KR20220152383A - 대식세포를 표적으로 하는 펩타이드, 컨쥬게이트, 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대식세포를 표적으로 하는 펩타이드, 컨쥬게이트, 조성물 및 그의 용도를 제공한다. 상기 폴리펩타이드는 M2-형, M1-형 및/또는 M0-형 대식세포에 대해 선택적이다.

Description

대식세포를 표적으로 하는 펩타이드, 컨쥬게이트, 조성물 및 그의 용도

관련 출원에 대한 상호-참조

본 출원은 2021년 5월 7일자로 출원된 미국 공개특허 제63/185,503호에 기술되어 있으며, 상기 개시 내용은 그 전체가 본 문서에 참조로 포함된다.

전자적으로 제출된 서열 목록 참조

본 명세서와 함께 제출된 ASCII 텍스트 파일(이름:3409-0001WO01_Sequence_Listing_ST25.txt, 크기: 20KB, 생성 날짜: 2022년 2월 4일)로 전자적으로 제출된 서열 목록의 내용은 전체가 참조로 본 문서에 통합된다.

본 발명은 대식세포를 표적으로 하는 펩타이드, 컨쥬게이트, 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다. 상기 폴리펩타이드는 M2-형, M1-형 및/또는 M0-형 대식세포에 대해 선택적이다.

대식세포(Macrophages)는 거의 모든 조직에서 발견되는 중요한 선천적인 면역 세포이며 골수에서 유래하여 혈액을 순환하며 혈관외유출(extravasation)을 통해 조직에서 분화된다. 이러한 대식세포는 M0 대식세포, 종양-억제 M1 대식세포 및 종양-지지 M2 대식세포의 세 가지 표현형으로 분류된다.

먼저, M0 대식세포는 인간 말초 단핵구와 구별되는 비활성화된 대식세포이다. M1 대식세포는 항원을 제시하는 강력한 능력을 가지고 있으며 일반적으로 인터페론-감마, 지질다당류(LPS) 및 종양 괴사 인자(TNF)-알파에 의해 활성화되고 전-염증 및 살균 효과가 있다.

M2 대식세포는 다양한 세포외 기질 성분, 혈관신생 및 화학주성 인자를 방출함으로써 면역억제, 종양형성 및 혈관신생을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 M2 대식세포는 IL-4 및 IL-13에 의해 유도되며 M2 대식세포가 아르기나제-1, 만노스(MMR, CD206) 및 스캐빈저 수용체(SR-A, CD204)와 같은 고유한 M2 마커를 발현하는 M1 대식세포와 구별된다.

멜리틴(Melittin)은 꿀벌(Apis mellifera L.)의 봉독이 주성분이며 26개의 아미노산 잔기를 갖는 양친매성 펩타이드로 기공 형성, 융합 및 소포 형성과 같은 막-교란 효과가 있다. 상기 멜리틴은 종양 세포에 대한 세포독성 및 세포성장을 억제하거나 세포사멸 및 괴사를 유도하는 능력 때문에 종양-보유 마우스 연구에 사용되었다(Russell, Cancer. Immunol. Immunother. 53:411-421, 2004).

또한, 멜리틴을 이용한 종래 기술은 멜리틴을 함유하는 동맥경화 치료용 조성물(대한민국 공개특허 제10-2011-0117789호), 멜리틴을 함유하는 섬유아세포 유사 활막세포의 활성을 억제하는 조성물(대한민국 공개특허 제10-2011-0117788호) 등을 들 수 있다. 아울러, 멜리틴을 이용하여 M2-형 대식세포를 선택적으로 사멸시키는 약제학적 조성물(대한민국 공개특허 제10-2019-0021765호) 및 항암제에 결합된 멜리틴을 함유하는 조성물(대한민국 공개특허 제10-2019-0053334호)이 개시되어 있다.

본 발명은 대식세포를 표적으로 하는 펩타이드, 컨쥬게이트, 조성물 및 그의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 하기 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드가 제공된다: X₁-X₂-Thr-X₄-Gly-Leu-X₇-Ala-Leu-Ile-X₁₁-Trp-Ile-X₁₄-Arg-Lys-Arg-X₁₈-X₁₉(서열번호 3)(상기 서열에서, X₁은 발린을 제외한 아미노산, X₂는 류신을 제외한 아미노산, X₄는 트레오닌을 제외한 아미노산, X₇은 프롤린을 제외한 아미노산, X₁₁은 세린을 제외한 아미노산, X₁₄는 라이신을 제외한 아미노산, X₁₈은 글루타민을 제외한 아미노산, 및/또는 X₁₉는 글루타민을 제외한 아미노산이다). 일부 실시양태에서, 상기 X₁은 알라닌(서열번호 4), X₂는 알라닌(서열번호 5), X₄는 알라닌(서열번호 6), X₇은 알라닌(서열번호 7), X₁₁은 알라닌(서열번호 8), X₁₄는 알라닌(서열번호 9), X₁₈은 알라닌(서열번호 10), X₁₉는 알라닌(서열번호 11), 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 서열번호 12 내지 35로 구성되는 군으로 부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 서열번호 49 내지 55로 구성되는 군으로 부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리펩타이드 및 제2 치료제를 포함하는 컨쥬게이트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 제2 치료제는 KLA, 알파-디펜신-1(alpha-defensin-1), BMAP-28, 브레베닌-2R(brevenin-2R), 부포린 IIb(buforin IIb), 세크로핀 A-마게이닌 2(CA-MA-2), 세크로핀 A(cecropin A), 세크로핀 B(cecropin B), 크리소프신-1(chrysophsin-1), D-K6L9, 고메신(gomesin), 락토페리신 B(lactoferricin ), LL27, LTX-315, 마가이닌 2(magainin 2), 마가이닌 II 봄베신 컨쥬게이트(MG2B), 파르닥신(pardaxin), 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 엔티노스타트(entinostat), 클라드리빈(cladribine), 프랄라트렉세이트(pralatrexate), 로라티닙(lorlatinib), 메이탄신 DM1(maytansine DM1), 메이탄신 DM3(maytansine DM3), 메이탄신 DM4(maytansine DM4) 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 컨쥬게이트는 상기 폴리펩타이드에 제2 치료제를 연결하는 링커를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 링커의 한쪽 또는 양쪽 말단은 카르보디이미드(carbodiimide), N-hydroxysuccinimide ester(NHS ester), 이미도에스테르(imidoester), 펜타플루오로페닐 에스테르(pentafluoropheny ester), 히드록시메틸 포스핀(hydroxymethyl phosphine), 말레이미드(maleimide), 할로아세틸(haloacetyl), 피리딜디설파이드(pyridyldisulfide), 티오술포네이트(thiosulfonate), 비닐술폰(vinylsulfone), EDC(1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide), DCC(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide), SATA(succinimidyl acetylthioacetate), sulfo-SMCC(sulfosuccinimidyl-4-(N-D-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate), DMA(dimethyl adipimidate·2HCl), DMP(dimethylpimelimidate·2HCl), DMS(dimethyl suberimidate·2HCl), DTBP(dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate·2HCl), sulfo-SIAB(sulfo-succinimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoate), SIAB(succinimidyl(4-iodoacetyl) aminobenzoate), SBAP(succinimidyl 3-(bromoacetamido) propionate), SIA(succinimidyliodoacetate), SM(PEG)_n(succinimidyl-([N-maleimidopropion-amido]-ethyleneglycol ester, wherein n=2, 4, 6, 8, 12 또는 24), SMCC (succinimidyl-4-(N-D-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), LCSMCC (succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxy-(6-amido-caproate)), sulfo-EMCS(N-ε-ester), EMCS(N-εsulfo-GMBS(N-γ-ester), GMBS(N-γ-ester), sulfo-KMUS(N-κ-ester), sulfo-MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfo-succin imide ester), MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), sulfo-SMPB(sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate), SMPB(succinimidyl 4-(pmaleimidophenyl)butyrate), AMAS(N-α-maleimido-acetoxysuccinimide ester), BMPS(N-β-maleimidopropyloxysuccinimide ester), SMPH(succinimidyl-6-[(β-maleimidopropionamido)hexanoate]), PEG12-SPDP(2-pyridyldithiol-tetraoxaocta-triacontane-N-hydroxysuccinimide), PEG4-SPDP, sulfo-LCSPDP(sulfosuccinimidyl 6-[3'-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoate), SPDP(succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionate), LC-SPDP(succinimidyl-6-[3'-(2-pyridyldi-thio) propionamido] hexanoate), SMPT(4-succinimidyloxycarbonyl-alphamethyl-alpha (2-pyridyldithio)toluene), DSS(disuccinimidyl suberate), BS(PEG)5(bis (succinimidyl) penta(ethylene glycol)), BS(PEG)9(bis (succinimidyl)nona (ethylene glycol)), BS3(bis[sulfosuccinimidyl] suberate), BSOCOES(bis[2-(succinimidooxycarbonyloxy)ethyl] sulfone), PDPH(3-(2-pyridyl-dithio) propionyl hydrazide), DSG(disuccinimidyl glutarate), DSP(dithio-bis[succin-imidyl propionate]), BM(PEG)n(1,8- bismaleimido-ethyleneglycol, n=2 또는 3), BMB(1,4-bismaleimidobutane), BMDB(1,4-bismaleimidyl-2,3-dihydroxybutane), BMH(bismaleimidohexane), BMOE(bismaleimidoethane), DTME(dithiobismaleimido-ethane), TMEA(tris(2-maleimidoethyl) amine), DSS(disuccinimidyl suberate), DST(disuccinimidyl tartarate), DTSSP(3,3'-dithiobis[sulfosuccinimidyl-propionate]), EGS(ethylene glycol bis[succinimidylsuccinate]), sulfo-EGS (ethylene glycol bis[sulfosuccinimidyl-succinate]), TSAT(tris-succinimidyl aminotriacetate), DFDNB(1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 작용기를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩타이드는 0.05 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml의 농도로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 피하 또는 정맥내 투여에 적합한 투여 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 동결건조되거나 캡슐화된 형태일 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리펩타이드를 개체에투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 M2-형 대식세포를 감소시키거나 M2-형 대식세포-매개 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 3, 4, 5, 7, 또는 8의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 비교하여 M2-형 대식세포를 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 질환은 암일 수 있고 상기 암은 흑색종, 전립선암, 폐암, 유방암, 결장암, 췌장암, 또는 암 미세환경에서 M2-형 종양 관련 대식세포를 갖는 다른 고형 종양일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 암은 간세포암일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 질환은 섬유증-관련 질환, 말기-간 질환, 신장 질환, 특발성 폐 섬유증(IPF), 심부전, 경피증, 류마티스 관절염, 크론병, 궤양성 대장염, 골수 섬유증을 포함하는 다양한 만성 자가면역 질환 및 전신성 홍반성 루푸스, 종양 침습 및 전이, 만성 이식 거부 및 다양한 진행성 근병증, 간경화 및 섬유증, 양성 전립선 비대증 또는 전립선염의 병인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 질환은 폐 섬유증일 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리펩타이드를 개체에투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 M1-형 대식세포를 감소시키거나 M1-형 대식세포-매개 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 3, 4, 5, 7, 8, 또는 11로 구성되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2로 구성되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 비교하여 M1-형 대식세포를 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 질환은 패혈성 쇼크, 다발성 기관 기능 장애 증후군(MODS), 아토피 피부염, 류마티스 관절염, 또는 자가면역 장애를 포함하는 만성 염증성 질환일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 질병은 패혈성 쇼크를 포함하는 패혈증일 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 M0-형 대식세포를 감소시키거나 M0-형 대식세포-매개 질환을 치료하는 방법이 제공된다.

일부 실시양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11로 구성되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2로 구성되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 비교하여 M0-형 대식세포를 감소시킬 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, M2-형 대식세포-매개 질환의 치료를 필요로 하는 개체에게 사용하기 위한 상기 펩타이드 및/또는 컨쥬게이트의 용도가 제공된다. 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, M2-형 대식세포-매개 질환의 치료를 필요로 하는 개체에게 사용하기 위한 상기 펩타이드 및/또는 컨쥬게이트가 제공된다. 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, M2-형 대식세포-매개 질환의 치료를 필요로 하는 개체에게 사용하는 약제의 제조를 위한 상기 펩타이드 및/또는 컨쥬게이트의 용도가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, M1-형 대식세포-매개 질환의 치료를 필요로 하는 개체에게 사용하기 위한 상기 펩타이드 및/또는 컨쥬게이트의 용도가 제공된다. 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, M1-형 대식세포-매개 질환의 치료를 필요로 하는 개체에게 사용하기 위한 상기 펩타이드 및/또는 컨쥬게이트가 제공된다. 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, M1-형 대식세포-매개 질환의 치료를 필요로 하는 개체에게 사용하는 약제의 제조를 위한 상기 펩타이드 및/또는 컨쥬게이트의 용도가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, M0-형 대식세포-매개 질환의 치료를 필요로 하는 개체에게 사용하기 위한 상기 펩타이드 및/또는 컨쥬게이트의 용도가 제공된다. 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, M0-형 대식세포-매개 질환의 치료를 필요로 하는 개체에게 사용하기 위한 상기 펩타이드 및/또는 컨쥬게이트가 제공된다. 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, M0-형 대식세포-매개 질환의 치료를 필요로 하는 개체에게 사용하는 약제의 제조를 위한 상기 펩타이드 및/또는 컨쥬게이트의 용도가 제공된다.

본 발명은 대식세포를 표적으로 하는 펩타이드, 컨쥬게이트, 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다. 상기 폴리펩타이드는 M2-형, M1-형 및/또는 M0-형 대식세포에 대해 선택적이다.

도 1a 내지 1f는 THP-1 유래 대식세포의 극성화를 분석한 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다. THP-1 세포를 M0 대식세포의 경우 PMA로 처리한 다음, M1 대식세포는 LPS 및 IFN-γ 및 M2 대식세포는 IL-4 및 IL-13과 함께 배양하였다. 대식세포의 극성화는 IL-12, CXCL10 및 CD86과 같은 M1 마커 및 IL-10, TGF-β, 아르기나제 1 및 CD206과 같은 M2의 마커에 의해 평가되었다. LPS 및 IFN-γ로 처리된 대식세포는 증가된 M1 마커를 나타내었고(도 1D, 1E 및 1F), IL-4 및 IL-13으로 처리된 대식세포는 M0에 비해 증가된 M2 마커를 나타냈다(도 1a, 1b, 1c 및 1f).
도 2a 내지 2c는 THP-1 유래 M2 대식세포에서 TAMPep 단편의 친화도를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. M2 대식세포에 대한 TAMpep 결합의 주요 아미노산 부위를 조사하기 위해, THP-1 유래 M2 대식세포에서 FITC와 결합된 TAMpep 및 TAMpep의 단편(도 2a에 개시된 아미노산 서열, 스크램블(서열번호 48); TAMpep(서열번호 1); TAMpep114(서열번호 49); TAMpep120(서열번호 50); TAMpep820(서열번호 51); TAMpep822(서열번호 52); Mpep(서열번호 2); TAMpep1026(서열번호 53); TAMpep1226(서열번호 54); 및 TAMpep1526(서열번호 55))을 사용하여 친화도 시험을 수행하였다. TAMpep(26개 아미노산 포함)은 90% 이상의 높은 친화도를 보였고 Mpep(C 말단에서 7개 아미노산 제거)은 M2 대식세포에서 45% 이상의 두 번째로 높은 친화도를 나타내었다. TAMpep의 단편(C 말단에서 10개 이상의 아미노산 또는 N 말단에서 4개 이상의 아미노산이 제거됨)은 26개 아미노산의 펩타이드와 비교하여 낮은 친화도를 나타내었다(도 2b 및 2c).
도 3a 내지 3c는 THP-1 유래 M2 대식세포에서 TAMpep 단편의 세포독성을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. TAMPep 단편은 THP-1 유래 M2 대식세포의 세포독성 분석에서 테스트되었다. TAMpep은 IC₅₀에서 0.815 μM의 높은 세포독성 값을 보였고 다른 펩타이드 단편은 M2 대식세포에서 세포독성 효과를 나타내지 않았다.
도 4a 내지 4d는 TAMpep 및 Mpep의 용혈 활성을 분석한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다. TAMpep 및 Mpep의 용혈을 조사하기 위해 마우스 RBC에서 펩타이드를 증가하는 농도(0.1 - 50 μM)로 처리했다. TAMpep은 IC₅₀에서 6.669 μM를 나타내었고 Mpep는 IC₅₀에서 > 50 μM를 나타내었다(도 4a 및 4b). 또한, dKLA에 결합된 TAMpep 및 Mpep는 IC₅₀에서 각각 1.122 μM 및 > 50 μM를 나타내었다(도 4c 및 4d).
도 5a 내지 5c는 THP-1 유래 대식세포에서 TAMpep 및 Mpep의 친화도를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. TAMpep과 Mpep가 대식세포의 서브타입 중 M2 대식세포에 더 특이적으로 부착하는지 비교하기 위해 FITC가 결합된 펩타이드에 THP-1 세포에서 극성화된 M0, M1, 및 M2 대식세포를 처리하고 FACs로 분석하였다. TAMpep 및 Mpep는 모두 M0 및 M1 대식세포와 비교하여 M2 대식세포에서 훨씬 더 높은 친화도를 보여주었다(도 5a 및 5b). 또한, TAMpep은 면역형광 현미경에 의해 M2 대식세포에서 높은 친화도를 보였다(도 5c).
도 6a 내지 6d는 THP-1 유래 대식세포에서 TAMpepK 및 MpepK의 세포독성을 분석한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다. dKLA에 결합된 TAMpep 및 Mpep가 선택적으로 세포사멸을 유도하는지 여부를 조사하기 위해 M2 대식세포를 TAMpepK 또는 MpepK(0.01-10 μM)의 농도를 증가시키면서 처리하였다. TAMpepK 및 MpepK는 M0 및 M1 대식세포와 비교하여 M2 대식세포에서 세포사멸을 유도하였다(도 6a 및 6b). 또한, 다른 서브타입 대식세포에 비해 M2 대식세포에서 세포사멸과 관련된 캐스페이즈-3의 발현이 증가하였다(도 6c 및 6d).
도 7a 내지 7e는 THP-1 유래 대식세포에서 알라닌 치환 라이브러리에 의한 Mpep의 친화도를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. M2 대식세포에서 Mpep의 부착력에서 주요 아미노산 서열을 찾기 위해 Mpep의 알라닌-치환 라이브러리를 사용하였다. M2 대식세포에서 3번째 T(트레오닌), 6번째 L(류신), 9번째 L(류신), 12번째 W(트립토판), 13번째 I(이소류신), 16번째 K(라이신) 및 17번째 R(아르기닌)에 알라닌이 치환되었을 때 펩타이드의 친화도가 감소하였다. 또한, 펩타이드(A13-16 및 A05)에서 6번째 L(류신)을 통해 9번째 L(류신) 및 3번째 T(트레오닌), 15번째 K(라이신), 16번째 R(아르기닌), 17번째 K(라이신), 및 19번째 Q(글루타민)으로 치환된 펩타이드의 친화도가 감소하였다. 또한, 펩타이드(A13-16 및 A05)에서 6번째 L(류신)을 통해 9번째 L(류신) 및 3번째 T(트레오닌), 15번째 K(라이신), 16번째 R(아르기닌), 17번째 K(라이신), 및 19번째 Q(글루타민)으로 치환된 펩타이드의 친화도가 감소하였다. 2번째 L(류신) 및 11번째 S(세린)를 치환한 펩타이드(A9 및 A18)는 M2 대식세포에서 증가된 친화도를 나타냈다(도 7a 내지 7e). 도 7b 내지 도 7e의 각각의 Mpep 아미노산 서열은 서열번호 2이다.
도 8a 내지 8c는 M2 대식세포 및 인간 흑색종 세포에서 TAMpepK의 세포독성을 분석한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다. TAMpepK가 흑색종 세포보다 M2 대식세포에서 더 많은 세포사멸 및 결합을 유도하는지 여부를 조사하기 위해, TAMpep 및 TAMpepK 각각을 THP-1 유래 M2 대식세포 또는 Sk-Mel-28 세포로 처리하였다(도 8a 및 8c). TAMpepK는 흑색종 세포(IC₅₀: 3.583 μM)에 비해 M2 대식세포에서 낮은 IC₅₀ 값(1.055 μM)을 나타내었고(도 8B), 캐스페이즈-3의 발현은 흑색종 세포와 비교하여 M2 대식세포에서도 증가하였다(도 8c).
도 9a 내지 9c는 TAMpepK로 처리된 M2 대식세포의 조건 배지에 의한 흑색종 세포의 증식 및 이동을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. TAMpepK가 M2 대식세포에 의해 유도된 흑색종 세포의 증식 및 이동을 억제하는지 여부를 조사하기 위해, TAMpepK(1 μM) 무처리 또는 전처리된 M0, M1 및 M2 대식세포의 조건배지 및 흑색종 세포에서 처리된 조건 배지를 제조하였다. 흑색종 세포의 증식은 M2 대식세포의 조건배지에 의해 증가된 반면, TAMpepK로 전처리된 M2 대식세포의 조건배지에서는 억제되었다(도 9a). 더욱이, TAMpepK로 전처리된 M2 대식세포의 조건 배지는 흑색종 세포의 이동을 억제한 반면, 흑색종 세포의 이동은 M2 대식세포의 조건 배지에 의해 증가되었다(도 9b 및 9c).
도 10a 내지 10d는 흑색종 마우스 모델에서 TAMpepK의 항암 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. TAMpepK의 생체 내 항암 효과를 평가하기 위해 C57BL6J 마우스의 오른쪽 옆구리에 마우스 흑색종 세포(B16F10 세포주)를 피하 주사하고 일주일 후 3일마다 TAMpepK를 복강 내 주사했다. 상기 TAMpepK로 처리된 마우스는 PBS 그룹과 비교하여 유의하게 감소된 종양 부피 및 중량을 나타내었다(도 10a, 10c 및 10d). 반면에, 마우스의 체중은 PBS와 TAMpepK 그룹 사이에서 유의한 변화가 없었다(도 10b).
도 11a 내지 11c는 흑색종 마우스 모델에서 M2-유사 TAM을 표적으로 하는 TAMpepK의 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. TAMpepK가 흑색종 마우스 모델에서 M2-유사 TAM을 감소시키는지 여부를 조사하기 위해 종양 조직에서 대식세포를 분리하고 FACs로 분석했다. M2-유사 TAM(F4.80⁺ 및 CD206⁺ 세포)은 PBS 그룹과 비교하여 TAMpepK 그룹에서 유의하게 감소하였다(도 11a 및 11b). 그러나, M1-유사 TAMs(F4/80⁺ 및 CD86⁺ 세포)는 PBS 및 TAMpepK 그룹 사이에 변화를 나타내지 않았다(도 11a 및 11b). 또한, M1/M2 비율을 통한 종양 미세환경의 변화를 분석하였다. TAMpepK 그룹은 PBS 그룹에 비해 M2 대식세포를 감소시켜 M1 대식세포의 증가된 비율을 보였다(도 11c).
도 12a 내지 12d는 흑색종 마우스 모델에서 TAMpepK 및 MpepK의 항암 효과를 분석한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다. 본 연구는 흑색종 모델에서 MpepK의 항암 효과를 확인하기 위해 수행되었다. 도 12에 나타낸 바와 같이, TAMpepK 및 MpepK 그룹 모두에서 종양 부피 및 중량이 감소하였고(도 12a 내지 12c), PBS 그룹에 비해 MpepK 그룹에서 생존율이 연장되었다(도 12d).
도 13a 내지 13e는 흑색종의 마우스 모델에서 M2-유사 TAM을 표적으로 하는 TAMpepK 및 MpepK의 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. MpepK가 흑색종에서 종양 미세환경의 변화를 유도하는지 조사하기 위해 대식세포의 M1/M2 비율과 CD8 소진을 FACs로 분석하였다. M2-유사 TAM(F4.80⁺ 및 CD206⁺ 세포)은 PBS 그룹과 비교하여 TAMpepK 및 MpepK 그룹에서 감소했다. 그러나, M1-유사 TAM(F4/80⁺ 및 CD86⁺ 세포)은 모든 그룹에서 변화를 나타내지 않았다(도 13a 및 13b). M1/M2 비율은 PBS 그룹에 비해 TAMpepK 및 MpepK 그룹에서 유의하게 증가하였다(도 13c). 또한, CD8⁺ T 세포에서 PD-1 및 LAG3와 같은 소진 마커(exhaustion marker)는 PBS 그룹에 비해 TAMpepK 및 MpepK 그룹에서 유의하게 감소하였다(도 13d 및 13e).
도 14a 및 14b는 전립선 종양 세포(TCM)의 조건 배지에 의한 THP-1 유래 M2 대식세포의 분화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 전립선암 세포(TCM)의 조건 배지에 의한 M2 대식세포의 극성화를 조사하기 위해, THP-1 유래 대식세포를 TCM과 함께 배양하였다. TCM-처리된 대식세포는 M0 대식세포와 비교하여 아르기나제 1, CD206 및 CD163과 같은 M2 마커의 mRNA 발현이 증가하고 NOS2 및 CCR7과 같은 M1 마커의 mRNA 발현이 감소하는 것으로 나타났다(도 14a 및 14b).
도 15a 내지 15c는 M2 대식세포의 조건 배지에 의한 전립선암 세포의 증식 및 이동을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 15a 내지 15c에 도시된 바와 같이, 암세포의 증식과 이동은 THP-1 유래 M2 대식세포에 의해 증가되었다. 본 연구는 TCM에 의해 극성화된 M2 대식세포가 전립선암 세포의 증식과 이동을 유도하는지 여부를 조사했다. TCM으로 처리된 대식세포의 조건 배지(M-TCM)는 THP-1 유래 M2 대식세포의 조건 배지(도 15a 내지 15c)와 유사하게 전립선암 세포의 증가된 증식 및 이동을 보였다.
도 16은 TAMpepK 또는 MpepK에 의한 대식세포의 세포 생존력을 분석한 결과를 나타내는 그림 및 그래프이다. TAMpepK 및 MpepK가 TCM에 의해 분화된 M2 대식세포의 세포 생존율을 감소시키는지 여부를 평가하기 위해, THP-1 유래 대식세포를 TAMpepK 및 MpepK(1 μM)로 처리하였다. TAMpepK 및 MpepK는 M2 대식세포와 유사하게 TCM으로 처리된 대식세포에서 세포사멸을 유도하였다.
도 17a 내지 17c는 TAMpepK 및 MpepK로 처리된 M2 대식세포의 조건 배지에 의한 전립선암 세포의 증식 및 이동을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. TCM에 의해 유도된 M2 대식세포 및 M2-유사 TAMs의 조건 배지는 전립선암 세포(PC3 세포)의 증식 및 이동을 증가시켰다(도 17a 내지 17c). 그러나, TAMpepK 및 MpepK로 전처리된 M2 대식세포 및 M2-유사 TAMs의 조건 배지는 M2 대식세포 또는 M2-유사 TAMs의 그룹과 비교하여 PC3 세포의 증식 및 이동을 유의하게 감소시켰다(도 17a 내지 17c).
도 18a 및 18b는 TAMpepK 및 MpepK로 처리된 M2 대식세포의 조건 배지에 의한 전립선암 세포의 침윤을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. PC3 세포를 대식세포의 조건 배지로 처리하였다. TCM에 의해 유도된 M2 대식세포 및 M2-유사 TAMs의 조건 배지는 PC3 세포의 침윤을 증가시켰다. 그러나, TAMpepK 및 MpepK로 전처리된 M2 대식세포 및 M2-유사 TAMs의 조건 배지는 M2 대식세포 또는 M2-유사 TAMs의 그룹과 비교하여 PC3 세포의 침윤을 유의하게 감소시켰다(도 18a 및 18b).
도 19a 내지 19f는 전립선암 마우스 모델에서 TAMpepK 및 MpepK의 효과을 분석한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다. 전립선암 모델에서 TAMpepK 및 MpepK의 항암 효과를 평가하기 위해 C57BL6J 마우스 오른쪽 옆구리에 TRAMP-C2 세포를 피하주사하고 일주일 후 3일마다 TAMpep, dKLA, TAMpepK, 및 MpepK를 복강내 주사했다. TAMpepK 및 MpepK로 처리된 마우스는 PBS 그룹과 비교하여 유의하게 감소된 종양 부피 및 중량을 나타내었다(도 19b, 19c, 19e 및 19f). 한편, 마우스의 체중은 모든 그룹에서 유의한 변화가 없었다(도 19d).
도 20a 내지 20d는 전립선암 모델의 증식 및 EMT에서 TAMpepK 및 MpepK의 효과를 분석한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다. 전립선암 모델의 종양 성장 및 EMT에서 TAMpepK 및 MpepK의 항암 효과를 확인하기 위해 증식성 마커인 PCNA 및 EMT(상피-중간엽 전이) 마커인 E-cadherin, vimentin, fibronectin, TGF-β 및 MMP9의 발현을 종양 조직에서 측정하였다. PCNA의 발현은 TAMpepK 및 MpepK 그룹에서 감소하였다(도 20c 및 20d). EMT 마커의 경우, 상피세포 마커로 알려진 E-cadherin은 TAMpepK 및 MpepK 그룹에서 증가하였고(도 20a 및 20d), 중간엽 마커로 알려진 vimentin 및 fibronectin은 TAMpepK 및 MpepK 그룹에서 감소하였다(도 20b 및 20d). 또한, EMT와 관련된 TGF-β 및 MMP9의 발현도 TAMpepK 및 MpepK 그룹에서 감소하였다(도 20d). 따라서, 상기 결과는 TAMpepK 및 MpepK가 전립선암에서 M2-유사 TAM을 표적으로 하는 종양 성장 및 전이를 억제함으로써 항암 효과가 있음을 시사하는 것이다.
도 21a 내지 21e는 결장암 모델에서 TAMpepK 및 MpepK의 항암 효과를 분석한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다. 결장암 모델의 종양 성장에서 TAMpepK 및 MpepK의 항암 효과를 확인하기 위해 종양 조직의 부피 및 중량을 측정하였다. TAMpepK 및 MpepK로 처리된 마우스는 PBS 그룹과 비교하여 유의하게 감소된 종양 부피 및 중량을 나타낸 반면, 종양 중량은 MpepK에서 유의하게 변화하지 않았다(도 21a 내지 21e).
도 22a 내지 22c는 폐 섬유증의 마우스 모델에서 MpepK의 효과를 분석한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다. MpepK가 폐 섬유증 억제에 대한 치료 효과가 있는지 여부를 조사하기 위해, 폐 섬유증의 마우스 모델을 기관 내 블레오마이신 투여에 의해 제조하였다. 블레오마이신에 의해 유도된 폐 섬유증은 MpepK에 의해 감소되었다(도 22b). 또한, fosl2, 제1형 콜라겐(collagen type 1) 및 피브로넥틴 1(fibronectin 1)과 같은 섬유증과 관련된 유전자 발현은 PBS에 비해 MpepK에서 유의하게 감소하였다(도 22c).
도 23a 내지 23e는 유방암의 마우스 모델에서 TAMpepK 및 MpepK의 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 유방암에서 TAMpepK 및 MpepK의 항암 효과를 확인하기 위해 유방암의 네 번째 유방 정위 마우스 모델을 제조하였다. TAMpepK 및 MpepK는 PBS 그룹과 비교하여 감소된 종양 부피 및 중량을 나타내었다(도 23b 내지 23d). 또한, M2 대식세포 마커로 알려진 아르기네이즈 1의 유전자 발현은 PBS에 비해 MpepK에서 유의하게 감소하였다(도 23e).
도 24a 내지 24c는 유방암의 폐 전이에서 TAMpepK 및 MpepK의 효과를 분석한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다. 폐 전이는 PBS 그룹에 비해 MpepK 그룹에서 감소하였다(도 24a 내지 24c).
도 25a 내지 25c는 M2-형, M1-형 및/또는 M0-형 대식세포에 대해 선택적인 폴리펩타이드의 세포독성을 분석한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다. M2-형, M1-형 및/또는 M0 형 대식세포에 대해 선택적인 폴리펩타이드는 THP-1 유래 M2, M1 및 M0 대식세포의 세포독성 분석에서 테스트되었다. 극성화된 세포를 MpepK, A12K, A14K, A17K, A18K, A22K, A25K 또는 A26K 펩타이드로 처리하였다. MpepK는 M2 대식세포에서 IC₅₀에서 1.121 μM의 높은 세포독성 값을 보였으나 A26K는 M1 대식세포에서 IC₅₀에서 1.192 μM의 높은 세포독성 값을 보였다. 또한, A17K, A22K 및 A25K는 M2 대식세포에서 1.5 μM로 MpepK와 유사한 세포독성을 보인 반면, A26K는 대조군과 비교하여 M1 대식세포에서 1.5 μM에서 생존력의 50% 이상의 억제를 나타냈다.
도 26a 및 26b는 시험관내 패혈증 모델, LPS 자극 M1(LPS-M1) 대식세포에서 A26K의 세포독성 및 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. M1 대식세포에 대한 가장 선택적인 폴리펩타이드인 A26K는 시험관내 패혈증 모델인 LPS 자극 M1(LPS-M1) 대식세포에서 테스트되었다. 세포 생존력은 CCK-8 분석을 사용하여 분석되었다. 실시간 정량적 PCR을 통해 염증유발 유전자(IL-8, TNF-α, NF-kB, IL-1β 및 CXCL10)의 발현 수준을 정량화했다. LPS-M1 대식세포에서 A26K의 세포독성을 조사하기 위해 M0, M1 및 LPS-M1 대식세포에 1.5 μM의 A26K를 처리하였다. 상기 A26K는 LPS-M1 대식세포와 M1 대식세포에서 현저한 세포독성 효과를 보였다. 전-염증성 유전자의 발현 수준을 더 조사하기 위해, M0, M1 및 LPS-M1 대식세포를 1.5 μM의 A26K로 1시간 동안 처리했다. LPS(1 μg/ml) 자극은 M0 대식세포와 비교하여 IL8, TNF-α, IL-1β, NF-kB 및 CXCL10의 발현을 유의하게 증가시켰다. A26K 처리는 LPS 자극에 의해 IL8, TNF α, IL-1β, NF-kB 및 CXCL10의 강화된 발현 수준을 유의하게 억제하였다.
도 27a 및 27b는 시험관 내 폐 섬유증 모델에서 A17K 또는 A22K의 효과, IL-4 및 IL-13 유도 THP-1 대식세포와 공배양된 TGF-β1 유도 A549 세포를 분석한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다. 세포 공배양 시스템을 사용하여 TGF-β1 유도 A549 세포를 IL-4 및 IL-13 유도 THP-1 대식세포와 공배양하였다. 타원형 상피세포의 A549에서 방추형 섬유아-유사 세포로의 형태적 변화가 명확하게 감지되었다. A17K 또는 A22K 개입은 IL-4 및 IL-13 유도 대식세포와 공배양하여 자극된 A549 세포에서 EMT의 방추형 중간엽 형태 표현형을 현저하게 차단했다. A17K 또는 A22K 처리는 M2 대식세포 단독 투여에 비해 A549 세포에서 E-cadherin, EMT 억제 마커의 발현을 유의하게 증가시켰고, FMT 강화 마커인 α-SMA의 발현을 감소시켰다.
도 28a 내지 28d는 간세포 암종의 마우스 모델에서 MpepK의 효과를 분석한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다. 생체 내에서 MpepK의 항암 효과를 평가하기 위해 마우스 hepa 1-6 세포를 C57BL/6J 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사했다. 세포 접종 12일 후, MpepK를 3일마다 복강내 주사하였다. 그 결과, 그룹 간에 체중 변화에 유의한 차이가 없었다. 반면에 모든 용량(100, 200 및 400 nmol/kg)의 MpepK를 처리한 마우스는 PBS 그룹과 비교하여 유의하게 감소된 종양 부피를 보였고, 생존율은 PBS 그룹과 비교 MpepK 그룹(100, 200 및 400 nmol/kg)에서 유의하게 연장되었다.

본 명세서에서 사용된 용어 "멜리틴(MEL)"은 Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln(서열번호 1)의 서열을 갖는 봉독의 주성분을 구성하는 펩타이드를 말한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "봉독(BV)"은 꿀벌(Apis mellifera)의 복부에서 생성되는 산성 및 염기성 분비물의 혼합물이며 무색의 쓴 액체 형태를 나타낸다. 그 주성분으로 멜리틴, 및 펩타이드인 아파민, 비만세포 탈과립(mast cell degranulating, MCD) 펩타이드, 효소인 phospholipase A2(PLA2) 등이 있다. 또한 BV에는 다양한 미량의 성분이 포함되어 있다.

Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln(서열번호 2; MEL826 또는 Mpep)와 같이 멜리틴의 첫 7개 아미노산이 제거된 펩타이드는 M0-형, M1-형 또는 M2-형 대식세포를 선택적으로 표적화하기 위해 서열번호 3 내지 11(Mpeps 또는 각 Mpep)로 돌연변이될 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 일 관점에 따르면, 하기 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드가 제공된다: X₁-X₂-Thr-X₄-Gly-Leu-X₇-Ala-Leu-Ile-X₁₁-Trp-Ile-X₁₄-Arg-Lys-Arg-X₁₈-X₁₉(서열번호 3), 이때 X₁은 발린을 제외한 아미노산, X₂는 류신을 제외한 아미노산, X₄는 트레오닌을 제외한 아미노산, X₇은 프롤린을 제외한 아미노산, X₁₁은 세린을 제외한 아미노산, X₁₄는 라이신을 제외한 아미노산, X₁₈은 글루타민을 제외한 아미노산, 및/또는 X₁₉는 글루타민을 제외한 아미노산이다.

일부 실시양태에서, 상기 X₁은 알라닌(서열번호 4), 상기 X₂는 알라닌(서열번호 5), 상기 X₄는 알라닌(서열번호 6), 상기 X₇은 알라닌(서열번호 7), 상기 X₁₁은 알라닌(서열번호 8), 상기 X₁₄는 알라닌(서열번호 9), 상기 X₁₈은 알라닌(서열번호 10), 상기 X₁₉는 알라닌(서열번호 11), 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 활성 성분 또는 치료제로서 단독으로, 또는 다른 활성 성분 또는 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명에서 제조한 서열번호 3 내지 11의 아미노산 서열을 하기 표 1에 요약하였다.

서열번호	아미노산 서열
3	X1-X2-Thr-X4-Gly-Leu-X7-Ala-Leu-Ile-X11-Trp-Ile-X14-Arg-Lys-Arg-X18-X19
4	Ala-X2-Thr-X4-Gly-Leu-X7-Ala-Leu-Ile-X11-Trp-Ile-X14-Arg-Lys-Arg-X18-X19
5	X1-Ala-Thr-X4-Gly-Leu-X7-Ala-Leu-Ile-X11-Trp-Ile-X14-Arg-Lys-Arg-X18-X19
6	X1-X2-Thr-Ala-Gly-Leu-X7-Ala-Leu-Ile-X11-Trp-Ile-X14-Arg-Lys-Arg-X18-X19
7	X1-X2-Thr-X4-Gly-Leu-Ala-Ala-Leu-Ile-X11-Trp-Ile-X14-Arg-Lys-Arg-X18-X19
8	X1-X2-Thr-X4-Gly-Leu-X7-Ala-Leu-Ile-Ala-Trp-Ile-X14-Arg-Lys-Arg-X18-X19
9	X1-X2-Thr-X4-Gly-Leu-X7-Ala-Leu-Ile-X11-Trp-Ile-Ala-Arg-Lys-Arg-X18-X19
10	X1-X2-Thr-X4-Gly-Leu-X7-Ala-Leu-Ile-X11-Trp-Ile-X14-Arg-Lys-Arg-Ala-X19

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 서열번호 12 내지 35로 구성되는 군으로 부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 서열번호 49 내지 55로 구성되는 군으로 부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다.

본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미드 결합(또는 펩타이드 결합)을 통해 결합된 임의의 길이의 아미노산의 고분자 형태를 지칭한다. NH₂는 폴리펩타이드의 아미노 말단에 존재하는 유리 아미노기를 지칭한다. COOH는 폴리펩타이드의 카르복실 말단에 존재하는 유리 카르복실기를 의미한다.

본 발명의 펩타이드는 당업계에 잘 알려진 다양한 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들어, 상기 펩타이드는 유전자 재조합 및 단백질 발현 시스템을 사용하거나, 펩타이드 합성과 같은 화학적 합성을 통해 시험관내에서 펩타이드를 합성하는 방법, 무세포 단백질 합성 방법 등에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리펩타이드 및 제2 치료제를 포함하는 컨쥬게이트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 컨쥬게이트에 있어서, 상기 제2 치료제는 dKLA(서열번호 47), 알파-디펜신-1(alpha-defensin-1), BMAP-28, 브레베닌-2R(brevenin-2R), 부포린 IIb(buforin IIb), 세크로핀 A-마게이닌 2(CA-MA-2), 세크로핀 A(cecropin A), 세크로핀 B(cecropin B), 크리소프신-1(chrysophsin-1), D-K6L9, 고메신(gomesin), 락토페리신 B(lactoferricin B), LL27, LTX-315, 마가이닌 2(magainin 2), 마가이닌 II봄베신 컨쥬게이트(MG2B), 파닥신(pardaxin), 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 엔티노스타트(entinostat), 클라드리빈(cladribine), 프랄라트렉세이트(pralatrexate), 로라티닙(lorlatinib), 메이탄신 DM1(maytansine DM1), 메이탄신 DM3(maytansine DM3), 메이탄신 DM4(maytansine DM4), 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "컨쥬게이트(conj㎍ate)"는 Mpep 펩타이드와 제2 치료제가 결합되어 대식세포를 표적으로 할 수 있는 컨쥬게이트를 의미한다. 상기 컨쥬게이트는 예를 들어, 약물이 표적으로 하는 M2형 대식세포에 결합하여 대식세포의 미토콘드리아를 손상시켜 종양 성장 및 전이를 억제시킬 수 있고, 종양 주변의 혈관신생을 선택적으로 억제함으로써 암을 억제할 수 있다. 즉, 본 발명의 컨쥬게이트는 제2 치료제 단독에 비해 개선된 활성을 가질 수 있다. 그러나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 컨쥬게이트는 상기 폴리펩타이드를 제2 치료제에 연결하는 링커를 추가로 포함할 수 있다.

상기 컨쥬게이트는 상기 폴리펩타이드를 제2 치료제에 연결하는 링커를 추가로 포함할 수 있다. 상기 링커는 자연 발생 다중-도메인 단백질에서 파생되거나 경험적으로 설계될 수 있다(Chen, X. et al., Adv. Dr㎍. Deliv. Rev. 65:1357-1369, 2013). 상기 링커는 가요성 링커(flexible linkers), 강성 링커(rigid linkers), 및 생체내 절단가능한 링커(in vivo cleavable linkers)를 포함할 수 있다. 또한, 기능적 도메인을 함께 연결하는 역할(가요성 및 강성 링커에서와 같이) 또는 생체 내에서 자유 기능적 도메인을 방출하는 역할(생체 내 절단 가능한 링커에서와 같이) 외에도 상기 링커는 생물학적 활성 개선, 발현 수율 증가 및 바람직한 약동학 프로파일 달성과 같은 융합 단백질 생산의 다른 이점을 제공할 수 있다. 상기 링커는 평균 길이가 각각 4.5 ± 0.7, 9.1 ± 2.4 및 21.0 ± 7.6 잔기인 소형, 중형 및 대형 링커일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 아미노산은 자연적으로 코딩된 아미노산의 대략 50%를 구성하는 극성의 전하를 띠지 않거나 전하를 띤 잔기일 수 있다.

상기 가요성 링커는 일반적으로 결합된 도메인이 어느 정도의 이동이나 상호작용을 필요로 할 때 적용된다. 상기 링커는 일반적으로 작은 비극성(예: 글리신) 또는 극성(예: 세린 또는 트레오닌) 아미노산으로 구성된다. 이러한 아미노산의 작은 크기는 유연성을 제공하고 연결 기능 도메인의 이동성을 허용한다. Ser 또는 Thr의 통합은 물 분자와 수소 결합을 형성함으로써 수용액에서 링커의 안정성을 유지할 수 있고, 따라서 링커와 단백질 부분 사이의 불리한 상호작용을 감소시킨다. 가장 일반적으로 사용되는 가요성 링커는 주로 Gly 및 Ser 잔기의 스트레치를 포함하는 서열("GS" 링커)을 갖는다. 가장 널리 사용되는 가요성 링커의 예는 하기 서열번호 36의(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n 링커로 카피 수 "n"을 조정함으로써, 상기 GS 링커의 길이는 기능적 도메인의 적절한 분리를 달성하거나 필요한 도메인간 상호작용을 유지하기 위해 최적화될 수 있다.

상기 강성 링커는 도메인 간의 고정된 거리를 유지하고 독립적인 기능을 유지하기 위해 성공적으로 적용되었다. 서열번호 37로 구성된 알파 나선-형성 링커((EAAAK)_n)는 많은 재조합 융합 단백질의 구성에 적용되어 왔다. 다른 유형의 강성 링커는 Ala, Lys 또는 Glu와 같은 아미노산을 지정하는 X와 함께 Pro-rich 서열(XP)n을 가지고 있다. 강성 링커는 α-나선 구조를 채택하거나 여러 Pro 잔기를 포함함으로써 상대적으로 단단한 구조를 나타낸다. 많은 상황에서 상기 강성 링커는 가요성 링커보다 기능적 도메인을 더 효율적으로 분리한다. 링커의 길이는 도메인 간의 최적의 거리를 달성하기 위해 카피 수를 변경하여 쉽게 조정할 수 있다. 결과적으로, 도메인의 공간적 분리가 융합 단백질의 안정성 또는 생체 활성을 보존하는 데 중요할 때 강성 링커가 선택된다.

일부 실시양태에서, 절단가능한 링커가 도입되어 생체내에서 유리 기능 도메인을 방출한다. 예를 들어, 링커 상의 2개의 시스테인(Cys) 잔기 사이에 형성된 분자내 이황화 결합을 함유하는 디티오시클로펩타이드(dithiocyclopeptide)를 기반으로 하는 이황화 링커(LEAGCKNFFPR↓SFTSCGSLE)(서열번호 38), 뿐만 아니라 2개의 Cys 잔기 사이의 트롬빈-민감성 서열(PRS)을 사용할 수 있다. 상기 디티오시클로펩타이드 서열(CRRRRRREAEAC)(서열번호 39)은 2개의 Cys 잔기 사이의 분자내 이황화 결합뿐만 아니라 효모 분비 경로에 상주하는 분비 신호 처리 프로테아제에 민감한 펩타이드 서열을 포함한다.

상기 링커는 또한 본원에 개시된 펩타이드의 세포 흡수를 향상시킬 수 있는 세포-투과 펩타이드를 포함할 수 있다. 세포-투과 링커는 예를 들어 5-30개의 아미노산을 포함할 수 있고 양이온성, 양친매성 또는 소수성일 수 있다. 상기 세포-투과 링커의 예는 RLRWR(서열번호 40), GRPRESGKKRKRKRLKP(서열번호 41), GRKKRRQRRRPPQ(서열번호 42), RYIRS(서열번호 43), RRMKWKK(서열번호 44), R8-12(서열번호 45), 및 RRRRRRRRRFFC(서열번호 46)을 포함한다(Bohmova, E. et al., Physiol. Res. 67,(Supp. 2): S267-S279, 2018). 본 명세서의 표 1은 참고로 표시된다.

예를 들어, 상기 컨쥬게이트는 GGGGS 링커(서열번호 36)를 통해 펩타이드 dKLA(서열번호 47, d(KLAKLAKKLAKLAK))를 Mpep(서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11)에 결합함으로써 수득할 수 있다.

대안적으로, 상기 컨쥬게이트는 SPDP 링커를 통해 Mpep에 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 엔티노스타트(entinostat), 클라드리빈(cladribine), 프랄라트렉세이트(pralatrexate) 및 로라티닙(lorlatinib)과 같은 항암제를 결합함으로써 수득할 수 있다. 대안적으로, 상기 컨쥬게이트는 링커 없이 메이탄신 DM1, 메이탄신 DM3 및 메이탄신 DM4를 Mpep에 결합시켜 수득할 수 있다. 그러나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 즉, 본 발명의 컨쥬게이트는 Mpep가 항암제에 직접 결합되거나 링커를 통해 결합된 형태일 수 있다. 그러나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 상기 링커는 Mpep 및 항암제의 아민(amine), 카르복실(carboxyl) 또는 설프히드릴(sulfhydryl)기를 통해 약물 및 Mpep에 결합할 수 있다. 그러나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 대한민국 공개특허 제10-2019-0053334호인 항암제에 결합된 멜리틴을 함유하는 조성물은 본 문서에 참조로 삽입된다.

일부 실시양태에서, 상기 링커의 한쪽 또는 양쪽 말단은 상기 링커는 양 말단에 카르보디이미드(carbodiimide), N-히드록시숙시니미드 에스테르(N-hydroxysuccinimide ester, NHS ester), 이미도에스테르(imidoester), 펜타플루오로페닐 에스테르(pentafluoropheny ester), 히드록시메틸 포스핀(hydroxymethyl phosphine), 말레이미드(maleimide), 할로아세틸(haloacetyl), 피리딜디설파이드(pyridyldisulfide), 티오술포네이트(thiosulfonate), 비닐술폰(vinylsulfone), EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimide), DCC(N,N'-dicyclohexyl-carbodiimide), SATA(succinimidyl-acetylthioacetate), sulfo-SMCC(sulfo-succin-imidyl-4-(N-D-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate), DMA(dimethyl adipimidate·2HCl), DMP(dimethyl-pimelimidate·2HCl), DMS(dimethyl suber-imidate·2HCl), DTBP(di-methyl-3,3'-dithiobispropionimidate·2HCl), sulfo-SIAB(sulfosuccinimidyl(4-iodoacetyl) aminobenzoate), SIAB(succinimidyl(4-iodoacetyl) aminobenzoate), SBAP (succin-imidyl-3-(bromoacetamido) propionate), SIA(succinimidyliodoacetate), SM(PEG)_n (succinimidyl-([N-male-imidopropion-amido]-ethyleneglycol ester, wherein n=2, 4, 6, 8, 12 or 24), SMCC(succinimidyl-4-(N-D-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), LCSMCC (succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxy-(6-amidocaproate)), sulfo-EMCS(N-ε-ester), EMCS(N-εsulfo-GMBS(N-γester), GMBS(N-γ-ester), sulfo-KMUS(N-κ-ester), sulfo-MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccin-imide ester), MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), sulfo-SMPB(sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate), SMPB (succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate), AMAS(N-α-maleimido-acetoxy-succinimide ester), BMPS(N-β-maleimidopropyloxysuccinimide ester), SMPH (succinimidyl 6-[(β-maleimidopropionamido)hexanoate]), PEG12-SPDP(2-pyridyl-dithiol-tetraoxaocta-triacontane-N-hydroxysuccinimide), PEG4-SPDP, sulfo-LCSPDP(sulfosuccinimidyl 6-[3'-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoate), SPDP (succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate), LC-SPDP(succinimidyl-6-[3'-(2-pyridyldithio) propionamido] hexanoate), SMPT(4-succinimidyloxycarbonyl-alpha-methylalpha(2-pyridyldithio)toluene), DSS(disuccinimidyl suberate), BS(PEG)₅(bis (succin-imidyl) penta(ethylene glycol)), BS(PEG)₉(bis(succin-imidyl) nona(ethylene glycol)), BS3(bis[sulfosuccinimidyl] suberate), BSOCOES(bis[2-(succinimido-oxycarbonyloxy)ethyl] sulfone), PDPH(3-(2-pyridyl-dithio)propionyl hydrazide), DSG(disuccinimidyl glutarate), DSP(dithio-bis[succinimidyl propionate]), BM(PEG)_n(1,8-bismaleimido-ethyleneglycol, n=2 or 3), BMB(1,4-bismaleimidobutane), BMDB(1,4-bismaleimidyl-2,3-dihydroxy-butane), BMH(bis-maleimidohexane), BMOE(bismaleimidoethane), DTME(dithiobis-maleimido-ethane), TMEA(tris(2-maleimidoethyl) amine), DSS(disuccinimidyl suberate), DST(di-succinimidyl tartarate), DTSSP(3,3'-dithiobis[sulfo-succin-imidyl-propionate]), EGS(ethylene glycol bis[succinimidylsuccinate]), sulfo-EGS (ethylene glycol bis[sulfosuccinimidyl-succinate]), TSAT(tris-succin-imidyl aminotriacetate), DFDNB(1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 작용기를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 펩타이드는 펩타이드의 반감기 또는 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적을 위해 설계된 표적화 서열, 태그, 표지된 잔기, 및/또는 추가 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 이펙터, 약물, 전구약물, 독소, 펩타이드 및/또는 전달 분자와 같은 커플링 파트너에 결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 펩타이드는 RNA, DNA 또는 항체와 같은 커플링 파트너에 결합될 수 있다(Shoari et al., Pharmaceutics, 13:1391, pp. 1-32, 2021)

일부 실시양태에서, 생체내 반감기를 연장하고, 안정성을 증가시키고, 및/또는 본 발명에 개시된 펩타이드의 제거를 감소시키기 위해, 상기 펩타이드는 하기와 같이 변형될 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다:담체 단백질에 대한 접합, 리간드에 대한 접합, 항체에 대한 접합, PEG화(PEGylation), 폴리시알릴화 HESylation, 재조합 PEG 모방체(recombinant PEG mimetics), 나노입자 부착, 나노입자 캡슐화, 콜레스테롤 융합, 철 융합, 아실화(acylation), 아미드화, 글리코실화, 측쇄 산화(side chain oxidation), 인산화, 비오틴화, 미소구체(microsphere) 또는 미소구체 중합체 약물 전달 시스템, 또는 표면 활성 물질, 아미노산 모방체 또는 비천연 아미노산의 첨가.

본 발명의 상기 펩타이드는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 제조될 수 있다. 구체적으로, 염은 산을 첨가함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 염은 다음 물질을 펩타이드에 첨가하여 형성할 수 있다: 무기산(예: 염산, 브롬화수소산, 인산, 질산, 황산 등), 유기 카르복실산(예: 아세트산, 트리플루오로아세트산 등의 할로아세트산, 프로피온산, 말레산, 숙신산, 말산, 구연산, 타르타르산, 살리실산), 산성당(글루쿠론산, 갈락투론산, 글루콘산, 아스코르브산), 산성다당류(예, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 아르긴산), 콘드로이틴 설페이트 등의 설폰산 당 에스테르를 포함하는 유기 설폰산(예: 메탄설폰산, p-톨루엔 설폰산) 등을 들 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 상기 펩타이드 또는 컨쥬게이트는 인간을 위해 사용될 수 있다. 그러나, 상기 펩타이드 또는 컨쥬게이트는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양과 같은 가축 또는 예를 들어 염증성 질환 또는 암이 발생한 개 또는 고양이와 같은 애완동물에 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 암 예방 또는 치료용 조성물을 투여하기 위한 투여 경로 및 투여 방식은 특별히 제한되지 않는다. 조성물이 표적 부위에 도달할 수 있는 한, 임의의 투여 경로 및 방식이 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 다양한 경로, 즉 경구 또는 비경구를 통해 투여될 수 있다. 투여 경로의 비제한적인 예는 안구, 경구, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비강 또는 흡입 경로를 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질을 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 피하 또는 정맥내 투여에 적합한 투여 형태이다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 동결건조되거나 캡슐화된 형태이다.

본 발명의 상기 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있고 상기 담체는 비천연 담체를 포함할 수 있다.

본 명세서에 기재된 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 상기 조성물에 노출된 세포 또는 인간에 대해 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.

상기 약학적 조성물은 통상적인 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 유제, 시럽제, 에어로졸제 등의 경구 투여 형태, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제제화될 수 있다. 목적하는 질병이나 암의 예방 또는 치료에 사용되는 제제라면 어떠한 제제라도 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 이에 제한되지 않는다.

상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 예를 들어 락토스(lactose), 덱스트로스(dextrose), 수크로스(sucrose), 소르비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol), 자일리톨(xylitol), 에리트리톨(erythritol), 말티톨(maltitol), 전분(starch), 아카시아 검(gum acacia), 알기네이트(alginate), 젤라틴(gelatin), 인산칼슘(calcium phosphate), 규산칼슘(calcium silicate),셀룰로오스(cellulose), 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose), 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 물, 메틸하이드록시벤조에이트(methylhydroxybenzoate), 프로필하이드록시벤조에이트(propylhydroxybenzoate), 활석(talc), 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리 락트산(PLA), 폴리-L-락트산(PLLA), 미네랄 오일, 및/또는 이와 유사한 것일 수 있다.

상기 제제는 일반적으로 사용되는 충전제, 증량제, 접합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제와 같은 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.

경구 투여를 위한 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함한다. 상기 고형 제제는 조성물에 전분, 탄산칼슘, 자당 또는 유당과 같은 하나 이상의 부형제 및 젤라틴을 혼합하여 제조할 수 있다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 활석(talc) 등의 윤활제를 사용할 수 있다.

경구 투여용 액체 제제에는 현탁액, 액체 용액, 유제, 시럽 등이 포함된다. 상기 액상 제제에는 일반적으로 사용되는 단순 희석제인 물 및 유동 파라핀 외에 다양한 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미료, 향료, 방부제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용매, 현탁제, 에멀젼, 동결건조 제제, 좌제 등을 포함할 수 있다. 비수성 용매 및 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 및 에틸 올레에이트와 같은 주입 가능한 에스테르를 포함할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(마크로골), 트윈 61, 카카오 버터, 라우린(laurin), 글리세로젤라틴(glycerogelatin) 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 성분 외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 방부제 등을 더 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제형은 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 자세히 설명되어 있다. 본 발명의 조성물은 약리학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 당업자가 용이하게 수행할 수 있는 방법에 따라 제형화하여 단위 용량 형태로 제조하거나 다회 용량 용기로 도입하여 제조할 수 있다. 이 경우, 상기 제형은 또한 오일 또는 수성 매질 중 용액, 현탁액 또는 에멀젼의 형태 또는 부형제, 분말, 과립, 정제 또는 캡슐의 형태일 수 있으며, 추가로 분산제 또는 안정화제를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법에 의해 본 발명의 조성물을 개체에게 제공하는 것을 의미한다.

본 발명의 조성물은 비경구, 피하주입, 또는 피부를 통한 국소투여(경피투여)가 가능하나 이에 제한되지 않는다. 상기 약학적 조성물의 적절한 투여량은 제형 방법, 투여 유형, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설율 및 응답 민감도등의 요인에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 조성물의 경구 투여량은 1일 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg(체중), 0.5 mg/kg 내지 1 mg/kg(체중), 또는 이로부터 유도된 임의의 투여량 또는 범위일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 조성물을 종양 관련 대식세포의 제거가 필요한 개체에 투여하는 경우, 그 투여량은 0.01 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml, 0.05 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml 내지 100㎍/ml, 0.1 ㎍/ml 내지 70㎍/ml, 0.1 ㎍/ml 내지 50 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml 내지 40 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml 내지 30 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml 내지 25 ㎍/ml 또는 그로부터 유도된 임의의 용량 또는 범위이지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "개체"는 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 생쥐와 같은 모든 동물을 포함하는 인간 및 비인간을 지칭한다. 상기 개체는 본 발명의 펩타이드 또는 이의 조성물을 투여함으로써 각종 암 또는 염증성 질환의 증상을 개선할 수 있는 질환의 치료가 필요할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "phospholipase A2(PLA2)"는 두 번째 탄소 위치의 글리세롤을 가수분해하여 지방산을 생성하는 기능을 하는 효소로 인지질의 sn-2 아실 결합을 특이적으로 인식하여 아라키돈산과 리소인지질을 방출함으로써 가수분해 활성을 촉매한다. 상기 PLA2는 박테리아, 곤충 및 뱀 독 뿐만 아니라 포유류 조직에서도 흔히 발견된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, Mpep 및 항암제를 결합하는 단계를 포함하는, Mpep-항암제 컨쥬게이트의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 M2-형 대식세포를 감소시키거나 M2-형 대식세포-매개 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열 3, 4, 5, 7, 또는 8의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 비교하여 M2-형 대식세포를 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 질환은 암 일 수 있고 상기 암은 흑색종, 전립선암, 폐암, 유방암, 결장암, 췌장암, 또는 암 미세환경에서 M2-형 종양 관련 대식세포를 갖는 다른 고형 종양일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 암은 간세포암일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 질환은 섬유증-관련 질환, 말기-간 질환, 신장 질환, 특발성 폐 섬유증(IPF), 심부전, 경피증, 류마티스 관절염, 크론병, 궤양성 대장염, 골수 섬유증을 포함하는 다양한 만성 자가면역 질환 및 전신성 홍반성 루푸스, 종양 침습 및 전이, 만성 이식 거부 및 다양한 진행성 근병증, 간경화 및 섬유증, 양성 전립선 비대증 또는 전립선염의 병인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 질환은 폐 섬유증일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 질환은 폐 섬유증일 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 M1-형 대식세포를 감소시키거나 M1-형 대식세포-매개 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 3, 4, 5, 7, 8, 또는 11로 구성되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2로 구성되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 비교하여 M1-형 대식세포를 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 질환은 패혈성 쇼크, 다발성 기관 기능 장애 증후군(MODS), 아토피 피부염, 류마티스 관절염, 또는 자가면역 장애를 포함하는 만성 염증성 질환일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 질병은 패혈성 쇼크를 포함하는 패혈증일 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 M0-형 대식세포를 감소시키거나 M0-형 대식세포-매개 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11로 구성되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2로 구성되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 비교하여 M0-형 대식세포를 감소시킬 수 있다.

본 발명의 Mpep 폴리펩타이드는 M2, M1, 및/또는 M0 대식세포를 선택적으로 표적화할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "선택적"은 다른 유형보다 하나 이상의 유형의 대식세포에 대한 선호도 또는 더 큰 결합 또는 친화도를 의미하며, 예를 들어 이에 제한되지는 않지만 적어도 1/4배, 적어도 1/3배, 적어도 1/2배, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 5배 등, 또는 이들로부터 유도된 임의의 배수 또는 범위를 의미한다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 종양-관련 대식세포-매개 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 상기 조성물은 M2형 종양 관련 대식세포의 제거를 통한 암 성장 및 전이의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다. 그러나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 컨쥬게이트를 이용하여 종양의 성장 및 전이를 억제하거나 지연시키는 모든 작용을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 염증성 질환 또는 암, 종양 성장 및/또는 전이와 같은 질병의 증상에 대해 본 발명의 펩타이드를 사용하여 감소, 억제 또는 유익하게 변경되는 임의의 작용을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "항암제"는 화학요법제와 같이 암 치료에 사용되는 약물의 총칭이다. 상기 항암제는 화합물 또는 프로-아폽토시스 펩타이드일 수 있다. 그러나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "암"은 신체 조직의 자율적인 과증식으로 인해 비정상적으로 자라는 종양 또는 종양과 관련된 질환을 의미한다. 일부 실시양태에서, 상기 암은 흑색종, 전립선암, 폐암, 유방암, 결장암, 췌장암, 또는 암 미세환경에서 M2-형 종양 관련 대식세포를 갖는 다른 고형 종양일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 엔티노스타트(entinostat), 클라드리빈(cladribine), 프랄라트렉세이트 (pralatrexate), 로라티닙(lorlatinib), 메이탄신 DM1, 메이탄신 DM3, 및 메이탄신 DM4일 수 있다. 그러나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프로-아폽토시스(pro-apoptosis)"는 세포가 바이오 에너지인 ATP를 능동적으로 소비하면서 세포가 사멸하는 과정을 의미한다. 전형적인 아폽토시스 과정은 세포 수축, DNA의 규칙적인 절단 및 세포막의 단편화를 통해 진행된다. 아폽토시스(세포사멸)는 비정상적인 세포 분열, 방사선, 자외선, 박테리아 감염 또는 바이러스 감염으로 인해 세포가 정상적인 기능을 유지하지 못할 때 유도될 수 있다.

본 발명의 프로-아폽토시스 펩타이드는 dKLA, 알파-디펜신-1(alpha-defensin-1), BMAP-28, 브레베닌-2R(brevenin-2R), 부포린 IIb(buforin IIb), 세크로핀 A-마게이닌 2(CA-MA-2), 세크로핀 A(cecropin A), 세크로핀 B(cecropin B), 크리소프신-1(chrysophsin-1), D-K6L9, 고메신(gomesin), 락토페리신 B(lactoferricin B), LL27, LTX-315, 마가이닌 2(magainin 2), 마가이닌 II봄베신 컨쥬게이트(MG2B), 파닥신(pardaxin), 또는 이들의 조합일 수 있다. 그러나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "종양 관련 대식세포(tumor-associated macrophage, TAM)"는 암의 성장 및 전이와 같은 전반적인 종양 미세환경에서 중요한 역할을 하는 대식세포를 의미한다. 종양 주변에 존재하는 종양 관련 대식세포는 종양 세포의 성장 및 전이와 밀접한 관련이 있다. 종양 관련 대식세포는 종양 억제 M1 대식세포 또는 종양 지지 M2 대식세포의 두 가지 표현형으로 분류된다. M2형 종양 관련 대식세포는 IL-10, TGFbeta 및 CCL18과 같은 사이토카인을 생성하여 암 성장을 촉진하고 표면 수용체를 통해 T 세포 및 NK 세포의 항종양 활성을 억제한다. 이러한 종양 관련 대식세포(TAM)는 골수, 난황낭 또는 골수외 조혈에서 유래하는 단핵구 및 대식세포와 구별될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 TAM은 골수로부터 단리될 수 있다. 그러나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 컨쥬게이트 또는 이를 함유하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 종양 관련 대식세포 매개 질환의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 종양 관련 대식세포 매개 질환의 예방 또는 치료를 위한 Mpep-항암 약물 컨쥬게이트의 용도가 제공된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "치료학적 유효량"은 염증성 질환, 암 또는 종양 관련 대식세포 매개 질환과 같은 의도된 질환의 치료에 효과적인 Mpep의 양을 의미한다.

본 발명의 Mpep-항암 약물 컨쥬게이트는 M2-형 TAM(tumor-associated macrophage)을 표적으로 하는 항암물질로서, M2-형 TAM(tumor-associated macrophage)을 선택적으로 선택하는 효과가 우수하다. 따라서 M2-형 종양 관련 대식세포를 표적으로 하는 약물 전달을 위해 Mpep과 항암제 간의 결합 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 종양 관련 대식세포 매개 질환의 예방 또는 치료 방법, 특히 루이스 폐암 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법은 증상이 발현되기 전에 질환 자체를 치료할 뿐만 아니라, Mpep를 투여함으로써 이의 증상을 억제하거나 회피한다. 질병의 관리에서, 특정 활성 성분의 예방 또는 치료 용량은 질병 또는 상태의 성질 및 중증도, 활성 성분이 투여되는 경로에 따라 달라질 것이다. 투여량은 1일 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg(체중), 1일 0.2 mg/kg 내지 8 mg/kg(체중), 1일 0.3 mg/kg 내지 5 mg/kg(체중), 1일 0.4 mg/kg 내지 3 mg/kg(체중), 1일 0.5 mg/kg 내지 1 mg/kg(체중), 또는 이로부터 유도된 임의의 용량 또는 범위이지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물의 경구 투여량은 1일 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg(체중), 1일 0.2 mg/kg 내지 8 mg/kg(체중), 1일 0.3 mg/kg 내지 5 mg/kg(체중), 1일 0.4 mg/kg 내지 3 mg/kg(체중), 1일 0.5 mg/kg 내지 1 mg/kg(체중) 일 수 있다. 또는 그로부터 유도된 임의의 용량 또는 범위이지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 조성물을 종양 관련 대식세포의 제거가 필요한 개체에게 투여하는 경우, 그 투여량은 0.01 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml, 0.05 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml, 0.2 ㎍/ml 내지 70 ㎍/ml, 0.3 ㎍/ml 내지 50 ㎍/ml, 0.4 ㎍/ml 내지 40 ㎍/ml, 0.5 ㎍/ml 내지 30 ㎍/ml, 0.6 ㎍/ml 내지 25 ㎍/ml, 또는 이로부터 유도된 임의의 용량 또는 범위지만, 이에 제한되지 않는다.

투여는 1일 1회 또는 수회 투여될 수 있다. 그러나, 그 투여량과 투여 빈도는 환자 개개인의 연령, 체중, 반응에 따라 달라질 수 있으며, 적절한 투여량은 이러한 요인을 자연스럽게 고려하는 당업자라면 용이하게 선택할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위한 실시예를 제시한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위해 제공되는 것으로, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 재료 및 방법

1.1. 펩타이드 합성

보호된 아미노산 및 2-(6-chloro-1Hbenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetra-methylaminium hexafluorophosphate(HCTU)는 AAPPTec(Louisville, KY) 및 AnaSpec (Fremont, CA)에서 구입했다. 펩타이드 합성은 표준 Fmoc 고체상 펩타이드 합성 화학에 따라 자동화된 PS3 펩타이드 합성기(Protein Technologies, Phoenix, AZ)에서 수행되었다. 필요한 경우 아미노산과 HCTU가 DMF 중 0.4M N-메틸모르폴린(methylmorpholine)에 용해된 용액에서 3시간 동안 배양하여 아미노산을 수동으로 결합했다. 커플링 반응은 Kaiser Test로 완료되었는지 확인했고 Fmoc 보호 그룹은 DMF 중 20%(v/v) 피페리딘에서 30분 동안 2회 배양을 통해 제거되었다. 2시간 동안 acetic anhydride/triethylamine/DCM(1:1:5 v/v/v)에서 펩타이드의 N-말단에서 아세틸화시켰다. 펩타이드를 TFA(trifluoroacetic acid)/TIPS(triisopropyl-silane)/EDT(1,2-ethanedithiol)/DMB(1,3-dimethoxybenzene(90:2.5:2.5:5 v/v/v/v)에서 2.5시간 동안 분해였다. EDT는 시스테인-함유 펩타이드에 대해서만 절단 용액(cleavage solution)에 포함되었다. 상기 절단된 펩타이드를 차가운 에테르에서 2회 침전시키고 이동상 A 및 ACN(0.1% TFA)을 이동상 B로 H2O(0.1% TFA) 중 Phenomenex Fusion-RP C18 semi-preparative 컬럼(Torrance, CA)을 사용하여 RP-HPLC(Agilent 1200, Santa Clara, CA)로 정제했다. 그 후, HyperSep™ C18 카트리지를 사용하여 펩타이드를 탈염하고 RP-HPLC로 순도를 확인했다. 상기 정제된 펩타이드의 분자량은 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석기(MALDI-TOF MS, Bruker Daltonics, Billerica, MA)에 의해 확인되었다.

상기 방법에 따라 하기 펩타이드를 합성하였다.

TAMPep: 전장 멜리틴(서열번호 1);

Mpep: 첫 7개 아미노산이 제거된 전장 멜리틴(서열번호 2);

TAMpepK: d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys(dKLA)(서열번호 47)에 부착된 링커(GGGGS)(서열번호 36)에 부착된 전장 멜리틴 펩타이드(서열번호 1) ; 및

MpepK: d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys(dKLA)(서열번호 47)에 부착된 링커(GGGS)(서열번호 36)에 부착된 Mpep(서열번호 2).

1-2. 세포

THP-1 세포는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입하고 열처리되지 않은 10% 우태아혈청(FBS; WelGENE), 2 mM L-글루타민, 0.05 mM β-메르캅토에탄올, 10 mM HEPES, 4500 mg/L 포도당, 100U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(Gibco)이 첨가된 RPMI 1640 배지를 사용하여 특정 적응증에 따라 배양했다. B16F10 마우스 흑색종 세포는 ATCC에서 구입했으며 10% FBS(WelGENE) 및 페니실린/스트렙토마이신(100 U/ml, Gibco)이 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM; WelGENE)에서 성장했다. Sk-Mel-28 인간 흑색종 세포(ATCC)를 10% FBS(WelGENE), 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(Gibco)을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 성장시키고 유지시켰다. 마우스 전립선암 세포(TRAMP-C2)는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입하여 페니실린과 스트렙토마이신(Gibco)을 함유하고 10% FBS(WelGENE)가 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM; WelGENE)에서 배양했다. American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입한 인간 전립선암 세포주(PC3)를 2.05 mM L-글루타민, 2 g/liter 중탄산나트륨 및 2 g/liter 포도당(WelGENE), 10% FBS(WelGENE), 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(Gibco)과 함께 37℃에서 가습된 5% CO₂ 분위기 하에 RPMI 1640 배지에서 배양했다.

1-3. 동물 연구

BALB/c 및 C57BL/6(B6) 야생형 마우스는 DBL에서 구입했다. 흑색종 및 전립선암의 피하 종양 모델을 위해, CT26(3×10⁵ cells/mouse), B16F10(1×10⁶ cells/mouse) 및 TRAMP-C2 세포(1×10⁶ cells/mouse)를 Matrigel matrix(Corning)와 혼합하여 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종하고, 4T1(1×10⁵ cells/mouse) 세포를 Matrigel matrix와 혼합하여 마우스의 4번째 유선 지방 패드에 접종하였다. TAMpepK 및 MpepK 펩타이드(200 nmol/kg)는 종양 접종 후 7일째부터 시작하여 매 3일마다 복강 내 주사하고 전자 캘리퍼스로 종양 부피를 측정하였다. 연구 종료 후 모든 종양 조직을 수확하고 전자 저울로 종양 무게를 측정했다.

폐 섬유증 마우스 모델의 경우, C57BL/6(B6) 야생형 마우스를 2.5% 이소플루란(isoflurane)으로 가볍게 마취하고 마이크로피펫을 사용하여 구강인두 흡인(OA)을 통해 블레오마이신(BLM, 2 mg/kg)을 투여했다. 14일 후, 상기 마우스에 격일로 MpepK(200 nmol/kg)를 복강내 주사하였다. 동물 연구는 경희대학교 동물관리위원회(KHUASP(SE)-20-530 흑색종, 20-382 전립선암)의 승인을 받았다. 모든 동물은 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 12시간 명암 주기로 특정 병원체 없는 환경에서 유지되었다. 중첩 시트(Nesting sheets)는 농축을 위해 사용되었다. 실험이 종료된 후 모든 마우스를 이소플루란과 경추 탈구를 사용하여 안락사시켰다.

1.4. 대식세포 분화

THP-1 단핵구는 100 nM 포르볼 12-myristate 13-acetate(PMA, Sigma)와 함께 24시간 배양한 후 RPMI 배지(Invitrogen)에서 24시간 배양하여 대식세포로 분화되었다. 대식세포는 20 ng/ml의 IFN-γ(Prospec) 및 100 ng/ml의 LPS(Sigma)와 함께 배양하여 M1 대식세포(M1)에서 극성화되었다. 대식세포 M2 극성화(M2)는 20 ng/ml의 인터루킨(IL) 4(Prospec) 및 20 ng/ml의 인터루킨 13(Prospec)과 함께 배양하여 수득하였다. M2-유사 종양-관련 대식세포는 PC3 세포의 20% 조건 배지와 함께 배양하여 극성화되었다.

1-5. 조건 배지의 준비

종양 조건 배지(TCM)를 얻기 위해 PC3 세포를 24웰 플레이트(Corning Inc)의 배양 배지에 2×10⁵개 세포/웰로 파종하였다. 24시간 후, 상기 배지를 무혈청 RPMI1640 배지로 교체하고 상기 세포를 24시간 동안 배양하였다. 대식세포의 조건 배지의 경우, THP-1 세포를 24웰 플레이트(Corning Inc)의 배양 배지에 2×10⁵ 세포/웰로 파종하고 100 nM PMA와 함께 24시간 동안 배양하였다. 그 후, TCM에 의해 세포를 M0, M1, 및 M2 대식세포 또는 TAM 대식세포로 극성화하고 무혈청 RPMI1640 배지로 변경하였다. 24시간 후, 상기 배지를 무혈청 RPMI1640 배지로 교체하고 상기 세포를 24시간 동안 배양하였다. 상등액을 수확하고 주사기 필터(0.2 μm, Milipore)로 정화했으며 PC3 세포의 상등액을 종양 조건 배지(TCM)라고 명명했다.

1-6. 유세포 분석

THP-1 세포는 100 nM PMA와 함께 24시간 배양하여 대식세포로 분화되었고 72시간 동안 20 ng/ml의 IL-4 및 20 ng/ml의 IL-13과 함께 배양하여 M2 대식세포에서 극성화되었다. 상기 극성화된 세포를 50 nM TAMpep 및 TAMpep 또는 Mpep의 단편 및 FITC와 결합된 Mpep의 알라닌 라이브러리로 1시간 동안 처리했다. 흑색종 조직에서 대식세포 집단의 변화를 시험하기 위해, 단일 세포를 DNase I(1 U/mL) 및 콜라게나제 D(1 mg/ml)에 의한 해리 후 40 μm 나일론 메쉬 스트레이너(nylon mesh strainer)를 통해 종양 조직으로부터 분리하였다. 세포는 BD FACSCalibur 및 BD FACSCantoII 기기에서 검출되었고 FlowJo 소프트웨어로 분석되었다.

1-7. 세포 생존력 테스트

THP-1 세포는 100 nM PMA와 함께 24시간 배양하여 대식세포로 분화되었고 72시간 동안 20 ng/ml의 IL-4 및 20 ng/ml의 IL-13과 함께 배양하여 M2 대식세포에서 극성화되었다. 상기 극성화된 세포를 24시간 동안 증가하는 농도의 TAMpep 및 TAMpep 단편(0.05-20 μM)으로 처리했다. CCK-8 분석을 사용하여 세포 생존력을 분석했다: CCK-8 시약(Enzo Life Sciences)을 각 웰에 첨가했다; 2시간 동안 배양을 계속하고 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정했다.

1-8. 용혈 활성 분석

마우스 혈액 샘플을 항응고제로 헤파린을 함유한 튜브에 수집하고 사용하기 전에 4℃에서 보관했다. 그 후, 전혈 샘플을 1,500×g에서 5분 동안 원심분리하고 생성된 혈장 분획을 샘플에서 제거하였다. 펠릿을 동일한 부피의 식염수로 세척하고, 역전으로 혼합하였다. 원심분리 및 세척 단계를 5회 반복하였고 적혈구를 혈구계산기로 계수하였으며 -5 × 10⁷ cells/mL로 조정하였다. 그런 다음 적혈구를 37℃에서 1% Triton X-100(양성 대조군), PBS(블랭크), 또는 증가하는 농도의 TAMpep 및 Mpep(0.1-50 μM)에서 배양하여 평가했다. 그 후 상기 샘플을 10,000 g에서 5분 동안 원심분리하고 상등액을 펠렛에서 분리하였으며 570 nm에서 흡광도를 측정했다. 1% Triton X-100으로 처리된 현탁액과 비교한 상대 광학 밀도를 용혈 백분율로 정의했다.

1-9. ELISA 분석

인간 대식세포의 극성화를 조사하기 위해, THP-1 세포를 24웰 플레이트(Corning Inc)의 배양 배지에 2×10⁵ 세포/웰로 파종하고 24시간 동안 100nM PMA와 함께 배양했다. 대식세포는 20 ng/ml의 IFN-γ 및 100 ng/ml의 LPS 및 M2 대식세포와 20 ng/ml의 IL-4 및 20 ng/ml의 IL-13과 함께 배양하여 M1 대식세포에서 극성화되었다. 분화 후, 대식세포의 상등액을 수집하였다. IL-10, TGF-β와 같은 M2 대식세포 및 IL-12, CXCL10과 같은 M1 대식세포의 마커는 제조사의 지침(BD Biosciences Inc.)에 따라 ELISA 키트로 측정하였다.

1-10. 면역형광 분석

THP-1 세포를 24웰 플레이트의 커버 글래스에 파종하고 M0, M1 및 M2 대식세포로 분화했다. 세포를 1 μM TAMpepK 및 MpepK로 1시간 동안 처리하고 펩타이드를 제거한 후 24시간 동안 배양하였다. 그 후 상기 세포를 세척하고 -20℃에서 4% 파라포름알데히드로 10분간 고정하고 0.1% 정상 염소 혈청으로 1시간 동안 차단하였다. 그런 다음 상기 커버 글래스를 항-캐스페이즈-3 항체(1:50, 토끼 다클론, Abcam)와 함께 4℃에서 밤새 배양하였고 세척하고 나서 Alexa 594-표지된 염소 항-토끼 lgG(1:500, Invitrogen)로 37℃에서 1시간 동안 염색하였다. 상기 커버 글래스는 핵을 시각화하기 위해 DAPI가 있는 Vectashield 장착 매체(Vector Laboratories)에 장착되었다. 이미지는 형광현미경(Leica)으로 촬영하였다.

1-11. 실시간 정량 PCR

Easy-Blue 시약을 사용하여 총 RNA를 추출했다. RNA의 농도는 분광광도계로 260 및 280 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하고 정량화했다. Maxime RT PreMix 키트(iNtRON)를 사용하여 전체 RNA에서 상보적 DNA(cDNA)를 합성했다. Real-time PCR 분석은 SYBR Green Master Mix로 수행되었다. PCR 조건은 95℃에서 5분, 95℃에서 10초, 60℃에서 10초, 72℃에서 10초 순으로 45회 반복하였다. mRNA 발현을 삼중으로 정량화하였다. 데이터는 CFX 소프트웨어(Bio-Rad)로 측정되었고 GAPDH 및 β-액틴을 내부 대조군으로 사용하였다.

1-12. 웨스턴 블롯 분석

세포를 수확하고 PRO-PREP 단백질 추출 용액(iNtRON, Bio Inc, 성남, 한국)에서 용해시켰다. 단백질 농도는 Bradford 단백질 분석 시약 키트(Bio-Rad, Richmond, CA, USA)를 사용하여 측정했다. 단백질 농도는 Bradford 단백질 분석 시약 키트(Bio-Rad, Richmond, CA, USA)를 사용하여 측정했다. 그 후 단백질을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)으로 분별하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막으로 이송하였다. 그 후 1차 항체인 항-아르기나제 1, 항-CD206, 항-캐스페이즈 3, 항-E-카드헤린, 항-피브로넥틴, 항-PCNA, 항-TGF-β, 항-MMP9 및 항-β-액틴 Ab와 함께 배양하였다. 염소 항-토끼 서양고추냉이 퍼옥시다제-결합 IgG 또는 염소 항-마우스 서양고추냉이 퍼옥시다제-결합 IgG(Abcam, Cambridge, MA, USA)가 2차 항체로 사용되었다. 단백질 밴드는 화학발광 시약 키트(SurModics)로 검출되었다.

1-13. 상처 치유 분석

전립선암과 흑색종 세포의 이동은 상처 치유 분석으로 평가하였다. PC3 및 Sk-Mel-28 세포를 24-웰 플레이트에 2×10⁵개 세포/웰로 파종하고 10% FBS와 함께 RPMI1640에서 배양하였다. 세포가 합류점에 도달했을 때, 멸균 마이크로피펫 팁으로 웰 표면을 긁어 상처를 유발하였다. 그 후 상기 세포를 즉시 세척하고 웰을 무혈청 배지 또는 TAMpepK 또는 MpepK가 있거나 없는 M0, M1, M2 및 M-TCM의 20% 조건 배지로 채우고 24시간 동안 배양하였다. 배양 전후에, 도립현미경(Olympus)을 사용하여 각 샘플의 상처 부위의 적어도 5개의 상이한 필드를 촬영하였다. ImageJ 소프트웨어(NCI, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 상처 부위를 측정했다. 세포 이동으로 채워진 각 상처 부위의 백분율은 하기 공식을 이용하여 계산하였다:(평균 상처 너비-평균 남은 너비)/평균 상처 너비 × 100.

1-14. 침윤 분석

대식세포의 조절된 배지로 처리된 전립선암 세포의 침윤성은 약간 변형된 침습 분석(Corning Inc.)에 대한 제조업체의 지침에 따라 조사하였다. 간단히 말해서, 37℃에서 2시간 동안 매트리겔(200-300 μg/mL)로 사전 코팅된 폴리카보네이트 8 μm 기공 멤브레인 삽입물(Corning Inc.)이 장착된 24웰 플레이트를 사용하여 침윤성을 평가했다. 하부 웰은 350 μL의 무혈청 RPMI1640 배지 또는 20% 조건 배지(TAMPepK 또는 MpepK가 있거나 없는 M0, M1, M2 및 M-TCM의 조건 배지)로 채웠다. 상부 웰은 무혈청 배지에서 200 μL PC3 세포(5×10⁴개 세포/웰)로 채웠다. 상기 플레이트를 24시간 동안 배양하였고 세포를 메탄올에 고정하고 Giemsa로 염색했다. 멤브레인당 무작위로 선택된 5개의 필드를 광학 현미경(Olympus)으로 계산했다. 침윤 지수는 조절 배지가 없는 대조군과 비교하여 조절 배지에 반응하여 이동한 세포의 수로부터 계산되었다.

1-15. H&E 염색

폐 섬유증 마우스 모델의 폐 조직을 10% 중성 완충 포르말린에 고정하고 파라핀에 포매하였다. 파라핀이 포매된 조직 샘플을 5-μm 조각으로 절단한 다음 탈파라핀화하고 H&E로 염색하여 폐 조직 섬유증의 정도를 조사했다. 그 후 조직 절편은 표준 광학 현미경(Olympus)을 사용하여 무작위로 검사 및 평가하였다.

실시예 2. 결과

2-1. THP-1 유래 대식세포의 극성화

M1 또는 M2 대식세포로 극성화하기 위해, THP-1 세포를 M0 대식세포에 대해 PMA로 처리한 다음, M1 대식세포에 대해 LPS 및 IFN-γ 및 M2 대식세포에 대해 IL-4 및 IL-13과 함께 배양하였다. 대식세포의 극성화는 IL-12, CXCL10 및 CD86과 같은 M1 마커와 IL-10, TGF-β, 아르기나제 1 및 CD206과 같은 M2 마커에 의해 평가되었다. LPS와 IFN-γ를 처리한 대식세포는 M1 마커의 증가를 보였고(도 1d, 1e, 1f), IL-4와 IL-13을 처리한 대식세포는 M0에 비해 M2 마커의 증가를 보였다(도 1a, 1b, 1c, 및 1f). 따라서, 극성화된 대식세포는 M2 대식세포를 표적으로 하는 TAMpepK 또는 MpepK의 효능을 평가하는 추가 연구에 사용될 수 있다.

2-2. THP-1 유래 M2 대식세포에서 TAMPep 단편의 친화도

M2 대식세포에 결합하는 TAMpep의 주요 아미노산 부위를 조사하기 위하여, THP-1 유래 M2 대식세포에서 FITC가 결합된 TAMpep 및 TAMpep의 단편(아미노산 서열, 도 2A)을 사용하여 친화도 시험을 수행하였다. TAMpep(26개 아미노산 포함)는 90% 이상의 높은 친화도를 보였고 Mpep(C 말단에서 7개 아미노산 제거)는 M2 대식세포에서 45% 이상으로 두 번째로 높은 친화도를 보였다. 한편, TAMpep의 단편(C 말단에서 10개 이상의 아미노산 또는 N 말단에서 4개 이상의 아미노산이 제거됨)은 26개 아미노산의 스크램블된 펩타이드와 비교하여 낮은 친화도를 나타내었다(도 2b 및 2c). 따라서, 상기 결과는 N 말단의 4-6개 아미노산이 M2 대식세포에 대한 TAMpep의 친화도에 중요한 역할을 하는 아미노 부위임을 시사하는 것이다.

2-3. THP-1 유래 M2 대식세포에서 TAMpep 단편의 세포독성

26개 아미노산의 TAMpep은 세포독성이 있어 약물 운반체로 사용할 경우 정상 세포나 조직에 부작용을 일으킬 수 있다. 따라서 M2 대식세포에 대한 높은 친화도 와 낮은 세포독성을 갖는 새로운 서열 펩타이드가 필요하였다. 다양한 TAMpep 단편을 THP-1 유래 M2 대식세포의 세포독성 분석에서 조사하였다. TAMpep은 0.815 μM IC₅₀의 높은 세포독성 값을 나타내는 반면, 다른 펩타이드 단편은 M2 대식세포에서 세포독성 효과를 나타내지 않았다(도 3a 내지 3c). 특히, Mpep은 M2 대식세포에서 높은 친화도와 낮은 세포독성을 나타내어 최적의 약물 운반체로 기대되었다.

2-4. TAMpep 및 Mpep의 용혈

용혈 효과는 심각한 부작용을 일으킬 수 있으며 약물의 투여량을 제한하는 요인 중 하나이다. TAMpep 및 Mpep의 용혈을 조사하기 위해 마우스 RBC에서 펩타이드를 증가하는 농도(0.1 - 50 μM)로 처리했다. TAMpep은 IC₅₀에서 6.669 μM을 나타내었고, 반면 Mpep은 IC₅₀에서 > 50 μM을 나타냈다(도 4a 및 4b). 또한, TAMpep 및 Mpep 결합된 dKLA는 IC₅₀에서 각각 1.122 μM 및 > 50 μM을 나타내었다(도 4c 및 4d). 따라서 Mpep은 부작용이 적은 안전한 약물로 개발될 수 있다.

2-5. THP-1 유래 대식세포에서 TAMpep 및 Mpep의 친화도

TAMpep과 Mpep가 대식세포의 서브타입 중 M2 대식세포에 더 특이적으로 부착하는지 비교하기 위해 FITC가 결합된 펩타이드에 THP-1 세포에서 극성화된 M0, M1, 및 M2 대식세포를 처리하고 FACs로 분석하였다. TAMpep 및 Mpep는 모두 M0 및 M1 대식세포와 비교하여 M2 대식세포에서 훨씬 더 높은 친화도를 보여주었다(도 5a 및 5b). 또한, TAMpep은 면역형광 현미경에 의해 M2 대식세포에서 높은 친화도를 보였다(도 5c).

2-6. THP-1 유래 대식세포에서 TAMpepK 및 MpepK의 세포독성

TAMpep 및 Mpep 결합된 dKLA가 선택적 세포사멸을 유도하는지 여부를 평가하기 위해 M2 대식세포를 TAMpepK 또는 MpepK(0.01 - 10 μM)의 농도를 증가시키면서 처리했다. 그 결과, TAMpepK 및 MpepK는 M0 및 M1 대식세포에 비해 M2 대식세포에서 세포사멸을 유도하였다(도 6a 및 6b). 또한, 다른 서브타입 대식세포에 비해 M2 대식세포에서 세포사멸과 관련된 캐스페이즈-3의 발현이 증가하였다(도 6c 및 6d).

2-7. THP-1 유래 대식세포에서 알라닌 라이브러리에 의한 Mpep의 친화도

M2 대식세포에서 Mpep의 부착력에 중요한 주요 아미노산 서열을 찾기 위해 Mpep의 알라닌-치환 라이브러리를 사용하였다. M2 대식세포에서 3번째 T(트레오닌), 6번째 L(류신), 9번째 L(류신), 12번째 W(트립토판), 13번째 I(이소류신), 16번째 K(라이신) 및 17번째 R(아르기닌)에 알라닌이 치환되었을 때 펩타이드의 친화도가 감소하였다. 또한 6번째 L(류신)과 3번째 T(트레오닌), 15번째 K(라이신), 16번째 R(아르기닌), 17번째 K(라이신) 및 19번째 Q(글루타민)을 통해 치환된 펩타이드(A13-16 및 A05)에서 펩타이드의 친화도가 감소하였다. 한편, 펩타이드(A9 및 A18)는 2번째 L(류신) 및 11번째 S(세린)으로 치환된 M2 대식세포에서 증가된 친화도를 보였다.

2-8. M2 대식세포 및 인간 흑색종 세포에서 TAMpepK의 세포독성

TAMpepK가 흑색종 세포보다 더 많은 세포사멸 및 M2 대식세포에 대한 결합을 유도하는지 여부를 조사하기 위해, THP-1 유래 M2 대식세포 및 Sk-Mel-28 세포를 TAMpep(도 8A) 또는 TAMpepK(도 8c)로 처리하였다. TAMpepK는 흑색종 세포(IC₅₀: 3.583 μM)에 비해 M2 대식세포에서 낮은 IC₅₀ 값(1.055 μM)을 나타내었고, 캐스페이즈-3의 발현은 흑색종 세포와 비교하여 M2 대식세포에서도 증가하였다(도 8c). 따라서 상기 결과는 TAMpep이 M2 대식세포에 선택적으로 결합하여 세포사멸을 유도함을 시사하는 것이다.

2-9. TAMpepK로 처리된 M2 대식세포의 조건 배지에 의한 흑색종 세포의 증식 및 이동

TAMpepK가 M2 대식세포에 의해 유도된 흑색종 세포의 증식 및 이동을 억제하는지 여부를 조사하기 위해, TAMpepK(1 μM) 무처리 또는 전처리된 M0, M1 및 M2 대식세포의 조건 배지 및 흑색종 세포에 처리된 조건 배지를 제조하였다. 흑색종 세포의 증식은 M2 대식세포의 조건 배지에 의해 증가된 반면, TAMpepK로 전처리된 M2 대식세포의 조건 배지에서는 억제되었다(도 9a). 또한, TAMpepK로 전처리된 M2 대식세포의 조건 배지는 흑색종 세포의 이동을 억제하였지만 M2 대식세포의 조건 배지에 의해 이동이 증가하였다(도 9b 및 9c). 따라서 TAMpepK는 M2 대식세포의 세포사멸을 유도하여 흑색종 세포의 증식 및 이동을 억제한다.

2-10. 흑색종 마우스 모델에서 TAMpepK의 항암 효과

TAMpepK의 생체 내 항암 효과를 평가하기 위해 C57BL6J 마우스의 오른쪽 옆구리에 마우스 흑색종 세포(B16F10 세포주)를 피하 주사하고 일주일 후 3일마다 TAMpepK를 복강 내 주사했다. TAMpepK로 처리된 마우스는 PBS 그룹과 비교하여 유의하게 감소된 종양 부피 및 중량을 나타내었다(도 10a, 10c 및 10d).반면에, 마우스의 체중은 PBS와 TAMpepK 그룹 사이에서 유의한 변화가 없었다(도 10b).

2-11. 흑색종 마우스 모델에서 M2-유사 TAM을 표적으로 하는 TAMpepK의 효과

TAMpepK가 흑색종 마우스 모델에서 M2-유사 TAM을 감소시키는지 여부를 조사하기 위해 대식세포를 종양 조직에서 분리하고 FACs로 분석했다. M2-유사 TAM(F4.80⁺ 및 CD206⁺ 세포)은 PBS 그룹과 비교하여 TAMpepK 그룹에서 유의하게 감소했다. 그러나, M1-유사 TAM(F4/80⁺ 및 CD86⁺ 세포)은 PBS와 TAMpepK 그룹 사이에 변화가 없었다(도 11a 및 11b). 또한, M1/M2 비율을 통한 종양 미세환경의 변화를 분석하였다. TAMpepK 그룹은 PBS 그룹에 비해 M2 대식세포를 감소시켜 M1 대식세포의 비율을 증가시켰다(도 11c). 따라서, 상기 결과는 TAMpepK가 흑색종 모델에서 M2-유사 TAMs를 표적화함으로써 항암 효과가 있음을 시사하는 것이다.

2-12. 흑색종 마우스 모델에서 TAMpepK 및 MpepK의 항암 효과

TAMpepK의 항암 효과는 상기 결과에서 확인하였다. 본 연구는 흑색종 모델에서 MpepK의 항암 효과를 확인하기 위해 수행되었다. 종양의 사진을 도 12a에 나타내었다. 종양 부피(도 12c) 및 중량(도 12b)은 TAMpepK 및 MpepK 그룹 모두에서 감소되었고, 생존율(도 12d)은 PBS 그룹에 비해 MpepK 그룹에서 연장되었다.

2-13. 흑색종의 마우스 모델에서 M2-유사 TAM을 표적으로 하는 TAMpepK 및 MpepK의 효과

MpepK가 흑색종에서 종양 미세환경의 변화를 유도하는지 여부를 조사하기 위해 대식세포의 M1/M2 비율과 CD8 소진을 FACs로 분석하였다. M2-유사 TAM(F4/80⁺ 및 CD86⁺ 세포)은 PBS 그룹과 비교하여 TAMpepK 및 MpepK 그룹에서 감소했다. 그러나, M1-유사 TAM(F4/80⁺ 및 CD86⁺ 세포)은 모든 그룹에서 변화를 나타내지 않았다(도 13a 및 13b). M1/M2 비율은 PBS 그룹에 비해 TAMpepK 및 MpepK 그룹에서 유의하게 증가하였다(도 13c). 또한, CD8⁺ T 세포에서 PD-1 및 LAG3과 같은 소진 마커는 PBS 그룹에 비해 TAMpepK 및 MpepK 그룹에서 유의하게 감소하였다(도 13d 및 13e). 따라서, 상기 결과는 MpepK가 흑색종 모델에서 M2-유사 TAM을 표적화함으로써 항암 효과가 있음을 시사하는 것이다.

2-14. 전립선 종양 세포(TCM)의 조건 배지에 의한 THP-1 유래 M2 대식세포의 분화

전립선암 세포(TCM)의 조건 배지에 의한 M2 대식세포의 극성화를 조사하기 위해, THP-1 유래 대식세포를 TCM과 함께 배양하였다. TCM-처리 대식세포는 M0 대식세포와 비교하여 아르기네이즈 1, CD206 및 CD163과 같은 M2 마커의 mRNA 발현 증가를 보였고 NOS2 및 CCR7과 같은 M1 마커의 mRNA 발현 감소를 보였다(도 14a 및 14b). 따라서, 상기 연구는 전립선암의 종양 미세환경에서 M2-유사 TAM으로 유도된 극성화를 보여주었다.

2-15. M2 대식세포의 조건 배지에 의한 전립선암 세포의 증식 및 이동

도 15a 내지 15c에 나타낸 바와 같이, THP-1 유래 M2 대식세포에 의해 암세포의 증식 및 이동이 증가하였다. TCM에 의해 극성화된 M2 대식세포는 전립선암 세포의 증식 및 이동을 유도함을 조사하였다. TCM(M-TCM)으로 처리된 대식세포의 조건 배지는 전립선암 세포의 증식(도 15a) 및 이동(도 15b 및 15c)을 증가시켰고, THP-1 유래 M2 대식세포의 조건 배지와 유사하다(도 15a 내지 15c).

2-16. TAMpepK 또는 MpepK에 의한 대식세포의 세포 생존력

TAMpepK와 MpepK는 상기 결과와 같이 M2 대식세포의 세포사멸을 유도하였다. TAMpepK 및 MpepK가 TCM에 의해 분화된 M2 대식세포의 세포 생존력을 감소시키는지 여부를 조사하기 위해 THP-1 유래 대식세포를 TAMpepK 및 MpepK(1 μM)로 처리하였다. TAMpepK 및 MpepK는 M2 대식세포와 유사하게 TCM으로 처리된 대식세포에서 세포사멸을 유도하였다(도 16). 따라서, 상기 결과는 TAMpepK 및 MpepK가 TCM에 의해 유도된 대식세포 뿐만 아니라 M2 대식세포를 표적으로 한다는 것을 시사한다.

2-17. TAMpepK 및 MpepK로 처리된 M2 대식세포의 조건 배지에 의한 전립선암 세포의 증식 및 이동

TCM에 의해 유도된 M2 대식세포 및 M2-유사 TAM의 조건 배지는 전립선암 세포(PC3 세포)의 증식 및 이동을 증가시켰다. 그러나, TAMpepK 및 MpepK로 전처리된 M2 대식세포 및 M2-유사 TAM의 조건 배지는 M2 대식세포 또는 M2-유사 TAM의 그룹과 비교하여 PC3 세포의 증식(도 17a) 및 이동(도 17b 및 17c)이 현저히 감소하였다.

2-18. TAMpepK 및 MpepK로 처리된 M2 대식세포의 조건 배지에 의한 전립선암 세포의 침윤

TAMpepK 및 MpepK에 의한 전립선암 세포의 침윤을 억제하기 위해 PC3 세포를 대식세포의 조건 배지로 처리하였다. TCM에 의해 유도된 M2 대식세포 및 M2-유사 TAM의 조건 배지는 PC3 세포의 침습을 증가시켰다. 그러나, TAMpepK 및 MpepK로 전처리된 M2 대식세포 및 M2-유사 TAMs의 조건 배지는 M2 대식세포 또는 M2-유사 TAMs의 그룹과 비교하여 PC3 세포의 침윤을 유의하게 감소시켰다(도 18a 및 18b).

2-19. 전립선암 마우스 모델에서 TAMpepK 및 MpepK의 효과

전립선암 모델에서 TAMpepK와 MpepK의 항암 효과를 평가하기 위해 C57BL6J 마우스 오른쪽 옆구리에 TRAMP-C2 세포를 피하주사하고 일주일 후 3일마다 TAMpep, dKLA, TAMpepK, 및 MpepK를 복강내 주사하였다. TAMpepK 및 MpepK로 처리된 마우스는 PBS 그룹과 비교하여 유의하게 감소된 종양 부피 및 중량을 나타내었다(도 19b, 19c, 19e 및 19f). 한편, 마우스의 체중은 모든 군에서 유의한 변화가 없었다(도 19d).

2-20. 전립선암 모델의 증식 및 EMT에서 TAMpepK 및 MpepK의 효과

전립선암 모델의 종양 성장 및 EMT에서 TAMpepK 및 MpepK의 항암 효과를 조사하기 위해 종양 조직은 증식성 마커로서 PCNA의 발현을 측정하고 EMT(상피-중간엽 전이) 마커로서 E-카드헤린(cadherin), 비멘틴(vimentin), 피브로넥틴(fibronectin), TGF-β 및 MMP9의 발현을 측정하였다. PCNA의 발현은 TAMpepK 및 MpepK 그룹에서 감소되었다(도 20c 및 20d). EMT 마커에서 상피세포 마커로 알려진 E-cadherin은 TAMpepK 및 MpepK 그룹에서 증가하였고(도 20a 및 20d), 중간엽 마커로 알려진 vimentin 및 fibronectin은 TAMpepK 및 MpepK 그룹에서 감소하였다(도 20b 및 20d). 또한, EMT와 관련된 TGF-β 및 MMP9의 발현도 TAMpepK 및 MpepK 그룹에서 감소하였다(도 20d). 따라서, 상기 결과는 TAMpepK 및 MpepK가 전립선암에서 M2-유사 TAM을 표적으로 하는 종양 성장 및 전이를 억제함으로써 항암 효과를 나타냄을 시사하는 것이다.

2-21. 결장암 모델에서 TAMpepK 및 MpepK의 항암 효과

결장암 모델의 종양 성장에서 TAMpepK 및 MpepK의 항암 효과를 조사하기 위해 종양 조직의 부피 및 중량을 측정하였다. TAMpepK 및 MpepK로 처리된 마우스는 PBS 그룹과 비교하여 유의하게 감소된 종양 부피 및 중량을 나타낸 반면, 종양 중량은 MpepK에서 유의하게 변화하지 않았다(도 21a 내지 21e).

2-22. 폐 섬유증에 대한 마우스 모델에서 MpepK의 효과

MpepK가 폐 섬유증 억제에 대한 치료 효과가 있는지 여부를 조사하기 위해, 폐 섬유증의 마우스 모델을 기관내 블레오마이신 투여에 의해 제조하였다. 블레오마이신에 의해 유도된 폐 섬유증은 MpepK에 의해 감소되었다(도 22b). 또한, fosl2, 제1형 콜라겐 및 피브로넥틴 I(fibronectin 1)과 같은 섬유증과 관련된 유전자 발현은 PBS에 비해 MpepK에서 유의하게 감소하였다(도 22c).

2-23. 유방암에 대한 마우스 모델에서 TAMpepK 및 MpepK의 효과

유방암에서 TAMpepK 및 MpepK의 항암 효과를 조사하기 위해 유방암의 네 번째 유방 정위 마우스(the 4th mammary orthotopic mouse) 모델을 제조하였다. TAMpepK 및 MpepK는 PBS 그룹과 비교하여 감소된 종양 부피 및 중량을 나타내었다(도 23b 및 23d). 또한, M2 대식세포 마커로 알려진 아르기네이즈(arginase) 1의 유전자 발현은 PBS에 비해 MpepK에서 유의하게 감소하였다(도 23e). 또한, PBS 그룹에 비해 MpepK 그룹에서 폐 전이가 감소하였다(도 24a 내지 24c).

실시예 3. 재료 및 방법

3-1. 펩티드 합성

상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라 하기 펩타이드를 합성하였다:

TAMPep: 전장 멜리틴(서열번호 1);

Mpep: 첫 7개 아미노산이 제거된 전장 멜리틴(서열번호 2);

A12: Mpep의 5번째 G(글리신)가 알라닌으로 치환됨(서열번호 16);

A14: Mpep의 7번째 P(프롤린)가 알라닌으로 치환됨(서열번호 18);

A17: Mpep의 10번째 I(이소류신)가 알라닌으로 치환됨(서열번호 20);

A18: Mpep의 11번째 S(세린)이 알라닌으로 치환됨(서열번호 21);

A22: Mpep의 15번째 R(아르기닌)이 알라닌으로 치환됨(서열번호 25);

A25: Mpep의 18번째 Q(글루타민)가 알라닌으로 치환됨(서열번호 28);

A26: Mpep의 19번째 Q(글루타민)가 알라닌으로 치환됨(서열번호 29);

TAMpepK: d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys(dKLA)(서열번호 47)에 부착된 링커(GGGGS)(서열번호 36)에 부착된 전장 멜리틴 펩타이드(서열번호 1);

MpepK: d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys(dKLA)(서열번호 47)에 부착된 링커(GGGGS)(서열번호 36)에 부착된 Mpep(서열번호 2);

A12K: d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys(dKLA)(서열번호 47)에 부착된 링커(GGGGS)(서열번호 36)에 부착된 A12(서열번호 16);

A14K: d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys(dKLA)(서열번호 47)에 부착된 링커(GGGGS)(서열번호 36)에 부착된 A14(서열번호 18);

A17K: d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys(dKLA)(서열번호 47)에 부착된 링커(GGGGS)(서열번호 36)에 부착된 A17(서열번호 18);

A18K: d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys(dKLA)(서열번호 47)에 부착된 링커(GGGGS)(서열번호 36)에 부착된 A18(서열번호 21);

A22K: d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys(dKLA)(서열번호 47)에 부착된 링커(GGGGS)(서열번호 36)에 부착된 A22(서열번호 25);

A25K: d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys(dKLA)(서열번호 47)에 부착된 링커(GGGGS)(서열번호 36)에 부착된 A25(서열번호 28); 및

A26K: d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys(dKLA)(서열번호 47)에 부착된 링커(GGGGS)(서열번호 36)에 부착된 A26(서열번호 29).

3-2. 대식세포 분화

THP-1 단핵구는 100 nM phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA, Sigma)와 함께 24시간 배양한 후 RPMI 배지(Invitrogen)에서 24시간 배양하여 대식세포(M0)로 분화되었다. 대식세포는 20 ng/ml의 IFN-γ(Prospec) 및 100 ng/ml의 LPS(Sigma)와 함께 배양하여 M1 대식세포(M1)에서 극성화되었다. 대식세포 M2 극성화(M2)는 20 ng/ml의 인터루킨(IL) 4(Prospec) 및 20 ng/ml의 인터루킨 13(Prospec)과 함께 배양하여 얻었다.

3-3. 세포 생존력 테스트

극성화된 세포를 1.5 μM MpepK, A12K, A14K, A17K, A18K, A22K, A25K 또는 A26K 펩타이드로 1시간 동안 처리하고 RPMI1640 성장 배지에서 24시간 동안 추가로 배양하였다. CCK-8 분석을 사용하여 세포 생존력을 분석했다: CCK-8 시약(Enzo Life Sciences)을 각 웰에 첨가했다; 2시간 동안 배양을 계속하고 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정했다.

3-4. 시험관내 패혈증 모델, LPS 자극 M1(LPS-M1) 대식세포에서 A26K의 세포독성

THP 1 세포(1×10⁴ 세포/웰)를 24시간 동안 100nM PMA(M0)를 사용하여 대식세포로 분화시키고 IFN-γ(20 ng/ml) 및 LPS(100 ng/ml) 및 LPS-자극된 대식세포(LPS-M1)는 24시간 동안 LPS(1 μg/ml) 처리에 의해 유도되었다. 그 후, 세포를 1.5 μM의 A26K로 1시간 동안 처리하고 RPMI1640 성장 배지에서 24시간 동안 추가로 배양하였다. 세포 생존력은 CCK-8 분석을 사용하여 분석하였다. CCK-8 시약을 각 웰에 첨가하고 1.5-2시간 동안 배양했다. 흡광도는 마이크로플레이트 판독기로 450 nm에서 측정하였다.

3-5. LPS-M1 대식세포에서 A26K 처리의 효과

THP 1 세포(2×10⁵ 세포/웰)를 24시간 동안 100 nM PMA(M0)를 사용하여 대식세포로 분화시키고 IFN-γ(20 ng/ml) 및 LPS(100 ng/ml) 및 LPS를 처리하여 고전적 M1 대식세포로 극성화했다. 그리고 LPS-M1 대식세포는 2시간 동안 LPS(1 μg/ml) 처리에 의해 유도되었다. 극성화된 세포를 1.5 μM의 A26K로 1시간 동안 처리하고 RPMI1640 성장 배지에서 24시간 동안 추가로 배양하였다. 실시간 정량적 PCR을 통해 염증유발 유전자(IL-8, TNF-α, NF-kB, IL-1β 및 CXCL10)의 발현 수준을 정량화했다.

3-6. 시험관 내 폐 섬유증 모델-세포

THP-1 세포는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입하고 열처리되지 않은 10% 우태아혈청(FBS; WelGENE), 2 mM L-글루타민, 0.05 mM β-메르캅토에탄올, 10 mM HEPES, 4500 mg/L 포도당, 100U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(Gibco)이 첨가된 RPMI 1640 배지를 사용하여 특정 적응증에 따라 배양했다. American Type Culture Collection(ATCC)에서 입수한 인간 폐포 세포 A549 세포를 2.05 mM L-글루타민, 2 g/L 중탄산나트륨 및 2 g/L 포도당(WelGENE)을 10%와 함께 FBS(WelGENE), 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(Gibco)을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 상기 세포는 80% 융합(confluence)에 도달하도록 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 37℃에서 배양되었다

3-7. 시험관 내 폐 섬유증 모델 - 대식세포 분화

THP-1 세포는 100 nM phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA, Sigma)와 함께 24시간 배양한 후 RPMI 배지(Invtrogen)에서 24시간 배양하여 대식세포로 분화된다. 대식세포 M2 극성화(M2)는 20 ng/ml의 인터루킨(IL)-4(Prospec) 및 20 ng/ml의 인터루킨 13(Prospec)과 함께 배양하여 얻었다.

3-8. 시험관 내 폐 섬유증 모델 - 배양된 세포의 처리 및 공배양

THP-1 및 A549 세포의 비접촉 공배양 시스템은 6-포어 플레이트(Corning 3450; Corning, Inc., Corning, NY, USA)와 결합된 폴리에틸렌 테레프탈레이트 필름(polyethylene terephthalate film)이 있는 트랜스웰(Transwell) 현탁액 배양 챔버를 사용하여 제조하였다. 6-웰 플레이트에서 1 x 10⁵ cells/ml의 파종 밀도를 갖는 A549 세포를 TGF-β1(5 ng/ml)을 포함하는 배지에서 48시간 동안 배양하여 시험관내 EMT 또는 FMT를 유도하였다. MpepK , A17K 또는 A22K를 동시에 사용하여 처리된 세포에 대한 개입 효과를 관찰했다. 1×10⁵ cells/ml의 밀도로 파종된 THP-1 세포를 20 ng/ml의 IL-4 및 20 ng/ml의 IL-13에 48시간 동안 노출시켜 M2-를 유도하였다. 일부 세포는 또한 1.5 μM MpepK, A17K 및 A22K로 처리되었다. M2-유사 대식세포와의 공배양을 확립하기 위해 IL-4 및 IL-13 전처리된 대식세포를 포함하는 세포 배양 삽입물을 24시간 배양을 위해 A549 세포(5×10⁴ cells/ml)가 파종된 플레이트로 이송하였다. 8시간의 공배양 후, 플레이트 바닥의 세포를 추가 실험을 위해 수확했다.

3-9. 시험관 내 폐 섬유증 모델 - 실시간 정량적 PCR

Easy-Blue 시약을 사용하여 총 RNA를 추출했다. RNA의 농도는 분광광도계로 260 및 280 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하고 정량화했다. Maxime RT PreMix 키트(iNtRON)를 사용하여 전체 RNA에서 상보적 DNA(cDNA)를 합성했다. Real-time PCR 분석은 SYBR Green Master Mix로 수행되었다. PCR 조건은 95℃에서 5분, 95℃에서 10초, 60℃에서 10초, 72℃에서 10초 순으로 45회 반복하였다. mRNA 발현을 3회 반복하여 정량화하였다. 데이터는 CFX 소프트웨어(Bio-Rad)로 측정되었고 GAPDH는 내부 대조군으로 사용되었다.

3-10. 간세포 암종 마우스 모델에서 MpepK의 항암 효과

C57BL/6(B6) 야생형 마우스는 DBL에서 구입하였다. 간세포 암종의 피하 종양 모델의 경우, Hepa1-6 세포를 매트리겔 매트릭스(Corning)와 혼합하고 마우스의 우측 옆구리(4×10⁵ 세포/마우스)에 피하 접종하였다. MpepK 펩타이드(100, 200 및 400 nmol/kg)는 종양 접종 후 12일째부터 시작하여 3일마다 복강 내 주사하고 전자 캘리퍼스로 종양 부피를 측정했다. 모든 동물은 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 12시간 명암 주기로 특정 병원체 없는 환경에서 유지되었다. 실험이 종료된 후 모든 마우스를 이소플루란과 경추 탈구를 사용하여 안락사시켰다.

실시예 4. 결과

4-1. M2-형, M1-형 및/또는 M0형 대식세포에 대해 선택적인 폴리펩타이드의 세포독성

알라닌 치환된 Mpep 중 일부 펩타이드는 M2 대식세포에 비해 M1 대식세포에서 상대적으로 증가된 친화도 또는 M1 또는 M2 대식세포에 비해 M0 대식세포에서 상대적으로 증가된 친화도를 보였다(도 7a). 상기 증가된 친화도가 M0 또는 M1 또는 M2 대식세포에서 선택적 세포독성에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해 1.5 μM의 MpepK, A12K, A14K, A17K, A18K, A22K, A25K 또는 A26K 펩타이드를 M0, M1 및 M2 대식세포에서 처리하고 CCK-8 분석을 사용하여 세포 생존력을 측정했다. 그 결과, A26K 펩타이드는 대조군 M1 대식세포와 비교하여 M1 대식세포에서만 매우 유의한 선택적 세포독성 효과를 나타내었으며(^*** p < 0.001, 대조군 M1 대식세포와 비교) A12K, A14K 및 A18K 펩타이드는 M0, M1 및 M2 대식세포에서 선택적 세포독성을 나타내지 않았다(도 25a). A17K, A22K 및 A25K는 M2 대식세포(^* p < 0.05, 대조군 M2 대식세포와 비교)에서 MpepK와 유사한 유의한 세포독성 효과를 나타내었지만, M0 및 M1 대식세포에서는 그렇지 않았다(도 25b). M0, M1 및 M2 대식세포를 A26K의 농도를 증가시키면서 처리한 경우(0.01 내지 10 μM), A26K 펩타이드는 M1 대식세포에서 IC₅₀에서 1.192 μM을 나타내었다(도 25c).

4-2. 시험관내 패혈증 모델, LPS 자극 M1(LPS-M1) 대식세포에서 A26K의 세포독성 및 효과

패혈증(Sepsis)은 미생물 병원체의 감염에 대한 전신 염증 반응이다. LPS는 그람-음성 박테리아의 외막의 일부이며 생체 내 및 시험관 내 단핵구 및 대식세포에서 다중 염증 반응을 유도한다. 따라서 LPS가 매개하는 염증반응은 그람 음성균 감염 노출로 인한 주요 염증원이며 패혈증과 밀접한 관련이 있다. 본 발명자들은 LPS-M1 대식세포에서 A26K의 세포독성을 조사하기 위해 M0, M1 및 LPS-M1 대식세포에 1.5 μM의 A26K를 처리하였다. 그 결과, A26K는 LPS-M1 대식세포(대조군과 비교하여 37% 억제, ^* p < 0.05) 및 M1 대식세포(대조군과 비교하여 53% 억제, ^* p < 0.05)에서 유의한 세포독성 효과를 나타냈다(도 26a). 전-염증성 유전자의 발현 수준을 더 조사하기 위해 M0, M1 및 LPS-M1 대식세포를 1.5 μM의 A26K로 1시간 동안 처리했다. LPS(1 μg/ml) 자극은 M0 대식세포와 비교하여 IL8, TNFα, IL-1β, NF-kB 및 CXCL10의 발현을 유의하게 증가시켰다(^* p < 0.05 또는 ^** p < 0.01 또는 ^*** p < 0.001, M0 대식세포와 비교, 도 26b).

그러나 A26K 처리는 LPS 자극에 의한 IL8, TNF α, IL-1β, NF-kB 및 CXCL10의 발현 수준 증가를 유의하게 억제하였다(LPS-M1 대식세포와 비교, ^* p < 0.05 또는 ^** p < 0.01 또는 ^*** p < 0.001, M0 대식세포와 비교, 도 26b). 상기 결과는 A26K 처리가 LPS에 의해 유도된 시험관내 패혈증 모델인 M1 대식세포의 활성화를 유의하게 억제함을 말해준다. 따라서 A26K 처리는 M1 대식세포를 억제하여 초기 과잉 염증 반응을 조절할 수 있으며 패혈증의 중요하고 효과적인 치료제가 될 것이다.

4-3. 시험관 내 폐 섬유증 모델에서 A17K 또는 A22K의 효과, IL-4 및 IL-13 유도 THP-1 대식세포와 공배양된 TGF-β1 유도 A549 세포

A17K 또는 A22K 처리가 상피-중간엽 전이(EMT) 및 섬유아세포에서 근섬유아세포로의 전이(FMT) 반응에 미치는 영향을 조사하기 위해 본 발명자들은 A549 세포에서 TGF-β1 유도된 중간엽 특성 또는 섬유성 마커 획득의 존재하에 A549(인간 폐포 유형 II 폐 상피의 모델로 일반적으로 사용됨)를 배양했다. 형태학적 변화는 위상차 현미경(200x 배율로 표시)을 사용하여 이미지화되었다. 본 발명자들은 인간 폐포 상피 유형 II 세포(human alveolar epithelial type II cell)에서 가장 알려진 세포주인 A549 세포에서 TGF-β1을 48시간 동안 처리하여 EMT를 유도했다. 세포 공배양 시스템을 사용하여 TGF-β1 유도 A549 세포를 IL-4 및 IL-13 유도 THP-1 대식세포와 공배양하였다. A549에서 타원형 상피세포에서 방추형 섬유아세포로의 형태적 변화가 명확하게 감지되었다. A17K 또는 A22K 개입은 IL-4 및 IL-13 유도 대식세포와 공동 배양함으로써 자극된 A549 세포에서 EMT의 방추형 중간엽 형태 표현형을 현저하게 차단하였다(도 27a). A17K 또는 A22K 처리는 M2 대식세포 단독 투여에 비해 A549 세포에서 E-cadherin, EMT 억제 마커의 발현을 유의하게 증가시켰고, FMT 강화 마커인 α-SMA의 발현을 감소시켰다( ^* p < 0.05 또는 ^** p < 0.01 또는 ^*** p < 0.001, M2 대식세포와 비교). 그러나, THP-1의 M2 극성화와 공배양시 상기 상피 세포의 EMT 및 FMT에 대한 MpepK의 현저한 억제 효과는 관찰되지 않았다(도 27a 및 27b). 상기 한 결과는 A17K 또는 A22K가 MpepK보다 폐 섬유증의 더 나은 억제를 나타내고 폐 섬유증에 대한 더 큰 치료제가 될 것임을 시사하는 것이다.

4-4. 간세포 암종 마우스 모델에서 MpepK의 항암 효과

생체 내에서 MpepK의 항암 효과를 평가하기 위해 마우스 hepa1-6 세포를 C57BL/6J 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사했다. 세포 접종 12일 후, MpepK를 3일마다 복강내 주사하였다(도 28a). 그 결과, 체중 변화에 있어 실험군 간에 유의한 차이가 없었다(도 28b). 반면에 모든 농도(100, 200 및 400 nmol/kg)의 MpepK를 처리한 마우스는 PBS 그룹과 비교하여 유의하게 감소된 종양 부피를 보였고, 생존율은 PBS 그룹과 비교하여 MpepK 그룹(100, 200 및 400 nmol/kg)에서 유의하게 연장되었다(^* p < 0.05 또는 ^** p < 0.01 또는 ^*** p < 0.001, PBS 그룹과 비교, 도 28c 및 28d).

특정 실시예에 대한 전술한 설명은 다른 사람들이 본 기술 분야의 기술 내에서 지식을 적용함으로써 본 개시의 일반적인 개념을 벗어나지 않고 다양한 애플리케이션에 대해 쉽게 수정 및/또는 적응할 수 있도록 본 개시의 일반적인 특성을 완전히 드러낼 것이다. 따라서, 이러한 적응 및 수정은 여기에 제시된 교시 및 지침에 기초하여 개시된 실시예의 등가물의 의미 및 범위 내에 있도록 의도된다.

본 명세서의 어구 또는 용어는 설명의 목적을 위한 것이지 제한이 아니라, 본 명세서의 용어 또는 어구가 교시 및 지침에 비추어 당업자에 의해 해석되어야 함을 이해해야 한다. 본 개시내용의 폭 및 범위는 전술한 예시적인 실시예 중 어느 것에 의해 제한되어서는 안 되며, 다음의 청구범위 및 그 균등물에 따라서만 정의되어야 한다.

본 명세서에 기술된 모든 다양한 양태, 실시예 및 옵션은 임의의 모든 변형으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 여기에 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 동일한 정도로 참조로 여기에 포함됩니다.

SEQUENCE LISTING <110> Twinpig Biolab, Inc. <120> PEPTIDES TARGETING MACROPHAGES, AND CONJUGATES, COMPOSITIONS, AND USES THEREOF <130> PI22-5130 <150> 63/185,503 <151> 2021-05-07 <160> 55 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MEL <400> 1 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln 20 25 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MEL826 or Mpep <400> 2 Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys 1 5 10 15 Arg Gln Gln <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mpep <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X is an amino acid other than valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is an amino acid other than leucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X is an amino acid other than threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X is an amino acid other than proline <220> 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Lys Arg Ala 1 5 10 15 Arg Gln Gln <210> 27 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mpep <400> 27 Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys 1 5 10 15 Ala Gln Gln <210> 28 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mpep <400> 28 Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys 1 5 10 15 Arg Ala Gln <210> 29 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mpep <400> 29 Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys 1 5 10 15 Arg Gln Ala <210> 30 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mpep <400> 30 Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys 1 5 10 15 Arg Gln Ala <210> 31 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mpep <400> 31 Val Leu Ala Ala Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys 1 5 10 15 Arg Gln Gln <210> 32 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mpep <400> 32 Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ala Trp Ile Lys Arg Lys 1 5 10 15 Arg Gln Gln <210> 33 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mpep <400> 33 Val Leu Thr Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys 1 5 10 15 Arg Gln Gln <210> 34 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mpep <400> 34 Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys 1 5 10 15 Arg Ala Ala <210> 35 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mpep <400> 35 Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Ala Ala 1 5 10 15 Ala Gln Ala <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 36 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 37 Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 38 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 38 Leu Glu Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Pro Arg Ser Phe Thr Ser Cys 1 5 10 15 Gly Ser Leu Glu 20 <210> 39 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 39 Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Glu Ala Glu Ala Cys 1 5 10 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 40 Arg Leu Arg Trp Arg 1 5 <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 41 Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu Lys 1 5 10 15 Pro <210> 42 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 42 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 43 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 43 Arg Tyr Ile Arg Ser 1 5 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 44 Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X is 1-4 arginines <400> 45 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Xaa 1 5 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 46 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Phe Phe Cys 1 5 10 <210> 47 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 47 Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys 1 5 10 <210> 48 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Scrambled peptide <400> 48 Leu Ser Arg Gln Arg Ala Leu Gln Ile Lys Gly Leu Ile Lys Thr Pro 1 5 10 15 Trp Lys Ile Ala Gly Val Leu Gly Val Thr 20 25 <210> 49 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAMpep114 <400> 49 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro 1 5 10 <210> 50 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAMpep120 <400> 50 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Ile Ser Trp Ile 20 <210> 51 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAMpep820 <400> 51 Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile 1 5 10 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAMpep822 <400> 52 Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg 1 5 10 15 <210> 53 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAMpep1026 <400> 53 Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln 1 5 10 15 Gln <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAMpep1226 <400> 54 Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln 1 5 10 15 <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAMpep1526 <400> 55 Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln 1 5 10

Claims (34)

1. 하기 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드: X₁-X₂-Thr-X₄-Gly-Leu-X₇-Ala-Leu-Ile-X₁₁-Trp-Ile-X₁₄-Arg-Lys-Arg-X₁₈-X₁₉(서열번호 3)(상기 서열에서, X₁은 발린을 제외한 아미노산, X₂는 류신을 제외한 아미노산, X₄는 트레오닌을 제외한 아미노산, X₇은 프롤린을 제외한 아미노산, X₁₁은 세린을 제외한 아미노산, X₁₄는 라이신을 제외한 아미노산, X₁₈은 글루타민을 제외한 아미노산, 및/또는 X₁₉는 글루타민을 제외한 아미노산이다).
2. 제1항에 있어서,
   상기 X₁이 알라닌(서열번호 4)인, 폴리펩타이드.
3. 제1항에 있어서,
   상기 X₂가 알라닌(서열번호 5)인, 폴리펩타이드.
4. 제1항에 있어서,
   상기 X₄가 알라닌(서열번호 6)인, 폴리펩타이드.
5. 제1항에 있어서,
   상기 X₇이 알라닌(서열번호 7)인, 폴리펩타이드.
6. 제1항에 있어서,
   상기 X₁₁이 알라닌(서열번호 8)인, 폴리펩타이드.
7. 제1항에 있어서,
   상기 X₁₄가 알라닌(서열번호 9)인, 폴리펩타이드.
8. 제1항에 있어서,
   상기 X₁₈이 알라닌(서열번호 10)인, 폴리펩타이드.
9. 제1항에 있어서,
   상기 X₁₉가 알라닌(서열번호 11)인, 폴리펩타이드.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 및 제2 치료제를 포함하는 컨쥬게이트.
11. 제10항에 있어서,
    상기 제2 치료제는 KLA, 알파-디펜신-1(alpha-defensin-1), BMAP-28, 브레베닌-2R(brevenin-2R), 부포린 IIb(buforin IIb), 세크로핀 A-마게이닌 2(CA-MA-2), 세크로핀 A(cecropin A), 세크로핀 B(cecropin B), 크리소프신-1(chrysophsin-1), D-K6L9, 고메신(gomesin), 락토페리신 B(lactoferricin ), LL27, LTX-315, 마가이닌 2(magainin 2), 마가이닌 II 봄베신 컨쥬게이트(MG2B), 파르닥신(pardaxin), 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 엔티노스타트(entinostat), 클라드리빈(cladribine), 프랄라트렉세이트(pralatrexate), 로라티닙(lorlatinib), 메이탄신 DM1(maytansine DM1), 메이탄신 DM3(maytansine DM3), 메이탄신 DM4(maytansine DM4) 또는 이들의 조합인, 컨쥬게이트.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 폴리펩티드를 제2 치료제에 연결하는 링커를 추가로 포함하는, 컨쥬게이트.
13. 제12항에 있어서,
    상기 링커의 양 말단은 카르보디이미드(carbodiimide), N-hydroxysuccinimide ester(NHS ester), 이미도에스테르(imidoester), 펜타플루오로페닐 에스테르(pentafluoropheny ester), 히드록시메틸 포스핀(hydroxymethyl phosphine), 말레이미드(maleimide), 할로아세틸(haloacetyl), 피리딜디설파이드(pyridyldisulfide), 티오술포네이트(thiosulfonate), 비닐술폰(vinylsulfone), EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide), DCC(N,N'-dicyclohexyl-carbodiimide), SATA(succinimidyl acetylthioacetate), sulfo-SMCC(sulfosuccinimidyl-4-(NDmaleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate), DMA(dimethyl adipimidate·2HCl), DMP(dimethylpimelimidate·2HCl), DMS(dimethyl Suberimidate·2HCl), DTBP(dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate·2HCl), sulfo-SIAB(sulfosuccinimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoate), SIAB (succinimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoate), SBAP(succinimidyl-3-(bromoacet-amido) propionate), SIA(succinimidyl iodoacetate), SM(PEG)_n(succinimidyl-([N-maleimidopropionamido]-ethyleneglycol ester, wherein n=2, 4, 6, 8, 12 or 24), SMCC(succinimidyl-4-(N-D-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), LCSMCC (succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxy-(6-amido-caproate)), sulfo-EMCS(N-εester), EMCS(N-εsulfo-GMBS(N-γester), GMBS(N-γ ester), sulfo-KMUS(N-κester), sulfo-MBS(mmaleimidobenzoyl-N-hydroxysulfo-succinimide ester), MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), sulfo-SMPB(sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate), SMPB(succin-imidyl-4-(pmaleimidophenyl)butyrate), AMAS(N-α-maleimido-acetoxysuccinimide ester), BMPS(N-β-maleimidopropyloxysuccinimide ester), SMPH(succinimidyl 6-[(β-maleimidopropionamido)hexanoate]), PEG12-SPDP(2-pyridyldithioltetra-oxaocta-triacontane-N-hydroxysuccinimide), PEG4-SPDP, sulfo-LCSPDP(sulfo-succinimidyl 6-[3'-(2-pyridyldithio)propionamido] hexan-oate), SPDP(succin-imidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate), LC-SPDP(succinimidyl-6-[3'-(2-pyridyl-dithio) propionamido]hexanoate), SMPT(4-succini-midyloxy-carbonyl-alpha-methylalpha (2-pyridyldithio)toluene), DSS(di-succin-imidyl suberate), BS(PEG)₅ (bis (succinimidyl)penta(ethylene glycol)), BS(PEG)₉(bis(succinimidyl)nona (ethyleneglycol)), BS3(bis[sulfo-succin-imidyl] suberate), BSOCOES(bis[2-(succinimidooxycarbonyloxy) ethyl] sulfone), PDPH(3-(2-pyridyldi-thio)propionyl hydrazide), DSG(disuccinimidyl glutarate), DSP(dithio-bis[succinimidyl propionate]), BM(PEG)n(1,8-bismaleimido-ethylene-glycol, n = 2 or 3), BMB(1,4-bismaleimidobutane), BMDB (1,4-bismaleimidyl-2,3-dihydro-xybutane), BMH(bis-maleimidohexane), BMOE(bis-maleimidoethane), DTME(dithio-bismaleimidoethane), TMEA(tris(2-maleimido-ethyl)amine), DSS(di-succinimidyl suberate), DST(di-succinimidyl tartarate), DTSSP(3,3'-dithiobis[sulfo-succinimidylpropionate]), EGS(ethylene glycol bis [succin-imidyl-succinate]), sulfo-EGS(ethylene glycol bis[sulfosuccin-imidyl-succinate]), TSAT(tris-succinimidyl aminotriacetate), DFDNB(1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene) 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 컨쥬게이트.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 컨쥬게이트 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
15. 제14항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드는 0.05 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml의 농도인 것을 특징으로 하는, 조성물.
16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 조성물은 피하 또는 정맥내 투여에 적합한 제형인 것을 특징으로 하는 조성물.
17. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 조성물은 동결건조 또는 캡슐화된 형태인, 조성물.
18. 제1항, 제2항, 제3항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 M2형 대식세포를 감소시키거나 M2-형 대식세포 매개 질환을 치료하는 방법.
19. 제18항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 비교하여 M₂-형 대식세포를 감소시키는, 방법.
20. 제18항에 있어서,
    상기 질환은 암인, 방법.
21. 제20항에 있어서,
    상기 암은 흑색종, 전립선암, 폐암, 유방암, 결장암, 췌장암, 또는 암 미세환경에서 M₂-형 종양 관련 대식세포를 갖는 기타 고형 종양인, 방법.
22. 제18항에 있어서,
    상기 질환은 섬유증 관련 질환, 말기 간 질환, 신장 질환, 특발성 폐 섬유증(IPF), 심부전, 경피증, 류마티스 관절염, 크론병, 궤양성 대장염, 골수 섬유증, 전신 홍반 루푸스를 포함하는 자가면역질환, 종양 침습 및 전이, 만성 이식 거부, 진행성 근병증의 발병기전, 간경변 및 섬유증, 양성 전립선 비대증 또는 전립선염인, 방법.
23. 개체에게 제1항, 제2항, 제5항, 제6항 및 제9항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체에서 M1-형 대식세포를 감소시키거나 M1형 대식세포 매개 질환을 치료하는 방법.
24. 제23항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 비해 M1-형 대식세포를 감소시키는, 방법.
25. 제23항에 있어서,
    상기 질환은 패혈성 쇼크, 다발성 장기 기능 장애 증후군(MODS), 아토피 피부염, 류마티스 관절염 또는 자가면역 질환을 포함하는 만성 염증성 질환인 방법.
26. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체에서 M0-형 대식세포를 감소시키거나 M0-형 대식세포 매개 질환을 치료하는 방법.
27. 제26항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 비해 M₀-형 대식세포를 감소시키는 방법.
28. 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드가 제2 치료제에 연결된, 방법.
29. 제28항에 있어서,
    상기 제2 치료제는 KLA, 알파-디펜신-1(alpha-defensin-1), BMAP-28, 브레베닌-2R(brevenin-2R), 부포린 IIb(buforin IIb), 세크로핀 A-마게이닌 2(CA-MA-2), 세크로핀 A(cecropin A), 세크로핀 B(cecropin B), 크리소프신-1(chrysophsin-1), D-K6L9, 고메신(gomesin), 락토페리신 B(lactoferricin ), LL27, LTX-315, 마가이닌 2(magainin 2), 마가이닌 II 봄베신 컨쥬게이트(MG2B), 파르닥신(pardaxin), 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 엔티노스타트(entinostat), 클라드리빈(cladribine), 프랄라트렉세이트(pralatrexate), 로라티닙(lorlatinib), 메이탄신 DM1(maytansine DM1), 메이탄신 DM3(maytansine DM3), 메이탄신 DM4(maytansine DM4) 또는 이들의 조합인, 방법.
30. 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 링커에 의해 제2 치료제에 연결되는 방법.
31. 제30항에 있어서,
    상기 링커는 양 말단에 카르보디이미드(carbodiimide), N-히드록시숙시니미드 에스테르(N-hydroxysuccinimide ester, NHS ester), 이미도에스테르(imidoester), 펜타플루오로페닐 에스테르(pentafluoropheny ester), 히드록시메틸 포스핀(hydroxymethyl phosphine), 말레이미드(maleimide), 할로아세틸(haloacetyl), 피리딜디설파이드(pyridyldisulfide), 티오술포네이트(thio-sulfonate), 비닐술폰(vinylsulfone), EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl) carbodiimide), DCC(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide), SATA(succinimidyl-acetyl-thioacetate), sulfo-SMCC(sulfo-succinimidyl-4-(N-D-maleimidomethyl) cyclo-hexane-1-carboxylate), DMA(dimethyl adipimidate·2HCl), DMP(dimethyl-pimelimidate·2HCl), DMS(dimethyl suber-imidate·2HCl), DTBP(di-methyl-3,3'-dithiobispropionimidate·2HCl), sulfo-SIAB(sulfosuccinimidyl(4-iodoacetyl) aminobenzoate), SIAB(succinimidyl(4-iodoacetyl) aminobenzoate), SBAP(succin-imidyl-3-(bromoacetamido)propionate), SIA(succinimidyliodoacetate), SM(PEG)_n (succinimidyl-([N-maleimidopropion-amido]-ethyleneglycol ester, wherein n=2, 4, 6, 8, 12 or 24), SMCC(succinimidyl-4-(N-D-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), LCSMCC(succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxy-(6-amidocaproate)), sulfo-EMCS(N-ε-ester), EMCS(N-εsulfo-GMBS(N-γester), GMBS(N-γ-ester), sulfo-KMUS(N-κ-ester), sulfo-MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester), MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), sulfo-SMPB(sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate), SMPB (succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate), AMAS(N-α-maleimido-acetoxy-succinimide ester), BMPS(N-β-maleimidopropyloxysuccinimide ester), SMPH (succinimidyl 6-[(β-maleimidopropionamido)hexanoate]), PEG12-SPDP(2-pyridyl-dithiol-tetraoxaocta-triacontane-N-hydroxysuccinimide), PEG4-SPDP, sulfo-LCSPDP(sulfosuccinimidyl 6-[3'-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoate), SPDP (succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate), LC-SPDP(succinimidyl-6-[3'-(2-pyridyldithio)propionamido] hexanoate), SMPT(4-succinimidyloxycarbonyl-alpha-methylalpha(2-pyridyldithio)toluene), DSS(disuccinimidyl suberate), BS(PEG)₅ (bis(succinimidyl) penta(ethylene glycol)), BS(PEG)₉(bis(succin-imidyl)nona (ethylene glycol)), BS3(bis[sulfosuccinimidyl] suberate), BSOCOES(bis[2-(succinimidooxycarbonyloxy)ethyl] sulfone), PDPH(3-(2-pyridyl-dithio) propionyl hydrazide), DSG(disuccinimidyl glutarate), DSP(dithio-bis[succin-imidyl propionate]), BM(PEG)_n(1,8-bismaleimido-ethyleneglycol, n=2 or 3), BMB(1,4-bismaleimidobutane), BMDB(1,4-bismaleimidyl-2,3-dihydroxy-butane), BMH(bismaleimidohexane), BMOE(bismaleimidoethane), DTME(dithiobis-maleimido-ethane), TMEA(tris(2-maleimidoethyl) amine), DSS(disuccinimidyl suberate), DST(disuccinimidyl tartarate), DTSSP(3,3'-dithiobis[sulfo-succin-imidyl-propionate]), EGS(ethylene glycol bis[succinimidylsuccinate]), sulfo-EGS (ethylene glycol bis[sulfosuccinimidyl-succinate]), TSAT(tris-succin-imidyl aminotriacetate), DFDNB(1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 작용기를 포함하는, 방법.
32. 제18항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드의 농도는 0.05 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml의 농도인, 방법.
33. 제18항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드가 피하로 또는 정맥내로 투여되는 것인, 방법.
34. 제20항에 있어서,
    상기 암은 간세포암인, 방법.

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