KR20220124196A - 사이클릭 펩티드 수용체 란티오닌 신테타제 c-유사 단백질 (lancl) 및 이의 용도 - Google Patents

사이클릭 펩티드 수용체 란티오닌 신테타제 c-유사 단백질 (lancl) 및 이의 용도 Download PDF

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앤드류 기어링
데이비드 켄리
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레터럴 아이피 피티와이 리미티드
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Abstract

본 개시내용은 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 (LANCL)의 리간드를 스크리닝 및 확인하는 방법, 및 통증을 포함하는 병태의 치료를 위한 확인된 리간드의 용도에 관한 것이다. 또한 본원에는 통증을 포함하는 병태를 치료하는 방법이 개시되며, 상기 방법은 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 1 (LANCL1)에 결합하는 약제의 치료적으로 유효한 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 약제는 인간 성장 호르몬 또는 이의 비-인간 상동체 유래의 펩티드가 아니며, 상기 약제는 LANCL1에의 결합에 대해 서열 번호: 1 (YLRIVQCRSVEGSCGF)을 포함하는 사이클릭 펩티드와 경쟁한다.

Description

사이클릭 펩티드 수용체 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 (LANCL) 및 이의 용도
본 발명은 일반적으로 사이클릭 펩티드 수용체 (cyclic peptide receptor), 및 치료제를 스크리닝 및 확인하기 위한 이의 용도, 및 통증 치료를 포함하는 확인된 치료제의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에 인용된 임의의 특허 또는 특허 출원을 포함하는 모든 참고문헌은 본 발명의 완전한 이해를 가능하게 하기 위해 본원에 참조로 통합된다. 그럼에도 불구하고, 그러한 참고문헌은 이들 문서가 호주 또는 임의의 다른 국가에서 해당 기술에 대한 통상적인 일반적 지식의 일부를 형성하는 것을 인정 (admission)을 구성하는 것으로 해석되어서는 안된다.
통증은 전형적으로 조직 손상 및/또는 근본적인 신경 장애와 관련된 쇠약성 감각 경험 (debilitating sensory experience)일 수 있다. 통증은 급성 또는 만성 여부과 관계없이, 임의의 감지할 수 있는 자극, 상해 또는 기저 질환 없이 발생할 수 있다. 급성 통증은 통상 짧은 기간 (예: 몇 시간 또는 며칠) 동안 지속되며, 전형적으로 근본적인 자극이 중단되면 사라질 것이다. 대조적으로, 만성 통증은 더 오랜 기간 (예: 몇 주 또는 몇 개월) 동안 지속되며, 근본적인 자극이 없이도 지속될 수 있다.
통증의 가장 널리 알려진 2가지 타입에는 통각수용기성 통증 (nociceptive pain) 및 신경병증성 통증 (neuropathic pain)이 있다. 통각수용기성 통증은 기계적 또는 물리적 손상에 반응하는 신체 주변의 통각수용기에 의해 감지되는 감각 신경 섬유의 잠재적으로 유해한 자극의 결과이다. 통각수용기성 통증은 조직 손상을 경고하여 유해한 자극으로부터의 회피를 유발함으로써 보호 생물학적 기능을 제공한다. 통각수용기성 통증은 화상 또는 동상과 같은 열적 손상이나, 또는 열상 또는 압박과 같은 기계적 외상으로 인해 발생할 수 있다.
통각수용기성 통증과 달리, 신경병증성 통증은 말초 또는 중추 신경계의 1차 병변, 기능부전 또는 기능장애로 인해 발생한다. 신경병증성 통증은 보호 효과는 없고, 상해 후 또는 질병 상태의 해소 후 수일 또는 수개월 후에 발병할 수 있으며, 종종 오래 지속되고 만성이다.
신경병증성 통증은 스포츠 상해, 사고, 낙상 또는 관통상과 같은 외상으로 인한 신경 손상으로부터 기인할 수 있거나, 또는 신경 손상은 뇌졸중, 바이러스 감염, 독소 노출, 퇴행성 질환 및 당뇨병과 같은 질병 과정으로부터 기인할 수 있다.
일부 경우에, 통각수용기성 통증 및 신경병증성 통증은 중복될 수 있으며, 이로 인해 일부 상해 또는 질병 상태는 조직 및 신경 모두에 영향을 주어, 통증의 2가지 타입 모두를 유발할 수 있다.
이용 가능한 진통제가 많이 있지만, 진통제의 선택 및 이의 효과는 전형적으로 보고된 통증의 수준, 급성 또는 만성 여부, 통증의 위치 및 타입, 및/또는 잠재적 금기사항에 따라 다르다. WHO (the World Health Organisation)의 진통제 래더 (analgesic ladder)에 따르면, 경미하거나 또는 일시적인 통증 병태는 일반 의약품 (over-the-counter medication) 예컨대 파라세타몰 및 비-스테로이드성 항-염증제 예컨대 아스피린, 이부프로펜 및 나프록센에 반응해야 한다. 중등도 내지 중증, 만성 또는 복합 통증의 치료는 현재 마일드 코데인, 옥시코돈, 메타돈, 모르핀 및 펜타닐을 포함한, 오피오이드-기반 진통제 (opioid-based analgesics)의 사용에 의존하고 있다.
비-오피오이드 진통제, 예컨대 선택적 COX-2 억제제는 심혈관 질환에 대한 허용할 수 없는 관련 위험으로 인해 회피되었다. 의료용 대마초 및 칸나비노이드의 사용은 통증, 구체적으로 만성 통증의 치료에 광범위하게 사용되는 것을 뒷받침하는 증거가 거의 없어 논란의 여지가 있다. 그러므로, 오피오이드 진통제는 여전히 골드 표준 (gold standard)으로 남아 있다. 그러나, 오피오이드 진통제는 진정 및 졸음과 같은 심각한 부작용을 수반하며, 장기간 사용하는 경우에 약물 내약성 및 약물 의존성의 위험이 있다. 따라서, 많은 다른 진통제에서 볼 수 있는 유해 부작용의 일부를 제한하면서, 통증을 치료 또는 예방하는데 효과적인 새로운 대체 옵션에 대한 긴급한 필요성이 남아 있다. 이를 위해, 본 발명자들은 이전에 신경병증성 통증을 포함하는 통증을 치료할 수 있는 사이클릭 펩티드의 부류를 확인하였다. 본 발명자들은 본원에서 처음으로 이러한 사이클릭 펩티드의 분자 표적을 확인하고 특성 규명하여, 신경병증성 통증을 포함하는 통증 치료를 위한 새로운 부류의 치료제의 확인 및 사용을 가능하게 한다. 본 발명자들의 발견은 또한 이전에 본원에 기재된 펩티드로 치료한 병태를 포함하는, 통증 이외의 병태를 치료하기 위한 새로운 부류의 치료제의 확인 및 사용을 가능하게 한다.
발명의 요약
본 발명은 이전에 진통 특성이 부여된 사이클릭 펩티드 분자의 새로운 부류의 분자 표적 (수용체)의 본 발명자들의 확인 및 특성 규명에 적어도 부분적으로 근거한다. 이는 사이클릭 펩티드 분자의 새로운 부류의 분자 표적이 확인되고 특성 규명되어, 통증과 같은 병태를 치료할 수 있는 치료제를 포함하여, 새롭고 개선된 치료제를 확인할 수 있게 한 첫 사례이다.
따라서, 일 양상에서, 본 발명은 대상체에서 통증을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 1 (Lanthionine synthetase C-like protein 1: LANCL1)에 결합하는 약제 (agent)의 치료적으로 유효한 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 약제는 인간 성장 호르몬 또는 이의 비-인간 상동체 (non-human homologue) 유래의 펩티드가 아니며, 상기 약제는 LANCL1에의 결합에 대해 서열 번호: 1 (YLRIVQCRSVEGSCGF)을 포함하는 사이클릭 펩티드와 경쟁한다.
또한, 본원에는 진통제에 대한 스크리닝 방법이 개시되며, 상기 방법은 (a) 서열 번호: 1 (YLRIVQCRSVEGSCGF)을 포함하는 펩티드, 또는 이의 구조적 유사체의 존재하에, 후보 약제 (candidate agent)의 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 (LANCL)에 대한 결합을 허용하는 조건하에, 후보 약제를 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 (LANCL)과 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 후보 약제가 LANCL에 결합하고, LANCL에의 결합에 대해 서열 번호: 1을 포함하는 펩티드 또는 이의 구조적 유사체와 경쟁하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 LANCL에의 결합에 대해 서열 번호: 1을 포함하는 펩티드 또는 이의 구조적 유사체와 경쟁하는 후보 약제의 능력은 상기 후보 약제가 진통제 (analgesic agent)임을 나타낸다.
또한, 본원에는 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 (LANCL)의 리간드에 대한 스크리닝 방법이 개시되며, 상기 방법은 (a) 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드, 또는 이의 구조적 유사체의 존재하에, 후보 약제의 LANCL에 대한 결합을 허용하는 조건하에, 후보 약제를 LANCL과 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 후보 약제가 LANCL에 결합하고, LANCL에의 결합에 대해 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체와 경쟁하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 LANCL에의 결합에 대해 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체와 경쟁하는 후보 약제의 능력은 상기 후보 약제가 LANCL의 리간드임을 나타낸다.
일 구체예에서, 상기 LANCL은 LANCL1, LANCL2 및 LANCL3으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 LANCL은 LANCL1이다.
다른 양상에서, 본원에 개시된 스크리닝 방법에 의해 확인된 진통제를 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 약제는 인간 성장 호르몬 또는 이의 비-인간 상동체 유래의 펩티드가 아니다.
또한, 본원에는 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료하는데 사용하기 위한 조성물이 개시되며, 상기 조성물은 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 1 (LANCL1)에 결합하고, LANCL에의 결합에 대해 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체와 경쟁하는 약제를 포함하며, 상기 약제는 인간 성장 호르몬 또는 이의 비-인간 상동체 유래의 펩티드가 아니다.
본 개시내용은 또한 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료하기 위한 의약 (medicament)의 제조에 있어서, 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 1 (LANCL1)에 결합하고, LANCL1에의 결합에 대해 서열 번호: 1의 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체와 경쟁하는 약제의 용도로 확장되며, 상기 약제는 인간 성장 호르몬 또는 이의 비-인간 상동체 유래의 펩티드가 아니다.
본 개시내용은 또한 대상체에서 병태 (condition)를 치료하는 방법으로 확장되며, 상기 방법은 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 1 (LANCL1)에 결합하는 약제의 치료적으로 유효한 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 약제는 인간 성장 호르몬 또는 이의 비-인간 상동체 유래의 펩티드가 아니며, 상기 약제는 LANCL1에의 결합에 대해 서열 번호: 1 (YLRIVQCRSVEGSCGF)을 포함하는 사이클릭 펩티드와 경쟁하고, 상기 병태는 근감소증 (sarcopenia), 내당능 장애 (impaired glucose tolerance), 당뇨병, 비만, 대사 질환 및 비만-관련 병태, 신경병증성 통증, 골관절염, 근육 장애, 소모 장애 (wasting disorder), 악액질 (cachexia), 식욕 부진 (anorexia), AIDS 소모 증후군 (AIDS wasting syndrome), 근이영양증 (muscular dystrophy), 신경근 질환 (neuromuscular disease), 운동 신경 질환 (motor neuron disease), 신경근 접합 질환 (diseases of the neuromuscular junction), 염증성 근병증 (inflammatory myopathy), 화상, 상해 또는 외상, LDL 콜레스테롤 상승과 관련된 병태, 손상된 연골 세포, 프로테오글리칸 또는 콜라겐 생성 또는 품질 (quality)과 관련된 병태, 손상된 연골 조직 형성 또는 품질과 관련된 병태, 손상된 근육, 인대 또는 힘줄 질량 (mass), 형태 또는 기능과 관련된 병태, 근육 또는 결합 조직에 영향을 미치는 염증, 외상 또는 유전자 이상과 관련된 병태, 호흡기 병태 및 골 질환 (bone disorder)으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
또한, 본원에는 치료를 필요로 하는 대상체에서 병태를 치료하는데 사용하기 위한 조성물이 개시되며, 상기 조성물은 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 1 (LANCL1)에 결합하고, LANCL1에의 결합에 대해 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체와 경쟁하는 약제를 포함하고, 상기 약제는 인간 성장 호르몬 또는 이의 비-인간 상동체 유래의 펩티드가 아니며, 상기 병태는 근감소증, 내당능 장애, 당뇨병, 비만, 대사 질환 및 비만-관련 병태, 신경병증성 통증, 골관절염, 근육 장애, 소모 장애, 악액질, 식욕 부진, AIDS 소모 증후군, 근이영양증, 신경근 질환, 운동 신경 질환, 신경근 접합 질환, 염증성 근병증, 화상, 상해 또는 외상, LDL 콜레스테롤 상승과 관련된 병태, 손상된 연골 세포, 프로테오글리칸 또는 콜라겐 생성 또는 품질과 관련된 병태, 손상된 연골 조직 형성 또는 품질과 관련된 병태, 손상된 근육, 인대 또는 힘줄 질량, 형태 또는 기능과 관련된 병태, 근육 또는 결합 조직에 영향을 미치는 염증, 외상 또는 유전자 이상과 관련된 병태, 호흡기 병태 및 골 질환으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
본 개시내용은 또한 치료를 필요로 하는 대상체에서 병태를 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서, 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 1 (LANCL1)에 결합하고, LANCL1에의 결합에 대해 서열 번호: 1의 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체와 경쟁하는 약제의 용도로 확장되며, 상기 약제는 인간 성장 호르몬 또는 이의 비-인간 상동체 유래의 펩티드가 아니며, 상기 병태는 근감소증, 내당능 장애, 당뇨병, 비만, 대사 질환 및 비만-관련 병태, 신경병증성 통증, 골관절염, 근육 장애, 소모 장애, 악액질, 식욕 부진, AIDS 소모 증후군, 근이영양증, 신경근 질환, 운동 신경 질환, 신경근 접합 질환, 염증성 근병증, 화상, 상해 또는 외상, LDL 콜레스테롤 상승과 관련된 병태, 손상된 연골 세포, 프로테오글리칸 또는 콜라겐 생성 또는 품질과 관련된 병태, 손상된 연골 조직 형성 또는 품질과 관련된 병태, 손상된 근육, 인대 또는 힘줄 질량, 형태 또는 기능과 관련된 병태, 근육 또는 결합 조직에 영향을 미치는 염증, 외상 또는 유전자 이상과 관련된 병태, 호흡기 병태 및 골 질환으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
도 1은 파클리탁셀로 처리된 (상단) 또는 미처리된 (하단) 마우스 유래의 배근 신경절 (Dorsal root ganglion: DRG) 뉴런에 대한 LAT9991-PAL 리간드 (서열 번호: 12-PAL; 5μM)의 결합을 보여주며 - 적색 염색은 처리된 신경병증 동물 유래의 뉴런에만 LAT9991-PAL이 선택적으로 결합하는 것을 나타낸다. 스케일 바 (Scale bar)는 10 μm를 나타낸다.
도 2는 신경 수축 후 신경병증 마우스 유래의 뉴런에서 LAT9991-PAL의 분자 표적 (이미지에서 적색으로 염색됨)이 신경 세포막 내부 및 세포질에서 점상 염색 (punctate staining)으로 표시되는 것을 보여주는 현미경 사진 (photomicrograph)의 고-배율 이미지이다. 스케일 바는 10 μm를 나타낸다.
도 3은 신경병증 동물 유래의 신경 조직의 조직 균질물에서 가교된 LAT9991-PAL (서열 번호: 12-PAL; 5 μM)에 의해 형성된 복합체의 겔 분리를 보여준다. 결과는 12-15 kDa, 37 kDa 및 40-50 kDa의 3가지 분자량 범위에서 표적을 확인하는 특정 염색 패턴을 나타낸다. PAL 리간드가 없는 균질물 및 과량의 LAT8881 (서열 번호: 1; 50 μM)의 존재하에 LAT9991-PAL (5 μM)을 갖는 균질물을 대조군으로 사용하였다.
도 4는 LAT9991-PAL, LAT9993-PAL (서열 번호: 41-PAL) 및 LAT7771-PAL (서열 번호: 52-PAL)이 조직 균질물 유래의 LANCL1에 결합하였고 (질량 분석에 의해 확인됨), 이러한 결합이 과량의 LAT8881의 존재하에 억제되었음을 보여준다.
도 5는 LAT9991-PAL에 결합하는 추정 표적 단백질의 아이덴티티 (identity)를 확인하기 위해 Western Blot 분석에서 상업용 LANCL1 항체를 사용한 LANCL1의 검출을 보여준다.
도 6은 LAT9991-PAL이 재조합 LANCL1에 결합하였고, 이러한 결합이 과량의 LAT8881의 존재하에 억제되었음을 보여준다.
도 7은 LAT7771-PAL이 재조합 LANCL1에 결합하였고, 이러한 결합이 과량의 LAT8881의 존재하에 억제되었음을 보여준다.
도 8은 LAT9993S-PAL (서열 번호: 44-PAL)이 재조합 LANCL1에 결합하였고, 이러한 결합이 과량의 LAT8881의 존재하에 억제되었음을 보여준다.
도 9는 LAT9991-PAL이 재조합 LANCL1에 결합하였고, 이러한 결합이 (좌측에서 우측으로) 과량의 LAT8881, LAT9991, LAT7771 및 LAT9993S의 존재하에 억제되었음을 보여준다.
도 10은 LAT7771-PAL이 재조합 LANCL2에 결합하였고, 이러한 결합이 과량의 LAT8881의 존재하에 억제되었음을 보여준다.
도 11은 LAT9993-PAL이 재조합 LANCL3에 결합하였고, 이러한 결합이 과량의 LAT8881의 존재하에 억제되었음을 보여준다.
도 12는 변형된 펩티드, IDPHAPNEM(Ox)LYGR (서열 번호: 59)의 의존성 펩티드 MS 분석 후에 사이클릭 펩티드 LAT9991-PAL에 대한 LANCL1의 결합 부위를 보여준다. 변형된 펩티드는 454.199 (PAL-CR-N2)의 특징적인 ΔM을 갖는 것으로 확인되었다.
도 13은 siRNA에 의한 유전자 침묵 (SiLANCL1) 후에 선암성 폐포 기저 상피 세포 (A549)에서 LANCL1의 손실을, 대조군 siRNA (SiControl)로 형질감염된 A549 세포와 비교하여 보여준다.　LANCL1 침묵 48시간 후에, LANCL1 단백질이 고갈되었고, 이는 항-LANCL1 항체 (Invitrogen)를 사용한 Western blot 분석에 의해 결정된 바와 같이 세포 단리주 (cell isolates)로부터 ~37 kDa LANCL1 단백질의 손실로 입증되었다 (A). 이는 항-LANCL1 항체 (Invitrogen)를 사용한 공초점 현미경 (B)에 의해 결정되는 LANCL1 염색의 관찰된 감소와 일치하였지만, SiLANCL A549 세포의 세포질에서 LANCL1의 일부 내인성 염색은 남아 있었다.
발명의 상세한 설명
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 방법 및 물질과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 기재된다. 본 발명의 목적을 위해, 다음의 용어들이 하기에 정의된다.
단수 용어 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다. 핵산 또는 폴리펩티드에 대해 주어진 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자량 값은 근사치이며, 설명을 위해 제공됨을 추가로 이해해야 한다.
본 명세서 전체에서, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함한다 (comprise)", "포함하다 (comprises)" 및 "포함하는 (comprising)"은 명시된 단계 또는 요소, 또는 단계들 또는 요소들의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 단계 또는 요소, 또는 단계들 또는 요소들의 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 용어 "포함하는 (comprising)" 및 유사어의 사용은 나열된 요소가 요구되거나 또는 필수이지만, 다른 요소는 선택적이고, 존재할 수도 있거나 또는 존재하지 않을 수도 있음을 나타낸다. "필수적으로 구성되는 (consisting essentially of)"은 문구 뒤에 나열된 임의의 요소를 포함하는 것을 의미하며, 나열된 요소에 대한 개시내용에 명시된 활성 또는 작용을 방해하거나 또는 이에 기여하지 않는 다른 요소로 제한된다. 따라서, 문구 "필수적으로 구성되는 (consisting essentially of)"은 나열된 요소가 요구되거나 또는 필수이지만, 다른 요소는 선택적이고, 나열된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지 여부에 따라 존재할 수도 있거나 또는 존재하지 않을 수도 있음을 나타낸다.
본원에서 사용된, "및/또는 (and/or)"은 관련된 나열된 항목들 중 하나 이상의 임의 및 모든 가능한 조합 뿐만 아니라, 대안 (또는)으로 해석되는 경우 조합의 결여를 포함하는 것을 나타낸다.
본원에서 사용된, 용어 "약 (about)"은 수량, 수준, 값, 치수, 크기 또는 양이 참조 수량, 수준, 값, 치수, 크기 또는 양에 대해 10% 만큼 (예: 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%) 가변하는 것을 나타낸다.
본원에 기재된 각 구체예는 달리 구체적으로 명시되지 않는 한 각 및 모든 구체예에 준용하여 적용되어야 한다.
스크리닝 방법
본원에서 언급된 바와 같이, 본 발명자들은 처음으로 진통 특성이 이전에 부여된 사이클릭 펩티드 분자의 부류의 분자 표적을 확인 및 특성 규명하여, 통증, 구체적으로 신경병증성 통증을 치료하는데 사용할 수 있는 후보 화합물을 스크리닝하는 방법을 가능하게 하였다. 따라서, 본원에는 진통제에 대한 스크리닝 방법이 개시되며, 상기 방법은 (a) 서열 번호: 1 (YLRIVQCRSVEGSCGF)을 포함하는 펩티드, 또는 이의 구조적 유사체의 존재하에, 후보 약제의 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 (LANCL)에 대한 결합을 허용하는 조건하에, 후보 약제를 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 (LANCL)과 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 후보 약제가 LANCL에 결합하고, LANCL에의 결합에 대해 서열 번호: 1을 포함하는 펩티드 또는 이의 구조적 유사체와 경쟁하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 LANCL에의 결합에 대해 서열 번호: 1을 포함하는 펩티드 또는 이의 구조적 유사체와 경쟁하는 후보 약제의 능력은 상기 후보 약제가 진통제임을 나타낸다. 일 구체예에서, 상기 LANCL은 LANCL1, LANCL2 및 LANCL3으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 LANCL은 LANCL1이다.
본 발명자들의 발견은 또한 LANCL의 리간드에 대한 일반적인 스크리닝 방법을 가능하게 한다. 따라서, 또한 본원에는 LANCL의 리간드에 대한 스크리닝 방법이 개시되며, 상기 방법은 (a) 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드, 또는 이의 구조적 유사체의 존재하에, 후보 약제의 LANCL에 대한 결합을 허용하는 조건하에, 후보 약제를 LANCL과 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 후보 약제가 LANCL에 결합하고, LANCL에의 결합에 대해 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체와 경쟁하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 LANCL에의 결합에 대해 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체와 경쟁하는 후보 약제의 능력은 상기 후보 약제가 LANCL의 리간드임을 나타낸다. 일부 구체예에서, 확인된 리간드는 LANCL 활성의 조절로부터 유익할 수 있는 병태를 치료하는데 사용할 수 있는 치료제이며, 이의 실증적 예시는 근감소증, 내당능 장애, 당뇨병, 비만, 대사 질환 및 비만-관련 병태, 신경병증성 통증, 골관절염, 근육 장애, 소모 장애, 악액질, 식욕 부진, AIDS 소모 증후군, 근이영양증, 신경근 질환, 운동 신경 질환, 신경근 접합 질환, 염증성 근병증, 화상, 상해 또는 외상, LDL 콜레스테롤 상승과 관련된 병태, 손상된 연골 세포, 프로테오글리칸 또는 콜라겐 생성 또는 품질과 관련된 병태, 손상된 연골 조직 형성 또는 품질과 관련된 병태, 손상된 근육, 인대 또는 힘줄 질량, 형태 또는 기능과 관련된 병태, 근육 또는 결합 조직에 영향을 미치는 염증, 외상 또는 유전자 이상과 관련된 병태, 통증 (예: 신경병증성 통증) 및 골 질환을 포함한다.
란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 (LANCL)은 lantibiotics에서 란티오닌 고리의 형성에 관여하는 사이클라제 (cyclase)인 박테리아 LanC의 진핵생물 상동체이다. 인간은 3개의 LanCL 단백질을 가지며, 이는 염색체 2, 7, 및 X에 각각 코딩된 LANCL1, LANCL2, 및 LANCL3이다. 진핵생물 LANC-유사 (LANCL) 단백질 패밀리의 제1 구성원인 LANCL1은 인간 적혈구 막으로부터 단리하였다. LANCL2는 이후에 인간에서 확인되었다. LANCL1 상동체는 또한 마우스, 래트 및 소를 포함한 다른 포유동물에서 발견하고 특성 규명하였다. 진핵생물 LANCL 단백질과 원핵생물 LANC 효소의 아미노산 서열들을 비교한 결과, 몇 가지 중요한 유사점이 밝혀졌으며, 이는 진핵생물에서 LANCL 단백질의 정의에 대한 기초를 형성하였다. 예를 들어, LANCL 단백질은 7개의 소수성 서열 반복부를 함유하고, 이들 각각은 하나의 특징적인 GXXG 컨센서스 모티프 (여기서 G = 글리신 및 X = 임의의 아미노산)를 갖는다. 또한, LANCL 단백질은 3개의 중요한 모티프인, 반복부 4에서 히스티딘 (H)-글리신 (G) 모티프, 반복부 5에서 트립토판 (W)-시스테인 (C)-X-글리신 (G) 모티프, 및 반복부 6에서 시스테인 (C)-히스티딘 (H)-글리신 (G) 모티프를 함유한다. 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) LanC 단백질인 니신 사이클라제 (nisin cyclise: NisC)의 결정 구조 및 부위-지향 돌연변이 유발 (site-directed mutagenesis) 연구에 의해 밝혀진 바와 같이, 반복부 4의 HG 모티프는 정확한 고리화를 허용하기 위해 기질 탈양성자화 (substrate deprotonation)에 중요하며, 반복부 5의 WCXG 모티프 및 반복부 6의 CHG 모티프는 보존된 아연-배위 잔류물을 함유한다 (Chen and Ellis, Plant Signal Behav. 2008; 3(5): 307-310 참조).
란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 1 (LANCL1)은 399개의 아미노산으로 이루어진 말초 막 단백질 (peripheral membrane protein)로서, 이는 원래 막-관련 적혈구 GPCR p40/GPR69A로 발견된, 박테리아 효소 란티오닌 신테타제 성분 C (LANC)와 서열 및 구조적 상동성을 갖는 3개의 관련된 포유동물 LANCL 단백질 (LANCL1, 2 및 3) 중 하나인 것으로 이해되며, 이는 항생제 합성에 관여한다. LANC는 특정 탈수효소 (dehydratases)와 협력하여 작용하고 시스테인의 세린 또는 트레오닌 잔기로의 분자내 접합을 촉진하여, 란티오닌으로 알려진 시스테인의 마크로사이클릭 티오에테르 유사체를 수득하는 아연-함유 효소이다. 이러한 생성물은 강력한 항미생물 활성을 나타내며, 란티바이오틱스 (lantibiotics)로 알려져 있다. 후속 연구에 따르면, 동물의 LANCL1은 GPCR이 아니며, 박테리아 효소의 사이클라제 활성을 보유하지 않는 것으로 밝혀졌다.
LANCL1에 인접한 인간 염색체 2q34의 게놈 영역은 가족성 정신분열병 (familial schizophrenia) 및 신경관 결함 (neural tube defects)의 조기 발병 AD 감수성 형태와 관련이 있다. LANCL1은 또한 유전자 연관성 연구에서 천식과 관련이 있다. LANCL1은 또한 MTMP 신경독성 독성 (파킨슨병에 대한 모델)에 대한 감수성과 상관관계가 있는 마우스의 3가지 유전자들 중 하나로 확인되었다.
LANCL2는 아브시스산 (abscisic acid: ABA) 신호전달 경로에 관여하는 것으로 나타났으며, 이는 면역 세포 및 인슐린종 세포 (insulinoma cells)에서 ABA-특이적 효과를 전파하기 위해 다운스트림으로 작용한다. 이전 연구에서 LANCL2는 Akt를 조절한다고 보고하였고, 이는 구체적으로 키나제 및 기질 모두와의 직접적인 물리적 상호작용을 통해, 라파마이신 복합체 2의 포유동물 표적 (mTORC2)에 의한 Akt의 최적 인산화를 촉진하는데 관여한다. 인간 LANCL2는 또한 아드리아마이신 감작에 역할을 하는 것으로 제시되었다. LANCL2는 고환 및 뇌에서 높게 발현되지만, 검사한 다른 모든 조직에 편재하여 더 적게 발현된다. LANCL3에 대해서는 비교적 알려진 것이 거의 없다.
본원에서 사용된, 용어 "LANCL1"은 네이티브 LANCL1 폴리펩티드와는 구조적으로 (예: 아미노산 서열에 의해) 상이하지만, 네이티브 단백질의 생물학적 활성을 유지하거나 또는 실질적으로 유지하는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일 구체예에서, LANCL1은 인간 LANCL1이다. 인간 LANCL1 분자의 예는 당업자에게 알려져 있을 것이며, 이의 실증적 예시는 GenBank Accession number CAG46576 (version CAG46576.1) 및 GenBank Accession no. NP_006046.1에 기재되어 있다. 따라서, 일 구체예에서, LANCL1은 GenBank Accession number CAG46576 (version CAG46576.1) 또는 GenBank Accession no. NP_006046.1의 아미노산 서열, 또는 상기 서열들 중 어느 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
용어 "LANCL1"은 비-인간 상동체, 예컨대 뮤린 (murine), 개, 고양이 및 말의 LANCL1 이소형을 포함한다. LANCL1의 비-인간 이소형은 당업자에게 알려져 있을 것이며, 이의 실증적 예시는 GenBank Accession numbers RLQ75574.1, OWK13010.1, NP_001177913.1, NP_001177914.1 및 NP_067270.1에 기재되어 있다.
본원에서 사용된, 용어 "LANCL2"는 네이티브 LANCL2 폴리펩티드와는 구조적으로 (예: 아미노산 서열에 의해) 상이하지만, 네이티브 단백질의 생물학적 활성을 유지하거나 또는 실질적으로 유지하는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일 구체예에서, LANCL2는 인간 LANCL2이다. 인간 LANCL2 분자의 예는 당업자에게 알려져 있을 것이며, 이의 실증적 예시는 GenBank Accession number NP_061167.1 (version NP_061167.1)에 기재되어 있다. 따라서, 일 구체예에서, LANCL2는 GenBank Accession number NP_061167.1 (version NP_061167.1)의 아미노산 서열, 또는 상기 서열들 중 어느 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
용어 "LANCL2"는 비-인간 상동체, 예컨대 뮤린, 개, 고양이 및 말의 LANCL2 이소형을 포함한다. LANCL2의 비-인간 이소형은 당업자에게 알려져 있을 것이며, 이의 실증적 예시는 GenBank Accession numbers AAH16072.1, AAI49312.1, 및 NP_001014209.1에 기재되어 있다.
본원에서 사용된, 용어 "LANCL3"은 네이티브 LANCL3 폴리펩티드와는 구조적으로 (예: 아미노산 서열에 의해) 상이하지만, 네이티브 단백질의 생물학적 활성을 유지하거나 또는 실질적으로 유지하는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일 구체예에서, LANCL3은 인간 LANCL3이다. 인간 LANCL3 분자의 예는 당업자에게 알려져 있을 것이며, 이의 실증적 예시는 GenBank Accession number NP_001163802 (version NP_001163802.1)에 기재되어 있다. 따라서, 일 구체예에서, LANCL3은 GenBank Accession number NP_001163802 (version NP_001163802.1)의 아미노산 서열, 또는 상기 서열들 중 어느 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
용어 "LANCL3"은 비-인간 상동체, 예컨대 뮤린, 개, 고양이 및 말의 LANCL3 이소형을 포함한다. LANCL3의 비-인간 이소형은 당업자에게 알려져 있을 것이며, 이의 실증적 예시는 GenBank Accession numbers NP_775590.2, XP_031301363.1 및 XP_018875202.2에 기재되어 있다.
용어 "기능적 변이체 (functional variant)"는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 보존적 또는 비-보존적 치환에 의해 (인간 또는 비-인간 이소형의) 네이티브 LANCL1 펩티드와는 상이한 분자를 나타내기 위해 본원에서 사용되며, 여기서 변이체는 본원에 기재된 바와 같이, 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드, 또는 이의 구조적 유사체에 결합하는 능력을 포함하여, 네이티브 단백질의 생물학적 활성을 유지하거나 또는 실질적으로 유지한다. 펩티드가 LANCL1, LANCL2 및/또는 LANCL3의 기능적 변이체인지를 결정하는 방법은 당업자에게 친숙할 것이며, 이의 실증적 예시는 본원에 기재되어 있다 (예: 본원에 기재된 바와 같이, 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드, 또는 이의 구조적 유사체에 결합하고, 및/또는 이와 복합체를 형성하는 기능적 변이체의 능력). LANCL1, LANCL2 및/또는 LANCL3의 기능적 변이체는 또한 각각 LANCL1, LANCL2 및/또는 LANCL3의 기능적 단편으로 확장된다. 기능적 단편은 본원에 기재된 바와 같이 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체에 결합하는 능력을 포함하는, 네이티브 단백질의 생물학적 활성을 유지하거나 또는 실질적으로 유지하는 한, 이는 임의의 적합한 길이일 수 있음을 이해해야 한다. 일 구체예에서, 기능적 단편은 길이가 적어도 50개의 아미노산 잔기 (즉, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 등), 바람직하게는 길이가 적어도 100개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 길이가 적어도 150개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 길이가 적어도 200개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 길이가 적어도 250개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 길이가 적어도 300개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 길이가 적어도 350개의 아미노산 잔기, 또는 더 바람직하게는 길이가 적어도 350개의 아미노산 잔기이다.
용어 "네이티브 (native)", "야생형 (wild-type)", "자연 발생 (naturally occurring)" 및 유사어는 자연 발생 공급원으로부터 단리되는 경우 해당 유전자 또는 유전자 산물의 특징을 갖는 유전자 또는 유전자 산물을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 야생형, 네이티브 또는 자연 발생 유전자 또는 유전자 산물 (예: 폴리펩티드)은 집단에서 가장 빈번하게 관찰되는 것으로서, 유전자 또는 유전자 산물의 "정상 (normal)" 또는 "야생형 (wild-type)" 형태로 임의로 지정된다.
본원에 언급된 바와 같이, LANCL1, LANCL2 및 LANCL3의 기능적 변이체는 네이티브 LANCL 서열과 적어도 70% (및 적어도 71% 내지 적어도 99%, 및 그 사이의 모든 정수 퍼센트)의 서열 동일성 또는 유사성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 분자를 제한 없이 포함한다. 네이티브 LANCL 폴리펩티드 서열의 실증적 예시는 본원에 기재되어 있으며, GenBank Accession numbers CAG46576 (예: version CAG46576.1), NP_006046.1, RLQ75574.1, OWK13010.1, NP_001177913.1, NP_001177914.1 및 NP_067270.1을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. LANCL1, LANCL2 및 LANCL3의 기능적 변이체는 하나의 유기체로부터 다른 유기체로 존재 및 발생할 수 있는 LANCL 펩티드의 천연 대립유전자 변이를 추가로 포함한다. 글리코실화 또는 다른 번역 후 변형의 정도 및 위치는 또한 선택된 숙주 및 숙주 세포 환경의 특성에 따라 달라질 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, LANCL1, LANCL2 및 LANCL3의 기능적 변이체는 또한 참조 또는 자연-발생 (네이티브) LANCL 펩티드에 비해 화학적으로 변형 (예: 인산화, 메틸화 또는 아세틸화)되고, 및/또는 참조 또는 자연-발생 LANCL 펩티드에 비해 하나 이상의 아미노산 서열 변경을 함유하고, 및/또는 참조 또는 자연-발생 전장 또는 처리된 LANCL 펩티드에 비해 절단된 아미노산 서열을 함유하는 LANCL 펩티드로 확장된다. LANCL1, LANCL2 및 LANCL3의 기능적 변이체는 또한 약간 변형된 아미노산 서열을 갖는 단백질성 분자 (proteinaceous molecules), 예를 들어 N-말단 아미노산 결실 또는 추가를 포함하는 변형된 N-말단 단부를 갖는 펩티드, 및/또는 참조 또는 자연-발생 LANCL 펩티드에 비해 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 포함한다. 본원에 언급된 바와 같이, LANCL의 기능적 변이체는 또한 본원에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해, 참조 또는 자연-발생 LANCL 펩티드의 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는 펩티드로 확장된다.
"보존적 아미노산 치환 (conservative amino acid substitution)"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 치환을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당해 기술 분야에 정의되어 있으며, 이는 일반적으로 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 하위-분류될 수 있다:
아미노산 하위-분류
하위-분류 아미노산
산성 아스파르트산, 글루탐산
염기성 비-사이클릭: 아르기닌, 리신; 사이클릭: 히스티딘
하전됨 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 리신, 히스티딘
소 글리신, 세린, 알라닌, 트레오닌, 프롤린
극성/중성 아스파라긴, 히스티딘, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌
극성/대 아스파라긴, 글루타민
소수성 티로신, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판
방향족 트립토판, 티로신, 페닐알라닌
사슬 배향에 영향을 미치는 잔기 글리신 및 프롤린
보존적 아미노산 치환은 또한 측쇄를 기반으로 하는 그룹화를 포함한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌이며; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 예를 들어, 류신을 이소류신 또는 발린으로 대체, 아스파르테이트를 글루타메이트로 대체, 트레오닌을 세린으로 대체하거나, 또는 구조적으로 관련된 아미노산으로 아미노산을 유사하게 대체하는 것은 생성된 변이체 폴리펩티드의 특성에 큰 영향을 미치지 않을 것으로 예상하는 것이 합리적이다. 아미노산 변경이 기능성 폴리펩티드를 생성하는지 여부는 이의 활성을 분석함으로써 용이하게 결정할 수 있다.
보존적 치환은 예시 및 바람직한 치환이라는 제목으로 하기 표 2에 개시되어 있다. 본 발명의 범위에 속하는 아미노산 치환은 일반적으로 (a) 치환 영역에서 펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 크기 (bulk)를 유지하는데 있어서 이들의 영향이 크게 다르지 않은 치환을 선택함으로써 달성된다. 치환이 도입된 후에, 변이체의 생물학적 활성을 스크리닝한다.
후보 약제가 (i) LANCL1, LANCL2 및/또는 LANCL3에 결합하고, (ii) 서열 번호: 1의 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체와 결합에 대해 경쟁하는 능력에 대해 후보 약제를 스크리닝하는 다수의 접근법이 있다. 다양한 스크리닝 분석 또는 방법이 충분할 것이며, 그럼에도 불구하고 본 개시내용에 비추어, 본원에 명시적으로 기재되지 않은 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
예시 및 바람직한 아미노산 치환
원래 잔기 예시되는 치환 바람직한 치환
Ala Val, Leu, Ile Val
Arg Lys, Gln, Asn Lys
Asn Gln, His, Lys, Arg Gln
Asp Glu Glu
Cys Ser Ser
Gln Asn, His, Lys, Asn
Glu Asp, Lys Asp
Gly Pro Pro
His Asn, Gln, Lys, Arg Arg
Ile Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleu Leu
Leu Norleu, Ile, Val, Met, Ala, Phe Ile
Lys Arg, Gln, Asn Arg
Met Leu, Ile, Phe Leu
Phe Leu, Val, Ile, Ala Leu
Pro Gly Gly
Ser Thr Thr
Thr Ser Ser
Trp Tyr Tyr
Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe
Val Ile, Leu, Met, Phe, Ala, Norleu Leu
본원에 기재된 바와 같이, 후보 화합물 (약제)은 임의의 조합 화학 방법 (combinatorial chemical method)에 의해 형성될 수 있다. 대안으로서, 후보 약제는 적합한 공급원으로부터 추출 및 정제되거나, 또는 인 비보 (in vivo) 또는 인 비트로 (in vitro) 합성되는 자연 발생 분자일 수 있다. 테스트 (스크리닝)할 후보 약제 (화합물)는 예를 들어 박테리아, 효모, 식물 또는 다른 유기체에 의해 생산 (예: 천연물)되거나, 화학적으로 제조 (예: 펩티드 모방체를 포함한 소분자)되거나, 또는 재조합으로 생성될 수 있다. 후보 화합물에는 비-펩티딜 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드 모방체, 당 및 호르몬을 포함한다.
본원에서 사용된, 용어 "약제 (agent)"는 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 유도하는 화합물을 포함한다. 상기 용어는 또한 염, 에스테르, 아미드, 프로드러그, 활성 대사산물, 유사체 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 본원에 구체적으로 언급된 화합물의 약학적으로 허용 가능하고, 약리학적으로 활성인 성분을 포함한다. 상기 용어가 사용되는 경우, 이는 활성제 그 자체 뿐만 아니라 약학적으로 허용 가능하고, 약리학적으로 활성인 염, 에스테르, 아미드, 프로드러그, 대사산물, 유사체 등을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "약제 (agent)"는 좁게 해석되지 않고, 소분자, 단백질성 분자 예컨대 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질, 뿐만 아니라 이들을 포함하는 조성물, 및 이의 화학적 유사체, 및 세포 제제 (cellular agents)로 확장된다. 용어 "약제 (agent)"는 본원에 언급된 약제를 생성 및 분비할 수 있는 세포, 뿐만 아니라 해당 약제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 용어 "약제 (agent)"는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터, 발현 벡터 및 다양한 세포 내에서 발현 및 분비를 위한 플라스미드와 같은 벡터를 포함하는 핵산 구조체로 확장된다. 용어 "후보 약제 (candidate agent)" 및 "테스트 약제 (test agent)"는 본원에 기재된 바와 같이 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 1 (LANCL1)에 결합하는 능력에 대해 스크리닝될 약제 및/또는 조성물을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다.
후보 화합물은 단일의 개별 엔티티 (entities)로 제공될 수 있거나, 또는 조합 화학에 의해 만들어진 것과 같이 더 복잡한 라이브러리로 제공될 수 있다. 이러한 라이브러리는 예를 들어 알코올, 알킬 할라이드, 아민, 아미드, 에스테르, 알데히드, 에테르 및 다른 부류의 유기 화합물을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 스크리닝 방법에 대한 후보 화합물의 제시는 특히 초기 스크리닝 단계에서 단리된 형태 또는 화합물들의 혼합물일 수 있다. 선택적으로, 후보 화합물은 다른 화합물로 유도체화될 수 있고, 화합물의 단리를 용이하게 하는 유도체화 기를 가질 수 있다. 유도체화 기 (derivatizing groups)의 비-제한적인 예로는 바이오틴, 플루오레세인, 디곡시게닌, 녹색 형광 단백질, 동위원소, 폴리히스티딘, 자기 비드 (magnetic beads), 글루타티온 S-트란스퍼라제 (GST), 광활성화 가능한 가교제 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
화합물 및 천연 추출물의 라이브러리를 테스트하는 많은 약물 스크리닝 프로그램에서, 주어진 기간 동안 조사된 화합물의 수를 최대화하기 위해 고처리량 분석 (high throughput assays)이 바람직하다. 정제되거나 또는 반-정제된 단백질로 유도될 수 있는 것과 같은 무-세포 시스템에서 수행되는 분석은 후보 화합물에 의해 매개되는 분자 표적에서의 변경을 빠르게 개발 및 비교적 쉽게 검출할 수 있도록 생성될 수 있다는 점에서 종종 "1차 (primary)" 스크린으로 선호된다. 더욱이, 후보 화합물의 세포 독성 또는 생체이용률의 효과는 일반적으로 인 비트로 시스템에서 무시될 수 있으며, 대신에 상기 분석은 주로 분자 표적 (즉, LANCL1)에 대한 후보 화합물의 효과에 중점을 두었다.
후보 화합물은 또한 잘 알려진 거대 화합물 라이브러리 예컨대 ACD (the Available Chemical Directory; http://www.organicworldwide.net/content/available-chemical-directory)의 전자 스크리닝을 통해 선택할 수 있다. 이러한 라이브러리의 화합물은 도킹 프로그램 (docking programs)에 의해 분석할 수 있다. 구체적으로, 후보 화합물 및 LANCL1 간 상호작용의 적합성 및 강도를 평가하기 위해, 도킹 프로그램 (docking programs) 예컨대 Autodock (available from Oxford Molecular, Oxford, UK), Dock (available from Molecular Design Institute, University of California San Francisco, Calif.), Gold (available from Cambridge Crystallographic Data Centre, Cambridge, UK) 및 FlexX and FlexiDock (both available from Tripos, St. Louis, Mo.)이 사용될 수 있다. 이들 프로그램 및 프로그램 Affinity (available from Molecular Simulations, San Diego, Calif.)는 또한 후보 화합물의 추가 개발 및 최적화에 사용될 수 있다. 표준 분자 역학 역장 (standard molecular mechanics force fields) 예컨대 CHARMm 및 AMBER은 또한 에너지 최소화 및 분자 역학에 사용될 수 있다.
본 발명의 스크리닝 분석의 실증적 예시에서, 후보 화합물은 LANCL1 펩티드와 접촉된다. 일 구체예에서, LANCL1은 GenBank Accession No. CAG46576 (version CAG46576.1)에 기재된 바와 같이, 아미노산 서열: MAQRAFPNPY ADYNKSLAEG YFDAAGRLTP EFSQRLTNKI RELLQQMERG PKSADPRDGT GYTGWAGIAV LYLHLYDVFG DPAYLQLAHG YVKQSLNCLT KRSITFLCGD AGPLAVAAVL YHKMNNEKQA EDCITRLIHL NKIDPHAPNE MLYGRIGYIY ALLFVNKNFG VEKIPQSHIQ QICETILTSG ENLARKRNFT AKSPLMYEWY QEYYVGAAHG LAGIYYYLMQ PSLQVSQGKL HSLVKPSVDY VCQLKFPSGN YPPCIGDNRD LLVHWCHGAP GVIYMLIQAY KVFREEKYLC DAYQCADVIW QYGLLKKGYG LCHGSAGNAY AFLTLYNLTQ DMKYLYRACK FAEWCLEYGE HGCRTPDTPF SLFEGMAGTI YFLADLLVPT KARFPAFEL (서열 번호: 2)을 포함한다.
본 발명의 스크리닝 분석의 다른 실증적 예시에서, 후보 화합물은 LANCL2 펩티드와 접촉된다. 일 구체예에서, LANCL2는 GenBank Accession No. NP_061167 (version NP_061167.1)의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 스크리닝 분석의 다른 실증적 예시에서, 후보 화합물은 LANCL3 펩티드와 접촉된다. 일 구체예에서, LANCL3은 GenBank Accession No. NP_001163802 (version NP_001163802.1)의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 스크리닝 분석의 다른 실증적 예시에서, 후보 화합물은 LANCL1, LANCL2 및 LANCL3 펩티드 중 2개 이상 (예: (i) LANCL1 및 LANCL2; (ii) LANCL1, LANCL2 및 LANCL3; (iii) LANCL1 및 LANCL3; (iv) LANCL2 및 LANCL3)과 접촉된다.
상기 LANCL1, LANCL2 및 LANCL3은 예를 들어 Ausubel et al. "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994-2003에 기재된 바와 같은 표준 프로토콜을 사용한 재조합 기술에 의해 편리하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 LANCL1, LANCL2 및 LANCL3은 하기 단계를 포함하는 절차에 의해 제조될 수 있다: (a) LANCL1, LANCL2 및/또는 LANCL3에 대한 코딩 서열을 포함하는 구조체를 제조하는 단계로서, 상기 코딩 서열은 조절 요소에 작동 가능하게 연결되는 것인 단계; (b) 상기 구조체를 숙주 세포에 도입하는 단계; (c) 상기 코딩 서열을 발현하도록 숙주 세포를 배양하여 코딩된 펩티드를 생산하는 단계; 및 (d) 코딩된 LANCL 펩티드를 상기 숙주 세포로부터 단리하는 단계. 본원에서 사용된 용어 "작동 가능하게 결합된 (operably connected)" 또는 "작동 가능하게 연결된 (operably linked)"은 기재된 성분들이 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 상관관계에 있는 병치 (juxtaposition)를 지칭한다. 예를 들어, 관심 뉴클레오티드 서열 (예: 코딩 및/또는 비-코딩 서열)에 "작동 가능하게 연결된" 조절 서열 (예: 프로모터)은 제어 서열에 적합한 조건하에 관심 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 관심 뉴클레오티드 서열에 대한 제어 서열의 위치 지정 및/또는 배향을 지칭한다. 상기 제어 서열이 발현을 지시하는 기능을 하는 한, 상기 제어 서열은 관심 뉴클레오티드 서열과 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 개재 비-코딩 서열 (예: 번역되지 않은, 전사된 서열)은 프로모터 및 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 상기 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.
대표적인 LANCL1 코딩 서열은 선택된 숙주 세포에서 발현을 증진시키기 위한 코돈-최적화된 서열을 포함하는, GenBank Accession No. NM_006055 (version NM_006055.3)의 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 상응하는 서열을 포함한다. 대표적인 LANCL2 코딩 서열은 선택된 숙주 세포에서 발현을 증진시키기 위한 코돈-최적화된 서열을 포함하는, GenBank Accession No. NM_018697.3의 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 상응하는 서열을 포함한다. 대표적인 LANCL3 코딩 서열은 선택된 숙주 세포에서 발현을 증진시키기 위한 코돈-최적화된 서열을 포함하는, GenBank Accession No. NM_001170331.2, 또는 이에 상응하는 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 후보 화합물 및 LANCL의 혼합물에 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드, 또는 이의 구조적 유사체를 함유하는 조성물이 부가된다. LANCL1 및 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 상동체 사이에 형성된 복합체의 검출 및 정량 분석은 LANCL 및 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체 사이의 복합체 형성을 억제하는 후보 화합물의 능력을 결정하기 위한 수단을 제공한다. LANCL 및 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체 사이의 복합체 형성을 억제하는 후보 화합물의 효능은 다양한 농도의 후보 화합물을 사용하여 수득된 데이터로부터 용량 반응 곡선을 생성함으로써 평가될 수 있다. 비교를 위한 기준선을 제공하기 위해 대조 분석이 또한 수행될 수 있다. 예를 들어, 대조 분석에서, LANCL1은 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체를 포함하는 조성물에 부가되고, LANCL1/사이클릭 펩티드 복합체의 형성은 후보 화합물의 부재하에 정량 분석된다. 일반적으로, 반응물들이 혼합될 수 있는 순서는 다양할 수 있고, 동시에 혼합될 수 있음이 이해될 것이다. 더욱이, 정제된 단백질 대신에, 세포 추출물 및 용해물을 사용하여 적절한 무-세포 분석 시스템을 만들 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "복합체 (complex)"는 분자들 (예: 펩티드, 폴리펩티드 등)이 서로 직접 및/또는 간접적으로 접촉한 집합체 또는 응집체를 지칭한다. 특정 구체예에서, "접촉 (contact)", 또는 보다 구체적으로 "직접 접촉 (direct contact)"은 2개 이상의 분자들이 충분히 가까워서 인력의 비-공유 상호작용 예컨대 반데르발스 힘 (Van der Waal forces), 수소 결합, 이온 및 소수성 상호작용 등이 분자들의 상호작용에서 우세한 것을 의미한다. 이러한 구체예에서, 분자들의 복합체 (예: 펩티드 및 폴리펩티드)는 복합체가 (예: 이의 성분 분자들의 비-응집 또는 비-복합 상태와 비교하여) 열역학적으로 유리하도록 하는 조건하에 형성된다. 본원에서 사용된, 용어 "복합체 (complex)"는 달리 기재하지 않는 한, 2개 이상의 분자들 (예: 펩티드, 폴리펩티드 또는 이들의 조합)의 집합체를 지칭한다. 용어 "상호작용 (interaction)"은 이의 문법적 등가물을 포함하여, 두 분자들 간의 상호작용을 지칭하는 경우 분자들이 서로 물리적으로 접촉하는 것을 지칭한다. 일반적으로, 이러한 상호작용은 상기 분자들 중 하나 또는 둘 모두의 활성을 초래한다 (생물학적 효과를 생성한다). 물리적 접촉은 전형적으로 분자들 간의 결합 또는 회합을 필요로 하며, 유도 자기장 또는 상자성 자기장의 형성, 공유 결합 형성, 이온 상호작용 (예: 이온 격자에서 발생), 수소 결합, 또는 대안으로서 반 데르 발스 상호작용 예컨대 예를 들어 쌍극자-쌍극자 상호작용, 쌍극자-유도 쌍극자 상호작용, 유도 쌍극자-유도 쌍극자 상호작용, 또는 반발 상호작용, 또는 상기 인력의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
LANCL 및 사이클릭 펩티드, 또는 이의 구조적 유사체 사이의 상호작용을 조절 (경쟁)하는 후보 화합물의 능력은 2개의 단백질들 간의 상호작용을 평가하는데 적합한 것으로 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 테스트될 수 있다. 실증적 예시로는 면역블롯팅, 면역침강 분석, PAR 초점의 면역형광, 형광 편광, FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer), BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), AlphaScreenTM (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay), 섬광 근접 분석 (Scintillation Proximity Assay), ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), SPR (Surface Plasmon Resonance, also known as BIAcoreTM), 등온 적정 열량계 (isothermal titration calorimetry: ITC), 시차 주사 열량계 (differential scanning calorimetry), 마이크로스케일 열영동 (microscale thermophoresis), 겔 전기영동 (gel electrophoresis), 및 겔 여과를 포함한 크로마토그래피를 포함한다. 본원에 기재된 것을 포함한, 이들 및 다른 방법은 LANCL1, LANCL2 및/또는 LANCL3 및/또는 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체의 융합 파트너 또는 표지 (예: 본원에 기재된 바와 같은 광-활성화 표지 (photo-activated labelling: PAL)를 이용할 수 있다. 발색, 형광, 발광 또는 동위원소 표지를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 검출 방법이 분석에 사용될 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "조절하다 (modulate)"는 관심 있는 분자, 과정, 경로 또는 현상에서 정성적 또는 정량적 변화, 변경 또는 변형을 유발하거나 또는 촉진하는 것을 의미한다. 제한 없이, 그러한 변화는 결합 특성의 증가, 감소, 변화, 또는 과정, 경로 또는 현상의 다른 구성요소 또는 브랜치의 상대적 강도 또는 활성의 변화일 수 있다.
본 개시내용은 또한 LANCL 및 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체 간의 상호작용을 방해하는 후보 화합물을 확인하기 위한 상호작용 트랩 분석 (interaction trap assay) (또한, "two hybrid assay"으로 알려짐)의 사용을 고려한다 (예를 들어, U.S. Pat. No. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; 및 Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696 참조). 일 구체예에서, 본 개시내용은 LANCL 및 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체 간의 상호작용을 해리하는 화합물 (예: 소분자 또는 펩티드)을 확인하기 위한 리버스 2 하이브리드 시스템 (reverse two hybrid systems)의 사용을 고려한다 (예를 들어, Vidal and Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal and Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; 및 U.S. Pat. Nos. 5,525,490; 5,955,280; 및 5,965,368 참조).
후보 화합물은 인 비보에서 원하는 치료 프로파일을 갖는 해당 화합물을 확인하기 위해 동물 모델에서 추가로 테스트될 수 있다. 이러한 후보는 예를 들어 화합물을 순차적 변형, 분자 모델링 및 합리적인 약물 디자인에 사용되는 다른 일상적인 절차에 적용함으로써 의약품의 추가 개발을 위한 "선도 화합물 (lead compounds)"로서 역할을 할 수 있다.
용어 "구조적 유사체 (structural analogue)"는 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드를 지칭하는 한, 서열 번호: 1의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환 (보존적 또는 비-보존적)에 의해 상이하지만, 사이클릭 확인 (cyclic confirmation)을 (예를 들어, 서열 번호: 1; YLRIVQ C RSVEGS C GF의 2개의 시스테인 잔기에 상응하는 시스테인 잔기들 간의 디설파이드 결합을 유지함으로써) 및 본원에 기재된 바와 같은 LANCL1, LANCL2 또는 LANCL3에 결합하는 능력을 유지하거나, 또는 실질적으로 유지하는 분자를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 맥락에서, 반대되는 명시적 표시가 없는 경우, 용어 "구조적 유사체 (structural analogue)" 및 "기능적 유사체 (functional analogue)"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. "상응하다 (corresponds to)" 또는 "상응하는 (corresponding to)"은 아미노산 서열이 참조 아미노산 서열에 대해 실질적인 서열 유사성 또는 동일성을 나타내는 것을 의미한다. 일반적으로, 아미노산 서열은 참조 아미노산 서열의 적어도 일부에 대해 적어도 약 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 최대 100%의 서열 유사성 또는 동일성을 나타낼 것이다. 일 구체예에서, 상기 구조적 유사체는 서열 번호: 1에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 또는 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
서열 번호: 1의 적합한 구조적 유사체의 실증적 예시는 WO2019/136528에 기재되어 있으며, 그 전체 내용은 본원에 참조로 통합된다. 일 구체예에서, 상기 구조적 유사체는 하기 화학식 (I)의 펩티드를 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로 필수적으로 구성된다:
R1-CRSVEGSCG-R2 (I) (서열 번호: 3)
상기에서
R1은 YLRIVQ (서열 번호: 4), LRIVQ (서열 번호: 5), RIVQ (서열 번호: 6), IVQ (서열 번호: 7), VQ (서열 번호: 8), 및 Q (서열 번호: 9)로 구성된 그룹으로부터 선택되거나, 또는 R1은 부재하고;
R2는 F (페닐알라닌; 서열 번호: 10)이거나, 또는 R2는 부재하며,
상기 화학식 (I)의 펩티드는 2개의 시스테인 잔기들 사이의 디설파이드 결합에 의해 형성된 사이클릭 펩티드이다.
일 구체예에서, 상기 구조적 유사체는 LRIVQCRSVEGSCGF (서열 번호: 11), CRSVEGSCG (서열 번호: 12; LAT9991), CRSVEGSCGF (서열 번호: 13; LAT9991F)로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 상기 서열들 중 어느 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 또는 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로 필수적으로 구성된다.
일 구체예에서, 상기 구조적 유사체는 하기 화학식 (II)의 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로 필수적으로 구성된다:
R1-C-R-X1-X2-P-X3-X4-X5-X6-C-R2 (II) (서열 번호: 14)
상기에서,
X1, X3, X5 및 X6은 세린, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신 및 글리신으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
X2는 알라닌, 아르기닌 또는 리신이며;
X4는 글루탐산 또는 아스파르트산이고;
R1은
S (서열 번호: 15),
HS (서열 번호: 16),
GHS (서열 번호: 17),
PGHS (서열 번호: 18),
APGHS (서열 번호: 19),
EAPGHS (서열 번호: 20),
SEAPGHS (서열 번호: 21),
SSEAPGHS (서열 번호: 22),
PSSEAPGHS (서열 번호: 23),
DPSSEAPGHS (서열 번호: 24), 및
IDPSSEAPGHS (서열 번호: 25)로 구성된 그룹으로부터 선택되거나, 또는 R1은 부재하며;
R2는
S (서열 번호: 26),
SS (서열 번호: 27),
SSK (서열 번호: 28),
SSKF (서열 번호: 29),
SSKFS (서열 번호: 30),
SSKFSW (서열 번호: 31),
SSKFSWD (서열 번호: 32),
SSKFSWDE (서열 번호: 33),
SSKFSWDEY (서열 번호: 34),
SSKFSWDEYE (서열 번호: 35),
SSKFSWDEYEQ (서열 번호: 36),
SSKFSWDEYEQY (서열 번호: 37),
SSKFSWDEYEQYK (서열 번호: 38),
SSKFSWDEYEQYKK (서열 번호: 39), 및
SSKFSWDEYEQYKKE (서열 번호: 40)로 구성된 그룹으로부터 선택되거나, 또는
R2는 부재하고;
상기 화학식 (II)의 펩티드는 2개의 시스테인 잔기들 사이의 디설파이드 결합에 의해 형성된 사이클릭 펩티드이다.
일 구체예에서, 상기 구조적 유사체는 SCRSRPVESSC (서열 번호: 41; LAT9993), CRSRPVESSC (서열 번호: 42), CRSRPVESSCS (서열 번호: 43), SCRSRPVESSCS (서열 번호: 44; LAT9993S)로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열 및 상기 서열들 중 어느 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 또는 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로 필수적으로 구성된다.
다른 구체예에서, 상기 구조적 유사체는 하기 화학식 (III)의 펩티드를 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로 필수적으로 구성된다:
R1-C-R-I-X1-X2-X3-X4-N-C-R2 (III) (서열 번호: 45)
상기에서,
X1은 이소류신 (I) 및 발린 (V)으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
X2는 히스티딘 (H) 및 티로신 (Y)으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
X3은 아스파르트산 (D) 및 아스파라긴 (N)으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
X4는 아스파라긴 (N) 및 세린 (S)으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
R1은 YLKLLK (서열 번호: 46), LKLLK (서열 번호: 47), KLLK (서열 번호: 48), LLK (서열 번호: 49), LL (서열 번호: 50), K (서열 번호: 51)로 구성된 그룹으로부터 선택되거나, 또는 R1은 부재하고;
R2는 G (글리신)이거나, 또는 R2는 부재하며,
상기 화학식 (III)의 펩티드는 2개의 시스테인 잔기들 사이의 디설파이드 결합에 의해 형성된 사이클릭 펩티드이다.
일 구체예에서, 상기 구조적 유사체는 CRIIHNNNC (서열 번호: 52; LAT7771), CRIIHNNNCG (서열 번호: 53), CRIVYDSNC (서열 번호: 54), CRIVYDSNCG (서열 번호: 55)로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열 및 상기 서열들 중 어느 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 또는 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로 필수적으로 구성된다.
일 구체예에서, 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드의 구조적 유사체는 인간 인터루킨-1 수용체-관련 키나제 3 (interleukin-1 receptor-associated kinase 3: IRAK-3)으로부터 유래된다.
일 구체예에서, 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드의 구조적 유사체는 인간 프로락틴 (prolactin)으로부터 유래된다.
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 진통제를 단리 및/또는 제조하는 것으로 확장된다. 따라서, 일 구체예에서, 상기 방법은 본원에 개시된 방법에 따라 진통제로 확인된 후보 약제를 단리, 합성 또는 달리 제조하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, 기능적 변이체 및 구조적 유사체는 본원에 기재된 바와 같이, 네이티브 단백질의 아미노산 서열과 하나 이상 (예: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 초과)의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 상이한 아미노산 서열을 갖는 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 기능적 변이체 및 구조적 유사체는 네이티브 단백질의 아미노산 서열과 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 상이한 아미노산 서열을 가질 것이다. 본원에서 사용된, 용어 "보존적 아미노산 치환 (conservative amino acid substitution)"은 주어진 위치에서 아미노산을 대략 동일한 크기, 전하 및/또는 극성의 아미노산으로 대체하여 아미노산 동일성을 변경시키는 것을 지칭한다. 아미노산의 천연 보존적 치환의 예는 (통상적인 1-문자 코드로 지정된) 하기 8개의 치환 그룹을 포함한다: (1) M, I, L, V; (2) F, Y, W; (3) K, R, (4) A, G; (5) S, T; (6) Q, N; (7) E, D; 및 (8) C, S.
일 구체예에서, 기능적 변이체 및 구조적 유사체는 네이티브 단백질의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 가질 것이다. "적어도 85% (at least 85%)"에 대한 언급은 예를 들어 최적 정렬 또는 최적 적합 분석 후에, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 따라서, 일 구체예에서, 상기 서열은 예를 들어 최적 정렬 또는 최적 적합 분석 후에, 본원에서 확인된 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 86%, 바람직하게는 적어도 87%, 바람직하게는 적어도 88%, 바람직하게는 적어도 89%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 바람직하게는 적어도 92%, 바람직하게는 적어도 93%, 바람직하게는 적어도 94%, 바람직하게는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 96%, 바람직하게는 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 99% 또는 바람직하게는 100%의 서열 동일성 또는 서열 상동성을 갖는다.
본원에서 사용된, 용어 "동일성 (identity)", "유사성 (similarity)", "서열 동일성 (sequence identity)", "서열 유사성 (sequence similarity)", "상동성 (homology)", "서열 상동성 (sequence homology)" 등은 정렬된 서열의 임의의 특정 아미노산 잔기 위치에서, 아미노산 잔기들이 정렬된 서열들 사이에서 동일하다는 것을 의미한다. 본원에서 사용된, 용어 "유사성 (similarity)" 또는 "서열 유사성 (sequence similarity)"은 정렬된 서열의 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 서열들 사이에 유사한 타입임을 나타낸다. 예를 들어, 류신은 이소류신 또는 발린 잔기로 치환될 수 있다. 본원에 언급된 바와 같이, 이는 보존적 치환으로 지칭될 수 있다. 일 구체예에서, 아미노산 서열은 그 안에 함유된 임의의 아미노산 잔기의 보존적 치환에 의해 변형될 수 있고, 기능적 변이체가 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우 통증을 완화시키는 이의 능력에 있어서 이러한 변형은 비-변형 (네이티브) 펩티드/단백질과 비교하여 영향을 미치지 않는다.
일부 구체예에서, 펩티드 서열에 대한 서열 동일성은 서열을 정렬하고, 최대 상동성 퍼센트를 달성하기 위해 필요한 경우 갭 (gaps)을 도입한 후에, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환은 고려하지 않고, 상응하는 펩티드 서열의 잔기와 동일한 후보 서열내 아미노산 잔기의 퍼센트에 관한 것이다. N- 또는 C-말단 연장부, 또는 삽입은 서열 동일성 또는 상동성을 감소시키는 것으로 해석되어서는 안된다. 2개 이상의 아미노산 서열의 정렬을 수행하고, 이들의 서열 동일성 또는 상동성을 결정하기 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 2개의 아미노산 서열들의 동일성 또는 유사성의 퍼센트는 예를 들어 BLAST, FASTA, 또는 Smith-Waterman 알고리즘과 같은 알고리즘을 사용하여 용이하게 계산할 수 있다.
아미노산 서열 "유사성 (similarity)"을 결정하는 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 일반적으로, "유사성 (similarity)"은 아미노산들이 동일하거나 또는 전하 또는 소수성과 같은 유사한 화학적 및/또는 물리적 특성을 갖는 경우, 적절한 위치에서 또는 2개 이상의 펩티드 서열들의 정확한 아미노산 대 아미노산 비교를 의미한다. 소위 "유사성 퍼센트 (percent similarity)"는 비교되는 펩티드 서열들 사이에서 결정될 수 있다. 일반적으로, "동일성 (identity)"은 2개의 펩티드 서열들의 정확한 아미노산 대 아미노산 대응을 지칭한다.
2개 이상의 펩티드 서열들은 또한 이들의 "동일성 퍼센트 (percent identity)"를 결정함으로써 비교할 수 있다. 2개의 서열들의 동일성 퍼센트는 2개의 정렬된 서열들 사이의 정확한 일치 수를 더 짧은 서열의 길이로 나누고, 100을 곱한 것으로 설명될 수 있다. 핵산 서열에 대한 대략적인 정렬은 국소 상동성 알고리즘 (local homology algorithm)에 의해 제공되며, 이는 Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)이다. 이러한 알고리즘은 Dayhoff (Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA)에 의해 개발되고, Gribskov (Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763, 1986)에 의해 정규화된 스코어링 매트릭스 (scoring matrix)를 사용하여 펩티드 서열에서 사용하도록 확장될 수 있다. 서열들 간의 동일성 또는 유사성 퍼센트를 계산하는데 적합한 프로그램은 일반적으로 당해 분야에 알려져 있다.
비교 윈도우 (comparison window)를 정렬하기 위한 서열의 최적 정렬은 알고리즘의 컴퓨터 구현 (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA) 또는 선택된 다양한 방법에 의해 생성된 검사 및 최상의 정렬 (즉, 비교 윈도우에 대해 최대 상동성 퍼센트를 초래함)에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, Altschul et al., (1997, Nucl. Acids Res.25:3389)에 의해 개시된 바와 같은 프로그램의 BLAST 패밀리를 참조할 수 있다. 서열 분석의 상세한 논의는 Unit 19.3 of Ausubel et al. ("Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15)에서 찾을 수 있다.
"유사성 (similarity)"은 상기 표 1 및 2에 정의된 바와 같이 동일하거나 또는 보존적 치환을 구성하는 아미노산들의 수의 퍼센트를 지칭한다. 유사성은 서열 비교 프로그램 예컨대 GAP를 사용하여 결정할 수 있다 (Deveraux et al. 1984, Nucleic Acids Research 12: 387-395). 이러한 방식으로, 본원에 인용된 서열과 유사하거나 또는 실질적으로 상이한 길이의 서열은 갭을 정렬에 삽입함으로써 비교될 수 있으며, 이러한 갭은 예를 들어 GAP에 의해 사용되는 비교 알고리즘에 의해 결정된다.
치료 방법
본원에 언급된 바와 같이, 본 발명은 진통 특성이 최근에 부여된 사이클릭 펩티드 분자의 새로운 부류의 분자 표적의 본 발명자들의 확인 및 특성 규명에 적어도 부분적으로 근거한다. 이는 진통제 펩티드의 새로운 부류의 분자 표적이 확인되고 특성 규명되어, 신경병증성 통증을 포함하는 통증의 치료를 위한 새로운 치료제를 확인 및/또는 디자인할 수 있게 한 첫 사례이다. 따라서, 본원에 개시된 일 양상에서, 대상체에서 통증을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 1 (LANCL1)에 결합하는 약제의 치료적으로 유효한 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 약제는 인간 성장 호르몬 또는 이의 비-인간 상동체 유래의 펩티드가 아니며, 상기 약제는 LANCL1에의 결합에 대해 서열 번호: 1 (YLRIVQCRSVEGSCGF)을 포함하는 펩티드와 경쟁한다.
당업자가 알고 있는 바와 같이, 통증은 많은 가능한 원인이 있다. 그러므로, 본원에서 원인에 관계없이 통증의 치료 또는 예방이 고려된다는 것을 이해해야 한다. 일부 구체예에서, 통증은 조직에 대한 상해 또는 외상, 신경에 영향을 미치는 질병 또는 병태 (예: 1차 신경병증) 및/또는 전신 질환에 의해 야기된 통증 (2차 신경병증)의 결과이며, 이의 실증적 예시는 당뇨병성 신경병증; 대상포진 (띠헤르페스)-관련 신경병증; 섬유 근육통; 다발 경화증, 뇌졸중, 척수 손상; 만성 수술 후 통증, 환상 사지 통증, 파킨슨병; 요독증-관련 신경병증; 아밀로이드증 신경병증; HIV 감각 신경병증; 유전성 운동 및 감각 신경병증 (HMSN); 유전성 감각 신경병증 (HSN); 유전성 감각 및 자율 신경병증; 궤양-절단을 동반한 유전성 신경병증; 니트로푸란토인 신경병증; 순대양 신경병증; 영양 결핍으로 인한 신경병증, 신부전으로 인한 신경병증 및 복합 부위 통증 증후군을 포함한다. 통증을 유발할 수 있는 병태의 다른 실증적 예시는 타이핑이나 또는 조립 라인에서의 작업과 같은 반복적인 활동, 말초 신경병증을 유발하는 것으로 알려진 약물 예컨대 몇몇 항레트로바이러스 약물 ddC (잘시타빈) 및 ddI (디다노신), 항생제 (크론병에 사용되는 항생제인 메트로니다졸, 결핵에 사용되는 이소니아지드), 금 화합물 (류마티스 관절염에 사용), 일부 화학요법 약물 (예컨대 빈크리스틴 등) 및 다른 여러 약물을 포함한다. 알코올, 납, 비소, 수은 및 유기인산염 살충제를 포함하는 화학 화합물이 또한 말초 신경병증을 유발하는 것으로 알려져 있다. 일부 말초 신경병증은 감염 과정 (예컨대 Guillain-Barre 증후군)과 관련이 있다. 신경병증성 통증의 다른 실증적 예시는 열적 또는 기계적 통각과민증, 열적 또는 기계적 이질통증, 당뇨병성 통증, 구강에 영향을 미치는 신경병증성 통증 (예: 삼차신경 신경병증성 통증, 비정형성 치통 (환상 치아 통증), 구강 작열감 증후군), 섬유 근육통 및 포착 통증 (entrapment pain)을 포함한다.
본원에 개시된 일 구체예에서, 상기 통증은 암 통증; 치통; 내장 통증 (visceral pain) 예컨대 췌장염; 골반 통증; 열 및 화학약품 화상; 염증, 또는 박테리아, 진균 또는 바이러스 감염과 관련된 통증; 대사 질환, 식욕 부진, 비만 및 비만 관련 병태와 관련된 통증, 내당능 장애 및 당뇨병과 관련된 통증; 골관절염과 관련된 통증; 근골격계 및 신경근 질환과 관련된 통증; 손상된 연골 세포, 프로테오글리칸 또는 콜라겐 생성 또는 품질을 가진 병태와 관련된 통증; 손상된 연골 조직 형성 또는 품질을 가진 병태와 관련된 통증; 손상된 근육, 인대 또는 힘줄 질량, 형태 또는 기능을 가진 병태와 관련된 통증; 근육 또는 결합 조직에 영향을 미치는 염증, 외상 또는 유전자 이상과 관련된 병태 및 골 질환과 관련된 통증; 근이영양증과 관련된 통증, AIDS 소모 증후군과 관련된 통증, 대상포진 (띠헤르페스)-관련 신경병증과 관련된 통증; 섬유 근육통; 다발 경화증, 뇌졸중, 척수 손상; 만성 수술 후 통증, 환상 사지 통증, 파킨슨병; 요독증-관련 신경병증; 아밀로이드증 신경병증; HIV 감각 신경병증; 유전성 운동 및 감각 신경병증 (HMSN); 유전성 감각 신경병증 (HSN); 유전성 감각 및 자율 신경병증; 궤양-절단을 동반한 유전성 신경병증; 니트로푸란토인 신경병증; 순대양 신경병증; 영양 결핍으로 인한 신경병증, 신부전으로 인한 신경병증, 삼차신경 신경병증성 통증, 비정형성 치통 (환상 치아 통증), 구강 작열감 증후군, 복합 부위 통증 증후군, 반복 사용 긴장성 손상 (repetitive strain injury), 이질통, 감각과민, 통각과민, 작열통 및 전격 통증 (shooting pain), 약물-유도 말초 신경병증 (예: 화학-요법 유도된 신경병증), 및 감염과 관련된 말초 신경병증으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 상기 통증은 무감각, 무력증 및 반사 소실을 동반할 수 있다. 상기 통증은 심각하고, 장애를 일으킬 수 있다. "통각과민증 (hyperalgesia)"은 통상 고통스러운 자극에 대해 반응이 증가된 것을 의미한다. 통각과민 병태는 통상 고통스럽지 않은 자극으로 인한 통증과 관련된 병태이다. 용어 "감각과민증 (hyperesthesia)"은 과도한 신체 민감도, 특히 피부 민감도를 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "이질통증 (allodynia)"은 비-유해 자극 (non-noxious stimulus)으로 인한 통증; 즉, 통상 통증을 유발하지 않는 자극으로 인한 통증을 지칭한다. 이질통증의 실증적 예시는 열적 이질통증 (차갑거나 또는 뜨거운 자극으로 인한 통증), 촉각 이질통증 (가볍게 누르거나 또는 접촉으로 인한 통증), 기계적 이질통증 (무겁게 누르거나 또는 핀프릭 (pinprick)으로 인한 통증) 등을 포함한다.
통증은 급성 또는 만성일 수 있으며, 이러한 맥락에서, 통증의 시간 경과는 이의 근본 원인에 따라 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 외상에서, 통증 증상의 발병은 급성이거나, 또는 갑작스러울 수 있고; 그러나, 가장 심각한 증상은 경시적으로 발전하고, 수년 동안 지속될 수 있다. 몇 주 내지 몇 개월에 걸친 만성 시간 경과는 통상 유해하거나, 또는 대사성 통증 증후군을 나타낸다. 고통스런 당뇨병성 신경병증 또는 대부분의 유전성 신경병증 또는 만성 염증성 탈수초 다발성 신경병증 (chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy: CIDP)으로 불리는 병태로 발생하는 만성적이고, 서서히 진행되는 통증 증후군은 수년에 걸친 시간 경과를 가질 수 있다. 증상이 재발 및 완화되는 신경병증성 병태는 길랭-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome)을 포함한다.
일부 구체예에서, 신경병증성 통증은 섬유 근육통 또는 과민성 장 증후군과 같은 신경근 과민증을 특징으로 하는 병태로부터 기인한다.
다른 구체예에서, 신경병증성 통증은 신경 과민증을 초래하는 이상 신경 재생 (aberrant nerve regeneration)과 관련된 장애로부터 기인한다. 이러한 장애는 유방통 (breast pain), 간질성 방광염 (interstitial cystitis), 여성 외음부통 (vulvodynia) 및 암 화학요법-유발 신경병증을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 통증은 수술, 수술 전 통증 및 수술 후 통증, 구체적으로 수술 후 통증과 관련이 있다.
일부 구체예에서, 상기 통증은 외상 또는 조직 손상, 화학약품 또는 열 화상, 또는 내장 통증과 관련된다.
일 구체예에서, 상기 통증은 신경병증성 통증이다. 이론 또는 특정 적용 방식에 의해 얽매이지 않고, 신경병증성 통증은 전형적으로 신경 조직 또는 뉴런 자체에 대한 상해 또는 질병에 의한 손상 또는 신경 조직내 기능장애로 인한 통증을 특징으로 한다. 상기 통증은 말초, 중추 또는 이들의 조합일 수 있으며; 다시 말해서, 상기 용어 "신경병증성 통증 (neuropathic pain)"은 전형적으로 말초 또는 중추 신경계에서 1차 병변 또는 기능장애에 의해 개시되거나 또는 야기되는 임의의 통증 증후군을 지칭한다. 신경병증성 통증은 또한 전형적으로 오피오이드와 같은 일반적인 진통제에 의한 치료에 효과적으로 반응하지 않는다는 점에서 구별될 수 있다. 대조적으로, 통각수용기성 통증은 조직에 손상 또는 상해를 유발할 수 있는 유해하거나 또는 잠재적으로 유해한 자극에 의해 통각수용기의 자극으로부터 기인하는 통증을 특징으로 한다. 통각수용기성 통증은 전형적으로 오피오이드와 같은 일반적인 진통제에 반응한다.
신경병증성 통증의 타입은 당업자에게 친숙할 것이며, 이의 실증적 예시는 당뇨병성 신경병증; 대상포진 (띠헤르페스)-관련 신경병증; 섬유 근육통; 다발 경화증, 뇌졸중, 척수 손상; 만성 수술 후 통증, 환상 사지 통증, 파킨슨병; 요독증-관련 신경병증; 아밀로이드증 신경병증; HIV 감각 신경병증; 유전성 운동 및 감각 신경병증 (HMSN); 유전성 감각 신경병증 (HSN); 유전성 감각 및 자율 신경병증; 궤양-절단을 동반한 유전성 신경병증; 니트로푸란토인 신경병증; 순대양 신경병증; 영양 결핍으로 인한 신경병증, 신부전으로 인한 신경병증, 삼차신경 신경병증성 통증, 비정형성 치통 (환상 치아 통증), 구강 작열감 증후군, 복합 부위 통증 증후군, 반복 사용 긴장성 손상, 편두통, 약물-유도 말초 신경병증 (예: 화학요법 유도된 신경병증), 및 감염과 관련된 말초 신경병증, 만성 요통, 복합 부위 통증 증후군, 턱관절 장애 (temporomandibular joint disorders), 편평 태선 (Lichen Planus) 및 반사 교감신경 이영양증을 포함한다.
따라서, 일 구체예에서, 상기 신경병증성 통증은 당뇨병성 신경병증; 대상포진 (띠헤르페스)-관련 신경병증; 섬유 근육통; 다발 경화증, 뇌졸중, 척수 손상; 만성 수술 후 통증, 환상 사지 통증, 파킨슨병; 요독증-관련 신경병증; 아밀로이드증 신경병증; HIV 감각 신경병증; 유전성 운동 및 감각 신경병증 (HMSN); 유전성 감각 신경병증 (HSN); 유전성 감각 및 자율 신경병증; 궤양-절단을 동반한 유전성 신경병증; 니트로푸란토인 신경병증; 순대양 신경병증; 영양 결핍으로 인한 신경병증, 신부전으로 인한 신경병증, 삼차신경 신경병증성 통증, 비정형성 치통 (환상 치아 통증), 구강 작열감 증후군, 복합 부위 통증 증후군, 반복 사용 긴장성 손상, 편두통, 약물-유도 말초 신경병증 (예: 화학요법 유도된 신경병증), 및 감염과 관련된 말초 신경병증, 만성 요통, 복합 부위 통증 증후군, 턱관절 장애, 편평 태선 및 반사 교감신경 이영양증을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 약제는 인간 인터루킨-1 수용체-관련 키나제 3 (IRAK-3) 유래의 사이클릭 펩티드는 아니다.
일 구체예에서, 상기 약제는 인간 프로락틴 유래의 사이클릭 펩티드는 아니다.
본 개시내용은 또한 보조 요법 (adjunct therapies)으로 확장된다. 따라서, 일 구체예에서, 상기 방법은 추가의 진통제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 추가의 진통제는 (i) LANCL1에 결합하는 약제, 또는 (ii) LANCL1에의 결합에 대해 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드와 경쟁하는 약제는 아니다. 적합한 진통제는 당업자에게 친숙할 것이며, 통각수용기성 통증 및/또는 신경병증성 통증을 치료하는 약제를 포함할 수 있다. 적합한 진통제의 실증적 예시는 모르핀, 펜타닐, 트라마돌, 코데인, 디하이드로코데인, 하이드로코돈, 아세틸디하이드로코데인, 옥시코돈, 옥시모르폰 및 부프레노르핀, 및 비-스테로이드성 항-염증제 (NSAID)를 포함한다. 적합한 NSAID의 실증적 예시는 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 아세트아미노펜, 디플루니살, 살살레이트, 페나세틴, 페노프로펜, 케토프로펜, 플루르비프로펜, 옥사프로진, 록소프로펜, 인도메타신, 설린닥, 에토돌락, 케토롤락, 디클로페낙, 나부메톤, 메페남산, 메클로페남산, 플루페남산, 톨페남산, 셀레콕시브, 파레콕시브, 루마리콕시브, 에토리콕시브, 피로콕시브, 리메술리드 (rimesulide) 및 리코펠로네안 (licofelonean)을 포함한다.
일 구체예에서, 추가의 진통제는 대상체에서 통각수용기성 통증을 완화시킬 수 있는 약제를 포함한다. 일 구체예에서, 추가의 진통제는 모르핀, 펜타닐, 트라마돌, 코데인, 디하이드로코데인, 하이드로코돈, 아세틸디하이드로코데인, 옥시코돈, 옥시모르폰 및 부프레노르핀, 및 비-스테로이드성 항-염증제 (NSAID)로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 추가의 진통제는 비-스테로이드성 항-염증제 (NSAID)이다. 바람직한 일 구체예에서, NSAID는 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 아세트아미노펜, 디플루니살, 살살레이트, 페나세틴, 페노프로펜, 케토프로펜, 플루르비프로펜, 옥사프로진, 록소프로펜, 인도메타신, 설린닥, 에토돌락, 케토롤락, 디클로페낙, 나부메톤, 메페남산, 메클로페남산, 플루페남산, 톨페남산, 셀레콕시브, 파레콕시브, 루마리콕시브, 에토리콕시브, 피로콕시브, 리메술리드 및 리코펠로네안으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 추가의 진통제는 LANCL1에 결합하는 약제는 아니다.
용어 "치료하는 (treating)", "치료 (treatment)" 및 유사어는 이질통증 또는 통각과민증과 같은 통증의 하나 이상의 증상을 포함한, 통증의 완화, 감소, 경감, 개선 또는 달리 억제를 의미하기 위해, 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 용어 "방지하다 (prevent)", "방지하는 (preventing)", "예방 (prophylaxis)", "예방적 (prophylactic)", "방지적 (preventative)" 및 유사어는 통증 발병 또는 통증 발생 위험의 방지 또는 지연을 의미하기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다.
용어 "치료하는 (treating)", "치료 (treatment)" 및 유사어는 또한 적어도 일정 기간 동안 통증의 영향을 완화, 감소, 경감, 개선 또는 달리 억제하는 것을 포함한다. 용어 "치료하는", "치료" 및 유사어는 통증 또는 이의 증상이 영구적으로 완화, 감소, 경감, 개선 또는 달리 억제되는 것을 의미하지 않으므로, 따라서 통증 또는 이의 증상의 일시적인 완화, 감소, 경감, 개선 또는 달리 억제를 포함하는 것으로 이해해야 한다.
본원에 언급된 바와 같이, 본 발명은 (진통제 이외의) 치료제 특성이 부여된 사이클릭 펩티드 분자의 새로운 부류의 분자 표적의 본 발명자들의 확인 및 특성 규명에 적어도 부분적으로 근거한다. 따라서, 본원에 개시된 다른 양상에서, 대상체에서 병태를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 1 (LANCL1)에 결합하는 약제의 치료적으로 유효한 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 약제는 인간 성장 호르몬 또는 이의 비-인간 상동체 유래의 펩티드가 아니며, 상기 약제는 LANCL1에의 결합에 대해 서열 번호: 1 (YLRIVQCRSVEGSCGF)을 포함하는 사이클릭 펩티드와 경쟁하고, 상기 병태는 근감소증, 내당능 장애, 당뇨병, 비만, 대사 질환 및 비만-관련 병태, 신경병증성 통증, 골관절염, 근육 장애, 소모 장애, 악액질, 식욕 부진, AIDS 소모 증후군, 근이영양증, 신경근 질환, 운동 신경 질환, 신경근 접합 질환, 염증성 근병증, 화상, 상해 또는 외상, LDL 콜레스테롤 상승과 관련된 병태, 손상된 연골 세포, 프로테오글리칸 또는 콜라겐 생성 또는 품질과 관련된 병태, 손상된 연골 조직 형성 또는 품질과 관련된 병태, 손상된 근육, 인대 또는 힘줄 질량, 형태 또는 기능과 관련된 병태, 근육 또는 결합 조직에 영향을 미치는 염증, 외상 또는 유전자 이상과 관련된 병태, 호흡기 병태 및 골 질환으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
일 구체예에서, 상기 약제는 인터루킨-1 수용체-관련 키나제 3 (IRAK-3) 유래의 펩티드는 아니다. 일 구체예에서, 상기 약제는 인간 프로락틴 유래의 펩티드는 아니다. 일 구체예에서, 상기 병태는 호흡기 병태이다. 호흡기 병태의 실증적 예시는 만성 폐쇄성 폐질환, 천식, 낭포성 섬유증 및 폐암 및 기도 감염을 포함한다. 따라서, 일 구체예에서, 호흡기 병태는 만성 폐쇄성 폐 질환, 천식, 낭포성 섬유증 및 폐암 및 기도 감염으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 호흡기 병태는 기도 감염이다.
기도 감염 (Respiratory tract infection: RTI)은 전형적으로 상기도 또는 하기도의 임의의 감염성 질환으로 정의된다. 상기도 감염 (Upper respiratory tract infections: URTIs)에는 감기, 후두염, 인두염/편도선염, 급성 비염, 급성 비부비동염 및 급성 중이염을 포함한다. 하기도 감염 (Lower respiratory tract infections: LRTIs)에는 급성 기관지염, 세기관지염, 폐렴 및 기관염을 포함한다. 통상 1차 진료를 받는 성인 및 어린이에게 RTI에 대해 항생제가 처방된다. RTI의 일반 진료에서 모든 항생제 처방의 60%를 차지하는 이유이며, 이는 의료 시스템에 대한 상당한 비용을 구성한다 (NICE Clinical Guidelines, No. 69; Centre for Clinical Practice at NICE (UK), London: National Institute for Health and Clinical Excellence (UK); 2008).
인간 및 비-인간 대상체에서 상기도 및/또는 하기도의 감염을 일으키는 병원체는 당업자에게 알려져 있으며, 박테리아 및 바이러스를 포함하고, 이의 실증적 예시는 Charlton et al. (Clinical Microbiology Reviews; 2018,　32　(1): e00042-18), Popescu et al. (Microorganisms. 2019; 7(11): 521) 및 Kikkert, M. (J Innate Immun. 2020; 12(1): 4-20)에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 통합된다. 일 구체예에서, 기도 감염은 바이러스 감염이다.
인간 및 비-인간 대상체에서 기도 (상기도 및/또는 하기도) 감염을 일으키는 바이러스는 당업자에게 알려져 있으며, 이의 실증적 예시는 피코르나바이러스 (picornavirus), 코로나바이러스 (coronavirus), 인플루엔자 바이러스 (influenza virus), 파라인플루엔자 바이러스 (parainfluenza virus), 호흡기 세포융합 바이러스 (respiratory syncytial virus), 아데노바이러스 (adenovirus), 엔테로바이러스 (enterovirus), 및 메타뉴모바이러스 (metapneumovirus)를 포함한다. 따라서, 본원에 개시된 일 구체예에서, 상기 바이러스는 피코르나바이러스, 코로나바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 아데노바이러스, 엔테로바이러스, 및 메타뉴모바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다. 다른 구체예에서, 바이러스는 코로나바이러스이다. 기도 감염을 일으키는 코로나바이러스의 실증적 예시는 당업자에게 친숙할 것이며, 이의 실증적 예시는 Zhu N et al., (2019.　N Engl J Med.　2020) 및 US 특허공개 제20190389816호에 이전에 기재된 바와 같이, SARS-CoV-2를 포함하고, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 통합된다. 일 구체예에서, 바이러스는 SARS-CoV-2이다.
본원에 기재된 바와 같이, 방법, 조성물 및 이의 용도는 기도 감염을 악화시킬 수 있는 기저 의학적 병태가 있는 대상체를 포함하여, 기도 감염을 치료하는데 특히 유용할 수 있다. 이러한 기저 병태는 당업자에게 알려져 있으며, 이의 실증적 예시는 만성 폐쇄성 폐 질환, 천식, 낭포성 섬유증, 폐기종 및 폐암을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 병태는 만성 폐쇄성 폐 질환, 천식, 낭포성 섬유증, 기도 감염, 폐암 및 이들 중 임의의 것의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 대상체는 치료 (예: 화학요법, 방사선 요법에 의한) 또는 그렇지 않은 경우 (예: HIV 감염에 의한) 결과로 면역저하된다. 일 구체예에서, 기도 감염은 바이러스 감염이다.
본원에서 사용된, 용어 "투여된 (administered)"은 원하는 부위에서 화합물의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의해, 본원에 기재된 약제를 대상체로 배치하는 것을 지칭한다. 본원에 기재된 약제는 대상체에서 효과적인 치료를 초래하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있으며, 즉 투여는 조성물의 적어도 일부가 전달되는 대상체의 원하는 위치로 전달되게 한다. 예시되는 투여 방식은 주사, 주입, 점적 또는 섭취를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. "주사 (injection)"는 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 뇌실내, 피막내 (intracapsular), 안와내, 심장내, 피부내, 복강내, 기관내, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 뇌척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
용어 "동시에 투여 (administration concurrently)" 또는 "동시에 투여하는 (administering concurrently)" 또는 "병용-투여하는 (co-administering)" 및 유사어는 2개 이상의 활성제를 함유하는 단일 조성물의 투여, 또는 각 활성제를 개별 조성물로서 및/또는 개별 경로에 의해 동시적인 (contemporaneously) 또는 동시에 (simultaneously) 또는 이러한 모든 활성제가 단일 조성물로 투여되는 경우 수득된 결과와 동등한 효과적 결과를 수득하는데 충분히 짧은 시간내에 순차적 전달에 의한 투여를 지칭한다. "동시에 (simultaneously)"는 활성제들이 실질적으로 동시에, 바람직하게는 동일한 제제로 함께 투여되는 것을 의미한다. "동시적인 (contemporaneously)"은 활성제들이 시간적으로 가깝게 투여되는 것을 의미하며, 예를 들어, 하나의 활성제는 다른 활성제에 앞서 또는 이후에, 약 1분 내지 약 1일 이내에 투여된다. 임의의 동시적인 시간 (contemporaneous time)이 유용하다. 그러나, 동시에 투여되지 않는 경우, 활성제는 약 1분 내지 약 8시간 이내, 적합하게는 약 1시간 이내 내지 약 4시간 내에 투여된다. 동시로 투여되는 경우, 활성제는 대상체의 동일한 부위에 적절하게 투여된다. 용어 "동일한 부위 (same site)"는 정확한 위치를 포함하지만, 약 0.5 내지 약 15센티미터 이내, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 5센티미터 이내일 수 있다. 본원에서 사용된, 용어 "개별 (separately)"은 활성제가 간격을 두고, 예를 들어 약 1일 내지 몇 주 또는 몇 개월의 간격으로 투여되는 것을 의미한다. 활성제는 어느 순서로든 투여될 수 있다. 본원에서 사용된, 용어 "순차적 (sequentially)"은 활성제가 순서대로, 예를 들어 분, 시간, 일 또는 주의 간격 또는 간격들로 투여되는 것을 의미한다. 적절한 경우 활성제는 규칙적인 반복 주기로 투여될 수 있다. 본원에서 사용된, 용어 "병태 (condition)"는 생체 기능의 수행을 방해하거나 또는 수정하는, 살아있는 동물 또는 그 부분들 중 하나의 정상 상태의 손상을 구성하는, 정상으로부터 해부학적 및 생리학적으로 벗어난 것을 포함한다.
용어 "감소하다 (decrease)", "줄어들다 (reduce)" 또는 "억제하다 (inhibit)" 및 이들의 문법적 등가물은 모두 본원에서 통계적으로 유의미한 양만큼의 감소를 의미하기 위해 일반적으로 사용된다. 그러나 의심의 여지를 없애기 위해, 용어 "감소하다", "줄어들다" 또는 "억제하다" 및 이들의 문법적 등가물은 참조 수준과 비교하여 적어도 10% 만큼 감소, 예를 들어 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 만큼의 감소를 의미하며, 여기서 감소는 100% 미만이다. 일 구체예에서, 감소는 100% 감소 (예: 참조 샘플과 비교하여 수준이 없음), 또는 참조 수준과 비교하여 10-100% 사이의 임의의 감소를 포함한다.
용어 "증가하다 (increase)", "증진시키다 (enhance)" 또는 "활성화하다 (activate)" 및 이들의 문법적 등가물은 모두 본원에서 통계적으로 유의미한 양만큼의 증가를 의미하기 위해 일반적으로 사용되며; 의심의 여지를 없애기 위해, 용어 "증가하다", "증진시키다" 또는 "활성화하다" 및 이들의 문법적 등가물은 참조 수준과 비교하여 적어도 10%의 증가, 예를 들어 참조 수준과 비교하여 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 최대 100%의 증가를 포함하거나, 또는 10-100% 사이의 임의의 증가, 또는 참조 수준과 비교하여 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배, 또는 적어도 약 10배 증가, 또는 2배 내지 10배 사이의 임의의 증가 또는 초과의 증가를 의미한다.
문구 "치료적으로 유효한 양 (therapeutically effective amount)"은 전형적으로 발병을 지연시키거나 또는 이의 진행을 억제하거나, 또는 치료할 통증의 발병 또는 진행을 모두 정지시키는 것을 포함하는, 원하는 반응을 달성하는데 필요한 양을 의미한다. 당업자는 펩티드의 치료적으로 유효한 양이 몇몇 요인에 따라 가변될 수 있음을 이해할 것이고, 이의 실증적 예시는 치료할 대상체의 건강 및 신체 상태, 치료할 대상체의 분류학적 그룹, 치료할 통증의 중증도, 투여할 조성물의 제제, 투여 경로 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
치료적으로 유효한 양은 전형적으로 당업자가 일상적인 시험을 통해 결정할 수 있는 비교적 넓은 범위내에 속할 것이다. 대상체에게 투여하기 위해 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 치료제의 적합한 치료적으로 유효한 양의 실증적 예시는 체중 1 kg당 약 0.001 mg 내지 체중 1 kg당 약 1 g, 바람직하게는 체중 1 kg당 약 0.001 mg 내지 체중 1 kg당 약 50 g, 더 바람직하게는 체중 1 kg당 약 0.01 mg 내지 체중 1 kg당 약 1.0 mg을 포함한다. 본원에 개시된 일 구체예에서, 치료적으로 유효한 양은 투여량 (dose) 당 체중 1 kg당 약 0.001 mg 내지 체중 1 kg당 약 1 g (예: 체중 1 kg당 0.001mg/kg, 0.005mg/kg, 0.01mg/kg, 0.05mg/kg, 0.1mg/kg, 0.15mg/kg, 0.2mg/kg, 0.25mg/kg, 0.3mg/kg, 0.35mg/kg, 0.4mg/kg, 0.45mg/kg, 0.5mg/kg, 0.5mg/kg, 0.55mg/kg, 0.6mg/kg, 0.65mg/kg, 0.7mg/kg, 0.75mg/kg, 0.8mg/kg, 0.85mg/kg, 0.9mg/kg, 0.95mg/kg, 1mg/kg, 1.5mg/kg, 2mg/kg, 2.5mg/kg, 3mg/kg, 3.5mg/kg, 4mg/kg, 4.5mg/kg, 5mg/kg, 5.5mg/kg, 6mg/kg, 6.5mg/kg, 7mg/kg, 7.5mg/kg, 8mg/kg, 8.5mg/kg, 9mg/kg, 9.5mg/kg, 10mg/kg, 10.5mg/kg, 11mg/kg, 11.5mg/kg, 12mg/kg, 12.5mg/kg, 13mg/kg, 13.5mg/kg, 14mg/kg, 14.5mg/kg, 15mg/kg, 15.5mg/kg, 16mg/kg, 16.5mg/kg, 17mg/kg, 17.5mg/kg, 18mg/kg, 18.5mg/kg, 19mg/kg, 19.5mg/kg, 20mg/kg, 20.5mg/kg, 21mg/kg, 21.5mg/kg, 22mg/kg, 22.5mg/kg, 23mg/kg, 23.5mg/kg, 24mg/kg, 24.5mg/kg, 25mg/kg, 25.5mg/kg, 26mg/kg, 26.5mg/kg, 27mg/kg, 27.5mg/kg, 28mg/kg, 28.5mg/kg, 29mg/kg, 29.5mg/kg, 30mg/kg, 35mg/kg, 40mg/kg, 45mg/kg, 50mg/kg, 55mg/kg, 60mg/kg, 65mg/kg, 70mg/kg, 75mg/kg, 80mg/kg, 85mg/kg, 90mg/kg, 95mg/kg, 100mg/kg, 105mg/kg, 110mg/kg 등)이다. 일 구체예에서, 치료적으로 유효한 양은 체중 1 kg당 약 0.001 mg 내지 약 50 mg이다. 일 구체예에서, 치료적으로 유효한 양은 체중 1 kg당 약 0.01 mg 내지 약 1.0 mg이다. 투여 요법은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 여러 분할된 투여량을 매일, 매주, 매월 또는 다른 적절한 시간 간격으로 투여하거나, 또는 상황의 긴급성에 따라 용량을 비례적으로 줄일 수 있다.
용어 "진통 (analgesia)"은 본원에서 통증 감각의 부재를 포함한, 통증 인지가 감소된 상태 뿐만 아니라 유해 자극에 대한 감수성이 감소 또는 부재인 상태를 설명하기 위해 사용된다. 이러한 통증 인지가 감소 또는 부재인 상태는 당해 분야에서 일반적으로 이해되는 바와 같이, 전형적으로 통증-조절제 또는 통증-조절제들의 투여에 의해 유도되고, 의식 상실 없이 발생된다. 화합물이 진통 효과를 제공할 수 있는지 여부를 결정하는 적절한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 이의 실증적 예시는 만성 수축 손상 (chronic constriction injury), 척수 신경 결찰 (spinal nerve ligation) 및 부분 좌골 신경 결찰 (partial sciatic nerve ligation)과 같은 신경병증성 통증의 동물 모델 (Bennett et al. (2003); Curr. Protoc. Neurosci., Chapter 9, Unit 9.14 참조) 및 포르말린-, 카라기난- 또는 CFA (complete Freund's adjuvant)-유도 염증성 통증과 같은 통각수용기성 통증의 동물 모델의 사용을 포함한다. 다른 적절한 통증 모델은 Gregory et al. (2013, J. Pain.; 14(11); ":An overview of animal models of pain: disease models and outcome measures")에서 논의되었다.
본원에서 사용된, 용어 "대상체 (subject)"는 통증의 치료 또는 예방을 원하는 포유동물 대상체를 지칭한다. 적절한 대상체의 실증적 예시는 영장류, 특히 인간, 반려 동물 예컨대 고양이 및 개 등, 사역 동물 예컨대 말, 당나귀 등, 가축 예컨대 양, 소, 염소, 돼지 등, 실험실 테스트 동물 예컨대 토끼, 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터 등, 및 포획 야생 동물 예컨대 동물원 및 야생동물 공원의 동물, 사슴, 딩고 등을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 대상체는 인간이다. 다른 구체예에서, 상기 대상체는 개, 고양이 및 말로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
본원에서 대상체에 대한 언급은 상기 대상체가 통증 또는 이의 증상을 갖는 것을 의미할 뿐만 아니라, 통증 또는 이의 증상의 발병 위험이 있는 대상체를 포함하는 것으로 이해해야 한다. 일 구체예에서, 대상체는 통증 또는 이의 증상을 가지고 있다 (즉, 경험하고 있다). 다른 구체예에서, 대상체는 통증 또는 이의 증상을 치료 시에는 경험하고 있지 않지만, 통증 또는 이의 증상이 발병할 위험이 있다. 실증적 예시에서, 대상체는 통증의 발병 위험이 있는 질병 또는 병태를 가지며, 예를 들어 당뇨병 관리가 불량하면 당뇨병성 신경병증이 초래될 수 있다. 다른 구체예에서, 대상체는 대상포진 후 신경통을 초래할 수 있는, 대상포진 (띠헤르페스)과 같은 통증을 초래할 수 있는 질병 또는 병태를 갖고 있다.
일 구체예에서, 통증은 편두통이다. 편두통은 전형적으로 4-72시간 동안 지속되는 일시적, 재발성 치료불능 두통을 특징으로 하며, 이는 오심, 구토, 고성 공포증 (phonophobia), 광선 공포증 (photophobia), 언어 장애 (speech disturbances) 및 시각 전조 (visual auras)와 같은 다른 증상을 동반할 수 있다. 편두통 발작은 전형적으로 4단계로 나뉜다: 1) 전구기 (premonitory stage), 두통이 있기 몇 시간 전에 발생하고, 피로, 과민성, 집중력 장애, 기분 변화, 하품, 목 결림, 고성 공포증 및/또는 오심과 같은 증상을 특징으로 함; 2) 전조기 (aura phase), 감각 또는 인지 장애의 증상이 있음; 3) 두통기 (headache phase), 박동성 통증 (throbbing pain), 오심, 구토 및 감각 민감성을 포함함; 및 4) 후구증상기 (postdrome phase), 쇠약, 인지 장애, 기분 변화 및 위장관 증상과 같은 증상과 함께, 두통이 해소되고 수시간 내지 수일 후에 발생함.
편두통은 일시적 (급성) 또는 만성일 수 있다. The International Classification of Headache Disorders (3rd edition, The International Headache Society, 2018)에서 정의한 바와 같이, 편두통이 1개월에 15일 미만으로 발생하는 경우, 일시적 (episodic)인 것으로 간주되는 반면에, 만성 (chronic) 편두통은 전형적으로 3개월 동안 1개월에 15일 이상 두통이 발생한 경우로, 이중 8일 이상이 편두통인 것으로 정의된다.
본원에서는 원인에 관계없이 편두통의 치료 또는 예방이 고려되는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구체예에서, 편두통은 무감각, 쇠약 및/또는 반사 상실을 동반한다. 일부 구체예에서, 편두통은 중증 및/또는 치료불능 통증을 동반한다. 본원에서 대상체에 대한 언급은 상기 대상체가 편두통 또는 이의 증상을 갖는 것을 의미할 뿐만 아니라, 편두통 또는 이의 증상의 발병 위험이 있는 대상체를 포함하는 것으로 이해해야 한다. 일 구체예에서, 대상체는 편두통 또는 이의 증상을 가지고 있다 (즉, 경험하고 있다). 다른 구체예에서, 대상체는 편두통 또는 이의 증상을 치료 시에는 경험하고 있지 않지만, 편두통 또는 이의 증상이 발병할 위험이 있다. 일 구체예에서, 대상체는 만성 편두통을 앓고 있다. 다른 구체예에서, 대상체는 일시적 (급성) 편두통을 앓고 있다.
본원에 개시된 치료제 (즉, LANCL1에 결합할 수 있고, 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 상동체와 결합에 대해 경쟁할 수 있음)는 본원에 기재된 바와 같이 치료적으로 유효한 양의 펩티드를 대상체에게 전달할 수 있는 임의의 적절한 경로로 대상체에게 투여할 수 있다. 적절한 투여 경로가 당업자에게 알려져 있으며, 이의 실증적 예시는 장내 (enteral) 투여 경로 (예: 경구 및 직장), 비경구 투여 경로, 전형적으로 주사 또는 미세 주사에 의한 비경구 투여 경로 (예: 근육내, 피하, 정맥내, 경막외 (epidural), 관절내, 복강내, 수조내 (intracisternal) 또는 경막내 (intrathecal)) 및 국소 (경피 또는 경점막) 투여 경로 (예: 협측, 설하, 질, 비강내 또는 흡입)를 포함한다. 본원에 개시된 치료제는 또한 장기간에 걸쳐 활성제(들)의 제어 방출을 제공하기 위해 제어 방출 투여 제형으로서 대상체에게 적절하게 투여될 수 있다. 용어 "제어 방출 (controlled release)"은 전형적으로 활성제(들)의 방출이 일정 기간 (예: 약 8시간 내지 최대 약 12시간, 최대 약 14시간, 최대 약 16시간, 최대 약 18시간, 최대 약 20시간, 최대 1일, 최대 1주일, 최대 1개월 또는 1개월 초과)에 걸쳐 활성제의 농도를 일정하게 또는 실질적으로 일정하게 대상체에게 제공하는 것을 의미한다. 상기 활성제(들)의 제어 방출은 필요에 따라, 투여 후 몇 분내에 또는 투여 후 지연 기간 (지체 시간)이 만료된 후 시작될 수 있다. 적절한 제어 방출 투여 제형은 당업자에게 알려져 있으며, 이의 실증적 예시는 Anal, A. K. (2010; Controlled-Release Dosage Forms. Pharmaceutical Sciences Encyclopedia. 11:1-46)에 기재되어 있다.
이론 또는 특정 적용 방식에 구속되지 않고, 통증이 국소 또는 전신인지에 기초하여 투여 경로를 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 통증이 국소인 경우, 상기 약제를 이환 부위 또는 그에 바로 인접한 부위에 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 통증이 관절 (예: 목, 무릎, 팔꿈치, 어깨, 엉덩이 등)에 있는 경우, 상기 약제를 대상체의 이환된 관절로 관절내 투여할 수 있다. 대안으로서 또는 추가적으로, 상기 약제는 이환된 관절에 또는 이에 실질적으로 인접하게 투여될 수 있다. 다른 실증적 예시로서, 통증이 구강에 존재하는 경우 (예: 삼차신경 신경병증성 통증, 비정형성 치통 (환상 치아 통증) 또는 구강 작열감 증후군), 상기 약제는 구강 점막을 통한 투여 (예: 협측 및/또는 설하 투여)를 위해 제제화될 수 있다. 반대로, 통증이 대상체의 다수의 해부학적 부위에 걸쳐 전신이거나 또는 범발성인 경우, 상기 약제는 신경병증성 통증에 의해 이환된 다수의 해부학적 부위에 걸쳐 약제를 분포시키기 위해 임의의 부위에 국소, 장내 및/또는 비경구 투여될 수 있다. 본원에 개시된 일 구체예에서, 본원에 개시된 약제는 대상체에게 장내 투여된다. 본원에 개시된 일 구체예에서, 본원에 개시된 약제는 대상체에게 경구로 투여된다. 본원에 개시된 일 구체예에서, 본원에 개시된 약제는 대상체에게 비경구로 투여된다. 본원에 개시된 다른 구체예에서, 본원에 개시된 약제는 대상체에게 국소로 투여된다. 본원에 기재된 바와 같이, "국소 (topical)" 투여는 전형적으로 활성제를 피부 또는 점막과 같은 신체의 표면에 크림, 로션, 폼, 겔, 연고, 점비액 (nasal drop), 점안액 (eye drop), 점이액 (ear drop), 경피 패치, 경피 필름 (예: 설하 필름) 등과 같은 형태로 적절하게 적용하는 것을 의미한다. 국소 투여는 또한 흡입 (inhalation) 또는 통기법 (insufflation)에 의한 기도 점막을 통한 투여를 포함한다. 본원에 개시된 일 구체예에서, 상기 국소 투여는 경피 및 경점막 투여로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 본원에 개시된 펩티드는 대상체에게 경피로 투여된다.
일 구체예에서, 상기 방법은 본원에 개시된 약제를 인간에게 경구로 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 본원에 개시된 약제를 비-인간 대상체에게 경구로 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 본원에 개시된 약제를 고양이, 개 및 말로 구성된 그룹으로부터 선택된 비-인간 대상체에게 경구로 투여하는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 방법은 본원에 개시된 약제를 인간에게 국소로 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 본원에 개시된 약제를 비-인간 대상체에게 국소로 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 본원에 개시된 약제를 고양이, 개 및 말로 구성된 그룹으로부터 선택된 비-인간 대상체에게 국소로 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 개시된 일 구체예에서, 본원에 개시된 약제는 대상체에게 제어 방출 투여 제형으로 투여되며, 이의 실증적 예시가 본원에 기재되어 있다. 일 구체예에서, 상기 방법은 본원에 개시된 약제를 인간에게 제어 방출 투여 제형으로 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 본원에 개시된 약제를 비-인간 대상체에게 제어 방출 투여 제형으로 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 본원에 개시된 약제를 제어 방출 투여 제형으로 고양이, 개 및 말로 구성된 그룹으로부터 선택된 비-인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 언급된 바와 같이, 몇몇 (즉, 다중) 분할 용량이 매일, 매주, 매월 또는 다른 적절한 시간 간격으로 투여될 수 있거나, 또는 상기 용량은 상황의 긴급성에 의해 지시되는 바와 같이 비례적으로 감소될 수 있다. 다중 용량의 과정이 필요하거나 또는 달리 요구되는 경우, 본원에 개시된 바와 같이 1개 초과의 경로를 통해 약제를 투여하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 제1 용량을 비경구 (예: 근육내, 정맥내; 피하, 경막외, 관절내, 복강내, 수조내 또는 경막내 투여 경로를 통해) 투여하여 대상체에서 신속하거나 또는 달리 급성의 진통 효과를 유도하고, 그 다음에 후속하는 (예: 제2, 제3, 제4, 제5 등) 용량을 장내 (예: 경구 또는 직장으로) 및/또는 국소 (예: 경피 또는 경점막 투여 경로를 통해) 투여하여 상기 활성제의 지속적인 이용 가능성을 급성 치료 단계 이후 연장된 기간에 걸쳐 제공한다. 대안으로서, 용량을 장내 (예: 경구 또는 직장)로 투여하고, 그 다음에 후속하는 (예: 제2, 제3, 제4, 제5 등) 용량을 비경구 (예: 근육내, 정맥내; 피하, 경막외, 관절내, 복강내, 수조내 또는 경막내 투여 경로를 통해) 및/또는 국소 (예: 경피 또는 경점막 투여 경로를 통해) 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 대안으로서, 용량을 국소 (예: 경피 또는 경점막 투여 경로를 통해) 투여하고, 그 다음에 후속하는 (예: 제2, 제3, 제4, 제5 등) 용량을 비경구 (예: 근육내, 정맥내; 피하, 경막외, 관절내, 복강내, 수조내 또는 경막내 투여 경로를 통해) 및/또는 장내 (예: 경구 또는 직장으로) 투여하는 것이 바람직할 수 있다.
상기 투여 경로는 본원에서 논의된 바와 같이 통증이 국소 또는 전신인지에 기초하여 적절하게 선택될 수 있다. 대안으로서 또는 추가적으로, 투여 경로는 주어진 투여 경로의 경우 대상체의 일반적인 건강, 연령, 체중 및 내약성 (또는 이의 부족)과 같은 요인을 고려하여 적절하게 선택될 수 있다 (예: 바늘에 공포증이 있는 경우, 장내 및/또는 국소와 같이 대체 투여 경로가 선택될 수 있음).
또한, 다수의 투여 경로가 요구되는 경우, 2 이상의 투여 경로의 임의의 조합이 본원에 개시된 방법에 따라 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 적절한 조합의 실증적 예시는 (투여 순서로) (a) 비경구-장내; (b) 비경구-국소; (c) 비경구-장내-국소; (d) 비경구-국소-장내; (e) 장내-비경구; (f) 장내-국소; (g) 장내-국소-비경구; (h) 장내-비경구-국소; (i) 국소-비경구; (j) 국소-장내; (k) 국소-비경구-장내; (l) 국소-장내-비경구; (m) 비경구-장내-국소-비경구; (n) 비경구-장내-국소-장내; 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일 구체예에서, 상기 방법은 (i) 본원에 개시된 약제를 대상체에게 비경구로 투여하고, (ii) 본원에 개시된 약제를 대상체에게 비-비경구로 (non-parenterally) (즉, 장내 또는 국소) 투여하는 단계를 포함하고, 상기 비-비경구 (장내 또는 국소) 투여는 비경구 투여에 후속한다. 일 구체예에서, 상기 비경구 투여는 근육내, 피하 및 정맥내로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 추가의 일 구체예에서, 상기 비경구 투여는 피하 투여이다. 일 구체예에서, 상기 비-비경구 투여는 경구 투여이다.
일 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 (i) 본원에 개시된 약제를 인간 대상체에게 비경구로 투여하고, (ii) 본원에 개시된 약제를 인간 대상체에게 경구로 투여하는 단계를 포함하고, 상기 경구 투여는 비경구 투여에 후속한다. 일 구체예에서, 상기 비경구 투여는 피하 투여이다. 다른 구체예에서, 상기 비경구 투여는 경막내 투여이다.
일 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 (i) 본원에 개시된 약제를 비-인간 대상체에게 비경구로 투여하고, (ii) 본원에 개시된 펩티드를 비-인간 대상체에게 경구로 투여하는 단계를 포함하고, 상기 경구 투여는 비경구 투여에 후속한다.
일 구체예에서, 비-인간 대상체는 고양이, 개 및 말로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 비경구 투여는 피하 투여이다. 다른 구체예에서, 비경구 투여는 경막내 투여이다.
다른 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 (i) 본원에 개시된 약제를 인간 대상체에게 비경구로 투여하고, (ii) 본원에 개시된 약제를 인간 대상체에게 국소로 투여하는 단계를 포함하며, 상기 국소 투여는 비경구 투여에 후속한다.
추가적 일 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 (i) 본원에 개시된 약제를 비-인간 대상체에게 비경구로 투여하고, (ii) 본원에 개시된 약제를 비-인간 대상체에게 국소로 투여하는 단계를 포함하고, 상기 국소 투여는 비경구 투여에 후속한다. 일 구체예에서, 상기 비-인간 대상체는 고양이, 개 및 말로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 상기 비경구 투여 경로는 피하이다. 다른 구체예에서, 상기 국소 투여 경로는 경피이다. 다른 구체예에서, 상기 비경구 투여는 피하이고, 상기 국소 투여는 경피이다.
대안으로서 또는 추가로, 본원에 개시된 약제는 제어 방출 투여 제형으로서 적절하게 투여될 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 상기 방법은 (i) 본원에 개시된 약제를 대상체에게 비경구로 투여하고, (ii) 본원에 개시된 약제를 제어 방출 투여 제형으로서 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 제어 방출 투여 제형은 비경구 투여에 후속하여 투여된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 (i) 본원에 개시된 약제를 대상체에게 비-비경구로 (장내 또는 국소) 투여하고, (ii) 본원에 개시된 약제를 제어 방출 투여 제형으로서 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 제어 방출 투여 제형은 비-비경구 투여에 후속하여 대상체에게 투여된다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 (i) 본원에 개시된 약제를 대상체에게 장내 투여하고, (ii) 본원에 개시된 약제를 제어 방출 투여 제형으로서 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 제어 방출 투여 제형은 장내 투여에 후속하여 대상체에게 투여된다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 (i) 본원에 개시된 약제를 대상체에게 국소로 투여하고, (ii) 본원에 개시된 약제를 제어 방출 투여 제형으로서 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 제어 방출 투여 제형은 국소 투여에 후속하여 대상체에게 투여된다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 제어 방출 투여 제형은 비경구 투여를 위해 제제화된다.
본원에 언급된 바와 같이, 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 치료제는 하나 이상의 추가의 활성제와 함께, 순차적으로 또는 조합하여 (예: 혼합물로서) 적절하게 투여될 수 있다. 다른 활성제의 특성은 치료 또는 예방할 병태에 의존할 것임을 당업자는 이해할 것이다. 예를 들어, 대상체가 암을 가진 경우, 본원에 개시된 치료제는 하나 이상의 화학요법제와 함께, 순차적으로 또는 조합하여 (예: 혼합물로서) 대상체에게 투여될 수 있고, 이의 실증적 예시는 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 특성의 병용 치료는 종종 몇몇 화학요법제와 관련된 통증을 완화시킴으로써 유리할 수 있고, 이의 실증적 예시는 시스플라틴 (cisplatin), 카보플라틴 (carboplatin), 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 빈크리스틴 (vincristine), 도세탁셀 (docetaxel), 파클리탁셀 (paclitaxel), 이즈베필론 (izbepilone), 보르테조밉 (bortezomib), 탈리도마이드 (thalidomide) 및 레날리노마이드 (lenalinomide)를 포함한다. 따라서, 일 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 치료적으로 유효한 양의 화학요법제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 개시된 약제는 또한 대상체에서 통증을 완화시킬 수 있는 하나 이상의 추가의 진통제와 함께, 순차적으로 또는 조합하여 (예: 혼합물로서) 대상체에게 적절하게 투여될 수 있다. 적절한 추가의 진통제는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 이의 실증적 예시는 통각수용기성 통증을 완화시킬 수 있는 진통제, 신경병증성 통증을 완화시킬 수 있는 진통제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 따라서, 일 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 대상체에서 통증을 완화시킬 수 있는 추가의 진통제의 치료적으로 유효한 양을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일 구체예에서, 상기 추가의 진통제는 대상체에서 통각수용기성 통증을 완화시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 추가의 진통제는 대상체에서 신경병증성 통증을 완화시킬 수 있다.
통각수용기성 통증을 완화시킬 수 있는 적절한 약제는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 이의 실증적 예시는 본원에 개시되어 있고, 아편제 (opiates) 예컨대 모르핀, 펜타닐, 트라마돌, 코데인, 디하이드로코데인, 하이드로코돈, 아세틸디하이드로코데인, 옥시코돈, 옥시모르폰 및 부프레노르핀, 및 비-스테로이드성 항-염증제 (NSAID) 예컨대 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 아세트아미노펜, 디플루니살, 살살레이트, 페나세틴, 페노프로펜, 케토프로펜, 플루르비프로펜, 옥사프로진, 록소프로펜, 인도메타신, 설린닥, 에토돌락, 케토롤락, 디클로페낙, 나부메톤, 메페남산, 메클로페남산, 플루페남산, 톨페남산, 셀레콕시브, 파레콕시브, 루마리콕시브, 에토리콕시브, 피로콕시브, 리메술리드 및 리코펠론을 포함한다. 일 구체예에서, 통각수용기성 통증을 완화시킬 수 있는 추가의 진통제는 오피오이드 (opioid)이다. 일 구체예에서, 추가의 진통제는 NSAID이다.
본원에 개시된 다른 구체예에서, 본원에 개시된 약제는 신경병증성 통증 또는 신경병증성 통증을 유발하는 기저 병태를 치료 또는 완화시키는 다른 요법과 함께, 순차적으로 또는 조합하여 (예: 혼합물로서) 투여된다. 일부 예에서, 상기 추가의 진통제의 양은 본원에 개시된 펩티드와 함께 투여되는 경우 감소될 수 있다. 신경병증성 통증을 치료할 수 있는 적절한 약제의 실증적 예시는 둘록세틴, 프레가발린, 가바펜틴, 페니토인, 멜라토닌, 카르바마제핀, 레보카르니틴, 캡사이신, 트리사이클릭 항우울제 예컨대 아미트립틸린 및 나트륨 채널 차단제 예컨대 리도카인을 포함한다.
또한, 본원에는 치료를 필요로 하는 대상체에서 병태를 치료하는데 사용하기 위한 조성물이 개시되며, 상기 조성물은 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 1 (LANCL1)에 결합하고, LANCL1에의 결합에 대해 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체와 경쟁하는 약제를 포함하며, 상기 약제는 인간 성장 호르몬 또는 이의 비-인간 상동체 유래의 펩티드가 아니고, 상기 병태는 근감소증, 내당능 장애, 당뇨병, 비만, 대사 질환 및 비만-관련 병태, 신경병증성 통증, 골관절염, 근육 장애, 소모 장애, 악액질, 식욕 부진, AIDS 소모 증후군, 근이영양증, 신경근 질환, 운동 신경 질환, 신경근 접합 질환, 염증성 근병증, 화상, 상해 또는 외상, LDL 콜레스테롤 상승과 관련된 병태, 손상된 연골 세포, 프로테오글리칸 또는 콜라겐 생성 또는 품질과 관련된 병태, 손상된 연골 조직 형성 또는 품질과 관련된 병태, 손상된 근육, 인대 또는 힘줄 질량, 형태 또는 기능과 관련된 병태, 근육 또는 결합 조직에 영향을 미치는 염증, 외상 또는 유전자 이상과 관련된 병태, 호흡기 병태 및 골 질환으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
본 개시내용은 또한 치료를 필요로 하는 대상체에서 병태의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서, 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 1 (LANCL1)에 결합하고, LANCL1에의 결합에 대해 서열 번호: 1의 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체와 경쟁하는 약제의 용도로 확장되며, 상기 약제는 인간 성장 호르몬 또는 이의 비-인간 상동체 유래의 펩티드가 아니고, 상기 병태는 근감소증, 내당능 장애, 당뇨병, 비만, 대사 질환 및 비만-관련 병태, 신경병증성 통증, 골관절염, 근육 장애, 소모 장애, 악액질, 식욕 부진, AIDS 소모 증후군, 근이영양증, 신경근 질환, 운동 신경 질환, 신경근 접합 질환, 염증성 근병증, 화상, 상해 또는 외상, LDL 콜레스테롤 상승과 관련된 병태, 손상된 연골 세포, 프로테오글리칸 또는 콜라겐 생성 또는 품질과 관련된 병태, 손상된 연골 조직 형성 또는 품질과 관련된 병태, 손상된 근육, 인대 또는 힘줄 질량, 형태 또는 기능과 관련된 병태, 근육 또는 결합 조직에 영향을 미치는 염증, 외상 또는 유전자 이상과 관련된 병태, 호흡기 병태 및 골 질환으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
약학적 조성물
본원에 개시된 치료제는 순수한 화학물질 또는 화합물로서 대상체에게 투여하기 위해 제제화될 수 있다. 그러나, 소정의 구체예에서, 수의학적 조성물 (veterinary compositions)을 포함하는 약학적 조성물로서 본원에 개시된 약제를 제제화하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 본원에는 본원에 개시된 스크리닝 방법에 의해 확인된 약제를 포함하는 조성물이 개시되며, 상기 약제는 인간 성장 호르몬 또는 이의 비-인간 상동체 유래의 펩티드가 아니다.
본원에 개시된 방법에 따라 확인된 약제는 적합하게는 (i) LANCL1에 결합할 수 있고, (ii) LANCL1에의 결합에 대해 서열 번호: 1의 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체와 경쟁할 수 있으며, 상기 약제는 인간 성장 호르몬 또는 이의 비-인간 상동체 유래의 펩티드가 아니다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함한다.
본원에서 사용된, 용어 "약학적으로 허용 가능한 (pharmaceutically acceptable)"은 이들 화합물, 약제, 물질, 조성물 및/또는 투여 제형이 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 합리적인 유익/위험 비율에 적합하게 대상체에게 투여하기에 적합한 것을 지칭한다.
본원에서 사용된, 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체 (pharmaceutically-acceptable carrier)"는 전형적으로 약학적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 제조 조제 (예: 활택제, 탈크 마그네슘, 칼슘 또는 아연 스테아레이트, 또는 스테아르산 (steric acid)), 또는 용매 캡슐화 물질이 대상 약제를 하나의 장기 또는 신체의 일부로부터 다른 장기 또는 신체의 다른 부분으로 운반하거나 또는 수송하는데 관여하는 것을 의미한다. 각 담체는 제제의 다른 성분과 적합할 수 있고, 환자에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용 가능"해야 한다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 당해 분야에 잘 알려져 있고 (예를 들어, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21st　Edition, Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, Pa.) 및 The National Formulary (American Pharmaceutical Association, Washington, D.C.) 참조), 당 (예: 락토스, 수크로스, 만니톨 및 소르비톨), 전분, 셀룰로스 제제, 인산칼슘 (예: 인산이칼슘, 인산삼칼슘 및 인산수소칼슘), 시트르산 나트륨, 물, 수용액 (예: 식염수, 염화나트륨 주사, 링거 주사, 덱스트로스 주사, 덱스트로스 및 염화나트륨 주사, 락테이트 링거 주사), 알코올 (예: 에틸 알코올, 프로필 알코올 및 벤질 알코올), 폴리올 (예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜), 유기 에스테르 (예: 에틸 올레에이트 및 트리글리세리드), 생분해성 폴리머 (예: 폴리락티드-폴리글리콜리드, 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)), 엘라스토머 매트릭스 (elastomeric matrices), 리포솜, 미소구체, 오일 (예: 옥수수, 배아, 올리브, 피마자, 참깨, 면실 및 땅콩), 코코아 버터, 왁스 (예: 좌약 왁스), 파라핀, 실리콘, 탈크, 살리실레이트 (silicylate) 등을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 사용되는 각 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제의 다른 성분들과 적합하고, 대상체에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용 가능"해야 한다. 선택된 투여 제형 및 의도된 투여 경로에 적합한 담체는 당해 분야에 잘 알려져 있고, 선택된 투여 제형 및 투여 방법에 대해 허용 가능한 담체는 당업자를 사용하여 결정될 수 있다.
본원에 개시된 약학적 조성물은 또한 치료적 항원-결합 분자 제제를 포함하는 약학적 조성물에 통상적으로 사용되는 추가의 성분 및/또는 물질을 함유할 수 있다. 이러한 성분 및 물질은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, (1) 충전제 또는 증량제, 예컨대 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및 규산; (2) 결합제, 예컨대 카복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 수크로스 및 아카시아; (3) 보습제, 예컨대 글리세롤; (4) 붕해제, 예컨대 아가-아가 (agar-agar), 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트, 나트륨 전분 글리콜레이트, 가교된 나트륨 카복시메틸 셀룰로스 및 탄산나트륨; (5) 용액 지연제, 예컨대 파라핀; (6) 흡수 촉진제, 예컨대 4차 암모늄 화합물; (7) 습윤제, 예컨대 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡수제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 클레이; (9) 활택제, 예컨대 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜 및 나트륨 라우릴 설페이트; (10) 현탁화제, 예컨대 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미세결정질 셀룰로스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트라가칸트; (11) 완충제; (12) 부형제, 예컨대 락토스, 유당 (milk sugars), 폴리에틸렌 글리콜, 동물성 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 코코아 버터, 전분, 트라가칸트, 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 탈크, 살리실레이트, 산화아연, 수산화 알루미늄, 규산칼슘 및 폴리아미드 분말; (13) 불활성 희석제, 예컨대 물 또는 기타 용매; (14) 보존제; (15) 계면 활성제; (16) 분산화제; (17) 제어-방출 또는 흡수-지연제, 예컨대 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 다른 폴리머 매트릭스, 생분해성 폴리머, 리포솜, 미소구체, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 및 왁스; (18) 불투명화제; (19) 아쥬반트; (20) 습윤제; (21) 유화제 및 현탁화제; (22) 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (구체적으로, 면실, 땅콩, 옥수수, 배아, 올리브, 피마자 및 참깨 오일), 글리세롤, 테트라하이드로푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르; (23) 분사제, 예컨대 클로로플루오로탄화수소 및 휘발성 비-치환 탄화수소 예컨대 부탄 및 프로판; (24) 항산화제; (25) 제제를 의도된 수혜자의 혈액과 등장성으로 만드는 활성제, 예컨대 슈거 및 염화나트륨; (26) 증점제; (27) 코팅 물질, 예컨대 레시틴; 및 (28) 감미료, 향미료, 착색제, 방향제 및 보존제를 포함한다. 이러한 각 성분 또는 물질은 제제의 다른 성분과 적합할 수 있고, 대상체에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용 가능"해야 한다. 선택된 투여 제형 및 의도된 투여 경로에 적합한 성분 및 물질은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 선택된 투여 제형 및 투여 방법에 대해 허용 가능한 성분 및 물질은 당업자를 사용하여 결정될 수 있다.
일 구체예에서, 본원에 개시된 약제는 본원에 기재된 바와 같이 대상체에서 치료할 통증 또는 임의의 다른 병태를 완화시키는 치료적으로 유효한 양으로 대상체에게 투여하기 위해 제제화된다.
일 구체예에서, 상기 약제는 대상체의 통증을 완화시킬 수 있는 추가의 진통제와 순차로 또는 조합하여 투여하기 위해 제제화된다. 일 구체예에서, 상기 약제는 본원에 기재된 바와 같이 대상체의 병태를 치료할 수 있는 추가의 치료제와 순차로 또는 조합하여 투여하기 위해 제제화된다. 일 구체예에서, 추가의 진통제는 대상체에서 통각수용기성 통증을 완화시킬 수 있으며, 이의 실증적 예시는 본원에 기재되어 있다. 다른 구체예에서, 추가의 진통제는 대상체에서 신경병증성 통증을 완화시킬 수 있으며, 이의 실증적 예시는 또한 본원에 기재되어 있다. 일 구체예에서, 추가의 진통제는 오피오이드이다.
본원에 개시된 약제는 치료할 병태에 따라 달라질 수 있는 하나 이상의 다른 활성제와, 순차로 또는 조합하여 (예: 혼합물로서) 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 대상체가 암에 걸린 경우, 본원에 개시된 조성물은 하나 이상의 화학요법제와, 순차로 또는 조합하여 (예: 혼합물로서) 함께 투여를 위해 제제화될 수 있으며, 이의 실증적 예시는 당업자에게 친숙할 것이다. 이러한 특성의 병용 치료는 종종 일부 화학요법제와 관련된 통증을 완화시킴으로써 유리할 수 있으며, 이의 실증적 예시는 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 빈크리스틴, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이즈베필론, 보르테조밉, 탈리도마이드 및 레날리노마이드를 포함한다.
일 구체예에서, 본원에 개시된 조성물은 대상체에서 통증을 완화시킬 수 있는 추가의 약제를 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 상기 추가의 진통제는 LANCL1에 결합하는 약제가 아니다.
일 구체예에서, 상기 추가의 진통제는 대상체에서 통각수용기성 통증을 완화시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 추가의 진통제는 대상체에서 신경병증성 통증을 완화시킬 수 있다.
통각수용기성 통증을 완화시킬 수 있는 적합한 약제는 당업자에게 친숙할 것이며, 이의 실증적 예시는 본원에 기재되어 있고, 아편제 (opiates) 예컨대 모르핀, 펜타닐, 트라마돌, 코데인, 디하이드로코데인, 하이드로코돈, 아세틸디하이드로코데인, 옥시코돈, 옥시모르폰 및 부프레노르핀, 및 비-스테로이드성 항-염증제 (NSAID) 예컨대 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 아세트아미노펜, 디플루니살, 살살레이트, 페나세틴, 페노프로펜, 케토프로펜, 플루르비프로펜, 옥사프로진, 록소프로펜, 인도메타신, 설린닥, 에토돌락, 케토롤락, 디클로페낙, 나부메톤, 메페남산, 메클로페남산, 플루페남산, 톨페남산, 셀레콕시브, 파레콕시브, 루마리콕시브, 에토리콕시브, 피로콕시브, 리메술리드 및 리코펠론을 포함한다. 일 구체예에서, 통각수용기성 통증을 완화시킬 수 있는 추가의 진통제는 오피오이드이다. 일 구체예에서, 추가의 진통제는 NSAID이다.
본원에 개시된 다른 구체예에서, 본원에 개시된 조성물은 통증 또는 통증을 유발하는 기저 병태를 치료 또는 완화시키는 다른 요법과, 순차로 또는 조합하여 (예: 혼합물로서) 함께 투여하기 위해 제제화된다. 일부 예에서, 상기 추가의 진통제의 양은 본원에 개시된 펩티드와 함께 투여되는 경우 감소될 수 있다. 신경병증성 통증을 치료할 수 있는 적절한 약제의 실증적 예시는 본원에 기재되어 있다.
본원에 개시된 다른 구체예에서, 본원에 개시된 조성물은 대상체에서 임의의 다른 병태를 치료하기 위한 다른 치료제와, 순차로 또는 조합하여 (예: 혼합물로서) 함께 투여하기 위해 제제화된다. 일부 예에서, 상기 추가의 치료제의 양은 본원에 개시된 펩티드와 함께 투여되는 경우 감소될 수 있다.
적합한 약학적 제제의 실증적 예시는 장내 또는 비경구 투여에 적합한 것을 포함하고, 이의 실증적 예시는 본원에 기재되어 있으며, 경구, 직장, 협측, 설하, 질, 비강, 국소 (예: 경피), 근육내, 피하, 정맥내, 경막외, 관절내 및 경막내를 포함한다. 일 구체예에서, 조성물은 경구 투여를 위해 제제화된다.
본원에 기재된 치료제는 경구 사용의 경우 고체 (예: 정제 또는 충전된 캡슐) 또는 액체 (예: 용액, 현탁액, 에멀젼, 엘릭시르, 또는 이로 충전된 캡슐)로서, 직장 투여의 경우 연고, 좌제 또는 관장제 (enemas)의 형태, 비경구 사용 (예: 근육내, 피하, 정맥내, 경막외, 관절내 및 경막내 투여)의 경우 멸균 주사 가능한 용액의 형태; 또는 국소 (예: 국소, 협측, 설하, 질) 투여의 경우 연고, 로션, 크림, 겔, 패치, 설하 스트립 또는 필름 등의 형태로 이용될 약학적 조성물 및 유닛 용량 (unit dosages)의 형태로 적절하게 배치될 수 있다. 일 구체예에서, 본원에 개시된 약제는 국소 (예: 경피) 전달을 위해 제제화된다. 적절한 경피 전달 시스템은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 이의 실증적 예시는 Prausnitz and Langer (2008; Nature Biotechnol. 26(11):1261-1268)에 기재되어 있고, 이의 내용은 본원에 참조로 통합된다. 다른 구체예에서, 본원에 개시된 약제는 설하 또는 협측 전달을 위해 제제화된다. 적절한 설하 및 협측 전달 시스템은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 이의 실증적 예시는 Bala et al. (2013; Int. J. Pharm. Investig. 3(2):67-76)에 기재된 바와 같이 용해 가능한 스트립 또는 필름을 포함하고, 이의 내용은 본원에 참조로 통합된다.
적절한 약학적 조성물 및 이의 유닛 투여 제형은 추가의 활성 화합물 또는 성분과 함께 또는 이들 없이, 기존의 성분을 통상적인 비율로 포함할 수 있고, 이러한 유닛 투여 제형은 사용되는 의도된 일일 투여량 범위에 상응하는 임의의 적절한 유효량의 활성 성분을 함유할 수 있다.
일부 구체예에서, 통증 또는 다른 병태가 국소 또는 전신인지에 기초하여 투여 경로를 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 통증 또는 병태가 국소인 경우, 본원에 개시된 조성물을 이환 부위 또는 그에 바로 인접한 부위에 투여하기 위해 제제화하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 통증이 관절 (예: 목, 무릎, 팔꿈치, 어깨 또는 엉덩이)에 있는 경우, 상기 조성물은 이환된 관절로 관절내 투여하기 위해 제제화될 수 있다. 대안으로서 또는 추가적으로, 상기 조성물은 이환된 관절에 또는 이에 실질적으로 인접하게 투여하기 위해 제제화될 수 있다. 다른 실증적 예시로서, 통증이 구강에 존재하는 경우 (예: 삼차신경 신경병증성 통증, 비정형성 치통 (환상 치아 통증) 또는 구강 작열감 증후군), 상기 조성물은 구강 점막을 통한 투여 (예: 협측 및/또는 설하 투여)를 위해 제제화될 수 있다.
반대로, 통증 또는 다른 병태가 대상체의 다수의 해부학적 부위에 걸쳐 전신이거나 또는 범발성인 경우, 이는 통증 또는 병태에 의해 이환된 다수의 해부학적 부위에 걸쳐 활성제를 분포시키기 위해 본원에 기재된 바와 같이 장내, 국소 및/또는 비경구 투여 경로를 위해 조성물을 제제화는 것이 편리할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 인간에게 경구 투여를 위해 제제화된다. 다른 구체예에서, 상기 조성물은 비-인간 대상체에게 경구 투여를 위해 제제화된다. 또 다른 구체예에서, 상기 조성물은 고양이, 개 및 말로 구성된 그룹으로부터 선택된 비-인간 대상체에게 경구 투여하기 위해 제제화된다.
다른 구체예에서, 상기 조성물은 인간에게 비경구 투여를 위해 제제화된다. 다른 구체예에서, 상기 조성물은 비-인간 대상체에게 비경구 투여를 위해 제제화된다. 또 다른 구체예에서, 상기 조성물은 고양이, 개 및 말로 구성된 그룹으로부터 선택된 비-인간 대상체에게 비경구 투여하기 위해 제제화된다. 일 구체예에서, 상기 비경구 투여는 피하 투여이다.
다른 구체예에서, 상기 조성물은 인간에게 국소 투여를 위해 제제화된다. 다른 구체예에서, 상기 조성물은 비-인간 대상체에게 국소 투여를 위해 제제화된다. 또 다른 구체예에서, 상기 조성물은 고양이, 개 및 말로 구성된 그룹으로부터 선택된 비-인간 대상체에게 국소 투여하기 위해 제제화된다. 일 구체예에서, 상기 국소 투여는 경피 투여이다.
다른 구체예에서, 상기 조성물은 인간에게 투여되는 제어 방출 투여 제형으로서 제제화된다. 다른 구체예에서, 상기 조성물은 비-인간 대상체에게 투여되는 제어 방출 투여 제형으로서 제제화된다. 또 다른 구체예에서, 상기 조성물은 고양이, 개 및 말로 구성된 그룹으로부터 선택된 비-인간 대상체에게 투여되는 제어 방출 투여 제형으로서 제제화된다. 적절한 제어 방출 투여 제형의 실증적 예시는 본원에 기재되어 있다.
본원에 기재된 조성물을 제조하기 위해, 약학적으로 허용 가능한 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 고체 형태 제제의 실증적 예시는 분말, 정제, 환제, 캡슐, 카셰 (cachets), 좌제 및 분산성 과립을 포함한다. 고체 담체는 희석제, 풍미제, 가용화제, 활택제, 현탁화제, 결합제, 보존제, 정제 붕해제 또는 캡슐화 물질로서 작용할 수 있는 하나 이상의 물질일 수 있다. 분말에서, 담체는 미분된 활성 성분과의 혼합물로 존재하는 미분된 고체 (finely divided solid)일 수 있다. 정제에서, 활성 성분은 필요한 결합 능력을 갖는 담체와 적절한 비율로 혼합되고, 원하는 형태 및 크기로 압축될 수 있다.
일부 구체예에서, 분말 및 정제는 5 또는 10 내지 약 70%의 활성 화합물을 함유한다. 적절한 담체의 실증적 예시는 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 당 (sugar), 락토스, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 저융점 왁스, 코코아 버터 등을 포함한다. 용어 "제제 (preparation)"는 담체를 갖거나 또는 갖지 않는 활성제가 담체에 의해 둘러싸인 캡슐을 제공하는, 활성제와 캡슐화 물질의 제제를 포함하는 것으로 의도된다. 유사하게, 카셰 및 로젠지가 또한 본원에서 구상된다. 정제, 분말, 캡슐, 환제, 카셰 및 로젠지는 경구 투여에 적절한 고체 제형으로 사용될 수 있다.
좌제를 제조하기 위해, 저융점 왁스 예컨대 지방산 글리세리드 또는 코코아 버터의 혼합물이 먼저 용융되고, 활성제가 교반에 의해 그 안에서 균질하게 분산된다. 그 다음에, 용융된 균질한 혼합물을 편리한 크기의 몰드에 붓고, 냉각시켜서, 이에 의해 고체화된다.
질내 투여에 적절한 제제는 활성 성분에 추가하여 당해 분야에 적절하다고 알려져 있는 담체를 함유하는 페서리 (pessaries), 탐폰 (tampons), 크림, 겔, 페이스트, 폼 (foams) 또는 스프레이로서 제시될 수 있다.
액체 형태 제제는 용액, 현탁액 및 에멀젼, 예를 들어 수용액 또는 물-프로필렌 글리콜 용액을 포함한다. 예를 들어, 비경구 주사 액체 제제는 폴리에틸렌 글리콜 수용액 중에 용액으로서 제제화될 수 있다.
본원에 개시된 약제는 비경구 투여 (예: 주사, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입)를 위해 적절하게 제제화될 수 있고, 앰플, 사전-충전된 주사기, 소량 주입 또는 보존제가 첨가된 다회-용량 용기 중에 유닛 투여 제형으로 제시될 수 있다. 상기 조성물은 오일 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있고, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산화제와 같은 제제화제를 함유할 수 있다. 대안으로서, 활성 화합물(들)은 사용 전에, 적절한 비히클, 예를 들어 무균, 발열원-제거수 (sterile, pyrogen-free water)로 구성하기 위해, 무균 고체의 무균 분리 또는 용액으로부터의 동결 건조에 의해 수득되는 분말 형태일 수 있다.
경구 사용에 적절한 수성 용액은 활성제를 물에 용해시키고, 적절한 착색제, 풍미제, 안정화제 및 증점제를 원하는 대로 첨가함으로써 제조될 수 있다. 경구 사용에 적절한 수성 현탁액은 천연 또는 합성 검, 수지, 메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스 또는 다른 잘 알려져 있는 현탁화제와 같은 점성 물질을 가진 물에 미분된 활성제를 분산시킴으로써 제조될 수 있다.
또한, 본원에는 사용 직전에 경구 투여를 위한 액체 형태 제제로 전환되도록 의도된 고체 형태 제제가 고려된다. 이러한 액체 형태는 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 이들 제제는 활성제에 추가하여 착색제, 풍미제, 안정화제, 완충제, 인공 및 천연 감미제, 분산제, 증점제, 가용화제 등을 함유할 수 있다.
표피로의 국소 투여의 경우, 본원에 기재된 치료제는 연고, 크림 또는 로션, 또는 경피 패치로서 제제화될 수 있다. 연고 및 크림이 예를 들어 적절한 증점제 및/또는 겔화제가 첨가된 수성 또는 오일 베이스로 제제화될 수 있다. 로션은 수성 또는 오일 베이스로 제제화될 수 있고, 일반적으로 하나 이상의 유화제, 안정화제, 분산화제, 현탁화제, 증점제 또는 착색제를 함유할 것이다.
구강내 국소 투여에 적절한 제제는 풍미 베이스, 통상 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트 중에 활성제를 포함하는 로젠지; 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로스 및 아카시아와 같은 불활성 베이스 중에 활성 성분을 포함하는 파스틸 (pastilles); 및 적절한 액체 담체 중에 활성 성분을 포함하는 구강 세정제를 포함한다.
용액 또는 현탁액은 기존의 수단, 예를 들어 점적기, 피펫 또는 스프레이로 비강에 직접 적용된다. 상기 제제는 단일 또는 다중 투여 제형으로 제공될 수 있다. 후자의 점적기 또는 피펫의 경우, 이는 환자가 적절한 미리 결정된 부피의 용액 또는 현탁액을 투여함으로써 달성될 수 있다. 스프레이의 경우, 이는 예를 들어 계량 분무 스프레이 펌프에 의해 달성될 수 있다. 비강 전달 및 체류를 개선하기 위해, 본 발명에 사용된 펩티드는 사이클로덱스트린으로 캡슐화되거나, 또는 비강 점막에 전달 및 체류를 증진시킬 것으로 예상되는 약제와 함께 제제화될 수 있다.
기도로의 투여는 또한 에어로졸 제제에 의해 달성될 수 있으며, 상기 활성제는 클로로플루오로카본 (CFC), 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 또는 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소, 또는 다른 적절한 기체와 같은 적절한 분사제로 가압된 팩에 제공된다. 상기 에어로졸은 또한 편리하게 레시틴과 같은 계면활성제를 함유할 수 있다. 약물의 용량은 계량 밸브를 제공함으로써 제어될 수 있다.
대안으로서 또는 추가로, 상기 치료제는 건조 분말, 예를 들어 락토스, 전분, 전분 유도체 예컨대 하이드록시프로필메틸 셀룰로스 및 폴리비닐피롤리돈 (PVP)과 같은 적절한 분말 베이스 중에 화합물의 분말 믹스의 형태로 제공될 수 있다. 편리하게는, 상기 분말 담체는 비강에서 겔을 형성할 것이다. 상기 분말 조성물은 예를 들어 젤라틴과 같은 캡슐 또는 카트리지, 또는 분말이 흡입기에 의해 투여될 수 있는 블리스터 팩 (blister packs)으로 유닛 투여 제형으로 제시될 수 있다.
비강내 제제를 포함한, 기도에 투여하기 위한 제제에서, 상기 약제는 일반적으로 예를 들어 약 1 내지 10 마이크론 이하의 작은 입자 크기를 가질 것이다. 이러한 입자 크기는 당해 분야에 알려져 있는 수단, 예를 들어 미분화 (micronization)에 의해 수득될 수 있다.
원하는 경우, 본원에 기재된 바와 같이, 활성제의 제어 또는 지속 방출을 제공하도록 조정된 제제가 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 약학적 제제는 본원에 기재된 바와 같이 바람직하게는 유닛 투여 제형이다. 이러한 제형에서, 상기 제제는 적절한 양의 활성 성분을 함유하는 유닛 용량으로 세분된다. 상기 유닛 투여 제형은 패키지된 제제일 수 있으며, 상기 패키지는 바이알 또는 앰플내에 패키지된 정제, 캡슐 및 분말과 같은 제제의 이산량을 함유한다. 또한, 유닛 투여 제형은 캡슐, 정제, 카셰 또는 로젠지 자체일 수 있거나, 또는 이는 이들의 적절한 수의 패키지된 형태일 수 있다.
또한, 본원에는 의약으로서 사용하기 위한, 본원에 기재된 치료제를 포함하는 조성물이 개시된다.
일 구체예에서, 본원에 개시된 조성물은 인간에게 경구 투여를 위해 제제화된다. 또 다른 구체예에서, 본원에 개시된 조성물은 비-인간에게 경구 투여를 위해 제제화된다. 추가의 일 구체예에서, 본원에 개시된 조성물은 고양이, 개 및 말로 구성된 그룹으로부터 선택된 비-인간에게 경구 투여를 위해 제제화된다.
다른 구체예에서, 본원에 개시된 약제는 인간 대상체에게 경구 투여를 위해 제제화된다. 다른 구체예에서, 본원에 개시된 약제는 비-인간 대상체에게 경구 투여를 위해 제제화된다. 또 다른 구체예에서, 본원에 개시된 약제는 고양이, 개 및 말로 구성된 그룹으로부터 선택된 비-인간 대상체에게 경구 투여를 위해 제제화된다.
다른 구체예에서, 본원에 개시된 약제는 인간 대상체에게 국소 투여를 위해 제제화된다. 다른 구체예에서, 본원에 개시된 약제는 비-인간 대상체에게 국소 투여를 위해 제제화된다. 또 다른 구체예에서, 본원에 개시된 약제는 고양이, 개 및 말로 구성된 그룹으로부터 선택된 비-인간 대상체에게 국소 투여하기 위해 제제화된다. 일 구체예에서, 상기 국소 투여는 경피 투여이다.
다른 구체예에서, 본원에 개시된 약제는 인간 대상체에게 제어 방출 투여 제형으로서 투여하기 위해 제제화된다. 또 다른 구체예에서, 본원에 개시된 약제는 비-인간 대상체에게 제어 방출 투여 제형으로서 투여하기 위해 제제화된다. 다른 구체예에서, 본원에 개시된 약제는 비-인간 대상체에게 제어 방출 투여 제형으로 투여하기 위해 제제화되며, 상기 비-인간 대상체는 고양이, 개 및 말로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 상기 제어 방출 투여 제형은 비경구 투여를 위해 제제화된다.
본원에 언급된 바와 같이, 몇몇 (즉, 다중) 분할 용량이 매일, 매주, 매월 또는 다른 적절한 시간 간격으로 투여될 수 있거나, 또는 상기 용량은 상황의 긴급성에 의해 지시되는 바와 같이 비례적으로 감소될 수 있다. 다중 용량의 과정이 필요하거나 또는 달리 요구되는 경우, 본원에 개시된 조성물은 상기 다수의 경로를 통한 투여를 위해 적절하게 제제화될 수 있다. 예를 들어, 제1 용량을 비경구 (예: 근육내, 정맥내; 피하 등) 투여하여 대상체에서 신속하거나 또는 달리 급성의 진통 효과를 유도하고, 그 다음에 후속하는 (예: 제2, 제3, 제4, 제5 등) 용량은 비-비경구 (예: 장내 및/또는 국소로) 투여하여 상기 활성제의 지속적인 이용 가능성을 급성 치료 단계 이후 연장된 기간에 걸쳐 제공한다. 따라서, 일 구체예에서, 약제 및 조성물은 본원에 개시된 바와 같이 제1 용량으로서 대상체에게 비경구 투여를 위해 제제화되고 (즉, 비경구 투여 제형으로서), 제1 용량 후에 대상체에게 비-비경구 투여를 위해 제제화된다 (예: 장내 및/또는 국소 투여 제형으로서). 일 구체예에서, 비경구 투여는 근육내, 피하 및 정맥내로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 추가의 일 구체예에서, 비경구 투여는 피하 투여이다.
다른 구체예에서, 장내 투여는 경구 투여이다. 따라서, 일 구체예에서, 약제 및 조성물은 본원에 개시된 바와 같이 제1 용량으로서 대상체에게 비경구 투여를 위해 제제화되고, 제1 용량 후에 대상체에게 경구 투여를 위해 제제화된다 (즉, 경구 투여 제형으로서).
다른 구체예에서, 장내 투여는 국소 투여이다. 따라서, 일 구체예에서, 약제 및 조성물은 본원에 개시된 바와 같이 제1 용량으로서 대상체에게 비경구 투여를 위해 제제화되고, 제1 용량 (즉, 경구 투여 제형으로서) 후에 대상체에게 국소 투여를 위해 제제화된다. 일 구체예에서, 상기 국소 투여는 경피 투여이다.
다른 구체예에서, 제1 용량을 비경구로 (예: 근육내, 정맥내; 피하 등) 투여하여 대상체에서 신속하거나 또는 달리 급성의 진통 효과를 유도하고, 그 다음에 후속하는 (예: 제2, 제3, 제4, 제5 등) 용량은 본원에 기재된 바와 같이 제어 방출 투여 제형으로 투여하여, 상기 활성제의 제어 방출을 급성 치료 단계 이후 연장된 기간에 걸쳐 제공한다. 따라서, 다른 구체예에서, 약제 및 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 제1 용량으로서 대상체에게 비경구 투여를 위해 제제화되고, 제1 용량 후에 대상체에게 제어 방출 투여 제형으로서 투여하기 위해 제제화된다. 일 구체예에서, 상기 제어 방출 투여 제형은 비경구 투여를 위해 제제화된다.
또한, 제1 용량을 장내 (예: 경구 또는 직장으로) 투여하고, 그 다음에 후속하는 (예: 제2, 제3, 제4, 제5 등) 용량을 국소로 (예: 경피로) 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 약제 및 조성물은 본원에 개시된 바와 같이 제1 용량으로서 대상체에게 장내 투여를 위해 제제화되고 (즉, 장내 투여 제형; 경구 또는 직장), 제1 용량 후에 대상체에게 국소 투여를 위해 제제화된다 (예: 경피 또는 경점막 투여 제형으로서). 다른 구체예에서, 약제 및 조성물은 본원에 개시된 바와 같이 경피 및 경점막 투여로 구성된 그룹으로부터 선택된 국소 투여를 위해 제제화된다. 추가의 일 구체예에서, 펩티드 및 조성물은 본원에 개시된 바와 같이 경피 투여를 위해 제제화된다.
또 다른 구체예에서, 제1 용량으로서 장내에 (예: 경구 또는 직장으로) 본원에 개시된 약제 또는 조성물을 투여하고, 그 다음에 후속하는 (예: 제2, 제3, 제4, 제5 등) 용량은 본원에 기재된 바와 같이 제어 방출 투여 제형으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 약제 및 조성물은 본원에 개시된 바와 같이 제1 용량으로서 장내 투여를 위해 제제화되고, 제어 방출 투여 제형으로서 투여를 위해 제제화되며, 상기 제어 방출 투여 제형은 제1 용량에 후속한 투여를 위해 제제화된다. 일 구체예에서, 장내 용량은 경구 투여를 위해 제제화된다. 다른 구체예에서, 상기 제어 방출 투여 제형은 비경구 투여를 위해 제제화된다.
일 구체예에서, 약제 또는 조성물을 본원에 개시된 바와 같이 제1 용량으로서 국소로 (예: 경구 또는 직장으로) 투여하고, 그 다음에 후속하는 (예: 제2, 제3, 제4, 제5 등) 용량은 본원에 기재된 바와 같이 제어 방출 투여 제형으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 약제 및 조성물은 본원에 개시된 바와 같이 제1 용량으로서 국소 투여를 위해 제제화되고, 제어 방출 투여 제형으로서 투여를 위해 제제화되며, 상기 제어 방출 투여 제형은 제1 국소 용량에 후속하는 투여를 위해 제제화된다. 일 구체예에서, 상기 국소 용량은 경피 투여를 위해 제제화된다. 다른 구체예에서, 상기 제어 방출 투여 제형은 비경구 투여를 위해 제제화된다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 약학적 조성물은 캡슐, 카셰, 환제, 정제, 분말, 과립, 수성 또는 비-수성 액체의 용액 또는 현탁액, 수중유 또는 유중수 액체 에멀젼, 엘릭시르 또는 시럽, 파스틸, 볼루스, 연질약 또는 페이스트의 형태일 수 있다. 이들 제제는 당해 분야에 알려진 방법, 예를 들어 통상적인 팬-코팅, 혼합, 과립화 또는 동결건조 공정에 의해 제조될 수 있다.
경구 투여를 위한 고체 투여 제형 (캡슐, 정제, 환제, 드라제, 분말, 과립 등)은 예를 들어 활성 성분(들)을 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 및 선택적으로 하나 이상의 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 용액 지연제, 흡수 촉진제, 습윤제, 흡수제, 활택제 및/또는 착색제를 혼합함으로써 제조될 수 있다. 유사한 타입의 고체 조성물은 적절한 부형제를 사용하여 연질 및 경질 충전 젤라틴 캡슐에 충전제로서 사용될 수 있다. 정제는 선택적으로 하나 이상의 보조 성분과 함께 압축 또는 성형에 의해 제조될 수 있다. 압축 정제는 적합한 결합제, 활택제, 불활성 희석제, 보존제, 붕해제, 표면-활성제 또는 분산화제를 사용하여 제조할 수 있다. 성형된 정제는 적합한 기계에서 성형함으로써 제조될 수 있다. 정제, 및 다른 고체 투여 제형 예컨대 드라제, 캡슐, 환제 및 과립은 선택적으로 코팅 (coatings) 및 쉘 (shells), 예컨대 장용 코팅 및 약제학 분야에 잘 알려진 다른 코팅으로 스코어링되거나 또는 제조될 수 있다. 이들은 또한 그 안의 활성 성분의 저속 방출 또는 제어 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다. 예를 들어 박테리아-보유 필터를 통한 여과에 의해 이들은 멸균될 수 있다. 이들 조성물은 또한 선택적으로 불투명화제를 함유할 수 있고, 활성 성분을 단독으로 또는 우선적으로 위장관의 특정 부분에서 선택적으로 지연된 방식으로 방출하도록 하는 조성물일 수 있다. 활성 성분은 또한 마이크로캡슐화된 형태일 수 있다.
직장 또는 질 투여를 위한 본 발명의 약학적 조성물은 좌제로 제시될 수 있으며, 이는 실온에서 고체이지만, 체온에서는 액체이므로, 직장 또는 질강에서 용융되어 활성 화합물을 방출하는 하나 이상의 적합한 비-자극성 담체와 하나 이상의 활성 성분(들)을 혼합함으로써 제조될 수 있다. 질 투여에 적합한 본 발명의 약학적 조성물은 또한 적절한 것으로 당해 분야에 알려진 바와 같은 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 스프레이 제제를 포함한다.
경구 투여를 위한 액체 투여 제형은 약학적으로 허용 가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 액체 투여 제형은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 적합한 불활성 희석제를 함유할 수 있다. 불활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 또한 아쥬반트 예컨대 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 감미제, 향미제, 착색제, 방향제 및 보존제를 포함할 수 있다. 현탁액은 현탁화제를 함유할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 멸균 등장성 수성 또는 비-수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 사용 직전에 멸균 주사용 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말과 조합하여 하나 이상의 약제(들)/화합물(들)/항원-결합 분자를 포함하고, 이는 적절한 항산화제, 완충제, 제제를 의도된 수혜자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질, 또는 현탁화제 또는 증점제를 함유할 수 있다. 적절한 유동성 (fluidity)은 예를 들어 코팅 물질의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 이들 조성물은 또한 적절한 아쥬반트, 예컨대 습윤제, 유화제 및 분산화제를 함유할 수 있다. 이는 또한 등장화제를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사 가능한 의약품 제형의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 활성제의 포함에 의해 야기될 수 있다.
국소 또는 경피 투여를 위한 투여 제형은 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치, 점적제 및 흡입제를 포함한다. 활성제 (예: 치료제 조합)는 멸균 조건하에 적절한 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합될 수 있다. 연고, 페이스트, 크림 및 겔에는 부형제를 함유할 수 있다. 분말 및 스프레이에는 부형제 및 분사제를 함유할 수 있다.
일부 경우에, 약학적 조성물의 효과를 연장하기 위해, 피하 또는 근육내 주사로부터 흡수를 지연시키는 것이 바람직하다. 이는 수용성이 떨어지는 결정 또는 비결정 물질의 액체 현탁액을 포함함으로써 달성될 수 있다.
치료제 조합의 개별 성분들의 흡수 속도는 용해 속도에 따라 달라지며, 이는 결국 결정 크기 및 결정형에 따라 달라질 수 있다. 대안으로서, 비경구-투여된 활성제 또는 항체의 지연된 흡수는 활성제 또는 항체를 오일 비히클에 용해 또는 현탁시킴으로써 달성될 수 있다. 주사 가능한 데포 (depot) 제형은 생분해성 폴리머내 활성 성분의 마이크로캡슐화된 매트릭스를 형성함으로써 제조될 수 있다. 활성 성분 대 폴리머의 비율 및 사용되는 특정 폴리머의 특성에 따라, 활성 성분 방출 속도를 제어할 수 있다. 데포 주사 가능한 제제는 또한 신체 조직과 적합한 리포솜 또는 마이크로에멀젼에 약물을 포획시킴으로써 제조된다. 주사 가능한 물질은 예를 들어 박테리아-보유 필터를 통한 여과에 의해 멸균될 수 있다.
제제는 유닛-용량 또는 다중-용량 밀봉 용기, 예를 들어 앰플 및 바이알로 제공될 수 있으며, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용수 만을 부가하면 되는 동결건조 상태로 보관될 수 있다. 즉시 주사 용액 및 현탁액은 상기 기재된 타입의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
하기 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위해 제공되며, 어떠한 방식으로도 이의 범위를 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1: 사이클릭 펩티드의 분자 표적을 확인하기 위한 In-gel 형광 (In-gel fluorescence)
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 서열 번호: 1의 사이클릭 영역을 포함하는 인간 성장 호르몬의 펩티드 단편 또는 이의 비-인간 유사체가 신경병증성 통증을 포함한 통증의 치료에 유용하다는 것을 이전에 발견하였다 (WO2019/136528 참조). 최근에, 이들 사이클릭 펩티드 단편의 구조적 유사체는 또한 신경병증성 통증의 치료를 포함하여, 동일하거나 또는 유사한 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, WO2019/183686, US 특허 출원 제62/855270호 및 호주 특허 출원 제2019902436호 참조).
해당 정보를 사용하여, 본 발명자들은 이들 사이클릭 펩티드에 대한 분자 표적을 확인하고 특성 규명하고자 하였다.
리간드 구동 접근법 (ligand driven approach)을 사용하여, 본 발명자들은 활성 사이클릭 펩티드를 유도체화하여 결합 표적에 대한 UV-유도 가교를 허용하는 기술인 Evotec A.G.의 광-활성화 가능한 가교 PAL (Photo-Activated Labelling) 기술을 활용하였다 (본원에 펩티드/서열 번호: X-PAL로 기재됨). 이는 세포, 조직 단리물의 겔 또는 질량 분석 (PALMS)에 의한 시퀀싱을 위한 펩티드/표적 복합체의 풀-다운 (pull-down)에서 후속 검출을 허용한다. 서열 번호: 12의 사이클릭 펩티드 (LAT9991)는 PAL 그룹화에 접합되는 경우 (서열 번호: 12-PAL; 또한, 본원에서 LAT9991-PAL로 지칭됨) 기능적으로 안정한 것으로 밝혀졌고, 척수 슬라이스 모델에서 완전히 활성인 것으로 확인되었다 (데이터는 개시되지 않음).
In-gel 형광 프로토콜은 하기와 같이 간략하게 설명할 수 있다:
1. LANCL1 라벨링, 96웰 플레이트에서 분석, PBS 중 반응 부피 40 μl
3 μg/웰의 인간 재조합 LANCL1 (ABCAM catalog no. ab181923, 1 mg/ml; 대장균 (E.Coli)에서 발현되고, N-말단 23개의 아미노산 hexaHis 태그 (tag) 통합; UniProtKB/Swiss-Prot Accession no: O43813);
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMGSMAQRAFPNPYADYNKSLAEGYFDAAGRLTPEFSQRLTNKIRELLQQMERGLKSADPRDGTGYTGWAGIAVLYLHLYDVFGDPAYLQLAHGYVKQSLNCLTKRSITFLCGDAGPLAVAAVLYHKMNNEKQAEDCITRLIHLNKIDPHAPNEMLYGRIGYIYALLFVNKNFGVEKIPQSHIQQICETILTSGENLARKRNFTAKSPLMYEWYQEYYVGAAHGLAGIYYYLMQPSLQVSQGKLHSLVKPSVDYVCQLKFPSGNYPPCIGDNRDLLVHWCHGAPGVIYMLIQAYKVFREEKYLCDAYQCADVIWQYGLLKKGYGLCHGSAGNAYAFLTLYNLTQDMKYLYRACKFAEWCLEYGEHGCRTPDTPFSLFEGMAGTIYFLADLLVPTKARFPAFEL (서열 번호: 56), vol 3μl
Figure pct00001
비히클 DMSO
Figure pct00002
±LAT8881 (인간 성장 호르몬의 사이클릭 펩티드 단편; 서열 번호: 1)
Figure pct00003
서열 번호: 1) 경쟁인자 @ 25, 50, 100 또는 200 μM, 사전-인큐베이션 10분, 4 μl의 스톡 용액 10배 농축
Figure pct00004
±LAT9991-PAL, LAT7771-PAL 또는 LAT9993-PAL 프로브 @ 1 μM, 플레이트 교반기에서 실온에서 30분 인큐베이션 (빛으로부터 보호됨), 10 μM에서 스톡 용액 4 μl
2. LANCL1 포토라벨링
Figure pct00005
조사 @ 365 nm 20분 (4℃, 얼음이 함유된 지지대에서)
Figure pct00006
깨끗한 Eppendorf 튜브에 40 μl 전달
3. 환원 및 알킬화
Figure pct00007
환원: DTT 10 mM, 30분 @ 56℃
Figure pct00008
알킬화: 요오도아세트아미드 30 mM, 45분 @ RT Click-iT AzideTamra 60 μL 샘플
4. 클릭-반응
Figure pct00009
아세톤 침전 -20℃ ON
Figure pct00010
50 mM Tris-HCl pH 7.5 중 1% SDS 30 μL에 재현탁된 건조 펠렛
Figure pct00011
포토라벨링된 LANCL1을 30분 동안 Click-iT Protein Reaction Buffer Kit (ThermoFisher Scientific)를 사용하여 구리 클릭 화학 (copper click chemistry)에 의해 테트라메틸로다민 (TAMRA) 아지드 @ 100 μM TAMRA 아지드로 태그하였다.
Figure pct00012
클로로포름-메탄올 방법을 사용한 침전, 펠렛을 실온에서 10분 동안 공기-건조시키고, 30 μL SDS 로딩 버퍼 (2.5% v/v 2-머캅토에탄올을 함유하는 Bio Rad의 XT 샘플 버퍼)에 재현탁하고, 가열 (60℃, 30 분)하였다.
5. 가교된 단백질의 겔-기반 분석
Figure pct00013
SDS-PAGE (4-15% CriterionTM TGX Stain-FreeTM Protein Gel, Bio Rad)
Figure pct00014
녹색 LED 광을 여기 소스 (excitation source)로 사용하고 BP600/20 nm 방출 필터 (emission filter)를 가진 ChemiDoc™ MP Imaging System (Bio Rad)을 사용하여 In-gel 형광 스캐닝으로 분석하였다.
세포-결합 형광 프로토콜은 하기와 같이 간략하게 설명될 수 있다. LAT9991-PAL의 결합은 파클리탁셀로 처리된 마우스 (신경병증성 통증 모델)의 DRG 뉴런에서 볼 수 있지만, 미처리 대조군 마우스에서는 볼 수 없었다 (도 1). 암컷 C57/Bl6 마우스에서 파클리탁셀 - 50 mg/kg 파클리탁셀 또는 비히클 (체중 1 kg당 10 ml)을 정맥내 (i.v.)로 1일차, 3일차 및 5일차에 주사하여 화학요법-유발 말초 신경병증의 모델을 생성하였다. 기계적 이질통 (Mechanical allodynia)은 비히클 또는 파클리탁셀 처리 (좌측 및 우측 발) 개시 9일 후에 von Frey (VF) 필라멘트를 사용하여 확인하였다. 10마리의 C57/Bl6 마우스 (비히클 대조군 및 파클리탁셀 처리) 각각을 CO2 흡입으로 안락사시키고, 개별적으로 해부하였다.
L5-L6 DRG를 신속하게 해부하고, 해부 배지 (dissection medium)를 함유하는 페트리 접시에 두었다. 수막 (meninges)을 꺼냈다.
각 DRG 풀 (pool)은 다음과 같았다:
Figure pct00015
해리 버퍼 (0.5 mg/ml 디스파제 (Dispase), 2.5 mg/ml 콜라게나제, 6 mg/ml BSA, 10 mM HEPES)에서 37℃에서 30분 동안 800회/분으로 부드럽게 교반하면서 인큐베이션하였고;
Figure pct00016
세척하였고;
Figure pct00017
배양 배지에서 연마하고 (triturated), 40 μm 필터로 여과하였고;
Figure pct00018
신경 성장 인자 (NGF) 250 ng/ml가 보충된 1 ml 배양 배지 중에 재현탁시켰다.
각 풀로부터 해리된 세포를 계수하고, 4x104 세포/웰의 밀도로 폴리-D-리신- 및 라미닌-코팅된 μ 슬라이드 상에 시딩하고, 37℃ 5%CO2에서 인큐베이션하였다. 배지를 3일 동안 매일 교체하였다. 배양 3일 후에, 각 조건 (대조군 또는 파클리탁셀)의 DRG 세포를 하기 처리를 사용하여, 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하였다:
Figure pct00019
PBS (대조군)
Figure pct00020
LAT9991-PAL 2.5 μM
Figure pct00021
LAT9991-PAL 2.5 μM + 경쟁인자 LAT8881 50 μM
Figure pct00022
LAT9991-PAL 2.5 μM + 경쟁인자 LAT9991 50 μM
Figure pct00023
LAT9991-PAL 5 μM
Figure pct00024
LAT9991-PAL 5 μM + 경쟁인자 LAT8881 50 μM
Figure pct00025
LAT9991-PAL 5 μM + 경쟁인자 LAT9991 50 Mm
배양 배지를 제거하고, PBS로 교체하였다. 세포를 얼음 위에서 20분 동안 UV 광 조사 (365 (365 nm))하여 LAT9991-PAL을 표적 단백질에 가교시켰다. 세포를 실온에서 15분 동안 파라포름알데히드 3.7%로 고정시켰다 (Mol. Probes R37602). LAT-9991-PAL 리간드 결합의 국소화는 공초점 현미경하에 면역형광 (immunofluorescence)에 의해 밝혀졌다.
LAT9991-PAL은 잠재적 표적(들)의 위치를 시각화하기 위해 공초점 현미경과 함께 사용하였으며, 진통제는 중추 또는 말초 뉴런, 또는 뉴런 근처에 있는 아교 세포 (glial cell) 또는 염증 세포의 여러 부위에서 활성을 가질 수 있다는 점에 주목하였다. LAT9991-PAL이 결합하는 세포 타입을 확인하기 위해, 신경병증 또는 대조군 부위에서 DRG의 3일간의 세포 배양물을 척수 신경 결찰로 인한 신경병증을 가진 동물로부터 채취하였다. 간략하게, 수컷 Sprague Dawley 래트의 L5 및 L6 척수 신경을 결찰하여 손상된 뒷발의 견고하고 오래 지속되는 기계적 이질통을 형성하였다. 신경병증성 통증의 존재는 동측 (ipsilateral) (손상된) 및 대측 (contralateral) (비손상) 발에 적용된 von Frey (VF) 필라멘트 (up-and-down method)를 사용하여 척수 신경 결찰 수술 2주 후에 (14일차) 확인하였다. 살아있는 DRG 세포를 이전에 설명한 대로 해부하고, UV 조사 전에 1시간 동안 LAT9991-PAL과 인큐베이션하여 결합을 인 시투 (in situ) 고정시켰다. 여러 번 반복된 실험을 통해, LAT9991-PAL은 신경병증성 DRG의 뉴런에만 국소화되었고, 영향을 받지 않은 DRG (협착 모델의 대측 DRG 또는 화학요법 모델의 건강한 대조군 동물의 DRG)에서는 국소화되지 않은 것으로 밝혀졌다. 특이성 대조군으로서, LAT9991-PAL의 신경병증성 DRG에의 결합은 과량의 표지되지 않은 LAT9991 펩티드의 존재하에 차단되었다.
고출력 이미징 (High-powered imaging)은 LAT9991-PAL에 대한 표적이 신경 세포막 내부에서 표시되었고, 세포질에서 점상 염색 (punctate staining)으로 표시되었음을 보여주었다 (도 2).
LAT9991-PAL은 신경병증 동물 유래 신경의 조직 균질물에 가교하였다. 겔에서 분리한 후에, ~12-15kD, ~37kD 및 ~50kD의 3가지 분자량 범위에서 표적을 확인하는 특정 염색 패턴이 밝혀졌다 (도 3). 참고로, 사이클릭 펩티드 접합체 LAT9993-PAL 및 LAT7771-PAL은 또한 신경병증 동물 유래 신경의 조직 균질물에 가교된 것으로 밝혀졌다.
잠재적인 표적을 대표하는 적어도 3개의 분자량 밴드를 확인하고, 겔의 12-15kD, 37kD 및 50kD 영역을 절제하고, 제한된 단백질 분해를 수행하고, 질량 분석법으로 분석하여 차등적으로 농축된 단백질로부터 펩티드를 확인하였다. (i) 비-가교 샘플 및 (ii) 과량의 LAT8881 (서열 번호: 1; YLRIVQCRSVEGSCGF)의 존재하에 LAT9991-PAL과 비교하여 LAT9991-PAL 가교된 샘플 중에 농축된 단백질로부터 적어도 2개의 상이한 펩티드들을 검출하여 포지티브 시그니쳐 (positive signature)로 간주하였다. LAT9991-PAL, LAT9993-PAL 및 LAT7771-PAL을 또한 사용하였다. LAT9993 (서열 번호: 41)은 아미노산 서열 SCRSRPVESSC를 갖는다.
37kDa 밴드로부터, 질량 분석에 의한 분석으로 LANCL1을 후보로 확인하였고, 상기에 기재된 바와 같이 (LAT9991-PAL에의 결합의 경우) "히트 (hit)"에 대한 임의의 통계적 기준을 충족하였다 (LANCL1-유래 펩티드, 하기 밑줄 및 진하게로 식별되었음):
MAQR AFPNPYADYNKSLAENYFDSTGRLTPEFSHR LTNKIRELLQQMERGLKSADPQDGTGYTGWAGIAVLYLHLHNVFGDPAYLQMAHSYVK HSLNCLSR R SITFLCGDAGPLAVAAVLYHK MNSGK QAEDCITR LIHLNKIDPHVPNEMLYGRIGYIFALLFVNK NFGEEKIPQSHIQQICETILTSGEK LSRKRNFTTKSPLMYEWYQEYYVGAAHGLAGIYYYLMQPSLHVSQGK LHSLVKPSVDFVCQLKFPSGNYPSCLDDTR DLLVHWCHGAPGVIYMLIQAYKVFKEEHYLCDAQQCADVIWQYGLLKKGYGLCHGAAGNAYAFLALYNLTQDAKYLYRACK FAEWCLDYGE HGCRTPDTPFSLFEGMAGTIYFLADLLVPTKAKFPAFEL).
LANCL1이 또한 LAT9993-PAL 및 LAT7771-PAL 샘플에서 검출되었음에 유의한다. 도 4에서 LANCL1은 대조군 비-가교된 샘플 (CTL) 및 과량의 LAT8881과 인큐베이션한 샘플 (COMP)보다 LAT7771-PAL, LAT9991-PAL 및 LAT9993-PAL 샘플에서 수회 배수-변화에 의해 농축된 것을 보여주었다 (Y 축은 log base 2 scale로 제공됨).
질량 분석 시퀀싱 풀-다운 실험에 의해 관찰된 LANCL1 농축을 확인하기 위해, LANCL1에 대한 상업용 항체 (Invitrogen제 폴리클로날 토끼 항-LANCL1, PA557107)를 사용하여, 신경 마이크로솜 제제에서 LANCL1의 존재를 확인하였다. 간략하게, 래트 척수를 용해 버퍼 (인산나트륨 버퍼 5mM pH7.4, 수크로스 0.32M + 프로테아제 억제제 (Roche의 완전 ULTRA 정제, mini easy pack, 05892970001))에서 용해시켰다. 다음 단계는 모두 얼음 위에서 수행하였다. 샘플을 균질화하고, 전체 추출물을 10000g에서 20분 동안 원심분리하였다. 상등액을 유지하고, 10 ml의 추가의 용해 버퍼를 부가하여 펠렛에 대해 용해 단계를 반복한 다음에, 새로운 원심분리 단계를 수행하였다. 이러한 단계 추출은 기재된 바와 같이 2회 수행하고, 상등액을 모아서, 4℃에서 90분 동안 Ti50.2 Beckman 로터를 사용하여 105000g으로 원심분리하였다. 펠렛은 마이크로솜 분획으로 유지하고, -80℃에서 보관하였다. 마이크로솜 분획의 단백질 농도는 8.8 mg/ml이었다. 마이크로솜 분획은 다음 중 하나와 함께 인큐베이션하여, 3가지 상이한 조건으로 처리하였다: 1) DMSO 대조군; 2) 5μM LAT9991-PAL 프로브; 3) 50μM LAT8881로 사전-처리, 경쟁인자 10배 과량 및 LAT9991-PAL 프로브; 그 다음에 UV-조사하여 광-가교를 개시하였다 (365 nm에서 20분). 후속하여, 프로브-표지된 단백질을 바이오틴 아지드 프로브와 상기 프로브 상의 지방족 알킨 관능기를 통해 클릭 반응시켜서 프로브-표지된 단백질(들)에 바이오틴 리포터를 선택적으로 태그하였다 (제조자의 지침에 따름; Thermo Fischer Click-iT Assay kits). 입력 샘플을 꺼내고, 지정하였다. 나머지 반응 부피를 스트렙타비딘 자기 비드 슬러리 반응에 부가하여 바이오틴-표지된 단백질을 정제하였다. 분획을 통한 흐름을 지정하고, 비드를 50 mM Tris, 150 mM NaCl pH 7.5, 2 M 우레아로 2회 세척한 후에, 50 mM 중탄산암모늄으로 2회 세척하였다. 그 다음에 비드를 50 mM 중탄산암모늄에 재현탁하고, 토끼 항-LANCL1 (Invitrogen PA-57107 항체) 및 염소 항-토끼 (E Bioscience ref-18881633)를 사용하여 Western Blot 분석에 사용하였다. 이후에 상기 블롯을 HRP 접합체로 프로브하고, 증강 화학발광 (SuperSignal West Dura substrate, ThermoFisher)으로 시각화하고, ChemiDocTM MP Imaging System (Bio Rad)으로 기록하였다. ChemiDocTM MP Imaging System으로 획득한 이미지는 Imagelab 소프트웨어 (Bio-Rad)로 분석하였다.
LANCL1은 네이티브 대조군 PBS 샘플, LAT9991-PAL 샘플 및 과량의 LAT8881과 함께 인큐베이션한 LAT9991-PAL 샘플의 FT (flow through) 입력에서 검출하였다 (도 5 참조). 이들 데이터로부터 LANCL1이 신경 세포에서 발현되는 것을 확인하였다. 그러나, LANCL1은 LAT9991-PAL 샘플의 용출액에서만 특이적으로 결합된 단백질로서 검출될 수 있었고, 수준은 과량의 LAT8881이 존재하는 경우 감소하였다 (도 5에서 CP 레인 참조).
추가 연구에서, LAT9991-PAL, LAT7771-PAL 및 LAT9993S-PAL은 신경병증 동물 유래 신경의 조직 균질물에 가교되었다. 겔에서 분리한 후에, ~12-15kD, ~37kD 및 ~50kD의 3가지 분자량 범위에서 특정 염색 패턴이 표적을 나타내었다. LAT9991-PAL, LAT7771-PAL 및 LAT9993S-PAL은 각각 신경병증 동물의 신경의 조직 균질물에 가교된 것으로 나타났다. 사이클릭 펩티드 LAT9991-PAL, LAT7771-PAL 및 LAT9993S-PAL의 재조합 LANCL1에의 결합은 과량의 LAT8881의 존재하에 억제되었다 (각각 도 6-8 참조).
병행 연구에서, LAT9991-PAL은 ~12-15kD, ~37kD 및 ~50kD의 3가지 분자량 범위를 나타내는 특정 염색 패턴에 의해 입증된 바와 같이, 신경병증 동물 유래의 신경의 조직 균질물에 가교되었다.
LAT9991-PAL의 재조합 LANCL1에의 결합을 과량의 LAT8881, LAT9991, LAT7771 및 LAT9993S의 존재하에 억제하였다 (도 9 참조).
실시예 2: 사이클릭 펩티드의 LANCL2 및 LANCL3에의 결합을 확인하기 위한 In-gel 형광
In-gel 형광 프로토콜에 따라 사이클릭 펩티드가 LANCL2 및 LANCL3에 결합하는지 여부를 결정하였다. 간략하게:
1. LANCL2 및 LANCL3 라벨링, 96웰 플레이트에서 분석, PBS 중 반응 부피 40 μl
Figure pct00026
1 μg/웰의 인간 재조합 LANCL2 (아미노산 잔기 1-450; ABCAM catalog no. ab163277, ~0.07 mg/ml; 밀 배아에서 발현되고, N-말단 GST 태그 통합; UniProt Accession no: Q9NS86)
MGETMSKRLKLHLGGEAEMEERAFVNPFPDYEAAAGALLASGAAEETGCVRPPATTDEPGLPFHQDGKIIHNFIRRIQTKIKDLLQQMEEGLKTADPHDCSAYTGWTGIALLYLQLYRVTCDQTYLLRSLDYVKRTLRNLNGRRVTFLCGDAGPLAVGAVIYHKLRSDCESQECVTKLLQLQRSVVCQESDLPDELLYGR AGYLYALLYLNTEIGPGTVCESAIKEVVNAIIESGKTLSREERKTERCPLLYQWHRKQYVGAAHGMAGIYYMLMQPAAKVDQETLTEMVKPSIDYVRHKKFRSGNYPSSLSNETDRLVHWCHGAPGVIHMLMQAYKVFKEEKYLKEAMECSDVIWQRGLLRKGYGICHGTAGNGYSFLSLYRLTQDKKYLYRACKFAEWCLDYGAHGCRIPDRPYSLFEGMAGAIHFLSDVLGPETSRFPAFELDSSKRD; 서열 번호: 57), vol 3μl
Figure pct00027
3 μg/웰의 인간 재조합 LANCL3 (아미노산 잔기 1-420; ABCAM catalog no. ab163277, ~0.07 mg/ml; 대장균에서 발현되고, N-말단 10xHis 태그 및 C-말단 Mvc 태그 통합; UniProt Accession no: Q6ZV70);
MDTKRCFANRFDDYQGSLLAGQCEEAVAPLVTATIERILQELPPLGGGAEARGATAGASACQGGLYGGVAGVAYMLYHVSQSPLFATARERYLRSAKRLIDACARAEEWGEPDADTRAAFLLGGAGVYAVATLVYHALGRSDYVQPLGKFRALCAVCAPVSFLECGSDELFVGRAGYLCAALVLKQKLAQEVLTPAQIKSICQAILDSGKQYAIKKRKPFPLMYSYYGTEYLGAAHGLSSILQMLLSYHEHLKPSDRELVWQSVDFLMEQEQNCNWPPELGETIERENELVHWCHGAPGIAYLFAKAYLVSKKPQYLDTCIRCGELTWQKGLLKKGPGICHGVAGSAYVFLLLYRLTGNSKYIYRAQRFAQFLFTEEFKAGSRVLESIYS LYEGFSGTVC FLIDLLQPNQAEFPLFSVFV; 서열 번호: 58), vol 3μl
Figure pct00028
비히클 DMSO
Figure pct00029
±LAT8881 (인간 성장 호르몬의 사이클릭 펩티드 단편; 서열 번호: 1)
Figure pct00030
서열 번호: 1 경쟁인자 @ 50, 100 또는 200 μM, 사전-인큐베이션 10분, 4 μl의 스톡 용액 10배 농축
Figure pct00031
±LAT9991-PAL 프로브 @ 1 μM, 플레이트 교반기에서 실온에서 30분 인큐베이션 (빛으로부터 보호됨), 10 μM 스톡 용액 4 μl
2. LANCL2 및 LANCL3 포토라벨링
Figure pct00032
조사 @ 365 nm 20분 (4℃, 얼음이 함유된 지지대에서)
Figure pct00033
깨끗한 Eppendorf 튜브에 40 μl 전달
3. 환원 및 알킬화
Figure pct00034
환원: DTT 10 mM, 30분 @ 56℃
Figure pct00035
알킬화: 요오도아세트아미드 30 mM, 45분 @ RT Click-iT AzideTamra 60 μL 샘플
4. 클릭-반응
Figure pct00036
아세톤 침전 -20℃ ON
Figure pct00037
50 mM Tris-HCl pH 7.5 중 1% SDS 30 μL에 재현탁된 건조 펠렛
Figure pct00038
포토라벨링된 LANCL1을 30분 동안 Click-iT Protein Reaction Buffer Kit (ThermoFisher Scientific)를 사용하여 구리 클릭 화학에 의해 테트라메틸로다민 (TAMRA) 아지드 @ 100 μM TAMRA 아지드로 태그하였다.
Figure pct00039
클로로포름-메탄올 방법을 사용한 침전, 펠렛을 실온에서 10분 동안 공기-건조시키고, 30 μL SDS 로딩 버퍼 (2.5% v/v 2-머캅토에탄올을 함유하는 Bio Rad XT 샘플 버퍼)에 재현탁하고, 가열 (60℃, 30 분)하였다.
5. 가교된 단백질의 겔-기반 분석
Figure pct00040
SDS-PAGE (4-15% CriterionTM TGX Stain-FreeTM Protein Gel, Bio Rad)
Figure pct00041
녹색 LED 광을 여기 소스로 사용하고 BP600/20 nm 방출 필터를 가진 ChemiDoc™ MP Imaging System (Bio Rad)을 사용하여 In-gel 형광 스캐닝으로 분석하였다.
도 10 및 11에 도시된 바와 같이, LAT9991-PAL은 LANCL2 및 LANCL3에 결합하고, 상기 결합은 과량의 LAT8881의 존재에 의해 억제된다.
실시예 3: 6His-LanCL1의 LAT9991-PAL 프로브를 사용한 인 비트로 포토라벨링 및 특정 결합 부위를 확인하기 위한 LC-MS/MS 분석
A. MS-분석을 위한 라벨링된 LANCL1의 제조
530 μL PBS 중 재조합 인간 6His-LaNCL1 단백질 (2 μM, 1 nmol, 53 μg)을 50μM의 LAT8881 또는 DMSO와 함께 10분 동안 사전-인큐베이션한 다음에, NuncTM MicroWellTM 96-웰 플레이트 (Thermo Fisher Scientific cat#167008)에서 실온에서 추가 30분 동안 25μM LAT9991-PAL로 처리하였다 (최종 반응 부피, 530 μL). 샘플을 4℃에서 20분 동안 UV-조사하였다 (365 nm). UV-조사 후에, 샘플은 3 μg 또는 50 μg의 단백질을 함유하는 2개의 상이한 샘플로 분할하였다.
B. In gel 형광 스캐닝에 의한 단백질 포토라벨링의 제어
단백질 샘플 (3 μg 단백질)을 1% SDS 및 10 mM DTT로 조정하였다. 56℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에, 단백질 샘플을 암실에서 RT에서 45분 동안 30 mM 요오도아세트아미드로 처리하였다. -20℃로 미리 냉각된 건조 아세톤 (9 부피)을 부가하고, 흐린 혼합물을 완전히 와동하고, -20℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 원심분리 (4℃에서 10분 동안 15,000 xg) 후에, 상등액을 붓고, 나머지 펠렛을 -20℃ 아세톤으로 세척하였다. 세척 상등액을 원심분리에 의해 제거하고, 침전된 단백질 펠렛을 실온에서 10분 동안 공기-건조시키고, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 중 1% SDS 30μL에 재현탁시켰다. 프로브-라벨링된 LANCL1에는 제조자의 지침에 따라 #을 사용하여 구리 클릭 화학에 의해 100 μM 테트라메틸로다민 (TAMRA) 아지드 (Thermo Fisher Scientific cat# T10182)로 태그하였다. 그 다음에 Wessel and Fluegge (Wessel and Fluegge, 1984)에 의해 설명된 클로로포름-메탄올 방법을 사용하여 단백질을 침전시키고, 침전된 단백질 펠렛을 실온에서 10분 동안 공기-건조시켰다. 상등액을 제거한 후에, 단백질 펠렛을 공기-건조시키고, laemmli 버퍼에 용해시키고, 60℃에서 20분 동안 가열하고, In gel 형광 스캐닝으로 분석하였다.
C. MS-분석을 위한 라벨링된 LANCL1
나머지 50 μg의 단백질 샘플을 -20℃로 사전-냉각된 건조 아세톤 (9 부피)으로 침전시키고, 흐린 혼합물을 완전히 와동시키고, -20℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 원심분리 후에, 펠렛을 50 mM NH4HCO3 중 6M 우레아 30μL에 용해시키고, 10초 동안 3회 초음파 처리하였다. 샘플을 실온에서 60분 동안 10 mM DTT로 환원시키고, 암실에서 실온에서 45분 또는 30 mM 요오도아세트아미드로 알킬화시켰다. 샘플을 50 mM NH4HCO3 pH 8.0으로 희석한 다음에, 최종 효소:기질 비율 1:25 (w/w)로 소화시키고, 이를 약한 교반하에 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 펩티드 혼합물 (50 μg)을 추가로 산성화하고 (1% TFA 최종 농도), Bond Elut OMIX 피펫-기반 SPE C18 팁 (Agilent cat# A57003100)을 사용하여 세척하였다. 먼저, 피펫 팁은 100 μL의 50% ACN을 사용하여 사전-컨디셔닝하고, H2O 중 0.1% TFA 100μl로 평형화하였다. 샘플을 분배하고, 10회 흡인하여 펩티드 혼합물을 로딩하고, H2O 중 0.1% TFA 100μL로 2회 세척하였다. 용출은 50% ACN/0.1% TFA 100μl 및 80% ACN/0.1% TFA 100μl로 연속으로 수행하였다. 그 다음에 용출액을 모으고, 진공하에 증발시켰다. LC-MS/MS 분석 전에, 펩티드를 0.2% FA/5% DMSO 10 μL에 재현탁하였다. 생성된 펩티드를 후속하여 수조에서 15분 동안 초음파 처리하고, 실온에서 5분 동안 혼합하였다.
D. LANCL1 펩티드의 LC-MS/MS 분석
NanoFlex 소스가 있는 Q-Exactive Plus 질량 분석기에 온라인으로 연결된 Ultimate 3000 RSLC (Thermo Fisher Scientific)를 구비한 nanoLC-MS/MS로 펩티드를 분석하였다. 분석 컬럼 (길이 40 cm, ID 75 μm)은 P-2000 Laser Based Micropipette Puller System (Sutter Instrument)을 사용하여 방출기가 당겨진 ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 μm 역상 수지 (Dr Maisch GmbH cat# r119.aq)로 in-house 패킹하였다. 높은 유속에서 배압을 줄이고, 분리 효율을 증진시키기 위해, 컬럼 구획을 60℃로 유지하였다. 펩티드 혼합물 (5 μl)을 분석 컬럼에 로딩하여 용매 A (5% DMSO, 0.2% FA) 중 5% 용매 B (80% ACN, 5% DMSO, 0.2% FA)를 400 nL/min의 유속으로 수행하고, 103분에 걸쳐 300 nL/min의 유속으로 5%에서 30% 용매 B의 선형 구배로 분리하였다. 로딩, 도입 및 세척 단계로 인해, LC-MS/MS 실행의 총 시간은 약 180분이었다. Q-Exactive Plus는 하기 설정을 사용하여 데이터-종속 수집 모드 (data-dependent acquisition mode)에서 작동되었다: 전체-스캔 자동 이득 대조군 (automatic gain control: AGC) 표적 3 x 106, 70,000 해상도; 스캔 범위 350-1500 m/z; Orbitrap 전체-스캔 최대 주입 시간 45ms; MS2 스캔 AGC 표적 3.2 x 103, 17,500 해상도; 최대 주입 45 ms; 정규화된 충돌 에너지 27; 동적 배제 시간 30 s; 분리 윈도우 2.2 m/z; 전체 스캔 당 10 MS2 스캔.
E. MS 데이터 처리
펩티드 및 단백질 확인 및 정량화를 위해 MaxQuant 소프트웨어로 원시 (raw) 파일을 처리하였다. 하기 파라미터를 사용하여 재조합 인간 6HisLANCL1 서열만을 함유하는 데이터베이스에 대해 Andromeda 검색 엔진을 사용하여 소화물 (digests)의 MS/MS 원시 파일을 검색하였다: 시스테인의 카바미도메틸화 (carbamidomethylation)를 고정 변형 (fixed modification)으로 설정하였고, 반면에 N-말단 아세틸화 및 메티오닌 산화를 변수 변형 (variable modifications)으로 설정하였다. 모든 펩티드는 7개 아미노산의 최소 펩티드 길이 및 최대 2개의 미스 절단 (miss cleavages)을 갖는 것을 필요로 한다. Glu-C 절단에 대한 특이성은 글루타메이트 및 아스파르테이트 다음에 절단하는 것을 필요로 하였다. 질량 허용 오차는 MS 및 MS/MS에서 각각 4.5 ppm 및 20 ppm으로 설정하였다. 단백질 및 펩티드 식별을 위한 FDR (false discovery rate)은 최대 1%로 설정하였다. 여러 실행에서 식별을 확인하고 전달하기 위해, MaxQuant의 "실행 간 일치 (match between runs)" 옵션이 0.7분의 일치 시간 윈도우 (Match time window) 및 20분의 정렬 시간 윈도우 (alignment time window)로 활성화되었다. 표준 검색에서 MaxQuant에서 구현된 "의존성 펩티드" 설정에 의해 알려지지 않은 변형을 확인하였다 (Cox et al., 2011; J. Am. Soc. Mass Spectrom.　22:1373-1380). 상기 알고리즘은 이미 확인된 펩티드로부터 유래된 변형된 펩티드에 대한 비편향된 검색 (unbiased search)을 수행한다. 확인되지 않은 스펙트럼이 확인된 스펙트럼과 일치하는 경우, 일치된 서열 및 이론적 및 관찰된 전구물질 질량 간의 질량 이동 (펩티드의 변형에 해당함)을 보고할 것이다. 변형된 펩티드는 FDR이 1%이고 질량 허용 오차가 6.5 mDa인 이미 확인된 비변형 펩티드로부터 유래되는 경우에만 확인된다. 변형된 펩티드는 비변형 "기본 펩티드 (base peptide)" 및 변형된 펩티드 간의 ΔM 질량 이동과 함께 allPeptides.txt에서 추출하였다. 모든 아미노산은 변형 가능한 잔기로 고려하였다. 프로브-변형된 펩티드를 검색하는데 사용된 변형의 질량은 LAT9991-PAL의 경우 + 454.1991 m/z이었고, 이는 해당 프로브의 질량으로부터 2개의 질소 원자를 차감한 값이고, 아르기닌 아미노산 다음에 트립신/Lys C 효소에 의해 절단된다. 이러한 변형은 모든 MaxQuant 검색에서 변수 변형으로 설정하였다. 간략하게, "의존성 펩티드" 분석의 경우, "all.peptides.txt" 파일을 로딩하고, DP 단백질 = "sp|DLanCL1|", DP 질량 차이 = 454.1991 +/- 6 ppm 및 DP 스코어 ">60"에 대해 필터링하였다. 허용 오차가 6 ppm인 광부가물 (photoadduct)에 해당하는 DP 질량 이동을 갖고 "LAT9991-PAL" 및 "LAT9991-PAL+LAT8881"의 2가지 조건에만 존재하고 대조군 "DMSO"에는 존재하지 않는 선택된 펩티드는 포지티브 히트 (positive hits)로 간주하였다. 나머지 히트는 수동 방식으로 추가로 검증하였다. MS 스펙트럼은 비변형 펩티드 및 변형 펩티드의 존재를 검증하기 위해 Xcalibur 소프트웨어로 시각화하였다. 이상적으로, 비변형 펩티드는 3가지 조건 모두에서 검출되어야 하는 반면에, 광-부가물로 변형된 펩티드는 "LAT9991-PAL" 조건에서 검출되어야 하고, "LAT9991-PAL+LAT8881" 조건에서는 더 적은 정도로 검출되어야 하며, 대조군 "DMS0"에서는 검출되지 않았다. MS2 스펙트럼은 비변형 펩티드의 y 및 b 이온에 주석을 달기 위해 MaxQuant의 뷰어 프로그램을 사용하여 시각화하였다. 관심있는 비변형 펩티드 및 변형 펩티드의 MS2 스펙트럼을 XCalibur를 사용하여 분석하여 서열에서 광-부가물의 위치를 결정하였다. y 및/또는 b 이온에서 광-부가물에 해당하는 질량 이동이 예상된다.
결과:
LAT9991-PAL 조건에서 차별적으로 검출된 유일한 변형된 펩티드 서열은 IDPHAPNEM(ox)LYGR이었고, 여기서 PNEM 서열 (인간 LANCL1의 아미노산 잔기 171-174 (서열 번호: 56)은 LAT9991-PAL 부가물의 국소화를 위한 가장 가능성 있는 부위이다 (도 12 참조).
실시예 4: 호흡 상피 세포에 대한 LANCL1 및 LAT9991F-PAL 결합의 공동-국소화
A. 세포 이미징
LAT8881의 광활성화 가능한 유사체 (LAT9991F (서열 번호: 13)-PAL)를 사용하여 실험을 수행하였다. A549 또는 NCI-H358 세포를 30분 동안 2.5 μM의 LAT9991F-PAL로 처리하였다. LAT9991F-PAL을 UV-가교에 의해 이의 표적(들) 부위에 고정하고, LAT9991F-PAL-표적 복합체를 클릭 화학에 의해 녹색-형광 Alexa Fluor 488 알킨 염료로 표지한 후에 형광 신호를 기록하였다. 대조군 세포를 비히클, 디메틸 설폭시드 (DMSO) 및 과량의 모체 약물 LAT8881 또는 다른 경쟁인자, GSH, NSC61610 또는 ABA와 조합된 LAT9991F-PAL로 처리하여, 비-특이적 형광 배경 및 염색의 특이성을 각각 평가하였다. 공동-국소화 (colocalization) 실험을 위해, 후속하여 항-LANCL1 또는 LANCL2 항체 및 Alexa 568 (적색) 접합된 2차 항체를 사용한 면역형광 염색을 수행하였다. 프로브로 표지된 세포의 스택 이미지를 수집하고, Metamorph의 Measure Colocalization 프러그인 또는 ImageJ)의 JACoP 프러그인을 사용하여 LAT9991F-PAL-표적 복합체 및 LANCL1 또는 LANCL2의 공동-국소화 정도를 평가하였다.
약어 목록
DMEM Dulbecco 변형된 eagle 배지
DMSO 디메틸 설폭시드
FBS 우태아 혈청
LanCL1 글루타티온 S-트란스퍼라제 LANCL1
LanCL2 글루타티온 S-트란스퍼라제 LANCL2
NSC NSC61610
GSH L-글루타티온 환원된 단백질
ABA 아브시스산
PAL 광친화성 라벨링
PBS 포스페이트 버퍼 용액
PCC Pearson의 상관 계수
ROI 관심 영역
UV 자외선
물질 및 방법
1. 세포주 및 배양 조건
A549 또는 NCI-H358 세포 (각각 ATCC CCL-185 및 ATCC CRL-5807)를 10% 열-불활성화 FBS (Dutscher, #SV30160-036), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco, #15140-122)을 함유하는 적절한 배지에서 배양하였고, 5% CO2와 가습된 37℃ 인큐베이터에서 유지하였다.
세포 배양 배지
세포주 배양 배지
A549
ATCC
CCL-185		 DMEM GIBCO ref: 119600 500 ml
피루베이트 데 소듐 (Pyruvate de Sodium) GIBCO 100 mM ref: 11360-039_5 ml, 1 mM 최종
GlutaMax GIBCO 35050-087 5 ml 1 mM 최종
MEM NEAA 1%
페니실린/스트렙토마이신 100x Gibco 농도 피날레: 100 IU/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신
SVF 10% Gibco ref: 10270 50 ml
NCI-H358 ATCC
CRL-5807		 DMEM GIBCO ref: 119600 500ml
피루베이트 데 소듐 (Pyruvate de Sodium) GIBCO 100 mM ref: 11360-039_5 ml, 1 mM 최종
GlutaMax GIBCO 35050-087 5 ml 1 mM 최종
페니실린/스트렙토마이신 100x Gibco 농도 피날레: 100 IU/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신
SVF10% Gibco ref: 10270 50 ml
2. 테스트 항목
LAT9991F-PAL은 감광성 화합물이며, LAT9991F-PAL의 모든 조작은 가능한한 어두운 곳에서 수행하였다. bLAT8881은 Lateral PHARMA (Melbourne, Australia)가 제공하였다. LAT9991F-PAL은 Evotec, Toulouse에서 합성하였다.
테스트 항목의 특성
회사명 분자량 (g/mol) 스톡 농도 (mM) 용매
LAT8881 1813.86 10 DMSO
LAT9991F-PAL 1042.3 10 DMSO
탁솔 (Sigma)T7402 853.91 10 DMSO
H2O2 (Sigma)H1009 34.01 10 DMSO
GSH (Sigma)G6013 307.32 10 DMSO
NSC61610 (Sigma)SML2293 548.59 10 DMSO
아브시스산 (Sigma)SLCD2431 264.32 10 DMSO
3. 장치
- 원심분리기 1-15pk (Sigma)
- 직열 (Direct heat) CO2 인큐베이터 (Thermo Electron)
- UVP CL-1000 UV 가교 챔버 (Hyland Scientific)
- CSU-W1 Yokogawa 공초점 유닛을 구비한 Axiovert200M 현미경 (Zeiss)
4. 테스트 항목 준비
LAT9991F-PAL을 DMSO에 용해시켜서 10 mM 스톡 용액을 제조하였다. 각각의 LAT8881 및 LAT9991F-PAL의 10 mM 스톡 용액으로부터 배양 배지에서 25 μM 및 2.5 μM의 중간 용액을 제조하였다. 각 중간 용액을 PBS로 2배 희석하여 세포 처리에 사용하였다. GSH, NSC61610 및 ABA와 같은 다른 경쟁인자에 대해 10 mM의 스톡 용액을 제조하였다. 25 μM의 최종 농도를 분석에 사용하였다.
5. 조직화학적 염색
ibidiTreat Polymer Coverslips (Ibidi, #80826)을 37℃에서 1시간 동안 혈청으로 코팅한 다음에, NCI-H358 세포에 대해 라미닌 (100 μg/ml)으로 코팅하였다 (37℃에서 1시간 동안 인큐베이션).
A549 또는 NCI-H358 세포를 200 μl의 완전 배지 중에 2.5 × 105 세포/cm2로 ibidiTreat Polymer Coverslips (Ibidi, #80826) 상에 시딩하였다. 24시간 후에, 배지를 제거하고, PBS (Gibco, #10010049)로 세포를 세척한 다음에, 탁솔 1μM로 3시간 또는 H2O2 25μM로 2시간 동안 사전-처리하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 그 다음에 유도된 스트레스 세포 (stress cells) 또는 대조군 세포 (control cells)를, LAT8881 (25μM) 또는 경쟁인자로 사용된 다른 화합물의 존재 또는 부재하에, PBS 중 LAT9991F-PAL (2.5μM)에 30분 동안 노출시키고, 10분 동안 사전-인큐베이션하였다. 처리 후에, 세포를 차가운 PBS로 세척하고, PBS에서 20분 동안 UV-조사하였다 (365 nm). 4% 파라포름알데히드로의 고정 및 투과 (permeabilization) (0.5% Triton/PBS) (Image-iTTM Fixation/Permeabilization Kit, ThermoFisher, #R37602) 후에, Alexa Fluor 488 알킨 (1 μM) (ThermoFisher, #A10267)을 사용한 생체직교 반응 (bioorthogonal reaction)은 제조자 프로토콜에 따라 Click-iTTM Cell Reaction Buffer Kit (ThermoFisher, #C10269)를 사용하여 25℃에서 수행하였다. 클릭 반응 후에, 세포를 PBS로 2회 세척하고, PBS 중 3% BSA로 1시간 동안 차단하고, Hoechst 33342 염료 (ThermoFisher, #H1399)로 염색하였다.
공동-국소화 실험을 위해, 세포를 PBS 중 3% BSA에서 마우스 항-LanCL1 항체 (Invitrogen, PA5-57-107) (희석 1:1000) 또는 LanCL2 (Atlas Antibodies HPA019711) (희석 1:1000)와 함께 4℃에서 밤새 추가로 인큐베이션하고, PBS로 2회 세척한 다음에, PBS 중 3% BSA에서 염소 항-마우스 Alexa 488 (Molecular Probes, #A21467) (희석 1:800)과 1시간 동안 각각 인큐베이션하였다. PBS로 3회 더 세척한 후에, 세포를 Ibidi Mounting Medium (ibidi, #50001)에 포매하였다. 시편은 분석할 때까지 암실에서 4℃로 보관하였다.
6. 현미경 및 이미지 분석
이미지는 CSU-W1 Yokogawa 공초점 유닛을 사용하여 Axiovert200M (Zeiss) 현미경에서 획득하였다. 이러한 현미경에는 plan Apochromat X40 건식 대물렌즈 NA (numerical aperture) 0.95 및 Neofluar X100 유침 대물렌즈 NA 1.45가 장착되어 있다. 이미지는 EMCCD 카메라 (Prior, ProEM 1024X1024)로 캡쳐하였다. 다양한 실험 설정 (즉, LAT9991F-PAL-표적 복합체, LANCL1의 정량화)을 설명하기 위해, 레이저 출력 및 노출 설정을 개별적으로 조정하고, 비교 가능성 (comparability)을 허용하는 전체 측정 전반에 걸쳐 일정하게 유지하였다. Metamorph 소프트웨어 (Molecular Devices)로 이미지를 획득하였다. 적분 세기 (Integrated intensity: II) 및 표면 (A)은 z-스택 이미지의 각 형광 염료에 대해 측정하였다. 간략하게, 배경 형광은 z-스택의 모든 슬라이스에서 차감하였다. 그 다음에, 각 채널에 대해 DMSO-처리된 세포 이미지에 대해 정의된 역치를 분석된 모든 LAT9991F-PAL-처리된 세포 이미지에 적용하여 내재화된 형광 신호를 정량분석하였다. 관심 영역 (region-of-interest: ROI)을 각 대상에 대해 정의하였으며, II 및 A는 Metamorph 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. II/A 비율은 각 조건에 대해 결정하였다. Dunnett의 다중 비교 테스트 (GraphPad Prism 버전 7.0)와 관련된 one-way ANOVA를 사용하여, 유도된 스트레스의 유무하에 각 조건에 대해 LAT9991F-PAL-처리 또는 LAT9991F-PAL+LAT8881-처리 및 LAT9991F-PAL + 다른 경쟁인자 처리와 DMSO를 비교하였다. 공동 국소화 분석을 위해, z-스택 이미지는 이미지의 ROI에 있는 모든 픽셀에 걸쳐 두 대상들 간의 중첩 퍼센트를 결정하기 위해 Metamorph 소프트웨어의 Measure Colocalization 프러그인, 또는 Pearson 상관 계수 (Pearson's correlation coefficient: PCC)를 계산하기 위해 ImageJ 소프트웨어 (Bolte and Cordelieres 2006)의 JACoP 프러그인을 사용하여 분석하였다. PCC는 이미지의 ROI에 있는 모든 픽셀에서 측정된다. PCC 값의 범위는 -1 내지 +1이다. 2개의 프로브의 공동 국소화가 없는 경우, 예상 PCC는 0이다. 포지티브 PCC는 2개의 프로브가 어느 정도 공동 국소화되었음을 의미한다. 고급 3D 시각화를 위해, Avizo Fire 3D 시각화 및 분석 소프트웨어 (FEI)로 이미지를 처리하였다.
7. siRNA에 의한 LANCL 녹다운
ibidiTreat Polymer Coverslips (Ibidi, #80826)을 37℃에서 혈청으로 1시간 동안 코팅한 다음에, NCI-H358 세포에 대해 라미닌 (100 μg/ml)으로 코팅하였다 (37℃에서 1시간 인큐베이션). A549 또는 NCI-H358 세포를 완전 배지 중 2.5 Х 105 세포/cm2로, 최종 부피 200μl로, ibidiTreat Polymer Coverslips (Ibidi, #80826) 상에 시딩하였다. A549 또는 NCI-H358 세포는 리포펙타민 RNAi-MAX Transfection Reagent (Thermo Fisher LMRNA015) 키트를 사용하여 형질감염하였다. 24시간 후에, 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 완전 배지를 부가하였다. 형질감염을 위한 혼합 용액을 준비하고, 5 μl의 siRNA 대조군 (SiControl) 또는 siLanCL1 (Silencing of Glutathione S-transferase LANCL1) 스톡 용액 20 μM을 125 μl의 OptiMEM 배지 (최종 농도 100 nM)를 용액 A로 부가하였다. si-RNA는 Dharmacon: ON-TARGET plus human LANCL1 (10314) siRNA - SMART POOL (L-012166-00-0005)로부터 구입하였다.
리포펙타민 RNAI 최대 시약 3 μl의 용액을 용액 B로서 125 μl의 OptiMEM 배지에 부가하였다. 용액 A 및 용액 B를 혼합하고, 와동하고, 20분 동안 인큐베이션하였다. 혼합 용액 200 μl를 세포에 부가하였다. 24시간 후에, 배지를 제거하고, PBS로 2회 세척하고, 혈청이 포함된 완전 배지를 부가하였다. 추가 24시간 후에, 배지를 제거하고, 처리를 수행하였다.
결과
1. A549 선암성 폐포 기저 상피 세포주
공초점 현미경 검사로부터 선암성 폐포 기저 상피 세포주인 A549에서 LANCL1 및 LAT9991F-PAL 결합의 공동 국소화를 보여주었다. A549 세포에서 LANCL1의 siRNA 녹다운 (SiLANCL1 A549 세포) 후에 LANCL1 및 LAT9991F-PAL의 공동 국소화가 소실되었다. 이는 SiLANCL1 A549 세포의 세포질에서 내인성 LANCL1의 약한 검출에 의해 입증된 바와 같이, siRNA를 통해 LANCL1이 불완전하게 침묵되었다 (도 13 참조).
LAT9991F-PAL 결합은 과산화수소 (H2O2; 2시간 동안 25 μM) 또는 탁솔 (3시간 동안 1 μM)로 유도된 산화적 스트레스 후에 siLANCL1 A549 세포에서 검출되었지만, 결합 수준은 대조군 세포 (SiControl)와 비교하여 세기가 떨어졌다.
SiLANCL1 A549 세포에 대한 LAT9991F-PAL 결합은 대조군 세포와 비교하여, 과량의 LAT8881 (25 μM), LAT9993S (25 μM), LAT7771 (25 μM) 및 글루타티온 (GSH; 25 μM)의 존재하에 부분적으로 경쟁하였다. 대조적으로, SiLANCL1 A549 세포에 대한 LAT9991F-PAL 결합은 테스트한 모든 조건에서 LANCL2 리간드인 NSC61610에 의해 강력하게 경쟁하였다.
2. NCI-H358 비-소세포 폐암 세포주
공초점 현미경 검사로부터 비-소세포 폐암 세포주인 NCI-H358에 결합하는 LANCL1 및 LAT9991F-PAL의 공동-국소화를 보여주었다. NCI-H358 세포에서 LANCL1의 siRNA 녹다운 (SiLANCL1 NCI-H358 세포) 후에 LANCL1 및 LAT9991F-PAL의 공동-국소화가 소실되었다. 이는 SiLANCL1 NCI-H358 세포의 세포질에서 내인성 LANCL1의 약한 검출에 의해 입증된 바와 같이, siRNA를 통해 LANCL1이 불완전하게 침묵되었다.
LAT9991F-PAL 결합은 스트레스 후에 siLANCL1 NCI-H358 세포에서 검출되었지만, 결합 수준은 대조군 세포와 비교하여 세기가 떨어졌다.
SiLANCL1 NCI-H358 세포에 대한 LAT9991F-PAL 결합은 대조군 세포와 비교하여, 과량의 LAT8881 (25 μM), LAT9993S (25 μM), LAT7771 (25 μM) 및 글루타티온 (GSH; 25 μM)의 존재하에 부분적으로 경쟁하였다. 대조적으로, SiLANCL1 NCI-H358 세포에 대한 LAT9991F-PAL 결합은 테스트한 모든 조건에서 NSC61610에 의해 강력하게 경쟁하였다.
이들 데이터로부터 LANCL1은 LAT8881, LAT9991, LAT9991F, LAT9993 및 LAT7771을 포함하는, 본원에 개시된 사이클릭 펩티드의 추정 표적임을 확인하였다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물의 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.
본원에서 임의의 참고문헌의 인용은 이러한 참고문헌이 본 출원에 대한 "선행 기술"로 이용 가능하다는 인정으로 해석되어서는 안된다.
명세서 전반에 걸쳐, 목적은 본 발명을 임의의 일 구체예 또는 특징들의 특정 집합으로 제한하지 않고 본 발명의 바람직한 구체예를 설명하는 것이다. 그러므로, 당업자는 본 개시내용에 비추어, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고, 예시된 특정 구체예에서 다양한 수정 및 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 모든 수정 및 변경은 첨부된 청구항의 범위내에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (72)

  1. 대상체에서 통증 (pain)을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 1 (Lanthionine synthetase C-like protein 1: LANCL1)에 결합하는 약제 (agent)의 치료적으로 유효한 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 약제는 인간 성장 호르몬 또는 이의 비-인간 상동체 (non-human homologue) 유래의 펩티드가 아니며, 상기 약제는 LANCL1에의 결합에 대해 서열 번호: 1 (YLRIVQCRSVEGSCGF)을 포함하는 사이클릭 펩티드 (cyclic peptide)와 경쟁하는 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 통증은 신경병증성 통증 (neuropathic pain)인 것인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 신경병증성 통증은 당뇨병성 신경병증; 대상포진 (띠헤르페스)-관련 신경병증; 섬유 근육통; 다발 경화증, 뇌졸중, 척수 손상; 만성 수술 후 통증, 환상 사지 통증, 파킨슨병; 요독증-관련 신경병증; 아밀로이드증 신경병증; HIV 감각 신경병증; 유전성 운동 및 감각 신경병증 (HMSN); 유전성 감각 신경병증 (HSN); 유전성 감각 및 자율 신경병증; 궤양-절단을 동반한 유전성 신경병증; 니트로푸란토인 신경병증; 순대양 신경병증; 영양 결핍으로 인한 신경병증, 신부전으로 인한 신경병증, 삼차신경 신경병증성 통증, 비정형성 치통 (환상 치아 통증), 구강 작열감 증후군, 복합 부위 통증 증후군, 반복 사용 긴장성 손상 (repetitive strain injury), 편두통, 약물-유도 말초 신경병증 및 감염과 관련된 말초 신경병증, 만성 요통, 복합 부위 통증 증후군, 턱관절 장애 (temporomandibular joint disorders), 편평 태선 (Lichen Planus) 및 반사 교감신경 이영양증으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 진통제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 추가의 진통제는 (i) LANCL1에 결합하는 약제, 또는 (ii) LANCL1에의 결합에 대해 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드와 경쟁하는 약제가 아닌 것인 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 추가의 진통제는 대상체에서 통각수용기성 통증 (nociceptive pain)을 완화시킬 수 있는 약제를 포함하는 것인 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 추가의 진통제는 오피오이드 (opioid)인 것인 방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 추가의 진통제는 모르핀, 펜타닐, 트라마돌, 코데인, 디하이드로코데인, 하이드로코돈, 아세틸디하이드로코데인, 옥시코돈, 옥시모르폰 및 부프레노르핀, 및 비-스테로이드성 항-염증제 (non-steroidal anti-inflammatory drug: NSAID)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 NSAID는 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 아세트아미노펜, 디플루니살, 살살레이트, 페나세틴, 페노프로펜, 케토프로펜, 플루르비프로펜, 옥사프로진, 록소프로펜, 인도메타신, 설린닥, 에토돌락, 케토롤락, 디클로페낙, 나부메톤, 메페남산, 메클로페남산, 플루페남산, 톨페남산, 셀레콕시브, 파레콕시브, 루마리콕시브, 에토리콕시브, 피로콕시브, 리메술리드 (rimesulide) 및 리코펠로네안 (licofelonean)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제는 인간 인터루킨-1 수용체-관련 키나제 3 (interleukin-1 receptor-associated kinase 3: IRAK-3) 유래의 펩티드가 아닌 것인 방법.
  10. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제는 인간 프로락틴 (prolactin) 유래의 펩티드가 아닌 것인 방법.
  11. 진통제 (analgesic agents)에 대한 스크리닝 방법으로서, 상기 방법은 (a) 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드, 또는 이의 구조적 유사체의 존재하에, 후보 약제 (candidate agent)의 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 (LANCL)에 대한 결합을 허용하는 조건하에, 후보 약제를 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 (LANCL)과 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 후보 약제가 LANCL에 결합하고, LANCL에의 결합에 대해 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체와 경쟁하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 LANCL에의 결합에 대해 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체와 경쟁하는 후보 약제의 능력은 상기 후보 약제가 진통제 (analgesic agent)임을 나타내는 것인 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드의 구조적 유사체는 인간 인터루킨-1 수용체-관련 키나제 3 (IRAK-3)으로부터 유래된 것인 방법.
  13. 청구항 11에 있어서, 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드의 구조적 유사체는 인간 프로락틴으로부터 유래된 것인 방법.
  14. 청구항 11에 있어서, 상기 구조적 유사체는 하기 화학식 (I)의 펩티드를 포함하고:
    R1-CRSVEGSCG-R2 (I)
    상기에서
    R1은 YLRIVQ, LRIVQ, RIVQ, IVQ, VQ, 및 Q로 구성된 그룹으로부터 선택되거나, 또는 R1은 부재하고,
    R2는 F (페닐알라닌)이거나, 또는 R2는 부재하며,
    상기 화학식 (I)의 펩티드는 2개의 시스테인 잔기들 사이의 디설파이드 결합에 의해 형성된 사이클릭 펩티드인 것인 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 구조적 유사체는 LRIVQCRSVEGSCGF (서열 번호: 11), CRSVEGSCG (서열 번호: 12), CRSVEGSCGF (서열 번호: 13) 및 상기 서열들 중 어느 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 사이클릭 펩티드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 청구항 11에 있어서, 상기 구조적 유사체는 하기 화학식 (II)의 펩티드를 포함하고:
    R1-C-R-X1-X2-P-X3-X4-X5-X6-C-R2 (II)
    상기에서
    X1, X3, X5 및 X6은 세린, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신 및 글리신으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기이고;
    X2는 알라닌, 아르기닌 또는 리신이며;
    X4는 글루탐산 또는 아스파르트산이고;
    R1은
    S,
    HS,
    GHS,
    PGHS,
    APGHS,
    EAPGHS,
    SEAPGHS,
    SSEAPGHS,
    PSSEAPGHS,
    DPSSEAPGHS, 및
    IDPSSEAPGHS로 구성된 그룹으로부터 선택되거나, 또는
    R1은 부재하며;
    R2는
    S,
    SS,
    SSK,
    SSKF,
    SSKFS,
    SSKFSW,
    SSKFSWD,
    SSKFSWDE,
    SSKFSWDEY,
    SSKFSWDEYE,
    SSKFSWDEYEQ,
    SSKFSWDEYEQY,
    SSKFSWDEYEQYK,
    SSKFSWDEYEQYKK, 및
    SSKFSWDEYEQYKKE로 구성된 그룹으로부터 선택되거나, 또는
    R2는 부재하고;
    상기 화학식 (II)의 펩티드는 2개의 시스테인 잔기들 사이의 디설파이드 결합에 의해 형성된 사이클릭 펩티드인 것인 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 구조적 유사체는 YLRVMKCRRFVESSCAF, LRVMKCRRFVESSCAF, CRRFVESSCAF, CRRFVESSCA 및 상기 서열들 중 어느 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 사이클릭 펩티드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 청구항 11에 있어서, 상기 구조적 유사체는 하기 화학식 (III)의 펩티드를 포함하고:
    R1-C-R-I-X1-X2-X3-X4-N-C-R2 (III)
    상기에서
    X1은 이소류신 (I) 및 발린 (V)으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
    X2는 히스티딘 (H) 및 티로신 (Y)으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
    X3은 아스파르트산 (D) 및 아스파라긴 (N)으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
    X4는 아스파라긴 (N) 및 세린 (S)으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
    R1은 YLKLLK, LKLLK, KLLK, LLK, LL, K로 구성된 그룹으로부터 선택되거나, 또는 R1은 부재하고;
    R2는 G (글리신)이거나, 또는 R2는 부재하며,
    상기 화학식 (III)의 펩티드는 2개의 시스테인 잔기들 사이의 디설파이드 결합에 의해 형성된 사이클릭 펩티드인 것인 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 구조적 유사체는 CRIIHNNNC, CRIIHNNNCG, CRIVYDSNC, CRIVYDSNCG 및 상기 서열들 중 어느 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 사이클릭 펩티드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 청구항 11 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 진통제로서 확인된 후보 약제를 단리, 합성 또는 달리 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  21. 청구항 11 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LANCL은 LANCL1, LANCL2 및 LANCL3으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 LANCL은 LANCL1인 것인 방법.
  23. 청구항 11 내지 22 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 확인된 진통제를 포함하는 조성물로서, 상기 약제는 인간 성장 호르몬 또는 이의 비-인간 상동체 유래의 펩티드가 아닌 것인 조성물.
  24. 청구항 23에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  25. 청구항 23 또는 24에 있어서, 상기 약제는 인간 인터루킨-1 수용체-관련 키나제 3 (IRAK-3) 유래의 펩티드가 아닌 것인 조성물.
  26. 청구항 23 또는 24에 있어서, 상기 약제는 인간 프로락틴 유래의 펩티드가 아닌 것인 조성물.
  27. 청구항 23 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 진통제를 추가로 포함하고, 상기 진통제는 LANCL1에 결합하는 약제가 아닌 것인 조성물.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 추가의 진통제는 대상체에서 통각수용기성 통증을 완화시킬 수 있는 약제인 것인 조성물.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 추가의 진통제는 오피오이드인 것인 조성물.
  30. 청구항 28에 있어서, 상기 추가의 진통제는 모르핀, 펜타닐, 트라마돌, 코데인, 디하이드로코데인, 하이드로코돈, 아세틸디하이드로코데인, 옥시코돈, 옥시모르폰 및 부프레노르핀, 및 비-스테로이드성 항-염증제 (NSAID)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 조성물.
  31. 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료하는데 사용하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 1 (LANCL1)에 결합하고, LANCL1에의 결합에 대해 서열 번호: 1 (YLRIVQCRSVEGSCGF)을 포함하는 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체와 경쟁하는 약제를 포함하고, 상기 약제는 인간 성장 호르몬 또는 이의 비-인간 상동체 유래의 펩티드가 아닌 것인 조성물.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 통증은 신경병증성 통증인 것인 조성물.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 신경병증성 통증은 당뇨병성 신경병증; 대상포진 (띠헤르페스)-관련 신경병증; 섬유 근육통; 다발 경화증, 뇌졸중, 척수 손상; 만성 수술 후 통증, 환상 사지 통증, 파킨슨병; 요독증-관련 신경병증; 아밀로이드증 신경병증; HIV 감각 신경병증; 유전성 운동 및 감각 신경병증 (HMSN); 유전성 감각 신경병증 (HSN); 유전성 감각 및 자율 신경병증; 궤양-절단을 동반한 유전성 신경병증; 니트로푸란토인 신경병증; 순대양 신경병증; 영양 결핍으로 인한 신경병증, 신부전으로 인한 신경병증, 삼차신경 신경병증성 통증, 비정형성 치통 (환상 치아 통증), 구강 작열감 증후군, 복합 부위 통증 증후군, 반복 사용 긴장성 손상, 편두통, 약물-유도 말초 신경병증 및 감염과 관련된 말초 신경병증, 만성 요통, 복합 부위 통증 증후군, 턱관절 장애, 편평 태선 및 반사 교감신경 이영양증으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 조성물.
  34. 청구항 31 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 진통제를 추가로 포함하고, 상기 추가의 진통제는 (i) LANCL1에 결합하는 약제, 또는 (ii) LANCL1 또는 이의 상동체에의 결합에 대해 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드와 경쟁하는 약제가 아닌 것인 조성물.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 추가의 진통제는 대상체에서 통각수용기성 통증을 완화시킬 수 있는 약제를 포함하는 것인 조성물.
  36. 청구항 35에 있어서, 상기 추가의 진통제는 오피오이드인 것인 조성물.
  37. 청구항 35에 있어서, 상기 추가의 진통제는 모르핀, 펜타닐, 트라마돌, 코데인, 디하이드로코데인, 하이드로코돈, 아세틸디하이드로코데인, 옥시코돈, 옥시모르폰 및 부프레노르핀, 및 비-스테로이드성 항-염증제 (NSAID)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 조성물.
  38. 청구항 31 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제는 인간 인터루킨-1 수용체-관련 키나제 3 (IRAK-3) 유래의 펩티드가 아닌 것인 조성물.
  39. 청구항 31 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제는 인간 프로락틴 유래의 펩티드가 아닌 것인 조성물.
  40. 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료하기 위한 의약 (medicament)의 제조에서, 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 1 (LANCL1)에 결합하고, LANCL1에의 결합에 대해 서열 번호: 1 (YLRIVQCRSVEGSCGF)의 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체와 경쟁하는 약제 (agent)의 용도로서, 상기 약제는 인간 성장 호르몬 또는 이의 비-인간 상동체 유래의 펩티드가 아닌 것인 용도.
  41. 청구항 40에 있어서, 상기 통증은 신경병증성 통증인 것인 용도.
  42. 청구항 41에 있어서, 상기 신경병증성 통증은 당뇨병성 신경병증; 대상포진 (띠헤르페스)-관련 신경병증; 섬유 근육통; 다발 경화증, 뇌졸중, 척수 손상; 만성 수술 후 통증, 환상 사지 통증, 파킨슨병; 요독증-관련 신경병증; 아밀로이드증 신경병증; HIV 감각 신경병증; 유전성 운동 및 감각 신경병증 (HMSN); 유전성 감각 신경병증 (HSN); 유전성 감각 및 자율 신경병증; 궤양-절단을 동반한 유전성 신경병증; 니트로푸란토인 신경병증; 순대양 신경병증; 영양 결핍으로 인한 신경병증, 신부전으로 인한 신경병증, 삼차신경 신경병증성 통증, 비정형성 치통 (환상 치아 통증), 구강 작열감 증후군, 복합 부위 통증 증후군, 반복 사용 긴장성 손상, 편두통, 약물-유도 말초 신경병증 및 감염과 관련된 말초 신경병증, 만성 요통, 복합 부위 통증 증후군, 턱관절 장애, 편평 태선 및 반사 교감신경 이영양증으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 용도.
  43. 청구항 40 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제는 인간 인터루킨-1 수용체-관련 키나제 3 (IRAK-3) 유래의 펩티드가 아닌 것인 용도.
  44. 청구항 40 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제는 인간 프로락틴 유래의 펩티드가 아닌 것인 용도.
  45. 청구항 40 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 의약은 추가의 진통제와 투여하기 위해 제제화되고, 상기 추가의 진통제는 (i) LANCL1에 결합하는 약제, 또는 (ii) LANCL1에의 결합에 대해 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드와 경쟁하는 약제가 아닌 것인 용도.
  46. 청구항 45에 있어서, 상기 추가의 진통제는 대상체에서 통각수용기성 통증을 완화시킬 수 있는 약제를 포함하는 것인 용도.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 추가의 진통제는 오피오이드인 것인 용도.
  48. 청구항 46에 있어서, 상기 추가의 진통제는 모르핀, 펜타닐, 트라마돌, 코데인, 디하이드로코데인, 하이드로코돈, 아세틸디하이드로코데인, 옥시코돈, 옥시모르폰 및 부프레노르핀, 및 비-스테로이드성 항-염증제 (NSAID)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 용도.
  49. 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 (LANCL)의 리간드에 대한 스크리닝 방법으로서, 상기 방법은 (a) 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드, 또는 이의 구조적 유사체의 존재하에, 후보 약제의 LANCL에 대한 결합을 허용하는 조건하에, 후보 약제를 LANCL과 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 후보 약제가 LANCL에 결합하고, LANCL에의 결합에 대해 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체와 경쟁하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 LANCL에의 결합에 대해 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드 또는 이의 구조적 유사체와 경쟁하는 후보 약제의 능력은 상기 후보 약제가 LANCL의 리간드임을 나타내는 것인 방법.
  50. 청구항 49에 있어서, 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드의 구조적 유사체는 인간 인터루킨-1 수용체-관련 키나제 3 (IRAK-3)으로부터 유래된 것인 방법.
  51. 청구항 49에 있어서, 서열 번호: 1을 포함하는 사이클릭 펩티드의 구조적 유사체는 인간 프로락틴으로부터 유래된 것인 방법.
  52. 청구항 49에 있어서, 상기 구조적 유사체는 하기 화학식 (I)의 펩티드를 포함하고:
    R1-CRSVEGSCG-R2 (I)
    상기에서
    R1은 YLRIVQ, LRIVQ, RIVQ, IVQ, VQ, 및 Q로 구성된 그룹으로부터 선택되거나, 또는 R1은 부재하고,
    R2는 F (페닐알라닌)이거나, 또는 R2는 부재하며,
    상기 화학식 (I)의 펩티드는 2개의 시스테인 잔기들 사이의 디설파이드 결합에 의해 형성된 사이클릭 펩티드인 것인 방법.
  53. 청구항 14에 있어서, 상기 구조적 유사체는 LRIVQCRSVEGSCGF (서열 번호: 11), CRSVEGSCG (서열 번호: 12), CRSVEGSCGF (서열 번호: 13) 및 상기 서열들 중 어느 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 사이클릭 펩티드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  54. 청구항 49에 있어서, 상기 구조적 유사체는 하기 화학식 (II)의 펩티드를 포함하고:
    R1-C-R-X1-X2-P-X3-X4-X5-X6-C-R2 (II)
    상기에서
    X1, X3, X5 및 X6은 세린, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신 및 글리신으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기이고;
    X2는 알라닌, 아르기닌 또는 리신이며;
    X4는 글루탐산 또는 아스파르트산이고;
    R1은
    S,
    HS,
    GHS,
    PGHS,
    APGHS,
    EAPGHS,
    SEAPGHS,
    SSEAPGHS,
    PSSEAPGHS,
    DPSSEAPGHS, 및
    IDPSSEAPGHS로 구성된 그룹으로부터 선택되거나, 또는
    R1은 부재하며;
    R2는
    S,
    SS,
    SSK,
    SSKF,
    SSKFS,
    SSKFSW,
    SSKFSWD,
    SSKFSWDE,
    SSKFSWDEY,
    SSKFSWDEYE,
    SSKFSWDEYEQ,
    SSKFSWDEYEQY,
    SSKFSWDEYEQYK,
    SSKFSWDEYEQYKK, 및
    SSKFSWDEYEQYKKE로 구성된 그룹으로부터 선택되거나, 또는
    R2는 부재하고;
    상기 화학식 (II)의 펩티드는 2개의 시스테인 잔기들 사이의 디설파이드 결합에 의해 형성된 사이클릭 펩티드인 것인 방법.
  55. 청구항 54에 있어서, 상기 구조적 유사체는 YLRVMKCRRFVESSCAF, LRVMKCRRFVESSCAF, CRRFVESSCAF, CRRFVESSCA 및 상기 서열들 중 어느 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 사이클릭 펩티드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  56. 청구항 49에 있어서, 상기 구조적 유사체는 하기 화학식 (III)의 펩티드를 포함하고:
    R1-C-R-I-X1-X2-X3-X4-N-C-R2 (III)
    상기에서
    X1은 이소류신 (I) 및 발린 (V)으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
    X2는 히스티딘 (H) 및 티로신 (Y)으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
    X3은 아스파르트산 (D) 및 아스파라긴 (N)으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
    X4는 아스파라긴 (N) 및 세린 (S)으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
    R1은 YLKLLK, LKLLK, KLLK, LLK, LL, K로 구성된 그룹으로부터 선택되거나, 또는 R1은 부재하고;
    R2는 G (글리신)이거나, 또는 R2는 부재하며,
    상기 화학식 (III)의 펩티드는 2개의 시스테인 잔기들 사이의 디설파이드 결합에 의해 형성된 사이클릭 펩티드인 것인 방법.
  57. 청구항 56에 있어서, 상기 구조적 유사체는 CRIIHNNNC, CRIIHNNNCG, CRIVYDSNC, CRIVYDSNCG 및 상기 서열들 중 어느 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 사이클릭 펩티드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  58. 청구항 49 내지 57 중 어느 한 항에 있어서, LANCL의 리간드로서 확인된 후보 약제를 단리, 합성 또는 달리 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  59. 청구항 49 내지 58 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LANCL은 LANCL1, LANCL2 및 LANCL3으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  60. 청구항 59에 있어서, 상기 LANCL은 LANCL1인 것인 방법.
  61. 청구항 49 내지 60 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 확인된 리간드를 포함하는 조성물로서, 상기 리간드는 인간 성장 호르몬 또는 이의 비-인간 상동체 유래의 펩티드가 아닌 것인 조성물.
  62. 청구항 60 또는 61에 있어서, 상기 리간드는 인간 인터루킨-1 수용체-관련 키나제 3 (IRAK-3) 유래의 펩티드가 아닌 것인 조성물.
  63. 청구항 23 또는 24에 있어서, 상기 리간드는 인간 프로락틴 유래의 펩티드가 아닌 것인 조성물.
  64. 대상체에서 병태 (condition)를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 란티오닌 신테타제 C-유사 단백질 1 (LANCL1)에 결합하는 약제의 치료적으로 유효한 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 약제는 인간 성장 호르몬 또는 이의 비-인간 상동체 유래의 펩티드가 아니며, 상기 약제는 LANCL1에의 결합에 대해 서열 번호: 1 (YLRIVQCRSVEGSCGF)을 포함하는 사이클릭 펩티드와 경쟁하고, 상기 병태는 근감소증 (sarcopenia), 내당능 장애 (impaired glucose tolerance), 당뇨병, 비만, 대사 질환 및 비만-관련 병태, 신경병증성 통증, 골관절염, 근육 장애, 소모 장애 (wasting disorder), 악액질 (cachexia), 식욕 부진 (anorexia), AIDS 소모 증후군 (AIDS wasting syndrome), 근이영양증 (muscular dystrophy), 신경근 질환 (neuromuscular disease), 운동 신경 질환 (motor neuron disease), 신경근 접합 질환 (diseases of the neuromuscular junction), 염증성 근병증 (inflammatory myopathy), 화상, 상해 또는 외상, LDL 콜레스테롤 상승과 관련된 병태, 손상된 연골 세포, 프로테오글리칸 또는 콜라겐 생성 또는 품질 (quality)과 관련된 병태, 손상된 연골 조직 형성 또는 품질과 관련된 병태, 손상된 근육, 인대 또는 힘줄 질량 (mass), 형태 또는 기능과 관련된 병태, 근육 또는 결합 조직에 영향을 미치는 염증, 외상 또는 유전자 이상과 관련된 병태, 호흡기 병태 및 골 질환 (bone disorder)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  65. 청구항 64에 있어서, 상기 약제는 인터루킨-1 수용체-관련 키나제 3 (IRAK-3) 유래의 펩티드가 아닌 것인 방법.
  66. 청구항 64 또는 65에 있어서, 상기 약제는 인간 프로락틴 유래의 펩티드가 아닌 것인 방법.
  67. 청구항 64 내지 66 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병태는 호흡기 병태인 것인 방법.
  68. 청구항 67에 있어서, 상기 호흡기 병태는 만성 폐쇄성 폐질환, 천식, 낭포성 섬유증, 폐암, 및 기도 감염으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  69. 청구항 68에 있어서, 상기 호흡기 병태는 기도 감염인 것인 방법.
  70. 청구항 69에 있어서, 상기 기도 감염은 바이러스 감염인 것인 방법.
  71. 청구항 70에 있어서, 상기 바이러스는 피코르나바이러스 (picornavirus), 코로나바이러스 (coronavirus), 인플루엔자 바이러스 (influenza virus), 파라인플루엔자 바이러스 (parainfluenza virus), 호흡기 세포융합 바이러스 (respiratory syncytial virus), 아데노바이러스 (adenovirus), 엔테로바이러스 (enterovirus), 및 메타뉴모바이러스 (metapneumovirus)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  72. 청구항 71에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스 또는 코로나바이러스인 것인 방법.
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