TW201919647A - 使用菸鹼醯胺單核苷酸之組成物及治療方法 - Google Patents

使用菸鹼醯胺單核苷酸之組成物及治療方法 Download PDF

Info

Publication number
TW201919647A
TW201919647A TW107128071A TW107128071A TW201919647A TW 201919647 A TW201919647 A TW 201919647A TW 107128071 A TW107128071 A TW 107128071A TW 107128071 A TW107128071 A TW 107128071A TW 201919647 A TW201919647 A TW 201919647A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
slc12a8
nmn
mammalian cell
protein
seq
Prior art date
Application number
TW107128071A
Other languages
English (en)
Inventor
今井真一郎
艾莉西亞 格吉歐
Original Assignee
華盛頓大學
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 華盛頓大學 filed Critical 華盛頓大學
Publication of TW201919647A publication Critical patent/TW201919647A/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4406—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof only substituted in position 3, e.g. zimeldine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/455—Nicotinic acids, e.g. niacin; Derivatives thereof, e.g. esters, amides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

描述用於治療年齡相關病況及其他醫學病況諸如肌病、第二型糖尿病、及/或肥胖之各種方法及組成物。進一步描述增強NMN之細胞攝取及刺激NAD+產生之方法。描述各種哺乳動物細胞及哺乳動物細胞株，包括包含編碼Slc12a8蛋白之cDNA者。亦揭示包含編碼Slc12a8之核酸之基因療法載體及包含Slc12a8基因之不活化突變之非人類動物。亦描述用於篩選出識別促進NMN運輸之化合物之候選化合物之方法。

Description

使用菸鹼醯胺單核苷酸之組成物及治療方法
本揭露係關於用於治療年齡相關病況及其他醫學病況諸如肌病、第二型糖尿病、及/或肥胖之各種方法及組成物。進一步描述增強NMN之細胞攝取及刺激NAD+產生之方法。描述各種哺乳動物細胞及哺乳動物細胞株，包括包含編碼Slc12a8蛋白之cDNA之哺乳動物細胞及哺乳動物細胞株。亦揭示包含編碼Slc12a8之核酸之基因療法載體及包含Slc12a8基因之不活化突變之非人類動物。亦描述用於篩選出識別促進NMN運輸之化合物之候選化合物之方法。
NAD+ 為涉及許多細胞氧化還原反應之通用且必需的輔酶。NAD+ 亦為NAD+ 消耗酶之活性所需的，包括NAD+ 依賴性蛋白去乙醯酶之sirtuin家族、聚-ADP-核糖聚合酶(PARP)、及CD38/157 NAD+ 水解酶/環狀ADP-核糖合成酶(Canto, C.等人, Cell Metab. 22, 304, 31-53, 2015；Imai, S.及Guarente, L., Trends in Cell Biology, 24, 306 464-471, 2014)。為了生成NAD+ ，哺乳動物利用諸如色胺酸、菸鹼醯胺及菸鹼酸(亦稱為維生素B3 之兩種形式)之各種前驅物及包括菸鹼醯胺核糖苷(NR)及菸鹼醯胺單核苷酸(NMN)之中間物。自菸鹼醯胺開始之補救途徑為哺乳動物中之主要NAD+ 生物合成途徑(Garten, A.等人, Nat. Rev. Endocrinol., 11, 535-546, 2015.；Imai, S., Curr. Pharm. Des., 15, 20-28, 2009)。在此途徑中，菸鹼醯胺磷酸核糖基轉移酶(NAMPT)由菸鹼醯胺及5'-磷酸核糖焦磷酸(phosphoribose pyrophosphate)產生NMN。然後NMN連同ATP一起藉由NMN腺苷酸轉移酶NMNAT1-3轉化成NAD+ 。NAMPT反應之產物為NMN，其為關鍵的NAD+ 中間物。NAMPT為哺乳動物中之限速NAD+生物合成酶。不受任何特定理論束縛，認為NMN可實用於預防及/或治療各種疾病病況並減輕年齡相關生理衰退。然而，NMN運輸機制存在爭議。
最初Gagnon, K.B.及Delpire, E.識別出Slc12a8(Am. J. Physiol. Cell Physiol., 304, C693-714, 2013)。然而，Gagnon等人未識別出Slc12a8之功能。Kubo, Y.等人(Exp. Eye Res., 124, 17-23, 2014)將Slc12a8識別為精胺運輸蛋白，但未揭示其涉及NMN運輸。
提供治療有需要之受試者之年齡相關病況之各種方法。通常，該等方法包含向該受試者投與治療有效量的菸鹼醯胺單核苷酸(NMN)及至少一種選自由菸鹼酸、戊四菸酯(niceritrol)、菸鹼酸生育酚酯、β-吡啶甲醇、六菸鹼酸肌醇、其任何酯、其任何醫藥上可接受之鹽、及其任何組合組成之群之額外化合物，且其中該年齡相關病況包含至少一種選自由胰島素敏感性缺乏、胰島素分泌缺乏、胰島素作用及分泌缺乏、記憶功能障礙、眼功能衰退、視網膜變性、功能衰退、及其任何組合組成之群之病況。
其他方法係關於治療有需要之受試者之醫學病況。該等方法包含向該受試者投與治療有效量的菸鹼醯胺單核苷酸(NMN)及至少一種選自由菸鹼酸、戊四菸酯、菸鹼酸生育酚酯、β-吡啶甲醇、六菸鹼酸肌醇、其任何酯、其任何醫藥上可接受之鹽、及其任何組合組成之群之化合物，其中該醫學病況包含選自由肌病、第二型糖尿病、肥胖、及其任何組合組成之群之至少一者。
亦提供一種增強有需要之受試者之NMN之細胞攝取之方法。該方法包含向該受試者投與治療有效量的選自由以下組成之群之化合物：菸鹼酸、戊四菸酯、菸鹼酸生育酚酯、β-吡啶甲醇、六菸鹼酸肌醇、其任何酯、其任何醫藥上可接受之鹽、及其任何組合。
提供一種用於在有需要之受試者中刺激NAD+產生及/或增加向細胞中之NMN攝取之方法。該方法包含向該受試者投與治療有效量的編碼Slc12a8之核酸。
提供一種基因療法載體。該基因療法載體包含編碼Slc12a8之核酸。
提供一種非人類動物。該非人類動物包含Slc12a8基因之不活化突變。
提供一種哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株。該哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株包含編碼Slc12a8蛋白之cDNA。該cDNA包含編碼SEQ ID NO：12(小鼠Slc12a8蛋白)、SEQ ID NO：13(小鼠Scl12a8變異體A蛋白)、SEQ ID NO：14(小鼠Scl12a8變異體B蛋白)、或SEQ ID NO：15(人類Slc12a8蛋白)之cDNA。
提供另一種哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株。該哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株包含編碼Slc12a8蛋白之cDNA。該cDNA包含編碼具有與SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%一致性之蛋白之cDNA。
提供又另一種哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株。該哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株包含編碼Slc12a8蛋白之cDNA。該cDNA包含具有與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)或Slc12a8人類全長cDNA(SEQ ID NO：11)至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或100%序列一致性之cDNA序列。
提供另一種哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株。該細胞或細胞株包含編碼Slc12a8蛋白之cDNA。該細胞或細胞株不包含胎盤衍生細胞。
提供用於篩選出識別調節NMN運輸之化合物之候選化合物之方法。該等方法包含(a)使該候選化合物與表現NMN運輸蛋白之細胞或包含NMN運輸蛋白之蛋白脂質體接觸；且(b)偵測該細胞中該NMN運輸蛋白之表現或活性變化或該蛋白脂質體中該NMN運輸蛋白之活性變化。與該候選化合物接觸之後該細胞中該NMN運輸蛋白之表現或活性變化或該蛋白脂質體中該NMN運輸蛋白之活性變化指示該候選化合物調節NMN之運輸。
提供一種醫藥組成物。該醫藥組成物包含NMN及NMN運輸蛋白促效劑。
提供另一種醫藥組成物。該醫藥組成物包含NMN及Slc12a8或其同源物之基因表現之誘導劑。
政府支持之聲明
本發明係在政府支持的情況下、根據美國國家衛生研究院(National Institutes of Health)授予之AG047902及AG037457進行。政府享有本發明中之某些權利。 對序列表之引用
序列表為本揭露之一部分，包括包含本發明之引物、核苷酸、及/或胺基酸序列之文本文件。該序列表之主題以全文引用之方式併入本文中。以計算機可讀形式記錄之資訊與書面序列表相同。
本文揭示增強向細胞中之NMN攝取之方法。亦揭示實用於研究Slc12a8及因之NMN運輸之細胞株。發明人已識別出運輸蛋白Slc12a8，其增強向細胞中之NMN攝取。
本文所揭示之方法可用於治療、改善、減輕、或逆轉涉及NMN代謝之任何疾病或病況，諸如但不限於第二型糖尿病，肥胖，年齡相關肥胖，年齡相關血脂水準增加，年齡相關胰島素敏感性下降，年齡相關記憶功能之缺乏或下降，年齡相關眼功能之缺乏或下降，年齡相關生理衰退，葡萄糖刺激之胰島素分泌障礙，糖尿病，對阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)中之粒線體功能、神經死亡及/或認知功能之改善，對心臟免遭局部缺血/再灌注損傷之保護，對神經幹細胞群體/先驅細胞群體之維持，對損傷之後的骨骼肌粒線體功能及動脈功能恢復，及年齡相關功能衰退。
本教示包括但不限於： 　　1. 諸如小鼠Slc12a8 mRNA或人類Slc12a8 mRNA之哺乳動物Slc12a8 mRNA之全長cDNA。 　　2. 編碼小鼠Slc12a8多肽或人類Slc12a8多肽之cDNA。 　　3. 包含諸如全長Slc12a8 cDNA之Slc12a8 cDNA之哺乳動物表現載體。 　　4. 攜帶Slc12a8 cDNA之諸如NIH3T3細胞株之細胞株，包括過表現諸如全長小鼠Slc12a8 cDNA(Slc12a8-OE細胞)或全長人類Slc12a8 cDNA之Slc12a8 cDNA之細胞株。 　　5. 攜帶減少或靜默Slc12a8 mRNA之表現之shRNA之慢病毒。 　　6. 抗諸如小鼠Slc12a8蛋白或人類Slc12a8蛋白之Slc12a8蛋白之N端及內部結構域之多株抗體，包括兔多株抗體。 　　7. 全身Slc12a8剔除小鼠。
本教示包括一種蛋白脂質體系統，其包含諸如Slc12a8蛋白之運輸蛋白埋置於雙層膜中之脂質體。此一系統可用於分析Slc12a8蛋白之性質及測試候選藥物對Slc12a8之親和力或作為Slc12a8活性之促效劑或拮抗劑之活性。
本教示包括有助於細胞、組織、及諸如腸之器官中NMN之攝取之方法。此等方法可包括向腸投與Slc12a8之cDNA。此等方法可包括向腸投與包含編碼Slc12a8之cDNA之慢病毒。
有助於NMN攝取之方法可包括投與與鈉鹽組合之NMN。例如，投與可為口服投與。
本教示包括向有需要之受試者投與菸鹼酸(NA)或NA衍生化合物(即，NA之結構類似物)以增強NMN攝取。本教示包括投與菸鹼酸(NA)或NA衍生化合物(即，NA之結構類似物)以增強有需要之受試者中Slc12a8 NMN運輸蛋白之NMN攝取功能。可以一劑量範圍向有需要之受試者投與菸鹼酸(NA)或NA衍生化合物，諸如但不限於就NA或NA衍生化合物而言，10-500 mg/天或50-500 mg/天。投與可為口服投與、腸胃外投與、或其任何組合。
本教示包括投與與NMN組合之NA或NA衍生化合物以促進或有助於有需要之受試者之NMN攝取，這可藉由增強Slc12a8 NMN運輸蛋白之NMN攝取功能來實現。可以一劑量範圍向有需要之受試者投與此一組合，諸如但不限於就NMN及NA或NA衍生化合物之各者而言，10-500 mg/天或50-500 mg/天。投與可為口服投與、腸胃外投與、或其組合。
本教示包括投與NMN及一些鹽(例如，Na+)之組合以有助於有需要之受試者之NMN攝取。該組合可為口服投與之組合。該組合可為腸胃外投與之組合。可以一劑量範圍投與NMN及諸如鈉鹽之NMN攝取促進鹽，諸如但不限於10-500 mg/天或50-500 mg/天。
本教示可包括投與NMN、鈉鹽、及菸鹼酸(NA)或NA衍生化合物之組合以促進有需要之受試者之NMN攝取。可口服投與NMN、鈉鹽、及菸鹼酸(NA)或NA衍生化合物之一或任何組合。投與可包含口服投與NMN、鈉鹽、及菸鹼酸(NA)或NA衍生化合物中之任一者或全部。可各自以一劑量範圍向有需要之受試者投與NMN、鈉鹽、及菸鹼酸(NA)或NA衍生化合物，諸如但不限於10-500 mg/天或50-500 mg/天。
本教示亦包括投與菸鹼醯胺核糖苷(NR)或NR衍生化合物以抑制有需要之受試者中Slc12a8 NMN運輸蛋白之NMN攝取功能。可口服投與菸鹼醯胺核糖苷(NR)或NR衍生化合物。可以一劑量範圍向有需要之受試者投與NR或NR衍生化合物，諸如但不限於10-500 mg/天或50-500 mg/天。
本教示亦包括投與諸如例如鋰鹽之非鈉鹽以抑制有需要之受試者中Slc12a8 NMN運輸蛋白之NMN攝取功能。可口服投與非鈉鹽。可以一劑量範圍向有需要之受試者投與非鈉鹽，諸如但不限於10-500 mg/天或50-500 mg/天。
本教示包括投與與諸如例如鋰鹽之非鈉鹽組合之菸鹼醯胺核糖苷(NR)或NR衍生化合物以抑制有需要之受試者中Slc12a8 NMN運輸蛋白之NMN攝取功能。可口服投與NR或NR衍生化合物及/或非鈉鹽。可以一劑量範圍向有需要之受試者投與NR或NR衍生化合物及非鈉鹽，諸如但不限於10-500 mg/天或50-500 mg/天。
本教示揭示刺激受試者中NAD+產生之方法。該方法可包含向有需要之受試者投與包含基因體DNA或編碼Slc12a8之cDNA之核酸。核酸可為或可包含有包含基因體DNA或編碼Slc12a8之cDNA之慢病毒，該cDNA諸如但不限於具有如NM_134251(SEQ ID NO：1)、Slc12a8小鼠變異體A(SEQ ID NO：9)、Slc12a8小鼠變異體B(SEQ ID NO：10)、或Slc12a8人類全長cDNA(SEQ ID NO：11)所闡明之序列之cDNA。受試者可為哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、或人類)。編碼Slc12a8之cDNA可為與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)具有至少70%序列一致性、與Slc12a8小鼠變異體A(SEQ ID NO：9)具有至少70%序列一致性、與Slc12a8小鼠變異體B(SEQ ID NO：10)具有至少70%序列一致性、或與Slc12a8人類全長cDNA(SEQ ID NO：11)具有至少70%序列一致性之序列。編碼Slc12a8之cDNA可為GenBank參考序列NM_134251之序列，或可具有與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性。
編碼Slc12a8之cDNA可為SEQ ID NO：9之序列，或可具有與SEQ ID NO：9至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性。
編碼Slc12a8之cDNA可為如SEQ ID NO：10所闡明之Slc12a8小鼠變異體b之序列，或可具有與Slc12a8小鼠變異體b(SEQ ID NO：10)至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性。
編碼Slc12a8之cDNA可為如SEQ ID NO：11所闡明之Slc12a8人類全長序列之序列，或可具有與Slc12a8人類全長序列(SEQ ID NO：11)至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性。
本教示包括促進或增加受試者之向細胞中之NMN攝取之方法。該方法可包含向有需要之受試者投與包含編碼Slc12a8之cDNA或具有與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)、Slc12a8小鼠變異體A(SEQ ID NO：9)、Slc12a8小鼠變異體B(SEQ ID NO：10)、或Slc12a8人類全長cDNA(SEQ ID NO：11)至少70%序列一致性之序列的核酸。具有與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)至少70%序列一致性之序列可具有與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性。具有與Slc12a8小鼠變異體a(SEQ ID NO：9)至少70%序列一致性之序列可具有與Slc12a8小鼠變異體a(SEQ ID NO：9)至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性。具有與Slc12a8小鼠變異體b(SEQ ID NO：10)至少70%序列一致性之序列可具有與Slc12a8小鼠變異體b(SEQ ID NO：10)至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性。具有與Slc12a8全長人類cDNA(SEQ ID NO：11)至少70%序列一致性之序列可具有與Slc12a8全長人類cDNA(SEQ ID NO：11)至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性。可向腸投與cDNA。此投與可包含藉由管飼之投與。此投與可包含經設計以溶解於小腸中之口服藥品。
本教示包括包含Slc12a8基因之缺失之剔除小鼠。缺失可為Slc12a8基因之完全缺失或Slc12a8基因之部分缺失，諸如例如但不限於Slc12a8基因之外顯子4之缺失或在Slc12a8基因之外顯子4內之缺失。
本教示包括一種哺乳動物細胞株，其包含引入之Slc12a8基因或cDNA之序列，諸如如GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)、Slc12a8小鼠變異體A(SEQ ID NO：9)、Slc12a8小鼠變異體B(SEQ ID NO：10)、或Slc12a8人類全長cDNA(SEQ ID NO：11)所闡明之序列。引入之Slc12a8基因或cDNA可為外生源，或可為與宿主哺乳動物細胞株相同的物種。哺乳動物細胞株可表現水準高於未引入Slc12a8基因或cDNA之親體細胞株之水準的Slc12a8多肽。
本教示包括一種哺乳動物細胞株，其包含非天然存在之序列，即藉由轉型或轉染引入至細胞株之序列，且具有與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)、Slc12a8小鼠變異體A(SEQ ID NO：9)、Slc12a8小鼠變異體B(SEQ ID NO：10)、或Slc12a8人類全長cDNA(SEQ ID NO：11)至少70%序列一致性。具有與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)至少70%序列一致性之序列可具有與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性。具有與Slc12a8小鼠變異體a(SEQ ID NO：9)至少70%序列一致性之序列可具有與Slc12a8小鼠變異體a(SEQ ID NO：9)至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性。具有與Slc12a8小鼠變異體b(SEQ ID NO：10)至少70%序列一致性之序列可具有與Slc12a8小鼠變異體b(SEQ ID NO：10)至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性。具有與Slc12a8全長人類cDNA(SEQ ID NO：11)至少70%序列一致性之序列可具有與Slc12a8全長人類cDNA(SEQ ID NO：11)至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性。
本教示包括一種哺乳動物細胞株，其包含諸如如GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)、Slc12a8小鼠變異體A(SEQ ID NO：9)、Slc12a8小鼠變異體B(SEQ ID NO：10)、或Slc12a8人類全長cDNA(SEQ ID NO：11)之Slc12a8序列。本教示之細胞株之Slc12a8序列可為宿主細胞之異源性來源。
本教示之細胞株可包含可具有與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)、Slc12a8小鼠變異體A(SEQ ID NO：9)、Slc12a8小鼠變異體B(SEQ ID NO：10)、或Slc12a8人類全長cDNA(SEQ ID NO：11)至少70%序列一致性之Slc12a8序列。該序列可為基因體或編碼Slc12a8之cDNA之序列。本教示之細胞株之基因體或編碼Slc12a8之cDNA可為宿主細胞之異源性來源。包含編碼Slc12a8之序列之細胞株可進一步包含可操作地連接編碼Slc12a8之序列之啟動子。細胞株可為哺乳動物細胞株。哺乳動物細胞株可缺乏CD73活性，可缺乏CD38活性，或可缺乏CD73活性及CD38活性。哺乳動物細胞株可為NIH 3T3細胞株。哺乳動物細胞株可為穩定轉型之細胞株，其包含具有與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)、Slc12a8小鼠變異體A(SEQ ID NO：9)、Slc12a8小鼠變異體B(SEQ ID NO：10)、或Slc12a8人類全長cDNA(SEQ ID NO：11)至少70%序列一致性。具有與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)至少70%序列一致性之序列可具有與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性。哺乳動物細胞株可經具有與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)至少70%序列一致性之序列短暫轉染。具有與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)至少70%序列一致性之序列可具有與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性。哺乳動物細胞株可為小鼠細胞株、大鼠細胞株、或人類細胞株。哺乳動物細胞株可選自由小鼠細胞株及大鼠細胞株組成之群。哺乳動物細胞株可為人類細胞株。具有與GenBank 參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)、Slc12a8小鼠變異體A(SEQ ID NO：9)、Slc12a8小鼠變異體B(SEQ ID NO：10)、或Slc12a8人類全長cDNA(SEQ ID NO：11)至少70%序列一致性之序列可為全長Slc12a8 cDNA。
本教示之方法可包含增強有需要之受試者中NMN之細胞攝取之方法。此等方法可包含向有需要之受試者投與治療有效量的菸鹼酸或其酯或醫藥上可接受之鹽。菸鹼酸之酯或醫藥上可接受之鹽可為結構或其醫藥上可接受之鹽，其中R可選自由以下組成之群：H、甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、正己基、正辛基、2-氯乙基、2-羥乙基、3-羥丙基、2-甲氧基乙基、2-丁氧基乙基、胺甲醯基甲基、l-胺甲醯基乙基、2-二甲基胺乙基、3-胺丙基、四氫呋喃基、苯甲基、苯氧基乙基、對氯苯基、及對硝基苯基。R可為H、2-二甲基胺乙基、對氯苯基、或對硝基苯基。R可選自由以下組成之群：H、2-二甲基胺乙基、對氯苯基、及對硝基苯基。R可選自由以下組成之群：2-二甲基胺乙基、對氯苯基、及對硝基苯基。R可選自由以下組成之群：H、C1 -C6 線型烷基、C3 -C6 支鏈烷基、C3 -C6 環烷基、C1 -C6 線型烷氧基、C3 -C6 支鏈烷氧基、及C3 -C6 環烷氧基。R可選自由以下組成之群：H、C1 -C6 線型烷氧基、C3 -C6 支鏈烷氧基、C3 -C6 環烷氧基、C1 -C6 線型鹵烷氧基、C3 -C6 支鏈鹵烷氧基、C3 -C6 環鹵烷氧基、C1 -C6 線型羥基烷氧基、C3 -C6 支鏈羥基烷氧基、C3 -C6 環羥基烷氧基、烷氧基甲基、烷氧基乙基、烷氧基烷氧基甲基、烷氧基烷氧基乙基、苄基、烷氧基苄基、萘基、及烷氧基萘基。
R可選自由以下組成之群：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、正己基、正辛基、2-氯乙基、2-羥乙基、3-羥丙基、2-甲氧基乙基、2-丁氧基乙基、胺甲醯基甲基、l-胺甲醯基乙基、2-二甲基胺乙基、3-胺丙基、四氫呋喃基、苯甲基、苯氧基乙基、對氯苯基、及對硝基苯基。R可為2-二甲基胺乙基、對氯苯基、或對硝基苯基。R可選自由以下組成之群：2-二甲基胺乙基、對氯苯基、及對硝基苯基。R可選自由以下組成之群：2-二甲基胺乙基、對氯苯基、及對硝基苯基。R可選自由以下組成之群：C1 -C6 線型烷基、C3 -C6 支鏈烷基、C3 -C6 環烷基、C1 -C6 線型烷氧基、C3 -C6 支鏈烷氧基、及C3 -C6 環烷氧基。R可選自由以下組成之群：C1 -C6 線型烷氧基、C3 -C6 支鏈烷氧基、C3 -C6 環烷氧基、C1 -C6 線型鹵烷氧基、C3 -C6 支鏈鹵烷氧基、C3 -C6 環鹵烷氧基、C1 -C6 線型羥基烷氧基、C3 -C6 支鏈羥基烷氧基、C3 -C6 環羥基烷氧基、烷氧基甲基、烷氧基乙基、烷氧基烷氧基甲基、烷氧基烷氧基乙基、苄基、烷氧基苄基、萘基、及烷氧基萘基。
本教示包括增強有需要之受試者中NMN之細胞攝取之方法。此等方法可包含向受試者投與化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物可為菸鹼酸、戊四菸酯、菸鹼酸生育酚酯、β-吡啶甲醇、或六菸鹼酸肌醇。化合物可選自由以下組成之群：菸鹼酸、戊四菸酯、菸鹼酸生育酚酯、β-吡啶甲醇、及六菸鹼酸肌醇。化合物或其醫藥學上可接受之鹽可為菸鹼酸或其醫藥上可接受之鹽。投與可包含每天投與50-500 mg菸鹼酸或其醫藥上可接受之鹽。投與可包含每天投與50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、或500 mg菸鹼酸或其醫藥上可接受之鹽。投與可包含每天投與50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、85-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-105、105-110、110-115、115-120、120-125、125-130、130-135、135-140、140-145、145-150、150-155、155-160、160-165、165-170、170-175、175-180、180-185、185-190、190-195、195-200、200-205、205-210、210-215、215-220、220-225、225-230、230-235、235-240、240-245、245-250、250-255、255-260、260-265、265-270、270-275、275-280、280-285、285-290、290-295、295-300、300-305、305-310、310-315、315-320、320-325、325-330、330-335、335-340、340-345、345-350、350-355、355-360、360-365、365-370、370-375、375-380、380-385、385-390、390-395、395-400、400-405、405-410、410-415、415-420、420-425、425-430、430-435、435-440、440-445、445-450、450-455、455-460、460-465、465-470、470-475、475-480、480-485、485-490、490-495、或495-500 mg菸鹼酸或其醫藥上可接受之鹽。投與可包含每天投與50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、260-270、270-280、280-290、290-300、300-310、310-320、320-330、330-340、340-350、350-360、360-370、370-380、380-390、390-400、400-410、410-420、420-430、430-440、440-450、450-460、460-470、470-480、480-490、490-500 mg菸鹼酸或其醫藥上可接受之鹽。投與化合物或其醫藥上可接受之鹽可包含投與化合物或其醫藥上可接受之鹽與醫藥上可接受之賦形劑。
本教示包括治療、減少、預防、或逆轉有需要之受試者之年齡相關胰島素敏感性缺乏及/或胰島素分泌。治療、改善、減少、預防、或逆轉有需要之受試者之年齡相關胰島素敏感性缺乏之方法可包含投與有效量NMN或其醫藥上可接受之鹽及有效量以下之至少一者：菸鹼酸或其醫藥上可接受之鹽、戊四菸酯或其醫藥上可接受之鹽、菸鹼酸生育酚酯或其醫藥上可接受之鹽、或β-吡啶甲醇六菸鹼酸肌醇或其醫藥上可接受之鹽。治療、改善、減少、預防、或逆轉有需要之受試者之年齡相關胰島素分泌缺乏之方法可包含投與有效量NMN或其醫藥上可接受之鹽及有效量以下之至少一者：菸鹼酸或其醫藥上可接受之鹽、戊四菸酯或其醫藥上可接受之鹽、菸鹼酸生育酚酯或其醫藥上可接受之鹽、或β-吡啶甲醇六菸鹼酸肌醇或其醫藥上可接受之鹽。
本教示包括治療、改善、減少、預防、或逆轉有需要之受試者之年齡相關記憶功能障礙。治療、改善、減少、預防、或逆轉有需要之受試者之年齡相關記憶功能障礙之方法可包含投與有效量NMN或其醫藥上可接受之鹽及有效量以下之至少一者：菸鹼酸或其醫藥上可接受之鹽、戊四菸酯或其醫藥上可接受之鹽、菸鹼酸生育酚酯或其醫藥上可接受之鹽、或β-吡啶甲醇六菸鹼酸肌醇或其醫藥上可接受之鹽。
本教示包括治療、改善、減少、預防、或逆轉有需要之受試者之年齡相關眼功能衰退。治療、改善、減少、預防、或逆轉有需要之受試者之年齡相關眼功能衰退之方法可包含投與有效量NMN或其醫藥上可接受之鹽及有效量以下之至少一者：菸鹼酸或其醫藥上可接受之鹽、戊四菸酯或其醫藥上可接受之鹽、菸鹼酸生育酚酯或其醫藥上可接受之鹽、β-吡啶甲醇或其醫藥上可接受之鹽、或六菸鹼酸肌醇或其醫藥上可接受之鹽。
提供一種治療有需要之受試者之年齡相關視網膜變性之方法。該方法可包含投與NMN或其醫藥上可接受之鹽及以下之至少一者：菸鹼酸或其醫藥上可接受之鹽、戊四菸酯或其醫藥上可接受之鹽、菸鹼酸生育酚酯或其醫藥上可接受之鹽、β-吡啶甲醇或其醫藥上可接受之鹽、或六菸鹼酸肌醇或其醫藥上可接受之鹽。
提供一種治療年齡相關視網膜變性、年齡相關眼功能衰退、年齡相關記憶功能障礙、或年齡相關胰島素敏感性缺乏之方法。該方法可包含投與NMN或其醫藥上可接受之鹽及以下之至少一者：菸鹼酸或其醫藥上可接受之鹽、戊四菸酯或其醫藥上可接受之鹽、菸鹼酸生育酚酯或其醫藥上可接受之鹽、β-吡啶甲醇或其醫藥上可接受之鹽、或六菸鹼酸肌醇或其醫藥上可接受之鹽。
提供一種治療、改善、預防、或逆轉年齡相關功能衰退之方法。該方法可包含投與NMN或其醫藥上可接受之鹽及以下之至少一者：菸鹼酸或其醫藥上可接受之鹽、戊四菸酯或其醫藥上可接受之鹽、菸鹼酸生育酚酯或其醫藥上可接受之鹽、β-吡啶甲醇或其醫藥上可接受之鹽、或六菸鹼酸肌醇或其醫藥上可接受之鹽。年齡相關功能衰退可包含食欲缺乏、低葡萄糖水準、肌肉無力、肌少症、或其組合。
提供一種治療、改善、預防、或逆轉糖尿病之方法。該方法可包含投與NMN或其醫藥上可接受之鹽及以下之至少一者：菸鹼酸或其醫藥上可接受之鹽、戊四菸酯或其醫藥上可接受之鹽、菸鹼酸生育酚酯或其醫藥上可接受之鹽、β-吡啶甲醇或其醫藥上可接受之鹽、或六菸鹼酸肌醇或其醫藥上可接受之鹽。糖尿病可為第一型糖尿病或第二型糖尿病。
提供一種治療、改善、預防、或逆轉肥胖之方法。該方法可包含投與NMN或其醫藥上可接受之鹽及以下之至少一者：菸鹼酸或其醫藥上可接受之鹽、戊四菸酯或其醫藥上可接受之鹽、菸鹼酸生育酚酯或其醫藥上可接受之鹽、β-吡啶甲醇或其醫藥上可接受之鹽、或六菸鹼酸肌醇或其醫藥上可接受之鹽。
提供一種醫藥組成物。該醫藥組成物可包含NMN或其醫藥上可接受之鹽及NMN運輸蛋白促效劑。NMN運輸蛋白促效劑可為菸鹼酸或其醫藥上可接受之鹽、戊四菸酯或其醫藥上可接受之鹽、菸鹼酸生育酚酯或其醫藥上可接受之鹽、β-吡啶甲醇或其醫藥上可接受之鹽、或六菸鹼酸肌醇或其醫藥上可接受之鹽。NMN運輸蛋白促效劑可選自由以下組成之群：菸鹼酸、戊四菸酯、菸鹼酸生育酚酯或其醫藥上可接受之鹽、β-吡啶甲醇或其醫藥上可接受之鹽、或六菸鹼酸肌醇或其醫藥上可接受之鹽。NMN運輸蛋白可為Slc12a8多肽或其同源物。
提供另一種醫藥組成物。該醫藥組成物可包含NMN及Slc12a8或其同源物之基因表現之誘導劑。Slc12a8可具有識別為登錄號NM_134251(SEQ ID NO：12)、Slc12a8小鼠變異體a(SEQ ID NO：13)、Slc12a8小鼠變異體b(SEQ ID NO：14)、或Slc12a8人類(SEQ ID NO：15)之胺基酸序列。
本教示包括刺激受試者之NAD+產生之方法及增加受試者之向細胞中之NMN攝取之方法。受試者可為需要治療涉及NMN代謝之疾病諸如例如年齡相關肥胖之受試者。此等方法包括向有需要之受試者投與包含編碼Slc12a8之cDNA之核酸。編碼Slc12a8之cDNA可為來自哺乳動物諸如人類或諸如小鼠或大鼠之齧齒動物之Slc12a8 mRNA轉錄本之Slc12a8 cDNA。核酸可包括包含編碼Slc12a8之cDNA之慢病毒。編碼Slc12a8之cDNA可包括GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)中所述之序列或可與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)具有70%或更大的序列一致性。可向需要治療之受試者之小腸投與本教示之慢病毒。
本教示亦包括包含Slc12a8基因之缺失之剔除小鼠。缺失可為但不限於Slc12a8基因之外顯子4之缺失。
本教示進一步包括一種哺乳動物細胞株，其包含編碼Slc12a8多肽之cDNA或具有與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)至少70%序列一致性之cDNA序列。細胞株可經cDNA穩定轉型或經cDNA短暫轉型。cDNA可以可操作地鏈接對照序列諸如，例如但不限於可操作地連接cDNA之啟動子或增強子。
哺乳動物細胞株可缺乏CD73及/或CD38活性。
哺乳動物細胞株可為小鼠細胞株、大鼠細胞株、或人類細胞株。哺乳動物細胞株可為經具有與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)至少70%序列一致性之cDNA序列轉型之NIH 3T3細胞株。轉型可為穩定轉型或短暫轉型。
本教示亦包括增強有需要之受試者中NMN之細胞攝取之方法。此等方法包括投與治療有效量的菸鹼酸或其酯或醫藥上可接受之鹽。菸鹼酸酯可具有結構，其中R可為但不限於甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、正己基、正辛基、2-氯乙基、2-羥乙基、3-羥丙基、2-甲氧基乙基、2-丁氧基乙基、胺甲醯基甲基、l-胺甲醯基乙基、2-二甲基胺乙基、3-胺丙基、四氫呋喃基、苯甲基、苯氧基乙基、對氯苯基、或對硝基苯基。R可為H、2-二甲基胺乙基、對氯苯基、或對硝基苯基。R可為2-二甲基胺乙基、對氯苯基、或對硝基苯基。
本教示亦包括增強有需要之受試者中NMN之細胞攝取之方法。此等方法可包括投與化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物為菸鹼酸、菸鹼酸酯、戊四菸酯、菸鹼酸生育酚酯、β-吡啶甲醇、或六菸鹼酸肌醇。投與可包含每天投與50-500 mg菸鹼酸、菸鹼酸酯、戊四菸酯、菸鹼酸生育酚酯、β-吡啶甲醇或六菸鹼酸肌醇、或此等化合物之任一者之醫藥上可接受之鹽。化合物或其醫藥上可接受之鹽可與醫藥上可接受之賦形劑一起投與。
本教示亦包括治療有需要之受試者之年齡相關胰島素敏感性缺乏之方法、治療有需要之受試者之年齡相關胰島素分泌缺乏之方法、治療有需要之受試者之年齡相關胰島素作用缺乏之方法、治療有需要之受試者之年齡相關胰島素作用及分泌缺乏之方法、治療有需要之受試者之年齡相關記憶功能障礙之方法、治療有需要之受試者之年齡相關眼功能衰退之方法、及治療有需要之受試者之年齡相關視網膜變性之方法。此等方法可包含投與醫藥上有效量的NMN以及諸如以下之化合物：菸鹼酸、菸鹼酸酯、戊四菸酯、菸鹼酸生育酚酯、β-吡啶甲醇或六菸鹼酸肌醇、或其醫藥上可接受之鹽。
本教示亦包括治療有需要之受試者之肌病之方法。可根據本教示進行治療之肌病包括但不限於肌肉衰弱、肌肉萎縮、肌肉消瘦、肌肉強度降低。可根據本教示進行治療之肌病包括但不限於肌少症、力弱症、惡病質、肌肉失養症、肌強直症、脊髓性肌肉萎縮、及肌病變。肌肉失養症可為例如裘馨氏肌肉失養症(Duchenne Muscular Dystrophy)、貝克氏肌肉失養症(Becker Muscular Dystrophy)、先天性肌肉失養症、遠端肌肉失養症、艾梅氏肌肉失養症(Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy)、顏面肩胛肱骨型肌肉失養症、肢帶型肌肉失養症、或眼咽肌肉失養症。肌強直症可為肌強直性失養症、先天性肌強直、或先天性副肌強直。肌病變可為貝斯蘭氏肌病變(Bethlem myopathy)、先天性纖維類型不均衡、進行性肌肉骨化症、甲狀腺功能亢進性肌病變、甲狀腺功能低下性肌病變、微軸空肌病變、多軸空肌病變、肌小管肌病變、桿狀體肌病變、週期性麻痹、低血鉀性肌病變、或高血鉀性肌病變。肌病可為酸性麥芽糖酶缺乏、肉鹼缺乏、肉鹼棕櫚醯基轉移酶缺乏、去支酶缺乏、乳酸去氫酶缺乏、粒線體肌病變、肌腺苷酸去胺基酶缺乏、磷酸化酶缺乏、磷酸果糖激酶缺乏、或磷酸甘油酯激酶缺乏。肌病可為肌少症、力弱症、或惡病質。肌病可為肌少症。此等方法可包含投與醫藥上有效量的NMN以及諸如以下之化合物：菸鹼酸、菸鹼酸酯、戊四菸酯、菸鹼酸生育酚酯、β-吡啶甲醇或六菸鹼酸肌醇、或其醫藥上可接受之鹽。
本教示亦包括包含NMN及NMN運輸蛋白促效劑之醫藥組成物。NMN運輸蛋白促效劑可為但不限於菸鹼酸、菸鹼酸酯、戊四菸酯、菸鹼酸生育酚酯、β-吡啶甲醇或六菸鹼酸肌醇。
NMN運輸蛋白可為Slc12a8多肽或其同源物。
本教示亦包括預防有需要之受試者之年齡相關功能衰退之方法。年齡相關功能衰退可由非限制性地例如以下引起或可與其相關：食欲缺乏、低葡萄糖水準、肌肉無力、營養不良、或老年厭食症。此等方法可包含投與醫藥上有效量的NMN以及諸如以下之化合物：菸鹼酸、菸鹼酸酯、戊四菸酯、菸鹼酸生育酚酯、β-吡啶甲醇或六菸鹼酸肌醇、或其醫藥上可接受之鹽。
本教示亦包括預防有需要之受試者之年齡相關功能衰退之方法。年齡相關功能衰退可由非限制性地例如以下引起或可與其相關：食欲缺乏、低葡萄糖水準、肌肉無力、營養不良、或老年厭食症。此等方法可包含投與醫藥上有效量的NMN以及諸如以下之化合物：菸鹼酸、菸鹼酸酯、戊四菸酯、菸鹼酸生育酚酯、β-吡啶甲醇或六菸鹼酸肌醇、或其醫藥上可接受之鹽。
本教示亦包括治療有需要之受試者之第二型糖尿病之方法。此等方法可包含投與醫藥上有效量的NMN以及諸如以下之化合物：菸鹼酸、菸鹼酸酯、戊四菸酯、菸鹼酸生育酚酯、β-吡啶甲醇或六菸鹼酸肌醇、或其醫藥上可接受之鹽。
本教示亦包括治療有需要之受試者之肥胖之方法。此等方法可包含投與醫藥上有效量的NMN以及諸如以下之化合物：菸鹼酸、菸鹼酸酯、戊四菸酯、菸鹼酸生育酚酯、β-吡啶甲醇或六菸鹼酸肌醇、或其醫藥上可接受之鹽。
本文吡啶甲醇六菸鹼酸肌醇或其醫藥上可接受所呈現之研究說明，Slc12a8基因編碼哺乳動物之新穎NMN運輸蛋白。Slc12a8基因之mRNA表現回應於NAD+衰退而上調，不受理論限制，其使細胞對NAD+生物合成之迫切需要有反應。在生理條件下，Slc12a8 NMN運輸蛋白可特異於NMN。儘管在細胞培養物及小腸中敲落此基因完全廢除NMN之快速攝取，但是其全長cDNA之過表現提供增加之向細胞之NMN轉運，該等細胞以其他方式表現出最小的NMN轉運。
以下段落另外詳細地描述本發明之各種態樣。 治療方法
提供治療有需要之受試者之年齡相關病況之各種方法。通常，該方法包含向該受試者投與治療有效量的菸鹼醯胺單核苷酸(NMN)及至少一種選自由菸鹼酸、戊四菸酯、菸鹼酸生育酚酯、β-吡啶甲醇、六菸鹼酸肌醇、其任何酯、其任何醫藥上可接受之鹽、及其任何組合組成之群之額外化合物，且其中該年齡相關病況包含至少一種選自由胰島素敏感性缺乏、胰島素分泌缺乏、胰島素作用及分泌缺乏、記憶功能障礙、眼功能衰退、視網膜變性、功能衰退、及其任何組合組成之群之病況。
年齡相關病況可包含胰島素敏感性缺乏。
年齡相關病況可包含胰島素分泌缺乏。
年齡相關病況可包含胰島素作用及分泌缺乏。
年齡相關病況可包含記憶功能障礙。
年齡相關病況可包含眼功能衰退。
年齡相關病況可包含視網膜變性。
年齡相關病況可包含功能衰退(例如，食欲缺乏、低葡萄糖水準、肌肉無力、營養不良、老年厭食症、或其任何組合)。
年齡相關病況可包含本文所述之年齡相關病況之任何組合。
其他方法係關於治療有需要之受試者之醫學病況。該方法包含向該受試者投與治療有效量的菸鹼醯胺單核苷酸(NMN)及至少一種選自由菸鹼酸、戊四菸酯、菸鹼酸生育酚酯、β-吡啶甲醇、六菸鹼酸肌醇、其任何酯、其任何醫藥上可接受之鹽、及其任何組合組成之群之化合物，其中該醫學病況包含選自由肌病、第二型糖尿病、肥胖、及其任何組合組成之群之至少一者。
醫學病況可包含肌病。當受試者需要治療肌病時，該肌病可包含肌肉衰弱、肌肉萎縮、肌肉消瘦、肌肉強度降低、或其任何組合。
肌病可包含肌少症、力弱症、惡病質、肌肉失養症(例如，裘馨氏肌肉失養症、貝克氏肌肉失養症、先天性肌肉失養症、遠端肌肉失養症、艾梅氏肌肉失養症、顏面肩胛肱骨型肌肉失養症、肢帶型肌肉失養症、眼咽肌肉失養症、或其任何組合)、肌強直症(例如，肌強直性失養症、先天性肌強直、先天性副肌強直、或其任何組合)、脊髓性肌肉萎縮、肌病變(例如，貝斯蘭氏肌病變、先天性纖維類型不均衡、進行性肌肉骨化症、甲狀腺功能亢進性肌病變、甲狀腺功能低下性肌病變、微軸空肌病變、多軸空肌病變、肌小管肌病變、桿狀體肌病變、週期性麻痹、低血鉀性肌病變、高血鉀性肌病變、或其任何組合)、或其任何組合。
肌病可包含酸性麥芽糖酶缺乏、肉鹼缺乏、肉鹼棕櫚醯基轉移酶缺乏、去支酶缺乏、乳酸去氫酶缺乏、粒線體肌病變、肌腺苷酸去胺基酶缺乏、磷酸化酶缺乏、磷酸果糖激酶缺乏、磷酸甘油酯激酶缺乏、或其任何組合。
肌病可選自由以下組成之群：肌少症、力弱症、惡病質、及其任何組合。
肌病可包含肌少症。
醫學病況可包含第二型糖尿病。
醫學病況可包含肥胖。
醫學病況可包含本文所述之醫學病況之任何組合。
在本文所述之各種方法中，該至少一種額外化合物可包含菸鹼酸、其任何酯、或其任何要上可接受之鹽。
菸鹼酸之酯或醫藥上可接受之鹽可為結構(I)之化合物其中R選自由以下組成之群：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、正己基、正辛基、2-氯乙基、2-羥乙基、3-羥丙基、2-甲氧基乙基、2-丁氧基乙基、胺甲醯基甲基、l-胺甲醯基乙基、2-二甲基胺乙基、3-胺丙基、四氫呋喃基、苯甲基、苯氧基乙基、對氯苯基、及對硝基苯基(例如，R可選自由2-二甲基胺乙基、對氯苯基、及對硝基苯基組成之群)。
在本文所述之各種方法中，每天向受試者投與約50 mg至約500 mg該至少一種額外化合物。同樣，可每天向受試者投與約10至約500 mg NMN。
另外，受試者可投與包含NMN及該至少一種額外化合物之醫藥組成物。
亦提供一種增強有需要之受試者之NMN之細胞攝取之方法。該方法包含向該受試者投與治療有效量的選自由以下組成之群之化合物：菸鹼酸、戊四菸酯、菸鹼酸生育酚酯、β-吡啶甲醇、六菸鹼酸肌醇、其任何酯、其任何醫藥上可接受之鹽、及其任何組合。
化合物可包含菸鹼酸、其酯、或其醫藥上可接受之鹽。菸鹼酸之酯或醫藥上可接受之鹽可為結構(I)之化合物其中R選自由以下組成之群：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、正己基、正辛基、2-氯乙基、2-羥乙基、3-羥丙基、2-甲氧基乙基、2-丁氧基乙基、胺甲醯基甲基、l-胺甲醯基乙基、2-二甲基胺乙基、3-胺丙基、四氫呋喃基、苯甲基、苯氧基乙基、對氯苯基、及對硝基苯基(例如，R選自由2-二甲基胺乙基、對氯苯基、及對硝基苯基組成之群)。
可每天向受試者投與約50 mg至約500 mg化合物。
提供一種用於在有需要之受試者中刺激NAD+產生及/或增加向細胞中之NMN攝取之方法。該方法包含向該受試者投與治療有效量的編碼Slc12a8之核酸。
編碼Slc12a8之核酸可包含編碼Slc12a8之cDNA。
在用於在受試者中刺激NAD+產生及/或增加向細胞中之NMN攝取之方法中，投與編碼Slc12a8之核酸可包含投與編碼Slc12a8之基因療法載體。
基因療法載體可包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、α病毒、皰疹病毒、痘瘡病毒、或其任何組合。
例如，基因療法載體可包含反轉錄病毒。
當基因療法載體包含反轉錄病毒時，反轉錄病毒合適地包含慢病毒。
在包含投與編碼Slc12a8之cDNA之用於在受試者中刺激NAD+產生及/或增加向細胞中之NMN攝取之方法之任一者中，編碼Slc12a8之cDNA可包含具有與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)至少70%序列一致性之序列。
編碼Slc12a8之cDNA可包含具有與SEQ ID NO：1至少75%序列一致性之序列。
編碼Slc12a8之cDNA可包含具有與SEQ ID NO：1至少80%序列一致性之序列。
編碼Slc12a8之cDNA可包含具有與SEQ ID NO：1至少85%序列一致性之序列。
編碼Slc12a8之cDNA可包含具有與SEQ ID NO：1至少90%序列一致性之序列。
編碼Slc12a8之cDNA可包含具有與SEQ ID NO：1至少95%序列一致性之序列。
編碼Slc12a8之cDNA可包含具有與SEQ ID NO：1至少99%序列一致性之序列。
編碼Slc12a8之cDNA可包含具有與SEQ ID NO：1100%序列一致性之序列。
或者或此外，編碼Slc12a8之cDNA可包含本文所揭示之Slc12a8之任一者。
在包含向受試者投與治療有效量編碼Slc12a8之核酸之用於在受試者中刺激NAD+產生及/或增加向細胞中之NMN攝取之方法之任一者中，該方法可包含向受試者之胃腸道投與編碼Slc12a8之核酸。例如，該方法可包含向該受試者之小腸投與該編碼Slc12a8之核酸。
在包含向受試者投與治療有效量編碼Slc12a8之核酸之用於在受試者中刺激NAD+產生及/或增加向細胞中之NMN攝取之方法之任一者中，該受試者可為需要治療肌病、第二型糖尿病、肥胖、年齡相關病況、或其任何組合之受試者。
該年齡相關病況可選自由以下組成之群：胰島素敏感性缺乏、胰島素分泌缺乏、胰島素作用及分泌缺乏、記憶功能障礙、眼功能衰退、視網膜變性、功能衰退、肥胖、及其任何組合。
年齡相關病況可包含胰島素敏感性缺乏。
年齡相關病況可包含胰島素分泌缺乏。
年齡相關病況可包含胰島素作用及分泌缺乏。
年齡相關病況可包含記憶功能障礙。
年齡相關病況可包含眼功能衰退。
年齡相關病況可包含視網膜變性。
年齡相關病況可包含功能衰退(例如，食欲缺乏、低葡萄糖水準、肌肉無力、營養不良、老年厭食症、或其任何組合)。
年齡相關病況可包含年齡相關肥胖。
當受試者需要治療肌病時，該肌病可包含肌肉衰弱、肌肉萎縮、肌肉消瘦、肌肉強度降低、或其任何組合。
肌病可包含肌少症、力弱症、惡病質、肌肉失養症(例如，裘馨氏肌肉失養症、貝克氏肌肉失養症、先天性肌肉失養症、遠端肌肉失養症、艾梅氏肌肉失養症、顏面肩胛肱骨型肌肉失養症、肢帶型肌肉失養症、眼咽肌肉失養症、或其任何組合)、肌強直症(例如，肌強直性失養症、先天性肌強直、先天性副肌強直、或其任何組合)、脊髓性肌肉萎縮、肌病變(例如，貝斯蘭氏肌病變、先天性纖維類型不均衡、進行性肌肉骨化症、甲狀腺功能亢進性肌病變、甲狀腺功能低下性肌病變、微軸空肌病變、多軸空肌病變、肌小管肌病變、桿狀體肌病變、週期性麻痹、低血鉀性肌病變、高血鉀性肌病變、或其任何組合)、或其任何組合。
肌病可包含酸性麥芽糖酶缺乏、肉鹼缺乏、肉鹼棕櫚醯基轉移酶缺乏、去支酶缺乏、乳酸去氫酶缺乏、粒線體肌病變、肌腺苷酸去胺基酶缺乏、磷酸化酶缺乏、磷酸果糖激酶缺乏、磷酸甘油酯激酶缺乏、或其任何組合。
肌病可選自由以下組成之群：肌少症、力弱症、惡病質、及其任何組合。
肌病可包含肌少症。
在包含向受試者投與治療有效量編碼Slc12a8之核酸之用於在受試者中刺激NAD+產生及/或增加向細胞中之NMN攝取之方法之任一者中，該受試者可為需要治療第二型糖尿病之受試者。
在包含向受試者投與治療有效量編碼Slc12a8之核酸之用於在受試者中刺激NAD+產生及/或增加向細胞中之NMN攝取之方法之任一者中，該受試者可為需要治療肥胖之受試者。
在本文所述之方法之任一者中，受試者可為哺乳動物。
例如，受試者可為小鼠或大鼠。
受試者可為人類。當受試者為人類時，人類可為至少30歲、至少40歲、至少50歲、至少60歲、或至少70歲。 基因療法載體
提供一種基因療法載體。該載體包含編碼Slc12a8之核酸。
編碼Slc12a8之核酸可包含編碼Slc12a8之cDNA。
載體可包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、α病毒、皰疹病毒、痘瘡病毒、或其任何組合。
例如，基因療法載體可包含反轉錄病毒。
反轉錄病毒可包含慢病毒。
編碼Slc12a8之cDNA可包含具有與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)至少70%序列一致性之序列。
編碼Slc12a8之cDNA可包含具有與SEQ ID NO：1至少75%序列一致性之序列。
編碼Slc12a8之cDNA可包含具有與SEQ ID NO：1至少80%序列一致性之序列。編碼Slc12a8之cDNA可包含具有與SEQ ID NO：1至少70%序列一致性之序列。
編碼Slc12a8之cDNA可包含具有與SEQ ID NO：1至少85%序列一致性之序列。
編碼Slc12a8之cDNA可包含具有與SEQ ID NO：1至少90%序列一致性之序列。
編碼Slc12a8之cDNA可包含具有與SEQ ID NO：1至少95%序列一致性之序列。
編碼Slc12a8之cDNA可包含具有與SEQ ID NO：1至少99%序列一致性之序列。
編碼Slc12a8之cDNA可包含具有與SEQ ID NO：1100%序列一致性之序列。
或者或此外，編碼Slc12a8之cDNA可包含本文所揭示之Slc12a8之任一者。 包含Slc12a8之突變之非人類動物
提供一種非人類動物。該非人類動物包含Slc12a8基因之不活化突變。
非人類動物合適地包含小鼠或大鼠。
Slc12a8基因之不活化突變可包含Slc12a8基因之缺失、Slc12a8基因之插入、或其組合。
例如，Slc12a8基因之不活化突變可包含Slc12a8基因之缺失。缺失可包含Slc12a8基因之部分缺失或Slc12a8基因之完全缺失。
缺失可包含Slc12a8基因之外顯子4之缺失。
缺失可包含Slc12a8基因之外顯子4之一部分之缺失。 哺乳動物細胞及哺乳動物細胞株
亦提供哺乳動物細胞及哺乳動物細胞株。
提供一種哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株。該哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株包含編碼Slc12a8蛋白之cDNA。該cDNA包含編碼SEQ ID NO：12(小鼠Slc12a8蛋白)、SEQ ID NO：13(小鼠Scl12a8變異體A蛋白)、SEQ ID NO：14(小鼠Scl12a8變異體B蛋白)、或SEQ ID NO：15(人類Slc12a8蛋白)之cDNA。
提供另一種哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株。該哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株包含編碼Slc12a8蛋白之cDNA。該cDNA包含編碼具有與SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15至少70%序列一致性之蛋白之cDNA。
該cDNA可包含編碼具有與SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15至少75%序列一致性之蛋白之cDNA。
該cDNA可包含編碼具有與SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15至少80%序列一致性之蛋白之cDNA。
該cDNA可包含編碼具有與SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15至少85%序列一致性之蛋白之cDNA。
該cDNA可包含編碼具有與SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15至少90%序列一致性之蛋白之cDNA。
該cDNA可包含編碼具有與SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15至少95%序列一致性之蛋白之cDNA。
該cDNA可包含編碼具有與SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15至少99%序列一致性之蛋白之cDNA。
提供又另一種哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株。該哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株包含編碼Slc12a8蛋白之cDNA。該cDNA包含具有與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)或Slc12a8人類全長cDNA(SEQ ID NO：11)至少70%序列一致性之cDNA序列。
該cDNA可包含具有與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：11至少75%序列一致性之cDNA序列。
該cDNA可包含具有與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：11至少80%序列一致性之cDNA序列。
該cDNA可包含具有與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：11至少85%序列一致性之cDNA序列。
該cDNA可包含具有與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：11至少90%序列一致性之cDNA序列。
該cDNA可包含具有與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：11至少95%序列一致性之cDNA序列。
該cDNA可包含具有與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：11至少99%序列一致性之cDNA序列。
該cDNA可包含具有與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：11100%序列一致性之cDNA序列。
對於哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株之任一者，該哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株較佳不包含胎盤衍生細胞。
提供另一種哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株。該細胞或細胞株包含編碼Slc12a8蛋白之cDNA。該細胞或細胞株不包含胎盤衍生細胞。
該cDNA可編碼小鼠Slc12a8蛋白或其變異體。
該cDNA可編碼人類Slc12a8蛋白或其變異體。
在哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株之任一者中，cDNA可包含編碼SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14、或SEQ ID NO. 15之cDNA。
在哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株之任一者中，該細胞或細胞株可進一步包含可操作地連接該cDNA之啟動子。
在哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株之任一者中，與不包含該cDNA之相同哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株中之Slc12a8蛋白之表現相比，Slc12a8蛋白之表現較佳增加。
在哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株之任一者中，哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株可缺乏可偵測之CD73活性，可缺乏可偵測之CD38活性，或可缺乏可偵測之CD73活性及可偵測之CD38活性兩者。
在哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株之任一者中，哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株較佳表現出增加之NMN攝取。
哺乳動物細胞可包含纖維母細胞、腸細胞、胰臟細胞、肝細胞、脂肪細胞、神經元、或神經膠細胞。
哺乳動物細胞株可包含纖維母細胞、腸細胞、胰臟細胞、肝細胞、脂肪細胞、神經元、或神經膠細胞。
哺乳動物細胞可為NIH 3T3細胞。
哺乳動物細胞株可為NIH 3T3細胞株。
在哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株之任一者中，哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株可經cDNA序列穩定地轉型。
在哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株之任一者中，哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株可經cDNA序列短暫轉染。
在哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株之任一者中，cDNA序列可具有與GenBank參考序列：NM_134251(SEQ ID NO：1)至少70%序列一致性。
cDNA序列可具有與SEQ ID NO：1至少75%序列一致性。
cDNA序列可具有與SEQ ID NO：1至少80%序列一致性。
cDNA序列可具有與SEQ ID NO：1至少85%序列一致性。
cDNA序列可具有與SEQ ID NO：1至少90%序列一致性。
cDNA序列可具有與SEQ ID NO：1至少95%序列一致性。
cDNA序列可具有與SEQ ID NO：1至少99%序列一致性。
cDNA序列可具有與SEQ ID NO：1100%序列一致性。
哺乳動物細胞之任一者可為小鼠細胞或大鼠細胞。
哺乳動物細胞株之任一者可為小鼠細胞株或大鼠細胞株。
哺乳動物細胞之任一者可為人類細胞。
哺乳動物細胞株之任一者可為人類細胞株。 藥物篩選方法
提供用於篩選出識別調節(例如，促進) NMN運輸之化合物之候選化合物之方法。此類方法可用於例如識別出可用於預防或治療藉由促進向細胞中之NMN攝取來改善之疾病或病況之新治療化合物。
提供一種用於篩選出識別調節NMN運輸之化合物之候選化合物之方法。該方法包含(a)使該候選化合物與表現NMN運輸蛋白之細胞或包含NMN運輸蛋白之蛋白脂質體接觸；且(b)偵測該細胞中該NMN運輸蛋白之表現或活性變化或該蛋白脂質體中該NMN運輸蛋白之活性變化。與該候選化合物接觸之後該細胞中該NMN運輸蛋白之表現或活性變化或該蛋白脂質體中該NMN運輸蛋白之活性變化指示該候選化合物調節NMN之運輸。
NMN運輸蛋白可包含Slc12a8蛋白。
Slc12a8蛋白可包含具有與SEQ ID NO：12(小鼠Slc12a8蛋白)、SEQ ID NO：13(小鼠Scl12a8變異體A蛋白)、SEQ ID NO：14(小鼠Scl12a8變異體B蛋白)、或SEQ ID NO：15(人類Slc12a8蛋白)至少70%序列一致性之胺基酸序列。
Slc12a8蛋白可包含具有與SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15至少75%序列一致性之胺基酸序列。
Slc12a8蛋白可包含具有與SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15至少80%序列一致性之胺基酸序列。
Slc12a8蛋白可包含具有與SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15至少85%序列一致性之胺基酸序列。
Slc12a8蛋白可包含具有與SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15至少90%序列一致性之胺基酸序列。
Slc12a8蛋白可包含具有與SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15至少95%序列一致性之胺基酸序列。
Slc12a8蛋白可包含具有與SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15至少99%序列一致性之胺基酸序列。
Slc12a8蛋白可包含具有與SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15100%序列一致性之胺基酸序列。
該方法可進一步包含比較(i)在與候選化合物接觸之後，表現NMN運輸蛋白之細胞中NMN運輸蛋白之表現或活性；與(ii)在與候選化合物接觸之後，不表現NMN運輸蛋白之細胞或其中NMN蛋白之表現或活性已抑制之細胞中NMN運輸蛋白之表現或活性。
不表現NMN運輸蛋白之細胞可包含Slc12a8剔除動物之細胞。
該方法可進一步包含比較(i)在與候選化合物接觸之後，包含NMN運輸蛋白之蛋白脂質體中NMN運輸蛋白之活性；與(ii)在與候選化合物接觸之後，不包含NMN運輸蛋白之蛋白脂質體或其中NMN運輸蛋白之活性已抑制之蛋白脂質體中NMN運輸蛋白之活性。
不包含NMN運輸蛋白之蛋白脂質體可包含衍生自Slc12a8剔除動物之細胞之蛋白脂質體。
在該等方法之任一者中，細胞可包含哺乳動物纖維母細胞、腸細胞、胰臟細胞、肝細胞、脂肪細胞、神經元、或神經膠細胞。
在該等方法之任一者中，蛋白脂質體可包含衍生自哺乳動物纖維母細胞、腸細胞、胰臟細胞、肝細胞、脂肪細胞、神經元、或神經膠細胞之蛋白脂質體。
在該等方法之任一者中，細胞可包含本文所述之哺乳動物細胞之任一者。
在該等方法之任一者中，蛋白脂質體可包含衍生自本文所述之哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株之任一者之蛋白脂質體。
在該等方法之任一者中，蛋白脂質體包含衍生自包含Slc12a8 cDNA之哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株之蛋白脂質體。 醫藥組成物
提供一種醫藥組成物。該醫藥組成物包含NMN及NMN運輸蛋白促效劑。
該NMN運輸蛋白促效劑可包含選自由以下組成之群之化合物：菸鹼酸、戊四菸酯、菸鹼酸生育酚酯、β-吡啶甲醇、六菸鹼酸肌醇、其酯、其醫藥上可接受之鹽、及其組合。NMN運輸蛋白可包含菸鹼酸、其任何酯、或其任何醫藥上可接受之鹽。
菸鹼酸之酯或醫藥上可接受之鹽可為結構(I)之化合物其中R選自由以下組成之群：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、正己基、正辛基、2-氯乙基、2-羥乙基、3-羥丙基、2-甲氧基乙基、2-丁氧基乙基、胺甲醯基甲基、l-胺甲醯基乙基、2-二甲基胺乙基、3-胺丙基、四氫呋喃基、苯甲基、苯氧基乙基、對氯苯基、及對硝基苯基(例如，R可選自由2-二甲基胺乙基、對氯苯基、及對硝基苯基組成之群)。
另外，NMN運輸蛋白可包含Slc12a8多肽或其同源物。
提供另一種醫藥組成物。該醫藥組成物包含NMN及Slc12a8或其同源物之基因表現之誘導劑。
已詳細描述本發明，明顯的是，在不脫離如附加申請專利範圍所界定的本發明的範疇時，修改及變化係可能的。 實例 方法
本文所述之方法及組成物利用熟習此項技術者熟知之實驗室技術，且可見於諸如以下之實驗室手冊中：Sambrook, J.等人, Molecular Cloning：A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001；Spector, D. L.等人, Cells：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1998；Nagy, A., Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual(第三版), Cold Spring Harbor, NY, 2003及Harlow, E., Using Antibodies：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1999。投與藥品及劑量方案之方法可根據熟習此項技術者熟知之標準原則，使用Remington：the Science and Practice of Pharmacy(Alfonso R. Gennaro 編, 第19版, 1995)；Hardman, J.G.等人, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第九版, McGraw-Hill, 1996；及Rowe, R.C.等人, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第四版, Pharmaceutical Press, 2003。除非上下文另外指示，否則如本說明書及附加申請專利範圍中所用，單數形式「一個」、「一種」、及「該」意欲亦包括複數形式。
微陣列分析。自初代肝細胞、胰島、及海馬神經球單離出總RNA，用0.1% DMSO(對照)或FK866(初代肝細胞為200 nM，且胰島及海馬神經球為10 nM)處理。為了確定藉由FK866處理誘導之轉錄變化，使用Illumina小鼠Ref 8全基因體微陣列(第2版)進行微陣列分析。將減去背景之原始微陣列數據進行Z分數轉換，且如先前所述計算Z比率(Yoshino, J.等人, Cell Metab., 14, 528-536, 2011)。藉由R統計軟體套裝計算所有數據。
細胞培養及離體小腸外植體培養。將NIH3T3細胞在37℃及5% CO2下於補充有10%胎牛血清、100單位/ml青黴素、及100 μg/ml鏈黴素之杜爾貝寇氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium；DMEM)中培養。對於Slc12a8 mRNA表現分析，於6孔盤中用含有0.1% DMSO、或100 nM FK866、或100 nM FK866加100 μM NMN之具有1% FBS之DMEM孵育每孔2.5 × 105個細胞達24 h。將3月齡B6雄性小鼠之小腸切成三個區段，其中十二指腸/空腸/回腸長度比為1：3：2(Wang, H. H.等人, Hepatology 45, 998-1006, 2007)。將1公分各區段縱向打開，用冷PBS洗滌一次，且在37℃下用0.1% DMSO、或100 nM FK866、或100 nM FK866加500 μM NMN於具有5% FBS及以下添加劑之DMEM及漢姆氏F-12培養基(Ham's F-12 medium)之1：1混合物(Sigma)中孵育4 h：5 μg/ml胰島素(Sigma)、20 ng/ml表皮生長因子(Sigma)、1x B27補充劑(GIBCO)、1 mM丙酮酸鈉(Corning)、100單位/ml青黴素、100 μg/ml鏈黴素、及2 mM GlutaMAX™(GIBCO)。如先前所述，藉由定量RT-PCR分析細胞及組織RNA樣品(Stein, L. R.及Imai, S., EMBO J., 33, 1321-1340, 2014)。
藉由HPLC之NAD+及NMN測量。如先前所述，自細胞及組織提取出NAD+及NMN且藉由HPLC定量(Yoshino, J.等人, Cell Metab., 14, 528-536, 2011；Yoshino, J.及Imai, S., Methods Mol. Biol., 1077, 203-215, 2013)。
流動式細胞測量術分析。在37℃及5% CO2下於10-cm培養皿中用含有0.1% DMSO、或100 nM FK866、或100 nM FK866加100 μM NMN之具有1% FBS之DMEM孵育2 × 106個NIH3T3細胞達48 h。然後將細胞用冷PBS洗滌一次，用0.02%於PBS中之EDTA處理，且在4℃下使用在1：200下之可商購之多株兔抗小鼠Slc12a8抗體(ARP44039, Aviva, CA)、在1：2000下之結合ALEXA FLUOR® 488之二級山羊抗兔IgG(H+L)(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)、及在1：400下之存活標誌物ZOMBIE AQUA™染料(Biolegend, San Diego, CA)染色25 min以用於流動式細胞測量術。然後洗滌細胞且藉由GALLIOS™流動式細胞測量儀(BeckmanCoulter, Indianapolis, IN)進行分析。對於細胞內染色，首先在室溫下將細胞於2% PFA中固定10 min，然後在RT下於含有皂素之緩衝液中再滲透10 min。在4℃下於滲透緩衝液中進行Slc12a8染色達25 min。藉由GALLIOS™流動式細胞測量儀(BeckmanCoulter, Indianapolis, IN)分析樣品，且使用KALUZA™ 1.3(BeckmanCoulter, Indianapolis, IN)分析數據。使用ZOMBIE AQUA™可固定活力套組(Biolegend, San Diego, CA)排除死亡細胞。
肝細胞單離、5'-核苷酸酶活性檢定、NMN攝取測量、以及Slc12a8及Nrk1表現之靜默。如先前所述，自3月齡C57BL/6J(B6) 雄性小鼠單離出初代肝細胞(Grimm, A.A.等人, Aging Cell, 10, 305-317, 2011)。在進行任何實驗之前，在37℃及5% CO2下於塗佈有聚-L-離胺酸之6孔盤中將細胞於補充有10%胎牛血清(FBS)、100單位/ml青黴素、及100 μg/ml鏈黴素(pen/strep)之杜爾貝寇氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)中培養隔夜。藉由用500 nM FK866或500 nM FK866加500 μM NMN於具有1% FBS之DMEM中孵育肝細胞達24 h來評估Slc12a8 mRNA表現及NAD+含量。為了測試腺苷-5ʹ-[α, β-亞甲基]二磷酸酯(AOPCP)是否抑制5'-核苷酸酶活性，於12孔盤中將每孔1.5 × 105個細胞用500 nM FK866於具有1% FBS之DMEM中生長24 h，然後在100 μM單磷酸腺苷(AMP)或100 μM AMP加500 μM AOPCP存在下於1.4 ml pH 7.5之具有Ca2+及Mg2+之漢克斯氏緩衝鹽溶液(HBSS, GIBCO)中孵育。在不同時間點(0、1、5、15、及30 min)，收集200 μl各培養上清液並藉由添加28 μl 70%過氯酸來提取。藉由HPLC確定產生之腺苷之量。AMP及腺苷之溶離時間分別為4.7及17.4 min。為了檢查細胞活力，使用CELLTITER 96® AQueous單溶液細胞增殖溶液(Promega, Madison, WI)，且在4 h孵育之後在λ=490下測量吸光度。對於NMN攝取測量，於12孔盤中將每孔1.5 × 105個細胞用500 nM FK866於具有1% FBS之DMEM中生長24 h，然後在500 μM AOPCP、20 μM二吡待摩(dipyridamole)、及500 nM FK866或此等抑制劑加100 μM NMN存在下於1 ml HBSS中孵育。在不同時間點(0、0.25、1、5、15、及30 min)，用冷HBSS洗滌細胞一次並於冷10%過氯酸中溶解。如先前所述，藉由HPLC測量細胞內NMN水準(Yoshino, J.等人, Cell Metab., 14, 528-536, 2011)。對於基因靜默實驗，與100 μl AMAXA®小鼠肝細胞NUCLEOFECTOR®溶液(Lonza, Basel, Switzerland)混合，根據製造商之說明書使用NUCLEOFECTOR®程式H-26(Lonza, Basel, Switzerland)，將10 μg特異於Slc12a8(J-042450-12-0020)或Nrk1(J 051839-11-0010)之ON-TARGETPLUS™(Dharmacon, Inc, Lafeyette, CO)小鼠siRNA(Thermo scientific)或陰性對照siRNA(非靶向siRNA #1，D-001810-01-20)電穿孔至每個條件一百萬個細胞中。將電穿孔之細胞於光析槽中孵育15 min，之後添加培養基。電穿孔之後，在37℃及5% CO2下於塗佈有聚-L-離胺酸之6孔盤中將每孔2.5 × 105個細胞接種於含有10% FBS及青黴素-鏈黴素之DMEM中達48 h。將此等細胞用500 nM FK866於具有1% FBS之DMEM中孵育24 h。在室溫下於具有500 μM AOPCP、20 μM二吡待摩、及500 nM FK866或此等抑制劑加100 μM NMN之HBSS中孵育細胞1 min之後，藉由HPLC測量NMN攝取。藉由定量RT-PCR評估靜默效率。
穩定過表現全長小鼠Slc12a8 cDNA之NIH3T3細胞之產生。
將GenBank參考序列：NM_134251用於該序列。本文將GenBank 參考序列：NM_134251之序列呈現為SEQ ID NO：1。
藉由PCR，使用PFUULTRA™ II Fusion HS DNA聚合酶(Agilent, Santa Clara, CA)，用以下含有XhoI位點之正向及反向引物(表1)擴增小鼠肝臟之全長小鼠Slc12a8 cDNA(GenBank參考序列：NM_134251)之編碼區。 表1：
將所得全長Slc12a8 cDNA之2118-bp片段用XhoI消化且選殖至pBluescript SK-載體中。然後將Slc12a8 cDNA次選殖至哺乳動物表現載體pCXN2中(Revollo, J. R.等人, J. Biol. Chem., 279, 50754-50763, 2004)。藉由測序確認最終載體中之Slc12a8 cDNA序列。使用SUPERFECT®轉染試劑(QIAGEN, Fredrick, MD)，用5 μg攜帶全長Slc12a8 cDNA之pCXN2(Slc12a8-OE)或空pCXN2載體(對照)轉染NIH3T3細胞，且於補充有10% FBS、抗生素、及300 μg/ml G418(Invitrogen)之DMEM中培養2周。將抗性細胞彙集，且將等分試樣冷凍以用於進一步實驗。為了確認Slc12a8-OE細胞中之Slc12a8蛋白表現水準，如先前所述，由對照及Slc12a8-OE NIH3T3細胞製備質膜(PM)級分(Bruzzone, S.等人, FASEB J. 26, 1251-1260, 2012)。簡言之，使用培養於五個10-cm皿中之7.5 × 107個細胞。用冰冷的HES緩衝液(20 mM HEPES、1 mM EDTA、及255 mM蔗糖，pH 7.4)洗滌2次之後，將細胞藉由於含有蛋白酶抑制劑混合物(Roche)之HES緩衝液(3 ml/皿)中刮削來收集且藉由行進通過22號針5次來均質化。在4℃下進行所有後續步驟。在16,000 g下於JA 25.5轉動體(Beckman-Coulter)中離心(Avanti J-E)均質物達30 min。將團塊再懸浮於10 ml HES緩衝液中且在16,000 g下再離心30 min。將所得團塊再懸浮於10 ml HES緩衝液中且於10-ml 蔗糖墊(38.5%蔗糖、20 mM HEPES、及1 mM EDTA，pH 7)之頂部分層並在53,000 g下離心120 min。將含有PM級分之界面移除，再懸浮於10 ml HES緩衝液中，且在40,000 × g下離心30 min，得到於團塊中之PM級分。將對照或Slc12a8OE細胞之PM級分用RIPA緩衝液(150 mM氯化鈉、1.0% NP-40、0.25%去氧膽酸鈉、0.1% SDS、50 mM Tris，pH 7.5、2 mM EDTA、1 mM PMSF、0.5 mM DTT、及蛋白酶抑制劑混合物)溶解且於1x Laemmli緩衝液中沸騰5分鐘。用多株兔抗小鼠Slc12a8(1：500，ARP44039，Aviva，CA)及抗窖蛋白-1(1：2000，#3238，Cell Signaling，MA)進行西方墨點法。使用ADOBE® PHOTOSHOP®(Adobe Systems Inc.，San Jose，CA)，在AMERSHAM HYPERFILM™ ECL(GE Healthcare，Marlborough，MA)上定量譜帶強度。
用放射標記之NMN進行之NMN攝取分析。藉由離心(400 × g，5 min)收穫對照及Slc12a8-OE NIH3T3細胞，於HBSS中洗滌一次，且在37℃下於含有100 nM 3H-β-菸鹼醯胺單核苷酸(9 Ci/mmol；Moravek Biochemicals，CA)及未標記之NMN之HBSS [pH 7.5](5 × 106個細胞/ml)中孵育，得到最終濃度25 μM。在指定時間點(1、3、5、及10分鐘)，收集細胞之等分試樣(100 µl)且放置於含有在2 M氫氧化鉀溶液之頂部上之聚矽氧-礦物油(密度，1.015；Sigma-Aldrich)之1.5-ml微離心管中，接著在16,000 × g下離心30 s。自緩衝液分離出細胞且透過聚矽氧-礦物油層集結成粒。藉由液體閃爍計數器確定此等細胞團塊之放射性。對於計算Km及Vmax，如上文所述使用相同條件，但用範圍為1 μM至100 μM之各種總濃度的NMN。在4-min時間點，收集100 µl細胞懸浮液且以與上文所述相同的方式集結成粒。藉由液體閃爍計數器確定細胞團塊之放射性。減去對照NIH3T3細胞中測量之放射性以計算Slc12a8-OE NIH3T3細胞中之Slc12a8特異性NMN攝取。
蛋白脂質體實驗。如先前所述，進行蛋白脂質體製備(Bruzzone, S.等人, FASEB J., 15, 10-12, 2001)。簡言之，將2 × 107個對照細胞或Slc12a8-OE NIH3T3細胞再懸浮於1 ml溶解緩衝液(10 mM Tris-HCl，pH 8.3、150 mM NaCl、0.3 M蔗糖、蛋白酶抑制劑混合物)中並使用均質機破碎。將溶解產物在3,000 × g下離心10 min，且收集上清液並在100,000 × g下離心15 min。用緩衝液A(10 mM Tris-HCl，pH 8.3，其含有150 mM NaCl及0.5%正辛基β-葡哌喃糖苷)溶解膜蛋白。單獨地，如先前所述，自無血紅素紅血球膜(山羊)提取出總脂質(Franco, L.等人, FASEB J., 12, 1507-1520, 1998)。將人類紅血球膜之總脂質(3 mg)乾燥且與600 µl經溶解之膜蛋白(在約0.7 mg/ml蛋白濃度下)一起再懸浮。將所得乳液在冰中聲處理1 min且在4℃下用5公升不含正辛基-β-葡哌喃糖苷之緩衝液A(透析緩衝液)透析24 h。回收蛋白脂質體，在100,000 × g下離心15 min，再懸浮於900 µl透析緩衝液中，且行進穿過30號針5次。
為了檢查Slc12a8之Na+依賴性，用150 mM LiCl置換NaCl。在4℃下進行所有步驟。在25℃下，在含或不含無標記核苷酸(NMN、NR、NAD、AMP、NAM、或NaMN)之105 cpm/ml 3H-β-NMN(比活性，9.1 Ci/毫莫耳)存在下，將蛋白脂質體(各條件30 µl一式三份)孵育2、5、或10 min。在孵育結束時，將樣品在玻璃纖維紙上過濾。用3 ml透析緩衝液洗滌濾器，乾燥，且計算放射性。
體內Slc12a8敲落實驗。為了產生表現shRNA之慢病毒構築體，產生小鼠Slc12a8及螢火蟲螢光素酶(fLuc)之56-bp雙鏈寡核苷酸(其各自含有意義靶序列、基於微小RNA之環序列(CTTCCTGTCA；SEQ ID NO：4)、反義序列、4胸苷之終止序列、及在兩端之適當限制酶位點)且選殖至華盛頓大學醫學院(Washington University School of Medicine)之病毒載體核心提供之U6-PGK-GFP載體中。有義Slc12a8序列為‘5-GCCTAGAGTGAACAGAGAAGA-3'(SEQ ID NO：5)。慢病毒係如先前所述產生(Satoh, A.等人, Cell Metab., 18, 416-430, 2013)。使用初級腸結構測試敲落效率(Sato, T.及Clevers, H., Methods Mol. Biol. 945, 319-328, 2013)。由華盛頓大學之神經紊亂康復中心(Hope Center for Neurological Disorders)之病毒載體核心進行大規模慢病毒生產。將三月齡C57BL/6J雄性小鼠(Jackson Laboratories)在隔夜禁食連續兩天之後以5 × 106個轉導單位之效價口服接受(藉由管飼) fLuc或Slc12a8 shRNA慢病毒。6天之後，將已接受fLuc或Slc12a8 shRNA慢病毒之小鼠禁食隔夜，給予NMN(500 mg/kg)或PBS之管飼。在管飼投與之後0、5、及60 min自尾部靜脈收集血液，然後藉由離心分離血漿。然後在管飼投與之後60分鐘收集組織樣品。如先前所述，測量血漿NMN及組織NAD+水準(Yoshino, J.等人, Cell Metab., 14, 528-536, 2011；Grimm, A. A.等人, Aging Cell, 10, 305-317, 2011)。
抗小鼠Slc12a8之抗體之產生。針對小鼠Slc12a8之合成N端肽(AQRSPQELFHEAAQQGC；SEQ ID NO：6)(Covance, Denver, PA)產生兩種不同多株兔抗血清。自此等抗血清之一親和力純化出Slc12a8特異性抗體。將針對Slc12a8 N端肽之抗血清或親和力純化之抗體以1：500稀釋用於西方墨點法。
全身Slc12a8剔除小鼠之產生。由華盛頓大學之基因轉殖載體核心用CRISPR-CAS9技術產生全身Slc12a8剔除(Slc12a8KO)小鼠。將CRISPR gRNA設計成Slc12a8基因之側翼外顯子4。gRNA序列係如下：5' gRNA；5'- AGTGCATGTATAGACGTATG - 3'(SEQ ID NO：7)及3' gRNA；5' - CCTCACAAATATTTACAGGC - 3'(SEQ ID NO：8)。呈gBlock(IDT)獲得gRNA。藉由使用XTREMEGENE™ HP(Roche, Basel, Switzerland)用gBlock及Cas9質體(addgene # 42230)轉染N2A細胞來評估裂解活性。藉由T7E1檢定使用標準方法確定裂解活性。使用T7 MEGASHORTSCRIPT™套組(Ambion, Waltham, MA, USA)體外轉錄gRNA。使用MMESSAGE MMACHINE® T7超級套組(Ambion, Waltham, MA)體外轉錄Cas9 RNA。使用MEGACLEAR®柱(Ambion, Waltham, MA)純化所有RNA。在華盛頓大學小鼠基因核心設施中在50 ng/µl Cas9、25 ng/µl gRNA、及100 ng/µl ssODN之濃度下將RNA微注射至C57BL/6J × CBA雜交合子中。藉由PCR跨裂解位點偵測全身剔除細胞且藉由測序來確認。一種異型接合創始者(founder)經確立，且小鼠經回交至野生型C57BL/6J小鼠(Jackson Laboratories)達5代，之後進行分析。Slc12a8缺失異型接合小鼠經雜交以產生同型接合Slc12a8KO小鼠。將野生型同窩仔畜用作對照。
18O-D-NMN之產生。由18O水中菸鹼甲腈之水解製備18O菸鹼醯胺(Kolodziejska-Huben, M.等人, J. Label. Compd. Radiopharm. 45, 1005-1010, 2002)。由D-[2-2H]-核糖合成1,2-2H,3,5-四乙酸鹽(購自Omicron Biochemicals；Chatterjee, A.等人, Angew. Chem. Int.編 Engl. 49, 8653-8656, 2010)。由18O-菸鹼醯胺及D-核呋喃糖1,2-2H,3,5-四乙酸鹽合成18O-2H標記之菸鹼醯胺核糖苷(Fouquerel, E.等人, Cell Rep., 8, 1819-1831, 2014)。如先前所述，由18O-2H菸鹼醯胺核糖苷合成18O-2H菸鹼醯胺單核苷酸(18O-D-NMN)(Mills, K. F等人, Cell Metab., 24, 795-806, 2016)。
同位素示蹤實驗。隔夜禁食之後，將7至8月齡Slc12a8KO小鼠及其野生型同窩仔畜口服投與500mg/kg 18O-D-NMN或PBS。在口服管飼之後10 min，收集空腸及回腸。將試劑級甲醇及水之1：1混合物(4℃)添加至冷凍組織(60 μL/mg組織)中。聲處理之後，在4℃下將提取物在12,000 × g下離心15 min。將氯仿在1：1(v/v)比率下添加至提取物中，充分振盪30 s，且在4℃下在12,000 × g下離心10 min。將上層相(甲醇及水)與下層(有機)相分開且在室溫下藉由快速真空來凍乾，用5 mM甲酸銨重構且在12,000 × g下離心10 min。將於5 mM甲酸銨中之濃度範圍為128-1000 nmol/L之NMN及18O-D-NMN之連續稀釋液用於校準。藉由HPLC(1290；Agilent)用ATLANTIS® T3(LC 2.1 × 150mm, 3 mm；Waters, Millford, MA)在0.15 ml/min之流速下進行液相層析，其中5 mM甲酸銨為流動相A且100%甲醇用於流動相B。以下列梯度溶離代謝物：0-10 min，0-70% B；10-15 min，70% B；16-20 min，0% B。用三重四極質譜儀(6470；Agilent)在正ESI多重反應監測(MRM)下使用針對NMN(335＞123)及18O-D-NMN(338＞125)之參數分析代謝物。NMN之碎斷、碰撞、及後段加速電壓為135、8、7。使用MassHunter定量分析工具(Agilent)識別NMN及18O-D-NMN峰。
動物實驗。在12-hr光/12-hr暗循環之情況下將所有小鼠群養於隔離設施中。在標準飼料上隨意飼養小鼠(LabDiet 5053；LabDiet, St. Louis, MO)。如先前所述，進行食物攝入量及餵食及禁食葡萄糖、三酸甘油酯、游離脂肪酸、及胰島素水準之測量(Yoshino, J.等人, Cell Metab., 14, 528-536, 2011；Mills, K. F.等人, Cell Metab., 24, 795-806, 2016；Yoon, M.J.等人, Cell Metab., 21, 706-717, 2015)。在上午9點與10點之間收集Slc12a8KO小鼠及其野生型同窩仔畜之糞便且使其在55℃下乾燥隔夜，之後稱重。如先前所述，用氯仿/甲醇混合物(2：1，體積/體積)(Sigma, St. Louis, MO)提取總糞便脂肪(Folch, J.等人, J. Biol. Chem., 226, 497-509, 1957)。將1毫升有機相轉移至預先稱重之管中，真空乾燥，且再稱重以確定脂質量。將脂質含量之百分比正規化為提取之糞便之起始質量(g)。在上午9點或下午9點收集8-10月齡Slc12a8KO小鼠及其野生型同窩仔畜之組織，且藉由HPLC確定NAD+水準。使用全身NMR儀器(EchoMRI®, Echo Medical Systems LLC, Waco, TX)確定體組成。藉由PhenoMaster系統(TSE Systems, MO)進行間接熱量分析及運動活性測試(locomotor activity)。所有動物研究均經華盛頓大學動物研究委員會批准且根據NIH指導進行。
血漿GLP-2測量。禁食24 h(上午9點至上午9點)之後及再餵食6 h(上午10點至下午4點)之後使用EDTA塗佈之微量采血管(microvette tube)收集7-9月齡Slc12a8KO小鼠及其對照野生型同窩仔畜之尾部靜脈之血液。立即在冰上冷卻血液，在5,000 × g及4℃下離心，且在-80℃下儲存血漿樣品。根據製造商之說明書，藉由小鼠GLP-2 ELISA套組(Alpco, Salem, NH)測量血漿GLP-2水準。
血漿中及離體小腸外植體培養物之上清液中之GLP-1測量。在禁食24 h(上午9點至上午9點)之後再餵食6 h(上午10點至下午4點)之後使用EDTA塗佈之管收集2月齡或24月齡雌性Slc12a8敲落小鼠及其對照組之尾部靜脈之血液。立即在冰上冷卻血液，在5,000 × g及4℃下離心，且在-80℃下儲存血漿樣品。將腸特異Slc12a8敲落雌性小鼠或12月齡Slc12a8KO雌性小鼠之小腸切成十二指腸、空腸、及回腸之三段，長度比為1：3：2(Wang, H. H.等人., Hepatology, 2007, 45, 998-1006)。將一公分回腸或結腸縱向打開，用冷PBS洗滌一次，且在37℃下於500 µl不含菸鹼醯胺及葡萄糖且含0.25%無脂肪酸白蛋白牛血清(Sigma, St. Louis, MO)之DMEM(GIBCO，分泌培養基)中孵育2 h。對於用Sirt1及Sirt6抑制劑之實驗，在37℃下將24月齡雌性B6小鼠之回腸於500 µl含有0.2% DMSO(媒劑)、20 µM EX527(Cayman chemical, MI)、或20 µM STK665401(ChemDiv，cat #8018-9378；Sociali, G.等人, Eur. J. Med. Chem., 2015, 102, 530-539)之分泌培養基中預孵育2 h。預孵育之後，將培養基置換，且在37℃下將離體回腸外植體用相同的化學品孵育2 h。於潮濕孵育器(95% O2，5% v/v CO2)中孵育結束時，收集培養基，在4℃下在800g下離心5分鐘以移除任何漂浮物，且在-80℃下冷凍以用於後續GLP-1測量。根據製造商之說明書，藉由GLP-1總ELISA套組(EMD Millipore, MO)測量血漿及培養基中之GLP-1水準。藉由Bradford檢定所分析之總蛋白含量來正規化GLP-1值。
雷射顯微解剖。對各下視丘細胞核進行顯微解剖，並如先前所述，提取總RNA並藉由定量RT-PCR進行分析(Satoh, A.等人, Cell Metab., 18, 416-430, 2013)。
統計分析。除非另外指示，否則使用學生t檢定評估兩組之間的差異。使用單向ANOVA及實例中指示之各種事後檢定進行若干組之間的比較。使用魏克遜配對組符號等級檢定(Wilcoxon matched-pairs signed ranks test)比較氧消耗、能量消耗、呼吸交換率、及總運動活性之差異。對於比較，將＜0.05之p值視為統計學顯著。使用GraphPad Prism(第7版)進行統計分析。所有值呈現為平均值±SEM。除非另外指定，否則*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。 實例
本教示包括實例中所提供之描述，該等實例不意欲限制任何申請專利範圍或態樣之範疇。除非以過去式特別呈現，否則實例可為預示或實際實例。提供以下非限制性實例以進一步說明本教示。然而，根據本揭露，熟習此項技術者應理解可在不脫離本教示之精神及範疇之情況下對所揭示之具體實施例進行許多改變且仍獲得相似或類似之結果。 實例1
此實例說明NMN運輸蛋白基因之識別。
當在各種類型的初代細胞中NAMPT介導之NAD+生物合成受FK866(有效的NAMPT抑制劑)抑制時，與在FK866不存在下NMN所誘導之NAD+增加相比，NMN之共同投與總是產生較高NAD+增加(Revollo, J. R.等人, Cell Metab., 6, 363-375, 2007；Stein, L. R.及Imai, S., EMBO J., 33, 1321-1340 2014；Yoshino, J.等人, Cell Metab., 14, 528-536, 2011)。本研究人員在FK866處理之初代小鼠肝細胞、胰島、及海馬神經球中進行基因表現剖析，搜索在這三種初代培養物中通常上調的基因。搜索集中於編碼運輸蛋白或跨膜蛋白之基因，且發現僅一個符合此等標準且具有未知功能的基因。初代肝細胞、胰島、及神經球中此基因Slc12a8表現出分別2.06、1.69、及4.91之Z比率(圖1)。Slc12a8經識別於圖1中之汾恩圖中由箭頭所指示之部份中。各細胞類型之Slc12a8之Z比率及p值顯示於圖1中。Slc12a8基因屬電中性陽離子-氯化物偶聯之共同運輸蛋白之SLC12基因家族，且此基因編碼之蛋白之功能尚不清楚(Hebert, S. C.等人, Pflugers Arch. 447, 580-593, 2004)。 實例2
此實例說明B6小鼠中Slc12a8之差異性表現。
圖2說明Slc12a8於3月齡B6雄性小鼠(n= 3只小鼠)之小腸及胰臟中高度表現且於肝臟及白色脂肪組織中中度表現。初代小鼠肝細胞中觀察到另外的Slc12a8 mRNA表現變化且繪示於圖3中；(n=4只小鼠)，NIH3T3纖維母細胞(n=4)，以及空腸及回腸之離體外植體(DMSO及單獨FK866為n=4只小鼠；FK866加NMN為n=3只小鼠)，其用0.1% DMSO、單獨FK866、或FK866加NMN處理(細胞為24 h，且外植體為4 h；使用ANOVA用塔基氏檢定(Tukey's test)分析)。當用FK866處理時，小鼠初代肝細胞、小鼠NIH3T3纖維母細胞、以及空腸及回腸之離體外植體中Slc12a8表現經顯著誘導，而此誘導藉由添加NMN來手抑制(圖3-5)。圖4繪示用DMSO、單獨FK866、及FK866加NMN處理之初代小鼠肝細胞及NIH3T3纖維母細胞中之細胞內NAD+含量。細胞經此等化合物處理24 h(經DMSO及FK866處理之肝細胞為n=4只小鼠，且經FK866及NMN處理之肝細胞為n=3只小鼠；NIH3T3細胞為n=6；使用ANOVA用塔基氏檢定分析分析)。圖5繪示藉由流動式細胞測量術分析測量經FK866或FK866加NMN處理48 h之NIH3T3細胞中表面及細胞內Slc12a8蛋白表現水準。計算在針對凋亡標記物(Zombi-)陰性選擇之細胞中Slc12a8染色(Slc12a8+)之陽性NIH3T3細胞之百分比(表面染色為n=8，且細胞內染色為n=5；藉由非配對t檢定分析)。 實例3
此實例說明Slc12a8對NMN攝取之動力學之效應。
確定了小鼠初代肝細胞中NMN攝取之動力學。用AOPCP(腺苷-5ʹ-[α, β-亞甲基]二磷酸酯)抑制NMN由CD73細胞外降解成NR。用二吡待摩抑制NR透過核苷運輸蛋白向細胞中之攝取，且用FK866抑制藉由NAMPT之細胞內NMN合成。用AMP或AMP加AOPCP孵育完整初代肝細胞。在不同時間點(0、1、5、15、及30 min)藉由HPLC測量細胞外腺苷之產生。AOPCP抑制5'-核苷酸酶活性97%。AOPCP、二吡待摩、及FK866之混合物不影響細胞活力至多30 min(數據未示出)。
將初代小鼠肝細胞用500 nM FK866預處理24 h，然後在有或沒有100 μM NMN之情況下用20 μM二吡待摩、500 μM AOPCP、及500 nM FK866之混合物孵育。藉由HPLC測量NMN(n=4只小鼠，除了對於僅抑制劑之15及30分鐘為3個數據組；使用ANOVA用斯達克氏檢定(Sidak's test)分析)。與小鼠初代肝細胞之對照相比，此處理使細胞內NMN水準在1 min時間點顯著增加(圖6)。 實例4
此實例說明減少之Slc12a8及Nrk1 mRNA對NMN攝取之效應。
為了測量初代小鼠肝細胞中Slc12a8及Nrk1 mRNA之敲落效率，用雜燴(scramble)及Slc12a8或Nrk1 siRNA處理細胞72 h(Slc12a8靜默為n=5只小鼠且Nrk1靜默為n=3；使用未配對700 t檢定分析)。不受理論限制，此等條件敲落Slc12a8及Nrk1(將NR細胞內轉化成NMN之主要NR激酶)之表現(Belenky, P.等人, Cell, 129, 473-484, 2007)。經由HPLC分析在添加100 μM NMN之後1 min時用雜燴、Slc12a8、及Nrk1 siRNA處理之初代肝細胞。培養條件與實例3中所述相同(Slc12a8靜默為n=5只小鼠且Nrk1靜默為n=3；藉由ANOVA用塔基氏檢定分析)。兩種基因之敲落效率為大約80%(圖7)。Slc12a8敲落肝細胞中NMN之快速攝取經完全取消，而Nrk1敲落肝細胞中觀察到NMN攝取之不顯著減少(圖8)；這些數據指示，Slc12a8不是初代肝細胞中NMN之快速攝取所必需的，且觀察到之細胞內NMN之增加並不是由於NR或菸鹼醯胺轉化成NMN。 實例5
此實例說明小鼠NIH3T3細胞中全長小鼠Slc12a8 cDNA之過表現。
選擇NIH3T3細胞株，因為其不具有任何可偵測之細胞外CD73活性(將NMN轉化成NR)及CD38活性(將NMN降解成菸鹼醯胺及磷核糖)且亦具有非常弱的NMN攝取活性。如方法中所述，將全長小鼠Slc12a8 cDNA轉染至細胞中，且檢定Slc12a8蛋白之表現。圖9繪示對照及Slc12a8-OE NIH3T3細胞之質膜級分中之Slc12a8蛋白表現。圖10繪示針對各細胞株之正規化成窖蛋白-1蛋白水準之Slc12a8蛋白水準(右圖；n=3，藉由未配對t檢定分析)。Slc12a8過表現NIH3T3(Slc12a8-OE)細胞中Slc12a8蛋白水準顯著增加約2.2倍。 實例6
此實例說明Slc12a8-OE及對照細胞中使用3H標記之NMN之NMN攝取動力學。
如在「用放射標記之NMN進行之NMN攝取分析」下之方法中所述，在37℃下於具有Mg2+及Ca2+漢克斯氏緩衝液[ph7.5]中在對照及Slc12a8-OE NIH3T3細胞中使用25 μM 3H-NMN歷經10 min來測量NMN攝取(n=12；藉由ANOVA用斯達克氏檢定分析)。與對照細胞相比，Slc12a8-OE細胞中在3及5 min時間點時3H-NMN攝取顯著增強(圖11)。為了計算Slc12a8蛋白之米開勒斯-曼登參數，在37℃下於具有Mg2+及Ca2+之漢克斯氏緩衝液[pH7.5]中用100 nM 3H-NMN及遞增濃度之冷NMN孵育對照及Slc12a8-OE NIH3T3細胞4 min。由非線性迴歸分析藉由減去對照細胞之背景來確定Km及Vmax值(1及10 μM為n=5，且25及100 μM為n=4)。對於NMN，Km為34.1 ± 8.3 μM且Vmax為11.5 ± 1.2 pmol/min/mg(圖12)。此Km定性地符合小鼠血漿及紅血球中NMN濃度之偵測範圍(Revollo, J. R.等人, Cell Metab., 6, 363-375, 2007；Ramsey, K. M.等人, Science, 324, 651-654, 2009；Yamada, K.等人, Anal. Biochem., 352, 282-285, 2006)。 實例7
此實例說明Slc12a8蛋白之特異性。
藉由將Slc12a8-OE或對照NIH3T3細胞之膜級分與衍生自去蛋白紅血球質膜之磷脂雙層組合來產生蛋白脂質體，如上所述，在25℃下在運輸緩衝液中之由Slc12a8-OE及對照NIH3T3細胞之質膜級分所產生之蛋白脂質體中使用22 nM 3H-NMN(n=3；藉由單向ANOVA用斯達克氏多重比較檢定分析)。在2 min內，Slc12a8-OE衍生之蛋白脂質體與對照衍生之蛋白脂質體相比結合顯著更高水準的3H-NMN(圖13)。
在一些實驗中，發現菸鹼酸(NA)能夠增強放射標記之3H-NMN向Slc12a8過表現蛋白脂質體中之攝取(圖42)。藉由NA之3H-NMN攝取之增強在若干不同條件下經複製(圖42)。
為了確定Slc12a8之受質特異性，將此等Slc12a8-OE蛋白脂質體用於用3H-NMN及各種冷NAD+相關化合物之置換實驗。在運輸緩衝液中在150 μM競爭性冷化合物(NMN、NR、NAD、AMP、NaMN、及菸鹼醯胺)存在下在2 min時測量Slc12a8-OE蛋白脂質體之3H-NMN攝取(150 nM，25℃)(n=3，藉由ANOVA用杜奈特氏檢定(Dunnett's test)分析)。150 μM冷NMN顯示3H-NMN之完全置換，而NAD+、AMP、菸鹼酸單核苷酸(NaMN)、及菸鹼醯胺顯示在相同濃度下非常低或可忽略的置換(圖14)。150 μM NR表現出約70%置換，且因此使用該蛋白脂質體系統確定NMN及NR之IC50濃度。NMN之IC50為22.8 ± 3.6 μM，而NR之IC50為77.4 ± 10.8 μM(圖15)。數據係呈3H-NMN攝取之百分比顯示(n=3；藉由非線性迴歸分析計算IC50)。因為尚未顯示，在病理生理條件中諸如在血液(Frederick, D. W.等人, Cell Metab., 24, 269-282, 2016)及腹水滲出液(Sociali, G.等人, Oncotarget, 7, 2968-2984, 2016)中NR水準可達到此一高濃度，且不受理論限制，此結果表明Slc12a8蛋白在生理條件下主要特異於NMN。
此等發現指示，NA及一些NA衍生化合物可用於有助於Slc12a8 NMN運輸蛋白之功能。 實例8
此實例說明NMN運輸之Slc12a8之鈉離子依賴性。
在此等實驗中，使用蛋白脂質體系統評估NMN運輸之Slc12a8之鈉離子依賴性。當蛋白脂質體製備及NMN流入測量期間用等莫耳濃度的鋰(Li+)置換鈉(Na+)時，3H-NMN結合顯著減小約80%(圖16；n=3，藉由未配對t檢定分析)，指示藉由Slc12a8之NMN運輸具有鈉離子依賴性。
此等結果指示，鈉鹽可增強Slc12a8介導之NMN運輸，且諸如鋰之其他陽離子可抑制Slc12a8介導之NMN運輸。 實例9
此實例說明NIH3T3細胞中Slc12a8過表現對NAD+生物合成之效應之確定。
當將對照NIH3T3及Slc12a8-OE細胞用100 nM FK866、2 μM二吡待摩、及500 μM AOPCP之混合物預處理1 h時，對照及Slc12a8-OE細胞兩者中細胞內NAD+水準顯著降低(圖41)。然而，額外用100 μM NMN孵育1 h能夠僅使Slc12a8-OE細胞而非對照NIH3T3細胞中NAD+水準恢復至原始水準(圖41；n=9；藉由ANOVA用塔基氏檢定分析)。 實例10
此實例說明NMN運輸蛋白之體內驗證。
如上所述產生攜帶螢火蟲螢光素酶(fLuc) shRNA及Slc12a8 shRNA之慢病毒。發明人將各病毒直接管飼至小鼠腸。透過西方墨點測量對照shfLuc慢病毒感染及shSlc12a8慢病毒感染之空腸及回腸樣品中之Slc12a8蛋白表現水準(圖17)。圖18顯示空腸及回腸中正規化成GAPDH蛋白水準之Slc12a8蛋白水準之條形圖(n=6；3-4月齡B6雄性，藉由未配對t檢定分析)。與接受fLuc shRNA表現慢病毒之小鼠相比，腸中接受Slc12a8 shRNA表現慢病毒之小鼠之空腸中Slc12a8蛋白水準降低約60%且回腸中降低約30%(圖17-18)。當藉由向該等小鼠口服管飼來投與NMN(500 mg/kg體重)時，在5 min時對照小鼠中血漿NMN水準顯著增加，但Slc12a8敲落小鼠中血漿NMN水準不增加(圖19；藉由HPLC測量NMN；n=6；3-4月齡B6雄性，藉由ANOVA用斯達克氏檢定分析)。相反，與對照小鼠相比，Slc12a8敲落小鼠中血漿菸鹼醯胺水準傾向於更高(圖20)，可能是因為Slc12a8敲落小鼠中較高水準的NMN降解成菸鹼醯胺。除血漿樣品之外，在口服管飼磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或NMN(500 mg/kg體重)之後60 min時間點收集對照shfLuc慢病毒感染及shSlc12a8慢病毒感染之小鼠之空腸之組織樣品(PBS為n=5，且NMN為n=8；3-4月齡B6雄性)。然後藉由HPLC測量此等樣品中之NAD+水準(藉由ANOVA用塔基氏檢定分析)。與對照小鼠相比，Slc12a8敲落小鼠之空腸中之NAD+水準顯著下降(圖21)。此等結果強烈表明小腸中之Slc12a8對於自腸吸收NMN至血液循環來說為重要的，其影響小腸中之NAD+水準及體內全身NMN供應。 實例11
此實例說明Slc12a8剔除小鼠之特徵。
如上所述使用CRISPR-CAS9系統自小鼠切除Slc12a8基因之外顯子4，其得到全身Slc12a8剔除(Slc12a8KO)小鼠。此等剔除小鼠之出生比低於預期孟德爾式比率，其意味胚胎階段期間有一些早產死亡。然而，出生的幼崽生長至成年，且並未顯示任何嚴重的異常。在光照時間(上午9-10點)期間或黑暗時間(下午9-10點)期間收集Slc12a8KO小鼠及對照野生型同窩仔畜(WT)之十二指腸、空腸、回腸、及胰臟之組織樣品。藉由HPLC測量此等樣品中之NAD+水準(光照時間為n=5只小鼠，且黑暗時間為n=4只小鼠，除了Slc12a8KO小鼠之空腸為3個數據點；8-10月齡雌性；藉由未配對t檢定分析)。在成年Slc12a8KO小鼠中，組織中全長Slc12a8 mRNA之表現經完全消除(n=3，2-3月齡雄性；圖22)。藉由西方墨點法亦顯示Slc12a8KO小鼠之空腸及回腸(圖23)、胰臟(圖23)、及下視丘(圖24)之全組織溶解產物中Slc12a8蛋白表現經消除。使用針對Slc12a8之N端結構域之前17個胺基酸之抗血清。剔除小鼠之十二指腸不表現全長Slc12a8蛋白(圖23)，儘管其在野生型小鼠中表現高水準Slc12a8 mRNA(圖2)。與小腸中之蛋白表現概況一致，Slc12a8KO小鼠顯示空腸及回腸中但非十二指腸中之NAD+水準之顯著降低，特別是在NAD+ 198個水準通常升高的黑暗時間期間(圖25A-B)。其亦顯示在光照及黑暗時間期間胰臟中之NAD+降低(圖25A-B)。為了確認Slc12a8KO小鼠之小腸中之NMN運輸是否受損，發明人進行雙重標記之3-D較重同位素NMN(18O-D-NMN)之管飼，且藉由質譜法測量18O-D-NMN向空腸及回腸中之直接攝取。藉由口服管飼在Slc12a8KO小鼠及對照野生型(WT)同窩仔畜中投與500 mg/kg 758 18O-D-NMN之後10 min，野生型空腸及回腸清楚地偵測出此同位素NMN，而Slc12a8KO小鼠之空腸及回腸中18O-D-NMN攝取分別減少46%及36%(圖26；n=6只小鼠，7-8月齡的3只雄性及3只雌性，除了野生型回腸為2只雄性及2只雌性；藉由未配對t檢定分析)。藉由減去PBS對照之背景值計算18O-D-NMN之峰下面積。值係相對於在WT中偵測之18O-D-NMN水準來表示。在此實例中，所有值呈現為平均值±SEM。*p＜0.05，**p＜0.01 實例12
此實例說明Slc12a8KO小鼠表現出飲食過多，而對脂肪或精肉質量沒有影響。
在6-7月齡時，Slc12a8KO小鼠(特別是雌性小鼠)在黑暗時間時期開始出現明顯的飲食過多(圖27)。在光照時間(上午9點-下午6點)及黑暗時間(下午6點-上午9點)，測量Slc12a8KO小鼠及對照野生型(WT)同窩仔畜之食物攝入5天(各基因型為n=8只小鼠；6-7月齡雌性；藉由未配對t檢定分析)。然而，與野生型對照相比，Slc12a8KO小鼠未顯示在脂肪及精肉質量方面的任何差異(圖28)。使用全身NMR儀器測量Slc12a8KO及對照野生型同窩仔畜中之脂肪及精肉質量(各基因型為n=8只小鼠；8-10月齡雌性)。表現出之飲食過多並非由於腸吸收不良，因為對照小鼠與Slc12a8KO小鼠之間的糞便脂質含量沒有差異(圖29)。測量在上午9-10點收集自Slc12a8KO小鼠及對照野生型同窩仔畜之糞便之總脂質含量，表示提取之起始分辨質量之百分比(各基因型為n=8只小鼠，6-8月齡雌性)。 實例13
此實例說明Slc12a8KO小鼠之增加之呼吸及活力。
有趣的是，Slc12a8KO小鼠在黑暗時間期間表現出氧消耗(VO2；圖30)、能量消耗(圖31)、及總走動(圖32)之適度增加，為其在無體重增加之情況下的攝食過量表型提供解釋。此等小鼠亦顯示顯著較低的呼吸交換率(RER；圖33)，其意味在光照時間期間更高的脂肪酸利用，為維持正常脂肪質量提供額外解釋，儘管對照小鼠與Slc12a8KO小鼠之間的血漿脂肪酸水準未偵測出差異(未圖示)。 實例14
此實例說明Slc12a8剔除小鼠之增加之葡萄糖代謝。
當禁食16小時時，雌性Slc12a8KO小鼠(各基因型為n=8只小鼠；6-8月齡雌性；藉由未配對t檢定分析)表現出更高的葡萄糖(圖34)、胰島素(圖35)、及三酸甘油酯水準(圖36)。不受理論限制，所有此等表現型共同意味下視丘功能障礙。 實例15
此實例說明Slc12a8剔除小鼠中之升糖素樣肽2受體(GLP-2R)減損。
GLP-2R為腸道內分泌L細胞(enteroendocrine L cell)所產生之33個胺基酸升糖素原衍生之肽。禁食24 h(上午9點至上午9點)之後然後再餵食6 h(上午10點至下午4點)之後藉由ELISA測量Slc12a8KO小鼠之血漿GLP-2水準(各基因型為n=8只小鼠；7-8月齡雌性)。Slc12a8KO小鼠顯示回應於禁食24 h之後再餵食6 h之顯著較低的GLP-2血漿水準，而對照小鼠顯示再餵食之血漿GLP-2水準之顯著增加(圖37)。 實例16
此實例說明Slc12a8剔除小鼠之弓狀核中之表現破壞。
Chop(DNA損傷可誘導轉錄本3)及Socs3(細胞介素信號傳導抑制因子3)回應於內質網(ER)應激及所得的瘦素抗性而上調。在黑暗時間(下午9-10點)期間測量Slc12a8KO小鼠及對照野生型同窩仔畜之下視丘弓狀核中之Chop及Socs3 mRNA表現水準(Chop，各基因型為n=3只小鼠；Socs3，各基因型為n=4只小鼠；8-10月齡雌性；藉由未配對t檢定分析)。與此缺乏適當GLP-2刺激一致，Slc12a8KO小鼠之弓狀核表現出mRNA表達水準之增加(圖38)。不受理論限制，此等結果表明弓狀神經元之功能障礙(Williams, K.W.等人, Cell Metab., 20, 471-482,2014)。測量隨意餵食之Slc12a8KO小鼠及對照野生型同窩仔畜之Pepck(磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶)及G6pc(葡萄糖-6-磷酸酶催化次單元) mRNA表現水準(各基因型為n=5只小鼠；8-10月齡雌性；藉由未配對t檢定分析)。發現Slc12a8KO小鼠中此等糖質新生基因(gluconeogenic gene)上調(圖39)。不受理論限制，此等數據進一步提供弓狀神經元功能障礙之證據，且解釋禁食之Slc12a8KO小鼠中較高的葡萄糖及胰島素水準。 實例17
此實例說明Slc12a8剔除小鼠中PMCH之日mRNA表現概況。
在光照時間(上午9-10點)及黑暗時間(下午9-10點)期間測量Slc12a8KO小鼠及對照野生型同窩仔畜之側下視丘(LH)中之PMCH(原黑色素濃縮激素(Pro-Melanin Concentrating Hormone)) mRNA表現水準(各基因型為n=3只小鼠；8-10月齡雌性；藉由未配對t檢定分析)。Slc12a8KO小鼠之側下視丘中PMCH之日mRNA表現概況異常(圖40)，其顯示光照時間與黑暗時間之間的極小的表現變化，而野生型同窩仔畜中PMCH之表現在光照時間期間顯著增加。不受理論限制，NMN運輸蛋白缺乏整體影響下視丘功能。未偵測出在Slc12a8KO小鼠之其他下視丘核中編碼主要神經肽及其受體之基因表現異常(未圖示)。不受理論限制，此等發現揭示Slc12a8 NMN運輸蛋白質新穎功能，其調節腸與下視丘之間的適當組織間通訊，可能係透過NMN本身及GLP-2。 實例18
此實例說明小腸中之NAD+及Slc12a8濃度。
已充分說明NAD+含量在多個組織中隨著年齡而降低(Yoshino, J.等人, Cell Metab., 2018, 27：513-528, 2018)。測量在黑暗時間(下午9-10點)期間收集之2月齡(2 mo)及24月齡(24 mo)雌性B6小鼠之空腸及回腸中之NAD+水準。空腸及回腸中NAD+含量隨著年齡而降低，但是空腸中之此差異並未達到統計學顯著性(圖43；(各年齡為n=4只小鼠，藉由未配對t檢定分析))。測量2月齡(2 mo)及24月齡(24 mo)雌性B6小鼠之空腸及回腸中之Slc12a8 mRNA表現，且係在黑暗時間(下午9-10點)期間收集(各年齡為n=4只小鼠，藉由未配對t檢定分析)。與觀察到之NAD+降低一致，大齡回腸中之Slc12a8表現顯著上調(圖44)。此等結果說明，腸中Slc12a8上調與降低之NAD+有關。 實例19
此實例說明小鼠中Slc12a8腸敲落對葡萄糖代謝之效應。
發明人向2月齡及24月齡小鼠口服管飼攜帶對照螢火蟲螢光素酶(fLuc) shRNA及Slc12a8 shRNA之慢病毒且檢查其攝食的習慣。在光照時間(上午9點至下午6點)及黑暗時間(下午6點至上午9點)期間測量2月齡或24月齡腸Slc12a8敲落雌性B6小鼠(shSlc12a8)及對照小鼠(shfLuc)之食物攝入達4天。有趣的是，腸特異性Slc12a8敲落導致大齡小鼠在黑暗時間期間食物攝入顯著減少，而在年輕小鼠中其並不影響食物攝入(圖45；(2月齡腸Slc12a8敲落及對照雌性B6小鼠各為n=6只小鼠，且24月齡腸Slc12a8敲落及對照雌性B6小鼠各為n=9只小鼠；藉由ANOVA用塔基氏檢定分析)。禁食24 h之後測量2月齡(2 mo)或24月齡(24 mo)腸Slc12a8敲落雌性B6小鼠(shSlc12a8)及對照小鼠(shfLuc)之禁食葡萄糖水準(圖46；2月齡腸Slc12a8敲落及對照雌性B6小鼠各為n=6只小鼠，且24月齡腸Slc12a8敲落及對照雌性B6小鼠各為n=9只小鼠；藉由未配對t檢定分析)。因此，Slc12a8敲落亦降低大齡小鼠之禁食葡萄糖水準，但不降低年輕小鼠之禁食葡萄糖水準(圖46)。不受理論限制，此等結果說明，Slc12a8表現影響腸中之NAD+產生。 實例20
此實例說明，腸特異性Slc12a8敲落顯著增加血液中升糖素樣肽-1(GLP-1)之循環水準。
GLP-1為腸道內分泌L細胞所產生之升糖素原衍生之食慾減退肽。禁食24 h之後再餵食6 h(上午10點至下午4點)之後藉由ELISA測量2月齡或24月齡腸Slc12a8敲落雌性B6小鼠(shSlc12a8)及對照小鼠(shfLuc)之血漿GLP-1水準。Slc12a8敲落在大齡小鼠中回應於禁食24 h之後再餵食6 h而增加GLP-1循環水準，但不增加年輕小鼠之GLP-1循環水準(圖47；2月齡腸Slc12a8敲落及對照雌性B6小鼠各為n=6只小鼠，且24月齡腸Slc12a8敲落及對照雌性B6小鼠各為n=9只小鼠；藉由未配對t檢定分析)。不受理論限制，此等結果說明GLP-1分泌受Slc12a8活性影響。 實例21
此實例說明Slc12a8敲落對大齡回腸之效應。
熟知產生GLP之L細胞富集於回腸中(Yoon, M. J.等人, Cell Metab., 2015, 21, 706-717)。因此檢查回腸中之Slc12a8及GAPDH表現。對2月齡(圖48)或24月齡(圖49)腸Slc12a8敲落雌性B6小鼠(shSlc12a8)及對照小鼠(shfLuc)之回腸溶解產物中之Slc12a8及GAPDH進行西方墨點法。圖48-49繪示代表性西方墨點(左圖)，且對應條形圖顯示回腸中正規化成GAPDH蛋白水準之Slc12a8蛋白水準(右圖)。使用針對Slc12a8之N端結構域之前17個胺基酸之抗血清(2月齡腸Slc12a8敲落及對照小鼠各為n=6，且24月齡腸Slc12a8敲落及對照小鼠各為n=4-5；藉由未配對t檢定分析)。儘管Slc12a8蛋白水準在年輕及大齡Slc12a8敲落小鼠之回腸中顯著降低(圖48-49)，但僅大齡Slc12a8敲落回腸顯示NAD+水準之顯著降低(圖50)，確認Slc12a8上調在維持大齡回腸中之NAD+穩態中之生理學意義。圖50繪示2月齡或24月齡腸Slc12a8敲落(ShSlc12a8)及對照雌性B6小鼠(ShfLuc)之回腸中之NAD+水準(2月齡腸Slc12a8敲落及對照雌性B6小鼠各為n=6只小鼠，且24月齡腸Slc12a8敲落及對照雌性B6小鼠各為n=9只小鼠；藉由未配對t檢定分析)。不受理論限制，此等結果說明Slc12a8上調為維持大齡回腸中之NAD+穩態所需。 實例22
此實例說明Slc12a8敲落對培養之回腸中之GLP-1水準之效應。
發明人亦離體培養大齡fLuc對照及Slc12a8敲落小鼠之回腸。藉由ELISA測量在37℃下培養2 h之來自24月齡腸Slc12a8敲落雌性B6小鼠(shSlc12a8)及對照小鼠(shfLuc)之離體回腸外植體之上清液中之GLP-1水準(n=4只小鼠，使用未配對t檢定分析)。圖51說明與大齡fLuc對照回腸相比，大齡Slc12a8敲落回腸分泌3倍高水準的GLP-1。大齡fLuc對照及Slc12a8敲落小鼠之離體培養之結腸顯示GLP-1分泌無差異。藉由ELISA測量在37℃下培養2 h之12月齡Slc12a8KO雌性小鼠(Slc12a8KO)及對照野生型同窩仔畜(WT)之離體回腸外植體之上清液中之GLP-1水準(n=4只小鼠；使用未配對t檢定分析)。亦測量12月齡Slc12a8KO雌性小鼠(Slc12a8KO)及對照野生型同窩仔畜(WT)之此等回腸樣品中之NAD+水準(WT為n=3只小鼠，且Slc12a8KO為n=4只小鼠；藉由未配對t檢定分析)。所有值呈現為平均值±SEM。*p＜0.05，**p＜0.01。圖52繪示12月齡對照及Slc12a8KO小鼠之離體培養之回腸中增加之GLP-1分泌及減少之NAD+。不受理論限制，此等實例說明Slc12a8為大齡小鼠之腸中減少之NAD+之原因。 實例23
此實例說明SIRT1及SIRT6抑制劑對離體培養之回腸之效應。
檢查SIRT1(Yoon, M. J.等人, Cell Metab., 2015 21, 706-717)及SIRT6(Jiang, H.等人, Nature, 2013, 496, 110-113)在觀察到之GLP-1分泌增加中之參與。用SIRT1及SIRT6抑制劑處理離體培養之野生型回腸。藉由ELISA測量來自用0.2% DMSO、20 µM EX527、或20 µM STK665401培養4 h之24月齡雌性B6小鼠之離體回腸外植體之上清液中之GLP-1水準(n=3只小鼠，使用ANOVA用塔基氏檢定分析)。僅EX527(有效的SIRT1特異性抑制劑)而非STK665401(SIRT6特異性抑制劑)能夠增加回腸之GLP-1分泌(圖53)。不受理論限制，此等結果說明大齡Slc12a8敲落回腸中降低之SIRT1活性(由於顯著的NAD+ 減少)可能涉及觀察到之GLP-1分泌增加。
當引入本發明或者一或多個其較佳實施例之要素時，冠詞「一個」、「一種」、及「該(the/said)」意欲意謂存在一或多個要素。術語「包含」、「包括」、及「具有」意欲具有包括性且意謂可能存在除所列要素以外之額外要素。
綜上所述，應看到已達成本發明之若干目標且獲得其他有利結果。
因為在不脫離本發明之範疇的情況下，可對以上產物及方法做出各種改變，所以意欲將以上描述所含有的且在隨附圖式中所展示的所有事物解釋為說明性的且不具有限制意義。
圖1為用FK866處理之初代肝細胞、胰島、及海馬神經球中通常上調之基因之汾恩圖。
圖2繪示來自3月齡B6雄性小鼠之不同組織之Slc12a8 mRNA表現。
圖3繪示用0.1% DMSO、單獨FK866、或FK866加NMN處理之初代小鼠肝細胞、NIH3T3纖維母細胞、及空腸與回腸之離體外植體中之Slc12a8 mRNA表現變化。
圖4繪示用DMSO、單獨FK866、及FK866加NMN處理之初代小鼠肝細胞及NIH3T3纖維母細胞中之細胞內NAD+含量。
圖5繪示在用FK866及FK866加NMN處理48 h之NIH3T3細胞中所測量之表面及細胞內Slc12a8蛋白表現水準之流動式細胞測量術數據。
圖6繪示用以下詳述之NMN途徑抑制劑處理之初代小鼠肝細胞中外源性NMN攝取之時程。
圖7繪示初代小鼠肝細胞中Slc12a8及Nrk1 mRNA靜默之敲落效率。
圖8繪示如藉由HPLC所測量之經歷Slc12a8及Nrk1 mRNA靜默之細胞之細胞內NMN含量。
圖9繪示藉由對照及Slc12a8-OE NIH3T3細胞之質膜級分之SDS-PAGE揭示之Slc12a8蛋白表現。
圖10繪示對照及Slc12a8-OE NIH3T3細胞之正規化成窖蛋白-1蛋白水準之Slc12a8蛋白水準。
圖11繪示Slc12a8過表現及對照NIH3T3細胞中3 H-NMN之細胞內攝取。
圖12藉由對針對細胞內3 H-NMN攝取之細胞外NMN作圖繪示米開勒斯-曼登動力學(Michaelis-Menten kinetics)之計算。
圖13繪示衍生自Slc12a8-OE細胞或對照細胞之蛋白脂質體之3 H-NMN攝取。
圖14繪示為確定Slc12a8之受質特異性的3 H-NMN之用冷NAD+ 相關化合物之置換。
圖15繪示使用蛋白脂質體系統之NMN及NR之IC50 之確定。
圖16繪示用Li+ 置換Na+ 對蛋白脂質體之3 H-NMN攝取之效應。
圖17繪示螢火蟲螢光素酶(fLuc) shRNA及Slc12a8 shRNA感染之小鼠空腸及回腸組織樣品之代表性西方墨點。
圖18繪示螢火蟲螢光素酶(fLuc) shRNA及Slc12a8 shRNA感染之小鼠空腸及回腸組織之條形圖，其中表現水準已正規化成GAPDH。
圖19繪示對照小鼠及Slc12a8敲落小鼠在口服管飼NMN之後60 min內藉由HPLC測量之小鼠體內血漿NMN水準。
圖20繪示對照小鼠及Slc12a8敲落小鼠在口服管飼NMN之後60 min內藉由HPLC測量之小鼠體內血漿菸鹼醯胺水準。
圖21繪示對照小鼠對Slc12a8敲落小鼠中經由口服管飼投與NMN之後60分鐘收集之空腸組織樣品中之NAD濃度。
圖22繪示對照小鼠對Slc12a8剔除小鼠中各種組織中之Slc12a8 mRNA表現。
圖23經由西方墨點繪示Slc12a8剔除小鼠之十二指腸、空腸、回腸、及胰臟中不存在Slc12a8蛋白。
圖24經由西方墨點繪示Slc12a8剔除小鼠之下視丘中不存在Slc12a8蛋白。
圖25A-B繪示在一天之光照及黑暗時間期間收集自Slc12a8剔除小鼠之各種組織樣品中之NAD+水準。
圖26繪示SLc12a8剔除小鼠及其野生型同窩仔畜中藉由管飼投與之後18 O-D-NMN之攝取。
圖27繪示Slc12a8剔除小鼠與其野生型同窩仔畜相比之食物攝入。
圖28繪示Slc12a8剔除小鼠與其野生型同窩仔畜相比之脂肪對精肉質量百分比。
圖29繪示Slc12a8剔除小鼠與其野生型同窩仔畜相比之糞便脂質含量。
圖30繪示Slc12a8剔除小鼠與其野生型同窩仔畜相比之氧消耗。
圖31繪示Slc12a8剔除小鼠與其野生型同窩仔畜相比之能量消耗。
圖32繪示Slc12a8剔除小鼠與其野生型同窩仔畜相比之走動計數。
圖33繪示Slc12a8剔除小鼠與其野生型同窩仔畜相比之較低的呼吸交換率。
圖34繪示Slc12a8剔除小鼠與其野生型同窩仔畜相比之葡萄糖水準。
圖35繪示Slc12a8剔除小鼠與其野生型同窩仔畜相比之胰島素水準。
圖36繪示Slc12a8剔除小鼠與其野生型同窩仔畜相比之三酸甘油酯水準。
圖37繪示Slc12a8剔除小鼠與其野生型同窩仔畜相比之在禁食及再餵食條件下之GLP-2血漿水準。
圖38繪示Slc12a8剔除小鼠與其野生型同窩仔畜相比之弓狀核中Chop及Socs3之相對mRNA表現。
圖39繪示隨意餵食之Slc12a8剔除小鼠與其野生型同窩仔畜相比之肝臟中之Pepck及G6pc表現。
圖40繪示Slc12a8剔除小鼠與其野生型同窩仔畜相比之PMCH mRNA表現。
圖41繪示具有或不具有Slc12a8過表現構築體之NIH3T3細胞中NAD+ 生物合成之抑制劑之效應。
圖42繪示藉由菸鹼酸(NA)之向含Slc12a8之蛋白脂質體中之3 H標記之NMN(3 H-NMN)攝取之增強。
圖43繪示24月齡小鼠相對於2月齡小鼠之空腸及回腸中降低之NAD+ 水準。
圖44繪示2月齡及24月齡小鼠之空腸及回腸中之Slc12a8表現。
圖45繪示2月齡及24月齡腸Slc12a8敲落小鼠中之4天的食物攝入。
圖46繪示在腸中具有或不具有Slc12a8敲落之2月齡及24月齡小鼠之禁食葡萄糖水準。
圖47繪示Slc12a8小鼠及對照小鼠中禁食24小時之後再餵食對GLP-1水準之效應。
圖48繪示2月齡腸Slc12a8敲落小鼠及對照小鼠之回腸溶解產物中Slc12a8及GAPDH之西方墨點法。
圖49繪示24月齡腸Slc12a8敲落小鼠及對照小鼠之回腸溶解產物中Slc12a8及GAPDH之西方墨點法。
圖50繪示2月齡或24月齡腸Slc12a8敲落小鼠及對照小鼠之回腸中之NAD+水準。
圖51繪示24月齡腸Slc12a8敲落小鼠及對照小鼠之離體外植體之上清液中之GLP-1水準之ELISA。
圖52繪示12月齡Slc12a8剔除小鼠及對照小鼠之外植體中之GLP-1水準(左)及樣品中之NAD+水準(右)。
圖53繪示用SIRT家族抑制劑處理之外植體或對照中之GLP-1水準。

Claims (91)

  1. 一種治療有需要之受試者之年齡相關病況之方法，其包含向該受試者投與治療有效量的菸鹼醯胺單核苷酸(NMN)及至少一種選自由菸鹼酸、戊四菸酯、菸鹼酸生育酚酯、β-吡啶甲醇、六菸鹼酸肌醇、其任何酯、其任何醫藥上可接受之鹽、及其任何組合組成之群之額外化合物，且其中該年齡相關病況包含至少一種選自由胰島素敏感性缺乏、胰島素分泌缺乏、胰島素作用及分泌缺乏、記憶功能障礙、眼功能衰退、視網膜變性、功能衰退、及其任何組合組成之群之病況。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該年齡相關病況包含胰島素敏感性缺乏。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該年齡相關病況包含胰島素分泌缺乏。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法，其中該年齡相關病況包含胰島素作用及分泌缺乏。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之方法，其中該年齡相關病況包含記憶功能障礙。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之方法，其中該年齡相關病況包含眼功能衰退。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之方法，其中該年齡相關病況包含視網膜變性。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中該年齡相關病況包含功能衰退。
  9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該功能衰退係選自由以下所組成之群：食欲缺乏、低葡萄糖水準、肌肉無力、營養不良、老年厭食症、及其任何組合。
  10. 一種治療有需要之受試者之醫學病況之方法，其包含向該受試者投與治療有效量的菸鹼醯胺單核苷酸(NMN)及至少一種選自由菸鹼酸、戊四菸酯、菸鹼酸生育酚酯、β-吡啶甲醇、六菸鹼酸肌醇、其任何酯、其任何醫藥上可接受之鹽、及其任何組合組成之群之化合物，其中該醫學病況包含選自由肌病、第二型糖尿病、肥胖、及其任何組合組成之群之至少一者。
  11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該醫學病況包含肌病。
  12. 如申請專利範圍第10項或第11項之方法，其中該肌病係選自由以下組成之群：肌肉衰弱、肌肉萎縮、肌肉消瘦、肌肉強度降低、及其任何組合。
  13. 如申請專利範圍第10項至第12項中任一項之方法，其中該肌病係選自由以下組成之群：肌少症、力弱症、惡病質、肌肉失養症、肌強直症、脊髓性肌肉萎縮、肌病變、及其任何組合。
  14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該肌肉失養症係選自由以下組成之群：裘馨氏肌肉失養症、貝克氏肌肉失養症、先天性肌肉失養症、遠端肌肉失養症、艾梅氏肌肉失養症、顏面肩胛肱骨型肌肉失養症、肢帶型肌肉失養症、眼咽肌肉失養症、及其任何組合。
  15. 如申請專利範圍第13項或第14項之方法，其中該肌強直症係選自由以下組成之群：肌強直性失養症、先天性肌強直、先天性副肌強直、及其任何組合。
  16. 如申請專利範圍第13項至第15項中任一項之方法，其中該肌病變係選自由以下組成之群：貝斯蘭氏肌病變、先天性纖維類型不均衡、進行性肌肉骨化症、甲狀腺功能亢進性肌病變、甲狀腺功能低下性肌病變、微軸空肌病變、多軸空肌病變、肌小管肌病變、桿狀體肌病變、週期性麻痹、低血鉀性肌病變、高血鉀性肌病變、及其任何組合。
  17. 如申請專利範圍第10項至第16項中任一項之方法，其中該肌病係選自由以下組成之群：酸性麥芽糖酶缺乏、肉鹼缺乏、肉鹼棕櫚醯基轉移酶缺乏、去支酶缺乏、乳酸去氫酶缺乏、粒線體肌病變、肌腺苷酸去胺基酶缺乏、磷酸化酶缺乏、磷酸果糖激酶缺乏、磷酸甘油酯激酶缺乏、及其任何組合。
  18. 如申請專利範圍第10項至第17項中任一項之方法，其中該肌病係選自由以下組成之群：肌少症、力弱症、惡病質、及其任何組合。
  19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該肌病為肌少症。
  20. 如申請專利範圍第10項至第19項中任一項之方法，其中該醫學病況包含第二型糖尿病。
  21. 如申請專利範圍第10項至第20項中任一項之方法，其中該醫學病況包含肥胖。
  22. 如申請專利範圍第1項至第21項中任一項之方法，其中該至少一種額外化合物包含菸鹼酸、其任何酯、或其任何醫藥上可接受之鹽。
  23. 如申請專利範圍第1項至第22項中任一項之方法，其中該菸鹼酸之酯或醫藥上可接受之鹽為結構(I)之化合物其中R係選自由以下組成之群：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、正己基、正辛基、2-氯乙基、2-羥乙基、3-羥丙基、2-甲氧基乙基、2-丁氧基乙基、胺甲醯基甲基、l-胺甲醯基乙基、2-二甲基胺乙基、3-胺丙基、四氫呋喃基、苯甲基、苯氧基乙基、對氯苯基、及對硝基苯基。
  24. 如申請專利範圍第23項之方法，其中R係選自由2-二甲基胺乙基、對氯苯基、及對硝基苯基組成之群。
  25. 如申請專利範圍第1項至第24項中任一項之方法，其中每天向該受試者投與約50 mg至約500 mg的該至少一種額外化合物。
  26. 如申請專利範圍第1項至第25項中任一項之方法，其中每天向該受試者投與約10至約500 mg的NMN。
  27. 如申請專利範圍第1項至第26項中任一項之方法，其中該受試者經投與包含NMN及該至少一種額外化合物之醫藥組成物。
  28. 一種增強有需要之受試者之NMN之細胞攝取之方法，其包含向該受試者投與治療有效量的選自由以下組成之群之化合物：菸鹼酸、戊四菸酯、菸鹼酸生育酚酯、β-吡啶甲醇、六菸鹼酸肌醇、其任何酯、其任何醫藥上可接受之鹽、及其任何組合。
  29. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該化合物包含菸鹼酸、其酯、或其醫藥上可接受之鹽。
  30. 如申請專利範圍第28項或第29項之方法，其中該菸鹼酸之酯或醫藥上可接受之鹽為結構(I)之化合物其中R係選自由以下組成之群：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、正己基、正辛基、2-氯乙基、2-羥乙基、3-羥丙基、2-甲氧基乙基、2-丁氧基乙基、胺甲醯基甲基、l-胺甲醯基乙基、2-二甲基胺乙基、3-胺丙基、四氫呋喃基、苯甲基、苯氧基乙基、對氯苯基、及對硝基苯基。
  31. 如申請專利範圍第30項之方法，其中R係選自由2-二甲基胺乙基、對氯苯基、及對硝基苯基組成之群。
  32. 如申請專利範圍第28項至第31項中任一項之方法，其中每天向該受試者投與約50 mg至約500 mg的該化合物。
  33. 一種用於在有需要之受試者中刺激NAD+產生及/或增加向細胞中之NMN攝取之方法，其包含向該受試者投與治療有效量的編碼Slc12a8之核酸。
  34. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該編碼Slc12a8之核酸包含編碼Slc12a8之cDNA。
  35. 如申請專利範圍第33項或第34項之方法，其中投與該編碼Slc12a8之核酸包含投與編碼Slc12a8之基因療法載體。
  36. 如申請專利範圍第33項至第35項中任一項之方法，其中該基因療法載體包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、α病毒、皰疹病毒、痘瘡病毒、或其任何組合。
  37. 如申請專利範圍第36項之方法，其中該基因療法載體包含反轉錄病毒，且該反轉錄病毒包含慢病毒。
  38. 如申請專利範圍第34項至第37項中任一項之方法，其中該編碼Slc12a8之cDNA包含具有與GenBank參考序列: NM_134251 (SEQ ID NO: 1)至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%序列一致性之序列。
  39. 如申請專利範圍第33項至第38項中任一項之方法，其包含向該受試者之胃腸道投與該編碼Slc12a8之核酸。
  40. 如申請專利範圍第39項之方法，其包含向該受試者之小腸投與該編碼Slc12a8之核酸。
  41. 如申請專利範圍第33項至第40項中任一項之方法，其中該受試者需要治療肌病、第二型糖尿病、肥胖、年齡相關病況、或其任何組合。
  42. 如申請專利範圍第41項之方法，其中該年齡相關病況係選自由以下組成之群：胰島素敏感性缺乏、胰島素分泌缺乏、胰島素作用及分泌缺乏、記憶功能障礙、眼功能衰退、視網膜變性、功能衰退、肥胖、及其任何組合。
  43. 如申請專利範圍第42項之方法，其中該年齡相關病況包含年齡相關肥胖。
  44. 如申請專利範圍第1項至第43項中任一項之方法，其中該受試者為哺乳動物。
  45. 如申請專利範圍第1項至第44項中任一項之方法，其中該受試者為小鼠或大鼠。
  46. 如申請專利範圍第1項至第45項中任一項之方法，其中該受試者為人類。
  47. 如申請專利範圍第46項之方法，其中該人類為至少30歲、至少40歲、至少50歲、至少60歲、或至少70歲。
  48. 一種包含編碼Slc12a8之核酸之基因療法載體。
  49. 如申請專利範圍第48項之基因療法載體，其中該編碼Slc12a8之核酸包含編碼Slc12a8之cDNA。
  50. 如申請專利範圍第48項或第49項之基因療法載體，其中該載體包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、α病毒、皰疹病毒、痘瘡病毒、或其任何組合。
  51. 如申請專利範圍第50項之基因療法載體，其中該基因療法載體包含反轉錄病毒，且該反轉錄病毒包含慢病毒。
  52. 如申請專利範圍第49項至第51項中任一項之基因療法載體，其中該編碼Slc12a8之cDNA包含具有與GenBank參考序列: NM_134251 (SEQ ID NO: 1)至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%序列一致性之序列。
  53. 一種包含Slc12a8基因之不活化突變之非人類動物。
  54. 如申請專利範圍第53項之非人類動物，其中該非人類動物包含小鼠或大鼠。
  55. 如申請專利範圍第53項或第54項之非人類動物，其中該Slc12a8基因之該不活化突變包含該Slc12a8基因之缺失、該Slc12a8基因之插入、或其組合。
  56. 如申請專利範圍第55項之非人類動物，其中該Slc12a8基因之該不活化突變包含Slc12a8基因之缺失。
  57. 如申請專利範圍第56項之非人類動物，其中該缺失包含該Slc12a8基因之外顯子4或其一部分之缺失。
  58. 如申請專利範圍第57項之非人類動物，其中該缺失包含外顯子4之缺失。
  59. 一種包含編碼Slc12a8蛋白之cDNA之哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株，其中該cDNA包含： 　　(a) 編碼SEQ ID NO: 12 (小鼠Slc12a8蛋白)、SEQ ID NO: 13 (小鼠Scl12a8變異體A蛋白)、SEQ ID NO: 14 (小鼠Scl12a8變異體B蛋白)、或SEQ ID NO: 15 (人類Slc12a8蛋白)之cDNA； 　　(b) 編碼具有與SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、或SEQ ID NO: 15至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%一致性之蛋白之cDNA；或 　　(c) 具有與GenBank參考序列: NM_134251 (SEQ ID NO: 1)或Slc12a8人類全長cDNA (SEQ ID NO: 11)至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或100%序列一致性之cDNA序列。
  60. 如申請專利範圍第59項之哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株，其中該哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株不包含胎盤衍生細胞。
  61. 一種包含編碼Slc12a8蛋白之cDNA之哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株，其中該哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株不包含胎盤衍生細胞。
  62. 如申請專利範圍第61項之哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株，其中該cDNA編碼小鼠Slc12a8蛋白或其變異體或者人類Slc12a8蛋白或其變異體。
  63. 如申請專利範圍第59項至第62項中任一項之哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株，其中該cDNA包含編碼SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14、或SEQ ID NO. 15之cDNA。
  64. 如申請專利範圍第59項至第63項中任一項之哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株，其進一步包含連接該cDNA之啟動子。
  65. 如申請專利範圍第59項至第64項中任一項之哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株，其中與不包含該cDNA之相同哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株中之該Slc12a8蛋白之表現相比，該Slc12a8蛋白之表現增加。
  66. 如申請專利範圍第59項至第65項中任一項之哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株，其中該哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株缺乏可偵測之CD73活性，缺乏可偵測之CD38活性，或缺乏可偵測之CD73活性及可偵測之CD38活性兩者。
  67. 如申請專利範圍第59項至第66項中任一項之哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株，其中該哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株表現出增加之NMN攝取。
  68. 如申請專利範圍第59項至第67項中任一項之哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株，其中該哺乳動物細胞包含纖維母細胞、腸細胞、胰臟細胞、肝細胞、脂肪細胞、神經元、或神經膠細胞，或其中該哺乳動物細胞株包含纖維母細胞、腸細胞、胰臟細胞、肝細胞、脂肪細胞、神經元、或神經膠細胞。
  69. 如申請專利範圍第59項至第68項中任一項之哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株，其中該哺乳動物細胞為NIH 3T3細胞或其中該哺乳動物細胞株為NIH 3T3細胞株。
  70. 如申請專利範圍第59項至第69項中任一項之哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株，其中該哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株經該cDNA序列穩定轉型。
  71. 如申請專利範圍第59項至第70項中任一項之哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株，其中該哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株經該cDNA序列短暫轉染。
  72. 如申請專利範圍第59項至第71項中任一項之哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株，其中該cDNA序列具有與GenBank參考序列: NM_134251 (SEQ ID NO: 1)至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或100%序列一致性。
  73. 如申請專利範圍第59項至第72項中任一項之哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株，其中該哺乳動物細胞為小鼠或大鼠細胞或其中該哺乳動物細胞株為小鼠細胞株或大鼠細胞株。
  74. 如申請專利範圍第59項至第72項中任一項之哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株，其中該哺乳動物細胞為人類細胞或其中該哺乳動物細胞株為人類細胞株。
  75. 一種用於篩選出識別促進NMN運輸之化合物之候選化合物之方法，該方法包含： 　　(a) 使該候選化合物與表現NMN運輸蛋白之細胞或包含NMN運輸蛋白之蛋白脂質體接觸；且 　　(b) 偵測該細胞中該NMN運輸蛋白之表現或活性變化或該蛋白脂質體中該NMN運輸蛋白之活性變化； 　　其中與該候選化合物接觸之後該細胞中該NMN運輸蛋白之表現或活性變化或該蛋白脂質體中該NMN運輸蛋白之活性變化指示該候選化合物調節NMN之運輸。
  76. 如申請專利範圍第75項之方法，其中該NMN運輸蛋白包含Slc12a8蛋白。
  77. 如申請專利範圍第76項之方法，其中該Slc12a8蛋白包含具有與SEQ ID NO: 12 (小鼠Slc12a8蛋白)、SEQ ID NO: 13 (小鼠Scl12a8變異體A蛋白)、SEQ ID NO: 14 (小鼠Scl12a8變異體B蛋白)、或SEQ ID NO: 15 (人類Slc12a8蛋白)至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或至少100%序列一致性之胺基酸序列。
  78. 如申請專利範圍第75項至第77項中任一項之方法，其進一步包含比較： 　　(i) 與該候選化合物接觸之後，表現該NMN運輸蛋白之該細胞中該NMN運輸蛋白之表現或活性；與 　　(ii) 與該候選化合物接觸之後，不表現該NMN運輸蛋白之細胞或其中該NMN運輸蛋白之表現或活性已抑制之細胞中該NMN運輸蛋白之表現或活性。
  79. 如申請專利範圍第78項之方法，其中該不表現該NMN運輸蛋白之細胞包含Slc12a8剔除動物之細胞。
  80. 如申請專利範圍第75項至第77項中任一項之方法，其進一步包含比較： 　　(i) 與該候選化合物接觸之後，包含該NMN運輸蛋白之該蛋白脂質體中該NMN運輸蛋白之活性；與 　　(ii) 與該候選化合物接觸之後，不包含該NMN運輸蛋白之蛋白脂質體或其中該NMN運輸蛋白之活性已抑制之蛋白脂質體中該NMN運輸蛋白之活性。
  81. 如申請專利範圍第80項之方法，其中該不包含該NMN運輸蛋白之蛋白脂質體包含衍生自Slc12a8剔除動物之細胞之蛋白脂質體。
  82. 如申請專利範圍第75項至第81項中任一項之方法，其中該細胞包含哺乳動物纖維母細胞、腸細胞、胰臟細胞、肝細胞、脂肪細胞、神經元、或神經膠細胞，或其中該蛋白脂質體包含衍生自哺乳動物纖維母細胞、腸細胞、胰臟細胞、肝細胞、脂肪細胞、神經元、或神經膠細胞之蛋白脂質體。
  83. 如申請專利範圍第75項至第82項中任一項之方法，其中該細胞包含如申請專利範圍第59項至第74項中任一項之哺乳動物細胞，或其中該蛋白脂質體包含衍生自如申請專利範圍第59項至第74項中任一項之哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株之蛋白脂質體。
  84. 如申請專利範圍第75項至第83項中任一項之方法，其中該蛋白脂質體包含衍生自包含Slc12a8 cDNA之哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株之蛋白脂質體。
  85. 一種醫藥組成物，其包含NMN及NMN運輸蛋白促效劑。
  86. 如申請專利範圍第85項之醫藥組成物，其中該NMN運輸蛋白促效劑包含選自由以下組成之群之化合物：菸鹼酸、戊四菸酯、菸鹼酸生育酚酯、β-吡啶甲醇、六菸鹼酸肌醇、其酯、其醫藥上可接受之鹽、及其組合。
  87. 如申請專利範圍第85項或第86項之醫藥組成物，其中該NMN運輸蛋白包含菸鹼酸、其任何酯、或其任何醫藥上可接受之鹽。
  88. 如申請專利範圍第87項之醫藥組成物，其中該菸鹼酸之酯或醫藥上可接受之鹽為結構(I)之化合物其中R係選自由以下組成之群：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、正己基、正辛基、2-氯乙基、2-羥乙基、3-羥丙基、2-甲氧基乙基、2-丁氧基乙基、胺甲醯基甲基、l-胺甲醯基乙基、2-二甲基胺乙基、3-胺丙基、四氫呋喃基、苯甲基、苯氧基乙基、對氯苯基、及對硝基苯基。
  89. 如申請專利範圍第88項之醫藥組成物，其中R係選自由2-二甲基胺乙基、對氯苯基、及對硝基苯基組成之群。
  90. 如申請專利範圍第85項至第89項中任一項之醫藥組成物，其中該NMN運輸蛋白為Slc12a8多肽或其同源物。
  91. 一種醫藥組成物，其包含NMN及Slc12a8或其同源物之基因表現之誘導劑。
TW107128071A 2017-08-10 2018-08-10 使用菸鹼醯胺單核苷酸之組成物及治療方法 TW201919647A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762543856P 2017-08-10 2017-08-10
US62/543,856 2017-08-10
US201862653348P 2018-04-05 2018-04-05
US62/653,348 2018-04-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201919647A true TW201919647A (zh) 2019-06-01

Family

ID=65272822

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW107128071A TW201919647A (zh) 2017-08-10 2018-08-10 使用菸鹼醯胺單核苷酸之組成物及治療方法

Country Status (8)

Country Link
US (2) US11564936B2 (zh)
EP (1) EP3664813A4 (zh)
JP (2) JP2020530460A (zh)
KR (1) KR20200041330A (zh)
CN (1) CN110996967A (zh)
CA (1) CA3071423A1 (zh)
TW (1) TW201919647A (zh)
WO (1) WO2019032973A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112156105A (zh) * 2020-10-15 2021-01-01 天津科技大学 一种抑制剂联合小干扰rna抑制结肠癌细胞活性的新方法
CN113577091B (zh) * 2021-08-30 2023-10-13 厦门金达威集团股份有限公司 抗衰老药物组合及其用途
CN114480461B (zh) * 2022-02-21 2023-03-10 苏州华赛生物工程技术有限公司 生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物及构建方法和应用
CN114470213A (zh) * 2022-03-29 2022-05-13 重庆医科大学 Nampt抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗组织缺血再灌注损伤中的药物中的应用
CN116042724A (zh) * 2022-12-28 2023-05-02 天津科技大学 一种通过干扰Slc12a8导致NAD+/NADH水平降低建立衰老细胞模型

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007521791A (ja) 2003-04-01 2007-08-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
AU2003224132A1 (en) 2003-04-24 2004-11-19 Galapagos Genomics N.V. Effective sirna knock-down constructs
WO2005005601A2 (en) 2003-06-09 2005-01-20 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
JP2008501343A (ja) * 2004-06-04 2008-01-24 ワシントン・ユニバーシティ 神経障害を治療するための方法および組成物
AU2005299672A1 (en) 2004-10-22 2006-05-04 Benitec, Inc. Therapeutic RNAi agents for treating psoriasis
WO2008130568A1 (en) 2007-04-16 2008-10-30 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
EP2924112A1 (en) 2009-02-02 2015-09-30 Chromocell Corporation Novel cell lines and methods
US20110145936A1 (en) 2009-07-30 2011-06-16 Ostertag Eric M Genetically Modified Rat Models for Pharmacokinetics
EP2684055A1 (en) 2011-03-09 2014-01-15 Bayer Intellectual Property GmbH Modulators of slc22a7
MX357749B (es) 2011-06-01 2018-07-23 Anthrogenesis Corp Tratamiento contra el dolor utilizando células madre placentarias.
US9877981B2 (en) 2012-10-09 2018-01-30 President And Fellows Of Harvard College NAD biosynthesis and precursors for the treatment and prevention of cancer and proliferation
EP2968306B1 (en) * 2013-03-15 2023-06-07 Washington University Administration of nicotinamide mononucleotide in the treatment of dry eye
IL299824B2 (en) 2015-10-07 2024-02-01 Huizenga Joel Resetting biological pathways for protection against human aging and repair of resulting degeneration
SG11201803369TA (en) * 2015-10-23 2018-05-30 Jackson Lab Nicotinamide for use in the treatment and prevention of ocular neurodegenerative disorder (e.g. glaucoma)

Also Published As

Publication number Publication date
EP3664813A4 (en) 2021-08-11
US11564936B2 (en) 2023-01-31
CA3071423A1 (en) 2019-02-14
KR20200041330A (ko) 2020-04-21
EP3664813A1 (en) 2020-06-17
WO2019032973A1 (en) 2019-02-14
US20230338407A1 (en) 2023-10-26
CN110996967A (zh) 2020-04-10
JP2023139082A (ja) 2023-10-03
JP2020530460A (ja) 2020-10-22
US20200215087A1 (en) 2020-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW201919647A (zh) 使用菸鹼醯胺單核苷酸之組成物及治療方法
Grozio et al. Slc12a8 is a nicotinamide mononucleotide transporter
Halestrap et al. The monocarboxylate transporter family—role and regulation
Kashihara et al. YAP mediates compensatory cardiac hypertrophy through aerobic glycolysis in response to pressure overload
Yuan et al. Exercise‐induced α‐ketoglutaric acid stimulates muscle hypertrophy and fat loss through OXGR1‐dependent adrenal activation
Qu et al. Targeting iNOS alleviates early brain injury after experimental subarachnoid hemorrhage via promoting ferroptosis of M1 microglia and reducing neuroinflammation
Heitzmann et al. No potassium, no acid: K+ channels and gastric acid secretion
Casellas‐Díaz et al. Mfn2 localization in the ER is necessary for its bioenergetic function and neuritic development
Zhang et al. Downregulation of miR-151-5p contributes to increased susceptibility to arrhythmogenesis during myocardial infarction with estrogen deprivation
Tapryal et al. Catecholamine stress hormones regulate cellular iron homeostasis by a posttranscriptional mechanism mediated by iron regulatory protein: implication in energy homeostasis
US9988626B2 (en) Neurocalcin delta inhibitors and therapeutic and non-therapeutic uses thereof
CA2896688A1 (en) A mg53 mutant, methods of mutation and use thereof
Morales et al. Skeletal muscle type‐specific mitochondrial adaptation to high‐fat diet relies on differential autophagy modulation
Fan et al. Adaptor protein APPL1 coordinates HDAC3 to modulate brown adipose tissue thermogenesis in mice
WO2020032160A1 (ja) 炎症性腸疾患治療薬およびそのスクリーニング方法
Reidling et al. Regulation of the human biotin transporter hSMVT promoter by KLF-4 and AP-2: confirmation of promoter activity in vivo
US20210267939A1 (en) Compositions and methods for treating nafld/nash and related disease phenotypes
Kinney et al. μ-Crystallin in mouse skeletal muscle promotes a shift from glycolytic toward oxidative metabolism
Zeng et al. Adenosine diphosphate ribose cyclase: An important regulator of human pathological and physiological processes
Jones Deorphanizing Monocarboxylate Transporter 6: Evidence of Functional Roles in Lipid Metabolism and Drug Transport
Zhou et al. A small-molecule lycorine derivative reveals Na+/K+-ATPase α3 as an anti-obesity target
Campbell Protein Regulators of Lipid and Energy Metabolism
He et al. Knockdown of PROX1 promotes milk fatty acid synthesis by targeting PPARGC1A in dairy goat mammary gland
Yuan et al. α-ketoglutaric acid stimulates muscle hypertrophy and fat loss through OXGR1-dependent adrenal activation
Lipinski et al. Zinc-chelating BET bromodomain inhibitors equally target islet endocrine cell types