CN115996942A - 靶向巨噬细胞的肽及其缀合物、组合物和用途 - Google Patents

Abstract

本申请涉及靶向巨噬细胞的多肽以及其缀合物、组合物和用途。所述多肽对M2型、M1型和/或M0型巨噬细胞，例如肿瘤相关巨噬细胞具有选择性。此外，所述多肽和/或缀合物减少M2型、M1型和/或M0型巨噬细胞，并且治疗M2型、M1型和/或M0型巨噬细胞介导的疾病。

Description

靶向巨噬细胞的肽及其缀合物、组合物和用途

相关申请的交叉引用

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发明领域

本文涉及靶向巨噬细胞的多肽及其缀合物、组合物和用途。所述多肽对M2-型、M1-型和/或M0-型巨噬细胞具有选择性。

发明背景

巨噬细胞是在几乎所有组织中发现的重要的先天免疫细胞，并且源自骨髓并在血液中循环，且通过外渗在组织中分化。这些巨噬细胞被分类为三种表型：M0巨噬细胞、肿瘤抑制性M1巨噬细胞和肿瘤支持性M2巨噬细胞。

M0巨噬细胞为从人外周单核细胞分化的失活的巨噬细胞。

M1巨噬细胞具有强的呈递抗原的能力，并且通常被干扰素-γ、脂多糖(LPS)和肿瘤坏死因子(TNF)-α激活，且具有促炎性和杀菌效果。

已知M2巨噬细胞通过释放各种胞外基质成分、血管生成和趋化因子来促进免疫抑制、肿瘤发生和血管生成。通常，M2巨噬细胞由IL-4和IL-13诱导，并且区别于M1巨噬细胞，其中M2巨噬细胞表达独特的M2标记物，例如精氨酸酶-1、甘露糖(MMR，CD206)和清道夫受体(SR-A，CD204)。

蜂毒肽是蜜蜂(意大利蜜蜂(Apis mellifera L.))蜂毒的主要成分，并且为具有26个氨基酸残基的两亲性肽。蜂毒肽具有膜扰乱性作用，例如孔形成、融合和囊泡形成。蜂毒肽由于其对肿瘤细胞的细胞毒性和其抑制细胞生长或诱导细胞死亡和坏死的能力而被用于荷瘤大鼠研究(Russell,Cancer Immunol Immunother.2004；53:411-421)。

此外，使用蜂毒肽的常规技术涉及包含蜂毒肽的用于治疗动脉硬化的组合物(KR申请公开号10-2011-0117789)、包含蜂毒肽的抑制成纤维细胞样滑膜细胞活性的组合物(KR申请公开号10-2011-0117788)等。已经鉴定了使用蜂毒肽选择性杀伤M2-型巨噬细胞的药物组合物(KR申请公开号10-2019-0021765)。KR申请公开号10-2019-0053334中描述了包含与抗癌药物缀合的蜂毒肽的组合物。

发明概述

本文公开了包含氨基酸序列X1-X2-Thr-X4-Gly-Leu-X7-Ala-Leu-Ile-X11-Trp-Ile-X14-Arg-Lys-Arg-X18-X19(SEQ ID NO:3)的多肽，其中X1是除缬氨酸以外的氨基酸，X2是除亮氨酸以外的氨基酸，X4是除苏氨酸以外的氨基酸，X7是除脯氨酸以外的氨基酸，X11是除丝氨酸以外的氨基酸，X14是除赖氨酸以外的氨基酸，X18是除谷氨酰胺以外的氨基酸，和/或X19是除谷氨酰胺以外的氨基酸。在一些实施方案中，X1是丙氨酸(SEQ ID NO:4)，X2是丙氨酸(SEQ ID NO:5)，X4是丙氨酸(SEQ ID NO:6)，X7是丙氨酸(SEQ ID NO:7)，X11是丙氨酸(SEQ ID NO:8)，X14是丙氨酸(SEQ ID NO:9)，X18是丙氨酸(SEQ ID NO:10)，X19是丙氨酸(SEQ ID NO:11)，或其任意组合。

本文还公开了包含SEQ ID NO:12-35中任一个的氨基酸序列的多肽。本文还公开了包含SEQ ID NO:49-55中任一个的氨基酸序列的多肽。

本文还公开了包含本文公开的多肽和第二种治疗药物的缀合物。在一些实施方案中，所述第二种治疗药物为KLA、α-防御素-1、BMAP-28、brevenin-2R、buforin IIb、天蚕素A-爪蟾抗菌肽2(CA-MA-2)、天蚕素A、天蚕素B、chrysophsin-1、D-K6L9、gomesin、乳铁蛋白肽B、LL27、LTX-315、爪蟾抗菌肽2、爪蟾抗菌肽II铃蟾肽缀合物(MG2B)、pardaxin、多柔比星、甲氨蝶呤、恩替司他、克拉屈滨、普拉曲沙、劳拉替尼、美坦辛DM1、美坦辛DM3、美坦辛DM4，或其组合。

所述缀合物可进一步包含将多肽与第二种治疗药物连接的接头(linker)。在一些实施方案中，接头的一端或两端包含选自以下的官能团：碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)、亚氨酸酯、五氟苯基酯、羟甲基膦、马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、硫代磺酸酯、乙烯基砜、EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)、DCC(N,N'-二环己基碳二亚胺)、SATA(琥珀酰亚胺基乙酰基硫代乙酸酯)、磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯)、DMA(己二亚氨酸二甲酯·2HCl)、DMP(庚二亚氨酸二甲酯·2HCl)、DMS(辛二亚氨酸二甲酯·2HCl)、DTBP(3,3’-二硫代双丙酰亚氨酸二甲酯·2HCl)、磺基-SIAB((4-碘乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺基酯)、SIAB((4-碘乙酰基)氨基苯甲酸琥珀酰亚胺基酯)、SBAP(3-(溴乙酰氨基)丙酸琥珀酰亚胺基酯)、SIA(碘乙酸琥珀酰亚胺基酯)、SM(PEG)n(琥珀酰亚胺基-([N-马来酰亚胺基丙酰氨基]-乙二醇酯，其中n＝2、4、6、8、12或24)、SMCC(琥珀酰亚胺基-4-(N-D-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯)、LCSMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰氨基己酸琥珀酰亚胺基酯))、磺基-EMCS(N-ε酯)、EMCS(N-ε磺基-GMBS(N-γ酯)、GMBS(N-γ酯)、磺基-KMUS(N-κ酯)、磺基-MBS(间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N羟基磺基琥珀酰亚胺酯)、MBS(间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N羟基琥珀酰亚胺酯)、磺基-SMPB(4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺基酯)、SMPB(4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺基酯)、AMAS(N-α-马来酰亚胺基-乙酰氧基琥珀酰亚胺酯)、BMPS(N-β-马来酰亚胺基丙氧基琥珀酰亚胺酯)、SMPH(6-[(β-马来酰亚胺基丙酰氨基)己酸琥珀酰亚胺基酯])、PEG12-SPDP(2-吡啶基二硫基-四氧杂十八烷-N-羟基琥珀酰亚胺)、PEG4-SPDP、磺基-LCSPDP(6-[3’-(2-吡啶基二硫基)丙酰氨基]己酸磺基琥珀酰亚胺基酯)、SPDP(3-(2-吡啶基二硫基)丙酸琥珀酰亚胺基酯)、LC-SPDP(6-[3’-(2-吡啶基二硫基)丙酰氨基]己酸琥珀酰亚胺基酯)、SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基α(2-吡啶基二硫基)甲苯)、DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、BS(PEG)5(双(琥珀酰亚胺基)五(乙二醇))、BS(PEG)9(双(琥珀酰亚胺基)九(乙二醇))、BS3(辛二酸双[磺基琥珀酰亚胺基]酯)、BSOCOES(双[2-(琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基)乙基]砜)、PDPH(3-(2-吡啶基二硫基)丙酰肼)、DSG(戊二酸二琥珀酰亚胺酯)、DSP(二硫基双[丙酸琥珀酰亚胺基酯])、BM(PEG)n(1,8-二马来酰亚胺基-乙二醇，n＝2或3)、BMB(1,4-二马来酰亚胺基丁烷)、BMDB(1,4-二马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷)、BMH(二马来酰亚胺基己烷)、BMOE(二马来酰亚胺基乙烷)、DTME(二硫基双马来酰亚胺基乙烷)、TMEA(三(2-马来酰亚胺基乙基)胺)、DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、DST(酒石酸二琥珀酰亚胺酯)、DTSSP(3,3’-二硫代双[丙酸磺基琥珀酰亚胺基酯])、EGS(双[琥珀酸琥珀酰亚胺基酯]乙二醇酯)、磺基-EGS(双[琥珀酸磺基琥珀酰亚胺基酯]乙二醇酯)、TSAT(氨基三乙酸三-琥珀酰亚胺基酯)、DFDNB(1,5-二氟-2,4-二硝基苯)，以及它们的组合。

本文还公开了包含本文公开的多肽或缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，所述多肽的浓度为0.05μg/ml至100μg/ml。在一些实施方案中，所述组合物为适于皮下或静脉内施用的剂型。在一些实施方案中，所述组合物为冻干或包封形式。

本文公开了在有需要的个体中减少M2型巨噬细胞或治疗M2型巨噬细胞介导的疾病的方法，其包括向个体施用本文公开的多肽。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ IDNO：3、4、5、7或8的氨基酸序列。在一些实施方案中，与具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽相比，所述多肽减少M2型巨噬细胞。在一些实施方案中，所述疾病为癌症。在一些实施方案中，所述癌症为黑素瘤、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌或在癌症微环境中具有M2型肿瘤相关巨噬细胞的其他实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症为肝细胞癌。在一些实施方案中，所述疾病为纤维化相关疾病、终末期肝病、肾病、特发性肺纤维化(IPF)、心力衰竭、许多慢性自身免疫疾病，包括硬皮病、类风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、骨髓纤维化和系统性红斑狼疮、肿瘤侵袭和转移、慢性移植物排斥和许多进行性肌病的发病机制、肝硬化和纤维化、良性前列腺增生或前列腺炎。在一些实施方案中，所述疾病为肺纤维化。

本文还公开了在有需要的个体中减少M1型巨噬细胞或治疗M1型巨噬细胞介导的疾病的方法，其包括向个体施用本文公开的多肽。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ IDNO:3、4、5、7、8或11的氨基酸序列。在一些实施方案中，与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽相比，所述多肽减少M1型巨噬细胞。在一些实施方案中，所述疾病为慢性炎性疾病，包括脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(MODS)、特应性皮炎、类风湿性关节炎或自身免疫病症。在一些实施方案中，所述疾病为脓毒症，其包括脓毒性休克。

还公开了在有需要的个体中减少M0型巨噬细胞或治疗M0型巨噬细胞介导的疾病的方法，其包括向个体施用本文公开的多肽。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、10或11的氨基酸序列。在一些实施方案中，与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽相比，所述多肽减少M0型巨噬细胞。

本文还公开了本文公开的肽和/或缀合物用于治疗有需要的个体的M2型巨噬细胞介导的疾病的用途。本文还公开了本文公开的肽和/或缀合物，其用于治疗有需要的个体的M2型巨噬细胞介导的疾病。本文还公开了本文公开的肽和/或缀合物在制备用于治疗有需要的个体的M2型巨噬细胞介导的疾病的药物中的用途。

本文还公开了本文公开的肽和/或缀合物用于治疗有需要的个体的M1型巨噬细胞介导的疾病的用途。本文还公开了本文公开的肽和/或缀合物，其用于治疗有需要的个体的M1型巨噬细胞介导的疾病。本文还公开了本文公开的肽和/或缀合物在制备用于治疗有需要的个体的M1型巨噬细胞介导的疾病的药物中的用途。

本文还公开了本文公开的肽和/或缀合物用于治疗有需要的个体的M0型巨噬细胞介导的疾病的用途。本文还公开了本文公开的肽和/或缀合物，其用于治疗有需要的个体的M0型巨噬细胞介导的疾病。本文还公开了本文公开的肽和/或缀合物在制备用于治疗有需要的个体的M0型巨噬细胞介导的疾病的药物中的用途。

附图简述

图1A-1F.THP-1衍生的巨噬细胞的极化。对于M0巨噬细胞，用PMA处理THP-1细胞，然后对于M1巨噬细胞，用LPS和IFN-γ一起孵育，对于M2巨噬细胞，用IL-4和IL-13一起孵育。巨噬细胞的极化通过M1的标志物(例如IL-12、CXCL10和CD86)和M2的标志物(例如IL-10、TGF-β、精氨酸酶1和CD206)来评估。与M0相比，用LPS和IFN-γ处理的巨噬细胞显示出增加的M1标志物(图1D、1E和1F)，并且用IL-4和IL-13处理的巨噬细胞显示出增加的M2标志物(图1A、1B、1C和1F)。

图2A-2C.THP-1衍生的M2巨噬细胞中TAMpep片段的亲和力。为了确定TAMpep与M2巨噬细胞结合的主要氨基位点，通过在THP-1衍生的M2巨噬细胞中使用与FITC缀合的TAMpep和TAMpep的片段(图2A中提供的氨基酸序列)进行亲和力测试(乱序的-SEQ ID NO:48；TAMpep-SEQ ID NO:1；TAMpep114-SEQ ID NO:49；TAMpep120-SEQ ID NO:50；TAMpep820-SEQ ID NO:51；TAMpep822-SEQ ID NO:52；Mpep-SEQ ID NO:2；TAMpep1026-SEQID NO:53；TAMpep1226-SEQ ID NO:54；和TAMpep1526-SEQ ID NO:55)。在M2巨噬细胞中，TAMpep(包括26个氨基酸)显示出超过90％的高亲和力，且Mpep(从C末端去除7个氨基酸)显示出超过45％的第二高的亲和力。与26个氨基酸的肽相比，TAMpep的片段(从C末端去除超过10个氨基酸或从N末端去除超过4个氨基酸)显示出低亲和力(图2B和2C)。

图3A-3C.TAMpep片段在THP-1衍生的M2巨噬细胞中的细胞毒性。在THP-1衍生的M2巨噬细胞中的细胞毒性测定中测试TAMpep片段。TAMpep显示IC50为0.815μM的高细胞毒性值，而其他肽片段在M2巨噬细胞中不显示细胞毒性作用。

图4A-4D.TAMpep和Mpep的溶血。为了测定TAMpep和Mpep的溶血作用，在小鼠RBC中用递增浓度(0.1-50μM)的肽处理。TAMpep显示IC50为6.669μM，Mpep显示IC50为>50μM(图4A和4B)。此外，与dKLA缀合的TAMpep和Mpep显示IC50分别为1.122μM和>50μM(图4C和4D)。

图5A-5C.TAMpep和Mpep在THP-1衍生的巨噬细胞中的亲和力。为了比较TAMpep和Mpep在巨噬细胞亚型中是否更特异性地粘附于M2巨噬细胞，用从THP-1细胞极化的M0、M1和M2巨噬细胞处理与FITC缀合的肽，并通过FACS分析。与M0和M1巨噬细胞相比，TAMpep和Mpep在M2巨噬细胞中显示出显著更高的亲和力(图5A和5B)。另外，通过免疫荧光显微镜检查，TAMpep在M2巨噬细胞中显示出高亲和力(图5C)。

图6A-6D.TAMpepK和MpepK在THP-1衍生的巨噬细胞中的细胞毒性。为了评估与dKLA缀合的TAMpep和Mpep是否选择性诱导细胞凋亡，用递增浓度的TAMpepK或MpepK(0.01-10μM)处理M2巨噬细胞。与M0和M1巨噬细胞相比，TAMpepK和MpepK诱导M2巨噬细胞的凋亡(图6A和6B)。此外，与其他亚型的巨噬细胞相比，与细胞凋亡相关的半胱天冬酶-3的表达在M2巨噬细胞中增加(图6C和6D)。

图7A-7E.在THP-1衍生的巨噬细胞中通过丙氨酸取代文库的Mpep的亲和力。为了找到Mpep在M2巨噬细胞中的粘附能力中的关键氨基酸序列，使用丙氨酸替代的Mpep文库。在M2巨噬细胞中，当第3位T(苏氨酸)、第6位L(亮氨酸)、第9位L(亮氨酸)、第12位W(色氨酸)、第13位I(异亮氨酸)、第16位K(赖氨酸)和第17位R(精氨酸)上被丙氨酸替代时，肽的亲和力降低。此外，在肽(A13-16和A05)中替代第6位L(亮氨酸)至第9位L(亮氨酸)和第3位T(苏氨酸)、第15位K(赖氨酸)、第16位R(精氨酸)、第17位K(赖氨酸)和第19位Q(谷氨酰胺)时，肽的亲和力降低。替代第2位L(亮氨酸)和第11位S(丝氨酸)的肽(A9和A18)在M2巨噬细胞中显示出增加的亲和力(图7A-7E)。图7B-7E的每一个中的Mpep氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

图8A-8C.TAMpepK在M2巨噬细胞和人黑素瘤细胞中的细胞毒性。为了确定TAMpepK是否在M2巨噬细胞中诱导比黑素瘤细胞中更多的细胞凋亡和结合，将TAMpep和TAMpepK各自用THP-1衍生的M2巨噬细胞或Sk-Mel-28细胞进行处理(图8A和8C)。与黑素瘤细胞(IC50：3.583μM)相比，TAMpepK在M2巨噬细胞中显示出低IC50值(1.055μM)(图8B)，并且与黑素瘤细胞相比，M2巨噬细胞中半胱天冬酶-3的表达也增加(图8C)。

图9A-9C.用TAMpepK处理的M2巨噬细胞的条件培养基对黑素瘤细胞的增殖和迁移影响。为了测试TAMpepK是否抑制由M2巨噬细胞诱导的黑素瘤细胞的增殖和迁移，制备不用或用TAMpepK(1μM)预处理的M0、M1和M2巨噬细胞的条件培养基和在黑素瘤细胞中处理的条件培养基。黑素瘤细胞的增殖被M2巨噬细胞的条件培养基所增加，而在用TAMpepK预处理的M2巨噬细胞的条件培养基中被抑制(图9A)。此外，用TAMpepK预处理的M2巨噬细胞的条件培养基抑制黑素瘤细胞的迁移，而M2巨噬细胞的条件培养基增加黑素瘤细胞的迁移(图9B和9C)。

图10A-10D.TAMpepK在黑素瘤小鼠模型中的抗癌作用。为了评估TAMpepK在体内的抗癌作用，将鼠黑素瘤细胞(B16F10细胞系)皮下注射到C57BL6J小鼠的右侧腹中，并在一周后每隔三天将TAMpepK通过腹膜内注射一次。与PBS组相比，TAMpepK治疗的小鼠显示肿瘤体积和重量显著减小(图10A、10C和10D)。另一方面，小鼠的体重在PBS与TAMpepK组之间没有显著改变(图10B)。

图11A-11C.靶向M2样TAM的TAMpepK在黑素瘤小鼠模型中的作用。为了确定TAMpepK是否减少黑素瘤小鼠模型中的M2样TAM，从肿瘤组织中分离巨噬细胞并通过FACS分析。与PBS组相比，在TAMpepK组中M2样TAM(F4.80+和CD206+细胞)显著减少(图11A和11B)。然而，M1样TAM(F4/80+和CD86+细胞)在PBS与TAMpepK组之间未显示变化(图11A和11B)。另外，通过M1/M2比率分析了肿瘤微环境的变化。与PBS组相比，TAMpepK组通过减少M2巨噬细胞而显示M1巨噬细胞的比例增加(图11C)。

图12A-12D.TAMpepK和Mpepk在黑素瘤小鼠模型中的抗癌作用。进行本研究以确定MpepK在黑素瘤模型中的抗癌作用。如图12所示，与PBS组相比，TAMpepK和MpepK组的肿瘤体积和重量均降低(图12A-12C)，并且MpepK组中的存活率延长(图12D)。

图13A-13E.靶向M2样TAM的TAMpepK和MpepK在黑素瘤小鼠模型中的作用。为了确定MpepK是否诱导黑素瘤中肿瘤微环境的变化，通过FACS分析巨噬细胞的M1/M2比率和CD8耗竭。与PBS组相比，TAMpepK和MpepK组中M2样TAM(F4.80+和CD206+细胞)减少。然而，M1样TAM(F4/80+和CD86+细胞)在所有组中未显示变化(图13A和13B)。与PBS组相比，TAMpepK和MpepK组中M1/M2比率显著增加(图13C)。此外，与PBS组相比，TAMpepK和MpepK组中CD8⁺T细胞的耗竭标志物如PD-1和LAG3显著减少(图13D和13E)。

图14A和14B.前列腺肿瘤细胞条件培养基(TCM)对THP-1衍生的M2巨噬细胞的分化。为了确定前列腺癌细胞的条件培养基(TCM)对M2巨噬细胞的极化，将THP-1衍生的巨噬细胞与TCM一起孵育。与M0巨噬细胞相比，TCM处理的巨噬细胞显示出M2标志物如精氨酸酶1、CD206和CD163的mRNA表达增加，以及M1标志物如NOS2和CCR7的mRNA表达降低(图14A和14B)。

图15A-15C.M2巨噬细胞的条件培养基对前列腺癌细胞的增殖和迁移影响。如图15A-15C所示，THP-1衍生的M2巨噬细胞增加了癌细胞的增殖和迁移。本研究测试了TCM极化的M2巨噬细胞是否诱导前列腺癌细胞的增殖和迁移。用TCM处理的巨噬细胞的条件培养基(M-TCM)显示前列腺癌细胞的增殖和迁移增加，与THP-1衍生的M2巨噬细胞的条件培养基类似(图15A-15C)。

图16A和16B.通过TAMpepK或MpepK的巨噬细胞的细胞存活力。为了评估TAMpepK和MpepK是否降低由TCM分化的M2巨噬细胞的细胞存活力，用TAMpepK和MpepK(1μM)处理THP-1衍生的巨噬细胞(图16A)。TAMpepK和MpepK导致在用TCM处理的巨噬细胞中诱导凋亡，类似于M2巨噬细胞(图16B)。

图17A-17C.用TAMpepK和MpepK处理的M2巨噬细胞的条件培养基对前列腺癌细胞的增殖和迁移影响。由TCM诱导的M2巨噬细胞和M2样TAM的条件培养基增加了前列腺癌细胞(PC3细胞)的增殖和迁移(图17A-17C)。然而，与M2巨噬细胞或M2样TAM组相比，用TAMpepK和MpepK预处理的M2巨噬细胞和M2样TAM的条件培养基显著减少PC3细胞的增殖和迁移(图17A-17C)。

图18A和18B.用TAMpepK和MpepK处理的M2巨噬细胞的条件培养基对前列腺癌细胞的侵袭影响。用巨噬细胞的条件培养基处理PC3细胞。TCM诱导的M2巨噬细胞和M2样TAM的条件培养基增加了PC3细胞的侵袭。然而，与M2巨噬细胞或M2样TAM组相比，用TAMpepK和MpepK预处理的M2巨噬细胞和M2样TAM的条件培养基显著减少PC3细胞的侵袭(图18A和18B)。

图19A-19F.TAMpepK和MpepK在前列腺癌小鼠模型中的作用。为了评估TAMPEPK和MPEPK在前列腺癌模型中的抗癌作用，将TRAMP-C2细胞皮下注射到C57BL6J小鼠的右侧腹中，并且在一周后每隔3天通过腹膜内注射TAMpep、dKLA、TAMpepK和MpepK。用TAMpepK和MpepK处理的小鼠与PBS组相比显示出显著减小的肿瘤体积和重量(图19B、19C、19E和19F))。另一方面，小鼠的体重在所有组之间无显著性改变(图19D)。

图20A-20D.TAMpepK和MpepK在前列腺癌模型的增殖和EMT中的作用。为了确定TAMpepK和MpepK在前列腺癌模型的肿瘤生长和EMT中的抗癌作用，在肿瘤组织中测量作为增殖标志物的PCNA和作为EMT(上皮-间充质细胞转换)标志物的E-钙粘蛋白、波形蛋白、纤连蛋白、TGF-β和MMP9的表达。TAMpepK和MpepK组中PCNA的表达减少(图20C和20D)。对于EMT标志物，称为上皮细胞标志物的E-钙粘蛋白在TAMpepK和MpepK组中增加(图20A和20D)，而称为间充质标志物的波形蛋白和纤连蛋白在TAMpepK和MpepK组中减少(图20B和20D)。此外，与EMT相关的TGF-β和MMP9的表达在TAMpepK和MpepK组中也减少(图20D)。因此，这些发现表明，TAMpepK和MpepK通过抑制靶向前列腺癌中的M2样TAM的肿瘤生长和转移而具有抗癌作用。

图21A-21E.TAMpepK和MpepK在结肠癌模型中的抗癌作用。为了确定TAMpepK和MpepK在结肠癌模型的肿瘤生长中的抗癌作用，测量肿瘤组织的体积和重量。与PBS组相比，用TAMpepK和MpepK处理的小鼠显示出显著减小的肿瘤体积和重量，而MpepK中的肿瘤重量没有显著变化(图21A-21E)。

图22A-22C.MpepK在肺纤维化小鼠模型中的作用。为了确定MpepK是否具有抑制肺纤维化的治疗作用，通过气管内施用博来霉素建立肺纤维化小鼠模型。由博来霉素诱导的肺纤维化被MpepK减少(图22B)。另外，与PBS相比，MpepK中与纤维化相关的基因表达例如Fosl2、1型胶原蛋白和1型纤连蛋白显著减少(图22C)。

图23A-23E.TAMpepK和MpepK在乳腺癌小鼠模型中的作用。为了确定TAMpepK和MpepK在乳腺癌中的抗癌作用，建立了乳腺癌的第四乳腺原位小鼠模型。与PBS组相比，TAMpepK和MpepK显示肿瘤体积和重量减小(图23B-23D)。此外，与PBS相比，MpepK中称作M2巨噬细胞标志物的精氨酸酶1的基因表达显著减少(图23E)。

图24A-24C.TAMpepK和MpepK在乳腺癌的肺转移中的作用。与PBS组相比，MpepK组的肺转移减少(图24A-24C)。

图25A-25C.对M2型、M1型和/或M0型巨噬细胞具有选择性的多肽的细胞毒性。在THP-1衍生的M2、M1和M0巨噬细胞中的细胞毒性测定中测试对M2型、M1型和/或M0型巨噬细胞具有选择性的多肽。用MpepK、A12K、A14K、A17K、A18K、A22K、A25K或A26K肽处理极化的细胞。MpepK在M2巨噬细胞中显示出IC₅₀为1.121μM的高细胞毒性值，而A26K在M1巨噬细胞中显示出IC₅₀为1.192μM的高细胞毒性值。此外，与对照相比，A17K、A22K和A25K在1.5μM下在M2巨噬细胞中显示出类似的MpepK细胞毒性，而A26K在1.5μM下在M1巨噬细胞中显示出超过50％的存活力抑制。

图26A-26B.A26K在体外脓毒症模型，即LPS刺激的M1(LPS-M1)巨噬细胞中的细胞毒性和作用。在体外脓毒症模型LPS刺激的M1(LPS-M1)巨噬细胞中测试对M1巨噬细胞最有选择性的多肽A26K。使用CCK-8测定法分析细胞活力。通过实时定量PCR对促炎基因(IL-8、TNF-α、NF-kB、IL-1β和CXCL10)的表达水平进行定量。为了检查A26K在LPS-M1巨噬细胞中的细胞毒性，用1.5μM的A26K处理M0、M1和LPS-M1巨噬细胞。A26K在LPS-M1巨噬细胞和M1巨噬细胞中显示出显著的细胞毒性作用。为了进一步检查促炎基因的表达水平，用1.5μM A26K处理M0、M1和LPS-M1巨噬细胞1小时。与M0巨噬细胞相比，LPS(1μg/ml)刺激显著增加IL8、TNFα、IL-1β、NF-κB和CXCL10的表达。A26K处理显著抑制LPS刺激引起的IL8、TNFα、IL-1β、NF-kB和CXCL10的表达水平增加。

图27A-27B.A17K或A22K在体外肺纤维化模型，即与IL-4和IL-13诱导的THP-1巨噬细胞共培养的TGF-β1诱导的A549细胞中的作用。使用细胞共培养系统，将TGF-β1诱导的A549细胞与IL-4和IL-13诱导的THP-1巨噬细胞共培养。清楚地检测到A549从卵圆形上皮细胞向梭形成纤维细胞样细胞的形态学变化。A17K或A22K干预可明显阻断受到IL-4和IL-13诱导的巨噬细胞共培养刺激的A549细胞中EMT的梭形间充质形态表型。与单独的M2巨噬细胞的那些相比，A17K或A22K处理显著增强了A549细胞中EMT抑制标志物E-钙粘蛋白的表达，并减少了FMT增强标志物α-SMA的表达。

图28A-28D.MpepK在小鼠肝细胞癌模型中的作用。为了评估MpepK在体内的抗癌作用，将小鼠Hepa 1-6细胞皮下注射到C57BL/6J小鼠的右侧腹中。细胞接种后12天，每隔3天通过腹膜内注射MpepK。作为结果，各组之间的体重变化无显著性差异。另一方面，与PBS组相比，用所有剂量(100、200和400nmol/kg)的MpepK处理的小鼠均显示出显著减小的肿瘤体积，并且与PBS组相比，MpepK组(100、200和400nmol/kg)中的存活率显著延长。

发明详述

本文的术语“蜂毒肽”(MEL)是构成蜂毒的主要成分的肽，其具有序列例如Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln(SEQ ID NO:1)。本文所用的术语“蜂毒(BV)”是在蜜蜂(Apismellifera)的腹部产生的酸性和碱性分泌物的混合物，并且具有无色苦味液体形式。其主要成分是蜂毒肽、作为肽的蜂毒胺和肥大细胞脱粒(MCD)肽和作为酶的磷脂酶A2(PLA2)等。此外，BV包含多种痕量的成分。

已经确定，其中蜂毒肽的前7个氨基酸已经被去除的肽，例如Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln(SEQ ID NO:2；MEL826或Mpep)可以突变为SEQ ID NOS:3-11(Mpeps或每个Mpep)以选择性地靶向M0-型、M1-型或M2-型巨噬细胞。

因此，本文公开了包含X1-X2-Thr-X4-Gly-Leu-X7-Ala-Leu-Ile-X11-Trp-Ile-X14-Arg-Lys-Arg-X18-X19(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的多肽，其中X1是除缬氨酸以外的氨基酸，X2是除亮氨酸以外的氨基酸，X4是苏氨酸以外的氨基酸，X7是除脯氨酸以外的氨基酸，X11是除丝氨酸以外的氨基酸，X14是除赖氨酸以外的氨基酸，X18是除谷氨酰胺以外的氨基酸，和/或X19是除谷氨酰胺以外的氨基酸。在一些实施方案中，X1为丙氨酸(SEQ IDNO:4)，X2为丙氨酸(SEQ ID NO:5)，X4为丙氨酸(SEQ ID NO:6)，X7为丙氨酸(SEQ ID NO:7)，X11为丙氨酸(SEQ ID NO:8)，X14为丙氨酸(SEQ ID NO:9)，X18为丙氨酸(SEQ ID NO:10)，X19为丙氨酸(SEQ ID NO:11)或其任意组合(表1)。此类多肽可单独用作活性成分或治疗药物，或与其他活性成分或治疗药物组合使用。

表1

本文还公开了包含SEQ ID NOS:12-35中任一个的氨基酸序列的多肽。本文还公开了包含SEQ ID NOS:49-55任一个的氨基酸序列的多肽。

本文中可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指通过酰胺键(或肽键)缀合的任何长度的氨基酸的聚合形式。NH₂是指存在于多肽氨基末端的游离氨基。COOH是指存在于多肽的羧基末端的游离羧基。

根据本文，所述肽可以通过本领域众所周知的各种方法获得。例如，可以使用基因重组和蛋白质表达系统，或通过化学合成例如肽合成在体外合成肽的方法，通过无细胞的蛋白质合成方法和/或类似方法来制备所述肽。本文还公开了包含本文公开的多肽和第二种治疗药物的缀合物。在一些实施方案中，第二种治疗药物为dKLA(SEQ ID NO:47)、α-防御素-1、BMAP-28、brevenin-2R、buforin IIb、天蚕素A-爪蟾抗菌肽2(CA-MA-2)、天蚕素A、天蚕素B、chrysophsin-1、D-K6L9、gomesin、乳铁蛋白肽B、LL27、LTX-315、爪蟾抗菌肽2、爪蟾抗菌肽II铃蟾肽缀合物(MG2B)、pardaxin、多柔比星、甲氨蝶呤、恩替司他、克拉屈滨、普拉曲沙、劳拉替尼、美坦辛DM1、美坦辛DM3、美坦辛DM4、或它们的组合。

本文的术语“缀合物”是指一种缀合物，其中Mpep肽和第二种治疗药物彼此缀合并可以靶向巨噬细胞。该缀合物可以结合至例如该药物靶向的M2型巨噬细胞并破坏巨噬细胞的线粒体以抑制肿瘤生长和转移，并且可以通过选择性抑制肿瘤周围的血管生成来抑制癌症。也就是说，与单独的第二种治疗药物相比，本文的缀合物可具有改善的活性。然而，本文不限于此。

所述缀合物还可以包含将多肽连接至第二种治疗药物的接头。接头可以衍生自天然存在的多结构域蛋白质或根据经验设计。参见Chen,X.等人,Adv.Drug Deliv.Rev.65:1357-1369(2013)。接头可以包括柔性接头、刚性接头和体内可裂解接头。除了将功能性结构域连接在一起(如在柔性和刚性接头中)或在体内释放游离的功能性结构域(如在体内可裂解的接头)中的作用外，接头还可以在融合蛋白的生产中提供其他优势，例如提高生物活性，增加表达产量，并实现所需的药代动力学特性。所述接头可以为小型、中型和大型接头，它们具有的平均长度分别为4.5±0.7、9.1±2.4和21.0±7.6个残基。在一些实施方案中，氨基酸可以为极性不带电或带电残基，其构成约50％的天然编码氨基酸。

当连接的结构域需要一定程度的移动或相互作用时，通常会应用柔性接头。它们通常由小的非极性(例如Gly)或极性(例如Ser或Thr)氨基酸组成。这些氨基酸的小尺寸提供了灵活性并允许连接功能性结构域的移动。Ser或Thr的引入可以通过与水分子形成氢键来维持接头在水溶液中的稳定性，从而减少接头与蛋白质部分之间的不利相互作用。最常用的柔性接头具有主要包含Gly和Ser残基的序列(“GS”接头)。最广泛使用的柔性接头的实例具有(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n的序列(SEQ ID NO：36)。通过调整拷贝数“n”，可以优化这种GS接头的长度，以实现功能性结构域的适当分离，或维持必要的结构域间的相互作用。

已经成功地应用刚性接头来保持结构域之间的固定距离并维持它们的独立功能。具有(EAAAK)n(SEQ ID NO:37)序列的形成α螺旋的接头已应用于许多重组融合蛋白的构建。另一种类型的刚性接头具有富含Pro的序列(XP)n，其中X表示任何氨基酸，例如Ala、Lys或Glu。刚性接头通过采用α-螺旋结构或通过含有多个Pro残基而表现出相对刚性的结构。在许多情况下，它们比柔性接头更有效地分隔功能性结构域。通过改变拷贝数可以容易地调节接头的长度，以实现结构域之间的最佳距离。因此，当结构域的空间分离对于保持融合蛋白的稳定性或生物活性至关重要时，选择刚性接头。

在一些实施方案中，导入可裂解的接头以在体内释放游离的功能结构域。例如，可以使用基于含有在接头上的两个半胱氨酸(Cys)残基之间形成的分子内二硫键的二硫环肽的二硫化物接头(LEAGCKNFFPR↓SFTSCGSLE)(SEQ ID NO:38)，以及两个Cys残基之间的凝血酶敏感性序列(PRS)。二硫环肽序列(CRRRRRREAEAC)(SEQ ID NO:39)含有两个Cys残基之间的分子内二硫键，以及对驻留在酵母分泌途径中的分泌信号加工蛋白酶敏感的肽序列。

所述接头还可以包含细胞穿透肽，其可以增强本文公开的肽的细胞摄取。细胞穿透接头可以包含例如5-30个氨基酸，并且可以是阳离子的、两亲的或疏水的。细胞穿透接头的实例包括RLRWR(SEQ ID NO:40)、GRPRESGKKRKRKRLKP(SEQ ID NO:41)、GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:42)、RYIRS(SEQ ID NO:43)、RRMKWKK(SEQ ID NO:44)、R8-12(SEQ ID NO:45)和RRRRRRRRRFFC(SEQ ID NO:46)。参见Bohmova,E.等人,Physiol.Res.67(增刊2):S267-S279(2018),特别是表1-3，其通过引用并入本文。

例如，可以通过将肽dKLA(SEQ ID NO:47；d(KLAKLAKKLAKLAK))经由GGGGS接头(SEQ ID NO:36)缀合至Mpep(SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、10或11)而得到所述缀合物。

或者，所述缀合物可以通过使抗癌药物如多柔比星、甲氨蝶呤、恩替司他、克拉屈滨、普拉曲沙和劳拉替尼通过SPDP接头缀合至Mpep得到。或者，所述缀合物可以通过不使用接头而将美坦辛DM1、美坦辛DM3和美坦辛DM4缀合至Mpep得到。然而，本文不限于此。也就是说，本文的缀合物可以是Mpep直接缀合至抗癌药物或通过接头缀合至抗癌药物的形式。然而，本文不限于此。

根据本文，所述接头可以经由Mpep和抗癌药物上的胺、羧基或巯基结合至药物或Mpep。然而，本文不限于此。对于包含与抗癌药物缀合的蜂毒肽的组合物，参见KR申请公开号10-2019-0053334。

在一些实施方案中，接头的一端或两端包含以下官能团：碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)、亚氨酸酯、五氟苯基酯、羟甲基膦、马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、硫代磺酸酯、乙烯基砜、EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)、DCC(N,N'-二环己基碳二亚胺)、SATA(琥珀酰亚胺基乙酰基硫代乙酸酯)、磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯)、DMA(己二亚氨酸二甲酯·2HCl)、DMP(庚二亚氨酸二甲酯·2HCl)、DMS(辛二亚氨酸二甲酯·2HCl)、DTBP(3,3’-二硫代双丙酰亚氨酸二甲酯·2HCl)、磺基-SIAB((4-碘乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺基酯)、SIAB((4-碘乙酰基)氨基苯甲酸琥珀酰亚胺基酯)、SBAP(3-(溴乙酰氨基)丙酸琥珀酰亚胺基酯)、SIA(碘乙酸琥珀酰亚胺基酯)、SM(PEG)n(琥珀酰亚胺基-([N-马来酰亚胺基丙酰氨基]-乙二醇酯，其中n＝2、4、6、8、12或24)、SMCC(琥珀酰亚胺基-4-(N-D-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯)、LCSMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰氨基己酸琥珀酰亚胺基酯))、磺基-EMCS(N-ε酯)、EMCS(N-ε磺基-GMBS(N-γ酯)、GMBS(N-γ酯)、磺基-KMUS(N-κ酯)、磺基-MBS(间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N羟基磺基琥珀酰亚胺酯)、MBS(间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N羟基琥珀酰亚胺酯)、磺基-SMPB(4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺基酯)、SMPB(4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺基酯)、AMAS(N-α-马来酰亚胺基-乙酰氧基琥珀酰亚胺酯)、BMPS(N-β-马来酰亚胺基丙氧基琥珀酰亚胺酯)、SMPH(6-[(β-马来酰亚胺基丙酰氨基)己酸琥珀酰亚胺基酯])、PEG12-SPDP(2-吡啶基二硫基-四氧杂十八烷-N-羟基琥珀酰亚胺)、PEG4-SPDP、磺基-LCSPDP(6-[3’-(2-吡啶基二硫基)丙酰氨基]己酸磺基琥珀酰亚胺基酯)、SPDP(3-(2-吡啶基二硫基)丙酸琥珀酰亚胺基酯)、LC-SPDP(6-[3’-(2-吡啶基二硫基)丙酰氨基]己酸琥珀酰亚胺基酯)、SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基α(2-吡啶基二硫基)甲苯)、DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、BS(PEG)5(双(琥珀酰亚胺基)五(乙二醇))、BS(PEG)9(双(琥珀酰亚胺基)九(乙二醇))、BS3(辛二酸双[磺基琥珀酰亚胺基]酯)、BSOCOES(双[2-(琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基)乙基]砜)、PDPH(3-(2-吡啶基二硫基)丙酰肼)、DSG(戊二酸二琥珀酰亚胺酯)、DSP(二硫基双[丙酸琥珀酰亚胺基酯])、BM(PEG)n(1,8-二马来酰亚胺基-乙二醇，n＝2或3)、BMB(1,4-二马来酰亚胺基丁烷)、BMDB(1,4-二马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷)、BMH(二马来酰亚胺基己烷)、BMOE(二马来酰亚胺基乙烷)、DTME(二硫基双马来酰亚胺基乙烷)、TMEA(三(2-马来酰亚胺基乙基)胺)、DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、DST(酒石酸二琥珀酰亚胺酯)、DTSSP(3,3’-二硫代双[丙酸磺基琥珀酰亚胺基酯])、EGS(双[琥珀酸琥珀酰亚胺基酯]乙二醇酯)、磺基-EGS(双[琥珀酸磺基琥珀酰亚胺基酯]乙二醇酯)、TSAT(氨基三乙酸三-琥珀酰亚胺基酯)、DFDNB(1,5-二氟-2,4-二硝基苯)，或它们的组合。

根据本文，所述肽可包含靶向序列、标记、标记残基和/或为了增加肽的半衰期或稳定性的特定目的而设计的另外的氨基酸序列。此外，本文的肽可缀合至例如效应物、药物、前药、毒素、肽和/或递送分子这样的偶联配偶体。在一些实施方案中，本文的肽可以与偶联配偶体如RNA、DNA或抗体缀合。参见Shoari等人,Pharmaceutics 13:1391,pp.1-32(2021)。

在一些实施方案中，为了延长本文公开的肽的体内半衰期、增加其稳定性和/或降低其清除率，可以通过下列方法但不限于下列方法修饰所述肽：与载体蛋白缀合、与配体缀合、与抗体缀合、聚乙二醇化、聚唾液酸化、HES基化、重组PEG模拟物、纳米颗粒附着、纳米颗粒包封、胆固醇融合、铁融合、酰化、酰胺化、糖基化、侧链氧化、磷酸化、生物素化、微球或微球聚合物药物递送系统，或添加表面活性材料、氨基酸模拟物或非天然氨基酸。

根据本文，可以将所述肽制备成药学上可接受的盐的形式。具体地，可以通过向其中添加酸来形成盐。例如，可以通过向肽中添加以下物质来形成盐：无机酸(例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸等)、有机羧酸(如乙酸、卤代乙酸例如三氟乙酸、丙酸、马来酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、水杨酸)、酸性糖(葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡糖酸、抗坏血酸)、酸性多糖(如透明质酸、硫酸软骨素、精氨酸)、有机磺酸(例如，甲磺酸、对甲苯磺酸)，包括磺酸糖酯，例如硫酸软骨素等。

本文还公开了组合物，例如药物组合物，其包含本文公开的多肽或缀合物和药学上可接受的载体。

根据本文，所述肽或缀合物可以用于人类。然而，所述肽或缀合物可以施用于活的家畜，例如牛、马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊或宠物，例如狗或猫，其中例如发生炎性疾病或癌症。

对本文的用于预防或治疗癌症的组合物的施用途径和施用方式没有特别限制。只要该组合物可以到达目标部位，则任何施用途径和方式都可以使用。特别地，该组合物可以通过多种途径施用，即口服或胃肠外。施用途径的非限制性实例可以包括眼部、口服、直肠、局部、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、透皮、鼻腔或吸入途径。此外，可以使用能够将活性物质移动到靶细胞的任何装置来施用所述组合物。在一些实施方案中，所述组合物为适合于皮下或静脉内施用的剂型的形式。在一些实施方案中，所述组合物为冻干或包封的形式。

根据本文，药物组合物可以进一步包含通常用于制备药物组合物的药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。载体可以包括非天然存在的载体。

根据本文，术语“药学上可接受的”是指表示对暴露于该组合物的细胞或人无毒性的特征。

药物组合物可以按照常规方法配制成口服剂型，例如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂等，外用制剂、栓剂和无菌注射溶液。可以使用任何制剂，只要其用于预防或治疗预期疾病或癌症即可。因此，本文不限于此。

可以包含在药物组合物中的载体、赋形剂和稀释剂可以包括，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚-L-乳酸(PLLA)、矿物油等。

可以使用稀释剂或赋形剂制备制剂，例如常用的填充剂、增充剂、缀合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂。

用于口服施用的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等。这类固体制剂可以通过将组合物与至少一种赋形剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖和明胶混合来制备。此外，除了简单的赋形剂外，还可使用润滑剂，例如硬脂酸镁和滑石粉。

用于口服施用的液体制剂包括混悬液、液体溶液剂、乳剂、糖浆剂等。除了水和液体石蜡(它们是常用的简单稀释剂)外，液体制剂中还可以含有各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、香料、防腐剂等。用于肠胃外施用的制剂可以包括无菌的水溶液、非水溶剂、助悬剂、乳剂、冻干制剂、栓剂等。非水溶剂和助悬剂可以包括丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油和可注射的酯例如油酸乙酯。作为栓剂基质，可以使用witepsol、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂精、甘油明胶等。

除了上述成分之外，本文的组合物还可以包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂等。适合的药学上可接受的载体和制剂在Remington’sPharmaceutical Sciences(第19版,1995)中有详细描述。本文的组合物通过使用药理学上可接受的载体和/或赋形剂由本领域技术人员可以容易地配制以制备成单位剂量形式或通过导入多剂量容器制备的方法来配制。在这种情况下，该制剂还可以是在油或水性介质中的溶液、混悬液、乳液形式，或赋形剂、粉末、颗粒、片剂或胶囊剂的形式，并且还可以包括分散剂或稳定剂。本文使用的术语“施用”是指通过任意适合的方法向个体提供本文的预定组合物。

本文的组合物可以通过皮下输注或通过经皮肤的局部施用(透皮施用)肠胃外施用，但不限于此。

药物组合物的适合剂量可以通过各种因素以不同方式规定，例如配制方法、施用类型、患者的年龄、体重和性别、病理状况、食物、施用时间、施用途径、排泄率和反应敏感性等。本文的组合物的口服剂量可以为0.1mg/kg-10mg/kg(体重)/天、0.5mg/kg-1mg/kg(体重)/天或来源于其中的任意剂量或范围，但不限于此。此外，当将本文的组合物施用于有此需要的个体以去除肿瘤相关巨噬细胞时，其剂量可为0.01ug/ml-100ug/ml、0.05ug/ml-100ug/ml、0.1ug/ml-100ug/ml、0.1ug/ml-70ug/ml、0.1ug/ml-50ug/ml、0.1ug/ml-40ug/ml、0.1ug/ml-30ug/ml、0.1ug/ml-25ug/ml或来源于其中的任意剂量或范围，但不限于此。

本文使用的术语“个体”是指人类和非人类，包括所有动物，例如猴子、狗、山羊、猪或小鼠。这类个体可能需要治疗其中各种癌症或炎性疾病的症状可以通过施用本文的肽或其组合物来改善的疾病。

本文使用的术语“磷脂酶A2(PLA2)”是一种酶，其功能在于通过在第二个碳位置水解甘油来产生脂肪酸，其通过特异性识别磷脂的sn-2酰基键释放花生四烯酸和溶血磷脂质来催化水解活性。PLA2常见于哺乳动物组织以及细菌、昆虫和蛇毒中。

在一些方面，为了实现上述目的，本文提供了制备Mpep-抗癌药物缀合物的方法，该方法包括使Mpep与抗癌药物彼此缀合。

本文公开了减少有需要的个体的M2-型巨噬细胞或治疗M2-型巨噬细胞-介导的疾病的方法，包含向该个体施用如本文公开的多肽或其组合物。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:3、4、5、7或8的氨基酸序列。在一些实施方案中，与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽相比，所述多肽减少M2-型巨噬细胞。在一些实施方案中，所述疾病为癌症。在一些实施方案中，所述癌症为黑素瘤、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌或在癌症微环境中具有M2型肿瘤相关巨噬细胞的其他实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症为肝细胞癌。在一些实施方案中，所述疾病为纤维化相关疾病、终末期肝病、肾病、特发性肺纤维化(IPF)、心力衰竭、许多慢性自身免疫性疾病，包括硬皮病、类风湿病性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、骨髓纤维化和系统性红斑狼疮、肿瘤侵袭和转移、慢性移植物排斥和许多进行性肌病的发病机制、肝硬化和纤维化、良性前列腺增生或前列腺炎。在一些实施方案中，所述疾病为肺纤维化。

本文还公开了减少有需要的个体的M1-型巨噬细胞或治疗M1-型巨噬细胞-介导的疾病的方法，包含向该个体施用如本文公开的多肽或其组合物。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:3、4、5、7、8或11的氨基酸序列。在一些实施方案中，与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽相比，所述多肽减少M1-型巨噬细胞。在一些实施方案中，所述疾病为慢性炎症性疾病，包括脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(MODS)、特应性皮炎、类风湿性关节炎或自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述疾病为脓毒症，其中包括脓毒性休克。

还公开了在有需要的个体中减少M0型巨噬细胞或治疗M0型巨噬细胞介导的疾病的方法，包含将本文公开的多肽或其组合物施用于个体。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10或11的氨基酸序列。在一些实施方案中，与具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽相比，所述多肽减少M0型巨噬细胞。

本文公开的Mpep多肽可以选择性地靶向M2、M1和/或M0巨噬细胞。如本文所用，“选择性”是指对一种或多种巨噬细胞的结合或亲和力优于或强于对另一种类型的巨噬细胞的结合或亲和力，例如但不限于至少1/4倍、至少1/3倍、至少1/4倍、至少1/3倍、至少1/2倍、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍等，或由此衍生的任何倍数或范围。

在一些方面，为了实现上述目的，本文提供了用于预防或治疗与肿瘤相关的巨噬细胞介导的疾病的药物组合物。

根据本文，该组合物可以为用于通过去除M2型肿瘤相关巨噬细胞来预防或治疗癌症生长和转移的药物组合物。然而，本文不限于此。

根据本文，术语“预防”是指使用本文的缀合物抑制或延迟肿瘤生长和转移的任何行为。

根据本文，术语“治疗”是指使用本文公开的肽减少、抑制或有益地改变疾病症状(例如炎性疾病或癌症、肿瘤生长和/或转移)的任何行为。

根据本文，术语“抗癌药”是用于治疗癌症的药物的通用术语，例如化疗药物。抗癌药可以为化合物或促凋亡肽。然而，本文不限于此。

根据本文，术语“癌症”是指是指由于身体组织自主过度生长而异常生长的肿瘤，或与肿瘤有关的疾病。在一些实施方案中，所述癌症为黑素瘤、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌或在癌症微环境中具有M2型肿瘤相关巨噬细胞的其他实体瘤。根据本文，所述抗癌药可以为多柔比星、甲氨蝶呤、恩替司他、克拉屈滨、普拉曲沙、劳拉替尼、美坦辛DM1、美坦辛DM3和美坦辛DM4。然而，本文不限于此。

根据本文，术语“促凋亡”是指细胞导致死亡、同时细胞主动消耗ATP生物能的过程。典型的细胞凋亡过程通过细胞收缩、DNA的规则切割和细胞膜的破碎进行。当细胞因异常细胞分裂、辐射、紫外线照射、细菌感染或病毒感染而无法维持其正常功能时，可诱导细胞凋亡。

根据本文，促凋亡肽可以为dKLA、α-防御素-1、BMAP-28、brevenin-2R、buforinIIb、天蚕素A-爪蟾抗菌肽2(CA-MA-2)、天蚕素A、天蚕素B、chrysophsin-1、D-K6L9、gomesin、乳铁蛋白肽B、LLL27、LTX-315、爪蟾抗菌肽2、爪蟾抗菌肽II-爪蟾肽缀合物(MG2B)、pardaxin或其组合。然而，本文不限于此。

本文中的术语“肿瘤相关巨噬细胞(TAM)”是指在例如肿瘤生长和转移这样的整体肿瘤微环境中起重要作用的巨噬细胞。肿瘤周围存在的肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤细胞的生长和转移密切相关。肿瘤相关巨噬细胞分为两种表型：抑制肿瘤的M1巨噬细胞或支持肿瘤的M2巨噬细胞。M2-型肿瘤相关巨噬细胞产生细胞因子，例如IL-10、TGFβ和CCL18，其通过表面受体促进肿瘤生长并且抑制T细胞和NK细胞的抗肿瘤活性。这些肿瘤相关巨噬细胞(TAM)可以与源自骨髓、卵黄囊或髓外血细胞生成的单核细胞和巨噬细胞相区分。在一些实施方案中，可以从骨髓中分离TAM。然而，本文不限于此。

在本文其他方面，为了实现上述目的，提供了预防或治疗与肿瘤相关的巨噬细胞介导的疾病的方法，该方法包含向有此需要的个体施用所述缀合物或包含它们的药物组合物。

在本文的其他方面，为了实现上述目的，提供了Mpep-抗癌药物缀合物在预防或治疗与肿瘤相关的巨噬细胞介导的疾病中的用途。

本文使用的术语“治疗有效量”是指有效治疗预期疾病(例如炎性疾病、癌症或肿瘤相关巨噬细胞介导的疾病)的Mpep的量。

本文的Mpep-抗癌药物缀合物为靶向M2型肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的抗癌物质，并且具有选择性选择M2型肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的优异效果。因此，Mpep与抗癌药物之间的缀合方法可用于递送靶向M2型肿瘤相关巨噬细胞的药物。

本文预防或治疗肿瘤相关巨噬细胞介导的疾病的方法、特别是预防或治疗Lewis肺癌或炎性疾病的方法不仅包括在发生症状之前治疗疾病本身，还包括通过施用Mpep抑制或避免其症状。在疾病的处置过程中，特定活性成分的预防或治疗剂量将根据疾病或病症的性质和严重程度以及施用该活性成分的途径的不同而变化。其剂量可以为0.1mg/kg-10mg/kg(体重)/天、0.2mg/kg-8mg/kg(体重)/天、0.3mg/kg-5mg/kg(体重)/天、0.4mg/kg-3mg/kg(体重)/天、0.5mg/kg-1mg/kg(体重)/天或来源于其中的任意剂量或范围，但不限于此。本文的口服剂量可以为0.1mg/kg-10mg/kg体重)/天,0.1mg/kg-10mg/kg(体重)/天、0.2mg/kg-8mg/kg(体重)/天、0.3mg/kg-5mg/kg(体重)/天、0.4mg/kg-3mg/kg(体重)/天、0.5mg/kg-1mg/kg(体重)/天或来源于其中的任意剂量或范围，但不限于此。此外，当向有此需要的个体施用本文的组合物以去除肿瘤相关巨噬细胞时，其剂量可以为0.01ug/ml-100ug/ml、0.05ug/ml-100ug/ml、0.1ug/ml-100ug/ml、0.2ug/ml-70ug/ml、0.3ug/ml-50ug/ml、0.4ug/ml-40ug/ml、0.5ug/ml-30ug/ml、0.6ug/ml-25ug/ml或来源于其中的任意剂量或范围，但不限于此。

施用可以每天一次或数次施用。然而，其剂量和施用频率将根据个体患者的年龄、体重和反应的不同而变化，并且适合的剂量可以由自然考虑这些因素的本领域技术人员容易地选择。

实施例

在下文中，提供示例性实施例以更好地理解本文。然而，提供以下示例性实施方案仅用于更容易地理解本文，而本文的内容不限于以下示例性实施方案。

实施例1.材料和方法

1-1.肽合成

被保护的氨基酸和2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸铵(HCTU)购自AAPPTec(Louisville,KY)和AnaSpec(Fremont,CA)。按照标准Fmoc固相肽合成化学，在自动化PS3肽合成仪(Protein Technologies,Phoenix,AZ)上进行肽合成。在需要时，通过在溶于0.4M N-甲基吗啉的DMF溶液中的氨基酸和HCTU溶液中孵育3h来手动偶联氨基酸。通过Kaiser测试检查偶联反应是否完成。通过在20％(v/v)哌啶的DMF溶液中孵育两次30min去除Fmoc保护基。使肽在乙酐/三乙胺/DCM(1:1:5v/v/v)中在N末端上乙酰化2h。在TFA(三氟乙酸)/TIPS(三异丙基硅烷)/EDT(1,2-乙二硫醇)/DMB(1,3-二甲氧基苯(90:2.5:2.5:5v/v/v/v)中裂解肽2.5h。EDT仅包括在含有半胱氨酸的肽的裂解溶液中。将裂解的肽在冷乙醚中沉淀两次，并使用Phenomenex Fusion-RP C18半制备型柱(Torrance,CA)，以H2O(0.1％TFA)作为流动相A和ACN(0.1％TFA)作为流动相B，通过RP-HPLC(Agilent 1200,Santa Clara,CA)纯化。然后使用HyperSepTM C18柱对肽进行脱盐，并通过RP-HPLC证实纯度。通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS,Bruker Daltonics,Billerica,MA)证实纯化肽的分子量。

根据上述方法合成下列肽。

TAMpep：全长蜂毒肽(SEQ ID NO:1)；

Mpep：前7个氨基酸去除的全长蜂毒肽(SEQ ID NO:2)；

TAMpepK:连接至接头(GGGGS)(SEQ ID NO:36)的全长蜂毒肽(SEQ ID NO:1)，所述接头连接至d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys(dKLA)(SEQ ID NO:47)；和

MpepK：连接至接头(GGGS)(SEQ ID NO:36)的Mpep(SEQ ID NO:2)，所述接头连接至d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys(dKLA)(SEQ ID NO:47)。

1-2.细胞

THP-1细胞购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)，并根据其具体指示，使用补充有未经热处理的10％胎牛血清(FBS；WelGENE)、2mML-谷氨酰胺、0.05mMβ-巯基乙醇、10mM HEPES、4500mg/L葡萄糖、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Gibco)的RPMI 1640培养基进行培养。B16F10小鼠黑素瘤细胞购自ATCC，并使其在补充有10％FBS(WelGENE)和青霉素/链霉素(100U/ml；Gibco)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM；WelGENE)中生长。使Sk-Mel-28人黑素瘤细胞(来自ATCC)在包含10％FBS(WelGENE)和100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Gibco)的RPMI-1640培养基中生长和维持。小鼠前列腺癌细胞(TRAMP-C2)获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并在包含青霉素和链霉素(Gibco)并补充有10％FBS(WelGENE)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM；WelGENE)中培养。将从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的人前列腺癌细胞系(PC3)在37℃和5％CO2的加湿气氛中在包含2.05mM L-谷氨酰胺、2g/L碳酸氢钠和2g/L葡萄糖(WelGENE)以及10％FBS(WelGENE)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Gibco)的RPMI 1640培养基中培养。

1-3.动物研究

BALB/c和C57BL/6(B6)野生型小鼠购自DBL。对于黑素瘤和前列腺癌的皮下肿瘤模型，将CT26(3×10⁵细胞/小鼠)、B16F10(1 × 10⁶细胞/小鼠)和TRAMP-C2细胞(1 ×10⁶细胞/小鼠)与基质胶基质(Corning)混合，并且通过皮下接种到小鼠的右腹侧，并且将4T1(1×10⁵细胞/小鼠)细胞与基质胶基质混合并接种到小鼠的第4乳腺脂肪垫中。从肿瘤接种后第7天开始，每隔3天通过腹膜内注射TAMpepK和MpepK肽(200nmol/kg)，并通过电子卡尺测量肿瘤体积。研究结束后收集所有肿瘤组织，并通过电子天平测量肿瘤重量。

对于肺纤维化小鼠模型，用2.5％异氟烷轻度麻醉C57BL/6(B6)野生型小鼠，并使用微量移液器通过口咽吸入(OA)施用博来霉素(BLM,2mg/kg)。14天后，每隔一天给小鼠通过腹膜内注射MpepK(200nmol/kg)。动物研究得到Kyung Hee大学的机构动物管理及使用委员会批准(KHUASP(SE)-20–530用于黑素瘤，20-382用于前列腺癌)。将所有动物均维持在一个特定的无病原体环境中，进行12小时的光/暗循环，自由获取食物和水。嵌套板用于富集。实验结束后，使用异氟烷和颈椎脱臼法对所有小鼠实施安乐死。

1-4.巨噬细胞分化

THP-1单核细胞通过与100nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA,Sigma)一起孵育24h、然后在RPMI培养基(Invitrogen)中孵育24h分化为巨噬细胞。通过与20ng/ml的IFN-γ(Prospec)和100ng/ml的LPS(Sigma)一起孵育，M1巨噬细胞(M1)的巨噬细胞被极化。通过与20ng/ml白细胞介素(IL)4(Prospec)和20ng/ml白细胞介素13(Prospec)一起孵育，获得巨噬细胞M2极化(M2)。M2样肿瘤相关巨噬细胞通过与20％的PC3细胞条件培养基一起孵育被极化。

1-5.条件培养基的制备

为了获得肿瘤的条件培养基(TCM)，将PC3细胞以2× 10⁵个细胞/孔接种在24-孔板(Corning Inc)中的培养基中。24小时后，将培养基更换为无血清RPMI1640培养基，并培养细胞24小时。对于巨噬细胞的条件培养基，将THP-1细胞以2 × 10⁵个细胞/孔接种在24-孔板(Corning Inc)中的培养基中，并与100nM PMA一起孵育24h。细胞通过TCM极化为M0、M1和M2巨噬细胞或TAM巨噬细胞，并更换为无血清RPMI1640培养基。24小时后，将培养基更换为无血清RPMI1640培养基，并且培养细胞24小时。收集上清液并用注射器滤器(0.2μm，Milipore)净化。PC3细胞的上清液称为肿瘤条件培养基(TCM)。

1-6.流式细胞计数分析

THP-1细胞通过与100nM PMA孵育24h分化为巨噬细胞，并通过与20ng/ml IL-4和20ng/ml IL-13一起孵育72h在M2巨噬细胞中极化。用50nM TAMpep和TAMpep或Mpep的片段和与FITC缀合的Mpep的丙氨酸文库处理极化的细胞1h。为了测试黑素瘤组织中巨噬细胞群的变化，在通过DNase I(1U/mL)和胶原酶D(1mg/ml)解离后，通过40μm尼龙网筛过滤器从肿瘤组织中分离出单细胞。用BD FACSCalibur和BD FACSCantoII仪器检测细胞并通过FlowJo软件进行分析。

1-7.细胞存活力测试

THP-1细胞通过与100nM PMA孵育24h分化为巨噬细胞，并通过与20ng/ml IL-4和20ng/ml IL-13一起孵育72h在M2巨噬细胞中极化。将极化细胞用浓度递增的TAMpep和TAMpep片段(0.05-20μM)处理24h。使用CCK-8测定法分析细胞活力：向每个孔中加入CCK-8试剂(Enzo Life Sciences)；持续孵育2小时，用微量板读数器(Molecular Devices)在450nm测量吸光度。

1-8.溶血活性测定

将小鼠血液样本收集在含有肝素作为抗凝剂的试管中，并在使用前在4℃储存。将全血样品以1,500× g离心5min，然后从样品中去除所得血浆部分。用等体积的盐水洗涤沉淀，倒置混合。将离心和洗涤步骤重复5次。通过血细胞计数器计数红细胞并调整至-5×10⁷个细胞/mL。然后将红细胞在37℃在1％Triton X-100(阳性对照)、PBS(空白)中孵育1h，或评估增加浓度的TAMpep和Mpep(0.1-50μM)。然后将样品以10,000g离心5min，将上清液与沉淀分离，并在570nm测量其吸光度。将与用1％Triton X-100处理的混悬液相比的相对光密度定义为溶血百分比。

1-9.ELISA测定

为了测试人类巨噬细胞的极化，将THP-1细胞以2 ×10⁵个细胞/孔接种在24孔板(Corning Inc)的培养基中，并与100nM PMA一起孵育24h。通过在M1巨噬细胞中与20ng/ml的IFN-γ和100ng/ml的LPS一起孵育和通过在M2巨噬细胞中与20ng/ml的IL-4和20ng/ml的IL-13一起孵育使巨噬细胞极化。分化后，收集巨噬细胞的上清液。根据制造商的说明(BDBiosciences Inc.)，通过ELISA试剂盒测量M2巨噬细胞的标志物如IL-10和TGF-β，以及M1巨噬细胞的标志物如IL-12和CXCL10。

1-10.免疫荧光测定

将THP-1细胞接种在24-孔板的盖玻片上，并分化为M0、M1和M2巨噬细胞。用1μMTAMpepK和MpepK处理细胞1h，并在去除肽后孵育24h。洗涤细胞，用4％多聚甲醛在-20℃下固定10分钟，并且用0.1％正常山羊血清封闭1小时。然后将盖玻片与抗半胱天冬酶-3抗体(1:50，家兔多克隆，Abcam)在4℃孵育过夜，然后洗涤并且用Alexa 594标记的山羊抗-家兔IgG(1:500，Invitrogen)在37℃下染色1hr。将盖玻片固定在具有DAPI的Vectashield固定培养基(Vector Laboratories)中以可视化细胞核。用荧光显微镜(Leica)拍摄图像。

1-11.实时定量PCR

使用Easy-Blue试剂提取总RNA。通过用分光光度计测量260和280nm处的吸光度来确定和量化RNA的浓度。使用Maxime RT PreMix试剂盒(iNtRON)从总RNA合成互补DNA(cDNA)。使用SYBR Green Master Mix进行实时PCR分析。PCR条件为45个循环的95℃ 5min、然后95℃ 10秒、60℃ 10秒和72℃10秒。一式三份定量mRNA表达。使用CFX软件(Bio-Rad)测量数据。GAPDH和β-肌动蛋白用作内部对照。

1-12.蛋白质印迹分析

收获细胞，并且在PRO-PREP蛋白质提取溶液(iNtRON,Bio Inc,Sungnam,Korea)中裂解。用Bradford蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad,Richmond,CA,USA)测量蛋白质浓度。通过10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将它们与作为一抗的抗精氨酸酶1、抗CD206、抗半胱天冬酶3、抗E-钙粘蛋白、抗纤连蛋白、抗PCNA、抗TGF-β、抗MMP9和抗β-肌动蛋白抗体一起孵育。山羊抗家兔辣根过氧化物酶缀合的IgG或山羊抗小鼠辣根过氧化物酶缀合的IgG(Abcam，Cambridge，MA，USA)用作二抗。用化学发光试剂盒(SurModics)检测蛋白质条带。

1-13.伤口愈合试验

用伤口愈合试验评估前列腺癌和黑素瘤细胞的迁移。将PC3和Sk-Mel-28细胞以2×10⁵个细胞/孔接种在24-孔板中，并在含有10％FBS的RPMI1640中培养。当细胞达到汇合时，通过用无菌微量移液器尖端刮过孔的表面使它们受伤。即刻洗涤细胞，用无血清培养基或20％M0、M1、M2和M-TCM的条件培养基填充各孔，并孵育24小时。在孵育前后，使用倒置显微镜(Olympus)对每个样品的受伤区域的至少五个不同视野进行拍照。使用ImageJ软件(NCI,Bethesda,MD,USA)测量伤口面积。将通过细胞迁移填充的每个受伤区域的百分比计算为：(平均受伤宽度-平均剩余宽度)/平均受伤宽度×100。

1-14.侵袭测定

根据少量修改的制造商的侵袭试验说明书(Corning Inc.)测试用巨噬细胞的条件培养基处理的前列腺癌细胞的侵袭性。简言之，使用配有用基质胶(200-300μg/mL)预涂覆的聚碳酸酯8-μm孔膜插件(Corning Inc.)的24孔板在37℃下评估侵袭性2小时。给下排孔填充350μL无血清RPMI1640培养基或20％条件培养基(M0、M1、M2和M-TCM的条件培养基，不含或含TAMpepK或MpepK)。给上排孔填充无血清培养基中的200μL PC3细胞(5× 10⁴细胞/孔)。将板孵育24小时。然后将细胞固定在甲醇中并用吉姆萨染色。在光学显微镜(Olympus)下对每个膜随机选择的五个视野进行计数。根据与没有条件培养基的对照相比响应于条件培养基的迁移的细胞数计算侵袭指数。

1-15.H&E染色

将肺纤维化小鼠模型的肺组织固定在10％中性缓冲福尔马林中并包埋在石蜡中。将石蜡包埋的组织样本切成5-μm切片，然后脱石蜡，用H&E染色以研究肺组织纤维化程度。使用标准光学显微镜(Olympus)随机检查和评估切片。

实施例2.结果

2-1.THP-1衍生的巨噬细胞的极化

为了极化为M1或M2巨噬细胞，对于M0巨噬细胞，将THP-1细胞用PMA处理，然后对于M1巨噬细胞，与LPS和IFN-γ一起孵育，对于M2巨噬细胞，与IL-4和IL-13一起孵育。巨噬细胞的极化通过M1标志物(如IL-12、CXCL10和CD86)和M2标志物(如IL-10、TGF-β、精氨酸酶1和CD206)进行评估。与M0相比，LPS和IFN-γ处理的巨噬细胞显示M1标志物增加(图1D、1E和1F)，而用IL-4和IL-13处理的巨噬细胞显示M2标志物增加(图1A、1B、1C和1F)。

因此，极化的巨噬细胞可以用于进一步研究，其评估TAMpepK或MpepK靶向M2巨噬细胞的功效。

2-2.TAMpep片段在THP-1衍生的M2巨噬细胞中的亲和力

为了确定TAMpep与M2巨噬细胞结合的主要氨基位点，通过在THP-1衍生的M2巨噬细胞中使用与FITC缀合的TAMpep和TAMpep片段(氨基酸序列，图2A)进行亲和力测试。在M2巨噬细胞中，TAMpep(包括26个氨基酸)显示出超过90％的高亲和力，而Mpep(从C末端去除7个氨基酸)显示出超过45％的第二高的亲和力。另一方面，与26个氨基酸的乱序的肽相比，TAMpep的片段(从C末端去除超过10个氨基酸或从N末端去除超过4个氨基酸)显示出低亲和力(图2B和2C)。因此，这些结果表明，N末端的4-6个氨基酸是TAMpep对M2巨噬细胞的亲和力中起关键作用的氨基位点。

2-3.TAMpep片段在THP-1衍生的M2巨噬细胞中的细胞毒性

26个氨基酸的TAMpep具有细胞毒性，并且当用作药物载体时会对正常细胞或组织产生副作用。因此，需要一种对M2巨噬细胞具有高亲和力和低细胞毒性特征的新序列肽。在THP-1衍生的M2巨噬细胞的细胞毒性试验中测试了各种TAMpep片段。TAMpep显示出0.815μMIC50的高细胞毒性值，而其他肽片段在M2巨噬细胞中未显示出细胞毒性作用(图3A-3C)。特别地，Mpep在M2巨噬细胞中显示出高亲和力和低细胞毒性，因此预期它可以成为最佳的药物载体。

2-4.TAMpep和Mpep的溶血

溶血作用会引起严重的副作用，并且是限制药物剂量的因素之一。为确定TAMpep和Mpep的溶血作用，在小鼠RBC中以递增浓度(0.1-50μM)处理肽。TAMpep显示IC50为6.669μM，而Mpep显示IC50为>50μM(图4A和4B)。此外，与dKLA缀合的TAMpep和Mpep显示IC50分别为1.122μM和>50μM(图4C和4D)。因此，可以将Mpep开发为更少副作用的安全药物。

2-5.TAMpep和Mpep在THP-1衍生的巨噬细胞中的亲和力

为了比较TAMpep和Mpep在巨噬细胞亚型中是否更特异性地粘附于M2巨噬细胞，用从THP-1细胞极化的M0、M1和M2巨噬细胞处理与FITC缀合的肽，并通过FAC进行分析。与M0和M1巨噬细胞相比，TAMpep和Mpep在M2巨噬细胞中显示出显著更高的亲和力(图5A和5B)。此外，通过免疫荧光显微镜检查，TAMpep在M2巨噬细胞中显示出高亲和力(图5C)。

2-6.TAMpepK和MpepK在THP-1衍生的巨噬细胞中的细胞毒性

为了评估TAMpep和Mpep缀合的dKLA是否诱导选择性细胞凋亡，用递增浓度的TAMpepK或MpepK(0.01-10μM)处理M2巨噬细胞。作为结果，与M0和M1巨噬细胞相比，TAMpepK和MpepK诱导M2巨噬细胞中的细胞凋亡(图6A和6B)。此外，与其他亚型巨噬细胞相比，与细胞凋亡相关的半胱天冬酶-3在M2巨噬细胞中的表达增加(图6C和6D)。

2-7.在THP-1衍生的巨噬细胞中通过丙氨酸文库对Mpep的亲和力影响

为了找到对Mpep在M2巨噬细胞中的粘附能力重要的关键氨基酸序列，使用丙氨酸替代的Mpep文库。在M2巨噬细胞中，当第3位T(苏氨酸)、第6位L(亮氨酸)、第9位L(亮氨酸)、第12位W(色氨酸)、第13位I(异亮氨酸)、第16位K(赖氨酸)和第17位R(精氨酸)上被丙氨酸替代时，肽的亲和力降低。此外，在肽(A13-16和A05)中替代第6位L(亮氨酸)至第9位L(亮氨酸)和第3位T(苏氨酸)、第15位K(赖氨酸)、第16位R(精氨酸)、第17位K(赖氨酸)和第19位Q(谷氨酰胺)时，肽的亲和力降低。另一方面，替代第2位L(亮氨酸)和第11位S(丝氨酸)的肽(A9和A18)在M2巨噬细胞中显示出增加的亲和力(图7A-7E)。

2-8.TAMpepK在M2巨噬细胞和人黑素瘤细胞中的细胞毒性

为了确定TAMpepK是否比黑素瘤细胞诱导更多的细胞凋亡和与M2巨噬细胞的结合，用TAMpep(图8A)或TAMpepK(图8C)处理THP-1衍生的M2巨噬细胞和Sk-Mel-28细胞。与黑素瘤细胞(IC50:3.583μM)相比，TAMpepK在M2巨噬细胞中的IC50值(1.055μM)较低，并且与黑素瘤细胞相比，M2巨噬细胞中半胱天冬酶-3的表达也增加(图8C)。因此，这些发现表明TAMpep选择性地与M2巨噬细胞结合并诱导细胞凋亡。

2-9.用TAMpepK处理的M2巨噬细胞的条件培养基对黑素瘤细胞的增殖和迁移影响

为了测试TAMpepK是否抑制由M2巨噬细胞诱导的黑素瘤细胞的增殖和迁移，制备不使用或使用TAMpepK(1μM)预处理的M0、M1和M2巨噬细胞的条件培养基以及在黑素瘤细胞中处理的条件培养基。M2巨噬细胞的条件培养基增加了黑素瘤细胞的增殖，而用TAMpepK预处理的M2巨噬细胞的条件培养基抑制黑素瘤细胞的增殖(图9A)。此外，用TAMpepK预处理的M2巨噬细胞的条件培养基抑制黑素瘤细胞的迁移，但M2巨噬细胞的条件培养基增加了迁移(图9B和9C)。因此，TAMpepK通过诱导M2巨噬细胞凋亡来抑制黑素瘤细胞的增殖和迁移。

2-10.TAMpepK在黑素瘤小鼠模型中的抗癌作用

为了评估TAMpepK在体内的抗癌作用，将鼠黑色素瘤细胞(B16F10细胞系)通过皮下注射到C57BL6J小鼠的右腹侧，并在一周后每隔3天通过腹膜内注射一次TAMpepK。与PBS组相比，TAMpepK治疗的小鼠显示肿瘤体积和重量显著减小(图10A、10C和10D)。另一方面，小鼠的体重在PBS和TAMpepK组之间无显著性改变(图10B)。

2-11.靶向M2样TAM的TAMpepK在黑素瘤小鼠模型中的作用

为了确定TAMpepK是否减少黑素瘤小鼠模型中的M2样TAM，从肿瘤组织中分离出巨噬细胞并通过FACS进行分析。与PBS组相比，TAMpepK组中的M2样TAM(F4.80+和CD206+细胞)显著减少。然而，M1样TAM(F4/80+和CD86+细胞)在PBS和TAMpepK组之间没有变化(图11A和11B)。此外，通过M1/M2比率分析了肿瘤微环境的变化。与PBS组相比，TAMpepK组通过减少M2巨噬细胞而增加M1巨噬细胞的比例(图11C)。因此，这些发现表明TAMpepK通过在黑素瘤模型中靶向M2样TAM而具有抗癌作用。

2-12.TAMpepK和MpepK在黑素瘤小鼠模型中的抗癌作用

TAMpepK的抗癌作用显示在上述结果中。本研究旨在确定MpepK在黑素瘤模型中的抗癌作用。肿瘤照片如图12A中所示。与PBS组相比，TAMpepK和MpepK组中的肿瘤体积(图12C)和重量(图12B)均减小，并且MpepK组的存活率(图12D)延长。

2-13.靶向M2样TAM的TAMpepK和MpepK在黑素瘤小鼠模型中的作用

为了确定MpepK是否诱导黑素瘤中肿瘤微环境的变化，通过FACS分析巨噬细胞的M1/M2比率和CD8耗竭。与PBS组相比，TAMpepK和MpepK组中M2样TAM(F4.80+和CD206+细胞)减少。然而，M1样TAM(F4/80+和CD86+细胞)在所有组中未显示变化(图13A和13B)。与PBS组相比，TAMpepK和MpepK组中M1/M2比率显著增加(图13C)。此外，与PBS组相比，TAMpepK和MpepK组中CD8⁺T细胞的耗竭标志物如PD-1和LAG3显著减少(图13D和13E)。因此，这些发现表明，MpepK通过在黑素瘤模型中靶向M2样TAM而具有抗癌作用。

2-14.前列腺肿瘤细胞条件培养基(TCM)对THP-1衍生的M2巨噬细胞的分化

为了确定前列腺癌细胞的条件培养基(TCM)对M2巨噬细胞的极化，将THP-1衍生的巨噬细胞与TCM一起孵育。与M0巨噬细胞相比，TCM-处理的巨噬细胞显示M2标志物如精氨酸酶1、CD206和CD163的mRNA表达增加，而M1标志物如NOS2和CCR7的mRNA表达降低(图14A和14B)。因此，本研究显示在前列腺癌的肿瘤微环境中诱导极化为M2样TAM。

2-15.M2巨噬细胞的条件培养基对前列腺癌细胞的增殖和迁移影响

如图15A-15C所示，THP-1衍生的M2巨噬细胞增加癌细胞的增殖和迁移。测试了由TCM极化的M2巨噬细胞诱导前列腺癌细胞的增殖和迁移。用TCM处理的巨噬细胞条件培养基(M-TCM)增加前列腺癌细胞的增殖(图15A)和迁移(图15B和15C)，与THP-1衍生的M2巨噬细胞的条件培养基类似(图15A-15C)。

2-16.使用TAMpepK或MpepK的巨噬细胞的细胞存活率

如上述结果所示，TAMpepK和MpepK诱导M2巨噬细胞凋亡。为了评估TAMpepK和MpepK是否降低由TCM分化的M2巨噬细胞的细胞活力，用TAMpepK和MpepK(1μM)处理THP-1衍生的巨噬细胞。TAMpepK和MpepK在TCM处理的巨噬细胞中诱导细胞凋亡，类似于M2巨噬细胞(图16B)。因此，该结果显示TAMpepK和MpepK靶向M2巨噬细胞和由TCM诱导的巨噬细胞。

2-17.用TAMpepK和MpepK处理的M2巨噬细胞的条件培养基对前列腺癌细胞的增殖和迁移影响

由TCM诱导的M2巨噬细胞和M2样TAM的条件培养基增加了前列腺癌细胞(PC3细胞)的增殖和迁移。然而，与M2巨噬细胞或M2样TAM组相比，用TAMpepK和MpepK预处理的M2巨噬细胞和M2样TAM的条件培养基显著降低了PC3细胞的增殖(图17A)和迁移(图17B和17C)。

2-18.用TAMpepK和MpepK处理的M2巨噬细胞的条件培养基对前列腺癌细胞的侵袭影响

为了确定TAMpepK和MpepK抑制前列腺癌细胞的侵袭，用巨噬细胞条件培养基处理PC3细胞。由TCM诱导的M2巨噬细胞和M2样TAM的条件培养基增加了PC3细胞的侵袭。然而，与M2巨噬细胞或M2样TAM组相比，用TAMpepK和MpepK预处理的M2巨噬细胞和M2样TAM的条件培养基显著降低了PC3细胞的侵袭(图18A和18B)。

2-19.TAMpepK和MpepK在前列腺癌小鼠模型中的作用

为了评估TAMpepK和MpepK在前列腺癌模型中的抗癌作用，将TRAMP-C2细胞通过皮下注射到C57BL6J小鼠的右腹侧，并在一周后每隔3天一次通过腹膜内注射TAMpep、dKLA、TAMpepK和MpepK。与PBS组相比，TAMpepK和MpepK治疗的小鼠显示肿瘤体积和重量显著降低(图19B、19C、19E和19F)。另一方面，所有组之间的小鼠体重无显著变化(图19D)。

2-20.TAMpepK和MpepK在前列腺癌模型的增殖和EMT中的作用

为了确定TAMpepK和MpepK在前列腺癌模型的肿瘤生长和EMT中的抗癌作用，测量了肿瘤组织中PCNA作为增殖标志物和E-钙粘蛋白、波形蛋白、纤连蛋白、TGF-β和MMP9作为EMT(上皮-间充质细胞转换)标志物的表达。TAMpepK和MpepK组中PCNA的表达降低(图20C和20D)。在EMT标志物中，称作上皮细胞标志物的E-钙粘蛋白在TAMpepK和MpepK组中增加(图20A和20D)，而作为间充质标志物的波形蛋白和纤连蛋白在TAMpepK和MpepK组中减少(图20B和20D)。此外，在TAMpepK和MpepK组中，与EMT相关的TGF-β和MMP9的表达也降低(图20D)。因此，这些发现表明TAMpepK和MpepK通过抑制前列腺癌中靶向M2样TAM的肿瘤生长和转移而具有抗癌作用。

2-21.TAMpepK和MpepK在结肠癌模型中的抗癌作用

为了确定TAMpepK和MpepK在结肠癌模型的肿瘤生长中的抗癌作用，测量了肿瘤组织的体积和重量。与PBS组相比，用TAMpepK和MpepK治疗的小鼠显示肿瘤体积和重量显著减小，而MpepK中的肿瘤重量无显著变化(图21A-21E)。

2-22.MpepK在肺纤维化的小鼠模型中的作用

为了确定MpepK是否具有抑制肺纤维化的治疗作用，通过气管内施用博来霉素建立了肺纤维化小鼠模型。MpepK可减少博来霉素诱导的肺纤维化(图22B)。此外，与PBS相比，MpepK中与纤维化相关的基因表达例如fosl2、1型胶原蛋白和1型纤连蛋白显著降低(图22C)。

2-23.TAMpepK和MpepK在乳腺癌小鼠模型中的作用

为了确定TAMpepK和MpepK在乳腺癌中的抗癌作用，建立了第4乳腺癌原位小鼠模型。与PBS组相比，TAMpepK和MpepK显示出肿瘤体积和重量减小(图23B-23D)。此外，与PBS相比，MpepK中称作M2巨噬细胞标志物的精氨酸酶1的基因表达显著降低(图23E)。此外，与PBS组相比，MpepK组中的肺转移减少(图24A-24C)。

实施例3.材料和方法

3-1.肽合成

根据实施例1中所述的上述方法合成下列肽：

TAMpep：全长蜂毒肽(SEQ ID NO:1)；

Mpep：前7个氨基酸被去除的全长蜂毒肽(SEQ ID NO:2)；

A12：Mpep的第5位G(甘氨酸)被丙氨酸替代(SEQ ID NO:16)；

A14:Mpep的第7位P(脯氨酸)被丙氨酸替代(SEQ ID NO:18)；

A17:Mpep的第10位I(异亮氨酸)被丙氨酸替代(SEQ ID NO:20)；

A18:Mpep的第11位S(丝氨酸)被丙氨酸替代(SEQ ID NO:21)；

A22:Mpep的第15位R(精氨酸)被丙氨酸替代(SEQ ID NO:25)；

A25:Mpep的第18位Q(谷氨酰胺)被丙氨酸替代(SEQ ID NO:28)；

A26:Mpep的第19位Q(谷氨酰胺)被丙氨酸替代(SEQ ID NO:29)；

TAMpepK:连接至接头(GGGGS)；(SEQ ID NO:36)的全长蜂毒肽(SEQ ID NO:1)，所述接头连接至d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys(dKLA)(SEQ ID NO:47)；

MpepK：连接至接头(GGGS)(SEQ ID NO:36)的Mpep(SEQ ID NO:2)，所述接头连接至d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys(dKLA)(SEQ ID NO:47)；

A12K：连接至接头(GGGS)(SEQ ID NO:36)的A12(SEQ ID NO:16)，所述接头连接至d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys(dKLA)(SEQ ID NO:47)；

A14K：连接至接头(GGGS)(SEQ ID NO:36)的A13(SEQ ID NO:18)，所述接头连接至d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys(dKLA)(SEQ ID NO:47)；

A17K：连接至接头(GGGS)(SEQ ID NO:36)的A17(SEQ ID NO:20)，所述接头连接至d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys(dKLA)(SEQ ID NO:47)；

A18K：连接至接头(GGGS)(SEQ ID NO:36)的A18(SEQ ID NO:21)，所述接头连接至d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys(dKLA)(SEQ ID NO:47)；

A22K：连接至接头(GGGS)(SEQ ID NO:36)的A22(SEQ ID NO:25)，所述接头连接至d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys(dKLA)(SEQ ID NO:47)；

A25K：连接至接头(GGGS)(SEQ ID NO:36)的A25(SEQ ID NO:28)，所述接头连接至d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys(dKLA)(SEQ ID NO:47)；和

A26K：连接至接头(GGGS)(SEQ ID NO:36)的A26(SEQ ID NO:29)，所述接头连接至d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys-d-Leu-d-Ala-d-Lys(dKLA)(SEQ ID NO:47)。

3-2.巨噬细胞分化

THP-1单核细胞通过与100nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA,Sigma)一起孵育24h，然后在RPMI培养基(Invitrogen)中孵育24h分化为巨噬细胞(M0)。通过与20ng/ml的IFN-γ(Prospec)和100ng/ml的LPS(Sigma)一起孵育，巨噬细胞在M1巨噬细胞(M1)中被极化。通过与20ng/ml白细胞介素(IL)4(Prospec)和20ng/ml白细胞介素13(Prospec)一起孵育，获得巨噬细胞M2极化(M2)。

3-3.细胞活力测试

用1.5μM MpepK、A12K、A14K、A17K、A18K、A22K、A25K或A26K肽处理极化的细胞1小时，并且在RPMI1640生长培养基中进一步孵育24小时。使用CCK-8测定法分析细胞存活力：向每个孔中加入CCK-8试剂(Enzo Life Sciences)；持续孵育2小时，并且用微量板读数器(Molecular Devices)在450nm处测量吸光度。

3-4.A26K在体外脓毒症模型LPS-刺激的M1(LPS-M1)巨噬细胞中的细胞毒性

用100nM PMA(M0)使THP 1细胞(1x10⁴细胞/孔)24h分化成巨噬细胞，并通过IFN-γ(20ng/ml)和LPS(100ng/ml)的处理极化成典型的M1巨噬细胞，且通过LPS(1μg/ml)处理24h诱导LPS-刺激的巨噬细胞(LPS-M1)。用1.5μMA26K处理细胞1小时，并且在RPMI1640生长培养基中进一步孵育24小时。使用CCK-8测定法分析细胞存活力。每孔加入CCK-8试剂，并且孵育1.5-2小时。用微量板读数器在450nm处测量吸光度。

3-5.A26K处理在LPS-M1巨噬细胞中的作用

用100nM PMA(M0)使THP 1细胞(1x10⁵细胞/孔)24h分化成巨噬细胞，并通过IFN-γ(20ng/ml)和LPS(100ng/ml)的处理极化成典型的M1巨噬细胞，且通过LPS(1μg/ml)处理2h诱导LPS-M1巨噬细胞。用1.5μM A26K处理极化的细胞1小时，并且在RPMI1640生长培养基中进一步孵育24小时。通过实时定量PCR来量化促炎基因(IL-8、TNF-α、NF-kB、IL-1β和CXCL10)的表达水平。

3-6.肺纤维化体外模型-细胞

THP-1细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，根据其具体说明书使用补充有未经热处理的10％胎牛血清(FBS；WelGENE)、2mM L-谷氨酰胺、0.05mMβ-巯基乙醇、10mMHEPES、4500mg/L葡萄糖、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Gibco)的RPMI 1640培养基进行培养。将从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的人肺泡细胞A549细胞在包含2.05mML-谷氨酰胺、2g/L碳酸氢钠和2g/L葡萄糖(WelGENE)与10％FBS(WelGENE)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Gibco)的RPMI 1640培养基中培养。将细胞在37℃在5％CO₂加湿温育箱中培养，以达到80％的汇合率。

3-7.肺纤维化体外模型-巨噬细胞分化

THP-1细胞通过与100nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA,Sigma)孵育24h，然后在RPMI培养基(Invtrogen)中孵育24h分化成巨噬细胞。通过与20ng/ml白细胞介素(IL)-4(Prospec)和20ng/ml白细胞介素13(Prospec)一起孵育获得巨噬细胞M2极化(M2)。

3-8.肺纤维化体外模型-培养的细胞和共培养物的处理

使用带有合并6孔板的聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜的Transwell悬浮培养室(Corning 3450；Corning,Inc.,Corning,NY,USA)建立THP-1和A549细胞的无接触式共培养系统。将6孔板中1x10⁵个细胞/ml的A549细胞在包含TGF-β1(5ng/ml)的培养基中培养48h以在体外诱导EMT或FMT。将MpepK、A17K或A22K同步使用以观察对所处理细胞的介入作用。将THP-1细胞以1x10⁵个细胞/ml接种，暴露于20ng/ml IL-4和20ng/ml IL-13 48小时以诱导M2-。还用1.5μM MpepK、A17K和A22K处理一些细胞。为了建立与M2样巨噬细胞的共培养物，我们将包含IL-4和IL-13预处理的巨噬细胞的细胞培养插入物转移到已接种A549细胞(5×10⁴个细胞/ml)的板中培养24h。共培养48h后，收集板底部的细胞用于进一步实验。

3-9.肺纤维化体外模型-实时定量PCR

使用Easy-Blue试剂提取总RNA。通过用分光光度计测量260和280nm处的吸光度来确定和量化RNA的浓度。使用Maxime RT PreMix试剂盒(iNtRON)从总RNA合成互补DNA(cDNA)。使用SYBR Green Master Mix进行实时PCR分析。PCR条件为45个循环的95℃ 5min、然后95℃ 10秒、60℃ 10秒和72℃10秒。一式三份定量mRNA表达。使用CFX软件(Bio-Rad)测量数据。GAPDH用作内部对照。

3-10.MpepK在肝细胞癌小鼠模型中的抗癌作用

C57BL/6(B6)野生型小鼠购自DBL。对于肝细胞癌的皮下肿瘤模型，将Hepa1-6细胞与基质胶基质(Corning)混合并通过皮下接种到小鼠的右腹侧(4×10⁵个细胞/小鼠)。从肿瘤接种后第12天开始，每隔3天通过腹膜内注射一次MpepK肽(100、200和400nmol/kg)，并通过电子卡尺测量肿瘤体积。将所有动物维持在一个特定的无病原体环境中，进行12小时的光/暗循环，自由获取食物和水。实验结束后，使用异氟烷和颈椎脱臼法对所有小鼠实施安乐死。

实施例4.结果

4-1.对M2-型、M1-型和/或M0型巨噬细胞的选择性的多肽的细胞毒性

在丙氨酸替代的Mpep中，与M2巨噬细胞相比，一些肽显示在M1巨噬细胞中的亲和力相对增加，或者与M1或M2巨噬细胞相比，在M0巨噬细胞中的亲和力相对增加(图7A)。为了评估增加的亲和力是否影响在M0或M1或M2巨噬细胞中的选择性细胞毒性，在M0、M1和M2巨噬细胞中处理1.5μMMpepK、A12K、A14K、A17K、A18K、A22K、A25K或A26K肽并使用CCK-8测定法测量细胞存活力。作为结果，与对照M1巨噬细胞相比，A26K肽仅在M1巨噬细胞中显示出显著的选择性细胞毒性作用(与对照M1巨噬细胞相比，^***p<0.001)，而A12K、A14K和A18K肽在M0、M1和M2巨噬细胞中没有显示出选择性细胞毒性(图25A)。A17K、A22K和A25K在M2巨噬细胞中显示出与MpepK相似的显著的细胞毒作用(与对照M2巨噬细胞相比，^*p<0.05)，但在M0和M1巨噬细胞中未显示该作用(图25B)。当用递增浓度的A26K(0.01-10μM)处理M0、M1和M2巨噬细胞时，A26K肽在M1巨噬细胞中的IC₅₀显示为1.192μM(图25C)。

4-2.A26K在体外脓毒症模型LPS-刺激的M1(LPS-M1)巨噬细胞中的细胞毒性和作用

脓毒症是对微生物病原体感染的全身炎症反应。LPS是革兰氏阴性菌外膜的组成部分，并且在体内和体外诱导单核细胞和巨噬细胞的多种炎症反应。因此，LPS介导的炎症反应是暴露于革兰氏阴性菌感染的主要炎症来源，并且与脓毒症密切相关。为了检查A26K在LPS-M1巨噬细胞中的细胞毒性，用1.5μM的A26K处理M0、M1和LPS-M1巨噬细胞。作为结果，A26K在LPS-M1巨噬细胞(37％抑制率，与对照相比，^*p<0.05)和M1巨噬细胞(53％抑制率，与对照相比，^*p<0.05)中显示出显著的细胞毒作用(图26A)。为了进一步检查促炎基因的表达水平，用1.5μM A26K处理M0、M1和LPS-M1巨噬细胞1小时。与M0巨噬细胞相比，LPS(1μg/ml)刺激显著增加了IL8、TNFα、IL-1β、NF-kB和CXCL10的表达(与M0巨噬细胞相比，^*p<0.05或^**p<0.01或^***p<0.001，图26B)。然而，A26K处理显著抑制通过LPS刺激的IL8、TNF-α、IL-1β、NF-kB和CXCL10的增强的表达水平(与LPS-M1巨噬细胞相比，^#p<0.05或^##p<0.01或^###p<0.001，图26B)。这些结果表明，A26K处理显著抑制了LPS诱导的体外脓毒症模型的M1巨噬细胞的活化。因此，A26K治疗可以通过抑制M1巨噬细胞来控制早期过度炎症反应，并且可以作为脓毒症重要且有效的治疗方法。

4-3.A17K或A22K在体外肺纤维化模型，即与IL-4和IL-13诱导的THP-1巨噬细胞共培养的TGF-β1-诱导的A549细胞中的作用

为了研究A17K或A22K治疗对上皮间充质转化(EMT)和成纤维细胞向肌成纤维细胞转化(FMT)反应的影响，我们在A549细胞中的TGF-β1诱导的间充质特征或纤维化标志物存在下培养了A549(通常用作人肺泡II型肺上皮的模型)。使用相差显微镜(以200倍放大率显示)对形态变化进行成像。我们在A549细胞中诱导EMT，其是最普遍的人肺泡上皮II型细胞系，其中用TGF-β1处理48h。使用细胞共培养系统，将TGF-β1诱导的A549细胞与IL-4和IL-13诱导的THP-1巨噬细胞共培养。清楚地检测到A549的形态学改变，从椭圆形上皮细胞变为梭形成纤维细胞样细胞。A17K或A22K干预显著阻断了与IL-4和IL-13诱导的巨噬细胞共培养的A549细胞中EMT的纺锤样间充质形态表型(图27A)。与单独的M2巨噬细胞相比，A17K或A22K处理显著增强了A549细胞中EMT抑制标志物E-钙粘蛋白的表达并降低了FMT增强标志物α-SMA的表达(与M2巨噬细胞相比，^#p<0.05或^##p<0.01或^###p<0.001)。然而，当与THP-1的M2极化共培养时，MpepK对这些上皮细胞的EMT和FMT无显著抑制作用(图27A和27B)。这些结果表明，A17K或A22K对肺纤维化的抑制作用比MpepK更好，并且应当是对肺纤维化的更好治疗剂。

4-4.MpepK在肝细胞癌的小鼠模型中的抗癌作用

为评估MpepK的体内抗癌作用，将小鼠hepa1-6细胞皮下注射到C57BL/6J小鼠的右腹侧。细胞接种后12天，每隔3天通过腹膜内注射一次MpepK(图28A)。作为结果，各组之间的体重变化无显著性差异(图28B)。另一方面，与PBS组相比，所有剂量(100、200和400nmol/kg)的MpepK治疗的小鼠肿瘤体积显著减小，并且与PBS组相比，MpepK组(100、200和400nmol/kg)中的存活率显著延长(与PBS组相比，^*p<0.05或^**p<0.01或^***p<0.001，图28C和28D)。

具体实施方案的上述描述将充分地揭示本发明的一般性质，以至于其他人可以通过应用本领域技术人员的知识方便地修改和/或适应各种应用，且不背离本发明的一般概念。因此，基于本文所呈现的教导和指导，这类修改和适应被涵盖于所公开实施方案的等效方案的含义和范围内。应当理解，本文中的措辞或术语是出于描述而非限制的目的，因此本说明书的术语或措辞将由本领域技术人员根据所述教导和指导来解释。

本文的广度和范围不应受到任何上述示例性实施方案限制，而应当仅根据以下权利要求及其等效方案来定义。

本文所述的所有各个方面、实施方案和选项可以任何和所有变化形式组合。

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地通过引用并入本文的程度相同。

Claims (34)

1.包含X1-X2-Thr-X4-Gly-Leu-X7-Ala-Leu-Ile-X11-Trp-Ile-X14-Arg-Lys-Arg-X18-X19(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的多肽，其中X1是除缬氨酸以外的氨基酸，X2是除亮氨酸以外的氨基酸，X4是除苏氨酸以外的氨基酸，X7是除脯氨酸以外的氨基酸，X11是除丝氨酸以外的氨基酸，X14是除赖氨酸以外的氨基酸，X18是除谷氨酰胺以外的氨基酸，和/或X19是除谷氨酰胺以外的氨基酸。

2.权利要求1的多肽，其中X1为丙氨酸(SEQ ID NO:4)。

3.权利要求1的多肽，其中X2为丙氨酸(SEQ ID NO:5)。

4.权利要求1的多肽，其中X4为丙氨酸(SEQ ID NO:6)。

5.权利要求1的多肽，其中X7为丙氨酸(SEQ ID NO:7).

6.权利要求1的多肽，其中X11为丙氨酸(SEQ ID NO:8)。

7.权利要求1的多肽，其中X14为丙氨酸(SEQ ID NO:9)。

8.权利要求1的多肽，其中X18为丙氨酸(SEQ ID NO:10)。

9.权利要求1的多肽，其中X19为丙氨酸(SEQ ID NO:11)。

10.缀合物，其包含权利要求1-9任一项的多肽和第二种治疗药物。

11.权利要求10的缀合物，其中所述第二种治疗药物选自KLA、α-防御素-1、BMAP-28、brevenin-2R、buforin IIb、天蚕素A-爪蟾抗菌肽2(CA-MA-2)、天蚕素A、天蚕素B、chrysophsin-1、D-K6L9、gomesin、乳铁蛋白肽B、LLL27、LTX-315、爪蟾抗菌肽2、爪蟾抗菌肽II铃蟾肽缀合物(MG2B)、pardaxin、多柔比星、甲氨蝶呤、恩替司他、克拉屈滨、普拉曲沙、劳拉替尼、美坦辛DM1、美坦辛DM3、美坦辛DM4、以及它们的组合。

12.权利要求10或11的缀合物，其还包含将所述多肽连接至第二种治疗药物的接头。

13.权利要求12的缀合物，其中所述接头的两端包含选自以下的官能团：碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)、亚氨酸酯、五氟苯基酯、羟甲基膦、马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、硫代磺酸酯、乙烯基砜、EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)、DCC(N,N'-二环己基碳二亚胺)、SATA(琥珀酰亚胺基乙酰基硫代乙酸酯)、磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯)、DMA(己二亚氨酸二甲酯·2HCl)、DMP(庚二亚氨酸二甲酯·2HCl)、DMS(辛二亚氨酸二甲酯·2HCl)、DTBP(3,3’-二硫代双丙酰亚氨酸二甲酯·2HCl)、磺基-SIAB((4-碘乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺基酯)、SIAB((4-碘乙酰基)氨基苯甲酸琥珀酰亚胺基酯)、SBAP(3-(溴乙酰氨基)丙酸琥珀酰亚胺基酯)、SIA(碘乙酸琥珀酰亚胺基酯)、SM(PEG)n(琥珀酰亚胺基-([N-马来酰亚胺基丙酰氨基]-乙二醇酯，其中n＝2、4、6、8、12或24)、SMCC(琥珀酰亚胺基-4-(N-D-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯)、LCSMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰氨基己酸琥珀酰亚胺基酯))、磺基-EMCS(N-ε酯)、EMCS(N-ε磺基-GMBS(N-γ酯)、GMBS(N-γ酯)、磺基-KMUS(N-κ酯)、磺基-MBS(间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N羟基磺基琥珀酰亚胺酯)、MBS(间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N羟基琥珀酰亚胺酯)、磺基-SMPB(4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺基酯)、SMPB(4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺基酯)、AMAS(N-α-马来酰亚胺基-乙酰氧基琥珀酰亚胺酯)、BMPS(N-β-马来酰亚胺基丙氧基琥珀酰亚胺酯)、SMPH(6-[(β-马来酰亚胺基丙酰氨基)己酸琥珀酰亚胺基酯])、PEG12-SPDP(2-吡啶基二硫基-四氧杂十八烷-N-羟基琥珀酰亚胺)、PEG4-SPDP、磺基-LCSPDP(6-[3’-(2-吡啶基二硫基)丙酰氨基]己酸磺基琥珀酰亚胺基酯)、SPDP(3-(2-吡啶基二硫基)丙酸琥珀酰亚胺基酯)、LC-SPDP(6-[3’-(2-吡啶基二硫基)丙酰氨基]己酸琥珀酰亚胺基酯)、SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基α(2-吡啶基二硫基)甲苯)、DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、BS(PEG)5(双(琥珀酰亚胺基)五(乙二醇))、BS(PEG)9(双(琥珀酰亚胺基)九(乙二醇))、BS3(辛二酸双[磺基琥珀酰亚胺基]酯)、BSOCOES(双[2-(琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基)乙基]砜)、PDPH(3-(2-吡啶基二硫基)丙酰肼)、DSG(戊二酸二琥珀酰亚胺酯)、DSP(二硫基双[丙酸琥珀酰亚胺基酯])、BM(PEG)n(1,8-二马来酰亚胺基-乙二醇，n＝2或3)、BMB(1,4-二马来酰亚胺基丁烷)、BMDB(1,4-二马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷)、BMH(二马来酰亚胺基己烷)、BMOE(二马来酰亚胺基乙烷)、DTME(二硫基双马来酰亚胺基乙烷)、TMEA(三(2-马来酰亚胺基乙基)胺)、DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、DST(酒石酸二琥珀酰亚胺酯)、DTSSP(3,3’-二硫代双[丙酸磺基琥珀酰亚胺基酯])、EGS(双[琥珀酸琥珀酰亚胺基酯]乙二醇酯)、磺基-EGS(双[琥珀酸磺基琥珀酰亚胺基酯]乙二醇酯)、TSAT(氨基三乙酸三-琥珀酰亚胺基酯)、DFDNB(1,5-二氟-2,4-二硝基苯)，以及它们的组合。

14.药物组合物，包含权利要求1-13任一项的多肽或缀合物以及药学上可接受的载体。

15.权利要求14的组合物，其中所述多肽的浓度为0.05μg/ml-100μg/ml。

16.权利要求14或15的组合物，其中该组合物为适合于皮下或静脉内施用的剂型。

17.权利要求14或15的组合物，其中该组合物为冻干或包封的形式。

18.在有需要的个体中减少M2-型巨噬细胞或治疗M2-型巨噬细胞介导的疾病的方法，包括向该个体施用权利要求1、2、3、5和6任一项的多肽。

19.权利要求18的方法，其中与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽相比，所述多肽减少M2-型巨噬细胞。

20.权利要求18的方法，其中所述疾病为癌症。

21.权利要求20的方法，其中所述癌症为黑素瘤、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌或在癌症微环境中具有M2型肿瘤相关巨噬细胞的其他实体瘤。

22.权利要求18的方法，其中所述疾病为与纤维化相关的疾病、终末期肝病、肾病、特发性肺纤维化(IPF)、心力衰竭、许多慢性自身免疫性疾病，包括硬皮病、类风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、骨髓纤维化和系统性红斑狼疮、肿瘤侵袭和转移、慢性移植物排斥和许多进行性肌病的发病机制、肝硬化和纤维化、良性前列腺增生或前列腺炎。

23.在有需要的个体中减少M1-型巨噬细胞或治疗M1-型巨噬细胞介导的疾病的方法，包括向该个体施用权利要求1、2、3、5、6和9任一项的多肽。

24.权利要求23的方法，其中与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽相比，所述多肽减少M1-型巨噬细胞。

25.权利要求23的方法，其中所述疾病为慢性炎症性疾病，包括脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(MODS)、特应性皮炎、类风湿性关节炎或自身免疫性疾病。

26.在有需要的个体中减少M0-型巨噬细胞或治疗M0-型巨噬细胞介导的疾病的方法，包括向该个体施用权利要求1-9任一项的多肽。

27.权利要求26的方法，其中与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽相比，所述多肽减少M0-型巨噬细胞。

28.权利要求18-27任一项的方法，其中所述多肽连接至第二种治疗药物。

29.权利要求28的方法，其中所述第二种治疗药物选自KLA、α-防御素-1、BMAP-28、brevenin-2R、buforin IIb、天蚕素A-爪蟾抗菌肽2(CA-MA-2)、天蚕素A、天蚕素B、chrysophsin-1、D-K6L9、gomesin、乳铁蛋白肽B、LLL27、LTX-315、爪蟾抗菌肽2、爪蟾抗菌肽II铃蟾肽缀合物(MG2B)、pardaxin、多柔比星、甲氨蝶呤、恩替司他、克拉屈滨、普拉曲沙、劳拉替尼、美坦辛DM1、美坦辛DM3、美坦辛DM4，以及它们的组合。

30.权利要求18-28任一项的方法，其中所述多肽通过接头连接至所述第二种治疗药物。

31.权利要求30的方法，其中所述接头包括两端上的选自以下的官能团：碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)、亚氨酸酯、五氟苯基酯、羟甲基膦、马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、硫代磺酸酯、乙烯基砜、EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)、DCC(N,N'-二环己基碳二亚胺)、SATA(琥珀酰亚胺基乙酰基硫代乙酸酯)、磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯)、DMA(己二亚氨酸二甲酯·2HCl)、DMP(庚二亚氨酸二甲酯·2HCl)、DMS(辛二亚氨酸二甲酯·2HCl)、DTBP(3,3’-二硫代双丙酰亚氨酸二甲酯·2HCl)、磺基-SIAB((4-碘乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺基酯)、SIAB((4-碘乙酰基)氨基苯甲酸琥珀酰亚胺基酯)、SBAP(3-(溴乙酰氨基)丙酸琥珀酰亚胺基酯)、SIA(碘乙酸琥珀酰亚胺基酯)、SM(PEG)n(琥珀酰亚胺基-([N-马来酰亚胺基丙酰氨基]-乙二醇酯，其中n＝2、4、6、8、12或24)、SMCC(琥珀酰亚胺基-4-(N-D-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯)、LCSMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰氨基己酸琥珀酰亚胺基酯))、磺基-EMCS(N-ε酯)、EMCS(N-ε磺基-GMBS(N-γ酯)、GMBS(N-γ酯)、磺基-KMUS(N-κ酯)、磺基-MBS(间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N羟基磺基琥珀酰亚胺酯)、MBS(间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N羟基琥珀酰亚胺酯)、磺基-SMPB(4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺基酯)、SMPB(4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺基酯)、AMAS(N-α-马来酰亚胺基-乙酰氧基琥珀酰亚胺酯)、BMPS(N-β-马来酰亚胺基丙氧基琥珀酰亚胺酯)、SMPH(6-[(β-马来酰亚胺基丙酰氨基)己酸琥珀酰亚胺基酯])、PEG12-SPDP(2-吡啶基二硫基-四氧杂十八烷-N-羟基琥珀酰亚胺)、PEG4-SPDP、磺基-LCSPDP(6-[3’-(2-吡啶基二硫基)丙酰氨基]己酸磺基琥珀酰亚胺基酯)、SPDP(3-(2-吡啶基二硫基)丙酸琥珀酰亚胺基酯)、LC-SPDP(6-[3’-(2-吡啶基二硫基)丙酰氨基]己酸琥珀酰亚胺基酯)、SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基α(2-吡啶基二硫基)甲苯)、DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、BS(PEG)5(双(琥珀酰亚胺基)五(乙二醇))、BS(PEG)9(双(琥珀酰亚胺基)九(乙二醇))、BS3(辛二酸双[磺基琥珀酰亚胺基]酯)、BSOCOES(双[2-(琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基)乙基]砜)、PDPH(3-(2-吡啶基二硫基)丙酰肼)、DSG(戊二酸二琥珀酰亚胺酯)、DSP(二硫基双[丙酸琥珀酰亚胺基酯])、BM(PEG)n(1,8-二马来酰亚胺基-乙二醇，n＝2或3)、BMB(1,4-二马来酰亚胺基丁烷)、BMDB(1,4-二马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷)、BMH(二马来酰亚胺基己烷)、BMOE(二马来酰亚胺基乙烷)、DTME(二硫基双马来酰亚胺基乙烷)、TMEA(三(2-马来酰亚胺基乙基)胺)、DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、DST(酒石酸二琥珀酰亚胺酯)、DTSSP(3,3’-二硫代双[丙酸磺基琥珀酰亚胺基酯])、EGS(双[琥珀酸琥珀酰亚胺基酯]乙二醇酯)、磺基-EGS(双[琥珀酸磺基琥珀酰亚胺基酯]乙二醇酯)、TSAT(氨基三乙酸三-琥珀酰亚胺基酯)、DFDNB(1,5-二氟-2,4-二硝基苯)，以及它们的组合。

32.权利要求18-31任一项的方法，其中所述多肽的浓度为0.05μg/ml-100μg/ml。

33.权利要求18-32任一项的方法，其中所述多肽通过皮下或静脉内施用。

34.权利要求20的方法，其中所述癌症为肝细胞癌。

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