CN103134874A - 一种测定蛋白中糖基的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种测定蛋白中糖基的方法，具体涉及通过先将蛋白进行换液处理后，再还原酶切后，直接加入切糖酶切除糖链，并对获得的糖链纯化处理后，经荧光衍生、去除过量标记物后进行含量检测。该检测方法能够很好保证切糖的完全、且糖链结构完整、重复性好，而且测定方法简单易于操作。

Description

一种测定蛋白中糖基的方法
技术领域
本发明涉及生物蛋白检测领域，具体涉及一种测定蛋白中糖基的方法。 
背景技术
糖基化(glycosylation)指是在酶的控制下，蛋白质或脂质附加上糖类的过程，是蛋白质的一种重要的翻译后修饰，约有一半以上的蛋白质发生了糖基化，糖蛋白的糖基可影响生物活性，有介导受体识别的作用，可增加可溶性，调节并稳定蛋白构象。因此特殊的糖基结构与许多蛋白药物的安全有效性相关，它对蛋白质分子的生物活性、稳定性、免疫原性以及分子转运、识别等都有十分重要的意义，同时蛋白糖基化程度和糖链结构变化经常是肿瘤及其它疾病的发生标志。因此，在生物药物研究开发过程中，譬如工艺开发、制造纯化、剂型开发和稳定性检测过程中，蛋白质中糖基的测定是十分重要的。 
蛋白质发生的糖基化反应分为两种类型，一类是在细胞质的内质网中发生的，由酶催化进行的缩合反应，见于蛋白质翻译后的糖基化修饰。另一类为非酶催化的糖基化反应，是由葡萄糖、6-磷酸葡萄糖、果糖等醛糖的醛基与蛋白质分子中氨基酸(通常为赖氨酸)的NH2基缩合形成Shiffs碱，并进一步经分子重排形成更稳定的糖化产物。 
蛋白质糖基化的类型包括N-和O-两种糖基化类型，N-糖基化和O-糖基化中修饰蛋白的糖链与蛋白具有不同的连接方式，N-糖基化中糖链通过N原子与天冬酰胺相连接，糖链中包含一个由3个甘露糖和2个GlcNAc组成的5糖核心，靠近蛋白连接端的为2个GlcNAc。 
近年来，测定蛋白中糖基的方法一般是首先将糖链从蛋白上完整的脱下来，然后用荧光试剂与之反应使其能够被检测到，最后用合适的洗脱体系和色谱柱将其分离并检测。目前已知具有糖基化分析仪器或试剂的公司有：Waters，QA-bio，NEB，prozyme，Sigma，Agilent。其中Waters公司可提供除酶以外的其他试剂和仪器，该公司有一套较为成熟的糖基化分析方法，尤其在糖链纯化和色谱分析方面比较领先，他的纯化系统和色谱分离系统，在切糖方面不对蛋白变性，而是通过提供一个类似表面活性剂的试剂来改善切糖酶在切糖时的空间位阻，这种方法在蛋白分子量较小，糖基化情况比较简单的时候比较有效，但在应用到复杂糖基化蛋白，仍存在脱糖不完全的情况，而且用该方法切糖效率不高；另外Waters公司提供的方法中样品还原时间长、温度较高，这可能导致糖链中唾液酸脱落，无法全面有效的计算唾液酸的含量等问题。QA-bio公司可以提供全套的试剂以及酶等，也提供一个标准方法供选择，但 问题是蛋白在切糖前用100℃水浴变性，这样的条件太剧烈，不利于糖链结构的保护。另外，糖链末端的唾液酸对pH值也比较敏感，较低的pH值同样会导致唾液酸脱落，而QA-bio公司提供的糖链纯化标准方法中需要用到三氟乙酸，也有可能破坏糖链结构。 
目前蛋白中糖基的分析过程存在如下难点：如何保证糖链被完全从蛋白上切下来并不被破坏？如何提高检测结果重现性？寻求一种脱糖完全且糖链结构保持完整，结果重现性好的蛋白中糖基的测定方法变得十分重要。 
发明内容
为了解决现有技术中检测蛋白中糖链方法存在的切糖不完全、难以保全完整的糖链结构、以及重现性差等一系列技术问题，本发明提供了如下技术方案： 
本发明一方面提供了一种测定蛋白中糖链的方法，其前处理过程为先将蛋白进行换液处理后，再还原酶切后，直接加入切糖酶切除糖链，并对获得的糖链纯化。 
上述酶切过程中所用的酶为丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、巯基蛋白酶或天冬酰胺蛋白酶的一种或多种；所述切糖酶为肽N-糖苷酶F、β1-3半乳糖苷酶、β1-4半乳糖苷酶、α1-2，3甘露糖苷酶或α1-2岩藻糖苷酶的一种或多种；其中所述丝氨酸蛋白酶优选为胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、蛋白内切酶GluC，所述金属蛋白酶优选为羧肽酶、中性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胶原酶等，胰蛋白酶和糜蛋白酶也属于金属蛋白酶，所述巯基蛋白酶优选为组织蛋白酶B、H、L，所述天冬酰胺蛋白酶优选为组织蛋白酶D。 
上述换液过程是将溶液体系替换为符合酶切的溶液体系。譬如，酶切蛋白为胰蛋白酶，将溶液换为适合胰蛋白酶酶切的碳酸氢铵缓冲液(pH＝8.3)体系，或者利用Merck的酶切缓冲液体系是可在酶切前将溶液换为超纯水等等。 
本发明还进一步提供了测定蛋白中糖链的方法的前处理过程，其具体步骤如下：取换液处理后的蛋白溶液加入适量的提取缓冲液混匀后；加入酶切缓冲液和还原剂混匀，还原完全后取出，冷却至室温，加入保护剂混匀，保护完全；再加入蛋白酶，反应完全；再加入切糖酶，反应完全后，取出备用；其中所述的提取缓冲液、酶切缓冲液、还原剂、保护剂均为Merck公司生产的；所述蛋白酶为胰蛋白酶；所述的切糖酶为肽N-糖苷酶F。 
本发明又进一步提供了测定蛋白中糖链的方法的前处理过程，其具体步骤如下：取换液处理后的蛋白，加入盐酸胍变性处理后；取变性后样品，加入二硫苏糖醇进行蛋白还原；再加入碘乙酰胺充分反应后；再经充分换液处理后，加入胰蛋白酶反应完全后，再加入切糖酶，反应完全后备用。 
上述其中测定蛋白中糖链的方法的前处理过程中所述糖链纯化过程如下： 
1)向切糖获得的糖链中加入乙腈，混匀，将样品转移至洗脱板，再用乙腈充分冲洗； 
2)加入柠檬酸钠对糖链进行洗脱，并收集洗脱液，离心干燥后获得糖链。 
本发明另一方面还提供了一种测定蛋白中糖链的方法，具体为经纯化后的糖链经荧光衍生、去除过量标记物后进行含量检测。 
上述荧光衍生的方法如下： 
1)溶解荧光标记物，并将还原完全，制得标记溶液； 
2)将1)中标记溶液加到纯化后糖链中，充分混匀后离心后置于65度反应完全后，重复一次前述混匀和反应过程后，获得标记后的糖链。 
上述除过量标记物的方法如下： 
1)在获得的标记糖链中加入乙腈，混匀，将样品转移至板孔，再用乙腈充分冲洗； 
2)加入柠檬酸钠对糖链进行洗脱，并收集洗脱液，离心干燥后获得去除过量标记物的荧光标记糖链。 
本发明所述融合蛋白优选为序列1或所属蛋白为单克隆抗体：其轻链为序列2，重链为序列3。 
相对于现有技术中测定蛋白中糖链的方法，本发明测定方法更能保证切糖的完全、且糖链结构完整、重复性好，而且测定方法简单易于操作。 
附图说明
图1是对比实施例一中Waters提供方法重复两次实验HPLC检测蛋白中糖基的结果对比 
图2是对比实施例一中本发明方法与Waters提供方法HPLC检测蛋白中糖基的结果对比 
图3是对比实施例二中酶切前换液过程对检测蛋白中糖基的结果(HPLC结果)影响 
图4是实施例一中样品1、2检测实验的HPLC检测蛋白中糖基的结果对比 
图5是实施例一中样品1、3检测实验的HPLC检测蛋白中糖基的结果对比 
图6是重复实施例二两次实验HPLC检测单克隆抗体中糖基的结果对比 
图7是重复实施例三两次实验HPLC检测蛋白中糖基的结果对比 
本申请实验中所用试剂： 
RapiGest SF试剂：货号186001861，批号02391，Waters公司 
二硫苏糖醇(DTT)：货号D5545-1G，批号117K0663V，Sigma公司 
IAM(碘乙酰胺)：货号I1149-5G，批号068K53022，Sigma公司 
切糖酶(PNF)：货号P7817S，批号0361005，NEB公司 
HILIC纯化板：货号186002481，批号006530305，Waters公司 
柠檬酸钠：货号1.01456.010，批号20080103，广东东华化学厂有限公司 
荧光标记试剂盒：试剂盒名称：SIGNALTM 2-AA LABELING KIT，货号GKK-402，批号DH42009，Prozyme公司 
色谱柱：ACQUITYUPLC BEH Glycan 1.7μm，2.1×150mm，货号186004742，批号0112310521，Waters公司 
超滤离心管：货号UFC50109696PK，批号ROBA85051，Millipore公司 
提取缓冲液(Extration Buffer)：Merck公司ProteoExtractTM All-in-One Trypsin DigestionKit(货号650212) 
酶切缓冲液(Digest Buffer)：Merck公司ProteoExtractTM All-in-One Trypsin Digestion Kit(货号650212) 
保护剂(Blocking agent)：Merck公司ProteoExtractTM All-in-One Trypsin Digestion Kit(货号650212) 
还原剂(Reducing agent)：Merck公司ProteoExtractTM All-in-One Trypsin Digestion Kit(货号650212) 
对比实施例一 
1、Waters提供糖基化检测方法 
1.样品切糖 
1)将蛋白溶解在0.1％的RapiGest SF试剂中； 
2)加入二硫苏糖醇(DTT)使其最终含量为10mM； 
3)55℃加入样品45min以还原样品； 
4)冷却至室温，加入IAM(碘乙酰胺)使其最终浓度为15mM，避光反应45min； 
5)加入等体积的100mM碳酸氢铵，使样品缓冲液pH值为7.8； 
6)加入一定量的切糖酶(PNF)，37℃反应过夜。 
2.糖链纯化 
1)加入乙腈使样品中乙腈浓度达到90％； 
2)在HILIC纯化板相应孔中加入200μl纯水，加压使其流下； 
3)加入200μl 90％乙腈，加压使其流下，重复一次； 
4)将样品加入各孔中，使其自然流下，约需5-10min； 
5)加入200μl 90％乙腈，加压使其流下，重复一次； 
6)加入25-50μl10mM柠檬酸钠，加压使其流下，重复一次； 
7)收集柠檬酸钠溶液。 
3.糖链标记 
从荧光标记试剂盒中取150μl冰醋酸加入到350μl DMSO中，用移液器混匀；取上述混合溶液100μl加入到6mg 2-AA染料中，用移液器混匀，使标记物溶解；将标记溶液全部转移至6mg还原剂氰基硼氢化钠(sodium cyanoborohydride)的小瓶中，用移液器轻轻吹打混匀。如有不溶物，在65℃加热3min。此标记溶液60min内使用；加5μl标记溶液到纯化后干燥的样品中；混匀，将样品放在烘箱中65℃反应。反应30min后取出，混匀，再放入烘箱中继续反应2.5h，取出备用。 
4.标记后纯化 
同糖链纯化步骤。 
5.HPLC样品分析 
色谱柱：ACQUITYUPLC BEH Glycan 1.7μm，2.1×150mm； 
流动相A：100mM甲酸胺，流动相B：乙腈，进行梯度洗脱； 
流速：0.5ml/min，柱温：60℃； 
检测波长：Ex＝320nm，Em＝420nm； 
梯度洗脱表见表1： 
表1、梯度洗脱表 
Figure BDA0000137745340000051
利用Waters方法检测的检测结果见图1。 
2、本发明提供糖基化检测方法 
1)换液过程 
取1mg蛋白溶液，加入超滤离心管中，用超纯水补足400μl，10000r/min离心10min，再加入350μl超纯水，10000r/min离心10min，反复操作3次以上，此时得到样品体积约为40μl，浓度约为25mg/ml。 
2)样品酶切和切糖 
取一定量的换液后的蛋白溶液(使其加入30μl提取缓冲液(Extraction Buffer，Merck)后的终浓度为6mg/ml)至洁净的1.5ml EP管中。分别往样品中加入30μl Extration Buffer，混匀，12000r/min离心15min；取25μl上清液至1.5ml新的EP管中，加入25μl酶切缓冲液(Digest Buffer，Merk)和1μl还原剂(Reducing agent，Merck)混匀，37℃水浴加热10min，取出，冷却至室温；加入1μl保护剂(Blocking agent，Merck)混匀，室温反应10min；向样品中加入1μl胰蛋白酶(Trypsin，Merck)，37℃水浴加热1h，取出，冷却至室温；室温放置1h；加入5μl肽N-糖苷酶F(PNF)，37℃水浴2.5h，取出备用。 
3)糖纯化 
取Mass PREP HILIC μElution Plate(Waters)，向板孔中加入200μl 90％的乙腈，加压使其流过；加200μl超纯水，加压使其流过，重复一次；加入90％的乙腈冲洗2次，每次200μl，加压使其流过；往酶切后的样品中加入300μl纯乙腈，混匀，将样品小心转移至各孔中，所有样品上样完成后，静置15min，使其自然流下；用90％的乙腈冲洗2次，每次200μl，使溶液全部流下；加入150ul超纯水洗脱板孔，加压使洗脱液全部流下；加入10mM柠檬酸钠洗脱板孔，2次，每次25μl；将收集到的洗脱液转移至EP管中，离心干燥完全。 
4)荧光衍生 
从荧光标记试剂盒中取150μl冰醋酸加入到350μl DMSO中，用移液器混匀；取上述混合溶液100μl加入到6mg 2-AA染料中，用移液器混匀，使标记物溶解；将标记溶液全部转移至6mg还原剂氰基硼氢化钠(sodium cyanoborohydride)的小瓶中，用移液器轻轻吹打混匀。如有不溶物，在65℃加热3min。此标记溶液60min内使用；加5μl标记溶液到纯化后干燥的样品中；混匀，将样品放在烘箱中65℃反应。反应30min后取出，混匀，再放入烘箱中继续反应2.5h，取出备用。 
5)去除过量标记物 
取Mass PREP HILIC μElution Plate，按前法分别加入90％乙腈和水处理各孔，备用；往标记后的样品加入90％乙腈200μl，混匀后转移至板孔，向EP管中再加入200μl 90％的乙腈，混匀后全部转移至对应板孔中，所有样品上样完成后等待15min，使其自然流下；用90％的乙腈冲洗2次，每次200μl，加压使溶液全部流下；加入10mM柠檬酸钠洗脱板孔，2次，每次25μl；将收集到的样品转移至合适的EP管中，离心干燥，加入50μl超纯水，溶解并混匀，进行HPLC检测。 
6)HPLC分析 
同上述Waters提供糖基化检测方法中的5)HPLC分析方法 
3、实验结果 
3.1由图1可知，Waters提供方法可重复性很差，而且整体糖链响应值偏低； 
3.2由图2可知，Waters提供方法检测的各糖链含量比例与本发明方法检测的结果差异较大，本发明提供检测方法，整体糖链的响应值远远高于Waters提供检测方法，证明本发明提供检测方法灵敏度及准确度很高。 
对比实施例二 
实验方法：检测方法与对比实施例一中的本发明方法2一致，仅在第一步考虑是否增加样品的换液处理对检测结果的影响，具体结果见图3。 
实验结果： 
由图3可知，如果不再酶切前进行换液处理，胰蛋白酶和切糖酶的活性较弱，无法酶切和切糖完全，整体糖链的响应值较低，使得检测方法的灵敏度及准确度较高；相反，在酶切和切糖前增加换液处理，使得缓冲溶液对酶切和切糖不造成影响，使得切糖完全，从而保证了检测结果的灵敏度和准确度。 
具体实施方式
一、融合蛋白中糖基含量的检测 
1、具体实验步骤 
1)换液过程 
取1mg蛋白溶液，加入超滤离心管中，用超纯水补足400μl，10000r/min离心10min，再加入350μl超纯水，10000r/min离心10min，反复操作3次以上，此时得到样品体积约为40μl，浓度约为25mg/ml。 
2)样品酶切和切糖 
取一定量的换液处理后的蛋白(序列1)溶液(使其加入30μl Extraction Buffer后的终浓度为6mg/ml)至洁净的1.5ml EP管中，平行实验四份，分别编号为1、2、3、4。分别往样品中加入30μl提取缓冲液(Extration Buffer，Merck)，混匀，12000r/min离心15min；取25μl上清液至1.5ml新的EP管中，加入25μl酶切缓冲液(Digest Buffer，Merck)和1μl还原剂(Reducing agent，Merck)，混匀，37℃水浴加热10min，取出，冷却至室温；加入1μl保护剂(Blocking agent，Merck)混匀，室温反应10min；向样品1、2中加入1μl胰蛋白酶(Trypsin，Merck)，37℃水浴加热1h，取出，冷却至室温；样品3、4室温放置1h；向样品1、2、3、4中分别加入5μl切糖酶(PNF)，37℃水浴2.5h，取出备用。 
3)糖纯化 
取Mass PREP HILIC μElution Plate(waters)，向板孔中加入200μl 90％的乙腈，加压使其流过；加200μl超纯水，加压使其流过，重复一次；加入90％的乙腈冲洗2次，每次200μl，加压使其流过；往酶切后的样品中加入300μl纯乙腈，混匀，将样品小心转移至各孔中，所有样品上样完成后，静置15min，使其自然流下；用90％的乙腈冲洗2次，每次200μl，使溶液全部流下；加入150ul超纯水洗脱板孔，加压使洗脱液全部流下；加入10mM柠檬酸钠洗脱板孔，2次，每次25μl；将收集到的洗脱液转移至EP管中，离心干燥完全。 
4)荧光衍生 
从荧光标记试剂盒中取150μl冰醋酸加入到350μl DMSO中，用移液器混匀；取上述混合溶液100μl加入到6mg 2-AA染料中，用移液器混匀，使标记物溶解；将标记溶液全部转移至6mg还原剂氰基硼氢化钠(sodium cyanoborohydride)的小瓶中，用移液器轻轻吹打混匀。如有不溶物，在65℃加热3min。此标记溶液60min内使用；加5μl标记溶液到纯化后干燥的样品中；混匀，将样品放在烘箱中65℃反应。反应30min后取出，混匀，再放入烘箱中继续反应2.5h，取出备用。 
5)去除过量标记物 
取Mass PREP HILIC μElution Plate，按前法分别加入90％乙腈和水处理各孔，备用；往标记后的样品加入90％乙腈200μl，混匀后转移至板孔，向EP管中再加入200μl 90％的乙腈，混匀后全部转移至对应板孔中，所有样品上样完成后等待15min，使其自然流下；用90％的乙腈冲洗2次，每次200μl，加压使溶液全部流下；加入10mM柠檬酸钠洗脱板孔，2次，每次25μl；将收集到的样品转移至合适的EP管中，离心干燥，加入50μl超纯水，溶解并混匀，进行HPLC检测。 
6)HPLC分析 
色谱柱：ACQUITYUPLC BEH Glycan 1.7μm，2.1×150mm； 
流动相A：100mM甲酸胺，流动相B：乙腈，进行梯度洗脱； 
流速：0.5ml/min，柱温：60℃； 
检测波长：Ex＝320nm，Em＝420nm； 
梯度洗脱表见表1。 
2、实验结果 
由图4和表2结果可知，酶切后再切糖方面，使得蛋白中糖链的检测结果灵敏度和准确度较高，同时两次检测结果一直，证明其可重复性好，因此本实验方法，更适于糖 链结构复杂的蛋白中的糖链含量的测定。 
由图5和表2结果可知，切糖前如果不进行酶切，其难以切糖完全，整个糖链的响应值较低，其准确度和灵敏度远不如经切糖前先酶切处理的样品的糖链检测。 
表2蛋白中糖基检测结果 
Figure BDA0000137745340000091
二、单克隆抗体的蛋白中糖基的检测 
1、实验步骤 
取单克隆抗体(其轻链为序列2，重链为序列3)的检测过程同实施一样品1中糖基的检 测操作，共选择两批次样品进行了检测。 
2、实验结果 
表3单克隆抗体中糖基的检测结果 
Figure BDA0000137745340000101
图6和表3结果说明，本发明方法能很好的用于单克隆抗体中糖基的检测，并且重复性好，可操作性强。 
实施例三 
1、实验步骤 
1)换液过程 
取1mg蛋白(序列1)溶液，加入超滤离心管中，用50mmol/L碳酸氢铵缓冲液(pH＝8.3)补足400μl，10000r/min离心10min，再加入350μl 50mmol/L碳酸氢铵缓冲液(pH＝8.3)，10000r/min离心10min，反复操作3次以上，此时得到样品体积约为40μl，浓度约为25mg/ml。 
2)样品酶切和切糖 
取10μl的换液处理后的蛋白(序列1)溶液至洁净的1.5ml EP管中，平行实验两份。分别往样品中加入等体积8M盐酸胍溶液，混匀后，65℃水浴30min变性蛋白；取变性后样品，加入1μl 1M DTT溶液，使DTT终浓度为50mM，40℃水浴60min还原蛋白；再加入2μl 1M碘乙酰胺溶液，使其终浓度为100mM，避光室温反应30min；将反应后样品加入超滤离心管中，用50mM碳酸氢铵离心换液，10000r/min，15min/次，换液5次；取换液后的样品，加入10μl胰蛋白酶，37℃水浴过夜；再加入10μl切糖酶，37℃水浴3h，取出备用。 
3)糖纯化 
同实施例一。 
4)荧光衍生 
同实施例一。 
5)去除过量标记物 
同实施例一。 
6)HPLC分析 
同实施例一。 
2、实验结果 
检测结果见图7和表4。 
表4蛋白中糖基检测结果 
Figure BDA0000137745340000111
由上述结果可知，即使不用Merck公司的试剂盒，运用本发明方法仍能获得重现性较好的检测结果。 
实施例四唾液酸的检测 
唾液酸位于糖链的最外侧，很容易在分析过程中发生脱落，为了更好的反应本发明的前处理过程和检测方法并没有改变糖链的结构，特针对按照实施例一(样品1-3)和实施例三(样品4-6)中先酶切再切糖的方法获得的糖链进行唾液酸检测。 
发明人根据2010年版《中国药典》三部附录VIC唾液酸测定方法中记载的间苯二酚法来测定蛋白中唾液酸的含量。 
根据本发明检测蛋白中糖基的方法所得的HPLC结果计算糖链的含量，质谱仪检测结果获知糖链中含唾液酸的个数，发明人通过上述两个结果推算唾液酸的含量，计算公式如下： 
蛋白中唾液酸含量＝(c1*n1+c2*n2+......)*7*2/100 
其中c--含唾液酸糖链的含量％ 
n--糖链中含唾液酸的个数 
7--序列1中含有7个糖基化位点 
2-序列1蛋白为双链结构 
通过计算得到结果如下表5 
表5间苯二酚法和质谱推算唾液酸结果对比 
Figure BDA0000137745340000121
由表5可知，药典方法和经HPLC+质谱推算方法获得的唾液酸含量无明细差异，说明本发明检测蛋白中糖基的方法，并没有破坏糖链的结构，能够保持糖链的完整性。 
Figure IDA0000137745410000011
Figure IDA0000137745410000021
Figure IDA0000137745410000031
Figure IDA0000137745410000041
Figure IDA0000137745410000051

Claims (10)

1.一种测定蛋白中糖链的方法，其特征在于前处理过程为先将蛋白进行换液处理后，再还原酶切后，直接加入切糖酶切除糖链，并对获得的糖链纯化。
2.根据权利要求1所述的测定蛋白中糖链的方法，其特征在于酶切过程中所用的酶为丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、巯基蛋白酶或天冬酰胺蛋白酶的一种或多种；所述切糖酶为肽N-糖苷酶F、β1-3半乳糖苷酶、β1-4半乳糖苷酶、α1-2，3甘露糖苷酶或α1-2岩藻糖苷酶的一种或多种；其中所述丝氨酸蛋白酶优选为胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、蛋白内切酶GluC，所述金属蛋白酶优选为羧肽酶、中性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胶原酶等，所述巯基蛋白酶优选为组织蛋白酶B、H、L，所述天冬酰胺蛋白酶优选为组织蛋白酶D。
3.根据权利要求1所述的测定蛋白中糖链的方法，其特征在于所述换液过程为：将蛋白溶液体系替换为符合酶切的溶液体系；其中换液后溶液中蛋白浓度优选为25mg/ml。
4.根据权利要求2所述的测定蛋白中糖链的方法，其特征在于前处理过程为取换液处理后的蛋白溶液加入适量的提取缓冲液混匀后；加入酶切缓冲液和还原剂混匀，还原完全后取出，冷却至室温，加入保护剂混匀，保护完全；再加入蛋白酶，反应完全；再加入切糖酶，反应完全后，取出备用；其中所述的提取缓冲液、酶切缓冲液、还原剂、保护剂均为Merck公司生产的；所述蛋白酶为胰蛋白酶；所述的切糖酶为肽N-糖苷酶F。
5.根据权利要求2所述的测定蛋白中糖链的方法，其特征在于前处理过程为取换液处理后的蛋白，加入盐酸胍变性处理后；取变性后样品，加入二硫苏糖醇进行蛋白还原；再加入碘乙酰胺充分反应后；再经充分换液处理后，加入胰蛋白酶反应完全后，再加入切糖酶，反应完全后备用。
6.根据权利要求1所述的测定蛋白中糖链的方法，其特征在于所述糖链纯化过程如下：在所述切糖后获得的糖链中加入乙腈，混匀，将样品转移至洗脱板，再用乙腈充分冲洗；加入柠檬酸钠对糖链进行洗脱，并收集洗脱液，离心干燥后获得糖链。
7.根据权利要求5所述的测定蛋白中糖链的方法，其特征在于经纯化后的糖链经荧光衍生、去除过量标记物后进行含量检测。
8.根据权利要求6所述的测定蛋白中糖链的方法，其特征在于所述荧光衍生的方法如下：溶解荧光标记物，并将还原完全，制得标记溶液；将1)中标记溶液加到纯化后糖链中，充分混匀后离心后置于65度反应完全后，重复一次前述混匀和反应过程后，获得标记后的糖链。
9.根据权利要求7所述的测定蛋白中糖链的方法，其特征在于所述去除过量标记物的方法如下：在所述标记后的糖链中加入乙腈，混匀，将样品转移至板孔，再用乙腈充分冲洗；加入柠檬酸钠对糖链进行洗脱，并收集洗脱液，离心干燥后获得去除标记物的荧光标记糖链。
10.根据权利要求1-9中任一项所述测定蛋白中糖链的方法，其特征在于所述蛋白的系列为序列1或所述蛋白为单克隆抗体：其轻链为序列2，重链为序列3。
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