ES2692815T3 - Derivados de amiloide P sérico y su preparación y uso - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de Amiloide P Sérico (SAP) humano glicosilado recombinante que comprende una cadena de oligosacárido con unión en N, en la que al menos una ramificación de la cadena de oligosacárido termina con un resto de ácido siálico con unión α2,3 y en la que la composición tiene al menos un 50 % menos de restos de ácido siálico con unión α2,6 que el SAP de tipo silvestre aislado de suero humano.

Description

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DESCRIPCION

Derivados de amiloide P serico y su preparacion y uso Antecedentes de la invencion

El amiloide P serico (SAP, por sus siglas en ingles) es un miembro de la familia de protemas de pentraxina. SAP se secreta por el tugado y circula en la sangre como un pentamero estable. La investigacion previa demuestra que SAP tiene un papel importante tanto en la fase de inicio como en la de resolucion de la respuesta inmunitaria. SAP puede unirse a restos de azucar en la superficie de bacterias y de ese modo promueve su opsonizacion y fagocitacion por celulas presentadoras de antigeno. SAP tambien se une a ADN libre y cromatina generados por celulas apoptoticas en la resolucion de una respuesta inmunitaria, impidiendo de este modo una respuesta inflamatoria secundaria contra estos antigenos. Las moleculas a las que se une SAP se eliminan de zonas extracelulares debido a la capacidad de SAP para unirse a los tres receptores de Fcy (FcyR) clasicos, que tienen una afinidad particular por FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16). Tras la union al receptor, SAP y cualquier complejo unido generalmente se internalizan y se procesan por la celula.

Heegaard et al. (1999), Journal of Chromatography A, 853 (1-2): 189-195, describe la caracterizacion de un glicopeptido de union a heparina (T3) a partir del componente de SAP humano mediante el aprovechamiento de dos caractensticas importantes de la electroforesis capilar. Siebert et al. (1995), FEBS Letters, 371 (1): 13-16, muestra que la eliminacion de restos de acido sialico del unico N-glicano de cada monomero aparentemente afecta a la presentacion en superficie de los distintos aminoacidos de SAP reactivos a la polarizacion nuclear dinamica inducida qmmicamente (CIDNP, por sus siglas en ingles). De forma similar, Siebert et al. (1997), Glycoconjugate Journal, 14 (8): 945-949 descubrio que la eliminacion de restos de acido sialico del unico N-glicano de cada monomero aparentemente afecta a la presentacion en superficie de distintos aminoacidos de SAP reactivos a la CIDNP. Boysen et al. (2004), Protein Expr Purif, 35 (2): 284-92, describe la expresion del componente amiloide P serico humano (SAP) en la levadura metilotrofica Pichiapastoris. Kieman et al. (2004), Proteomics; 4 (6): 1825-1829 proporciona la caracterizacion de SAP directamente a partir de muestras de orina y plasma humanos a traves de una tecnologfa proteomica basada en la espectrometna de masas de afinidad.

Recientemente, se ha sugerido que SAP puede usarse como agente terapeutico para tratar diversos trastornos, incluyendo trastornos relacionados con fibrosis, trastornos de hipersensibilidad, trastornos autoinmunitarios, mucositis y trastornos inflamatorios tales como los provocados por infeccion microbiana. Veanse, por ejemplo, las solicitudes de Patente de los EE.UU. con n.° de serie 11/707.333, 12/217.617, 12/720.845 y 12/720.847. Los productos terapeuticos a base de protemas para tratar enfermedades humanas han revolucionado la industria de la atencion sanitaria. Sin embargo, existen muchas dificultades en la produccion de un producto terapeutico a base de protemas que tenga la potencia necesaria y/o en la cantidad suficiente para que sea util como agente terapeutico. Muchos posibles agentes terapeuticos se modifican para aumentar su actividad biologica, tal como semivida en plasma, en relacion con la protema derivada de manera natural. Habitualmente se implementa tecnologfa de expresion recombinante para producir polipeptidos en cantidad suficiente. Desafortunadamente, muchos sistemas recombinantes producen polipeptidos que tienen propiedades biologicas diferentes de las formas derivadas de manera natural, lo que puede afectar a la farmacocinetica, seguridad y eficacia de un producto terapeutico.

Por tanto, sigue existiendo la necesidad de desarrollar polipeptidos de SAP, y metodos de fabricacion de los mismos, adecuados para el tratamiento terapeutico de seres humanos.

Sumario

La presente invencion se define por las reivindicaciones. En mas detalle, la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un polipeptido de amiloide P serico (SAP) humano glicosilado recombinante que comprende una cadena de oligosacarido con union en N, en el que al menos una ramificacion de la cadena de oligosacarido termina en un resto de acido sialico con union a2,3 y en el que la composicion tiene al menos un 50 % menos de restos de acido sialico con union a2,3 que el SAP de tipos silvestre aislado de suero humano. El producto farmaceutico tiene al menos un 75 %, al menos un 85 %, al menos un 95 % menos de restos de acido sialico con union a2,3 que el SAP de tipo silvestre aislado de suero humano. El producto farmaceutico esta sustancialmente libre de restos de acido sialico con union a2,3. El polipeptido preferentemente comprende una secuencia de aminoacidos que es identica al menos en el 85 %, al menos en el 90 %, al menos en el 95 %, al menos en el 99 % a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 o comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1. La cadena de oligosacarido con union en N comprende preferentemente un nucleo de pentasacarido de Man[(a1,6-)-(Man(a1,3)]-Man(p1,4)-GlcNAc(p1,4)-GlcNAc(p1,N)-Asn. La cadena de oligosacarido comprende preferentemente al menos una ramificacion que tiene la estructura NeuNAc2a3Ga1p4GlcNAcp2Mana6. El polipeptido es preferentemente una protema de fusion que comprende un dominio de SAP y uno o mas dominios heterologos. Mas preferentemente el uno o mas dominios heterologos potencian uno o mas de estabilidad in vivo, semivida in vivo, captacion/administracion, localizacion o distribucion tisular, formacion de complejos proteicos y/o purificacion. El polipeptido comprende preferentemente uno o mas restos de aminoacido modificados. Mas preferentemente el uno o mas restos de aminoacido modificados comprenden un aminoacido pegilado, un

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aminoacido prenilado, un aminoacido acetilado, un aminoacido biotinilado y/o un aminoacido conjugado con un agente de derivatizacion organico. Incluso mas preferentemente el uno o mas restos de aminoacido modificados potencian uno o mas de estabilidad in vivo, semivida in vivo, captacion/administracion, localizacion o distribucion tisular, formacion de complejos proteicos y/o purificacion. Todas las ramificaciones de la cadena de oligosacarido terminan preferentemente en restos de acido sialico con union a2,3. El polipeptido de SAP recombinante preferentemente tiene una CI50 para inhibir la diferenciacion de monocitos en fibrocitos in vitro que es menor de la mitad de la de una muestra correspondiente de SAP de tipo silvestre aislado de suero humano. El polipeptido de SAP se expreso preferentemente en una celula CHO.

La presente invencion tambien se refiere a una composicion farmaceutica para su uso en la inhibicion de la diferenciacion de monocitos en fibrocitos, en la que la composicion es la composicion de la invencion como se ha definido anteriormente en el presente documento y por las reivindicaciones.

La presente invencion tambien se refiere a una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento o la prevencion de una afeccion o trastorno seleccionado entre un trastorno inflamatorio, un trastorno fibrotico o fibroproliferativo, un trastorno de hipersensibilidad, un trastorno autoinmunitario o mucositis, en la que la composicion es la composicion de la invencion como se ha definido anteriormente en el presente documento y por las reivindicaciones.

Por ultimo, la presente invencion se refiere a un polipeptido Amiloide P Serico (SAP) humano glicosilado para su uso en la inhibicion de la diferenciacion de los monocitos en fibrocitos, en el que el polipeptido de SAP comprende una cadena de oligosacarido con union en N y en el que al menos una ramificacion de la cadena de oligosacarido termina con un resto de acido sialico con union a2,3.

Tambien se describen en el presente documento variantes de polipeptidos de Amiloide P Serico (SAP) y metodos para producirlos. Se describen tambien metodos y composiciones para la adicion, delecion o modificacion in vitro e in vivo de restos de azucar para producir variantes de polipeptidos de SAP que tengan un patron de glicosilacion deseado.

En determinados aspectos, tambien se describe un polipeptido de SAP humano glicosilado, que comprende una cadena de oligosacarido con union en N o con union en O que tiene al menos una ramificacion que termina con un resto de acido sialico con union a2,3.

En determinados aspectos, tambien se describe un polipeptido de SAP humano glicosilado, que comprende una cadena de oligosacarido con union en N o con union en O que tiene al menos un 50 % menos de restos de acido sialico con union a2,6 que el SAP de tipo silvestre aislado de suero humano.

En determinados aspectos, tambien se describen metodos de fabricacion de un polipeptido de SAP humano glicosilado, que comprende expresar un polipeptido de SAP en una celula y aislar el polipeptido de SAP de la celula. La celula puede ser una celula CHO. En determinados aspectos, la celula es una celula CHO-S.

En determinados aspectos, tambien se describen metodos de fabricacion de un polipeptido de SAP humano, que comprende expresar un polipeptido de SAP humano en una celula CHO y aislar el polipeptido de SAP humano de la celula.

En determinados aspectos, tambien se describen metodos de fabricacion de un polipeptido de SAP humano, que comprende proporcionar un polipeptido de SAP humano glicosilado que contiene una cadena de oligosacarido con union en N o con union en O y alterar enzimatica o qmmicamente la cadena de oligosacarido con union en N o con union en O del polipeptido de SAP para producir un polipeptido de SAP glucosilado modificado.

En determinados aspectos, tambien se describen metodos de fabricacion de un polipeptido de SAP humano, que comprende proporcionar un polipeptido de SAP humano y alterar enzimatica o qmmicamente el polipeptido de SAP para producir un polipeptido de SAP glicosilado que comprende un oligosacarido con union en N o con union en O.

En determinados aspectos, tambien se describe un polipeptido de SAP humano preparado mediante un proceso que comprende expresar un polipeptido de SAP en una celula CHO y aislar el polipeptido de SAP de la celula.

En determinados aspectos, tambien se describe una celula CHO que contiene un polipeptido de SAP humano con una cadena de oligosacarido con union en N que tiene al menos una ramificacion de la cadena de oligosacarido que termina con un resto acido sialico con union a2,3.

En determinados aspectos, tambien se describe una celula CHO que contiene una secuencia de polinucleotido que codifica un polipeptido de SAP humano.

En determinados aspectos, tambien se describe un polipeptido de SAP humano que tiene una CI50 para la inhibicion de la diferenciacion de monocitos en fibrocitos in vitro que es menos de la mitad, menos de un tercio, menos de un

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cuarto, menos de una decima parte o menos de una centesima parte con respecto a la de una muestra correspondiente de SAP de tipo silvestre aislado de suero humano.

Los polipeptidos de SAP humano descritos en el presente documento pueden tener una cadena de oligosacaridos con union en N. Al menos una ramificacion de la cadena de oligosacarido con union en N puede terminar con un resto de acido sialico con union a2,3. La cadena de oligosacarido con union en N puede tener al menos un 50 % menos de restos de acido sialico con union a2,6 que un SAP de tipo silvestre aislado de suero humano. Todas las ramificaciones de la cadena de oligosacaridos con union en N pueden terminar con restos de acido sialico con union a2,3. La cadena de oligosacaridos con union en N puede estar sustancialmente libre de restos de acido sialico con union a2,6. Los polipeptidos de SAP glicovariantes descritos en el presente documento pueden comprender una o mas ramificaciones, por ejemplo, la cadena de oligosacarido con union en N puede caracterizarse por tener una estructura bi-antenaria, tri-antena, tetra-antenaria o penta-antenaria. La cadena de oligosacaridos con union en N puede comprender un nucleo de pentasacarido de Man[(a1,6-)-(Man(a1,3)]-Man(p1,4)-GlcNAc(p1,4)-GlcNAc(p1,N)- Asn. La cadena de oligosacaridos con union en N puede comprender al menos una ramificacion que tiene la estructura NeuNAc2a3Ga1p4GlcNAcp2Mana6. Al menos una ramificacion de la cadena de oligosacarido con union en N puede estar sustancialmente libre de galactosa y N-acetilglucosamina. Todas las ramificaciones de la cadena de oligosacarido con union en N pueden estar sustancialmente libres de galactosa y N-acetilglucosamina. Al menos una ramificacion de la cadena de oligosacarido con union en N puede comprender uno o mas restos de manosa. La cadena de oligosacarido con union en N puede comprender al menos un resto de fucosa. Cualquiera de los polipeptidos de SAP glicovariantes descritos en el presente documento pueden comprender al menos un resto de glicosilo modificado. Un resto de glicosilo modificado puede conjugarse con uno o mas grupos modificadores seleccionados entre polfmeros solubles e insolubles en agua, restos terapeuticos, agentes de diagnostico y biomoleculas.

En determinados aspectos, el polipeptido de SAP tambien descrito en el presente documento puede ser un polipeptido recombinante. El polipeptido de SAP tambien descrito en el presente documento puede comprender una secuencia de aminoacidos identica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % a las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4. El polipeptido de SAP puede ser una protema SAP humana. Un polipeptido de SAP humano tambien descrito en el presente documento puede comprender una secuencia de aminoacidos identica en al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % a la SEQ ID NO: 1.

En determinados aspectos, el polipeptido de SAP humano tambien descrito en el presente documento puede ser una protema de fusion que comprende un dominio de SAP y uno o mas dominios heterologos. El dominio heterologo puede potenciar una o mas de entre la estabilidad in vivo, la semivida in vivo, la captacion/administracion, la localizacion o distribucion tisular, la formacion de complejos proteicos y/o la purificacion.

En determinados aspectos, el polipeptido de SAP humano tambien descrito en el presente documento puede comprender uno o mas restos de aminoacidos modificados, por ejemplo, un aminoacido PEGilado, un aminoacido glicosilado (por ejemplo, glicosilacion con union en O), un aminoacido prenilado, un aminoacido acetilado, un aminoacido biotinilado y/o un aminoacido conjugado con un agente derivatizante organico. Los restos de aminoacidos modificados pueden potenciar una o mas de entre la estabilidad in vivo, la semivida in vivo, la absorcion/administracion, la localizacion o distribucion tisular, la formacion de complejos proteicos y/o la purificacion.

Los polipeptidos de SAP humano descritos en el presente documento pueden tener una actividad biologica incrementada con respecto a una muestra correspondiente de SAP de tipo silvestre aislado de suero humano. En determinados aspectos, los polipeptidos de SAP descritos en el presente documento pueden tener una CI50 para inhibir la diferenciacion de monocitos en fibrocitos in vitro que es menos de la mitad, menos de un tercio, menos de un cuarto, menos de una decima parte o menos de una centesima parte con respecto a la de una muestra correspondiente de SAP de tipo silvestre aislado de suero humano.

En determinados aspectos, los metodos de fabricacion de cualquiera de los polipeptidos de SAP humano descritos en el presente documento comprenden una etapa adicional de alteracion enzimatica o qmmica del polipeptido de SAP para unir una cadena de oligosacaridos con union en No con union en O al polipeptido de sAp o para modificar la cadena de oligosacarido con union en N o con union en O del polipeptido de SAP. La alteracion enzimatica o qmmica del polipeptido de SAP puede comprender tratar el polipeptido de SAP con una o mas protemas enzimaticas seleccionadas entre glicosiltransferasas, glicosidasas y fosfatasas. El proceso de alteracion enzimatica o qmmica del polipeptido de SAP puede efectuarse en presencia de uno o mas precursores de azucar. Los precursores de azucar adecuados incluyen UDP-N-acetilglucosamina, acido CMP-N-glicolilneurammico UDP-N- acetilgalactosamina, acido CMP-N-acetilneurammico, UDP-galactosa y GDP-fucosa. El proceso de alteracion enzimatica o qmmica del polipeptido de SAP puede eliminar uno o mas restos de acido sialico con enlaces con union a2,6 terminales de la cadena de oligosacarido con union en N o con union en O. El proceso de alteracion enzimatica o qmmica del polipeptido de SAP aislado puede reemplazar uno o mas restos de acido sialico con union a2,6 terminales en la cadena de oligosacarido con uno o mas restos de acido sialico con union a2,3.

Tambien se describen en el presente documento preparaciones farmaceuticas de polipeptidos de SAP humano descritos en el presente documento adecuados para su uso en un mairnfero. Las preparaciones farmaceuticas

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descritas en el presente documento incluyen al menos uno de los polipeptidos de SAP descritos en el presente documento y un vehffculo farmaceuticamente aceptable. La preparacion farmaceutica puede comprender adicionalmente un agente activo adicional. La preparacion farmaceutica puede prepararse como una formulacion de liberacion sostenida. Las preparaciones farmaceuticas descritas en el presente documento adecuadas para la administracion a un paciente por via topica, mediante inyeccion, mediante inyeccion intravenosa, mediante inhalacion, mediante deposito continuo o mediante bomba.

Tambien se describen en el presente documento metodos para el tratamiento o la prevencion de trastornos o afecciones sensibles a SAP mediante la administracion a un paciente que lo necesita de una cantidad terapeuticamente eficaz de uno o mas de los polipeptidos de SAP descritos en el presente documento. Los trastornos o afecciones sensibles a SAP incluyen, pero no se limitan a, trastornos o afecciones fibroticas o fibroproliferativas, trastornos o afecciones de hipersensibilidad, trastornos o afecciones autoinmunitarias, enfermedades o afecciones inflamatorias y mucositis. El polipeptido de SAP descrito en el presente documento se puede administrar a un paciente por via topica, mediante inyeccion, mediante inyeccion intravenosa, mediante inhalacion, mediante deposito continuo o bomba, o una combinacion de los mismos. El polipeptido de SAP descrito en el presente documento puede administrarse con uno o mas agentes activos adicionales.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. Ensayo de diferenciacion en fibrocitos. Se uso un ensayo basado en ELISA para medir la produccion de MDC tras la incubacion de monocitos con polipeptidos de SAP. El eje Y indica la potencia promedio (es decir, el promedio de 7 experimentos independientes) de SAP derivado de suero humano (hSAP) en comparacion con SAP humano recombinante (rhSAP) aislado de celulas CHO-S. La actividad relativa de hSAP se fija a 1,0.

Figura 2. Analisis estructural de glicanos de polipeptidos de SAP variantes. Se usaron analisis de cromatograffa de lfquidos/espectrometna de masas (CL/EM) (A) y analisis de cromatograffa de lfquidos de alta resolucion de intercambio anionico (AEX-HPLC) (B) para determinar las uniones de acido sialico en SAP humano recombinante sometido a glicorremodelacion aislado de celulas CHO-S. Se usaron analisis de cromatograffa de lfquidos/espectrometna de masas (CL/EM) (C) y analisis de cromatograffa de lfquidos de alta resolucion de intercambio anionico (AEX-HPLC) (D) para determinar las uniones de acido sialico en hSAP (SAP derivado de suero humano) sometido a glicorremodelacion. Se uso analisis de cromatograffa de lfquidos/espectrometffa de masas (CL/EM) (E) y analisis de cromatograffa de ffquidos de alta resolucion de intercambio anionico (AEX-HPLC) (F) para determinar las uniones de acido sialico en rhSAP que se trato con una a2,3-sialiltransferasa para aumentar el numero de acidos sialicos con union 2,3 terminales en los glicanos de SAP. Para las figuras de CL/EM, el eje X representa la masa en Dalton, y el eje Y representa la intensidad relativa. Para los perfiles de HPLC, el eje X es el tiempo en minutos, y el eje Y son las unidades de absorbancia (mUA).

Figura 3. Ensayo de diferenciacion en fibrocitos. Se uso un ensayo basado en ELISA para medir la produccion de MDC tras la incubacion de monocitos con polipeptidos variantes de SAP. El eje Y indica la actividad relativa promedio de cada variante de SAP en comparacion con un patron de referencia de hSAP, para el que la actividad se fija a 1,0 (vease la barra mas a la izquierda).

Figura 4. Ensayo de diferenciacion en fibrocitos. Se trataron monocitos con hMCSF y despues se cuantificaron posteriormente para determinar la diferenciacion en fibrocitos. El eje X representa la concentracion de hMCSF incubado con monocitos donadores. El eje Y indica la cantidad de proliferacion de fibrocitos en el dfa cinco tal como se mide mediante el recuento de fibrocitos por 5,0 x 104 celulas.

Figuras 5. Ensayo de diferenciacion en fibrocitos. Se trataron monocitos con hSAP y despues se cuantificaron posteriormente para determinar la diferenciacion en fibrocitos. El eje X indica la concentracion de hSAP incubado con monocitos donadores. El eje Y indica la cantidad de proliferacion de fibrocitos en el dfa cinco tal como se mide mediante el recuento de fibrocitos por 5,0 x 104 celulas.

Descripcion detallada

Vision general

La mayoffa de los peptidos que se producen de manera natural tienen restos de hidratos de carbono (es decir, glicanos) unidos al peptido por medio de uniones espedficas a determinados aminoacidos a lo largo de la longitud de la cadena pepffdica primaria, formando asf “glicopeptidos”. El patron de glicosilacion en cualquier peptido dado puede tener enormes implicaciones para la funcion de ese peptido. Por ejemplo, la estructura de los glicanos con union en N en un peptido puede tener un impacto sobre diversas caracteffsticas del peptido, incluyendo susceptibilidad a proteasas, trafico intracelular, secrecion, direccionamiento tisular, semivida biologica y antigenicidad. La alteracion de una o mas de estas caracteffsticas afecta enormemente a la eficacia de un peptido en su entorno natural.

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Las estructuras de glicanos encontradas en glicopeptidos que se producen de manera natural se dividen normalmente en dos clases, glicanos con union en N y con union en O. Los peptidos expresados en celulas eucariotas normalmente estan N-glicosilados en restos de asparagina en sitios en la estructura primaria del peptido que contienen la secuencia asparagina-X-serina/treonina, en la que X puede ser cualquier aminoacido excepto prolina y acido aspartico. La parte de hidrato de carbono de dichos peptidos se conoce como glicano con union en N u oligosacarido con union en N. Los acontecimientos tempranos de N-glicosilacion se producen en el retmulo endoplasmatico (RE) y estan conservados en mai^eras, plantas, insectos y otros eucariotas superiores. En primer lugar, se construye una cadena de oligosacarido que comprende catorce restos de azucar sobre una molecula transportadora lipfdica. A medida que el peptido naciente se traduce y se transloca al RE, se transfiere toda la cadena de oligosacarido al grupo amida del resto de asparagina en una reaccion catalizada por una enzima glicosiltransferasa unida a la membrana. El glicano con union en N se procesa adicionalmente tanto en el RE como en el aparato de Golgi. El procesamiento adicional conlleva generalmente la eliminacion de algunos de los restos de azucar y la adicion de otros restos de azucar en reacciones catalizadas por glicosilasas y glicosiltransferasas espedficas para los restos de azucar eliminados y anadidos.

Normalmente, las estructuras finales de los glicanos con union en N dependen del organismo en el que se produce el peptido. Por ejemplo, los peptidos producidos en bacterias generalmente no estan glicosilados. Los peptidos expresados en celulas de insecto contienen normalmente cadenas de oligosacarido con union en N con alto contenido en manosa o paucimanosa. Los peptidos producidos en cultivos de celulas de mairnfero habitualmente se glicosilan de manera diferente dependiendo de la especie y las condiciones de cultivo celular. Incluso en la misma especie y en las mismas condiciones, algunas veces se encuentra una cierta cantidad de heterogeneidad en la cadena de glicosilo. En general, los peptidos producidos en celulas vegetales comprenden estructuras de glicanos que difieren significativamente de las producidas en celulas animales.

Se ha propuesto una diversidad de metodos en la tecnica para adaptar el patron de glicosilacion de un peptido, incluyendo metodos descritos en las solicitudes internacionales publicadas n.° WO 99/22764, WO 98/58964 y WO 99/54342 asf como en la Patente de los EE.UU. n.° 5.047.335. Esencialmente, muchas de las enzimas requeridas para la glicosilacion in vitro de peptidos se han clonado y secuenciado. En algunos casos, estas enzimas se han usado in vitro para anadir azucares espedficos a un glicano sobre un peptido. En otros casos, se han modificado por ingeniena genetica celulas para que expresen una combinacion de enzimas y peptidos deseados de manera que se produzca la adicion de un resto de azucar deseado a un peptido expresado dentro de la celula.

Se usan dos clases principales de enzimas en la smtesis de hidratos de carbono: glicosiltransferasas y glicosidasas. Las glicosiltransferasas anaden o modifican las estructuras de oligosacaridos existentes sobre un peptido. Las glicosiltransferasas son eficaces para producir productos espedficos con buen control estereoqmmico y regioqmmico. Las glicosiltransferasas se han usado para preparar oligosacaridos y para modificar estructuras de hidrato de carbono con union en N y O terminales, particularmente en peptidos producidos en celulas de marnffero. Por ejemplo, los oligosacaridos terminales de glicopeptidos pueden estar completamente sialilados y/o fucosilados para proporcionar estructuras de azucar mas constantes usando glicosiltransferasas, los que puede mejorar la farmacodinamica del glicopeptido y una diversidad de otras propiedades biologicas.

Las glicosidasas se clasifican adicionalmente como exoglicosidasas (por ejemplo, p-manosidasa, p-glucosidasa) y endoglicosidasas (por ejemplo, Endo-A, Endo-M). Las glicosidasas catalizan normalmente la hidrolisis de un enlace glicosfdico. Sin embargo, en condiciones apropiadas, pueden usarse para formar esta union. La mayona de las glicosidasas usadas para la smtesis de hidratos de carbono son exoglicosidasas; la transferencia de glicosilos se produce en el extremo terminal no reductor del sustrato. La glicosidasa se une a un donador de glicosilo en un producto intermedio de glicosil-enzima que o bien se intercepta por agua para producir el producto de hidrolisis, o bien por un aceptor, para generar un nuevo glicosido u oligosacarido. Una ruta a modo de ejemplo que usa una exoglicosidasa es la smtesis del trisacarido central de todos los glicopeptidos con union en N, incluyendo la union p- manosido, que se forma mediante la accion de p-manosidasa (Singh et al., Chem. Commun. 993-994 (1996)). Aunque su uso es menos comun que el de las exoglicosidasas, las endoglicosidasas tambien se utilizan para preparar hidratos de carbono. Las endoglicosidasas pueden usarse para transferir una cadena de oligosacarido completa, en vez de un monosacarido, sobre un polipeptido. Se han anadido fragmentos de oligosacarido a sustratos usando endo-p-N-acetilglucosaminas, tales como endo-F y endo-M (Wang et al., Tetrahedron Lett. 37: 1975-1978; y Haneda et al., Carbohydr. Res. 292: 61-70 (1996). Cada una de estas clases de enzimas se ha usado satisfactoriamente para producir peptidos glicosilados. Para una revision general, vease, Crout et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 98-111. (1998).

El amiloide P serico (SAP) es una protema serica que se produce de manera natural en marnfferos compuesta por cinco subunidades identicas, o “promotores”, que estan asociadas de manera no covalente en un complejo similar a un disco. SAP pertenece a la superfamilia de protemas de pentraxina, que se caracterizan por esta estructura pentamerica dclica. Las pentatraxinas cortas clasicas incluyen SAP, asf como protema C reactiva (Osmand, A.P., et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 74: 739-743, 1997). SAP se sintetiza normalmente en el tugado y tiene una semivida fisiologica de veinticuatro horas. La secuencia de la subunidad de SAP humana se desvela a continuacion, correspondiendo a los aminoacidos 20-223 de n.° de registro de Gene bank NP_001630 (secuencia senal no representada).

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HTDLSGKVFVFPRESVTDHVNLITPLEKPLQNFTLCFRAYSDLSRA YSLFSYNTQGRDNELLVYKERVGEYSLYIGRHKVTSKVIEKFPAPV HICVSWESSSGIAEFWINGTPLVKKGLRQGYFVEAQPKIVLGQEQD SYGGKFDRSQSFVGEIGDLYMWDSVLPPENILSAYQGTPLPANILD WQALNYEIRGYVIIKPLVWV (SEQ ID NO: 1)

A continuacion, se desvela la secuencia de la subunidad de SAP de Gallus gallus.

QEDLYRKVFVFREDPSDAYVLLQVQLERPLLNFTVCLRSYTDLTRP HSLFSYATKAQDNEILLFKPKPGEYRFYVGGKYVTFRVPENRGEW EHVCASWESGSGIAEFWLNGRPWPRKGLQKGYEVGNEAWMLG QEQDAYGGGFDVYNSFTGEMADVHLWDAGLSPDKMRSAYLALR LPPAPLAWGRLRYEAKGDVWKPRLREALGA (SEQ ID NO: 2)

A continuacion, se desvela la secuencia de la subunidad de SAP de Bos taurus.

QTDLRGKVFVFPRESSTDHVTLITKLEKPLKNLTLCLRAYSDLSRG YSLFSYNIHSKDNELLVFKNGIGEYSLYIGKTKVTVRATEKFPSPVH ICTSWESSTGIAEFWINGKPLVKRGLKQGYAVGAHPKIVLGQEQDS YGGGFDKNQSFMGEIGDLYMWDSVLSPEEILLVYQGSSSISPTILD WQALKYEIKGYVIVKPMVWG (SEQ ID NO: 3)

A continuacion, se desvela la secuencia de la subunidad de SAP de Cricetulus migratorius.

QTDLTGKVFVFPRESESDYVKLIPRLEKPLENFTLCFRTYTDLSRPHSLFSYNTKN KDNELLIYKERMGEYGLYIENVGAIVRGVEEFASPVHFCTSWESSSGIADFWVNG IPWVKKGLKKGYTVKTQPSIILGQEQDNYGGGFDKSQSFVGEMGDLNMWDSVL TPEEIKSVYEGSWLEPNILDWRALNYEMSGYAVIRPRVWH (SEQ ID NO: 4)

Un aspecto que se describe en el presente documento se refiere al sorprendente descubrimiento de que la modificacion de una estructura de glicanos sobre un polipeptido de SAP humano puede aumentar la actividad biologica del polipeptido de SAP en relacion con una muestra correspondiente de SAP de tipo silvestre aislado de suero humano. Como se demuestra mediante los ejemplos de la divulgacion, SAP aislado de suero humano solo contiene restos de acido sialico con union a2,6. En cambio, SAP humano recombinante producido en celulas CHO solo contiene restos de acido sialico con union a2,3. Usando bioensayos basados en celulas in vitro, se demostro que polipeptidos de SAP con acido sialico con union a2,3 teman una actividad sistematicamente mas alta que SAP de tipo silvestre (es decir, SAP que comprende restos de acido sialico con union a2,6) aislado de suero humano. Los polipeptidos de SAP variantes descritos en el presente documento seran mas eficaces como agentes terapeuticos debido a su potencia biologica aumentada. Por ejemplo, variantes de SAP mas potentes pueden requerir menor dosificacion y/o dosificacion menos frecuente en relacion con SAP de tipo silvestre aislado de suero humano. La presente divulgacion proporciona tanto polipeptidos de SAP humano variantes como metodos para producir los mismos. En particular, la divulgacion incluye metodos y composiciones para la adicion, delecion o modificacion in vitro e in vivo de restos de azucar para producir un polipeptido de SAP humano que tiene un patron de glicosilacion deseado.

Definiciones

A menos que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen generalmente el mismo significado que entiende comunmente un experto habitual en la tecnica. Generalmente, la

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nomenclatura usada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio en cultivo celular, genetica molecular, qmmica organica y qmmica e hibridacion de acidos nucleicos son los que se conocen bien y se emplean comunmente en la tecnica. Se usan tecnicas convencionales para la smtesis de acidos nucleicos y peptidos. Las tecnicas y los procedimientos se realizan generalmente segun metodos convencionales en la tecnica y diversas referencias generales (por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), que se proporcionan a lo largo de todo el presente documento.

Los artmulos “un” y “una” se usan en el presente documento para referirse a uno o a mas de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artmulo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o mas de un elemento.

Como se usan en el presente documento, los terminos “tratamiento” y “tratar” se refieren a obtener un efecto farmacologico y/o fisiologico deseado. El efecto puede ser profilactico en cuanto a prevenir completa o parcialmente un trastorno o smtoma del mismo y/o puede ser terapeutico en cuanto a una cura parcial o completa para un trastorno y/o efecto adverso atribuible al trastorno. “Tratamiento”, tal como se usa en el presente documento, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mairnfero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) aumentar el tiempo de supervivencia; (b) disminuir el riesgo de muerte debido a la enfermedad; (c) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo o reducir la velocidad de progresion de la enfermedad; y (d) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresion de la enfermedad.

Como se usa en el presente documento, un producto terapeutico que “inhibe” o “previene” un trastorno o afeccion es un compuesto que, en una muestra estadfstica, reduce la aparicion del trastorno o afeccion en la muestra tratada en relacion con una muestra control no tratada, o retrasa el comienzo o reduce la gravedad de uno o mas smtomas del trastorno o afeccion en relacion con la muestra control no tratada.

Como se usa en el presente documento los terminos “sujeto” y “paciente” se refieren a animales incluyendo mairnferos, tales como seres humanos. El termino “mairnfero” incluye primates, animales domesticados incluyendo perros, gatos, ovejas, ganado, caballos, cabras, cerdos, ratones, ratas, conejos, cobayas, animales cautivos tales como animales de zoologicos, y animales salvajes.

Como se usa en el presente documento el termino “tejido” se refiere a un organo o conjunto de celulas especializadas tales como tejido cutaneo, tejido pulmonar, tejido renal y otros tipos de celulas.

El termino “efecto terapeutico” se reconoce en la tecnica y se refiere a un efecto local o sistemico en animales, particularmente mairnferos, y mas particularmente seres humanos, provocado por una sustancia farmacologicamente activa. La frase “cantidad terapeuticamente eficaz” significa la cantidad de una sustancia tal que produce algun efecto local o sistemico deseado a una razon de beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento. La cantidad terapeuticamente eficaz de tal sustancia variara dependiendo del sujeto y la patologfa que esta tratandose, el peso y la edad del sujeto, la gravedad de la patologfa, la manera de administracion, pudiendo determinarla facilmente un experto habitual en la tecnica. Por ejemplo, determinadas composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse en una cantidad suficiente para producir un efecto deseado a una razon de beneficio/riesgo razonable aplicable a tal tratamiento.

Como se usa en el presente documento, el termino “acido nucleico” se refiere a un polinucleotido tal como acido desoxirribonucleico (ADN) y, cuando sea apropiado, acido ribonucleico (ARN). Debe entenderse tambien que el termino incluye, como equivalentes, analogos de o bien ARN o bien ADN preparados a partir de analogos de nucleotido y, segun sea aplicable a los aspectos que esten describiendose, polinucleotido monocatenario (tal como sentido o antisentido) y bicatenario.

Los terminos “peptidos”, “protemas” y “polipeptidos” se usan de manera intercambiable en el presente documento. El termino “protema purificada” se refiere a una preparacion de una protema o protemas que estan preferiblemente aisladas de, o de otra forma sustancialmente libres de, otras protemas normalmente asociadas con la(s) protema(s) en una celula o lisado celular. Se define que el termino “sustancialmente libre de otras protemas celulares” o “sustancialmente libre de otras protemas contaminantes” engloba preparaciones individuales de cada una de las protemas que comprenden menos del 20 % (en peso seco) de protema contaminante, y preferiblemente comprende menos del 5 % de protema contaminante. Pueden prepararse formas funcionales de cada una de las protemas como preparaciones purificadas usando un gen clonado tal como se conoce bien en la tecnica. Por “purificado”, quiere decirse que la molecula indicada esta presente en ausencia sustancial de otras macromoleculas biologicas, tales como otras protemas (particularmente otras protemas que pueden enmascarar, disminuir, confundir o alterar sustancialmente las caractensticas de las protemas componentes o bien como preparaciones purificadas o bien en su funcion en la mezcla reconstituida objeto). El termino “purificado” tal como se usa en el presente documento significa preferiblemente al menos el 80 % en peso seco, mas preferiblemente en el intervalo del 85 % en peso, mas preferiblemente el 95-99 % en peso, y lo mas preferiblemente al menos el 99,8% en peso, de macromoleculas biologicas del mismo tipo presentes (pero pueden estar presentes agua, tampones y otras moleculas pequenas, especialmente moleculas que tienen un peso molecular de menos de 5000). El termino “puro” tal como se usa en el

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presente documento tiene preferiblemente los mismos Kmites numericos que “purificado” inmediatamente anterior.

Los oligosacaridos “con union en N” son los oligosacaridos que estan unidos a una estructura principal de peptido a traves de una asparagina, por medio de una union asparagina-N-acetilglucosamina. Los oligosacaridos con union en N tambien se denominan “N-glicanos”. Los oligosacaridos con union en N que se producen de manera natural tienen un nucleo de pentasacarido comun de Man[(a1,6-)-(Man(a1,3)]-Man(p1,4)-GlcNAc(p1,4)-GlcNAc(p1,N). Difieren en la presencia y en el numero de ramificaciones (tambien denominadas antenas) de azucares perifericos tales como N-acetilglucosamina, galactosa, N-acetilgalactosamina, fucosa y acido sialico. Opcionalmente, esta estructura tambien puede contener una molecula de xilosa y/o molecula de fucosa central.

El termino “acido sialico” se refiere a cualquier miembro de una familia de azucares carboxilados de nueve carbonos. El miembro mas comun de la familia de acido sialico es el acido N-acetilneurammico (a menudo abreviado como Neu5Ac, NeuAc o NANA). Un segundo miembro de la familia es el acido N-glicolil-neurammico (Neu5Gc o NeuGc), en el que el grupo N-acetilo de NeuAc esta hidroxilado. Un tercer miembro de la familia de acido sialico es el acido 2-ceto-3-desoxi-nonulosonico (KDN) (Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al., J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990)). Tambien se incluyen acidos sialicos 9-sustituidos tales como un 9-O-acil C1C6- Neu5Ac como 9-O-lactil-Neu5Ac o 9-O-acetil-Neu5Ac, 9-desoxi-9-fluoro-Neu5Ac y 9-azido-9-desoxi-Neu5Ac. Para una revision de la familia de acido sialico vease, por ejemplo, Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992); Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Funtion, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, Nueva York (1992)).

Una celula “modificada por ingeniena genetica” o “recombinante” es una celula que tiene una o mas modificaciones en el material genetico de la celula. Dichas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, inserciones de material genetico, deleciones de material genetico e insercion de material genetico que es extracromosomico tanto si tal material se mantiene de manera estable como si no.

Como se usa en el presente documento, el termino “azucar modificado” se refiere a un hidrato de carbono que se produce de manera natural o que no se produce de manera natural que se anade enzimaticamente sobre un aminoacido o un resto de glicosilo de un peptido en un proceso que se describe en el presente documento. El azucar modificado se selecciona entre varios sustratos enzimaticos incluyendo, pero sin limitarse a, nucleotidos de azucar (mono-, di-, y tri-fosfatos), azucares activados (por ejemplo, haluros de glicosilo, mesilatos de glicosilo) y azucares que ni estan activado ni son nucleotidos. Un “azucar modificado” puede funcionalizarse covalentemente con un “grupo modificador”. Los grupos modificadores utiles incluyen, pero no se limitan a, polfmeros solubles en agua e insolubles en agua, restos terapeuticos, restos de diagnostico, biomoleculas. El lugar de funcionalizacion con el grupo modificador se selecciona de manera que no impida que el “azucar modificado” se anada enzimaticamente a un peptido o resto de glicosilo del peptido.

Polipeptidos de SAP variantes

En parte, la divulgacion proporciona polipeptidos de amiloide P serico (SAP) variantes. En particular, las variantes de SAP que se describen en el presente documento incluyen polipeptidos de SAP humano glicosilados que comprenden una o mas cadenas de oligosacarido con union en N o con union en O teniendo cada una independientemente una, dos, tres, cuatro, cinco o mas ramificaciones que terminan en un resto de acido sialico con union a2,3. Todas las ramificaciones de las cadenas de oligosacarido con union en N o con union en O terminan en restos con union a2,3. Otras variantes de SAP que se describen en el presente documento incluyen polipeptidos de SAP humano glicosilados que contienen cadenas de oligosacarido con union en N o con union en 0 que tienen al menos el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 75 %, el 80 %, el 85 % o incluso al menos el 95 % menos de restos de acido sialico con union a2,6 que un polipeptido de SAP de tipo silvestre derivado de suero humano. Las cadenas de oligosacarido con union en N o con union en O pueden estar sustancialmente libres de restos de acido sialico con union a2,6, por ejemplo, teniendo menos del 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 97 %, el 98 % o incluso menos del 99 % de restos de acido sialico con union a2,6 en relacion con un polipeptido de SAP de tipo silvestre derivado de suero humano. Los polipeptidos de SAP glicovariantes que se describen en el presente documento pueden comprender un oligosacarido con union en No cadena con union en O que tiene una o mas ramificaciones (por ejemplo, que tiene una estructura biantenaria, triantenaria, tetraantenaria, pentaantenaria, etc.). Los polipeptidos de SAP que se describen en el presente documento comprenden una cadena de oligosacarido con union en No con union en O en la que una, dos, tres, cuatro o cinco ramificaciones de la cadena de oligosacarido estan sustancialmente libres de galactosa y N-acetilglucosamina (por ejemplo, que tienen menos del 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 97 %, el 98 % o incluso menos del 99 % de N-acetilglucosamina en relacion con un polipeptido de SAP de tipo silvestre derivado de suero humano). Determinados polipeptidos de SAP que se describen en el presente documento tienen cadenas de oligosacarido con union en N o con union en O que estan sustancialmente libres de galactosa y N-acetilglucosamina (por ejemplo, que tienen menos del 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 97 %, el 98 % o incluso menos del 99 % de galactosa y/o N-acetilglucosamina en relacion con un polipeptido de SAP de tipo silvestre derivado de suero humano). Los polipeptidos de SAP que se describen en el presente documento pueden comprender una cadena de oligosacarido con union en No con union en O en la que una, dos, tres, cuatro o cinco ramificaciones de la cadena de oligosacarido contienen uno o mas restos de manosa. El polipeptido de SAP que se describe en el presente documento puede comprender un oligosacarido con union en N que tiene un nucleo de pentasacarido de Man[(a1,6-)-(Man(a1,3)]-Man(p1,4)-GlcNAc(p1,4)-GlcNAc(p1,N)-Asn.

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Este nucleo de pentasacarido tambien puede comprender uno o mas restos de fucosa o xilosa. Los polipeptidos de SAP que se describen en el presente documento pueden comprender una cadena de oligosacarido con union en N en la que una, dos, tres, cuatro o cinco ramificaciones de la cadena de oligosacarido tienen la estructura NeuNAc2 a3Galp4GlcNAcp2Mana6. Los polipeptidos de SAP que se describen en el presente documento tambien pueden comprender una cadena de oligosacarido con union en N en la que todas las ramificaciones tienen la estructura NeuNAc2a3Galp4GlcNAcp2Mana6.

Los polipeptidos de SAP variantes que se describen en el presente documento pueden comprender uno o mas restos de azucar “modificados”. Los azucares modificados estan sustituidos en cualquier posicion que permita la union del grupo o resto modificador. En aspectos preferidos, el azucar modificado esta sustituido en una posicion que todavfa permite que el azucar funcione como sustrato para una enzima usada para acoplar el azucar modificado al peptido de SAP. Un grupo modificador puede unirse a un resto de azucar por medios enzimaticos, medios qmmicos o una combinacion de los mismos, produciendo de ese modo un azucar modificado, por ejemplo, galactosa, fucosa o acido sialico modificado. En la siguiente seccion se describen grupos modificadores adecuados para su uso en el presente documento, asf como metodos para conjugar estos grupos modificadores con restos de azucar.

En determinados aspectos, los polipeptidos de SAP variantes de la invencion tienen una CI50 para inhibir la diferenciacion de monocitos en fibrocitos in vitro que es menor de la mitad de la de una muestra correspondiente de SAP de tipo silvestre aislado de suero humano. Los polipeptidos de SAP variantes que se describen en el presente documento pueden tener una CI50 para inhibir la diferenciacion de monocitos en fibrocitos in vitro que es menor de 1/3, menor de 1/4, menor de 1/10 o menor de 1/100 de la de una muestra correspondiente de SAP de tipo silvestre aislado de suero humano.

Los polipeptidos de SAP variantes que se describen en el presente documento pueden ser identicos al menos en el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1, tal como se determina usando el programa informatico FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci., 6: 237-245 (1990)). Los parametros empleados para calcular la identidad en porcentaje y la similitud de una alineacion de aminoacidos comprenden: Matriz = PAM 150, k-tupla = 2, penalizacion por falta de coincidencia = 1, penalizacion por union = 20, longitud del grupo de aleatorizacion = 0, puntuacion de corte = 1, penalizacion por hueco = 5 y penalizacion por tamano de hueco = 0,05.

El termino “polipeptido de SAP” engloba fragmentos funcionales y protemas de fusion que comprenden cualquiera de los anteriores. Generalmente, un polipeptido de SAP se disenara para que sea soluble en disoluciones acuosas a temperaturas, niveles de pH y osmolaridad biologicamente relevantes. Los promotores de SAP que se asocian de manera no covalente entre sf para formar un complejo de SAP pentamerico pueden tener secuencias de aminoacidos y/o modificaciones postraduccionales identicas o, alternativamente, los promotores de SAP individuales dentro de un unico complejo pueden tener secuencias y/o modificaciones diferentes. El termino polipeptido de SAP incluye polipeptidos que comprenden cualquier polipeptido de SAP que se produce de manera natural, asf como cualquier variante de los mismos (incluyendo mutantes, fragmentos y fusiones). Un polipeptido de SAP que se describe en el presente documento puede ser un polipeptido recombinante. El polipeptido de SAP que se describe en el presente documento puede ser un polipeptido de sAp humano.

En el presente documento se proporcionan composiciones farmaceuticas que comprenden un polipeptido de SAP variante que se describe en el presente documento, o un fragmento funcional del mismo. En algunos aspectos, la secuencia de aminoacidos de una variante de SAP puede diferir de la SEQ ID NO: 1 en una o mas sustituciones conservativas o no conservativas. Como se usa en el presente documento, “sustituciones conservativas” son restos que son ffsica o funcionalmente similares a los restos de referencia correspondientes, es decir, una sustitucion conservativa y su resto de referencia tienen tamano, conformacion, carga electrica y/o propiedades qmmicas similares (por ejemplo, la capacidad para formar enlaces covalentes o de hidrogeno). Sustituciones conservativas preferidas son las que satisfacen los criterios definidos para una mutacion puntual aceptada en Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure 5: 345-352 (1978 y sup.). Ejemplos de sustituciones conservativas son sustituciones dentro de los siguientes grupos: (a) valina, glicina; (b) glicina, alanina; (c) valina, isoleucina, leucina; (d) acido aspartico, acido glutamico; (e) asparagina, glutamina; (f) serina, treonina; (g) lisina, arginina, metionina; y (h) fenilalanina, tirosina. Puede encontrarse orientacion adicional referente a que cambios de aminoacidos es probable que sean fenotfpicamente silenciosos en Bowie et al., Science 247: 1306-1310 (1990).

Polipeptidos de SAP variantes y fragmentos de los mismos que conservan la funcion biologica son utiles en las composiciones farmaceuticas y los metodos descritos en el presente documento. Un polipeptido de SAP variante o fragmento del mismo puede unirse a FcyRI, FcyRIIA y/o FcyRIIIB. Un polipeptido de SAP variante o fragmento del mismo puede inhibir una o mas de diferenciacion en fibrocitos, precursores de fibrocitos, precursores de miofibrolastos y/o precursores de monocitos hematopoyeticos. Pueden generarse variantes de SAP modificando la estructura de un polipeptido de SAP para fines tales como potenciar la eficacia terapeutica o estabilidad (por ejemplo, vida util de almacenamiento ex vivo y resistencia a la degradacion proteolttica in vivo).

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En determinados aspectos, los polipeptidos de SAP variantes que se describen en el presente documento pueden comprender ademas modificaciones postraduccionales ademas de cualquiera que este presente de manera natural en el polipeptido de SAP. Dichas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, acetilacion, carboxilacion, glicosilacion (por ejemplo, oligosacaridos con union en O, oligosacaridos con union en N, etc.), fosforilacion y lipidacion. Como resultado, el polipeptido de SAP modificado puede contener elementos distintos de aminoacidos, tales como polietilenglicoles, ftpidos, poli- o monosacaridos y fosfatos.

En determinados aspectos, una o mas modificaciones en el polipeptido de SAP descrito en el presente documento pueden potenciar la estabilidad del polipeptido de SAP. Por ejemplo, dichas modificaciones pueden potenciar la semivida in vivo del polipeptido de SAP o reducir la degradacion proteolftica del polipeptido de sAp.

En determinados aspectos, los polipeptidos de SAP variantes que se describen en el presente documento pueden incluir protemas de fusion que tienen al menos una parte del polipeptido de SAP humano y uno o mas dominios de fusion o partes heterologas. Los ejemplos bien conocidos de dichos dominios de fusion incluyen, pero no se limitan a, polihistidina, Glu-Glu, glutation S transferasa (GST), tiorredoxina, protema A, protema G, y region constante de cadena pesada de inmunoglobulina (Fc), protema de union a maltosa (MBP), o albumina serica humana. Puede seleccionarse un dominio de fusion para conferir una propiedad deseada. Por ejemplo, algunos dominios de fusion son particularmente utiles para el aislamiento de las protemas de fusion mediante cromatograffa de afinidad. Para el fin de purificacion por afinidad, se usan matrices relevantes para cromatograffa de afinidad, tales como resinas conjugadas con glutation, amilasa y mquel o cobalto. Como otro ejemplo, puede seleccionarse un dominio de fusion para facilitar la deteccion de los polipeptidos de SAP. Los ejemplos de dichos dominios de deteccion incluyen las diversas protemas fluorescentes (por ejemplo, GFP) asf como “marcadores de epftopo”, que son habitualmente secuencias pepffdicas cortas para las que esta disponible un anticuerpo espedfico. Los marcadores de epftopo bien conocidas para las que estan facilmente disponibles anticuerpos monoclonales espedficos incluyen marcadores FLAG, de hemaglutinina (HA) de virus influenza y c-myc. En algunos casos, los dominios de fusion tienen un sitio de escision de proteasas que permite que la proteasa relevante digiera parcialmente las protemas de fusion y de ese modo libere la protema recombinante de las mismas. Las protemas liberadas pueden aislarse despues del dominio de fusion mediante separacion cromatografica posterior. En algunos casos, el polipeptido de SAP puede fusionarse a un dominio heterologo que estabiliza el polipeptido de SAP in vivo. Por “estabilizar” quiere decirse cualquier cosa que aumente la semivida en suero, independientemente de si esto se debe a una disminucion de la destruccion, disminucion del aclaramiento por el rinon u otro efecto farmacocinetico. Se sabe que las fusiones con la parte Fc de una inmunoglobulina y albumina serica confieren un aumento de estabilidad.

Se entiende que diferentes elementos de las protemas de fusion pueden disponerse de cualquier manera que sea compatible con la funcionalidad deseada. Por ejemplo, un polipeptido de SAP puede colocarse en posicion C- terminal con respecto a un dominio heterologo, o, alternativamente, un dominio heterologo puede colocarse en posicion C-terminal con respecto a un polipeptido de SAP. No es necesario que el polipeptido de SAP y el dominio heterologo esten adyacentes en una protema de fusion, y pueden incluirse dominios o secuencias de aminoacidos adicionales (por ejemplo, secuencias de ligador) en posicion C- o N-terminal con respecto a cualquier dominio o entre los dominios.

Metodos de produccion de moleculas con N-glicosMacion alterada

En el presente documento se describen metodos de produccion de polipeptidos de SAP humanos variantes. Los metodos implican generalmente una etapa de poner en contacto un polipeptido de SAP con uno o mas agentes qmmicos o enzimaticos para producir o modificar una estructura de glicosilacion en el polipeptido de SAP. Los metodos pueden basarse en celulas o no basarse en celulas.

En la tecnica enzimas se conocen bien utiles para producir o modificar estructuras de glicanos. La mayona de las enzimas/protemas utiles en los metodos que se describen en el presente documento pueden clasificarse en una de dos clases funcionales: glicosiltransferasas y glicosidasas. Glicosiltransferasas (por ejemplo, N-acetilglucosaminil- transferasas, galactosil-transferasas, fucosil-transferasas, sialil-transferasas, glucosil-transferasas, manosil- transferasas, etc.), tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier enzima/protema que tiene la capacidad para transferir un azucar donador a un resto aceptor. Glicosidasas (por ejemplo, glucosidasas, manosidasas, N-acetilglucosaminidasas, sialidasas, fucosidasas, etc.), tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier enzima/protema que tiene la capacidad para catalizar la hidrolisis de la union glicosfdica entre restos de azucar.

Los metodos basados en celulas para producir glicoformas alteradas de un polipeptido de SAP usan celulas o bien silvestres (por ejemplo, celulas cHo) o bien modificadas por ingeniena genetica que tienen al menos una actividad de glicosilacion modificada en relacion con una celula humana. Las celulas adecuadas para los metodos que se describen en el presente documento incluyen, por ejemplo, celulas fungicas, celulas procariotas (es decir, bacterias, Archaea), celulas vegetales o celulas animales (por ejemplo, nematodos, insectos, plantas, aves, reptiles o mairftferos (por ejemplo, un raton, rata, conejo, hamster, jerbo, perro, gato, cabra, cerdo, vaca, caballo, ballena, mono o ser humano)). Las celulas pueden ser celulas primarias, celulas inmortalizadas o celulas transformadas. Dichas celulas pueden obtenerse de una diversidad de fuentes comerciales e instalaciones de recursos de

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investigacion, por ejemplo, la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (Rockville, Md.). En determinados aspectos, la celula usada para producir un polipeptido de SAP variante es una celula CHO.

El termino “actividad de glicosilacion” se refiere a cualquier actividad que puede (i) anadir glicanos con union en N o con union en O a una molecula diana (es decir, una actividad oligosacaril-transferasa); (ii) eliminar glicanos con union en N o con union en O a partir de una molecula diana; (iii) modificar uno o mas glicanos con union en N o con union en O en una molecula diana; (iv) modificar oligosacaridos unidos a dolicol; (v) ayudar en la actividad de una o mas de las actividades en i-iv. En consecuencia, la actividad de glicosilacion incluye, por ejemplo, actividad glicosidasa, actividad glicosiltransferasa, actividad de smtesis, modificacion o transportador de nucleotidos de azucar. La modificacion de uno o mas glicanos con union en No con union en O en una molecula diana incluye la accion de una actividad manosilfosforil-transferasa, una actividad cinasa o una actividad fosfatasa, por ejemplo, una actividad manosilfosforil-transferasa, una actividad cinasa o una actividad fosfatasa que altera el estado de fosforilacion de glicanos en moleculas diana.

Las celulas modificadas por ingeniena genetica utiles en los metodos que se describen en el presente documento pueden tener una o mas modificaciones geneticas incluyendo, pero sin limitarse a: (i) delecion de un gen endogeno que codifica una protema que tiene actividad de glicosilacion; (ii) introduccion de un acido nucleico recombinante que codifica una forma mutante de una protema (por ejemplo, protema endogena o exogena) que tiene una actividad de glicosilacion; (iii) introduccion o expresion de una molecula de ARN que interfiere con la expresion funcional de una protema que tiene la actividad de glicosilacion; (iv) introduccion de un acido nucleico recombinante que codifica una protema silvestre (por ejemplo, endogena o exogena) que tiene actividad de glicosilacion; o (v) alterar los elementos promotores o potenciadores de uno o mas genes endogenos que codifican protemas que tienen actividad de glicosilacion para asf alterar la expresion de las protemas codificadas. Las moleculas de ARN descritas anteriormente incluyen, por ejemplo, ARN de interferencia pequeno (ARNip), ARN en horquilla corto (ARNhc), ARN antisentido o microARN (miARN). Se entiende que el punto (ii) incluye, por ejemplo, la sustitucion de un gen endogeno (por ejemplo, mediante recombinacion homologa) por un gen que codifica una protema que tiene mayor actividad de glicosilacion en relacion con el gen endogeno sustituido de ese modo.

Las celulas modificadas por ingeniena genetica descritas en el presente documento tienen una o mas actividades de glicosilacion alteradas tales como: (i) un aumento en una mas actividades de glicosilacion en la celula modificada geneticamente, (ii) una disminucion en una o mas actividades de glicosilacion en la celula modificada geneticamente, (iii) un cambio en la localizacion o distribucion intracelular de una o mas actividades de glicosilacion en la celula modificada geneticamente, o (iv) un cambio en la razon de una o mas actividades de glicosilacion en la celula modificada geneticamente en relacion con una celula no modificada del mismo origen. Se entiende que un aumento en la cantidad de actividad de glicosilacion puede deberse a la sobreexpresion de una o mas protemas que tienen actividad de glicosilacion, un aumento en el numero de copias de un gen endogeno (por ejemplo, duplicacion genica), o una alteracion en el promotor, potenciador o supresor de un gen endogeno que estimula un aumento en la expresion de la protema codificada por el gen. Una disminucion en una o mas actividades de glicosilacion puede deberse a la sobreexpresion de una forma mutante (por ejemplo, una forma dominante negativa) de una o mas protemas que tienen actividades que alteran la glicosilacion, la introduccion o expresion de una o mas moleculas de ARN de interferencia que reducen la expresion de una o mas protemas que tienen una actividad de glicosilacion, o la delecion de uno o mas genes endogenos que codifican una protema que tiene actividad de glicosilacion.

Las celulas modificadas por ingeniena genetica usadas mediante los metodos de la divulgacion pueden expresar (por ejemplo, sobreexpresar) genes silvestres o mutantes que codifican protemas que tienen actividad de glicosilacion. Dichos genes incluyen, pero no se limitan a, ALG7, ALG13, aLg14, ALg1, ALG2, ALG11, RFT1, ALG3, ALG9, ALG12, ALG6, ALG8, ANL1, ALG10, ALG5, OST3, OST4, OST6, STT3, OST1, OST5, WBP1, SWP1, OST2, DPMI, SEC59, OCH1, MNN9, VAN1, MNN8, MNN10, MNN11, HOC1, MNN2, MNN5, MNN6, KTR1, YUR1, MNN4, KRE2, KTR2, KTR3, MNN1, MNS1, MNN4, PNO1, MNN9, glucosidasa I, glucosidasa II o endomanosidasa. Los genes que codifican protemas que tienen actividad de glicosilacion pueden ser de cualquier especie (por ejemplo, eucariotas inferiores (por ejemplo, hongos (incluyendo levaduras) o tripanosomas), procariotas (es decir, bacterias o Archaea), plantas o animales (por ejemplo, insectos, aves, reptiles o mairnferos, tales como raton o rata, perro, gato, caballo, cabra, vaca, cerdo, primate no humano o ser humano)). Se entiende que las celulas modificadas por ingeniena genetica usadas para los metodos de la divulgacion pueden expresar cualquier numero de genes (por ejemplo, genes que codifican protemas que tienen actividad de glicosilacion) y/o cualquier combinacion de uno o mas (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 15 o 20 o mas) de cualquiera de los genes mencionados en el presente documento. Ademas, cualquier celula modificada por ingeniena genetica usada por los metodos de la divulgacion puede comprender cualquier numero de mutaciones que alteran o suprimen una o mas actividades de glicosilacion.

El termino “expresion genica” o “expresion” puede referirse a los procesos celulares mediante los cuales se produce un polipeptido biologicamente activo a partir de una secuencia de ADN y presenta una actividad biologica en una celula. Como tal, la expresion genica implica los procesos de transcripcion y traduccion, pero tambien implica procesos postranscripcionales y postraduccionales que pueden influir en una actividad biologica de un gen o producto genico. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, smtesis, procesamiento y transporte de ARN, asf como smtesis, transporte de polipeptidos, y modificacion postraduccional de polipeptidos.

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Por ejemplo, en el presente documento se describen metodos para producir un polipeptido de SAP que se describe en el presente documento expresando un gen de SAP en una celula. La celula puede contener un gen de SAP endogeno o fragmento del mismo. Puede introducirse (por ejemplo, transformarse, transfectarse, etc.) un polinucleotido que codifica un polipeptido de SAP exogeno o fragmento del mismo en una celula. Los polinucleotidos de SAP adecuados que pueden introducirse en una celula incluyen fragmentos de acido nucleico, asf como construcciones de acido nucleico o vectores de expresion. El gen endogeno o exogeno puede codificar un polipeptido de SAP humano.

El fragmento de acido nucleico, por ejemplo, que codifica un polipeptido de SAP humano, usado para transformar la celula huesped puede incluir un sitio de Shine-Dalgarno (por ejemplo, un sitio de union a ribosoma) y un sitio de iniciacion (por ejemplo, el codon ATG) para iniciar la traduccion del mensaje transcrito para producir la enzima. Ademas, puede incluir una secuencia de terminacion para terminar la traduccion. Una secuencia de terminacion es normalmente un codon para el que no existe un aminoacetil-ARNt correspondiente, terminando asf la smtesis del polipeptido. Puede entregarse una construccion de acido nucleico que codifica para un polipeptido de SAP, por ejemplo, como plasmido de expresion que, cuando se transcribe en la celula, produce un polipeptido de SAP.

Un vector de expresion adecuado puede comprender una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido de SAP que se describe en el presente documento operativamente unida a al menos una secuencia reguladora. Las secuencias reguladoras se reconocen en la tecnica y se seleccionan para dirigir la expresion de cualquiera de los polipeptidos de la divulgacion. En consecuencia, el termino secuencia reguladora incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresion. Se describen secuencias reguladoras a modo de ejemplo en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Por ejemplo, cualquier secuencia de control de la expresion que regule la expresion de una secuencia de ADN cuando esta operativamente unida a la misma puede usarse en estos vectores para expresar cualquiera de los polipeptidos que se describen en el presente documento. Dichas secuencias de control de la expresion utiles incluyen, por ejemplo, los promotores temprano y tardm de SV40, el promotor tet, el promotor temprano inmediato de adenovirus o citomegalovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o tRc, promotor de T7 cuya expresion esta dirigida por ARN polimerasa de T7, las regiones de promotor y operador principales del fago lambda, las regiones de control para la protema de recubrimiento fd, el promotor para 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glicoltticas, los promotores de fosfatasa acida, por ejemplo, Pho5, los promotores de los factores de a-acoplamiento, el promotor de polihedrina del sistema de baculovirus y otras secuencias que se sabe que controlan la expresion de genes de celulas procariotas o eucariotas o sus virus, y diversas combinaciones de los mismos. Debe entenderse que el diseno del vector de expresion puede depender de factores tales como la eleccion de la celula huesped que va a transformarse y/o el tipo de protema que se desea que se exprese. Ademas, tambien deben considerarse el numero de copias del vector, la capacidad para controlar el numero de copias y la expresion de cualquier otra protema codificada por el vector, tal como marcadores de antibiotico.

El fragmento de acido nucleico o sistema de expresion usado para transformar la celula huesped puede incluir opcionalmente una o mas secuencias marcadoras. En terminos generales, las secuencias marcadoras adecuadas codifican normalmente un producto genico, habitualmente una enzima que inactiva o detecta de otra forma o se detecta por un compuesto en el medio de crecimiento. Por ejemplo, la inclusion de una secuencia marcadora puede hacer que la celula transformada sea resistente a un antibiotico, o puede conferir un metabolismo espedfico de compuesto a la celula transformada. Los ejemplos de secuencias marcadoras adecuadas que confieren resistencia incluyen kanamicina, ampicilina, cloranfenicol y tetraciclina. Como alternativa, en vez de presion selectiva, puede usarse un gen marcador que permita la deteccion de colonias particulares que contienen el gen, tal como p- galactosidasa, en el que se emplea un sustrato que proporciona un producto coloreado.

Una diversidad de metodos es adecuada para transformar una celula que se describe en el presente documento con un fragmento de acido nucleico o vector de expresion. Los metodos de transformacion comunes incluyen electroporacion, transformacion mediada por liposomas, transformacion mediada por calcio y transfeccion mediada por virus.

Cuando se transforma una celula huesped con un fragmento de acido nucleico o sistema de expresion que se describe en el presente documento, el gen (por ejemplo, SAP humano) en dicho sistema puede integrarse en el ADN cromosomico de las celulas huesped mediante una denominada recombinacion homologa y el huesped portara el sistema de expresion de manera estable.

Con el fin de integrar el sistema de expresion en el vector en el ADN cromosomico de las celulas huesped, puede usarse un gen marcador de seleccion apropiado en el que dicho gen marcador tiene una secuencia homologa al gen en el ADN cromosomico de la celula huesped espedfica. El experto en la tecnica puede seleccionar facilmente marcadores de seleccion para dicho fin. Como ejemplo, un marcador preferido es un gen que existe en un cromosoma y que esta relacionado con el metabolismo de las celulas huesped. Concretamente, se prefiere usar un huesped que se ha modificado de tal manera que el gen mencionado anteriormente en el cromosoma se inactivara mediante un medio apropiado tal como una mutacion. El huesped puede someterse despues a una recombinacion homologa con un vector de expresion que contiene el gen intacto correspondiente, con lo cual solo los transformantes que contienen el gen de metabolismo normal pueden crecer para seleccionarse. Por tanto, si se ha

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introducido un gen marcador de este tipo en el vector de expresion, tendra lugar una recombinacion homologa entre el gen marcador en dicho vector de expresion y la parte correspondiente del ADN cromosomico, con lo cual el casete de expresion del gen heterologo se integrara simultaneamente en el ADN cromosomico.

El termino “expresar” una protema en una celula tambien puede incluir metodos de introduccion de una protema por sf misma en celulas. Por tanto, en determinados aspectos, la divulgacion proporciona metodos para preparar un polipeptido de SAP que se describe en el presente documento introduciendo un polipeptido de SAP en una celula. En la tecnica se conocen tecnicas para introducir polipeptidos directamente en una celula e implican generalmente un procedimiento de permeacion de la membrana celular. Dichas tecnicas incluyen, pero no se limitan a, microinyeccion de polipeptidos de SAP; encapsulacion de un polipeptido de SAP dentro de vesmulas de membrana (por ejemplo, liposomas, cuerpos capsulares, fantasmas de eritrocitos, protoplastos, etc.) y puesta en contacto de los mismos con una membrana celular para de ese modo provocar la introduccion intracelular del polipeptido de SAP mediante fusion; uso de metodos ffsicos (por ejemplo, mecanicos, qmmicos, electricos, etc.) que se basan en macromoleculas que entran en celulas mediante difusion a traves de orificios introducidos de manera transitoria en sus membranas plasmaticas (por ejemplo, carga por raspado, carga por perlas, etc.); y mediante captacion a traves de endocitosis natural debido a fagocitosis celular. Un metodo de introduccion intracelular puede utilizar una ruta mediada por receptor, en el que uno de diversos receptores expresados sobre la superficie celular se fija como diana y se une un polipeptido de SAP (de manera covalente o no covalente) al ligando relacionado que actua como resto transportador. Se han descrito varios metodos para introducir protemas en celulas vivas usando adsorcion electrostatica, en la que en primer lugar se cationiza la protema y luego se pone en contacto con la superficie cargada negativamente de una celula (vease la publicacion de patente japonesa n.° 2004/049214).

En determinados aspectos, en el presente documento se describen celulas CHO que expresan un polipeptido de SAP. La celula CHO puede expresar un polipeptido de SAP exogeno. La celula CHO puede expresar un polipeptido de SAP humano. La divulgacion puede proporcionar celulas CHO que comprenden una secuencia de polinucleotido que codifica un polipeptido de SAP. La secuencia de polinucleotido puede codificar un polipeptido de SAP humano. Cualquiera de las tecnicas mencionadas anteriormente puede usarse para “expresar” un polipeptido de SAP que se describe en el presente documento en una celula CHO o cualquier otra celula adecuada que se describe en el presente documento.

Cuando cualquiera de las actividades de glicosilacion de la celula silvestre o modificada por ingeniena genetica puede inducirse o depende de la presencia de una clave de induccion (por ejemplo, una clave qrnmica o ffsica), la celula silvestre o modificada por ingeniena genetica, opcionalmente, puede cultivarse en presencia de un agente de induccion antes, durante o posteriormente a la introduccion del acido nucleico que codifica un polipeptido de SAP o un polipeptido de SAP. Por ejemplo, tras la introduccion del polipeptido de SAP en la celula, puede exponerse a un agente induccion qrnmico que puede promover la expresion de una o mas protemas que tienen una actividad de N- glicosilacion silvestre o alterada. Cuando multiples claves de induccion inducen la expresion condicional de una o mas protemas que tienen una actividad de N-glicosilacion silvestre y/o alterada, puede ponerse en contacto una celula con multiples agentes de induccion. El medio de cultivo puede modificarse para producir la estructura de glicanos deseada en el polipeptido de SAP. Por ejemplo, puede modificarse la concentracion de suero, glucosa y/o lfpido (por ejemplo, dolicol) del medio para la produccion optima de la glicovariante de SAP deseada. Pueden alterarse la temperatura, el pH y/o la osmolaridad del medio de cultivo para la produccion optima de la glicovariante de SAP deseada.

Un polipeptido de SAP variante que se describe en el presente documento puede procesarse adicionalmente in vivo o puede procesarse in vitro antes de o tras el aislamiento de la celula o el medio celular. El procesamiento adicional puede incluir la modificacion de uno o mas restos de glicano del polipeptido de SAP o una modificacion en el polipeptido de SAP distinta de su(s) estructura(s) de glicano. El procesamiento adicional del polipeptido de SAP puede incluir la adicion (union covalente o no covalente) de uno o mas restos heterologos. El procesamiento adicional puede implicare el tratamiento enzimatico o qrnmico del polipeptido de SAP. El tratamiento enzimatico puede implicar poner en contacto el polipeptido de SAP con una o mas glicosidasa, fosfodiesterasa, fosfolipasa, glicosiltransferasa o proteasa durante un tiempo suficiente para inducir la modificacion, adicion o delecion de restos de glicano (por ejemplo, galactosa, manosa, fucosa, acido sialico, xilosa, N-acetilglucosamina, etc.) sobre el polipeptido de SAP. La adaptacion de una cadena de oligosacarido con union en N puede lograrse mediante la modificacion, adicion o delecion secuenciales de los restos de azucar deseados, usando tecnicas bien conocidas en la tecnica. La escision enzimatica de restos de hidrato de carbono sobre variantes de peptido puede lograrse mediante el uso de una diversidad de endo- y exoglicosidasas tal como se describe por Thotakura et al., 1987, Met. Enzymol. 138: 350. Se desvelan metodos a modo de ejemplo de adicion de restos de azucar en las patentes de los EE.UU. n.° 5.876.980, 6.030.815, 5.728.554 y 5.922.577.

La modificacion de la estructura de glicanos de SAP puede requerir la presencia de uno o mas nucleotidos de azucar. Los nucleotidos de azucar a modo de ejemplo que se usan en el presente documento incluyen mono-, di- o trifosfatos de nucleotidos o analogos de los mismos. El nucleotido de azucar modificado puede seleccionarse entre un UDP-glicosido, CMP-glicosido o un GDP-glicosido. El nucleotido de azucar puede seleccionarse entre una UDP- galactosa, UDP-galactosamina, UDP-glucosa, UDP-glucosamina, GDP-manosa, GDP-fucosa, CMP-acido sialico, CMP-acido N-glicolilneurammico o CMP-NeuAc. Puede utilizarse un nucleotido de azucar modificado para anadir un

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resto de azucar modificado al polipeptido de SAP. Tambien se usan derivados de N-acetilamina de los nucleotidos de azucar en el metodo que se describe en el presente documento.

La adicion o eliminacion qmmica de restos glicosilo puede llevarse a cabo mediante cualquier metodo adecuado. Por ejemplo, la desglicosilacion qmmica puede implicar la exposicion del polipeptido de SAP a acido trifluorometanosulfonico, u otro acido fuerte. Este tratamiento da como resultado la escision de la mayona o la totalidad de los azucares excepto el azucar de union (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), al tiempo que el peptido permanece intacto. Se describen metodos de desglicosilacion qmmica por Haldmuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 y por Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118: 131. El tratamiento qmmico puede implicar, por ejemplo, poner en contacto el polipeptido de SAP alterado con un acido, tal como acido fluortudrico, durante un tiempo suficiente para inducir la modificacion del polipeptido de SAP. El tratamiento con acido fluortudrico, en determinadas condiciones, elimina espedficamente los restos de manosa que estan unidos por fosfodiester a los glicanos, al tiempo que deja el fosfato sobre el glicano. Un polipeptido de SAP alterado puede procesarse adicionalmente mediante la adicion o eliminacion de un grupo fosfato de uno o mas N-glicanos. Por ejemplo, puede ponerse en contacto un polipeptido de SAP alterado con una manosil cinasa o una manosil fosfatasa.

En determinados aspectos, es deseable modificar solo restos de azucar terminales en la estructura de glicanos del polipeptido de SAP (oligosacarido con union en No con union en O). Pueden modificarse una o mas ramificaciones de la estructura de glicanos de SAP mediante la adicion, eliminacion, sustitucion o modificacion de al menos un resto de acido sialico terminal. Pueden usarse metodos adecuados para modificar glicanos descritos en el presente documento para alterar solo el resto de azucar terminal en la estructura de glicanos de SAP. Se puede sustituir un resto de acido sialico terminal que tiene una union a2,6, union a2,8 o union a2,9 por uno o mas restos de acido sialico con union a2,3 terminales. En un aspecto particular, puede modificarse SAP humano que comprende restos de acido sialico con union a2,6 terminales segun uno de los metodos que se describen en el presente documento con el fin de sustituir uno o mas de los restos de acido sialico con union a2,6 terminales por uno o mas restos de acido sialico con union a2,3. Puede modificarse un resto de acido sialico con union a2,3 terminal para anadir uno o mas restos de acido sialico con union a2,6, con union a2,8 y con union a2,9.

En determinados aspectos, el procedimiento de preparacion de un polipeptido de SAP que se describe en el presente documento puede implicar una primera etapa de desglicosilar el polipeptido de SAP. El polipeptido de SAP puede estar parcial o completamente desglicosilado. La primera etapa de desglicosilacion puede implicar eliminar solo restos de azucar terminales de al menos una ramificacion de la estructura de glicanos sobre el polipeptido de SAP. La primera etapa de desglicosilacion puede eliminar al menos un resto de acido sialico con union a2,6. La primera etapa de desglicosilacion puede eliminar al menos un glicano con union en O. La primera etapa de desglicosilacion puede eliminar al menos un glicano con union en N. La primera etapa de desglicosilacion puede eliminar todos los glicanos con union en O y con union en N. Se procesa adicionalmente un polipeptido de SAP desglicosilado (parcial o completamente) segun los metodos que se describen en el presente documento, lo que incluye, pero no se limita a, modificar qmmica o enzimaticamente el polipeptido de SAP parcial o completamente desglicosilado, introducir el polipeptido de SAP parcial o completamente desglicosilado en una celula, o combinacion de los mismos, en las que el o los metodos producen un polipeptido de SAP variante que se describen en el presente documento. Tras haber introducido un polipeptido de sAp parcial o completamente desglicosilado en una celula, puede modificarse adicionalmente, in vivo o in vitro, segun los metodos que se describen en el presente documento para producir un polipeptido de SAP variante que se describe en el presente documento. De manera similar, un polipeptido de SAP parcial o completamente desglicosilado que se modifica in vitro, usando metodos enzimaticos o qmmicos descritos en el presente documento, puede introducirse en una celula para producir un polipeptido de SAP variante que se describe en el presente documento.

Se entiende que un polipeptido de SAP que se describe en el presente documento puede procesarse en una celula, aunque no es necesario. Por ejemplo, en el presente documento tambien se proporcionan metodos libres de celulas de produccion de un polipeptido de SAP que se describe en el presente documento. En algunos aspectos los metodos libres de celulas pueden incluir la etapa de poner en contacto un polipeptido de SAP, en condiciones de glicosilacion, con un lisado celular preparado a partir de una celula silvestre (por ejemplo, una celula fungica, una celula vegetal o una celula animal) o celula modificada por ingeniena genetica que tiene al menos una actividad de glicosilacion modificada, en los que la puesta en contacto del polipeptido de SAP con el lisado celular une un oligosacarido con union en No con union en O al polipeptido de SaP o modifica un oligosacarido con union en No con union en O existente en el polipeptido de sAp. Por “condiciones de N-glicosilacion” quiere decirse que una mezcla (por ejemplo, de polipeptido de SAP y lisado celular) se incuba en condiciones que permiten la N- glicosilacion alterada deseada.

Los metodos adecuados para obtener lisados celulares que conservan la actividad o integridad de una o mas actividades de glicosilacion en el lisado pueden incluir el uso de tampones y/o inhibidores apropiados, incluyendo inhibidores de nucleasas, proteasas y fosfatasas que conservan o minimizan cambios en actividades de N- glicosilacion en el lisado celular. Dichos inhibidores incluyen, por ejemplo, quelantes tales como acido etilendiaminatetraacetico (EDTA), acido etilenglicol-bis(P-aminoetil eter)N,N,N1,N1-tetraacetico (EGTA), inhibidores de proteasas tales como fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), aprotinina, leupeptina, antipama, e inhibidores de fosfatasas tales como fosfato, fluoruro de sodio y vanadato. Los inhibidores pueden elegirse de manera que no

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interfieren con, o afectan solo de manera mmimamente adversa a, la actividad o actividades de N-glicosilacion de interes. Se describen tampones y condiciones apropiados para obtener lisados que contienen actividades enzimaticas, por ejemplo, en Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (suplemento 47), John Wiley & Sons, Nueva York (1999); Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Harlow y Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1999); Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3a ed. Burtis and Ashwood, eds. W.B. Saunders, Filadelfia, (1999).

Un lisado celular puede procesarse adicionalmente para eliminar o minimizar la presencia de sustancias interferentes, segun sea apropiado. Si se desea, puede fraccionarse un lisado celular mediante cualquiera de una diversidad de metodos bien conocidos por los expertos en la tecnica, incluyendo fraccionamiento subcelular, y tecnicas cromatograficas tales como cromatograffa de intercambio ionico, fase hidrofoba e inversa, exclusion molecular, afinidad e induccion de carga hidrofoba (veanse, por ejemplo, Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, tercera edicion, Springer-Verlag, Nueva York (1993); Burton y Harding, J. Chromatogr. A 814: 71-81 (1998)), o cualquier otra tecnica de purificacion adecuada.

Puede prepararse un lisado celular en el que los organulos celulares completos permanecen intactos y/o funcionales. Por ejemplo, un lisado puede contener uno o mas de reffculo endoplasmatico rugoso intacto, reffculo endoplasmatico liso intacto o aparato de Golgi intacto. Se describen metodos adecuados para preparar lisados que contienen organulos celulares y someter a prueba la funcionalidad de los organulos, por ejemplo, en Moreau et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(7): 4329-4333; Moreau et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(7): 4322-4328; Rexach et al. (1991) J. Cell Biol. 114(2): 219-229; y Paulik et al. (1999) Arch. Biochem. Biophys. 367(2): 265-273.

El polipeptido de SAP puede ponerse en contacto con tan solo una protema purificada que tiene actividad de glicosilacion. El polipeptido de SAP puede ponerse en contacto con mas de una protema purificada que tiene actividad de glicosilacion. Una o mas protemas que tienen actividad de glicosilacion pueden purificarse usando tecnicas de aislamiento de protemas convencionales. Un polipeptido de SAP puede ponerse en contacto con una o mas protemas en un tampon adecuado durante un tiempo suficiente para inducir la modificacion de los polipeptidos de SAP tal como se describio anteriormente. El polipeptido de SAP puede ponerse en contacto con mas de una protema al mismo tiempo o secuencialmente. Cuando el polipeptido de SAP se pone en contacto secuencialmente con mas de una protema que tiene actividad de glicosilacion, el polipeptido de SAP puede purificarse tras una o mas etapas, pero no es necesario. Es decir, un polipeptido de SAP puede ponerse en contacto con una actividad de protema “A” y luego purificarse antes de poner en contacto la molecula con una actividad de protema “B”. En la tecnica se conocen metodos de modificacion de peptidos como tales, por ejemplo, Lee y Park (2002) 30(6): 716-720 y Fujita y Takegawa (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 282(3): 678-682.

Los metodos que se describen en el presente documento comprenden una etapa de aislamiento de un polipeptido de SAP, por ejemplo, a partir de una celula o a partir de componentes de un lisado celular. En la tecnica se conocen muchas tecnicas convencionales para el aislamiento de protemas. Por ejemplo, los metodos de aislamiento de polipeptidos incluyen, pero no se limitan a, cromatograffa de exclusion molecular, cromatograffa de fase inversa, cromatograffa de lfquidos (por ejemplo, HPLC), cromatograffa de afinidad (por ejemplo, cromatograffa de quelacion de metales o de inmunoafinidad), cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de interaccion hidrofoba, precipitacion, solubilizacion diferencial, inmunoprecipitacion, centrifugacion (por ejemplo, ultracentrifugacion, centrifugacion en gradiente de sacarosa, etc.) o cualquier combinacion de las mismas. El polipeptido de SAP puede conjugarse con un marcador de afinidad para facilitar la purificacion del polipeptido. Los marcadores de afinidad adecuadas para la purificacion de SAP incluyen, pero no se limitan a, marcadores de protema de union a quitina (CBP), protema de union a maltosa (MBP), glutation-S-transferasa (GST), estreptavidina, biotina y poli(His). Los marcadores de afinidad pueden producirse como parte de la protema recombinante (es decir, como una protema de fusion que comprende un dominio de marcador de afinidad heterologo y un dominio de polipeptido de SAP) o unirse (de manera covalente o no covalente) in vivo o in vitro al polipeptido de SAP. Pueden usarse multiples etapas de purificacion para aislar un polipeptido de SAP. Por ejemplo, un polipeptido de SAP que comprende un marcador de purificacion puede purificarse por afinidad a partir de un lisado celular o mezcla de multiples componentes usando purificacion por afinidad. Despues, el polipeptido de SAP purificado por afinidad puede purificarse adicionalmente para eliminar cualquier contaminante no deseado minoritario mediante una etapa de purificacion adicional, por ejemplo, cromatograffa de exclusion molecular o HPLC-FI. Cuando se produce un polipeptido que se describe en el presente documento en una celula, el polipeptido de SAP puede aislarse de la propia celula o de los medios en los que se cultivo la celula. Se producen polipeptidos de SAP que se describen en el presente documento y se secretan de una celula a los medios de cultivo. El aislamiento puede comprender la separacion de la fraccion celular de la fraccion soluble que contiene SAP (por ejemplo, mediante centrifugacion).

En algunos aspectos, puede ser ventajoso unir el polipeptido de SAP a un soporte de fase solida antes de poner en contacto la molecula diana con una o mas actividades de N-glicosilacion. Dicha union puede permitir una purificacion mas facil tras las modificaciones de la N-glicosilacion. Los soportes de fase solida adecuados incluyen, pero no se limitan a, placas de ensayo de multiples pocillos, parffculas (por ejemplo, parffculas magneticas o codificadas), una columna de cromatograffa o una membrana.

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Cualquiera de los polipeptidos de SAP alterados que se describen en el presente documento puede unirse a un resto heterologo usando medios enzimaticos o qmmicos. Un “resto heterologo” se refiere a cualquier constituyente que se une (por ejemplo, de manera covalente o no covalente) a la molecula diana alterada, constituyente que es diferente de un constituyente originalmente presente en el polipeptido de SAP. Los restos heterologos incluyen, por ejemplo, polfmeros solubles e insolubles en agua, restos de direccionamiento, restos terapeuticos, restos de diagnostico y biomoleculas.

Los polipeptidos de SAP que se describen en el presente documento pueden comprender uno o mas restos de azucar “modificados”. Un grupo modificador puede unirse a un resto de azucar por medios enzimaticos, medios qmmicos o una combinacion de los mismos, produciendo de ese modo un azucar modificado, por ejemplo, galactosa, fucosa o acido sialico modificados. Cuando se usa un acido sialico modificado, puede usarse o bien una sialil-transferasa o bien una trans-sialidasa en estos metodos. Los azucares pueden sustituirse en cualquier posicion que permita la union del resto modificador, pero que todavfa permita que el azucar funcione como sustrato para la enzima usada para acoplar el azucar modificado al peptido.

En general, el resto de azucar y el grupo modificador se unen entre sf a traves del uso de grupos reactivos, que se transforman normalmente mediante el proceso de union en un nuevo grupo funcional o especie no reactiva. El o los grupos funcionales reactivos de azucar pueden ubicarse en cualquier posicion en el resto de azucar. Grupos reactivos y clases de reacciones utiles en la practica de la presente divulgacion son generalmente los que se conocen bien en la tecnica de qmmica de bioconjugados. Clases de reacciones favorecidas actualmente disponibles con restos de azucar reactivos son las que avanzan en condiciones relativamente suaves. Estas incluyen, pero no se limitan a, sustituciones nucleofilas (por ejemplo, reacciones de aminas y alcoholes con haluros de acilo, esteres activos), sustituciones electrofilas (por ejemplo, reacciones de enamina) y adiciones a enlaces multiples de carbono- carbono y carbono-heteroatomo (por ejemplo, reaccion de Michael, adicion de Diels-Alder). Estas y otras reacciones utiles se comentan, por ejemplo, en Smith y March, Advanced Organic Chemistry, 5a ed., John Wiley & Sons, Nueva York, 2001; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; y Feeney et al., Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982.

Los grupos funcionales reactivos utiles colgantes de un nucleo de azucar o grupo modificador incluyen, pero no se limitan a: (a) grupos carboxilo y diversos derivados de los mismos (por ejemplo, esteres de N-hidroxisuccinimida, esteres de N-hidroxibenzotriazol, haluros de acido, acilimidazoles, tioesteres, esteres de p-nitrofenilo, esteres de alquilo, alquenilo, alquinilo y aromaticos); (b) grupos hidroxilo, que pueden convertirse, por ejemplo, en esteres, eteres, aldehfdos, etc.; (c) grupos haloalquilo, en los que el haluro puede desplazarse posteriormente con un grupo nucleofilo tal como, por ejemplo, una amina, un anion carboxilato, anion tiol, carbanion o un ion de alcoxido, dando como resultado de ese modo la union covalente de un nuevo grupo al grupo funcional del atomo de halogeno; (d) grupos dienofilos, que pueden participar en reacciones de Diels-Alder tales como, por ejemplo, grupos maleimido; (e) grupos aldehfdo o cetona, de manera que la derivatizacion posterior es posible por medio de la formacion de derivados de carbonilo tales como, por ejemplo, iminas, hidrazonas, semicarbazonas u oximas, o por medio de mecanismos tales como adicion de Grignard o adicion de alquil-litio; (f) grupos haluro de sulfonilo para la reaccion posterior con aminas, por ejemplo, para formar sulfonamidas; (e) grupos tiol, que pueden convertirse, por ejemplo, en disulfuros o hacerse reaccionar con haluros de alquilo y acilo; (h) grupos amina o sulfhidrilo, que pueden, por ejemplo, acilarse, alquilarse u oxidarse; (i) alquenos, que pueden someterse, por ejemplo, a cicloadiciones, acilacion, adicion de Michael, metatesis, reaccion de Heck, etc.; (j) epoxidos, que pueden reaccionar, por ejemplo, con aminas y compuestos de hidroxilo.

Los grupos funcionales reactivos pueden elegirse de manera que no participen en, o interfieran con, las reacciones necesarias para ensamblar el nucleo de azucar reactivo o grupo modificador. Como alternativa, puede protegerse un grupo funcional reactivo frente a su participacion en la reaccion por la presencia de un grupo protector. Los expertos en la tecnica entienden como proteger un grupo funcional particular de manera que no interfiera con un conjunto elegido de condiciones de reaccion. Para ejemplos de grupos protectores utiles, vease, por ejemplo, Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Nueva York, 1991.

El azucar modificado puede ser un azucar activado. Azucares modificados activados utiles en el presente documento son normalmente glicosidos que se han alterado de manera sintetica para incluir un grupo saliente activado. Como se usa en el presente documento, el termino “grupo saliente activado” se refiere a los restos que se desplazan facilmente en reacciones de sustitucion nucleofila reguladas por enzimas. En la tecnica se conocen muchos azucares activados. Veanse, por ejemplo, Vocadlo et al., en Carbohydrate Chemistry and Biology, vol. 2, Ernst et al. Ed., Wiley-VCH Verlag: Weinheim, Alemania, 2000; Kodama et al., Tetrahedron Lett. 34: 6419 (1993); Lougheed, et al., J. Biol. Chem. 274: 37717 (1999). Los ejemplos de dichos grupos salientes incluyen fluoro, cloro, bromo, tosilato, mesilato, triflato y similares. Los grupos salientes activados preferidos para su uso en el presente documento son los que no estorban estericamente de manera significativa la transferencia enzimatica del glicosido al aceptor. En consecuencia, los ejemplos de derivados de glicosidos activados incluyen fluoruros de glicosilo y mesilatos de glicosilo. Son ejemplos de fluoruros de glicosilo fluoruro de a-galactosilo, fluoruro de a-manosilo, fluoruro de a-glucosilo, fluoruro de a-fucosilo, fluoruro de a-xilosilo, fluoruro de a-sialilo, fluoruro de a-N- acetilglucosaminilo, fluoruro de a-N-acetilglucosaminilo, fluoruro de p-galactosilo, fluoruro de p-manosilo, fluoruro de beta-glucosilo, fluoruro de p-fucosilo, fluoruro de p-xilosilo, fluoruro de p-sialilo, fluoruro de p-N-acetilglucosaminilo y

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fluoruro de p-N-acetilgalactosaminilo.

Puede conjugarse un resto de azucar modificado con uno o mas poKmeros solubles en agua. Los expertos en la tecnica conocen muchos poKmeros solubles en agua y son utiles en la practica de la presente divulgacion. El termino poUmero soluble en agua engloba especies tales como sacaridos (por ejemplo, dextrano, amilosa, acido hialuronico, poli(acido sialico), heparanos, heparinas, etc.); poliaminoacidos; acidos nucleicos; polfmeros sinteticos (por ejemplo, poli(acido acnlico), polieteres, por ejemplo, polietilenglicol); peptidos, protemas, y similares. La presente divulgacion puede ponerse en practica con cualquier polfmero soluble en agua con la unica limitacion de que el polfmero debe incluir un punto en el que pueda unirse el resto del conjugado.

En la bibliograffa se describen metodos y la qmmica para la activacion de polfmeros solubles en agua y sacaridos, asf como metodos para conjugar sacaridos y polfmeros con diversas especies. Los metodos usados comunmente para la activacion de polfmeros incluyen la activacion de grupos funcionales con bromuro de cianogeno, peryodato, glutaraldetndo, biepoxidos, epiclorohidrina, divinilsulfona, carbodiimida, haluros de sulfonilo, triclorotriazina, etc. (veanse, R. F. Tailor, (1991), Protein Immobilization, Fundamentals and Applications, Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al., (1993), Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, N.Y.; Dunn, R. L., et al., Eds. Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, aCs Symposium Series vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991).

En determinados aspectos, se conjuga un resto de azucar modificado con uno o mas polfmeros insolubles en agua. Puede usarse la conjugacion con un polfmero insoluble en agua para administrar un peptido terapeutico de una manera controlada. En la tecnica se conoce sistemas de administracion de farmacos polimericos. Vease, por ejemplo, Dunn et al., Eds. Polymeric drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991. Los expertos en la tecnica apreciaran que sustancialmente cualquier sistema de administracion de farmacos conocido puede aplicarse a los conjugados que se describen en el presente documento.

Los polfmeros insolubles en agua representativos incluyen, pero no se limitan a, polifosfazenos, poli(alcoholes vimlicos), poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, poliacrilamidas, polialquilenglicoles, poli(oxidos de alquileno), poli(tereftalatos de alquileno), poli(vinil eteres), poli(esteres vimlicos), poli(haluros de vinilo), polivinilpirrolidona, poliglicolidas, polisiloxanos, poliuretanos, poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo), poli(acrilato de octadecilo), polietileno, polipropileno, polietilenglicol, poli(oxido de etileno), poli(tereftalato de etileno), poli(acetato de vinilo), poli(cloruro de vinilo), poliestireno, polivinilpirrolidona, pluronicos y polivinilfenol, y copolfmeros de los mismos.

Estos y otros polfmeros comentados en el presente documento pueden obtenerse facilmente de fuentes comerciales tales como Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.), Polysciences (Warrenton, Pa.), Aldrich (Milwaukee, Wis.), Fluka (Ronkonkoma, N.Y.) y BioRad (Richmond, Calif.), o bien sintetizarse a partir de monomeros obtenidos de estos proveedores usando tecnicas convencionales. Los polfmeros biodegradables representativos utiles en los conjugados que se describen en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, polilactidas, poliglicolidas y copolfmeros de las mismas, poli(tereftalato de etileno), poli(acido butmco), poli(acido valerico), poli(lactida-co- caprolactona), poli(lactida-co-glicolida), poliantudridos, poliortoesteres, combinaciones y copolfmeros de los mismos. Son de uso particular las composiciones que forman geles, tales como los que incluyen colageno, y pluronicos.

Pueden conjugarse uno o mas restos de azucar modificados con una o mas moleculas de PEG.

En determinados aspectos, el azucar modificado puede conjugarse con una biomolecula. La biomolecula que se describe en el presente documento puede incluir, pero no se limita a, protemas funcionales, enzimas, antfgenos, anticuerpos, peptidos, acidos nucleicos (por ejemplo, nucleotidos o nucleosidos unicos, oligonucleotidos, polinucleotidos y acidos nucleicos monocatenarios y con mas cadenas), lectinas, receptores o una combinacion de los mismos. Las biomoleculas pueden ser esencialmente no fluorescentes, o emiten una cantidad minima de fluorescencia tal que son inapropiadas para su uso como marcador fluorescente en un ensayo. Otras biomoleculas pueden ser fluorescentes.

La biomolecula puede ser un resto de direccionamiento. Un “resto de direccionamiento” y “agente de direccionamiento”, tal como se usa en el presente documento, se refieren a especies que se localizaran selectivamente en un tejido o region particular del cuerpo. Puede seleccionarse una biomolecula para dirigir el polipeptido de SAP que se describe en el presente documento a un compartimento intracelular especffico, potenciando de ese modo la administracion del peptido a ese compartimento intracelular en relacion con la cantidad de peptido no derivatizado que se administra al tejido. La localizacion esta mediada por el reconocimiento especffico de determinantes moleculares, el tamano molecular del conjugado o agente de direccionamiento, las interacciones ionicas, interacciones hidrofobas y similares. Los expertos en la tecnica conocen otros mecanismos para dirigir un agente a una region o tejido particular.

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El azucar modificado puede incluir un resto terapeutico. Los expertos en la tecnica apreciaran que hay solapamiento entre la categona de las biomoleculas y los restos terapeuticos, es dedr, muchas biomoleculas tienen propiedades o potencial terapeutico.

Las clases de restos terapeuticos utiles incluyen, por ejemplo, farmacos antiinflamatorios no esteroideos; farmacos antiinflamatorios esteroideos; adyuvantes; farmacos antihistammicos; farmacos antitusivos; farmacos antiprunticos; farmacos anticolinergicos; farmacos antiemeticos y farmacos antinauseosos; farmacos anorexfgenos; farmacos estimulantes centrales; farmacos antiarntmicos; farmacos bloqueantes p-adrenergicos; farmacos cardiotonicos; farmacos antihipertensores; farmacos diureticos; farmacos vasodilatadores; farmacos vasoconstrictores; farmacos antiulcerosos; farmacos anestesicos; farmacos antidepresivos; farmacos tranquilizantes y sedantes; farmacos antipsicoticos; y farmacos antimicrobianos.

Otros restos farmacologicos utiles en la practica de la presente divulgacion incluyen farmacos antineoplasicos, agentes citocidas, antiestrogenos y antimetabolitos. Tambien se incluyen dentro de esta clase agentes basados en radioisotopos tanto para diagnostico (por ejemplo, obtencion de imagenes) como para terapia, y toxinas conjugadas.

El resto terapeutico tambien puede ser una hormona, un relajante muscular, un antiespasmodico, agente activante oseo, agente modulador endocrino, modulador de la diabetes, androgeno, antidiureticos o farmaco de calcitonina.

Otros grupos de modificacion utiles incluyen farmacos inmunomoduladores, inmunosupresores, etc. Tambien son utiles grupos con actividad antiinflamatoria, tales como sulindaco, etodolaco, ketoprofeno y ketorolaco. Otros farmacos de uso conjuntamente con la presente divulgacion resultaran evidentes para los expertos en la tecnica.

Los polipeptidos de SAP con N-glicosilacion alterada producidos mediante los metodos que se describen en el presente documento pueden ser homogeneos (es decir, la muestra de polipeptido de SAP es uniforme en estructura de N-glicanos espedfica) o sustancialmente homogeneos. Por “sustancialmente homogeneos” quiere decirse que al menos aproximadamente el 25 % (por ejemplo, al menos aproximadamente el 27 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el

45 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente el

60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el

75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el

90 %, o al menos aproximadamente el 95 %, o al menos aproximadamente el 99 %) de los polipeptidos de SAP contienen la misma estructura de N-glicanos espedfica.

Los polipeptidos de SAP variantes que se describen en el presente documento tienen una CI50 para inhibir la diferenciacion de monocitos en fibrocitos in vitro que es menor de 1/2, menor de 1/3, menor de 1/4, menor de 1/10 o menor de 1/100 de la de una muestra correspondiente de SAP de tipo silvestre aislado de suero humano. Hay muchos metodos bien caracterizados para determinar la receptividad de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) o monocitos a SAP para la diferenciacion en fibrocitos. Estos metodos pueden usarse para determinar la potencia relativa de cualquiera de los polipeptidos variantes de SAP que se describen en el presente documento en comparacion con una muestra de SAP derivado de suero humano, cualquier otro polipeptido variante de SAP u otro agente activante o supresor de fibrocitos. Pueden obtenerse PBMC o monocitos adecuados para su uso en estos metodos de diversas lmeas de cultivo tisular. Como alternativa, pueden obtenerse celulas adecuadas para ensayos de diferenciacion en fibrocitos de cualquier muestra biologica que contenga PBMC o monocitos. La muestra biologica puede obtenerse de suero, plasma, tejido sano o tejido fibrotico. En general, los ensayos de diferenciacion en fibrocitos se realizan incubando PBMC o monocitos en medios con diversas concentraciones de un polipeptido de SAP para determinar el grado de diferenciacion en fibrocitos. La concentracion de SAP puede oscilar entre 0,0001 |jg/ml y 1 mg/ml, y en algunas realizaciones es de 0,001 jig/ml, 1,0 jig/ml, 5 jig/ml, 10|jg/ml, 15|jg/ml, 20 jig/ml, 25 jig/ml, 30 jig/ml, 35 jig/ml, 40 jig/ml, 45 jig/ml, 50 jig/ml, 100 jig/ml, 200 jig/ml, 300 jig/ml o 500 jig/ml. En algunos ensayos, los medios pueden complementarse con hMCSF entre 1-100 ng/ml; siendo la concentracion preferida de hMCSF 25 ng/ml. La indicacion de que PBMC y monocitos se han diferenciado en fibrocitos puede determinarla un experto en la tecnica. En general, los fibrocitos se definen morfologicamente como celulas adherentes con una conformacion de huso alargada y la presencia de un nucleo ovalado. En algunos ensayos, las celulas se fijan y se tinen con Hema 3 antes de contar los fibrocitos mediante recuento directo, por ejemplo, usando un microscopio invertido. Un experto en la tecnica interpreta la cantidad de diferenciacion en fibrocitos como una indicacion de la receptividad de una celula a SAP. Como se indica mediante los ejemplos de la divulgacion, una mayor supresion de la diferenciacion en fibrocitos indica un mayor grado de receptividad a SAP. Un metodo alternativo de medicion de la diferenciacion en fibrocitos implica determinar la expresion de factores secretados o marcadores de superficie celular espedficos de fibrocitos, por ejemplo, citocinas (por ejemplo, IL-1ra, ENA- 78/CXCL-5, PAI-1), fibronectina, colageno-1. En la tecnica se conocen bien metodos de deteccion y/o cuantificacion de marcadores de superficie celular o factores secretados, incluyendo, pero sin limitarse a, diversas tecnicas basadas en ELISA y FACS que usan anticuerpos inmunorreactivos contra uno o mas marcadores espedficos de fibrocitos. Como se describe en los ejemplos de la divulgacion, la medicion de la expresion de quimiocina derivada de macrofagos (MDC) es un metodo eficaz de determinacion de la diferenciacion en fibrocitos.

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Los metodos para detectar y/o caracterizar la N-glicosilacion (por ejemplo, N-glicosilacion alterada) de un polipeptido de SAP incluyen un metodo asistido por secuenciador de ADN (DSA), electroforesis de hidratos de carbono asistida por fluoroforo (FACE) o espectrometna de masas de desorcion/ionizacion laser potenciada por superficie con tiempo de vuelo (SELDI-TOF EM). Por ejemplo, un analisis puede utilizar DSA-FACE en el que, por ejemplo, se desnaturalizan las glicoprotemas seguido por inmovilizacion, por ejemplo, sobre una membrana. Las glicoprotemas pueden reducirse despues con un agente reductor adecuado tal como ditiotreitol (DATA) o p-mercaptoetanol. Los grupos sulfhidrilo de las protemas pueden carboxilarse usando un acido tal como acido yodoacetico. A continuacion, los N-glicanos pueden liberarse de la protema usando una enzima tal como N-glicosidasa F. Los N-glicanos, opcionalmente, pueden reconstituirse y derivatizarse mediante aminacion reductora. Despues, pueden concentrarse los N-glicanos derivatizados. La instrumentacion adecuada para el analisis de N-glicanos incluye, por ejemplo, el secuenciador de ADN ABI PRISM® 377 (Applied Biosystems). El analisis de datos puede realizarse usando, por ejemplo, el software GENESCAN® 3.1 (Applied Biosystems). Opcionalmente, pueden tratarse adicionalmente manoprotemas aisladas con una o mas enzimas para confirmar su estado de N-glicanos. Las enzimas a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, a-manosidasa o a-1,2-manosidasa. Los metodos adicionales de analisis de N- glicanos incluyen, por ejemplo, espectrometna de masas (por ejemplo, MALDI-TOF-EM), cromatograffa de lfquidos de alta presion (HPLC) en fase normal, fase inversa y cromatograffa de intercambio ionico (por ejemplo, con deteccion amperometrica pulsada cuando los glicanos no estan marcados y con absorbancia de UV o fluorescencia si los glicanos estan marcados apropiadamente). Veanse tambien Callewaert et al. (2001) Glycobiology 11(4): 275281 y Freire et al. (2006) Bioconjug. Chem. 17(2): 559-564.

Metodos de tratamiento

En el presente documento tambien se describen metodos para el tratamiento de un trastorno sensible a SAP en un paciente mediante la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un polipeptido de SAP variante que se describe en el presente documento a un paciente que lo necesita. La dosificacion y frecuencia de tratamiento puede determinarlas un experto en la tecnica y variaran dependiendo de los smtomas, la edad y el peso corporal del paciente, y la naturaleza y gravedad del trastorno que va a tratarse o prevenirse. Un polipeptido de SAP variante puede administrarse a un paciente una o dos veces al dfa, una o dos veces por semana, una o dos veces al mes o justo antes de o al aparecer los smtomas.

Las dosificaciones pueden determinarse facilmente mediante tecnicas conocidas por los expertos en la tecnica o tal como se ensena en el presente documento. La toxicidad y el efecto terapeutico de SAP pueden determinarse mediante procedimientos farmaceuticos convencionales en animales experimentales, por ejemplo, determinando la DL50 y la DE50. La DE50 (dosis eficaz 50) es la cantidad de farmaco requerida para producir un efecto especificado en el 50 % de una poblacion animal. La DL50 (dosis letal 50) es la dosis de farmaco que mata al 50 % de una poblacion de muestra.

El trastorno sensible a SAP puede ser fibrosis. El uso de SAP como tratamiento terapeutico para la fibrosis se describe en la solicitud de Patente de los EE.UU. n.° 2007/0243163. Los trastornos relacionados con fibrosis que pueden tratarse con el metodo objeto incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de colageno, enfermedad pulmonar intersticial, enfermedad pulmonar fibrotica humana (por ejemplo, bronquiolitis obliterante, fibrosis pulmonar idiopatica, fibrosis pulmonar de etiologfa conocida, estroma tumoral en enfermedad pulmonar, esclerosis sistemica que afecta a los pulmones, smdrome de Hermansky-Pudlak, neumoconiosis de los mineros del carbon, asbestosis, silicosis, hipertension pulmonar cronica, hipertension pulmonar asociada con SIDA, sarcoidosis, asma de moderada a grave y similares), enfermedad vascular fibrotica, esclerosis arterial, ateroesclerosis, venas varicosas, infartos coronarios, infartos cerebrales, fibrosis miocardica, fibrosis musculoesqueletica, adhesiones posquirurgicas, enfermedad renal humana (por ejemplo, smdrome nefntico, smdrome de Alport, nefropatfa asociada con VIH, enfermedad renal poliqrnstica, enfermedad de Fabry, nefropatfa diabetica, glomerulonefritis cronica, nefritis asociada con lupus sistemico, y similares), esclerosis sistemica progresiva (PSS), colangitis esclerosante primaria (PSC), fibrosis hepatica, cirrosis hepatica, fibrosis renal, fibrosis pulmonar, fibrosis qrnstica, enfermedad de injerto contra huesped cronica, esclerodermia (local y sistemica), oftalmopatfa de Graves, retinopatfa diabetica, glaucoma, enfermedad de Peyronie, fibrosis del pene, uretroestenosis tras citoscopia, acrecion interna tras cirugfa, cicatrizacion, mielofibrosis, fibrosis retroperitoneal idiopatica, fibrosis peritoneal de etiologfa conocida, ergotismo inducido por farmacos, fibrosis a consecuencia de cancer benigno o maligno, fibrosis a consecuencia de infeccion microbiana (por ejemplo, viral, bacteriana, parasitaria, fungica, etc.), enfermedad de Alzheimer, fibrosis a consecuencia de enfermedad inflamatoria del intestino (incluyendo formacion de estenosis en enfermedad de Crohn y colitis microscopica), tumores de celulas del estroma, mucositis, fibrosis inducida por ataque qrnmico o ambiental (por ejemplo, quimioterapia contra el cancer, pesticidas o radiacion (por ejemplo, radioterapia contra el cancer)).

El trastorno relacionado con fibrosis puede seleccionarse entre esclerodermia sistemica o local, queloides, cicatrices hipertroficas, ateroesclerosis, reestenosis, fibrosis e inflamacion pulmonar, fibrosis pulmonar idiopatica, cirrosis hepatica, fibrosis como resultado de infeccion por hepatitis B o C cronica, enfermedad renal, enfermedad cardiaca resultante de tejido cicatricial, degeneracion macular y retinopatfa retiniana y vftrea. El trastorno relacionado con fibrosis puede ser resultado de farmacos quimioterapicos, fibrosis inducida por radiacion, y lesiones y quemaduras. El trastorno o afeccion relacionado con fibrosis puede ser resultado de la cicatrizacion posquirurgica, por ejemplo, tras trabeculectoirna u otra cirugfa de filtracion del ojo.

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El trastorno sensible a SAP puede ser un trastorno de hipersensibilidad tal como los mediados por respuestas Th1 o Th2. El uso de SAP como tratamiento terapeutico para trastornos de hipersensibilidad tambien se describe en la solicitud provisional de los EE.UU. n.° 61/209.795. Los trastornos relacionados con hipersensibilidad que pueden tratarse con SAP incluyen, pero no se limitan a, rinitis alergica, sinusitis alergica, conjuntivitis alergica, broncoconstriccion alergica, disnea alergica, aumento alergico en la produccion de moco en los pulmones, eccema atopico, dermatitis, urticaria, anafilaxia, neumonitis y asma alergica.

Puede usarse un polipeptido de SAP variante que se describe en el presente documento para el tratamiento de respuestas inmunitarias espedficas de alergeno, tales como anafilaxia, a diversos antigenos, incluyendo, pero sin limitarse a, farmacos antimicrobianos (por ejemplo, cefalosporinas, sulfonamidas, penicilina y otras p-lactamas), anticonvulsivos (por ejemplo, fenitoma, fenobarbital, carbamazepina, dapsona, alopurinol y minociclina), quimioterapicos (por ejemplo, taxanos, compuestos de platino, asparaginasas y epipodofilotoxinas), heparina, insulina, protamina, aspirina y otros farmacos antiinflamatorios no esteroideos, relajantes musculares (por ejemplo, succinilcolina, atracurio, vecuronio y pancuronio), agentes de induccion (por ejemplo, barbituratos, etomidato, propofol), narcoticos (por ejemplo, fentanilo, meperidina, morfina), coloides para la expansion del volumen intravascular, materiales de radiocontraste, hemoderivados, latex, productos animales, caspa de animales, acaros del polvo, insectos (por ejemplo, mordeduras, picaduras o veneno), cosmeticos, metales (por ejemplo, mquel, cobalto y cromato), plantas, esporas, polen, alimentos (por ejemplo, leche, huevos, trigo, soja, cacahuetes y frutos secos, marisco), vacunacion y antfgenos fungicos (por ejemplo, especies de Aspergillus, Curvularia, Exserohilum y Alternaria).

En algunas realizaciones, el trastorno sensible a SAP puede ser un trastorno autoinmunitario tal como los mediados por respuestas de Th1 o Th2. El uso de SAP como tratamiento terapeutico para trastornos autoinmunitarios tambien se describe en la solicitud provisional de los EE.UU. n.° 61/209.845. Los trastornos relacionados con autoinmunidad que pueden tratarse con SAP incluyen, pero no se limitan a, diabetes tipo I, esclerosis multiple, artritis reumatoide, artritis psoriasica, miocarditis autoinmunitaria, penfigo, miastenia grave, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, enfermedad de Addison, hepatitis autoinmunitaria, artritis de Lyme cronica, cardiomiopatfa dilatada familiar, dermatomiositis juvenil, policondritis, smdrome de Sjogren, psoriasis, artritis idiopatica juvenil, enfermedad inflamatoria del intestino, lupus eritematoso sistemico, enfermedad pulmonar obstructiva cronica y enfermedad de injerto contra huesped.

El trastorno sensible a SAP puede ser una mucositis. El uso de SAP como tratamiento terapeutico para la mucositis tambien se describe en la solicitud de los EE.UU. n.° 12/217.614. Los metodos que se describen en el presente documento pueden ser utiles para tratar mucositis oral, esofagica y gastrointestinal, asf como ulceras gastricas y duodenales, o erosiones del estomago y esofago.

Puede usarse un polipeptido de SAP variante que se describe en el presente documento para el tratamiento de una enfermedad o afeccion inflamatoria. La enfermedad inflamatoria puede ser una infeccion vmca, bacteriana, fungica o parasitaria. El uso de SAP como tratamiento terapeutico para la infeccion vmca tambien se ha descrito en la Patente de los EE.UU. 6.406.698 y en la solicitud de patente internacional n.° WO1997/026906.

Preparaciones y formulaciones farmaceuticas

En determinados aspectos, los metodos que tambien se describen en el presente documento implican la administracion de al menos un polipeptido de SAP variante que se describe en el presente documento a un sujeto como agente terapeutico. Los agentes terapeuticos que se describen en el presente documento pueden formularse de una manera convencional usando uno o mas vehfculos o excipientes fisiologicamente aceptables. Por ejemplo, pueden formularse agentes terapeuticos y sus sales y solvatos fisiologicamente aceptables para su administracion mediante, por ejemplo, inyeccion (por ejemplo, s.c., i.m., i.p.), inhalacion o insuflacion (a traves o bien de la boca o bien de la nariz) o administracion oral, bucal, sublingual, transdermica, nasal, parenteral o rectal. Los agentes terapeuticos pueden administrarse localmente, en el sitio en el que estan presentes las celulas diana, es decir, un tejido, organo o lfquido espedfico (por ejemplo, sangre, lfquido cefalorraqrndeo, masa tumoral, etc.).

En el presente documento tambien se describe el uso de cualquier polipeptido de SAP variante que se describe en el presente documento en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento o la prevencion de un trastorno o una afeccion, tal como se describe en el presente documento, en un paciente, por ejemplo, el uso de un polipeptido de SAP variante en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un trastorno o afeccion descrito en el presente documento. En algunos aspectos, puede usarse cualquier polipeptido de SAP variante que se describe en el presente documento para preparar una preparacion farmaceutica para su uso en el tratamiento o la prevencion de una enfermedad o afeccion descrita en el presente documento.

Los agentes terapeuticos pueden formularse para una diversidad de modos de administracion, incluyendo administracion sistemica y topica o localizada. Pueden encontrarse tecnicas y formulaciones en general en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, PA. Para la administracion parenteral, se describe la inyeccion, incluyendo intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutanea. Para la inyeccion, los

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compuestos pueden formularse en disoluciones Kquidas, preferiblemente en tampones fisiologicamente compatibles tales como solucion de Hank o solucion de Ringer. Ademas, los compuestos pueden formularse en forma solida y disolverse o suspenderse inmediatamente antes de su uso. Tambien se incluyen formas liofilizadas. Los agentes terapeuticos pueden administrarse a celulas mediante una diversidad de metodos conocidos por los expertos en la tecnica, incluyendo, pero sin limitarse a, encapsulacion en liposomas, mediante iontoforesis o mediante incorporacion en otros vehnculos, tales como hidrogeles, ciclodextrinas, nanocapsulas biodegradables y microesferas bioadhesivas.

Para la administracion oral, las composiciones farmaceuticas pueden adoptar la forma, por ejemplo, de comprimidos, pastillas para chupar o capsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmaceuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidon de mafz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sflice); disgregantes (por ejemplo, almidon de patata o glicolato sodico de almidon); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio). Los comprimidos pueden recubrirse mediante metodos bien conocidos en la tecnica. Las preparaciones lfquidas para la administracion oral pueden adoptar la forma, por ejemplo, de disoluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para su constitucion con agua u otro vehfculo adecuado antes de su uso. Dichas preparaciones ifquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmaceuticamente aceptables tales como agentes de suspension (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arabiga); vehfculos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, esteres oleosos, alcohol etflico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p- hidroxibenzoatos de metilo o propilo o acido sorbico). Las preparaciones tambien pueden contener sales de tampon, agentes saborizantes, colorantes y edulcorantes segun sea apropiado. Las preparaciones para la administracion oral pueden formularse adecuadamente para dar la liberacion controlada del compuesto activo.

Para la administracion mediante inhalacion (por ejemplo, administracion pulmonar), los agentes terapeuticos pueden administrarse convenientemente en forma de una presentacion de pulverizacion en aerosol a partir de envases a presion o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dioxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol a presion, la unidad de dosificacion puede determinarse proporcionando una valvula para administrar una cantidad medida. Pueden formularse capsulas y cartuchos, por ejemplo, de gelatina, para su uso en un inhalador o insuflador que contienen una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidon.

En los metodos que se describen en el presente documento, los compuestos farmaceuticos tambien pueden administrarse por las vfas intranasal o intrabronquial incluyendo insuflacion, polvos y formulaciones en aerosol (para ejemplos de inhalantes de esteroides, veanse Rohatagi (1995) J. Clin. Pharmacology. 35: 1187-1193; Tjwa (1995) Ann. Allergy Asthma Immunol. 75: 107-111). Por ejemplo, pueden ponerse formulaciones en aerosol en propelentes a presion aceptables, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrogeno, y similares. Tambien pueden formularse como productos farmaceuticos para preparaciones no a presion tales como en un nebulizador o un atomizador. Normalmente, tal administracion es en un tampon acuoso farmacologicamente aceptable.

Pueden prepararse composiciones farmaceuticas adecuadas para la administracion respiratoria (por ejemplo, intranasal, inhalacion, etc.) de polipeptidos de SAP variantes o bien en forma solida o bien en forma lfquida.

Pueden formularse polipeptidos de SAP que se describen en el presente documento para la administracion parenteral mediante inyeccion, por ejemplo, mediante inyeccion en bolo o infusion continua. Las formulaciones para inyeccion pueden presentarse en forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes de multiples dosis, con un conservante anadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehfculos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulacion tales como agentes de suspension, estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, el principio activo puede estar en forma de polvo para su constitucion con un vehfculo adecuado, por ejemplo, agua esteril libre de pirogenos, antes de su uso.

Ademas, tambien pueden formularse polipeptidos de SAP que se describen en el presente documento como una preparacion de deposito. Dichas formulaciones de accion prolongada pueden administrarse mediante implantacion (por ejemplo, por via subcutanea o por via intramuscular) o mediante inyeccion intramuscular. Por tanto, por ejemplo, pueden formularse agentes terapeuticos con materiales polimericos o hidrofobos adecuados (por ejemplo, como una emulsion en un aceite aceptable) o resinas de intercambio ionico, o como derivados ligeramente solubles, por ejemplo, como una sal ligeramente soluble. La formula de liberacion controlada tambien incluye parches.

Los compuestos descritos en el presente documento pueden formularse para su administracion al sistema nervioso central (SNC) (revisado en Begley, Pharmacology & Therapeutics 104: 29-45 (2004)). Los enfoques convencionales para la administracion de farmacos al SNC incluyen: estrategias neuroquirurgicas (por ejemplo, inyeccion intracerebral o infusion intracerebroventricular); manipulacion molecular del agente (por ejemplo, produccion de una protema de fusion quimerica que comprende un peptido de transporte que tiene afinidad por una molecula de superficie de celulas endoteliales en combinacion con un agente que por sf mismo no puede cruzar la barrera

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hematoencefalica en un intento de aprovechar una de las rutas de transporte endogenas de la barrera hematoencefalica); estrategias farmacologicas disenadas para aumentar la solubilidad en ftpidos de un agente (por ejemplo, conjugacion de agentes solubles en agua con vehfculos de colesterol o ftpido); y la alteracion transitoria de la integridad de la BBB mediante alteracion hiperosmotica (resultante de la infusion de una disolucion de manitol en la arteria carotida o el uso de un agente biologicamente activo tal como un peptido de angiotensina).

Pueden incorporarse polipeptidos de SAP que se describen en el presente documento en una formulacion topica que contiene un vetftculo topico que es generalmente adecuado para la administracion topica de farmacos y que comprende cualquier material de este tipo conocido en la tecnica. El vetftculo topico puede seleccionarse para proporcionar la composicion en la forma deseada, por ejemplo, como una pomada, locion, crema, microemulsion, gel, aceite, disolucion, o similar, y puede estar compuesto por un material o bien de origen sintetico o bien que se produce de manera natural. Es preferible que el vetftculo seleccionado no afecte de manera adversa al agente activo u otros componentes de la formulacion topica. Los ejemplos de vetftculos topicos adecuados para su uso en el presente documento incluyen agua, alcoholes y otros disolventes organicos no toxicos, glicerina, aceite mineral, silicona, vaselina, lanolina, acidos grasos, aceites vegetales, parabenos, ceras, y similares.

Las composiciones farmaceuticas (incluyendo preparaciones cosmeticas) pueden comprender desde aproximadamente el 0,00001 hasta el l0o % tal como desde el 0,001 hasta el 10 % o desde el 0,1 % hasta el 5 % en peso de uno o mas de los polipeptidos de SAP variantes descritos en el presente documento. En determinadas formulaciones topicas, el agente activo esta presente en una cantidad en el intervalo de aproximadamente el 0,25 % en peso al 75 % en peso de la formulacion, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente el 0,25 % en peso al 30 % en peso de la formulacion, mas preferiblemente en el intervalo de aproximadamente el 0,5 % en peso al 15 % en peso de la formulacion, y lo mas preferiblemente en el intervalo de aproximadamente el 1,0 % en peso al 10 % en peso de la formulacion.

Pueden tratarse o prevenirse afecciones del ojo, por ejemplo, mediante inyeccion sistemica, topica, intraocular de agentes terapeuticos, o mediante insercion de un dispositivo de liberacion sostenida que libera agentes terapeuticos. Pueden administrarse polipeptidos de SAP que se describen en el presente documento en un vetftculo oftalmico farmaceuticamente aceptable, de manera que el compuesto se mantiene en contacto con la superficie ocular durante un periodo de tiempo suficiente como para permitir que el compuesto penetre en las regiones de la cornea e internas del ojo, como por ejemplo, la camara anterior, la conjuntiva, la camara posterior, el cuerpo vftreo, el humor acuoso, el humor vftreo, la cornea, el iris/cuerpo ciliar, el cristalino, la coroides/retina y la esclerotica. El vetftculo oftalmico farmaceuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, una pomada, un aceite vegetal o un material de encapsulacion. Como alternativa, los compuestos pueden inyectarse directamente en el humor vftreo y acuoso. En una alternativa adicional, los compuestos pueden administrarse por via sistemica, tal como mediante inyeccion o infusion intravenosa, para el tratamiento del ojo.

Los agentes terapeuticos descritos en el presente documento pueden almacenarse en un entorno libre de oxfgeno segun metodos en la tecnica.

Las composiciones a modo de ejemplo comprenden un polipeptido de SAP con uno o mas vetftculos farmaceuticamente aceptables y, opcionalmente, otros componentes terapeuticos. El o los vetftculos deben ser “farmaceuticamente aceptables” en el sentido de ser compatibles con los otros componentes de la composicion y no provocar un efecto perjudicial inaceptable en el sujeto. Dichos vetftculos se describen en el presente documento o de lo contrario los conocen bien los expertos en la tecnica de farmacologfa. Las composiciones farmaceuticas pueden estar libres de pirogenos y son adecuadas para su administracion a un paciente humano. Las composiciones farmaceuticas pueden estar libres de irritantes y pueden ser adecuadas para su administracion a un paciente humano. Las composiciones farmaceuticas pueden estar libres de alergenos y son adecuadas para su administracion a un paciente humano. Las composiciones pueden prepararse mediante cualquiera de los metodos bien conocidos en la tecnica de farmacia.

Un polipeptido de SAP puede administrarse en una formulacion de liberacion temporal, por ejemplo, en una composicion que incluye un poftmero de liberacion lenta. Puede prepararse un polipeptido de SAP con vetftculos que protegeran frente a una liberacion rapida. Los ejemplos incluyen un vetftculo de liberacion controlada, tal como un poftmero, sistema de administracion microencapsulado o gel bioadhesivo. Como alternativa, puede lograrse la administracion prolongada de un polipeptido de SAP incluyendo en la composicion agentes que retrasan la absorcion, por ejemplo, hidrogeles de monoestearato de aluminio y gelatina.

En la tecnica se conocen metodos para administrar compuestos de acido nucleico (veanse, por ejemplo, Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; y Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995; Sullivan et al., solicitud internacional n.° WO 94/02595). Estos protocolos pueden utilizarse para la administracion de practicamente cualquier compuesto de acido nucleico. Pueden administrarse compuestos de acido nucleico a celulas mediante una diversidad de metodos conocidos por los expertos en la tecnica, incluyendo, pero sin limitarse a, encapsulacion en liposomas, mediante iontoforesis o mediante incorporacion en otros vetftculos, tales como hidrogeles, ciclodextrinas, nanocapsulas biodegradables y microesferas bioadhesivas. Como alternativa, la combinacion de acido nucleico/vetftculo se administra localmente mediante inyeccion directa o mediante el uso de

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una bomba de infusion. Otras vfas de administracion incluyen, pero no se limitan a, administracion oral (forma de comprimido o pfldora) y/o intratecal (Gold, 1997, Neuroscience, 76, 1153-1158). Otros enfoques incluyen el uso de diversos sistemas de velmculos y transporte, por ejemplo, a traves del uso de conjugados y polfmeros biodegradables. Para una revision exhaustiva de las estrategias de administracion de farmacos, veanse Ho et al., 1999, Curr. Opin. Mol. Ther., 1, 336-343 y Jain, Drug Delivery Systems: Technologies and Commercial Opportunities, Decision Resources, 1998 y Groothuis et al., 1997, J. NeuroVirol., 3, 387-400. Se proporcionan descripciones mas detalladas de la entrega y la administracion de acido nucleico en Sullivan et al., citado anteriormente, Draper et al., documento PCT WO93/23569, Beigelman et al., solicitud internacional n.° WO99/05094, y Klimuk et al., publicacion internacional n.° WO99/04819.

Los ejemplos se presentan con fines ilustrativos.

Ejemplos

Ejemplo 1: SAP recombinante es mas potente que SAP derivado de suero humano.

Se sometieron a ensayo SAP humano recombinante aislado de celulas CHO-S (rhSAP) y SAP derivado de suero humano (hSAP) para determinar su bioactividad usando un bioensayo in vitro. En este ensayo, se incubaron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) enriquecidas en monocitos con concentraciones variables de o bien rhSAP o bien hSAP durante 96 horas. Tras esta incubacion, se retiraron los sobrenadantes de cultivo resultantes y se sometieron a ensayo mediante ELISA para cuantificar la cantidad de quimiocina derivada de macrofagos (MDC) que se produjo. MDC se produce por fibrocitos y por tanto es un indicador de la diferenciacion de monocitos en fibrocitos. Comparando la concentracion inhibidora al 50 % (CI50) de la muestra con respecto al patron de referencia de hSAP, puede determinarse la potencia relativa de una glicovariante de SAP. El resultado se expresa como una razon de CI50 de la muestra frente al patron de referencia de hSAP.

Todas las muestras y los patrones de SAP se diluyeron inicialmente hasta una concentracion de 1,0mg/ml en medios FibroLife complementados. Se diluyeron en serie patrones de SAP para generar concentraciones de patron de trabajo de 60, 30, 20, 13,4, 8,8, 6,0, 3,0, 1,5 y 0,75 pg/ml (concentracion de patron final de 30, 15, 10, 6,7, 4,4, 3,0, 1,5, 0,75 y 0,375 pg/ml). Vease la siguiente tabla 1.

Concentracion de patron de rhSAP de trabajo (pg/m|)

Volumen de patron Volumen de medios FibroLife complementados

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60 (1 mg/ml) 940

30

600 (60 pg/ml) 600

20

800 (30 pg/ml de patron) 400

3,4

800 (20 pg/ml de patron) 400

8,8

800 (13,4 pg/ml de patron) 400

6,0

800 (8,8 pg/ml de patron) 400

3,0

600 (6,0 pg/ml de patron) 600

1,5

600 (3,0 pg/ml de patron) 600

0,75

600 (1,5 pg/ml de patron) 600

Para preparar el ensayo de ELISA, se diluyo el anticuerpo de captura (es decir, anticuerpo de raton anti-MDC humana) hasta la concentracion de trabajo en PBS sin protema transportadora. Se uso el anticuerpo de captura diluido para recubrir placas de 96 pocillos, y despues se sello cada placa y se incubo durante la noche a temperatura ambiente. Antes de usar las placas recubiertas, se aspiro cada pocillo y se lavo con tampon de lavado, repitiendo el procedimiento dos veces para un total de tres lavados. Despues, se bloquearon las placas anadiendo 300 pl de diluyente de reactivo a cada pocillo e incubando a temperatura ambiente durante una hora. Tras la incubacion, se repitio el procedimiento de aspiracion y lavado de pocillos.

Para el ensayo ELISA, se anadieron a cada pocillo muestras de 100 pl de o bien los sobrenadantes de los cultivos de monocitos/fibrocitos o bien los patrones de SAP. Despues, se incubo la placa a temperatura ambiente durante 2 horas antes de aspirar y lavar los pocillos. Despues, se anadieron a cada pocillo 100 pl de una dilucion de trabajo de estreptavidina-HRP. Se incubo la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de anadir 50 pl de disolucion de parada a capa pocillo. Inmediatamente, se midio la densidad optica de cada pocillo usando un lector de microplacas fijado a 450 nm. Si se dispoma de correccion de longitud de onda, se fijo el lector de microplacas a 540 nm o 570 nm. Si no se dispoma de correccion de longitud de onda, despues se restaron las lecturas a 540 nm o 570 nm de las lecturas a 450 nm. Esta resta corrige las imperfecciones opticas en la placa.

Se sometieron a ensayo tanto RHSAP como hSAP para determinar la bioactividad usando este ensayo (figura 1). En promedio, RHSAP es 3,4 veces mas activo que hSAP (promedio de 7 experimentos independientes).

Ejemplo 2: Modificacion de estructuras de glicanos de SAP

Usando tecnicas de glicorremodelacion in vitro, se modificaron restos de glicano en una muestra de SAP humano recombinante (rhSAP) para sustituir restos de acido sialico con union a2,3 terminales por restos de acido sialico con 5 union a2,6 (figura 2, A y B). De manera similar, tambien se modifico una muestra de SAP derivado de suero humano (hSAP) para sustituir restos de acido sialico con union a2,6 terminales por restos de acido sialico con union a2,3 (figura 2, C y D). Ademas, ya que rhSAP aislado de celulas CHO-S esta solo parcialmente sialilado, se trato una muestra de rhSAP para sialilar completamente las estructuras de glicanos unidas con restos de acido sialico con union a2,3 (figura 2, E y F).

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Se trataron tanto rhSAP como hSAP (n.° de cat. de Calbiochem 970549) con una a2,3,6,8,9-sialidasa (n.° de cat. de Sigma N8271) para desialilar completamente los polipeptidos. Tras el tratamiento con sialidasa durante 17 horas, se purificaron rhSAP y hSAP desialilados (es decir asialo) usando cromatograffa de afinidad de fosfoetanolamina (PE) y de exclusion molecular (Sephadex 200 calidad prep.). Despues, se trataron enzimaticamente asialo-polipeptidos de 15 SAP purificados usando o bien a2,3- o bien a2,6-sialiltransferasas (n.° de cat. de Calbiochem 566223) en presencia de CMP-acido sialico (n.° de cat. de Calbiochem 233264) durante 17 horas a 37 °C. Las siguientes tablas proporcionan detalles sobre cada mezcla de reaccion.

Reacciones de asialo-rhSAP (reac.)

Tratamiento con a2,3 sialiltransferasa (ST3Gal3)

disoluciones madre de reactivos rhSAP, ST3Gal3

parametro unidades valor

[asialo-rhSAP] dis. mad.

mg/ml 10,8

PM de asialo-rhSAP

g/mol 116293

[asialo-rhSAP] dis. mad.

mm 93

[Galactosa] max.

mm 929

[ST3Gal3] dis. mad.

mg/ml 0,9

PM de ST3Gal3

g/mol 84000

[ST3Gal3] dis. mad.

mm 10,7

[CMP-SA] dis. mad.

mg/ml 25

PM de CMP-SA

g/mol 658,4

[CMP-SA] dis. mad.

mM 38

volumenes de reac.

Ml de asialo-rhSAP en reac. Ml 260

Ml de ST3Gal3 en reac.

Ml 50

Ml de CMP-SA en reac.

Ml 75

tampon (HEPES 10 mM/NaCl 150 mM, pH 8)

Ml 615

vol. de reac. tot.

Ml 1000

concentraciones de reac.

[asialo-rhSAP] reac. mm 24,1

[Galactosa] max.

mm 241

[SAP] reac.

mg/ml 2,8

[ST3Gal3] reac.

mm 0,5357

[ST3Gal3] reac.

mg/ml 0,045

[CMP-SA] reac.

mM 2,85

asialo-rhSAP: ST3

razon en masa 62

asialo-rhSAP: ST3

razon molar 45

CMP-SA: ST3

razon molar 5316

CMP-SA: asialo-rhSAP

razon molar 118

CMP-SA: Galactosa

razon molar 11,8

Tratamiento con a2,6 sialiltransferasa (reac. de ST6)

parametro unidades valor

disoluciones madre de reactivos rhSAP, ST6

[asialo-rhSAP] dis. mad. mg/ml 10,8

PM de asialo-rhSAP

g/mol 116293

[asialo-rhSAP] dis. mad.

mm 93

[Galactosa] max.

mm 929

[ST6] dis. mad.

mg/ml 0,205

PM de ST6

g/mol 42000

[ST6] dis. mad.

mm 4,9

[CMP-SA] dis. mad.

mg/ml 25

PM de CMP-SA

g/mol 658,4

[CMP-SA] dis. mad.

mM 38

Reacciones de asialo-rhSAP (reac.)

Tratamiento con a2,6 sialiltransferasa (reac. de ST6)

parametro unidades valor

volumenes de reac.

Ml de asialo-rhSAP 1 en reac. Ml 260

Ml de ST6 en reac.

Ml 30

Ml de CMP-SA en reac.

Ml 75

tampon (HEPES 10 mM/NaCl 150 mM, pH 8)

Ml 635

vol. de reac. tot.

Ml 1000

concentraciones de reac.

[asialo-rhSAPl reac. mm 24,1

[Galactosal max.

mm 241

[asialo-rhSAP] reac.

mg/ml 2,8

[ST6l reac.

mm 0,146

[ST6l reac.

mg/ml 0,006

[CMP-SAl reac.

mM 2,85

asialo-rhSAP: ST6

razon en masa 457

asialo-rhSAP: ST6

razon molar 165

CMP-SA: ST6

razon molar 19448

CMP-SA: asialo-rhSAP

razon molar 118

CMP-SA: Galactosa

razon molar 11,8

Reacciones de asialo-hSAP

Tratamiento con a2,3 sialiltransferasa (ST3Gal3)

disoluciones madre de reactivos hSAP, ST3Gal3

parametro unidades valor

[asialo-hSAPl dis. mad.

mg/ml 5,6

PM de SAP

g/mol 116293

[asialo-hSAPl dis. mad.

mm 48

[Galactosal max.

mm 482

[ST3Gal3l dis. mad.

mg/ml 0,9

PM de ST3Gal3

g/mol 84000

[ST3Gal3l dis. mad.

mm 10,7

[CMP-SAl dis. mad.

mg/ml 25

PM de CMP-SA

g/mol 685,4

[CMP-SAl dis. mad.

mM 38

volumenes de reac.

Ml de asialo-hSAP en reac. Ml 500

Ml de ST3Gal3 en reac.

Ml 50

Ml de CMP-SA en reac.

Ml 75

tampon (HEPES 10 mM/NaCl 150 mM, pH 8)

Ml 375

vol. de reac. tot.

Ml 1000

concentraciones de reac.

[asialo-hSAPl reac. mm 24,1

[Galactosal max

mm 241

[asialo-hSAPl reac.

mg/ml 2,8

[ST3Gal3l reac.

mm 0,54

[ST3Gal3l reac.

mg/ml 0,045

[CMP-SAl reac.

mM 2,85

asialo-hSAP: ST3

razon en masa 62

asialo-hSAP: ST3

razon molar 45

CMP-SA: ST3

razon molar 5316

CMP-SA: asialo-rhSAP

razon molar 118

CMP-SA: Galactosa

razon molar 11,8

Reacciones de asialo-hSAP

Tratamiento con a2,6 sialiltransferasa (reac. de ST6)

parametro unidades valor

disoluciones madre de reactivos hSAP, ST6

[asialo-hSAPl dis. mad. mg/ml 5,6

PM de asialo-hSAP

g/mol 116293

[asialo-hSAPl dis. mad.

mm 48

[Galactosal max.

mm 482

[ST6l dis. mad.

mg/ml 0,205

PM de ST6

g/mol 42000

[ST6l dis. mad.

mm 4,9

[CMP-SAl dis. mad.

mg/ml 25

PM de CMP-SA

g/mol 658,4

[CMP-SAl dis. mad.

mM 38

volumenes de reac.

Ml de asialo-hSAP en reac. Ml 500

Ml de ST6 en reac.

Ml 30

Ml de CMP-SA en reac.

Ml 75

tampon (HEPES 10 mM/NaCl 150 mM, pH 8)

Ml 395

vol. de reac. tot.

Ml 1000

concentraciones de reac.

[asialo-hSAPl reac. mm 24,1

[Galactosal max

mm 241

[asialo-hSAPl reac.

mg/ml 2,8

[ST6l reac.

mm 0,146

[ST6l reac.

mg/ml 0,006

[CMP-SAl reac.

mM 2,85

asialo-hSAP: ST6

razon en masa 455

asialo-hSAP: ST6

razon molar 164

CMP-SA: ST6

razon molar 19448

CMP-SA: asialo-rhSAP

razon molar 118

CMP-SA: Galactosa

razon molar 11,8

En una reaccion separada, se realizo la sialilacion completa de rhSAP a 37 °C durante 17 horas usando la a2,3- sialiltransferasa sin desialilar en primer lugar la molecula segun la siguiente tabla.

Tratamiento con a2,3 sialiltransferasa (ST3Gal3)

disoluciones madre de reactivos rhSAP, ST3Gal3

parametro unidades valor

[rhSAPl dis. mad.

mg/ml 19,0

PM de rhSAP

g/mol 116293

[rhSAPl dis. mad.

mm 163

[Galactosal max.

mm 1634

[ST3Gal3l dis. mad.

mg/ml 0,9

PM de ST3Gal3

g/mol 84000

[ST3Gal3l dis. mad.

mm 10,7

[CMP-SAl dis. mad.

mg/ml 25

PM de CMP-SA

g/mol 658,4

[CMP-SAl dis. mad.

mM 38

volumenes de reac.

Ml de rhSAP en reac. Ml 500

Ml de ST3Gal3 en reac.

Ml 50

Ml de CMP-SA en reac.

Ml 100

tampon (HEPES 10 mM/NaCl 150 mM, pH 8)

Ml 350

vol. de reac. tot.

Ml 1000

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Tratamiento con a2,3 sialiltransferasa (ST3Gal3)

parametro unidades valor

concentraciones de reac.

[rhSAPl reac. mM 81,7

[Galactosal max.

mM 817

[rhSAPl reac.

mg/ml 9,5

[ST3Gal3l reac.

mm 0,54

[ST3Gal3l reac.

mg/ml 0,045

[CMP-SAl reac.

mM 3,80

BTA-02-17: ST3

razon en masa 211

BTA-02-17: ST3

razon molar 152

CMP-SA: ST3

razon molar 7088

CMP-SA: BTA-02-17

razon molar 46

CMP-SA: Galactosa

razon molar 4,6

Tras el tratamiento de sialilacion, se purificaron variantes tanto de rhSAP como de hSAP sialilados usando cromatograffa de afinidad de PE seguido por dialisis en NaPi 10 mM/sorbitol al 5 % pH 7,5 (tampon P5S). Se realizo la confirmacion de las uniones de acido sialico deseadas (es decir, hSAP con union a2,3 y RHSAP con union a2,6) usando tanto cromatograffa de Kquidos/espectrometffa de masas (figura 2; A, C, y E) como cromatograffa de lfquidos de alta resolucion de intercambio anionico (figura 2; B, D, y F) tras el tratamiento de los polipeptidos de SAP glicovariantes con a2,3 sialidasa (n.° de cat. de Calbiochem 480706) a 37 °C durante 24 horas.

Ejemplo 3: Bioensayos in vitro para determinar la potencia de glicovariantes de SAP para inhibir la diferenciacion de monocitos en fibrocitos.

Se sometieron a ensayo rhSAP y hSAP glicorremodelados para determinar su bioactividad usando el mismo bioensayo in vitro descrito en el ejemplo 1. En resumen, se incubaron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) enriquecidas en monocitos con concentraciones variables de un polipeptido de SAP durante 96 horas. Tras esta incubacion, se retiraron los sobrenadantes de cultivo y se sometieron a ensayo mediante ELISA para cuantificar aproximadamente la quimiocina derivada de macrofagos (MDC) que se produjo. Se expresaron los resultados como una razon de CI50 de la muestra frente al patron de referencia de hSAP y se representaron graficamente como actividad relativa (actividad relativa de hSAP = 1). Todos los materiales de prueba que conteman union de acido sialico en a2,3 son > 2,4 veces mas activos que hSAP (figura 3). Mezclas iguales de derivados de SAP con acido sialico con union a2,3 y a2,6 muestran niveles de actividad intermedios entre el 100 % de SAP con union a2,6 y el 100 % SAP con union a2,3 tal como se esperaba (las dos barras mas a la derecha en la figura 3).

Un metodo alternativo de cuantificacion de la diferenciacion en fibrocitos implica contar directamente el numero de fibrocitos que se generan tras incubarse los monocitos con un supresor de fibrocitos (por ejemplo, SAP o variante del mismo) o agente activante (por ejemplo, M-CSF). En un experimento, se purificaron monocitos a partir de PBMC derivadas de sangre completa usando seleccion negativa con perlas magneticas convencional en la tecnica (por ejemplo, n.° de cat. 113-41D, Invitrogen, Carlsbad, CA) y se cultivaron en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos que contema medios FibroLife complementados con 25 o 50 ng/ml de M-CSF por triplicado. Se incubo la placa durante 96 horas a 37 °C en un incubador con el 5 % de CO2. Despues, se fijaron las celulas con paraformaldelffdo y se tineron con tincion Hema 3 (n.° de cat. 122-911, Hema 3 Stain, Fisher Scientific, Hampton, nH). Se determino el numero de fibrocitos por pocillo sumando el recuento de cinco campos diferentes por pocillo usando un microscopio invertido. Se definieron los fibrocitos morfologicamente como celulas adherentes con una conformacion de huso alargada y la presencia de un nucleo ovalado. Los datos indican que o bien 25 o bien 50 ng/ml de M-CSF eran suficientes para aumentar el numero de fibrocitos que se diferenciaban a partir de monocitos en ~50 % en este donador (figura 4). Experimentos posteriores usaron medios FibroLife complementados con 25 ng/ml de M-CSF segun era necesario y tal como se define a continuacion.

Medios Fibrolife: (n.° de cat. LM-0001, Lifeline Cell Technology, Walkersville, MD) complementados con HEPES 10 mM (n.° de cat. H0887, Sigma-Aldrich), aminoacidos no esenciales 1 x (n.° de cat. M7145, Sigma-Aldrich), piruvato de sodio 1 mM (n.° de cat. S8636, Sigma-Aldrich), glutamina 2 mM (n.° de cat. 25030-149, Invitrogen), penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 ug/ml (n.° de cat. P0781, Sigma-Aldrich), e ITS-3 (n.° de cat. I2771, albumina serica bovina 500 ug/ml, insulina 10 ug/ml, transferrina 5 ug/ml, selenito de sodio 5 ng/ml, acido linoleico 5 ug/ml y acido oleico 5 ug/ml; Sigma-Aldrich).

En un experimento adicional, se purificaron PBMC o monocitos a partir de sangre completa y se cultivaron en medios FibroLife complementados con diversas cantidades de SAP por triplicado (tal como se describio anteriormente). Se incubo la placa durante 96 horas a 37 °C en un incubador con el 5 % de CO2. Despues, se fijaron las celulas con paraformaldehido y se tineron con tincion Hema 3 (n.° de cat. 122-911, Hema 3 Stain, Fisher Scientific, Hampton, NH). Se determino el numero de fibrocitos por pocillo sumando el recuento de cinco campos diferentes por pocillo usando un microscopio invertido. Se determino que la concentracion minima de SAP necesaria para proporcionar una inhibicion maxima de la diferenciacion en fibrocitos en este sistema era de 2 ug/ml (figura 5).

10

15

El numero de fibrocitos disminuye al aumentar la concentracion de SAP en todos los donadores. LISTADO DE SECUENCIAS

<110> PROMEDIOR INC.

<120> DERIVADOS DE AMILOIDE P SERICO Y SU PREPARACION Y USO <130> T3337 EP/1

<150> 61/217.931 <151>

imagen1

<

170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 204 <212> PRT

<213> Homo sapiens

Thr Asp His Val Asn Leu lie Thr Pro Leu Glu Lys Pro Leu Gin Asn 20 25 30

Phe Thr Leu Cys Phe Arg Ala Tyr Ser Asp Leu Ser Arg Ala Tyr Ser 35 40 45

Leu Phe Ser Tyr Asn Thr Gin Gly Arg Asp Asn Glu Leu Leu Val Tyr 50 55 60

Lys Glu Arg Val Gly Glu Tyr Ser Leu Tyr lie Gly Arg His Lys Val 65 70 75 80

Thr Ser Lys Val lie Glu Lys Phe Pro Ala Pro Val His lie Cys Val 85 90 95

Ser Trp Glu Ser Ser Ser Gly lie Ala Glu Phe Trp lie Asn Gly Thr 100 105 110

Pro Leu Val Lys Lys Gly Leu Arg Gin Gly Tyr Phe Val Glu Ala Gin 115 120 125

Pro Lys lie Val Leu Gly Gin Glu Gin Asp Ser Tyr Gly Gly Lys Phe 130 135 140

Asp Arg Ser Gin Ser Phe Val Gly Glu lie Gly Asp Leu Tyr Met Trp 145 150 155 160

Asp Ser Val Leu Pro Pro Glu Asn lie Leu Ser Ala Tyr Gin Gly Thr 165 170 175

Pro Leu Pro Ala Asn lie Leu Asp Trp Gin Ala Leu Asn Tyr Glu lie 180 185 190

Arg Gly Tyr Val lie lie Lys Pro Leu Val Trp Val 195 200

<210> 2 <211> 208 <212> PRT

<213> Gallus gallus

Asp Ala Tyr Val Leu Leu Gin Val Gin Leu Glu Arg Pro Leu Leu Asn 20 25 30

Phe Thr Val Cys Leu Arg Ser Tyr Thr Asp Leu Thr Arg Pro His Ser 35 40 45

Leu Phe Ser Tyr Ala Thr Lys Ala Gin Asp Asn Glu lie Leu Leu Phe 50 55 60

Lys Pro Lys Pro Gly Glu Tyr Arg Phe Tyr Val Gly Gly Lys Tyr Val 65 70 75 80

Thr Phe Arg Val Pro Glu Asn Arg Gly Glu Trp Glu His Val Cys Ala 85 90 95

Ser Trp Glu Ser Gly Ser Gly lie Ala Glu Phe Trp Leu Asn Gly Arg 100 105 110

Pro Trp Pro Arg Lys Gly Leu Gin Lys Gly Tyr Glu Val Gly Asn Glu 115 120 125

Ala Val Val Met Leu Gly Gin Glu Gin Asp Ala Tyr Gly Gly Gly Phe 130 135 140

Asp Val Tyr Asn Ser Phe Thr Gly Glu Met Ala Asp Val His Leu Trp 145 150 155 160

Asp Ala Gly Leu Ser Pro Asp Lys Met Arg Ser Ala Tyr Leu Ala Leu 165 170 175

Arg Leu Pro Pro Ala Pro Leu Ala Trp Gly Arg Leu Arg Tyr Glu Ala 180 185 190

Lys Gly Asp Val Val Val Lys Pro Arg Leu Arg Glu Ala Leu Gly Ala 195 200 205

<210> 3 <211> 205 <212> PRT

<213> Bos taurus

Thr Asp His Val Thr Leu lie Thr Lys Leu Glu Lys Pro Leu Lys 20 25 30

Leu Thr Leu Cys Leu Arg Ala Tyr Ser Asp Leu Ser Arg Gly Tyr

35 40 45

Leu Phe Ser Tyr Asn lie His Ser Lys Asp Asn Glu Leu Leu Val 50 55 60

Lys Asn Gly lie Gly Glu Tyr Ser Leu Tyr lie Gly Lys Thr Lys 65 70 75

Thr Val Arg Ala Thr Glu Lys Phe Pro Ser Pro Val His lie Cys 85 90 95

Ser Trp Glu Ser Ser Thr Gly lie Ala Glu Phe Trp lie Asn Gly 100 105 110

Pro Leu Val Lys Arg Gly Leu Lys Gin Gly Tyr Ala Val Gly Ala 115 120 125

Pro Lys lie Val Leu Gly Gin Glu Gin Asp Ser Tyr Gly Gly Gly 130 135 140

Asp Lys Asn Gin Ser Phe Met Gly Glu lie Gly Asp Leu Tyr Met 145 150 155

Asp Ser Val Leu Ser Pro Glu Glu lie Leu Leu Val Tyr Gin Gly 165 170 175

Ser Ser lie Ser Pro Thr lie Leu Asp Trp Gin Ala Leu Lys Tyr 180 185 190

lie Lys Gly Tyr Val lie Val Lys Pro Met Val Trp Gly 195 200 205

<210> 4 <211> 204 <212> PRT

<213> Cricetulus migratorius

Ser

Asn

Ser

Phe

val

80

Thr

Lys

His

Phe

Trp

160

Ser

Glu

Claims (17)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion farmaceutica que comprende un polipeptido de Amiloide P Serico (SAP) humano glicosilado recombinante que comprende una cadena de oligosacarido con union en N, en la que al menos una ramificacion de la cadena de oligosacarido termina con un resto de acido sialico con union a2,3 y en la que la composicion tiene al menos un 50 % menos de restos de acido sialico con union a2,6 que el SAP de tipo silvestre aislado de suero humano.
2. 2. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 1, en la que la composicion tiene al menos un 75 %, al menos un 85 % o al menos un 95 % menos de restos de acido sialico con union a2,6 que el SAP de tipo silvestre aislado de suero humano.
3. 3. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 1, en la que la composicion esta sustancialmente libre de restos de acido sialico con union a2,6.
4. 4. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el polipeptido comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % identica a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 o comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1.
5. 5. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la cadena de oligosacaridos con union en N comprende un nucleo de pentasacarido de Man[(a1,6-)-(Man(a1,3)]-Man(p1,4)-GlcNAc(p1,4)- GlcNAc(p1,N)-Asn.
6. 6. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la cadena de oligosacarido comprende al menos una ramificacion que tiene la estructura NeuNAc2a3Galp4GlcNAcp2Mana6.
7. 7. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el polipeptido es una protema de fusion que comprende un dominio de SAP y uno o mas dominios heterologos.
8. 8. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 7, en la que el uno o mas dominios heterologos potencian una o mas de entre la estabilidad in vivo, la semivida in vivo, la captacion/administracion, la localizacion o distribucion tisular, la formacion de complejos proteicos y/o la purificacion.
9. 9. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que el polipeptido comprende uno o mas restos de aminoacidos modificados.
10. 10. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 9, en la que uno o mas restos de aminoacidos modificados comprenden un aminoacido PEGilado, un aminoacido prenilado, un aminoacido acetilado, un aminoacido biotinilado y/o un aminoacido conjugado con un agente de derivatizacion organica.
11. 11. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 9 o 10, en la que el uno o mas restos de aminoacidos modificados potencian una o mas de entre la estabilidad in vivo, la semivida in vivo, la captacion/administracion, la localizacion o distribucion tisular, la formacion de complejos proteicos y/o la purificacion.
12. 12. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en la que todas las ramificaciones de la cadena de oligosacarido terminan con restos de acido sialico con union a2,3.
13. 13. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la que el polipeptido de SAP recombinante tiene una CI50 para la inhibicion de la diferenciacion de monocitos en fibrocitos in vitro que es menos de la mitad que la de una muestra correspondiente de SAP de tipo silvestre aislado de suero humano.
14. 14. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en la que el polipeptido de SAP se expreso en una celula CHO.
15. 15. Una composicion farmaceutica para su uso en la inhibicion de la diferenciacion de monocitos en fibrocitos, en la que la composicion es la composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14.
16. 16. Una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento o la prevencion de una afeccion o trastorno seleccionado entre un trastorno inflamatorio, un trastorno fibrotico o fibroproliferativo, un trastorno de hipersensibilidad, un trastorno autoinmunitario o mucositis, en la que la composicion es la composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14.
17. 17. Un polipeptido de Amiloide P Serico (SAP) humano glicosilado para su uso en la inhibicion de la diferenciacion de monocitos en fibrocitos, en el que el polipeptido de SAP comprende una cadena de oligosacarido con union en N y en el que al menos una ramificacion de la cadena de oligosacarido termina con un resto de acido sialico con union

    4

    CO

    CD

    1

    Actividad relativa

    imagen1

    FIGURA 1

    CO

    imagen2

    CL/EM RC de hSAP

    imagen3

    Gsr 0,750,700:2500,1,003L75,R75; Cm(255:277}

    2-1879,0

    1: TOP EM EN+

    2T06e5

    imagen4

    0 • i iv ■ r1 ■1 ^ i>'»t 1

    23000 23500

    24033,0 -n 24675,0 ^ \

    \

    24000

    24500

    25170,0

    25244,0

    f

    25000

    I V 1 1 I‘-| i

    25500

    Asialo

    i i i f"i m r > r i i' i > t r 11* i 26000 ■ 26500

    i i i i i

    masa

    CO

    CO

    imagen5

    CO

    CD

    imagen6

    1; TOF EM EN+

    imagen7

    4^

    O

    imagen8

    0

    2

    6

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    imagen10

    mUA

    imagen11

    imagen12

    125

    100-

    75

    50-

    25

    imagen13

    FIGURA3

    Actividad relative promedio

    b u b '» 'o bi o w o oi <=>

    ilil

    Patron de hSAP

    rhSAP P Asialo rhSAP Asial-o hSAP rhSAP a2,3 glicorremod.

    hSAP a2s3 glicorremod. rhSAP a2,6 glicorremod.

    hSAP a2,6 glicorremod. rhSAP a2n3 compietamente slai.

    Mezcla 1:1 de rhSAP a2,3:a2,6 Mezcla 1:1 de hSAP a2,3:a2,6

    imagen14

    8 U03-0 9Z0Z6I-SI.3

    Numero de fibrocitos por 5,0 x 104 celulas

    imagen15

    FIGURA4

    4^

    cn

    imagen16

    0,25

    M hSAp

    imagen17

    FIGURA5