CN105372214B - 一种鉴定新红细胞生成刺激蛋白的n-连接寡糖结构的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定新红细胞生成刺激蛋白的N‑连接寡糖结构的方法。本发明的方法包括三个步骤：(1)唾液酸酶酶切结合激光诱导荧光毛细管电泳分离的方法来确定新红细胞生成刺激蛋白的N‑连接寡糖上其末端唾液酸的连接方式；(2)糖苷外切酶酶切测序的方法结合激光诱导荧光毛细管电泳分离的方法归属去唾液酸化的N‑连接寡糖的结构；(3)采用激光诱导荧光毛细管电泳和弱阴离子交换色谱的二维分离技术，结合唾液酸酶酶切的方法来分析N‑连接寡糖的结构。本发明的方法灵敏度高、分离度高、操作简单、成本低、准确度高，利于高通量检测和工业化应用，对新红细胞生成刺激蛋白上的N‑连接寡糖结构中占质量分数95％的糖链都进行了结构鉴定。
Description
技术领域
本发明具体的涉及一种鉴定新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖结构的方法。
背景技术
糖基化是一种将不同结构的糖链共价连接到蛋白质氨基酸序列特定位点的翻译后修饰形式。根据连接方式不同可以将糖基化分为4种类型：N-聚糖(N-glycan，N-连接寡糖)、O-聚糖(O-glycan，O-连接寡糖)、糖磷脂锚(glycophospholipid anchor，GPI Anchor)以及C-糖基化。蛋白质糖基化的一个重要特点是不均一性，即在糖基化发生过程中会产生一系列结构相关的糖链(微不均一性)以及同一糖蛋白中的不同糖基化位点连接有不同的糖链(点不均一性)。这是由于糖基化的发生不同于多肽链的合成，不受DNA的直接控制，而是由糖基化相关的几种酶协调作用完成的，受各种生理生化条件的影响很大，造成即使同一个位点也会有糖基化程度不同的产物。同时糖链的结构高度分支以及大量异构体的存在，对其结构鉴定存在大量困难。
促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)是一类糖蛋白类激素，主要促进成熟红细胞的生成。1989年，美国Amgen公司首次研制成功重组人促红细胞生成素(rhEPO)用于治疗慢性肾衰竭引起的贫血，取得了令人瞩目的疗效。它也属于国际奥委会规定的违禁药物,是一类兴奋剂。新红细胞生成刺激蛋白(Novel erythropoiesis stimulating protein,NESP)又称Darbepoetin alfa，Aranesp，是美国Amgen公司研制的长效EPO制剂,于2001年6月底获得欧洲药物评审委员会批准,用于慢性肾衰(chronic renal failure,CRF)引起的贫血。NESP是高度糖基化的重组EPO的类似物，通过基因工程技术改造，其N-连接糖基化位点增加到5个(Asn-24,30,38,83,88)，生物活性也大大提高。临床表明，皮下静脉注射的EPO如果含有高度分支唾液酸化的糖链，血浆半衰期长达5～6h；然而含有去唾液化的糖链，几分钟就会被肝脏所清除。正由于其糖基化修饰的程度对其生物活性、血浆半衰期、免疫原性以及稳定性有重要影响。
糖组学的分析是促红细胞生成素类药物质量控制的一个重要指标。蛋白糖基化修饰的高度复杂性以及糖链缺乏紫外或荧光检测基团、离子化较困难，因此对糖链的结构分析具有很大的挑战性。常见的糖链的分离分析方法包括亲水相互作用色谱(Hydrophilicinteraction chromatography，HILIC)、石墨化碳柱(Graphitized carbonchromatography)以及质谱(Mass spectrometry，MS)等。质谱在糖链的定性定量研究中具有很大的局限性，一方面是末端易丢失的单糖如唾液酸在质谱离子化过程中易丢失影响定性，另一方质谱在糖链定量分析的也不太准确。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服新红细胞生成刺激蛋白上的N-连接寡糖结构复杂、高度唾液酸化，难以鉴定结构的缺陷而提供了一种鉴定新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖结构的方法。本发明的方法利用了激光诱导荧光毛细管电泳(CE-LIF)和弱阴离子交换色谱的二维分离技术，大大提高了可被检测到的糖链类型数。同时二维分离技术与糖苷外切酶测序技术(Exglycosidase sequencing)相结合，可以快速、高效、准确地实现新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖结构的鉴定。而且方法简单，灵敏度高，检出限低于摩尔数量级。本发明中对新红细胞生成刺激蛋白上的N-连接寡糖结构中占质量分数95％的糖链都进行了结构鉴定。
本发明提供了一种新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖结构鉴定的方法，其包括以下步骤：
(1)对新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖进行8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐荧光衍生(APTS荧光衍生)，衍生产物分为两部分，一部分用广谱性的唾液酸酶α(2-3,6,8,9)-specific Neuraminidase进行酶切，另一部分用特异性的唾液酸酶α(2-3)-specificNeuraminidase进行酶切，对每一部分的酶切产物分别通过激光诱导荧光毛细管电泳进行分离；从毛细管电泳的结果来确定新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖上末端唾液酸与N-连接寡糖上唾液酸以外的部分的连接方式；
(2)对新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖进行8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐荧光衍生(APTS荧光衍生)，然后用特异性的唾液酸酶α(2-3)-specific Neuraminidase或广谱性的唾液酸酶α(2-3,6,8,9)-specific Neuraminidase进行酶切使去唾液酸化，形成中性的N-连接寡糖；然后将中性的N-连接寡糖分为三部分，第一部分用β1-4半乳糖苷酶进行酶切，第二部分用β1-4半乳糖苷酶和β-N-乙酰氨基葡糖苷酶进行酶切，第三部分用β1-4半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶和岩藻糖苷酶进行酶切；对每一部分的酶切产物分别用激光诱导荧光毛细管电泳分离；然后分别将每一部分的分离结果中的色谱峰迁移时间转换为葡萄糖单元组成个数(英文缩写GU，也称寡糖聚合度)；然后结合每一部分所用的糖苷外切酶的特异性，归属所述的中性的N-连接寡糖的结构；
(3)将新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖分为两部分，即第一部分和第二部分；将第一部分先进行2-氨基苯甲酰胺衍生(2-AB衍生)，然后用弱阴离子交换色谱法对衍生后的产物进行梯度分离，使衍生后的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖中的中性的N-连接寡糖、单唾液酸化的N-连接寡糖、二唾液酸化的N-连接寡糖、三唾液酸化的N-连接寡糖及四唾液酸化的N-连接寡糖达到基线分离；第二部分不经2-氨基苯甲酰胺衍生，直接用弱阴离子交换色谱法进行梯度分离，且梯度分离的条件同第一部分的梯度分离条件相同，并按照第一部分的分离结果中的衍生后的二唾液酸化的N-连接寡糖、衍生后的三唾液酸化的N-连接寡糖及衍生后的四唾液酸化的N-连接寡糖的出峰时间分别对第二部分的梯度分离后的未经衍生的二唾液酸化的N-连接寡糖、未经衍生的三唾液酸化的N-连接寡糖及未经衍生的四唾液酸化的N-连接寡糖进行收集；对收集的这三种N-连接寡糖都分别进行以下操作：先脱盐，然后用8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐进行荧光衍生，然后将8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐衍生产物分为两部分，一部分直接进行激光诱导荧光毛细管电泳分离，另一部分先用特异性的唾液酸酶α(2-3)-specific Neuraminidase或广谱性的唾液酸酶α(2-3,6,8,9)-specific Neuraminidase进行酶切，然后进行激光诱导荧光毛细管电泳分离，通过这两部分的电泳分离结果的对比来分析其结构。
所述的用β1-4半乳糖苷酶和β-N-乙酰氨基葡糖苷酶进行酶切，其中两种酶的酶切顺序不限，可以为β1-4半乳糖苷酶和β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的混合酶的酶切，也可以为依次用β1-4半乳糖苷酶和β-N-乙酰氨基葡糖苷酶进行酶切，也可以为依次用β-N-乙酰氨基葡糖苷酶和β1-4半乳糖苷酶进行酶切。
所述的用β1-4半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶和岩藻糖苷酶进行酶切，其中三种酶的酶切顺序不限，可以为三种酶混合在一起的混合酶的酶切；也可以先用其中任意两种酶的混合酶进行酶切，然后再用三种酶中的最后一种酶进行酶切；也可以为依次采用三种酶进行酶切，且所述的依次采用三种酶进行酶切中的三种酶的顺序不限，可以为任意排列组合后的顺序。
本发明所述的步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)之间的顺序不限，可以是先步骤(1)，然后步骤(2)，最后步骤(3)；或者是，先步骤(1)，然后步骤(3)，最后步骤(2)；或者是，先步骤(2)，然后步骤(1)，最后步骤(3)；或者是，先步骤(2)，然后步骤(3)，最后步骤(1)；或者是，先步骤(3)，然后步骤(1)，最后步骤(2)；或者是，先步骤(3)，然后步骤(2)，最后步骤(1)。
所述的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖可以是以本领域常规方法获得的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖，优选是将新红细胞生成刺激蛋白依次通过化学还原和肽N-糖苷酶F酶切而释放的N-连接寡糖。
所述的广谱性的唾液酸酶α(2-3,6,8,9)-specific Neuraminidase，又叫α(2-3,6,8,9)Neuraminidase、Acyl-neuraminyl Hydrolase、Sialidase、Arthrobacterureafaciens sialidase或NANase III，其可同时酶切α(2-3)、α(2-6)、α(2-8)及α(2-9)连接的糖苷键。所述的广谱性的唾液酸酶α(2-3,6,8,9)-specific Neuraminidase一般来自Arthrobacter ureafaciens。
所述的特异性的唾液酸酶α(2-3)-specific Neuraminidase，又叫α(2-3)Neuraminidase或NANase I，其可仅酶切α(2-3)连接的糖苷键，而不能酶切α(2-6)、α(2-8)及α(2-9)连接的糖苷键。所述的特异性的唾液酸酶α(2-3)-specific Neuraminidase一般来自重组基因后的Streptococcus pneumoniae。
所述的化学还原在进行前，优选先进行前处理来去除糖蛋白样品中的盐以及表面活性剂。所述的去除糖蛋白样品中的盐以及表面活性剂的方法可为本领域各种常规的去除糖蛋白样品中的盐以及表面活性剂的方法，优选采用超滤离心的方法。所述的超滤离心所用的超滤管优选为体积1.5mL，滤膜孔径大小3000Da，滤膜的膜材质为苯乙烯与丁二烯的共聚物。所述的超滤离心的离心力条件优选为10000～14000g。所述的超滤离心的一次离心的时间优选为10～15min。所述的超滤离心的次数优选为3～4次，且每次离心前将样品用水稀释。所述的超滤离心在结束后，优选将超滤管倒置，1000～3000g离心力条件下离心3～5min回收蛋白。
所述的化学还原的方法为本领域常规的糖蛋白的化学还原的方法，优选包括以下步骤：将含有新红细胞生成刺激蛋白、二硫苏糖醇的pH为8.0的水溶液依次置于95～100℃和20～25℃的温度下分别保持20～30s，将得到的产物再重复以上“依次置于95～100℃和20～25℃的温度下分别保持20～30s”的操作5次。所述的二硫苏糖醇的浓度优选为5～20mM。所述的新红细胞生成刺激蛋白的用量优选为反应体系中237.5～950g新红细胞生成刺激蛋白/mol二硫苏糖醇。所述的pH为8.0的水溶液优选使用碳酸铵水溶液调节pH值至8.0。
所述的肽N-糖苷酶F酶切中，肽N-糖苷酶F和新红细胞生成刺激蛋白的用量比例优选为每95～100μg新红细胞生成刺激蛋白用1000U(活力单位)的肽N-糖苷酶F进行酶切。所述的肽N-糖苷酶F酶切的温度优选为35～38℃，更优选为37℃。所述的肽N-糖苷酶F酶切的时间优选为16～18h。所述的肽N-糖苷酶F酶切在进行完后，优选进行以下后处理步骤：将肽N-糖苷酶F酶切后的体系与冰冻乙醇混合，10000～14000g离心力条件下离心8～10min，取上清液冻干备用。所述的冰冻乙醇的体积优选为是所述的酶切的体系的体积的3～4倍。
所述的8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐荧光衍生(APTS荧光衍生)的方法可为本领域各种常规方法，优选为包括以下步骤：将待衍生样品与APTS的水溶液、NaBH3CN溶在有机溶剂中的溶液混合，所述的APTS的水溶液中还含有乙酸或柠檬酸，且所述的柠檬酸在水溶液中的浓度为0.6～1.2M，所述的乙酸在水溶液中的浓度为1.2～3.0M，进行荧光衍生反应即可；所述的荧光衍生反应的温度优选为35～38℃，更优选为37℃。所述的荧光衍生反应的时间优选为16～18h。所述的APTS荧光衍生反应中，APTS与N-连接寡糖的物质的量比例优选为大于100:1，更优选为100:1～1000:1。所述的混合的方法优选搅拌或振荡。所述的8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐与NaBH3CN的摩尔比优选为1:10～1:20。所述的NaBH3CN的有机溶剂的溶液中NaBH3CN的浓度优选为1M。所述的有机溶剂优选包括脂肪族溶剂、芳香族溶剂和脂肪族卤化物溶剂中的一种或多种。所述的脂肪族溶剂优选包括戊烷、己烷、庚烷、环己烷和石油醚中的一种或多种。所述的芳香族溶剂优选为THF。所述的脂肪族卤化物溶剂优选包括二氯甲烷、二氯乙烷和氯仿中的一种或几种。所述的8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐在所述的水溶液的浓度优选为20～100mM，更优选为50mM。所述的荧光衍生反应在结束后，优选进行以下后处理：在避光条件下加入50-100μL水淬灭反应。
所述的激光诱导荧光毛细管电泳分离的方法可为本领域各种常规方法。所述的激光诱导荧光毛细管电泳分离中所用的毛细管柱优选为石英毛细管柱。所述的毛细管柱的内径优选为25～75μm，更优选为50μm。所述的毛细管柱的外径优选为365～385μm，更优选为370μm。所述的毛细管柱的总长度优选为30～100cm，更优选为40cm。所述的毛细管柱的有效长度优选为19.5～89.5cm，更优选为29.5cm。所述的激光诱导荧光毛细管电泳分离中所用的缓冲溶液优选为甲酸铵水溶液、乙酸钠水溶液或乙酸铵水溶液，更优选为乙酸铵水溶液。所述的缓冲溶液的pH值优选为3～5，更优选为4.75。所述的缓冲溶液中溶质的浓度优选为20～50mM，更优选为25mM。所述的缓冲溶液的溶质优选为还包含聚环氧乙烷(分子量范围优选4000～35000)、羟丙基甲基纤维素、或乙基纤维素。所述的聚环氧乙烷、羟丙基甲基纤维素、或乙基纤维素的含量优选为(0.2～1)％，更优选为0.4％，百分比为聚环氧乙烷、羟丙基甲基纤维素、或乙基纤维素的质量与缓冲溶液的体积之比。所述的激光诱导荧光毛细管电泳的进样的方法优选为流体力学进样和/或电迁移进样。所述的流体力学进样的压强优选为0.2～0.5磅/平方英寸，更优选为0.2磅/平方英寸。所述的进样时间优选为3～5s，更优选为3s。所述的毛细管电泳的分离电压优选为反转电压。所述的反转电压的电压值优选为10～20kV，更优选为12kV。所述的毛细管电泳的柱温优选为20～25℃。所述的毛细管电泳的激发波长优选为488nm。所述的毛细管电泳的发射波长优选为520nm。
所述的色谱峰迁移时间转换为葡萄糖单元组成个数的方法可以按照本领域常规的色谱峰迁移时间和葡萄糖单元组成个数的转换方法，优选按照以下步骤进行：将8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐荧光衍生的不同聚合度大小的葡萄糖寡聚糖的混合物，聚合度范围为1～20，作为外标，甘露二糖作为内标(以甘露二糖为内标，额外加入到实际样品中，是为了校正迁移时间，增加峰归属的准确性)，进行激光诱导荧光毛细管电泳分离，并建立色谱峰迁移时间和葡萄糖单元组成个数的线性关系；通过线性关系将N-连接寡糖的色谱峰迁移时间转化为葡萄糖单元组成个数，所述的激光诱导荧光毛细管电泳分离的方法同前所述。
所述的2-氨基苯甲酰胺衍生(2-AB衍生)的方法可为本领域各种常规的2-AB衍生的方法，优选按照以下步骤进行：将2-氨基苯甲酰胺与NaBH3CN溶于DMSO与乙酸体积比为6:4～8:2(优选为7:3)的混合溶剂中得溶液A；所述的溶液A中2-氨基苯甲酰胺的浓度为每毫升溶液A中含有2-氨基苯甲酰胺40～60mg(优选为50mg)；所述的溶液A中NaBH3CN的浓度为每毫升溶液A中含有NaBH3CN50～70mg(优选为63mg)；将所述的溶液A与N-连接寡糖溶于水的溶液B混合后，35～38℃下进行衍生反应，即可。所述的溶液A与所述的溶液B的体积比优选为3：2。所述的2-AB与所述的N-连接寡糖的摩尔比优选为大于100:1，更优选为100:1～1000:1。所述的衍生反应的温度优选为37℃。所述的衍生反应的时间优选为16～18h，更优选为17h。
所述的8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐荧光衍生或所述的2-氨基苯甲酰胺衍生的方法在进行完后可按照本领域常规的后处理步骤进行脱除衍生试剂的操作，优选按照以下步骤进行：将填料为聚酰胺类树脂，且填料粒径为50～160μm的固相萃取小柱(优选为美国Supelco公司的型号为Discovery DPA-6S的柱子)，用体积比为95:5的乙腈与水的混合液进行活化，然后将被乙腈或甲醇稀释后的所述的衍生后的产物或所述的荧光衍生后的产物上样，所述的被乙腈或甲醇稀释，要保证乙腈或甲醇用量不低于95％，百分比指乙腈的体积占整个稀释体系总体积的体积百分比；上样后用缓冲液A反复洗脱去除衍生试剂；所述的缓冲液A由95％乙腈、5％去离子水和50mM三乙胺组成，百分比是各组分的体积占缓冲液A总体积的体积百分比；然后用缓冲液B将保留在柱子上的N-连接寡糖洗脱，所述的缓冲液B是50mM的三乙胺的水溶液。
所述的脱除衍生试剂的操作在结束后，优选按照以下后处理将洗脱下来的N-连接寡糖进行保存：先将洗脱下来的N-连接寡糖在-10℃～-50℃冷冻干燥，然后将冻干后的N-连接寡糖溶解在去离子水中，-20℃保存备用。
所述的弱阴离子交换色谱法对衍生后的产物进行梯度分离可按照本领域常规的弱阴离子交换色谱法的条件进行。所述的弱阴离子交换色谱法所用的色谱柱优选为日本的shodex公司的型号为Asahipak ES-502N的柱子，其柱子长度为100mm，柱子内径为7.6mm，柱子填料粒径为9μm。所述的弱阴离子交换色谱法的流动相流速优选为0.5～0.8mL/min。所述的弱阴离子交换色谱法所用柱温优选为30～40℃。所述的弱阴离子交换色谱法所用的激发波长优选为330nm。所述的弱阴离子交换色谱法所用的发射波长优选为420nm。所述的弱阴离子交换色谱法所用的流动相优选为由A相和B相组成，所述的A相为由80wt％H2O和20wt％乙腈组成，所述的B相由50wt％500mM甲酸铵水溶液、30wt％H2O和20wt％乙腈组成，所述的B相的pH＝4.5。所述的弱阴离子交换色谱法对衍生后的产物进行梯度分离中的流动相梯度优选为以下条件：0～20min：0％所述的B相；20～25min：0％～16％所述的B相；25～65min：16％～50％所述的B相；百分比为体积百分比，且所述的A相的用量为100％减去所述的B相的用量。
所述的脱盐可按本领域常规的脱盐方法进行，优选使用反相脱盐的方法。所述的反相脱盐的方法优选使用C18柱或多空石墨化碳固相萃取小柱进行脱盐。当采用所述的C18柱进行脱盐时，所述的C18柱优选为Waters公司的Sep-pak C18柱。当采用所述的C18柱进行脱盐时，所述的反相脱盐优选按照以下步骤进行：先将C18柱活化，然后上样，用水洗脱去除样品里的盐。当采用所述的C18柱进行脱盐时，所述的活化优选采用体积比为8：2的乙腈和水的混合液活化柱子并重复使共执行三遍，然后用水活化柱子并重复使共执行三遍。当采用所述的C18柱进行脱盐时，所述的脱盐在结束后优选采用体积比为1:1的乙腈和水的混合液将N-连接寡糖洗脱下来。所述的N-连接寡糖洗脱下来之后，优选按照以下后处理将洗脱下来的N-连接寡糖进行保存：冻干，-20℃保存备用。
当采用所述的多空石墨化碳固相萃取小柱进行脱盐时，所述的反相脱盐优选按照以下步骤进行：先将多空石墨化碳固相萃取小柱活化，然后上样，用水洗脱去除样品里的盐。所述的活化优选采用体积比为8：2的乙腈和水，且含有0.1wt％三氟乙酸的混合液活化柱子并重复使共执行三遍，然后用水活化柱子并重复使共执行三遍。当采用所述的多空石墨化碳固相萃取小柱进行脱盐时，所述的脱盐在结束后优选采用体积比为4:6的乙腈和水，且含有0.05wt％三氟乙酸的混合液将N-连接寡糖洗脱下来。所述的N-连接寡糖洗脱下来之后，优选按照以下后处理将洗脱下来的N-连接寡糖进行保存：冻干，-20℃保存备用。
本发明中，所述的酶切，不包括所述的肽N-糖苷酶F酶切，酶切的条件均可为本领域常规的糖苷外切酶酶切的条件。所述的酶切，不包括所述的肽N-糖苷酶F酶切，酶切时的温度优选为35～38℃，更优选为37℃。所述的酶切，不包括所述的肽N-糖苷酶F酶切，酶切时N-连接寡糖和酶的用量比例优选为每1μg～5μg N-连接寡糖用活力单位为1.6～20mU的酶。所述的酶切，不包括所述的肽N-糖苷酶F酶切，酶切时的pH值优选为5.0～6.0。所述的酶切，不包括所述的肽N-糖苷酶F酶切，酶切的时间优选为18h～24h。所述的酶切，当所用的酶为广谱性的唾液酸酶α(2-3,6,8,9)-specific Neuraminidase或特异性的唾液酸酶α(2-3)-specific Neuraminidase时，酶与待酶切的N-连接寡糖的用量比例优选为1～2mU酶/μg N-连接寡糖，这里所述的N-连接寡糖包括APTS荧光衍生的N-连接寡糖。所述的酶切，当所用的酶为β1-4半乳糖苷酶时，酶与待酶切的N-连接寡糖的用量比例优选为4～8mU酶/μg N-连接寡糖，这里所述的N-连接寡糖包括APTS荧光衍生的N-连接寡糖。所述的酶切，当所用的酶为β-N-乙酰氨基葡糖苷酶时，酶与待酶切的N-连接寡糖的用量比例优选为2～4mU酶/μg N-连接寡糖，这里所述的N-连接寡糖包括APTS荧光衍生的N-连接寡糖。所述的酶切，当所用的酶为岩藻糖苷酶时，酶与待酶切的N-连接寡糖的用量比例优选为1.6～3.2mU酶/μgN-连接寡糖，这里所述的N-连接寡糖包括APTS荧光衍生的N-连接寡糖。
本发明中，所述的色谱峰迁移时间转换为葡萄糖单元组成个数的方法中，需要被计算葡萄糖单元组成个数的样品其测定色谱峰迁移时间所用的激光诱导荧光毛细管电泳的检测条件，一般和计算该线性关系时测定标准品的色谱峰迁移时间所用的激光诱导荧光毛细管电泳的检测条件一致。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的方法将激光诱导荧光毛细管电泳技术、糖苷外切酶测序技术及弱阴离子交换色谱技术相结合，可以实现N-连接寡糖结构的鉴定，方法简单、快速、可靠，利于新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖结构鉴定的高通量实施。
附图说明
图1为8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐荧光衍生的葡萄糖寡聚糖及甘露二糖激光诱导荧光毛细管电泳分离图；其中葡萄糖寡聚糖为由不同聚合度大小的葡萄糖寡聚糖的混合物，聚合度范围为1～20；
图2为8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐荧光衍生的聚合度范围为1～20的葡萄糖寡聚糖中各组分的葡萄糖单元组成个数与色谱峰迁移时间的线性关系图；其中线性方程为y＝1.7995x-7.80623。
图3为8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐荧光衍生的新红细胞生成刺激蛋白N-连接寡糖的激光诱导荧光毛细管电泳分离图；
图4为8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐荧光衍生的新红细胞生成刺激蛋白N-连接寡糖的唾液酸酶酶切产物的激光诱导荧光毛细管电泳分离图，其中图a是广谱性的唾液酸酶α(2-3,6,8,9)-specific Neuraminidase酶切产物的激光诱导荧光毛细管电泳分离图，图b是特异性的唾液酸酶α(2-3)-specific Neuraminidase酶切产物的激光诱导荧光毛细管电泳分离图；
图5为8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐荧光衍生的新红细胞生成刺激蛋白的去唾液酸化N-连接寡糖经不同的糖苷外切酶酶切产物的激光诱导荧光毛细管电泳分离图，其中图a为没有经过糖苷外切酶酶切的新红细胞生成刺激蛋白的去唾液酸化N-连接寡糖的激光诱导荧光毛细管电泳分离图，图b是β1-4半乳糖苷酶对新红细胞生成刺激蛋白的去唾液酸化N-连接寡糖酶切后产物的电泳分离图，图c是用β1-4半乳糖苷酶和β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的混合酶对新红细胞生成刺激蛋白的去唾液酸化N-连接寡糖酶切后产物的电泳分离图，图d是用β1-4半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶和岩藻糖苷酶的混合酶对新红细胞生成刺激蛋白的去唾液酸化N-连接寡糖酶切后产物的电泳分离图；
图6为弱阴离子交换色谱法分离2-AB衍生的新红细胞生成刺激蛋白N-连接寡糖的紫外色谱图；其中“+1唾液酸”、“+2唾液酸”、“+3唾液酸”和“+4唾液酸”分别表示末端有一个唾液酸、两个唾液酸、三个唾液酸和四个唾液酸的N-连接寡糖的色谱峰；
图7为不同唾液酸化程度的新红细胞生成刺激蛋白N-连接寡糖含量分布图；
图8为用弱阴离子交换色谱法分离并收集的不同唾液酸化程度的新红细胞生成刺激蛋白N-连接寡糖及其特异性的唾液酸酶α(2-3)-specific Neuraminidase酶切产物的电泳分离图；其中图a-1、图b-1以及图c-1分别是二唾液酸化的N-连接寡糖、三唾液酸化的N-连接寡糖、四唾液酸化的N-连接寡糖的电泳分离结果；图a-2、图b-2以及图c-2分别是用特异性的唾液酸酶α(2-3)-specific Neuraminidase酶切后的去唾液酸化的二唾液酸化的N-连接寡糖、三唾液酸化的N-连接寡糖、四唾液酸化的N-连接寡糖的电泳分离结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
以下实施例中用到的特异性的唾液酸酶α(2-3)-specific Neuraminidase是购自prozyme公司，产品型号为Sialidase STM/NANase I。
以下实施例中用到的广谱性的唾液酸酶α(2-3,6,8,9)-specific Neuraminidase是购自Prozyme公司，产品型号为SialidaseATM。
以下实施例中用到的新红细胞生成刺激蛋白购自Amgen公司，产品型号为Aranesp。
以下实施例中用到的肽N-糖苷酶F购自Prozyme公司，产品型号为PNGaseF。
以下实施例中用到的β1-4半乳糖苷酶购自Prozyme_公司，产品型号为β(1-4)-Galactosidase。
以下实施例中用到的β-N-乙酰氨基葡糖苷酶购自_Prozyme公司，产品型号为β-N-Acetylhexosaminidase。
以下实施例中用到的岩藻糖苷酶购自Prozyme公司，产品型号为α(1-2,3,4,6)Fucosidase。
实施例6和8是在美国Waters公司的固相微萃取装置Wat200609上进行。
实施例7是在安捷伦(Agilent)1260高效液相色谱仪器上进行。
实施例9是在贝克曼库尔特(Beckman_Coulter)P/ACETMMDQ高效毛细管仪器上进行。
实施例1新红细胞生成刺激蛋白样品的前处理
超滤去除盐以及表面活性剂：准备预先用水洗涤过的1.5mL超滤管，上样蛋白含量为100μg的新红细胞生成刺激蛋白水溶液100μL，离心力14000g下离心15min使样品体积减小到原来的1/10。加水稀释至原来的体积后再次在离心力14000g下离心15min。然后再稀释后离心一次，条件同前两次一样。之后，将超滤管倒置，离心力2000g下离心5min回收蛋白，回收率为95％，回收到的含水的蛋白样品体积为10μL，冻干备用。
实施例2化学还原
取实施例1中回收的蛋白溶解于20μL含有5mM二硫苏糖醇(DTT)的100mM的碳酸铵水溶液中，并置于0.5mL样品管中。依次置于100℃与25℃水浴中保持20s，重复以上改变温度条件的操作，使共执行六次。
实施例3肽N-糖苷酶F酶切
将实施例2中化学还原后的体系中加入2μL含有1000U(活力单位)的肽N-糖苷酶F的水溶液，37℃下进行酶切，反应16h。加入三倍体积的冰冻乙醇，离心力14000g下离心10min。取上清，冻干后备用。
实施例48-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐荧光衍生(APTS荧光衍生)
将50μg待衍生的N-连接寡糖中加入2μL的50mM的APTS的水溶液，且水溶液中还含有体积百分比为15％的乙酸，然后加入2μL的1M的NaBH3CN溶于THF的溶液。置于37℃反应16h。反应完毕后，避光加入100μL水淬灭反应。
实施例52-氨基苯甲酰胺衍生(2-AB衍生)
2-AB与NaBH3CN溶于DMSO与乙酸体积比为7:3的混合溶剂中，配成2-AB浓度为50mg/mL、NaBH3CN浓度为63mg/mL的溶液A。将50μg待衍生的N-连接寡糖溶解于10μL水中，并加入15μL上述溶液A，37℃反应17h。
实施例6去除衍生试剂
衍生后的样品用乙腈稀释，保证乙腈的体积百分比达到95％。首先用乙腈与水(v/v＝95:5)的混合液活化固相萃取小柱Discovery DPA-6S(Supelco，填料量为50mg/柱)；然后上样，过量的APTS采用缓冲液A(95％乙腈，5％去离子水和50mM三乙胺，百分比是体积百分比)反复洗脱去除。保留在小柱上的衍生后的糖链用缓冲液B(50mM三乙胺水溶液)洗脱。然后将洗脱回收的样品在-10℃～-50℃冷冻干燥，之后重新溶解到100μL去离子水中，-20℃保存备用。
实施例7弱阴离子交换色谱分离
色谱柱：日本昭和电工科学仪器公司(Shodex)的Asahipak ES-502N，柱子内径7.6mm，柱子长度100mm，柱子的填料粒径9μm；分离条件：流动相流速0.8ml/min；柱温30℃；激发波长为330nm，发射波长为420nm。流动相中A相为80％H2O和20％乙腈的混合液，百分比为体积百分比。流动相中B相为50％500mM甲酸铵水溶液、30％H2O和20％乙腈的混合液，百分比为体积百分比，pH＝4.5。梯度洗脱条件：0～20min：0％B；20～25min：0％～16％B；25～65min：16％～50％B；百分比为体积百分比，且A相的用量为100％减去B相的用量。
实施例8脱盐
C18柱脱盐法：将按照实施例7中弱阴离子交换色谱分离后收集的不同唾液酸化程度的N-连接寡糖各组分通过固相萃取小柱Sep-pak C18(Waters公司，填料量为200mg/柱)脱盐。首先用乙腈与水(v/v＝80:20)混合液活化小柱，重复使共执行三遍；再加水活化小柱，重复使共执行三遍。然后上样，大量的水洗去除甲酸铵，之后用乙腈的体积百分比为50％的乙腈水溶液洗脱保留在小柱上的N-连接寡糖。最后将回收的N-连接寡糖样品冻干，-20℃保存备用。
多空石墨化碳固相萃取小柱脱盐法：将按照实施例7中弱阴离子交换色谱分离后收集的不同唾液酸化程度的N-连接寡糖各组分通过多空石墨化碳固相萃取小柱(Grace公司,填料量为300mg/柱)。首先用乙腈与水(v/v＝80:20，含有0.1％三氟乙酸，百分比为体积百分比)的混合液活化小柱，控制流速小于1mL/min，重复使共执行三遍；再加水活化小柱，重复使共执行三遍。然后上样，大量的水洗去除甲酸铵，之后用乙腈与水(v/v＝40:60，含有0.05％三氟乙酸，百分比为体积百分比)的混合液洗脱保留在小柱上的N-连接寡糖。最后将回收的N-连接寡糖样品冻干，-20℃保存备用。
实施例9激光诱导荧光毛细管电泳分离
石英毛细管柱内径50μm，外径370μm，总长40cm，有效长度29.5cm；缓冲溶液为pH＝4.75的25mM乙酸铵水溶液，使用前加入0.4％(m/v)PEO，百分比为PEO的质量与缓冲溶液总体积的质量体积比，且质量单位为克，体积单位为毫升；进样量0.2psi×3s；分离电压12kV(反转电极)；柱温25℃；激发波长：488nm；发射波长：520nm。
实施例10唾液酸酶酶切
1μg APTS荧光衍生的N-连接寡糖溶解于10μL的50mM乙酸钠水溶液中(pH5.0)，加入2μL广谱性的唾液酸酶α(2-3,6,8,9)-specific Neuraminidase(其浓度为0.5mU/μL)或2μL特异性的唾液酸酶α(2-3)-specific Neuraminidase(其浓度为0.5mU/μL)进行酶切实验，37℃反应12h至酶切完全。
用广谱性的唾液酸酶α(2-3,6,8,9)-specific Neuraminidase或特异性的唾液酸酶α(2-3)-specific Neuraminidase对APTS荧光衍生的N-连接寡糖进行上述的酶切后，即得到APTS荧光衍生的去唾液酸化的中性的N-连接寡糖。
实施例11糖苷外切酶酶切去唾液酸化的中性的N-连接寡糖
1μg APTS荧光衍生的去唾液酸化的中性的N-连接寡糖溶解于10μL的50mM乙酸钠水溶液中(pH5.0)，加入2μLβ1-4半乳糖苷酶(其浓度为2mU/μL)，37℃反应12h至酶切完全。
1μg APTS荧光衍生的去唾液酸化的中性的N-连接寡糖溶解于10μL的50mM乙酸钠水溶液中(pH5.0)，然后加入2μL含有2mU/μL的β1-4半乳糖苷酶和1mU/μL的β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的混合酶，37℃反应12h至酶切完全。
1μg APTS荧光衍生的去唾液酸化的中性的N-连接寡糖溶解于10μL的50mM乙酸钠水溶液中(pH5.0)，然后加入2μL含有2mU/μL的β1-4半乳糖苷酶、1mU/μL的β-N-乙酰氨基葡糖苷酶和0.8mU/μL的岩藻糖苷酶的混合酶，37℃反应12h至酶切完全。
效果实施例1
依次按照实施例4、6和9的方法进行操作，具体地说是，用APTS对聚合度范围为1～20的葡萄糖寡聚糖及内标物甘露二糖荧光衍生后，进行激光诱导荧光毛细管电泳分离，结果见图1。以甘露二糖为内标，是为了校正迁移时间，增加色谱峰迁移时间和葡萄糖单元组成个数的线性关系的准确性。
将图1中各组分的色谱峰迁移时间和葡萄糖单元组成个数(GU值)进行相关性分析，结果如图2，线性良好，线性相关系数的平方R2＝0.998。根据图2中的线性关系，可以实现将新红细胞生成刺激蛋白经肽N-糖苷酶F酶切产物中所有N-连接寡糖或衍生后的N-连接寡糖的电泳迁移时间转换为葡萄糖单元组成个数(GU)。
依次按照实施例1、2、3、4、6、9的方法进行操作，具体地说是，将新红细胞生成刺激蛋白经肽N-糖苷酶F酶切，酶切后的N-连接寡糖经APTS荧光衍生后的产物电泳分离图见图3。GU值范围约4-10。
依次按照实施例1、2、3、4、6、10和9的方法进行操作，其中实施例10中的糖苷外切酶包括广谱性的唾液酸酶α(2-3,6,8,9)-specific Neuraminidase酶切和特异性的唾液酸酶α(2-3)-specific Neuraminidase酶切，具体地说是，将APTS荧光衍生后的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖分为两部分，第一部分用光谱性的唾液酸酶进行酶切，第二部分用特异性的唾液酸酶α(2-3)-specific Neuraminidase进行酶切，每种唾液酸酶酶切后的产物的激光诱导荧光毛细管电泳分离结果见图4，其中图a是广谱性的唾液酸酶α(2-3,6,8,9)-specific Neuraminidase酶切产物的激光诱导荧光毛细管电泳分离图，图b是特异性的唾液酸酶α(2-3)-specific Neuraminidase酶切产物的激光诱导荧光毛细管电泳分离图。广谱的唾液酸酶同时酶切α-2,3/6/8连接的唾液酸，特异性的唾液酸酶α(2-3)-specificNeuraminidase只可以酶切α-2,3连接的唾液酸，它们酶解产物的分离电泳图色谱峰完全一致，说明了其所有末端唾液酸的连接方式是α-2,3连接。
依次按照实施例1、2、3、4、6、10、11和9的方法进行操作，具体地说是，将APTS荧光衍生后的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖先用广谱性的唾液酸酶α(2-3,6,8,9)-specific Neuraminidase酶切，酶切后的产物分为四部分，第一部分直接用激光诱导荧光毛细管电泳分离；第二部分先用β1-4半乳糖苷酶酶切，然后酶切后产物再用激光诱导荧光毛细管电泳分离；第三部分先用β1-4半乳糖苷酶和β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的混合酶进行酶切，然后酶切后产物再用激光诱导荧光毛细管电泳分离；第四部分先用β1-4半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶和岩藻糖苷酶的混合酶进行酶切，然后酶切后产物再用激光诱导荧光毛细管电泳分离。结果见图5，其中图a为新红细胞生成刺激蛋白的去唾液酸化N-连接寡糖的激光诱导荧光毛细管电泳分离图，图b是β1-4半乳糖苷酶对新红细胞生成刺激蛋白的去唾液酸化N-连接寡糖酶切后产物的电泳分离图，图c是同时进行β1-4半乳糖苷酶以及β-N-乙酰氨基葡糖苷酶对新红细胞生成刺激蛋白的去唾液酸化N-连接寡糖酶切后产物的电泳分离图，图d是同时进行β1-4半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶和岩藻糖苷酶对新红细胞生成刺激蛋白的去唾液酸化N-连接寡糖酶切后产物的电泳分离图。
图5中的图b与图a相比，所有的色谱峰迁移时间提前，说明所有糖链末端都连接有半乳糖，其连接方式是β1-4连接。图5中的图c中只出现了色谱峰2，推算其GU＝6.21，推断其为核心岩藻糖化的甘露五糖。对其进行验证，在此基础上，又加入了岩藻糖苷酶进行酶切产物的电泳分离如图5中的图d。图5中图c的色谱峰2对应迁移成为图5中图d的色谱峰1，GU值变化了0.84。说明所有N-连接寡糖都是核心岩藻糖化。岩藻糖化五糖核心单元的结构式见表1，五糖核心单元的结构式也见表1。
图5中图a中的占N-连接寡糖色谱峰面积95％(归一化法计算)的糖链去唾液酸化后的结构都已推导出，结构式见表1。表1中峰号为3～9对应图5中图a中各个标记了相应峰号的色谱峰。
表1、新红细胞生成刺激蛋白N-连接寡糖的结构式及结构单元
依次按照实施例1、2、3、5、6、7和8的方法进行操作，具体地说是，将新红细胞生成刺激蛋白经肽N-内切酶酶切后的产物N-连接寡糖经2-AB衍生后，由弱阴离子交换色谱分离后的色谱结果见图6，图6中“+1唾液酸”表示末端有一个唾液酸的N-连接寡糖的色谱峰，“+2唾液酸”表示末端有两个唾液酸的N-连接寡糖的色谱峰，“+3唾液酸”与“+4唾液酸”同理。对图6中不同唾液酸化程度的N-连接寡糖进行了定量分析(归一化法)，结果如图7所示。单唾液酸化的N-连接寡糖的含量是2.3％，二唾液酸化的N-连接寡糖的含量是9.3％，三唾液酸化的N-连接寡糖的含量是23.8％，四唾液酸化的N-连接寡糖的含量是64.7％。
由于中性的N-连接寡糖和单唾液酸化的N-连接寡糖含量小于5％，主要制备收集二唾液酸化、三唾液酸化以及四唾液酸化的N-连接寡糖，依次按照实施例1、2、3、7和8的方法进行收集。对制备收集的二唾液酸化的N-连接寡糖、三唾液酸化的N-连接寡糖以及四唾液酸化的N-连接寡糖分别经脱盐后，分别都均分为两部分，每种N-连接寡糖的其中一部分都分别依次按照实施例4、6和9的方法进行APTS荧光衍生后用激光诱导荧光毛细管电泳进行分离。二唾液酸化的N-连接寡糖、三唾液酸化的N-连接寡糖、四唾液酸化的N-连接寡糖电泳分离结果分别如图8中a-1、b-1以及c-1所示。每种N-连接寡糖的另一部分都分别依次按照实施例4、6、10和9的方法进行APTS荧光衍生后唾液酸酶酶切，最后用激光诱导荧光毛细管电泳进行分离，这里实施例10中的糖苷外切酶为特异性的唾液酸酶α(2-3)-specificNeuraminidase。二唾液酸化的N-连接寡糖、三唾液酸化的N-连接寡糖和四唾液酸化的N-连接寡糖，它们的去唾液酸化产物的电泳分离结果分别如图8中的a-2、b-2以及c-2所示。
本发明中根据图5的结果已经对电泳图中新红细胞生成刺激蛋白的去唾液酸化N-连接寡糖的结构进行了归属，现在根据图8的结果又知道了N-连接寡糖的唾液酸化程度，最终确定了占总的N-连接寡糖含量95％的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖的结构，如表1所示，表1中峰号为10～18对应图3中各个标记了相应峰号的色谱峰。新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖中，中性的N-连接寡糖及单唾液酸化的N-连接寡糖由于含量太少，其结构没有进行鉴定。
综上所述，本发明的方法利用了激光诱导荧光毛细管电泳(CE-LIF)和弱阴离子交换色谱的二维分离技术，大大提高了可被检测到的糖链类型数。同时二维分离技术与糖苷外切酶测序技术(Exglycosidase sequencing)相结合，可以快速、高效、准确地实现新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖结构的鉴定。而且方法简单，灵敏度高，检出限低于摩尔数量级。本发明中对新红细胞生成刺激蛋白上的N-连接寡糖结构中占质量分数95％的糖链都进行了结构鉴定。
本发明所鉴定的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖的结构与文献(Proteomics2007,7,4278-4291及Analytical Biochemistry2008,383,243-254)报道的重组的促红细胞生成素的N-连接寡糖的结构相比，具有很大的相似性。N-连接寡糖都存在复杂型糖链，不存在高甘露糖型以及杂合型的糖链。
本发明所鉴定的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖的组成单糖的连接方式及含量也是与文献(Anal.chem.2011,83,4154-4162)报道一致的。末端唾液酸都是α2-3连接的糖苷键、半乳糖都是β1-4连接的糖苷键以及岩藻糖都是α1-6连接的糖苷键。不同唾液酸化糖链的相对含量都是四唾液酸化的N-连接寡糖的含量>三唾液酸化的N-连接寡糖的含量>二唾液酸化的N-连接寡糖的含量>单唾液酸化的N-连接寡糖的含量。
与这些现有技术相比，本发明首次将毛细管电泳的检测方法用在了新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖的结构分析上。毛细管电泳的分析方法灵敏度高，可以对浓度很低的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖的样品进行检测，这同时也节约了成本，且毛细管电泳的分析方法分离度高，可实现单个组分的N-连接寡糖的基线分离。另外，毛细管电泳的分析方法用在新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖的结构分析时操作简便，如果采用毛细管阵列电泳的仪器设备，则可实现本发明的方法的高通量的实施，利于工业化应用。这些优势都是现有技术中的液相色谱分析方法或质谱分析方法应用在新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖的结构分析时所不具备的。
Claims (10)
1.一种新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖结构鉴定的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)对新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖进行8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐荧光衍生，衍生产物分为两部分，一部分用广谱性的唾液酸酶α(2-3,6,8,9)-specificNeuraminidase进行酶切，另一部分用特异性的唾液酸酶α(2-3)-specific Neuraminidase进行酶切，对每一部分的酶切产物分别通过激光诱导荧光毛细管电泳进行分离；从毛细管电泳的结果来确定新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖上末端唾液酸与N-连接寡糖上唾液酸以外的部分的连接方式；
(2)对新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖进行8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐荧光衍生，然后用特异性的唾液酸酶α(2-3)-specific Neuraminidase或广谱性的唾液酸酶α(2-3,6,8,9)-specific Neuraminidase进行酶切使去唾液酸化，形成中性的N-连接寡糖；然后将中性的N-连接寡糖分为三部分，第一部分用β1-4半乳糖苷酶进行酶切，第二部分用β1-4半乳糖苷酶和β-N-乙酰氨基葡糖苷酶进行酶切，第三部分用β1-4半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶和岩藻糖苷酶进行酶切；对每一部分的酶切产物分别用激光诱导荧光毛细管电泳分离；然后分别将每一部分的分离结果中的色谱峰迁移时间转换为葡萄糖单元组成个数；然后结合每一部分所用的糖苷外切酶的特异性，归属所述的中性的N-连接寡糖的结构；
(3)将新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖分为两部分，即第一部分和第二部分；将第一部分先进行2-氨基苯甲酰胺衍生，然后用弱阴离子交换色谱法对衍生后的产物进行梯度分离，使衍生后的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖中的中性的N-连接寡糖、单唾液酸化的N-连接寡糖、二唾液酸化的N-连接寡糖、三唾液酸化的N-连接寡糖及四唾液酸化的N-连接寡糖达到基线分离；第二部分不经2-氨基苯甲酰胺衍生，直接用弱阴离子交换色谱法进行梯度分离，且梯度分离的条件同第一部分的梯度分离条件相同，并按照第一部分的分离结果中的衍生后的二唾液酸化的N-连接寡糖、衍生后的三唾液酸化的N-连接寡糖及衍生后的四唾液酸化的N-连接寡糖的出峰时间分别对第二部分的梯度分离后的未经衍生的二唾液酸化的N-连接寡糖、未经衍生的三唾液酸化的N-连接寡糖及未经衍生的四唾液酸化的N-连接寡糖进行收集；对收集的这三种N-连接寡糖都分别进行以下操作：先脱盐，然后用8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐进行荧光衍生，然后将8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐衍生产物分为两部分，一部分直接进行激光诱导荧光毛细管电泳分离，另一部分先用特异性的唾液酸酶α(2-3)-specific Neuraminidase或广谱性的唾液酸酶α(2-3,6,8,9)-specificNeuraminidase进行酶切，然后进行激光诱导荧光毛细管电泳分离，通过这两部分的电泳分离结果的对比来分析其结构；
所述的步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)之间的顺序不限，其顺序为先步骤(1)，然后步骤(2)，最后步骤(3)；或者是，先步骤(1)，然后步骤(3)，最后步骤(2)；或者是，先步骤(2)，然后步骤(1)，最后步骤(3)；或者是，先步骤(2)，然后步骤(3)，最后步骤(1)；或者是，先步骤(3)，然后步骤(1)，最后步骤(2)；或者是，先步骤(3)，然后步骤(2)，最后步骤(1)。
2.如权利要求1所述的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖结构鉴定的方法，其特征在于，所述的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖是将新红细胞生成刺激蛋白依次通过化学还原和肽N-糖苷酶F酶切而释放的N-连接寡糖。
3.如权利要求2所述的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖结构鉴定的方法，其特征在于，所述的化学还原的方法包括以下步骤：将含有新红细胞生成刺激蛋白、二硫苏糖醇的pH为8.0的水溶液依次置于95～100℃和20～25℃的温度下分别保持20～30s，将得到的产物再重复以上“依次置于95～100℃和20～25℃的温度下分别保持20～30s”的操作5次；所述的二硫苏糖醇的浓度为5～20mM；
和/或，所述的肽N-糖苷酶F酶切中，肽N-糖苷酶F和新红细胞生成刺激蛋白的用量比例为每95～100μg新红细胞生成刺激蛋白用1000U的肽N-糖苷酶F进行酶切；和/或，所述的肽N-糖苷酶F酶切的温度为35～38℃；和/或，所述的肽N-糖苷酶F酶切的时间为16～18h；和/或，所述的肽N-糖苷酶F酶切在进行完后，进行以下后处理步骤：将肽N-糖苷酶F酶切后的体系与冰冻乙醇混合，10000～14000g离心力条件下离心8～10min，取上清液冻干备用。
4.如权利要求1所述的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖结构鉴定的方法，其特征在于，
所述的8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐荧光衍生的方法包括以下步骤：将待衍生样品与APTS的水溶液、NaBH3CN溶在有机溶剂中的溶液混合，所述的APTS的水溶液中还含有乙酸或柠檬酸，且所述的柠檬酸在水溶液中的浓度为0.6～1.2M，所述的乙酸在水溶液中的浓度为1.2～3.0M，进行荧光衍生反应即可；
和/或，所述的2-氨基苯甲酰胺衍生的方法按照以下步骤进行：将2-氨基苯甲酰胺与NaBH3CN溶于DMSO与乙酸体积比为6:4～8:2的混合溶剂中得溶液A；所述的溶液A中2-氨基苯甲酰胺的浓度为每毫升溶液A中含有2-氨基苯甲酰胺40～60mg；所述的溶液A中NaBH3CN的浓度为每毫升溶液A中含有NaBH3CN 50～70mg；将所述的溶液A与N-连接寡糖溶于水的溶液B混合后，35～38℃下进行衍生反应，即可；
和/或，所述的弱阴离子交换色谱法所用的色谱柱为日本的shodex公司的型号为Asahipak ES-502N的柱子，其柱子长度为100mm，柱子内径为7.6mm，柱子填料粒径为9μm；和/或，所述的弱阴离子交换色谱法的流动相流速为0.5～0.8mL/min；和/或，所述的弱阴离子交换色谱法所用柱温为30～40℃；和/或，所述的弱阴离子交换色谱法所用的激发波长为330nm；和/或，所述的弱阴离子交换色谱法所用的发射波长为420nm；和/或，所述的弱阴离子交换色谱法所用的流动相为由A相和B相组成，所述的A相为由80wt％H2O和20wt％乙腈组成，所述的B相由50wt％500mM甲酸铵水溶液、30wt％H2O和20wt％乙腈组成，所述的B相的pH＝4.5；
和/或，所述的脱盐使用反相脱盐的方法。
5.如权利要求4所述的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖结构鉴定的方法，其特征在于，
所述的8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐荧光衍生的方法中，所述的荧光衍生反应的温度为35～38℃；和/或，所述的荧光衍生反应的时间为16～18h；和/或，所述的APTS荧光衍生反应中，APTS与N-连接寡糖的物质的量比例为大于100:1；和/或，所述的8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐与NaBH3CN的摩尔比为1:10～1:20；和/或，所述的NaBH3CN的有机溶剂的溶液中NaBH3CN的浓度为1M；和/或，所述的有机溶剂包括脂肪族溶剂、芳香族溶剂和脂肪族卤化物溶剂中的一种或多种；
和/或，所述的2-氨基苯甲酰胺衍生的方法中，所述的溶液A与所述的溶液B的体积比为3：2；和/或，所述的2-AB与所述的N-连接寡糖的摩尔比为大于100:1；和/或，所述的衍生反应的温度为37℃；所述的衍生反应的时间为16～18h；
和/或，所述的弱阴离子交换色谱法对衍生后的产物进行梯度分离中的流动相梯度为以下条件：0～20min：0％所述的B相；20～25min：0％～16％所述的B相；25～65min：16％～50％所述的B相；百分比为体积百分比，且所述的A相的用量为100％减去所述的B相的用量；
和/或，所述的反相脱盐的方法使用C18柱或多空石墨化碳固相萃取小柱进行脱盐；当采用所述的C18柱进行脱盐时，所述的C18柱为Waters公司的Sep-pak C18柱，和/或，当采用所述的C18柱进行脱盐时，所述的反相脱盐按照以下步骤进行：先将C18柱活化，然后上样，用水洗脱去除样品里的盐；当采用所述的多空石墨化碳固相萃取小柱进行脱盐时，所述的反相脱盐按照以下步骤进行：先将多空石墨化碳固相萃取小柱活化，然后上样，用水洗脱去除样品里的盐。
6.如权利要求5所述的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖结构鉴定的方法，其特征在于，
当采用所述的C18柱进行脱盐时，所述的活化采用体积比为8：2的乙腈和水的混合液活化柱子并重复使共执行三遍，然后用水活化柱子并重复使共执行三遍；和/或，当采用所述的C18柱进行脱盐时，所述的脱盐在结束后采用体积比为1:1的乙腈和水的混合液将N-连接寡糖洗脱下来；
当采用所述的多空石墨化碳固相萃取小柱进行脱盐时，所述的活化采用体积比为8：2的乙腈和水，且含有0.1wt％三氟乙酸的混合液活化柱子并重复使共执行三遍，然后用水活化柱子并重复使共执行三遍；和/或，当采用所述的多空石墨化碳固相萃取小柱进行脱盐时，所述的脱盐在结束后采用体积比为4:6的乙腈和水，且含有0.05wt％三氟乙酸的混合液将N-连接寡糖洗脱下来；
和/或，所述的8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐荧光衍生或所述的2-氨基苯甲酰胺衍生的方法在进行完后进行脱除衍生试剂的操作，按照以下步骤进行：将填料为聚酰胺类树脂，且填料粒径为50～160μm的固相萃取小柱，用体积比为95:5的乙腈与水的混合液进行活化，然后将被乙腈或甲醇稀释后的所述的衍生后的产物或所述的荧光衍生后的产物上样，所述的被乙腈或甲醇稀释，要保证乙腈或甲醇用量不低于95％，百分比指乙腈的体积占整个稀释体系总体积的体积百分比；上样后用缓冲液A反复洗脱去除衍生试剂；所述的缓冲液A由95％乙腈、5％去离子水和50mM三乙胺组成，百分比是各组分的体积占缓冲液A总体积的体积百分比；然后用缓冲液B将保留在柱子上的N-连接寡糖洗脱，所述的缓冲液B是50mM的三乙胺的水溶液。
7.如权利要求1所述的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖结构鉴定的方法，其特征在于，
所述的激光诱导荧光毛细管电泳分离中所用的毛细管柱的内径为25～75μm；和/或，所述的激光诱导荧光毛细管电泳分离中所用的毛细管柱的外径为365～385μm；和/或，所述的激光诱导荧光毛细管电泳分离中所用的毛细管柱的总长度为30～100cm；和/或，所述的激光诱导荧光毛细管电泳分离中所用的毛细管柱的有效长度为19.5～89.5cm；和/或，所述的激光诱导荧光毛细管电泳分离中所用的缓冲溶液为甲酸铵水溶液、乙酸钠水溶液或乙酸铵水溶液；和/或，所述的激光诱导荧光毛细管电泳的进样的方法为流体力学进样和/或电迁移进样；和/或，所述的进样时间为3～5s；和/或，所述的毛细管电泳的分离电压为反转电压；和/或，所述的毛细管电泳的柱温为20～25℃；和/或，所述的毛细管电泳的激发波长为488nm；和/或，所述的毛细管电泳的发射波长为520nm。
8.如权利要求7所述的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖结构鉴定的方法，其特征在于，
所述的缓冲溶液的pH值为3～5；和/或，所述的缓冲溶液中溶质的浓度为20～50mM；所述的缓冲溶液的溶质还包含聚环氧乙烷、羟丙基甲基纤维素、或乙基纤维素；所述的聚环氧乙烷、羟丙基甲基纤维素、或乙基纤维素的含量为0.2～1％，百分比为聚环氧乙烷、羟丙基甲基纤维素、或乙基纤维素的质量与缓冲溶液的体积之比；
和/或，当所述的激光诱导荧光毛细管电泳的进样的方法为流体力学进样时，所述的流体力学进样的压强为0.2～0.5磅/平方英寸；
和/或，所述的反转电压的电压值为10～20kV。
9.如权利要求1所述的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖结构鉴定的方法，其特征在于，所述的色谱峰迁移时间转换为葡萄糖单元组成个数的方法按照以下步骤进行：将8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐荧光衍生的不同聚合度大小的葡萄糖寡聚糖的混合物，聚合度范围为1～20，作为外标，甘露二糖作为内标，进行激光诱导荧光毛细管电泳分离，并建立色谱峰迁移时间和葡萄糖单元组成个数的线性关系；通过线性关系将N-连接寡糖的色谱峰迁移时间转化为葡萄糖单元组成个数，所述的激光诱导荧光毛细管电泳分离的方法同权利要求7～8中任一项所述。
10.如权利要求1所述的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖结构鉴定的方法，其特征在于，
所述的酶切，不包括所述的肽N-糖苷酶F酶切，酶切时的温度为35～38℃；和/或，所述的酶切，不包括所述的肽N-糖苷酶F酶切，酶切时N-连接寡糖和酶的用量比例为每1μg～5μgN-连接寡糖用活力单位为1.6～20mU的酶；和/或，所述的酶切，不包括所述的肽N-糖苷酶F酶切，酶切时的pH值为5.0～6.0；和/或，所述的酶切，不包括所述的肽N-糖苷酶F酶切，酶切的时间为18h～24h；和/或，所述的酶切，当所用的酶为广谱性的唾液酸酶α(2-3,6,8,9)-specific Neuraminidase或特异性的唾液酸酶α(2-3)-specific Neuraminidase时，酶与待酶切的N-连接寡糖的用量比例为1～2mU酶/μg N-连接寡糖，这里所述的N-连接寡糖包括APTS荧光衍生的N-连接寡糖；和/或，所述的酶切，当所用的酶为β1-4半乳糖苷酶时，酶与待酶切的N-连接寡糖的用量比例为4～8mU酶/μg N-连接寡糖，这里所述的N-连接寡糖包括APTS荧光衍生的N-连接寡糖；和/或，所述的酶切，当所用的酶为β-N-乙酰氨基葡糖苷酶时，酶与待酶切的N-连接寡糖的用量比例为2～4mU酶/μg N-连接寡糖，这里所述的N-连接寡糖包括APTS荧光衍生的N-连接寡糖；和/或，所述的酶切，当所用的酶为岩藻糖苷酶时，酶与待酶切的N-连接寡糖的用量比例为1.6～3.2mU酶/μg N-连接寡糖，这里所述的N-连接寡糖包括APTS荧光衍生的N-连接寡糖。
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