイナペニア、悪液質、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される、請求項１０〜１７のいずれか１つに記載の方法。
  19. 前記筋疾患がサルコペニアである、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記医学症状が２型糖尿病を含む、請求項１０〜１９のいずれか１つに記載の方法。
  21. 前記医学症状が肥満を含む、請求項１０〜２０のいずれか１つに記載の方法。
  22. 前記少なくとも１つの追加の化合物がニコチン酸、そのいずれかのエステル、またはそのいずれかの薬学的に許容可能な塩を含む、請求項１〜２１のいずれか１つに記載の方法。
  23. 前記ニコチン酸のエステルまたは薬学的に許容可能な塩が構造式（Ｉ）
    Figure 2020530460
     ［式中、Ｒはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−オクチル、２−クロロエチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、２−メトキシエチル、２−ブトキシエチル、カルバモイルメチル、１−カルバモイルエチル、２−ジメチルアミノエチル、３−アミノプロピル、テトラヒドロフルフリル、ベンジル、フェノキシエチル、ｐ−クロロフェニル、およびｐ−ニトロフェニルから成る群から選択される］で表される化合物である、請求項１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
  24. Ｒが２−ジメチルアミノエチル、ｐ−クロロフェニル、およびｐ−ニトロフェニルから成る群から選択される、請求項２３に記載の方法。
  25. １日当たり約５０ｍｇから約５００ｍｇの前記少なくとも１つの追加の化合物が前記対象に投与される、請求項１〜２４のいずれか１つに記載の方法。
  26. １日当たり約１０ｍｇから約５００ｍｇのＮＭＮが前記対象に投与される、請求項１〜２５のいずれか１つに記載の方法。
  27. 前記対象がＮＭＮと前記少なくとも１つの追加の化合物を含む医薬組成物を投与される、請求項１〜２６のいずれか１つに記載の方法。
  28. それを必要とする対象のＮＭＮの細胞内取込みを亢進させる方法であって、ニコチン酸、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロール、β−ピリジルカルビノール、ヘキサニコチン酸イノシトール、そのいずれかのエステル、そのいずれかの薬学的に許容可能な塩、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される治療有効量の化合物を該対象に投与することを含む方法。
  29. 前記化合物がニコチン酸、そのエステル、またはその薬学的に許容可能な塩を含む、請求項２８に記載の方法。
  30. ニコチン酸の前記エステルまたは薬学的に許容可能な塩が構造式（Ｉ）
    Figure 2020530460
     ［式中、Ｒはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−オクチル、２−クロロエチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、２−メトキシエチル、２−ブトキシエチル、カルバモイルメチル、１−カルバモイルエチル、２−ジメチルアミノエチル、３−アミノプロピル、テトラヒドロフルフリル、ベンジル、フェノキシエチル、ｐ−クロロフェニル、およびｐ−ニトロフェニルから成る群から選択される。］で表される化合物である、請求項２８または２９に記載の方法。
  31. Ｒが２−ジメチルアミノエチル、ｐ−クロロフェニル、およびｐ−ニトロフェニルから成る群から選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. １日当たり約５０ｍｇから約５００ｍｇの前記化合物が前記対象に投与される、請求項２８〜３１のいずれか１つに記載の方法。
  33. それを必要とする対象のＮＡＤ＋産生を刺激するおよび／または細胞内へのＮＭＮの取込みを亢進させる方法であって、該対象に治療有効量のＳｌｃ１２ａ８をコードする核酸を投与することを含む方法。
  34. 前記Ｓｌｃ１２ａ８をコードする核酸がＳｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡを含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記Ｓｌｃ１２ａ８をコードする核酸の投与がＳｌｃ１２ａ８をコードする遺伝子治療ベクターを投与することを含む、請求項３３または３４に記載の方法。
  36. 前記遺伝子治療ベクターがレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項３３〜３５のいずれか１つに記載の方法。
  37. 前記遺伝子治療ベクターがレトロウイルスを含み、該レトロウイルスがレンチウイルスを含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡがＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の配列相同性を有する配列を含む、請求項３４〜３７のいずれか１つに記載の方法。
  39. 前記Ｓｌｃ１２ａ８をコードする核酸を前記対象の前記消化管に投与することを含む、請求項３３〜３８のいずれか１つに記載の方法。
  40. 前記Ｓｌｃ１２ａ８をコードする核酸を前記対象の前記小腸に投与することを含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記対象が筋疾患、２型糖尿病、肥満、加齢関連症状、またはそのいずれかの組み合わせの治療を必要とする、請求項３３〜４０のいずれか１つに記載の方法。
  42. 前記加齢関連症状がインスリン感受性の損失、インスリン分泌の損失、インスリンの作用と分泌の損失、記憶機能の障害、眼機能の低下、網膜の変性、機能低下、肥満、およびそのいずれかの組み合わせから成る群から選択される、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記加齢関連症状が加齢関連肥満を含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記対象が哺乳動物である、請求項１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
  45. 前記対象がマウスまたはラットである、請求項１〜４４のいずれか１つに記載の方法。
  46. 前記対象がヒトである、請求項１〜４５のいずれか１つに記載の方法。
  47. 前記ヒトが少なくとも３０歳、少なくとも４０歳、少なくとも５０歳、少なくとも６０歳、または少なくとも７０歳の年齢を有する、請求項４６に記載の方法。
  48. Ｓｌｃ１２ａ８をコードする核酸を含む遺伝子治療ベクター。
  49. 前記Ｓｌｃ１２ａ８をコードする核酸がＳｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡを含む、請求項４８に記載の遺伝子治療ベクター。
  50. 前期ベクターがレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項４８または４９に記載の遺伝子治療ベクター。
  51. 前期遺伝子治療ベクターがレトロウイルスを含み、該レトロウイルスがレンチウイルスを含む、請求項５０に記載の遺伝子治療ベクター。
  52. 前記Ｓｌｃ１２ａ８をコードするｃＤＮＡがＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の配列相同性を有する配列を含む、請求項４９〜５１のいずれか１つに記載の遺伝子治療ベクター。
  53. Ｓｌｃ１２ａ８遺伝子に不活性化変異を含む非ヒト動物。
  54. 前期非ヒト動物がマウスまたはラットを含む、請求項５３に記載の非ヒト動物。
  55. 前記Ｓｌｃ１２ａ８遺伝子における前記不活性化変異が前期Ｓｌｃ１２ａ８遺伝子における欠損、前記Ｓｌｃ１２ａ８遺伝子への挿入、またはその組み合わせを含む、請求項５３または５４に記載の非ヒト動物。
  56. 前記Ｓｌｃ１２ａ８遺伝子における前記不活性化変異がＳｌｃ１２ａ８遺伝子における欠損を含む、請求項５５に記載の非ヒト動物。
  57. 前記欠損が前記Ｓｌｃ１２ａ８遺伝子のエクソン４またはその一部の欠損を含む、請求項５６に記載の非ヒト動物。
  58. 前記欠損がエクソン４の欠損を含む、請求項５７に記載の非ヒト動物。
  59. Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株であって、該ｃＤＮＡが
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２（マウスＳｌｃ１２ａ８タンパク質）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３（マウスＳｌｃ１２ａ８変異体Ａタンパク質）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（マウスＳｌｃ１２ａ８変異体Ｂタンパク質）、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５（ヒトＳｌｃ１２ａ８タンパク質）をコードするｃＤＮＡ、
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の相同性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡ、または
    （ｃ）ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）またはＳｌｃ１２ａ８ヒト全長ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の配列相同性を有するｃＤＮＡ配列、を含む哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株。
  60. 前記哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株が胎盤由来の細胞を含まない、請求項５９に記載の哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株。
  61. Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株であって、該哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株が胎盤由来の細胞を含まない哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株。
  62. 前記ｃＤＮＡがマウスＳｌｃ１２ａ８タンパク質もしくはその変異体またはヒトＳｌｃ１２ａ８タンパク質もしくはその変異体をコードする、請求項６１に記載の哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株。
  63. 前記ｃＤＮＡがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５をコードするｃＤＮＡを含む、請求項５９〜６２のいずれか１つに記載の哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株。
  64. さらに前記ｃＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項５９〜６３のいずれか１つに記載の前記哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株。
  65. 前記ｃＤＮＡを含まない同等の哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株における前記Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質の前記発現と比較して、前記Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質の前記発現が亢進している、請求項５９〜６４のいずれか１つに記載の哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株。
  66. 前記哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株が検出可能なＣＤ７３活性を欠いている、検出可能なＣＤ３８活性を欠いている、または検出可能なＣＤ７３活性と検出可能なＣＤ３８活性の両方を欠いている、請求項５９〜６５のいずれか１つに記載の哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株。
  67. 前記哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株が亢進したＮＭＮ取込みを示す、請求項５９〜６６のいずれか１つに記載の哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株。
  68. 前記哺乳動物細胞が線維芽細胞、腸管細胞、膵細胞、肝細胞、脂肪細胞、ニューロン、またはグリア細胞を含み、または該哺乳動物細胞株が線維芽細胞、腸管細胞、膵細胞、肝細胞、脂肪細胞、ニューロン、またはグリア細胞を含む、請求項５９〜６７のいずれか１つに記載の哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株。
  69. 前記哺乳動物細胞がＮＩＨ３Ｔ３細胞である、または該哺乳動物細胞株がＮＩＨ３Ｔ３細胞株である、請求項５９〜６８のいずれか１つに記載の哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株。
  70. 前記哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株が前記ｃＤＮＡ配列で安定的に形質転換される、請求項５９〜６９のいずれか１つに記載の哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株。
  71. 前記哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株が前記ｃＤＮＡ配列で一過性に形質転換される、請求項５９〜７０のいずれか１つに記載の哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株。
  72. 前記ｃＤＮＡ配列がＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１３４２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の配列相同性を有する、請求項５９〜７１のいずれか１つに記載の哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株。
  73. 前記哺乳動物細胞がマウスまたはラット細胞である、または前記哺乳動物細胞株がマウスまたはラット細胞株である、請求項５９〜７２のいずれか１つに記載の哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株。
  74. 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、または前記哺乳動物細胞株がヒト細胞株である、請求項５９〜７２のいずれか１つに記載の哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株。
  75. ＮＭＮ輸送を促進する化合物を同定するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、該方法が
    （ａ）該候補化合物を、ＮＭＮトランスポータータンパク質を発現している細胞またはＮＭＮトランスポータータンパク質を含むプロテオリポソームと接触させること、および
    （ｂ）該細胞における該ＮＭＮトランスポータータンパク質の該発現または活性の変化、または該プロテオリポソームにおける該ＮＭＮトランスポータータンパク質の該活性の変化を検出することを含み、
    ここで、該候補化合物との接触後の、該細胞における該ＮＭＮトランスポータータンパク質の該発現または活性の変化、または該プロテオリポソームにおける該ＮＭＮトランスポータータンパク質の該活性の変化が、該候補化合物がＮＭＮの前記輸送を調節することを意味することを特徴とする方法。
  76. 前記ＮＭＮトランスポータータンパク質がＳｌｃ１２ａ８タンパク質を含む、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記Ｓｌｃ１２ａ８タンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２（マウスＳｌｃ１２ａ８タンパク質）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３（マウスＳｌｃ１２ａ８変異体Ａタンパク質）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（マウスＳｌｃ１２ａ８変異体Ｂタンパク質）、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５（ヒトＳｌｃ１２ａ８タンパク質）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７６に記載の方法。
  78. （ｉ）前記候補化合物との接触後に、前記ＮＭＮトランスポータータンパク質を発現している前記細胞における前記ＮＭＮトランスポータータンパク質の該発現または活性、を
    （ｉｉ）該候補化合物との接触後に、前記ＮＭＮトランスポータータンパク質を発現していない細胞、または前記ＮＭＮトランスポータータンパク質の発現または活性が阻害されている細胞における該ＮＭＮトランスポータータンパク質の該発現または活性、と比較することをさらに含む、請求項７５〜７７のいずれか１つに記載の方法。
  79. 前記ＮＭＮトランスポータータンパク質を発現していない前記細胞がＳｌｃ１２ａ８ノックアウト動物の細胞を含む、請求項７８に記載の方法。
  80. （ｉ）前記候補化合物との接触後に、前記ＮＭＮトランスポータータンパク質を含む前記プロテオリポソームにおける前記ＮＭＮトランスポータータンパク質の前記活性、を
    （ｉｉ）該候補化合物との接触後に、前記ＮＭＮトランスポータータンパク質を含まないプロテオリポソーム、または前記ＮＭＮトランスポータータンパク質の該活性が阻害されているプロテオリポソームにおける前記ＮＭＮトランスポータータンパク質の前記活性、と比較することをさらに含む、請求項７５〜７７のいずれか１つに記載の方法。
  81. 前記ＮＭＮトランスポータータンパク質を含まない前記プロテオリポソームがＳｌｃ１２ａ８ノックアウト動物の細胞のプロテオリポソームを含む、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記細胞が哺乳動物線維芽細胞、腸管細胞、膵細胞、肝細胞、脂肪細胞、ニューロン、またはグリア細胞を含み、または前記プロテオリポソームが哺乳動物線維芽細胞、腸管細胞、膵細胞、肝細胞、脂肪細胞、ニューロン、またはグリア細胞に由来するプロテオリポソームを含む、請求項７５〜８１のいずれか１つに記載の方法。
  83. 前記細胞が請求項５９〜７４のいずれか１つの哺乳動物細胞を含む、または前記プロテオリポソームが請求項５９〜７４のいずれか１つの哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株に由来するプロテオリポソームを含む、請求項７５〜８２のいずれか１つに記載の方法。
  84. 前記プロテオリポソームがＳｌｃ１２ａ８ｃＤＮＡを含む哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株に由来するプロテオリポソームを含む、請求項７５〜８３のいずれか１つに記載の方法。
  85. ＮＭＮおよびＮＭＮトランスポーターのアゴニストを含む医薬組成物。
  86. ＮＭＮトランスポーターの前記アゴニストが、ニコチン酸、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロール、β−ピリジルカルビノール、ヘキサニコチン酸イノシトール、そのエステル、その薬学的に許容可能な塩、およびその組み合わせから成る群から選択される化合物を含む、請求項８５に記載の医薬組成物。
  87. 前記ＮＭＮトランスポーターが、ニコチン酸、そのいずれかのエステル、またはそのいずれかの薬学的に許容可能な塩を含む、請求項８５または８６に記載の医薬組成物。
  88. ニコチン酸の前記エステルまたは薬学的に許容可能な塩が構造式（Ｉ）
    Figure 2020530460
     ［式中、Ｒはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−オクチル、２−クロロエチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、２−メトキシエチル、２−ブトキシエチル、カルバモイルメチル、１−カルバモイルエチル、２−ジメチルアミノエチル、３−アミノプロピル、テトラヒドロフルフリル、ベンジル、フェノキシエチル、ｐ−クロロフェニル、およびｐ−ニトロフェニルから成る群から選択される。］で表される化合物である、請求項８７に記載の医薬組成物。
  89. Ｒが２−ジメチルアミノエチル、ｐ−クロロフェニル、およびｐ−ニトロフェニルから成る群から選択される、請求項８８に記載の医薬組成物。
  90. 前記ＮＭＮトランスポーターがＳｌｃ１２ａ８ポリペプチドまたはその同族体である、請求項８５〜８９のいずれか１つに記載の医薬組成物。
  91. ＮＭＮおよびＳｌｃ１２ａ８またはその同族体の遺伝子発現の誘発物質を含む医薬組成物。
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